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MICOLOGIA GUÍA DE PROCESAMIENTO DE
MATERIALES CLÍNICOS
DOCENTES:
ALICIA LUQUE
MARISA BIASOLI
MARÍA ELENA TOSELLO
SUSANA AMIGOT
SILVANA RAMADÁN
LUCÍA BULACIO
MAXIMILIANO SORTINO
CARLOS GÓMEZ
MIRTA TARTABINI
HERNÁN DALMASO
EDUARDO CODINO
VIRGINIA PODESTÁ
-AÑO 2015-
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La realización de análisis micológicos comprende la obtención del material
clínico y su procesamiento, su observación microscópica (a través de examen directo o
coloración según corresponda), la siembra en los medios de cultivo, tiempo y
temperaturas adecuados y la identificación del microorganismo (cuando los cultivos son
positivos).
En este capítulo se detallan los elementos necesarios para la realización de los
análisis, las muestras clínicas más frecuentes, las normas de bioseguridad de trabajo en
el laboratorio y finalmente la descripción del procesamiento de los distintos materiales.
ELEMENTOS NECESARIOS PARA LA REALIZACIÓN DE ANALISIS
MICOLÓGICOS
Obtención y procesamiento de muestras
Hisopos
Bisturí
Pinza
Portaobjetos
Tubos con solución fisiológica estéril
Gasa
Papel de filtro
Perlas de vidrio
Tubos de centrífuga
Jeringa
Aguja
Manipulación de muestras y cultivos
Ansa
Gancho
Hilo
Pinza
Líquidos de montaje para exámenes directos
Hidróxido de potasio 20%
Tinta Parker en KOH 20%
Azul de lactofenol (Gueguen)
Tinta china diluída al medio con formaldehido
Soluciones para realizar coloraciones:
May Grünwald Giemsa
May Grünwald
Agua estabilizada
Giemsa
Giemsa prologando
Metanol
Giemsa
Agua estabilizada
Ziehl Neelsen
Fucsina fenicada
Alcohol clorhídrico
Azul de metileno
Kinyoun
Carbol fucsina
Acido sulfúrico 1%
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Azul de metileno
Medios de cultivo
Agar Sabouraud Glucosa (ASG)
Agar Sabouraud Glucosa Cloromicetina (ASCl)
Mycosel
Lactrimel
Agar Sangre-Cerebro-Corazón con antibiótico (ASCC)
Dixon modificado
MATERIALES CLÍNICOS
La calidad del diagnóstico de las micosis depende de la calidad y cantidad del
material recogido del paciente, de las condiciones de envío, conservación, transporte y
procesamiento y de la pericia del micólogo. Las muestras deben ser representativas,
abundantes, libres de contaminantes, exógenos o endógenos, y de sustancias que
inhiban o alteren la viabilidad de los hongos.
Según su procedencia los materiales clínicos pueden clasificarse como:
Recogidos por el paciente.
Orina
Esputo
Materia fecal
Remitidos por médicos.
Biopsia
Lavado Bronquioalveolar (BAL)
Aspirados traqueales
Aspirados gástricos
Líquidos de punción
Líquido Cefalorraquídeo (LCR)
Hemocultivo (HC)
Médula ósea (MO)
Punta de catéter
Orina por Punción Suprapúbica (PSP)
Obtenidos por bioquímicos
Escamas de piel y uñas
Flujo Vaginal (FV)
Secreción uretral
Hisopados de mucosas
Suero para serología
Escarificaciones
Cuando las muestras son recogidas por médicos o pacientes es importante
informarles cuales son las condiciones adecuadas de recolección, almacenamiento y
transporte.
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NORMAS DE BIOSEGURIDAD PARA EL TRABAJO EN LABORATORIO
No consumir alimentos ni bebidas.
No fumar ni masticar chicle.
No aplicarse cosméticos.
No manipular lentes de contacto.
Utilizar guardapolvos y guantes todo el tiempo. No tocar elementos de uso común
con las manos enguantadas.
Utilizar barbijos y gafas protectoras cuando se procesen materiales que así lo
requieran.
Todo material corto-punzante (agujas, bisturíes, etc) deben descartarse en
recipientes colocados a tal fin.
Las muestras y cultivos desechados se evacuarán en recipientes impermeables en
bolsas de color rojo.
Los tubos y portaobjetos que estuvieron en contacto con material infeccioso se
descartan sumergiéndolos en solución de hipoclorito.
Las zonas de trabajo se limpiarán con un desinfectante apropiado después de cada
período de trabajo.
Todos los procedimientos deben realizarse de forma tal de evitar la generación de
aerosoles.
Durante las manipulaciones microbiológicas se desprenden partículas y gotas por
lo que es aconsejable lavarse las manos con frecuencia y no tocarse la boca ni los
ojos.
Nunca pipetear con la boca.
Utilizar material plástico en lugar de vidrio siempre que sea posible: tubos,
pipetas Pasteur, etc
Cuando se utilice material de vidrio observar que no esté rajado o agrietado
Ante la rotura de recipientes de vidrio conteniendo muestras: agregar hipoclorito y
dejar actuar 30 minutos, recoger con algodón evitando los cortes y colocar los
fragmentos en recipiente de plástico.
En caso de rotura de líquidos patogénicos: se debe absorber con algodón, papel o
tela, que será descartado como residuo patogénico.
En caso de accidentes corto-punzantes: favorecer el sangrado de la herida y lavar
con solución de yodo-povidona al 5% por no menos de 10 minutos.
En caso de salpicaduras en mucosas: lavar con abundante agua corriente por no
menos de 20 minutos.
En caso de salpicaduras en piel: lavar con yodo-povidona al 5% por los menos por
20 minutos.
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DESCRIPCIÓN DEL PROCESAMIENTO DE LOS DISTINTOS MATERIALES
PIEL: PIEL LISA, PEQUEÑOS Y GRANDES PLIEGUES Y FANERAS (UÑAS
Y PELOS)
Indicaciones al paciente:
Se debe suspender toda medicación antifúngica, tópica o sistémica, entre 15 a 30
días antes de la extracción.
Suspender la colocación de pomadas, cremas o talcos medicinales o cosméticos
por lo menos un día antes de concurrir al laboratorio.
Se debe higienizar por lo menos 3 horas antes de la extracción de muestra con
agua y jabón.
Cuando el material a estudiar es uña se recomienda no cortarlas la semana anterior
a la obtención de la muestra y cepillarlas con frecuencia usando jabón de tocador
y concurrir sin esmaltes.
