La Espectrometría de Masas:
una Técnica Clave en la
Investigación Biomédica,
Nutricional, Seguridad
Alimentaria,
Medioambiente,….
Jaume C. Morales
Especialista MS products
Flujos de Trabajo en
Análisis Comparativos por
Espectrometría de Masas.
Aplicaciones no “-ómicas” de las estrategias
de análisis metabolómico
26 de febrero de 2014
Página 2
Posibles Aplicaciones del Análisis Comparativo de
Muestras
¿Qué diferencias en su composición
química se correlacionan con las
diferencias observadas en
poblaciones semejantes?
¿Tienen
compuestos
químicos en
común?
¿Qué
compuestos
químicos
difieren en
concentración?
• Rápido crecimiento de las ciencias -ómicas
• Técnicas Clave utilizadas : Cromatografía, espectrometría de
masas en combinación con programas de análisis estadístico
• Areas donde el workflow de metabolómica ha tenido
expansión:
– Salud y patologías (clinical), nutrición, calidad alimentaria
– Descubrimiento de Biomarcadores (research)
– QC fermentaciones
– Biofueles “energías verdes”, investigación en granos y semillas
– Monitorización ambiental
• Aspectos críticos del enfoque :
– Preparación de muestra, automatización, protocolos…
– Identificación de los compuestos
– Integración de los resultados en un contexto biológico.
Metabolomics Workflow
ITP 2013
Metabolomics – Analisis Dirigido o No dirigido
Adquisición NO Dirigida – TOF / QTOF - GCMSD
• Perfilado de compuestos
• Enfoque de “descubrimiento”
• Traza de los compuestos a través de Masa, Rt y espectro MS
• Identificación de los compuestos tras análisis diferencial
• Utilización de bases de datos para Identificación
• Análisis de Rutas Metabólicas e Interpretación biológica
Adquisición Dirigida– QQQ
• Sólo compuestos conocidos
• Mayor sensibilidad que en el enfoque NO dirigido
• Cuantificación Absoluta (Patrones Ext e Int)
• Desarrollo de métodos SIM o MRM para cientos de compuestos
• Análisis de Rutas Metabólicas e Interpretación biológica
ITP 2013
Agilent 6000 Series LC/MS Portfolio
Infinity HPLC Range
Comprehensive Range of Software
6200 series TOF
6100 series Quad
6500 series Q-TOF
6400 series QQQ
Agilent 6000 Series LC/MS Portfolio
6200 series TOF
6100 series Quad
6500 series Q-TOF
6400 series QQQ
High Resolution - Qualitative
Low Resolution - Quantitative
Sin
gle
Stag
e Tan
dem
Stage
6400 Triple Quadrupole Mass Spectrometer
Feature Benefit
Dynamic MRM Extremely complex samples
Jet Stream Technology High sensitivity
Full autotune and calibration Easy to maintain
Broadest range of ion sources Multiple applications
Wide dynamic range Complex sample analysis
Fast polarity switching Analysis of multiple sample types
Dual Ion Funnel Highest sensitivity
6460 AJS
6420
• Focused analysis of small molecules e.g., organic chemistry • Natural product research • Pharmaceutical analysis such as BA/BE • DMPK studies • Quantitative analysis of compounds in high complexity backgrounds • Quantitative food safety analysis e.g., pesticides, drug residues • Clinical analysis e.g., endocrinology, new born screening • Peptide and metabolite quantitation
6460 ESI
6490
6500 True High Def Q-TOF Mass Spectrometer
Feature Benefit
True High-Def TOF High mass accuracy
Jet Stream Technology High sensitivity
Full autotune and calibration Easy to maintain
Broadest range of ion sources Multiple applications
Wide dynamic range Complex sample analysis
ChipLC Superb nano-spray applications
Dual Ion Funnel Highest sensitivity
6530
6540 • Proteomics including profiling and differential expression analysis • Protein identification – amino acid sequencing • Metabolomics profiling and identification • Quantitative analysis of compounds in low complexity backgrounds • Food safety analysis e.g., screening • Natural product analysis
6550
Cuellos de Botella en Metabolomica
2009 ASMS Metabolomics Survey Results
http://metabolomics.us/2009/ASMSMetabolomicsWorkshop/SurveyResults/
81% de los encuestados
afirman que los retos se
encuentran en el software
NO en el hardware
1. Identifi. de compuestos– 35%
2. Significado Bilogico – 27%
3. Procesado de datos – 14%
4. Análisis estadístico – 5%
Agilent Metabolomics Workflow G
CM
S
CE
/LC
MS
Separate &
Detect
CE-LC-TOF/QTOF
CE-LC-QQQ
Feature
Finding
MassHunter Qual Find by
Chromatogram
Deconvolution
MassHunter Qual MFE,
Find by Formula,
Find by Ion
Alignment &
Statistics
Mass Profiler
Professional
(MPP)
Identify
ID Browser
Mass Profiler
(MP)
Pathways //
Profiling
Pathway
Architect
Profiling
NM
R
ICP
-MS
Metabolómica
Análisis comparativo de metabolitos
endógenos encontrados en muestras
biológicas:
• Compara dos o más grupos biológicos
• Busca e identifica potenciales
biomarcadores
• Da significado a las rutas biológicas
• Descubre nuevos metabolitos
Los metabolitos son los subproductos
de la actividad enzimática
• Rango de propiedades físico-quimicas
• Clases: Amino acidos, Azucares, Acidos
Organicos, Acidos grasos, Lípidos…
¿Cuales son los cambios
químicos que resultan en
diferencias observables?