Obtención de la muestra:
La obtención de la muestra a examinar se realiza de diferente manera según la
zona afectada. En general deben prepararse pares de portaobjetos esterilizados a la
llama y un bisturí estéril. Después que los portaobjetos están fríos, se coloca uno de
ellos, con la cara flameada mirando hacia arriba e inmediatamente por debajo de la
lesión. Las escamas obtenidas se juntan en el centro del portaobjetos y se coloca encima
la cara flameada del segundo portaobjetos a modo de emparedado. Se los envuelve con
un papel en el cual se escribe el nombre del paciente y el lugar de donde fue obtenido el
material.
Las escamas de lesiones en piel lampiña deben obtenerse del borde de la
misma, cuando se sospecha de pitiriasis se recomienda realizar además la técnica de
cinta scotch (ver más abajo). La extracción de muestras del cuero cabelludo se efectúa
arrancando pelos con la pinza de depilar y luego raspando la superficie cutánea para
desprender escamas.
En las onicomicosis subungueales debe pasarse el bisturí por el espacio
subungueal, donde se acumula la hiperqueratosis; en la onicomicosis blanca
superficial se raspa la tabla externa de la uña y en las leuconiquias proximales
profundas debe procurarse la obtención de una muestra que abarque el mayor espesor
posible de la tabla ungueal.
Examen directo:
KOH al 20% y calor.
Tinta Parker en KOH al 20% y calor.
Gueguén
Observaciones: si el Examen directo: de uñas resultara negativo, se aconseja dejar el
preparado hasta 48 horas en cámara húmeda con una gota de agua glicerinada al 50%
por el reborde del cubreobjeto.
Cultivos:
Medios de cultivo Temperatura Tiempo
1 tubo de ASG
2 tubos de Lactrimel
1 tubo de Mycosel
1 tubo de Agar V8
28ºC 2 semanas
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PARA EL DIAGNÓSTICO DE PITIRIASIS:
Técnica de cinta scotch
Se aplica un fragmento de cinta de 10 cm sobre la lesión y se presiona raspando
con el borde lateral de la uña, la superficie de la cinta que cubre la zona afectada para
que se adhieran las escamas. La cinta se retira y se aplica sobre una lámina porta-objetos
limpia, rebatiendo los extremos hacia abajo para que no se despegue. Es conveniente
tomar dos o tres improntas y montarlas individuales. Para la observación microscópica
se despega uno de los extremos, se coloca una gota de Gueguen o Azul de Metileno y se
vuelve a colocar la cinta.
Examen directo de escamas obtenidas por raspado:
KOH al 20% y calor
Gueguén
Tinta Parker en KOH al 20% y calor
Cultivos:
Medios de cultivo Temperatura Tiempo
1 tubo de ASG con el agregado de 2-3
gotas de aceite de oliva estéril
1 tubo de Dixon modificado
32ºC 2 semanas
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FLUJO VAGINAL
Indicaciones al paciente:
Suspender toda medicación antibiótica y/o antifúngica, local o sistémica, 10 días
antes de la extracción.
No tener relaciones sexuales por lo menos 3 días antes de la extracción de la
muestra.
Se debe realizar una higiene de la zona genital la noche anterior a la extracción,
preferentemente sin ducha vaginal.
Utilizar ropa interior limpia.
Obtención de la muestra:
Se recolecta con hisopo, previa colocación de espéculo, con el que se debe
realizar
Frotis sobre portaobjetos
2 suspensiones en solución fisiológica estéril
Colocar hisopo en medio de Stuart
Estos materiales son utilizados:
Para análisis micológico: una suspensión en solución fisiológica
Para análisis bacteriológico: frotis, la otra suspensión y el medio de Stuart
Examen directo:
En fresco
Gueguen
Cultivos:
Medios de cultivo Temperatura Tiempo
1 tubo de ASG
1 tubo de ASCl 28ºC 1 semana
SECRECIÓN URETRAL
Indicaciones al paciente:
Higienizarse por lo menos 5 a 7 horas antes de la toma de muestra.
No colocarse pomadas ni tomar ningún antifúngico.
Obtención de la muestra:
Recolección con hisopo en solución fisiológica estéril
Examen directo:
En fresco
Gueguen
Cultivos:
Medios de cultivo Temperatura Tiempo
1 tubo de ASG
1 tubo de ASCl 28ºC 1 semana
OTRAS MUCOSAS Y SECRECIONES
Obtención de la muestra:
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Recolección con hisopo en solución fisiológica estéril
Examen directo:
En fresco
Gueguen
Cultivos:
Medios de cultivo Temperatura Tiempo
1 tubo de ASG
1 tubo de ASCl 28ºC 1 semana
ORINAY ORINA POR PUNCIÓN SUPRAPÚBICA
Indicaciones: al paciente:
Se recoge la primera orina de la mañana por la técnica del chorro medio
Si es una mujer debe higienizarse previamente y colocarse un tapón vaginal.
La orina se recoge en un recipiente estéril, de boca ancha, tapa de rosca y de
preferencia de plástico
Una vez recogida la muestra llevar inmediatamente al laboratorio (de lo contrario
conservar en heladera hasta 12 horas).
En los pacientes con sonda vesical la muestra debe ser obtenida por punción
proximal de la sonda, previa asepsia de la misma con yodo-povidona. También se
utiliza en estos casos la punción suprapúbica.
En neonatos y lactantes la toma de la muestra se realiza “al acecho”.
1-Orina:
Cultivos :
Sembrar 10 µl de orina completa, previamente agitada en placas conteniendo ASG
y ASCl.
El factor para el recuento es 100.
Examen directo:
Centrifugar la muestra para realizar el examen directo desde el sedimento: en
fresco y con gueguen.
2-Orina por punción suprapúbica:
Centrifugar la muestra para realizar el examen directo y cultivos con el sedimento.
Examen directo:
En fresco
Gueguen
Cultivos :
Medios de cultivo Temperatura Tiempo
1 tubo de ASG
1 tubo de ASCl 28ºC 1 semana
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BIOPSIAS, ESPUTO, LAVADO BRONQUIAL, ASPIRADOS TRAQUEALES,
ASPIRADOS GÁSTRICOS, LÍQUIDOS DE PUNCIÓN, ULCERAS,
ESCARIFICACIÓN DE LESIONES CUTÁNEAS (PÁPULAS, NÓDULOS)
Indicaciones:
Biopsias y lavado bronquio alveolar
Estos materiales los extrae médico. Se deben recoger en recipientes estériles
suspendidos en solución fisiológica y nunca en formol.
Remitirlo enseguida al laboratorio, en caso contrario guardar en la heladera unas
horas.
Esputo
Debe recogerse de tos profunda, a primera hora de la mañana (poco después de
levantarse). La muestra no debe contener saliva.
Antes de recoger la muestra, cepillar los dientes sin dentífrico y enjuagar la boca
con agua hervida y enfriada, y en lo posible con bicarbonato (una cucharadita de
té en un frasco de agua)
Utilizar un recipiente estéril, de cierre hermético, y rotulado con nombre y
apellido del paciente.