GeneSpring Software Platform Statistical and Visualization Tool with Pathway Analysis
LC/MS
GC/MS
MassHunter
Qual/Quant
Microarrays Feature
Extraction
GeneSpring
Platform
Pathway
Architect
• Commitment to the GeneSpring platform systems biology software
Abundance
color key
Average compound abundance
by sample group
ITP 2013
Perfilado en el Campo Alimentario
Perfilado de alimentos(def.) – Procesado de datos de espectros de MS de dos o más muestras de alimentos para discernir los compuestos que tienen una concentración estadísticamente diferencial.
Perfilado de Alimentos
Autenticidad
Degradación
Proceso Producción
Agilent Metabolomics Workflow G
CM
S
CE
/LC
MS
Separate &
Detect
GC/MSD
GC-QQQ
CE-LC-TOF/QTOF
CE-LC-QQQ
Feature
Finding
MassHunter Qual Find by
Chromatogram
Deconvolution
MassHunter Qual MFE,
Find by Formula,
Find by Ion
Alignment &
Statistics
Mass Profiler
Professional
(MPP)
Identify
ID Browser
Mass Profiler
(MP)
Pathways //
Profiling
Pathway
Architect
14
Prediction
Model
JAPAN
Country B
Country C
Country A
ITP 2013
Agilent Metabolomics Workflow G
CM
S
CE
/LC
MS
Separate &
Detect
CE-LC-TOF/QTOF
CE-LC-QQQ
Feature
Finding
MassHunter Qual Find by
Chromatogram
Deconvolution
MassHunter Qual MFE,
Find by Formula,
Find by Ion
Alignment &
Statistics
Mass Profiler
Professional
(MPP)
Identify
ID Browser
Mass Profiler
(MP)
Pathways //
Profiling
Pathway
Architect
Profiling
NM
R
ICP
-MS
Avanzado Algoritmo de Deconvolución “LC/MS Mass
Hunter Molecular Feature Extractor” para obtener por la
Masa Exacta de ”todos” los Compuestos Ionizados en la
Muestra Espectros Deconvolucionados
TIC IC’s 0
Forma parte del soft. de TOF y Q-TOF
Página 16
LC/MS-QTOF Page 17
Fácil y Rápida Detección e “Identificación”: Ejemplo M.F.E.+M.F.G.: 400 Compuestos en Miel en 5 min*!
Detailed
Formula
Generation
Results
Lista de
compuestos con
las fórmulas
moleculares
calculadas
Espectro de masas
del compuestos
superpuesto con el
patrón del pefil
isótopico teórico.
Resultados
detallados del
cálculo la fórmula
molecular
Superposición de
cromatogramas de
los compuestos
encontrados
*B.03: Mucho menor con
versiones actuales de software.
Agilent Metabolomics Workflow G
CM
S
CE
/LC
MS
Separate &
Detect
CE-LC-TOF/QTOF
CE-LC-QQQ
Feature
Finding
MassHunter Qual Find by
Chromatogram
Deconvolution
MassHunter Qual MFE,
Find by Formula,
Find by Ion
Alignment &
Statistics
Mass Profiler
Professional
(MPP)
Identify
ID Browser
Mass Profiler
(MP)
Pathways //
Profiling
Pathway
Architect
Profiling
NM
R
ICP
-MS
Mass Profiler Profesional: Herramientas de Comparación Estadística de Conjuntos de Muestras
Análisis
Estadístico
Admite Experimentos:
• Estudios simples (A vs. B) y complejos (n Variables)
• Estudios en función del tiempo, de condiciones múltiples, de dosificaciones varias, ….