Una vez recogido el material enviar inmediatamente al laboratorio (de lo contrario
conservar en heladera hasta 2 horas como máximo)
Si el estudio es seriado recoger la muestra preferentemente cuando tenga
expectoración, para evitar remitir saliva.
Obtención de las muestras:
Lesiones cutáneas: descartar las capas más superficiales y tomar el material de las
zonas más profundas con bisturí descartable realizar extendido. Suspender el
material en solución fisiológica estéril y centrifugar.
Escarificación: Se obtiene la muestra por raspado de la úlcera hasta sangrado. Con
el material obtenido se realizan frotis La siembra se realiza inoculando
directamente el material extraído en los medios de cultivos. Este proceso es muy
doloroso para el paciente por lo que se puede tratar la zona con anestésicos
locales, previo acuerdo con el médico solicitante de la práctica.
Úlceras: previo a la extracción limpiar la lesión con hisopo estéril. Utilizar bisturí
descartable para tomar la muestra. Realizar extendidos, resuspender el material en
solución fisiológica estéril y centrifugar.
Fístulas: Previo a la toma de muestra se debe higienizar la zona afectada con
solución fisiológica estéril. Comprimir suavemente la zona para favorecer el
drenaje del material purulento. Recoger en solución fisiológica estéril o inocularlo
directamente en los medios de cultivos. En el caso de escaso o nulo drenaje de
material tomar la muestra con hisopo estéril descartando el material superficial y
penetrando hacia la zona más profunda para la recolección. Si la recolección es
aún dificultosa se debe solicitar la biopsia de la zona fistulosa. Otra opción es
colocar en la fístula una mecha de gasa estéril durante 24 hs.
Secreciones oculares: Limpiar con solución fisiológica estéril y posteriormente
recolectar, por hisopado, en solución fisiológica estéril el material drenado. Las
muestras obtenidas por raspado de cornea o por aspiración del humor vitreo,
recolectadas por el oftalmólogo, deben ser remitidas inmediatamente al
laboratorio para su procesamiento.
Secreciones óticas: Limpiar con solución fisiológica estéril. Recolectar con hisopo
el material del conducto auditivo externo, lo más profundo posible y sin tocar las
paredes del canal auricular, en solución fisiológica.
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Secreciones de senos paranasales: Se recomienda la toma de muestra por aspirado
del material de los senos paranasales. En caso de no poder aspirar el material
hisopar las fosas nasales.
Preparación de las muestras:
Líquidos diluidos: se deben concentrar por centrifugación
Materiales sólidos o viscosos: triturar o disgregar de la forma más conveniente
(con mortero, perlas de vidrio, bisturí, tijeras, etc.)
Examen macroscópico de la muestra
Examen directo:
En fresco o con KOH al 20% (materiales densos)
Gueguen
Con tinta china (si se sospecha criptococosis, en esputos de HIV)
Coloraciones:
May Grünwald Giemsa o Giemsa prologando (según el material)
Ziehl Neelsen
Kinyoun (búsqueda de antinomicetales)
Cultivos:
Medios de cultivo Temperatura Tiempo
1 tubo de ASG
1 tubo de ASCl
1 tubo de Mycosel
28ºC
4 semanas
1 tubo de ASG
2 tubos de ASCC 37ºC
LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO
Preparación de la muestra:
Recolectar de manera estéril y centrifugar a 1000 rpm por 15 minutos, el análisis
micológico se realiza con el sedimento. Reservar el sobrenadante para la prueba de
aglutinación de antígeno por partículas de látex.
Examen directo:
En fresco
Gueguen
Con tinta china
Cultivos:
Medios de cultivo Temperatura Tiempo
1 tubo de ASG
1 tubo de ASCl 28ºC
2 semanas 1 tubo de ASG
1 tubos de ASCC 37ºC
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MATERIA FECAL
- con recuento de colonias
Indicaciones al paciente:
Para realizar este análisis no se debe realizar ninguna dieta previa.
Recoger una deposición espontánea de materia fecal en un recipiente estéril, de
cierre hermético y rotulado con el nombre y apellido del paciente.
Una vez recogida la muestra llevar inmediatamente al laboratorio (de lo contrario
conservar en heladera hasta 12 horas).
Preparación de la muestra:
Hacer una suspensión concentrada de materia fecal en solución fisiológica
(tomando por lo menos 10 lugares distintos de la muestra). Filtrar a través de doble capa
de gasa y llevar al doble de volumen con ácido cítrico al 10%. Dejar en reposo 24 hs en
la heladera. Centrifugar, descartar el sobrenadante y del sedimento sembrar, por
agotamiento en superficie, con ansa calibrada, en placa.
Ejemplo de siembra por agotamiento en superficie para realizar el recuento de colonias de levaduras de
materia fecal.
Examen directo: A partir de la muestra o bien a partir del filtrado de la misma.
En fresco
Gueguen
Cultivos:
Medios de cultivo Temperatura Tiempo
1 placa de ASG
1 placa de ASCl 28ºC 1 semana
Realizar el recuento de colonias y la identificación de las levaduras e informar el
número de colonias por gramo de heces (VN: hasta 5000 colonias de levaduras/g de
materia fecal)
- en neonatos
Preparación de la muestra:
No se realiza el procedimiento descripto para recuento de colonias
Examen directo:
En fresco
Gueguen
Cultivos:
Medios de cultivo Temperatura Tiempo
1 tubo de ASG
1 tubo de ASCl 28ºC 1 semana
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HEMOCULTIVO Y MÉDULA ÓSEA
- Por el método de lisis centrifugación
Preparación de la muestra:
Recolectar sangre en tubo de centrífuga con anticoagulante (heparina) y
saponina e incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. Centrifugar a 2000 rpm
durante 10 min, descartar el sobrenadante y sembrar el sedimento.
Cultivos:
Medios de cultivo Temperatura Tiempo
1 tubo de ASG
1 tubo de Mycosel 28ºC
4 semanas 1 tubo de ASG
1 tubos de ASCC 37ºC
Observaciones: En pacientes con alimentación parenteral agregar un tubo de Dixon o
ASG con dos gotas de aceite de oliva e incubar a 32ºC
- En caldo
Preparación de la muestra:
El volumen de sangre inoculado al frasco debe ser el 10 % del volumen del
medio de cultivo. Conservar el frasco de hemocultivo con la sangre a 28 ºC y se realizan
repiques a las 48 hs y a la semana de incubación. Previamente observar el aspecto del
sobrenadante sin agitar el frasco. Si el paciente es VIH + y/o se sospecha histoplasmosis
realizar además un repique a los 15 días.