• Clasificación (/ Autentificación) de muestras
Proporciona Muy Potentes Herramientas Estadísticas y de Visualización Comparación: • Filtrado simple (test de frecuencia)
• Test de relevancia (t-test, ANOVA 1 o 2 vías)
• Análisis de Componentes Principales (PCA)
• Agrupación (“Clustering” K-means, SOM, QT clustering),
• Predicción de Clases (K-nearest neighbors / SVM)
• Árboles jerárquicos Complete, average and single linkage (w. bootstrapping)
• Gráficos Volcano, Diagramas de Venn, ……
• Incluye Herramientas de visualización de datos (cromatogramas, espectros,…)
• Permite exportar la lista de iones precursores para realizar MS/MS y confirmar la identificación de los metabolitos de interés con Q-TOF’s de Agilent.
“Mass Profiler Profesional”: Ejemplo
combinación de Análisis de PCA con ANOVA
Proporciona una mucha mejor diferenciación
de clases
3 Ensayos con Arroz salvaje 4 Ensayos con Arroz transgénico 1
2
3-INF
4
5
6-RES
7-INF
3-INF
7-INF 6-RES
5
2
3-INF 7-INF
6-RES
5
2
mod. genet.
“bacteria salvaje”
“control”
“sin tratar”
+info: Nota de Aplicación Metabolomic Profiling of Bacterial Leaf Blight in Rice: 5989-6234EN
LCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/mta
ANOVA replicados 564 estadísticamente fiables
Permitiría evaluar si un tratamiento tiene un claro impacto en la composición de una muestra
Página 20
Ejemplo de Importación Genérica
de Datos de Equipos NO Agilent
21
Importación Genérica para equipos NO
Agilent: *.xls, *.xlsx, *.TXT or * .CSV fileS
Simplemente se requiere un fichero con algún parámetro identificativo de cada compuesto y la respuesta para cada muestra de cada compuesto
Parámetros identificativos Respuestas para cada muestra y compuesto
Agilent Metabolomics Workflow G
CM
S
CE
/LC
MS
Separate &
Detect
CE-LC-TOF/QTOF
CE-LC-QQQ
Feature
Finding
MassHunter Qual Find by
Chromatogram
Deconvolution
MassHunter Qual MFE,
Find by Formula,
Find by Ion
Alignment &
Statistics
Mass Profiler
Professional
(MPP)
Identify
ID Browser
Mass Profiler
(MP)
Pathways //
Profiling
Pathway
Architect
Profiling
NM
R
ICP
-MS
Bases de Datos (PCD) y Bibliotecas de MS/MS (PCDL)
con Masa Exacta para Identificación y “Screenings”
Masivos por LC/MS-TOF/QTOF
Accurate Mass PCDBs and MS/MS
PCDLs METLIN Metabolite
PCDL 24,768 entries plus 8,712 MS/MS spectra for
2,286 metabolites
METLIN Metabolite
PCD 24,768 entries
Forensics/Tox * PCDL
7,360 entries plus 8,263 MS/MS
spectra for 2,720 compounds
Forensics/Tox * PCD
7,360 entries
Pesticide PCD*
1,609 entries
Identificación y “Screenings” Masivos para aplicaciones
forenses/toxicológicas, seguridad alimentaria y
medioambiental, estudios metabolómicos,…..
*Kits de aplicaciones disponibles
Los TOF y QTOF facilitan mucho la ampliación del alcance del laboratorio
(nº compuestos a monitorizar).
Muy Fiable Análisis Dirigido: “Find by Fórmula”
Basta crear un fichero excel/csv con las fórmulas moleculares de interés a buscar
Elevada Fidelidad Isotópica
Teór.
Asignación Estructuras Moleculares: “Mass Structural
Correlation” (MSC):
Iones Espectro
MS/MS
Requiere la rotura
de más enlaces
mayor penalización
1.- MSC busca en internet posibles estructuras
asociadas a la fórmula molecular.
(p.e. Chemspider ≈ 30millones estructuras)
2.- MSC calculará el nº de enlaces que hay que
romper de la estructura del ión precursor, para
encajar con la fórmula de cada uno de los iones
producto. La probabilidad será mayor cuanto:
• menor sea el nº de enlaces a romper.
• menor nº de dobles enlaces a romper.
• … También se puede utilizar para
confirmar una estructura propuesta.
Página 25
Ejemplo Rapidez Asignación Estructuras Moleculares:
“Mass Structural Correlation” (MSC): 40 segundos
Page 26
Confidentiality Label
¿Que puede hacer la Metabolómica en
estudios Epidemiológicos, Biomédicos e
Investigación de Cancer ?
• Nuevos Biomarcadores para Pronostico/ Predicción de :
• Diagnóstico precoz de enfermedades y anticipación de terapias.
• Clasificación de pacientes para una mejor adecuación de la terapia adecuada.
• Determinación de efectos secundarios/toxicidad de los nuevos fármacos en las rutas metabólicas.
• Estudio del Impacto en el Metaboloma de una enfermedad, dieta, tratamiento, resistencia a un fármaco,…. para determinar :
• ¿Que ruta(s) metabólica(s) son alteradas ?
• ¿Que cambios específicos se producen en la ruta?
• …..
La Metabolómica puede ayudar en la evolución de una medicina
Predictiva, Preventiva, Personalizada
Page 28
COS Center for Omic Sciences http://www.omicscentre.com/
1er premio posters
Metabolomic Profiling
Florencia-2010 Agilent
Agilent LC/TOF+GC/MSD
Page 30
DNA
RNA
CH2OH
Metabolites
Proteins
GENÓMICS
TRANSCRIPTÓMICS
PROTEÓMICS
Proceso Biológico Clásico
METABOLOMICS
Page
30
“Omics”
DNA RNA Protein Metabolite
What is the “common coordinate” that
enables integrative analysis?
Page 32
DNA RNA Protein Metabolite
RNA Protein Metabolite
RNA Protein Metabolite
DNA
DNA RNA
Protein
Protein Metabolite
DNA RNA Protein Metabolite
El Reto de la Biología
DNA RNA Protein Metabolite
RNA Protein Metabolite
RNA Protein Metabolite
DNA
DNA RNA
Protein
Protein Metabolite
DNA RNA Protein Metabolite
“-Omicas” Procesos Biológicos
Enfoque Biológico
Clásico Enfoque “Biológía Integrada”
Interpretive value comes from integrating
diverse measurements within their biological
context
Looking at results from individual
disciplines describes only part of the
picture.
Common Reference: Pathway Representation
R
R
Gen B
Gen A
Gen X
HO
Sources
• WikiPathways
• KEGG
• BioCyc/MetaCyc
• Generalized BioPax
WikiPathways
Platforms
• GeneSpring
• IPA
• MetaCore
• others….
R
R
HO
Gene B
Gene A
Gene X
• Identifica porqué la ruta está activa
• Sugiere posteriores experimentos
Page 37
Proteomics Transcriptomics
Genes mRNA Proteins Metabolites
Genomics Metabolomics
Nuestro Enfoque de la Biología Integrada (IB)
(/Systems Biology) y nuevo de la Proteómica
TARGET UNTARGET UNTARGET
Multi-omics approaches helps a lot to reduce “biological samples noise” due to its high diversity.
Página 38
2 Tipos de Estudios Metabol/Prote-ómicos: Genéricos y Específicos
Comparación de
Perfiles Genéricos del
Metaboloma (metabolitos y péptidos
conocidos + desconocidos)
Se trabajará con MS (TOF/QTOF) en modo
espectral con masa exacta
Típico para Descubrimiento de
Nuevos Biomarcadores
Comparación de Perfiles Específicos (metab./pépt. concretos)
Se trabajará con MS (QTOF/QqQ) en modo
MS/MS o en MS en modo selectivo
Típico para Validación de Biomarcadores
Cambios en ciclos concretos del metabolismo
LC/MS-QTOF
GC/MS-QTOF
LC/MS-QqQ
GC/MS-QqQ
De los iones a las rutas metabólicas
Enfoque “Discovery” - No dirigido
• Este enfoque empieza por la deconvolución de posibles
compuestos seguido de un análisis estadístico, identificación
de metabolitos y análisis de rutas metabólicas.
Feature Extraction Pathway Analysis Filtering and Statistics Identify
De los iones a las rutas metabólicas
Enfoque “Discovery” - No dirigido
• Al empezar con datos puros, se realiza uma deconvolución para extraer y expresar señales iónicas como abundancia química.