Cultivos:
Medios de cultivo Temperatura Tiempo
1 tubo de ASG
1 tubo de Mycosel 28ºC
4 semanas 1 tubo de ASG
1 tubos de ASCC 37ºC
Observaciones: En MO el médico deberá realizar un extendido antes de inocular la
muestra de MO en el caldo, que se deberá teñir con MGG.
- Hemocultivos automatizados BACTEC™ Myco/F Lytic
Las botellas de hemocultivos automatizadas poseen un caldo con el agregado de
saponina, enzima lítica que destruye glóbulos blanco y rojos aumentando la taza de
recuperación de hongos intracelulares como Histoplasma capsulatum.
En su base poseen una sustancia que la reaccionar con el CO2 producido por el
desarrollo microbiológico origina fluorescencia, la cual es censada por el lector del
autoanalizador que construye una curva con los cambios de fluorescencia. Por tal
motivo es fundamental que desde el momento en que la botella es inoculada con la
sangre del paciente, no pasen más de 18 hs para ser introducida en el autoanalizador, ya
que una vez que la fase estacionaria de crecimiento es alcanzada, la fluorescencia
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emitida se vuelve constante lo cual no es interpretado como crecimiento para el
instrumento. Pasadas las 18 hs el hemocultivo se procesa como en caldo.
El volumen del inoculo figura siempre en la etiqueta del frasco y no debe ser
menor a 1 ml de sangre (baja sensibilidad) ni superior a 5 ml (se supera el
anticoagulante). Deben ser conservadas siempre a temperatura ambiente hasta ser
remitidas al laboratorio.
PUNTA DE CATÉTER
Preparación de la muestra:
Se recoge la punta de catéter en un tubo estéril y se coloca en 1 ml de solución
filológica estéril y se agita enérgicamente en un vortex durante 2-3 min. Centrifugar y
sembrar el sedimento.
Cultivos:
Medios de cultivo Temperatura Tiempo
1 tubo de ASG
1 tubo de ASCl 28ºC 1 semana
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AGLUTINACIÓN DE PARTÍCULAS DE LÁTEX PARA DETECTAR
ANTÍGENO DE CRYPTOCOCCUS
Fundamento:
Este test de aglutinación es rápido y simple para la detección cualitativa y
semicuantitativa del antígeno del polisacárido capsular de Cryptococcus neoformans en
LCR o suero.
Preparación de la muestra:
LCR
Recolectar de manera estéril y centrifugar 1000 rpm por 15 minutos. Para la
prueba de aglutinación se utiliza el sobrenadante. Si no se procesa inmediatamente,
refrigerar a 4ºC o congelar
Suero
La muestra se recoge sin sobrenadante. Si no se procesa inmediatamente,
refrigerar a 4ºC o congelar
Procesamiento
Según indicaciones del equipo comercial
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SEROLOGÍA. INMUNODIFUSIÓN DE OUTCHERLONY
Fundamento
Con esta técnica se detectan cualitativa y semicuantitativamente anticuerpos para
diagnóstico de Histoplasmosis, Paracoccidioidomicosis, Coccidioidomicosis,
Candidiasis y Aspergilosis
Preparación de la muestra:
Extraer sangre sin anticoagulante
El paciente debe estar en ayunas
A todos los sueros que se utilizan en las pruebas serológicas se les agrega
mertiolate de sodio (1/10.000) o azida sódica (1/1.000) como conservadores. Si no
se usan de inmediato pueden guardarse en congelador (-20ºC) hasta el momento
de su empleo.
Procesamiento
Preparación de los portaobjetos:
Se diluye 1 ml de agar para inmunodifusión en 7 ml de agua destilada y se
coloca en baño de agua a 70 ºC.
Se cubren los portaobjetos perfectamente limpios y desengrasados con alcohol
con una película de esta preparación, se desparrama con el dedo para que quede rugoso
y se deja secar en la estufa de 37 ºC hasta que se forme una capa seca y opaca.
Luego se agregan entre 2.5 y 2.8 ml de agar para inmunodifusión sin diluir por
portaobjetos. Una vez solidificados se los colocan en cámara húmeda y se conservan en
heladera hasta el momento de su uso. Pueden guardarse hasta una semana en estas
condiciones.
Realización de la prueba:
Con un sacabocados de 4 mm, se cortan el agar de acuerdo con un esquema de 6
hoyos periféricos y uno central. Los cilindros de agar se retiran con aguja o espátula.
Se deben llenar primero los pocillos correspondientes a sueros y antisueros y
después de 30 a 40 minutos de difusión se colocan los antígenos. Todas las cavidades se
llenan hasta el borde.
Ejemplo de diseño de placa de inmunodifusión para la evaluación de la presencia de tres tipos de
anticuerpos diferentes. Se enfrenta al suero del paciente frente a tres antígenos y sus correspondientes
antisueros controles.
La incubación se hace a temperatura ambiente, en cámara húmeda, durante 72
Ag 2
Ac 1
Suero paciente
Ac 2
Ag 3
Ac 3
Ag 1
16
horas, pero es conveniente observar diariamente la reacción.
Finalizada la incubación, los portaobjetos se cubren con una solución de citrato
de sodio (pH 8.2) durante 2 horas con el objeto de hacer desaparecer los halos formados
por los sueros que dificultan la observación de las bandas de precipitación y para
eliminar las bandas producidas por una proteína llamada sustancia C.
Luego de ese lapso se vuelca el tampón y se procede a ver la existencia de
bandas de precipitación que indican presencia de anticuerpos precipitantes en el suero
estudiado. Es necesario colocar una fuente de iluminación debajo de la placa para la
mejor visualización de los resultados. En casos de pruebas positivas se debe realizar una
titulación, efectuando diluciones seriadas al doble y repitiendo la prueba.
Siempre se debe realizar una coloración final, sobre todo en casos de pruebas
negativas (para confirmarlas), y en casos de titulaciones; se observa que bandas muy
débiles se observan luego de esta maniobra.
Tecnica de coloración de bandas
Lavado: Sumergir la placa por 24 horas en solución fisiológica cambiándola
frecuentemente. Colocar papel de filtro encima del gel y dejar secar a 37ºC. Sacar el
papel.
Coloración: Sumergir en colorante de 10 a 20 minutos
Decoloración: Sumergir en solución decolorante el tiempo que sea necesario
(aproximadamente 10 minutos). Primero con decolorante usado y luego con una parte
del nuevo el cual es guardado para el primer paso de la coloración siguiente. Enjuagar
con agua y dejar secar.
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Pruebas de sensibilidad a antifúngicos
Las pruebas de sensibilidad tienen como objetivo conocer si los microorganismos
ensayados son sensibles o resistentes a los antimicrobianos y sirven para elegir de forma
óptima el tratamiento antifúngico.
Metodologías para la determinación de sensibilidad antifúngica
Existen dos procedimientos generales para determinar la sensibilidad de los
microorganismos a los antimicrobianos y estos son:
- Dilución en agar o caldo
- Difusión en agar
Dilución en agar o caldo
Se realiza la dilución del antimicrobiano en un medio de cultivo adecuado para el
crecimiento del microorganismo que se va a ensayar. Se inocula el microorganismo, se
incuba a una temperatura determinada y se determina la concentración del
antimicrobiano que produce la inhibición del crecimiento del microorganismo definida
como CIM (Concentración Inhibitoria Mínima).
Esta metodología puede realizarse en macroescala, utilizando tubos, o en
microescala, usando microplacas de 96 pocillos. La posibilidad de cuantificar la
actividad antifúngica a través de la determinación de la CIM es la principal ventaja de
los métodos de dilución ya que estos valores cuantitativos se pueden utilizar, junto con
la farmacocinética del antimicrobiano, para calcular índices terapéuticos.
Difusión en agar con disco
Se inocula el microorganismo en la superficie del agar y se deposita un disco con
una concentración conocida de antimicrobiano. Después de incubar a una temperatura
adecuada, se produce una zona de inhibición del crecimiento del microorganismo
alrededor del disco. Dependiendo del tamaño de la zona, se puede determinar si el
microorganismo es sensible, intermedio, indeterminado o resistente al antimicrobiano
ya que los diámetros tienen una relación inversa con la CIM. La principal ventaja de la
difusión con disco es el bajo costo unido a la simplicidad de la técnica y esto incluye
desde la realización, la lectura y en la mayoría de las ocasiones, la interpretación.
64 32 16 8 4 264 32 16 8 4 2 64 32 16 8 4 264 32 16 8 4 2
- Inoculación
- Incubación
CIM = 16 μg/mLDiluciones del antifúngico
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Estándares de Referencia
El Instituto de Estándares Clínicos de Laboratorio, CLSI (Clinical Laboratory Standards
Institute), desarrolló “Estándares de Referencia” que describen detalladamente los
parámetros experimentales para la correcta realización de ambos métodos para lograr,
de esta forma, una mayor exactitud y reproducibilidad de los resultados.
Métodos de dilución
Documento M27-A3: Método de referencia para determinar la sensibilidad de las
levaduras a los antifúngicos a través del método de dilución en caldo.
Introducción
El método que describe este estándar está pensado para evaluar levaduras de las
especies de Candida y Cryptococcus neoformans. No se aplica para evaluar la fase
levaduriforme de los hongos dimórficos como Histoplasma capsulatum. Para algunos
hongos filamentosos se puede utilizar el método de dilución descripto en el documento
M38-A2.
Medio de cultivo
El medio recomendado es completamente sintético: RPMI con glutamina, sin
bicarbonato y rojo fenol como indicador de pH.
Preparación del inóculo
Se parte de un cultivo de 24 h en Agar Sabouraud a 35ºC (48 h para Cryptococcus), se
tocan cinco colonias y se suspenden en 5 ml de solución fisiológica estéril. El resultado
de la suspensión se homogeneiza durante 15 segundos, y su turbidez se ajusta a 0,5 de la
escala McFarland (equivalente a 1 x 106 a 5 x 10
6 UFC). Para los métodos de dilución,
la suspensión se diluye 1:2000 con RPMI 1640 para obtener 0,5 x 103 – 2,5 x 10
3
UFC/ml.
Soluciones de antifúngicos
Las soluciones madre de los antifúngicos se preparan a concentraciones de al
menos 1280 μg/ml o 10 veces la concentración mayor ensayada en dimetilsulfóxido y
luego se diluyen en el medio de cultivo apropiado. El intervalo de concentraciones
elegidos para cada antimicrobiano debe incluir los puntos críticos, o sea aquellos que
definen si una cepa es sensible o resistente. Basados en estudios previos, se
recomiendan las concentraciones de antifúngicos que están recogidas en la siguiente
tabla.
Placa con medio de
cultivo inoculada
Discos conteniendo
antifúngicos
Halos de inhibición
incubación
Placa con medio de
cultivo inoculada
Discos conteniendo
antifúngicos
Halos de inhibición
incubación
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Antifúngico Intervalo (μg/ml)
Anfotericina B 16 - 0,03
5-fluorocitosina 64 - 0,12
Ketoconazol 16 - 0,03
Fluconazol 64 - 0,12
Itraconazol 16 - 0,03
Voriconazol 16 - 0,03
Posaconazol 16 - 0,03
Ravuconazol 16 - 0,03
Anidulafungina 16 - 0,03
Caspofungina 16 - 0,03
Realización de la técnica de microdilución Se utilizan placas de microdilución estériles de 96 pocillos. Se dispensan 100 μl de
los antifúngicos a una concentración 2x en las columnas de la 1 a la 10 con una pipeta
multicanal. La columna 1 contiene la concentración más alta del antifúngico (64 o 16
μg/ml) y la fila 10 la más baja (0,12 o 0,03 μg/ml). Cada pocillo de la placa se inocula
con 100 μl de la suspensión del inóculo. El pocillo 11 control de crecimiento, que solo
contiene 100 μl de RPMI 1640, se añaden 100 μl del inóculo. El pocillo 12 es control de
esterilidad de la técnica y por tanto debe contener solo RPMI.
Incubación
Candida spp. se debe de incubar, sin agitación, en atmósfera normal, a 35ºC durante 24-
48 horas y Cryptococcus neoformans, en las mismas condiciones durante 70-74 horas.
Lectura de los resultados
La CIM es la concentración más baja de antifúngico que inhibe sustancialmente el
crecimiento del microorganismo detectado visualmente. Se compara el crecimiento en
cada concentración de antifúngico con el crecimiento en el tubo control de crecimiento
y se califica de la siguiente forma:
0 = ópticamente claro
1 = ligeramente turbio
2 = disminución prominente de la turbidez
3 = ligera disminución de la turbidez
4 = sin disminución de la turbidez
La CIM para la anfotericina B, se define como la concentración más baja que tiene una
puntuación de 0 (ópticamente claro). Para la 5-fluorocitosina, los azoles y las
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12 0,06 0,03
Control de crecimiento
Control de esterilidad
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12
Control de crecimiento
Control de esterilidad
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12
Control de crecimiento
Control de esterilidad
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equinocandinas es la concentración más baja que tiene una puntuación de 2
(disminución prominente de la turbidez). Para aquellos aislamientos que producen
grumos en el fondo, la dispersión de los mismos pipeteando o agitando puede ayudar a
la interpretación de los resultados.
Puntos de corte (μg/ml) recomendados por el CLSI. Documento M27-A3
Antifúngico Sensible SDD Intermedio Resistente
Anfotericina B ≤1 ----- ----- > 1
Fluconazol ≤8 16-32 ----- ≥64
Itraconazol ≤0,125 0,25-0,5 ----- ≥1
5-fluorocitosina ≤4 ----- 8-16 ≥32
Voriconazol ≤1 2 ----- ≥4
Equinocandinas ≤2 ----- ----- -----
Control de calidad
Los objetivos del programa de control de calidad son evaluar:
1. la precisión y exactitud del procedimiento de ensayo.
2. si los reactivos, las condiciones del ensayo y las instrucciones utilizadas en el
procedimiento fueron adecuadas.
3. el personal que realiza las técnicas y lee los resultados.
Estos objetivos se alcanzan si se utilizan cepas de control seleccionadas por su
estabilidad genética y por su utilidad para controlar el método que se está ensayando.
Las cepas de control de calidad son evaluadas de la misma forma y se incluyen siempre
que se ensaye un aislado, se utilizan C. parapsilosis ATCC 22019 y C. krusei 6258, los
resultados obtenidos deben estar dentro del rango recomendado
Microorganismo Antifúngico Rango CIM
C. parapsilosis ATCC 22019
Anfotericina B 0,25 – 2
Anidulafungina 0,25 – 2
Caspofungina 0,25 – 1
5-fluorocitosina 0,06 - 0,25
Fluconazol 0,5 – 4
Itraconazol 0,125 - 0,5
Ketoconazol 0,03 - 0,25
Posaconazol 0,06 - 0,25
Ravuconazol 0,016 - 0,12
C. krusei ATCC 6258
Voriconazol 0.016 - 0.12
Anfotericina B 0,5 – 2
Anidulafungina 0.03 - 0.12
Caspofungina 0.12 – 1
5-fluorocitosina 4 – 16
Fluconazol 8 – 64
Itraconazol 0,12 – 1
Ketoconazol 0,12 - 1
Posaconazol 0,06 - 0,5
Ravuconazol 0,06 - 0,5
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Métodos de difusión
Documento M44–A Método de referencia para determinar la sensibilidad de las
levaduras a los antifúngicos a través del método de difusión en disco
El documento M44-A describe el método de difusión en agar para levaduras del género
Candida. Las pruebas en medio sólido y en especial las de difusión son simples de
realizar y los resultados se obtienen de forma rápida, y muy fáciles de interpretar.
Medio de cultivo
Se utiliza Agar Müeller-Hinton con 2% glucosa y 0,5 μg/ml Azul de Metileno. Las
placas de Petri deben de tener una profundidad de 4 mm. Es necesario secar la
superficie antes de utilizarlas, colocando las placas durante media hora, en la estufa de
37ºC boca abajo y con las tapas ligeramente abiertas para permitir que la humedad se
evapore.
Preparación del inóculo
Se emplea el procedimiento descripto anteriormente utilizándose la suspensión obtenida
en solución fisiológica con una concentración de 1 x 106 a 5 x 10
6 UFC.
Inoculación de las placas
Siembra por dispersión con hisopo
Se sumerge un hisopo de algodón estéril en el inóculo. El exceso de líquido es
eliminado girando el hisopo varias veces contra las paredes interiores del tubo. El
inóculo se extiende por toda la superficie de la placa 3 veces seguidas. En cada
repetición, se gira la placa 60º, de forma que se asegure la distribución uniforme del
inóculo.
Siembra por inundación
Se realiza una dilución 1/10 del inóculo, se extraen entre 2-4 ml y se vuelcan en la placa
de Petri. Se distribuyen homogéneamente por la superficie y el exceso de líquido se
retira con una pipeta Pasteur estéril. Se deja secar la superficie durante 15 minutos a
temperatura ambiente.
Antifúngicos
Los antifúngicos pueden colocarse en distintos reservorios: pocillos en el agar, cilindros
que contienen el antimicrobiano, tabletas o discos. La aparición del disco de papel de
filtro impregnado de antimicrobiano revolucionó esta técnica y en la actualidad es el
reservorio de elección para las pruebas de susceptibilidad. Las tabletas son también un
método muy utilizado que se encuentra disponible comercialmente.
Colocación de los discos de antimicrobiano
Los discos de antimicrobianos se deben colocar no más de 15 minutos tras la
inoculación de las placas, de esa forma la difusión y el crecimiento ocurren en
simultáneo. Se pueden aplicar con la ayuda de un dispensador o con pinza estéril. Para
asegurar un completo contacto se aconseja presionar el disco contra la superficie del
agar. Se deben de colocar al menos a una distancia de 15 mm del borde de la placa y
separados entre sí por una distancia de 24 mm. Esta disposición reduce la posibilidad de
superposición de zonas de inhibición, que dificulta la lectura e interpretación. Una vez
colocados en el agar, es importante no moverlos ya que la difusión comienza de forma
inmediata.
22
Incubación de las placas
Las placas inoculadas deben ser incubadas a 35 ± 2 ºC durante 20-24 y hasta 48 horas
en una posición invertida.
Lectura de las zonas de inhibición
El diámetro de cada zona de inhibición se mide con una regla, calibre, plantilla o
instrumental electrónico.
Interpretación de resultados
Los hallazgos se clasifican categorías (sensible, Intermedio, Sensible dependiente de
dosis, resistente) basándose en los puntos de corte que se establecieron mediante el
método de dilución en caldo, las concentraciones séricas que el antibiótico alcanza en
suero y la distribución de las CIMs para la especie estudiada.
Antifúngico Concentración Halo de inhibición (mm)
R* S-DD* S*
Fluconazol 25 μg ≤ 14 15-18 ≥ 19
Anfotericina B 10 μg ≤ 10 11-14 ≥ 15
Itraconazol 8 μg ≤ 10 11-14 ≥ 15
Ketoconazol 15 μg ≤ 20 21-27 ≥ 28
Voriconazol 1 μg ≤ 13 14-16 ≥ 17
*Susceptible: S; *Susceptible-dependiente de dosis: S-DD; *Resistente: R
Rangos de diámetros (mm) para las cepas control de calidad
Antifúngicos
Candida albicans
ATCC 90028
Candida parapsilosis
ATCC 22019
Candida krusei ATCC
6258
Fluconazol 28-39 mm 22-33 mm ∗
Anfotericina B 18-23 mm 20-26 mm 17-23 mm
Itraconazol 21-30 mm 19-26 mm 16-22 mm
Ketoconazol 31-42 mm 26-35 mm 22-29 mm
Voriconazol 31-42 mm 28-37 mm 16-25 mm
∗ Los rangos de control de calidad de estos aislamientos no han sido establecidos para
estos antimicrobianos debido a la extensa variabilidad inter laboratorio.
Etest (AB Biodisk)
Es una técnica cuantitativa. Consiste en la utilización de una tira de plástico que, en una
de sus caras, lleva un gradiente de concentración del antimicrobiano. Tras la incubación,
la intersección entre el crecimiento del microorganismo y la zona de inhibición en
forma de elipse indican la CIM.
23
24
APÉNDICE
PREPARACIÓN DE LÍQUIDOS DE MONTAJE
Gueguen:
Acido Láctico ......................................... 400 mg
Sudan III ................................................. 400 mg
Azul Cotton o de Porrier .......................... 400 mg
Se trituran en mortero Sudan III al que se agrega Acido Láctico, se mezcla y se deja
reposar durante 24 hs. Después de ese tiempo se filtra, se agrega el Azul Cotton
(previamente triturado) y 70 u 80 gotas de solución de Iodo Alcohólica, se conserva en
frascos color caramelo en la heladera.-
Hidróxido de potasio:
Hidróxido de Potasio .............................. 20 g.
agua destilada ......................................... 100 ml
Disolver el hidróxido de potasio en agua. Se conserva en frascos goteros.
Tinta china:
Tinta China ............................................. 2 ml.
Formaldehido .......................................... 2 ml.
Mezclar ambos componentes y colocar en frascos goteros.
Tinta parker:
Solución KOH al 10% ............................ 3 ml.
Tinta Parker ............................................ 1.2 ml.
Mezclar ambos componentes y colocar en frascos goteros.
Lugol
Iodo metaloide…………………………..20 g
Ioduro de potasio………………………..40 g
Agua destilada…………………………..1000 ml
Se mezcla en un mortero el Iodo metaloide con el Ioduro de potasio hasta la total
disolución, luego se agrega de a poco el agua destilada. Se conserva en frascos color
caramelo.
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
Agar sangre:
Agar Infusión Cerebro Corazón .............. 52g.
Agua destilada ......................................... 1000 ml.
Cloranfenicol ........................................... 100 ml.
Estreptomicina ......................................... 40 gotas
Sangre ...................................................... 6 a 10 ml.
Disolver el Agar Infusión Cerebro Corazón con el agua destilada.
Una vez disuelto agregar: el Cloranfenicol y la Estreptomicina.
Luego distribuir en frascos de 100 ml., se taponan y se precintan. Esterilizar 20’.
25
Cuando los frascos se enfrían hasta 50º se agrega la sangre a cada frasco repartir en
tubos de ensayo estériles, estirar en pico de flauta.
Dixon modificado:
Agar ........................................................ 12 g.
Agua destilada ......................................... 1000 -
Extracto de Malta..................................... 36 g.
Peptona .................................................... 6 g.
Bilis de Buey ........................................... 20 g,
Tween 40 ................................................. 10 ml.
Glicerol ................................................... 2 ml
Cicloheximida .......................................... 0,8 g.
Aceite de Oliva ........................................ 1 %.
Disolver el Agar con el agua destilada. Agregar los demás componentes, distribuir y
esterilizar 20’. Estirar en pico de flauta.
Lactrimel:
Harina común .......................................... 16 g.
Leche descremada.................................... 160 ml.
Leche descremada.................................... 21,3 g.
Agua destilada ......................................... 200 ml.
Agar ......................................................... 18 g.
Miel .......................................................... 8 g.
Cloromicetina .......................................... 0,200 g,
Mezclar la harina común, con 600 ml de agua destilada. Se deja en la heladera 24 hs.
Luego de ese tiempo se filtra el preparado con papel de filtro y se lleva a volúmen de
600 ml.
Una vez filtrado se deja y por otro lado se mide la leche descremada, filtrándola con un
cono de papel de filtro, un embudo y un colador.
Disolver el Agar con 300 ml. de agua destilada. Una vez disuelto se agrega el agua de
harina.
Por otro lado pesar en un vaso de precipitado la miel con una pequeña cantidad del
preparado anterior, se mide el pH que tiene que ser de 6,9. Se agregan la leche
descremada y la miel al preparado de Agar.
Por último disolver la Cloromicetina en un vaso de precipitado con una pequeña
cantidad del preparado, una vez disuelto se agrega al preparado de Agar y se deja todo a
baño de maría.
Cuando el preparado está bien disuelto se reparte en tubos de ensayo, se taponan, se
esteriliza 15’ y se estira en pico de flauta.
Mycosel:
Preparación tradicional
Glucosa .................................................... 10 g.
Neopeptona .............................................. 5 g.
Agar ......................................................... 10 g.
Cloranfenicol ........................................... 250 mg. + 5 ml. alcohol 95º
Cicloheximida .......................................... 250 mg. + 5 ml. acetona
26
Agua destilada ......................................... 500 ml.
pH 6,9.
Disolver el Agar con 300 ml. de agua destilada a baño de maría.
Disolver en el agua destilada restante, la Glucosa, la Neopeptona, tomar el pH que tiene
que ser de 6,9 y después agregar el Cloranfenicol + 5 ml. de Alcohol de 95º y la
Cicloheximida + 5 ml. de Acetona. Se agrega todo al preparado de Agar. Ditribuir,
esterilizar 20’ y estirar en pico de flauta.
A partir de droga comercial
Mycobiotic Agar ...................................... 35,6 g.
Agua destilada ......................................... 1000 ml.
Disolver el Mycobiotic Agar con el agua destilada. Distribuir. Esterilizar 20’. Estirar en
pico de flauta.
Sabouraud cloromicetina:
Sabouraud Glucosa .................................. 65 g.
Solución de Cloranfenicol ....................... 100 ml.
Agua destilada ........................................ 1000 ml.
Solución de Cloranfenicol:
Cloromicetina ......................................... 1 g.
Alcohol .................................................... 200 ml.
Mezclar los componentes.
Conservar en frasco color caramelo.
Disolver el Sabouraud Glucosa en el Agua destilada. Agregar la solución de
Cloranfenicol. Distribuir en tubos de ensayo, taponar, esterilizar 20’ y estirar en pico de
flauta.
Sabouraud glucosa:
Preparación tradicional
Agar ......................................................... 20 g.
Peptona de Carne ..................................... 10 g.
Glucosa .................................................... 40 g.
Agua destilada ......................................... 1000 ml.
Disolver el Agar en 700 ml. de agua destilada. En los 300 ml. restantes de agua
destilada disolver la Peptona de Carne y la Glucosa. Mezclar todos los componentes,
distribuir en tubos de ensayo, taponar, esterilizar 20’, estirar en pico de flauta.
Luego se mezclan los dos componentes y se distribuye en tubos de ensayo, se taponan y
se autoclavan 20´.- Se estiran en pico de flauta.-
A partir de droga comercial
Sabouraud Glucosa .................................. 65 g.
Agua destilada ........................................ 1000 ml.
Disolver el Sabouraud Glucosa en el Agua destilada. Distribuir en tubos de ensayo,
27
taponar, esterilizar 20’ y estirar en pico de flauta.
Agar Mueller-Hinton modificado
Mueller Hinton agar…………………….37 g
Glucosa…………………………………20 g
Solución stock de azul de metileno.……100µl
Agua destilada……………………c.s.p. 1000 ml
Solución stock de azul de metileno:
Azul de metileno………………………..0,1 g
Agua destilada………………………….20 ml
Disolver el Mueller Hinton con el agua destilada, se agrega los demás componentes. Se
esteriliza 15 minutos en autoclave. Se plaquea.
TECNICAS DE COLORACIÓN
May Grünwald – Giemsa
1. Cubrir con May Grunwald 3 minutos
2. Agregar 20 gotas (1 ml) de H2O estabilizada ( 1 ml de estabilizador en 50 ml de
H2O destilada) y dejar reposar 1 minuto.
3. Volcar bien el contenido
4. Cubrir con Giemsa diluido al 10% 15 a 20 minutos.
5. Lavar con H2O.
6. Dejar secar en posición vertical
7. Observar con aceite.
Nota: en materiales donde se imponga diagnóstico diferencial con Leishmania conviene
usar May Grunwald diluido ½ con agua de canilla en el momento, dejar actuar por 5
minutos. Omitir paso 2
Zhiel – Neelsen
Para esta coloración se debe usar siempre portaobjetos nuevos, bien desengrasados,
realizando sobre ellos frotis finos que dejen leer un escrito con cierta dificultad, pero
que pueda ser leído en forma borrosa
1. Cubrir el preparado indicado con un papel de filtro del tamaño el portaobjetos.
2. Cubrir con Fuscina fenicada. Calentar con antorcha por debajo del porta objeto
hasta desprender vapores (no debe hervir el colorante).
3. Repetir el paso anterior incorporando más colorante para evitar que se seque, se
repite el paso por 3 veces en 5 minutos.
4. Lavar con H2O.
5. Decolorar con alcohol clorhídrico por un tiempo de 1 minuto y no más de dos
veces.
6. Lavar con H2O.
7. Cubrir con agua y sobre ella incorporar Azul de Metileno 1 minuto.
8. Lavar con H2O.
9. Dejar secar en posición vertical.
10. Observar con aceite
Kinyoun
28
Para esta coloración al igual que ZN, se debe usar siempre portaobjetos nuevos, bien
desengrasados, realizando sobre ellos frotis finos que dejen leer un escrito con cierta
dificultad, pero que pueda ser leído en forma borrosa
1. Cubrir con Fuscina fenicada 3 minutos.
2. Lavar con H2O.
3. Decolorar con H2SO4 al 1%.
4. Lavar con H2O.
5. Cubrir con Azul de Metileno 30 segundos.
6. Lavar con H2O.
7. Dejar secar en posición vertical.
8. Observar con aceite
Giemsa prolongado (para materiales con sangre, como biopsias, esputos
sanguinolentos, etc)
1. Cubrir con Giemsa diluido 2 AL 5 % , por 10 minutos.
2. Volcar suavemente el contenido.
3. Cubrir nuevamente con Giemsa diluido 10 minutos.
4. Volcar suavemente el contenido.
5. Cubrir con Giemsa diluido 1 hora.
6. Lavar con H2O.
7. Dejar secar en posición vertical.
8. Observar con aceite
Variante Giemsa solo
Fijar el preparado con metanol por 5 minutos, dejar secar totalmente en posición
viertical
Cubrir con Giemsa diluido según tiempo de coloración destinado
Gram – Nicolle
1. Cubrir con Violeta de Genciana 1 minuto.
2. Lavar con H2O.
3. Cubrir con Lugol 1 minuto.
4. Lavar con H2O.
5. Decolorar con alcohol-acetona 10 segundos.
6. Lavar con H2O.
7. Cubrir con Fuscina fenicada 30 segundos.
8. Lavar con H2O.
9. Dejar secar en posición vertical.
10. Observar con aceite
Técnica de Tinción Azul de Toluidina Preparación de reactivos
Reactivo de Sulfatación
Acido Acético Glacial 45 ml
Acido Sulfúrico 15 ml
Reactivo Azul de Toluidina
Azul de Toluidina 0.16 gr.
Agua Destilada 60 ml
Acido Clorhídrico 2 ml
Alcohol Etílico Absoluto 140 ml
29
Preparación de la muestra a procesar: Lavado broncoalveolar: centrifugar a 2.500 rpm 5 min. Y realizar con el
sedimento al menos tres frotis
Esputo ó secreción bronquial: Agregar perlas de vidrio y dos o tres gotas
de hidróxido de sodio al 10 %. Realizar al menos 6 frotis.
Técnica de coloración 1. Reactivo de Sulfatación 10 minutos
2. Agua corriente bajo la canilla (lado opuesto al preparado) 1 minuto
3. Reactivo azul de toluidina 5 minutos o 10 minutos o mas según la antigüedad del
reactivo
4. Alcohol etílico al 95 % 10 segundos
5. Alcohol etílico puro 10 segundos
6. Alcohol etílico puro 10 segundos
7. Xilol (no es indispensable) 10 segundos
SEROLOGÍA
Gel de agar:
Agar Noble o bacto (Difco) o agar Oxoid Nº 3 ......... 1 gr
Polietilénglicol 6000 (Carbowax 6000) (PEG) ......... 1 gr
Cloruro de sodio ........................................................ 0.85 gr
Fenol .......................................................................... 0.3 ml
Buffer de fosfatos ...................................................... 1 ml
Agua destilada .......................................................... csp 100 ml
Buffer de fosfatos (pH 7.4).
M/15 Na2HPO4 .......................................................... 80.8 ml
M/15 NaH2PO4 .......................................................... 19.2 ml
Se prepara primero la solución salina fenolada. Se agregan simultáneamente el agar y el
PEG y se mezclan durante 5 minutos. Se lleva a baño de agua de 100ºC para su
disolución completa y por último se distribuye en tubos de ensayo a razón de 4 a 5 ml,
una vez solidificado el gel se los tapa y se los conserva a 4 ºC.
Buffer de citrato de sodio (pH 8.2):
Citrato de sodio ........................................ 5 mg
Solución fisiológica ................................. 100 ml
Colorante:
Coomassie brillant blue R (Sigma R-250) 0.30 gr
Solución decolorante ............................... 100 ml
Solvente:
Alcohol etílico ......................................... 40 ml
Ácido acético glacial ............................... 20 ml
Agua destilada ......................................... 40 ml
Al preparar el colorante, se debe disolver primero en el alcohol el Coomassie brillant
blueR, luego se agregan el acético y el agua juntos. Dejar madurar por lo menos una
noche con buena agitación. Guardar en frasco bien cerrado.
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