• El anáiliss estadístico y de rutas metabólicas se puede realizar tan sólo cuando se han extraído el listado de compuestos.
• Cuando se realiza un enfoque de éste estilo sin conocimiento previo de los compuestos nos referimos a él como un enfoque NO Dirigido. “Untargeted feature extraction”
Feature Extraction Pathway Analysis Filtering and Statistics Identify
De los iones a las rutas metabólicas
Enfoque “Bajo Hipotesis” - Dirigido
• Si se dispone de una base de datos de metabolitos
conocidos de interés de los cuales se quiere sacar
información, nos referimos a él como un enfoque “Targeted
feature extraction”
• No es necesaria una etapa de Identificación. Simplemente
mapear las rutas.
Feature Extraction Pathway Analysis Filtering and Statistics
Abundancias Diferenciales de 3 Metabolitos de la Ruta de la Arginasa (Ciclo Urea) en Eritrocitos infectados por Malaria.
Página 42 15-10m
Rojo: Eritrocitos INFECTADOS
Azul: Eritrocitos NO INFECTADOS
Ver en que rutas metabólicas
están involucrados los
metabolitos relevantes del estudio
diferencial y cómo cambian.
Eritrocitos INFECTADOS // NO INFECTADOS
Pathways Drives the Next Experiment
By discovering a pathway with one Agilent technology, we can
continuously reinforce, revisit and refine the hypothesis with
complementary Agilent solutions
Página 44
2 Tipos de Estudios Metabolómicos: Genéricos y
Específicos
Comparación de Perfiles Genéricos del
Metaboloma (metabolitos conocidos
+ desconocidos)
Se trabajará con MS (TOF/QTOF) en modo
espectral con masa exacta
Típico para Descubrimiento de
Nuevos Biomarcadores
Comparación de Perfiles Específicos (metabolitos concretos)
Se trabajará con QqQ/QTOF en modo
MS/MS o en MS (QTOF/TOF) en modo
selectivo (masa exacta)
Típico para Validación* de Biomarcadores
Cambios en ciclos concretos del metabolismo
*Se corroborarán los resultados de PCA con perfiles específicos de un elevado
nº de individuos.
LC/MS-QTOF
LC/MS-QqQ
• What is the Next Experiment?
protein mRNA
DNA metabolite
metabolite
• Transcription
al regulation?
• Splice
variants?
• Missense or
nonsense
mutation?
• Translational
regulation?
• Differential
PTM?
• Known
agonists or
antagonists?
From a
metabolic
pathway I’ve
identified…
• What is the Next Experiment?
protein mRNA
DNA metabolite
metabolite
From my
proteomics data…
• Any metabolic
changes?
• Any
compensatory
pathways?
• Is mRNA expression
correlated?
• Was this a
splice variant?
• Any deviations from my
FASTA protein
sequence?
• Correlation to
any GWAS?
• Disease gene
panels?
• Pathogenic
variants?
• What is the Next Experiment?
protein mRNA
DNA metabolite
metabolite
From my
RNA-Seq or
array data…
• Loss/gain of
function?
• Differential
PTM?
• Change in
interactions?
• Any metabolic
changes?
• Any
compensatory
pathways?
• Any disease
gene panels?
• Any pathogenic
variants?
From my
DNA data…
• What is the Next Experiment?
protein mRNA
DNA metabolite
metabolite
• Coordinated
expression
changes for
affected gene
panels?
• Compensatory
changes in
miRNA?
• Loss/gain of
function?
• Differential
PTM?
• Change in
interactions?
• Any metabolic
changes?
• Any
compensatory
pathways?
De los iones a las rutas metabólicas
Resumen
• MPP cubre las etapas de software necesarias para llegar de análisis de los iones a las rutas metabólicas
• El análisis de rutas metabólicas está diseñado para poder dar una respuesta de relevancia biológica a los datos obtenidos.
• La Biología Integrada también permite formular experimentos posteriores.
Feature Extraction Pathway Analysis Filtering and Statistics Identify
Agilent
Solutions
Herramientas Quimiométricas
para el perfilado en
aplicaciones alimentarias con
Mass Profiler Professional
(MPP) Software
54
Agenda
56
Enfoque Metabolómico
Introducción al “Food Profiling”
Autenticidad
Degradación de alimentos
Desarrollo del producto
Agilent Metabolomics Workflow G
CM
S
CE
/LC
MS
Separate &
Detect
CE-LC-TOF/QTOF
CE-LC-QQQ
Feature
Finding
MassHunter Qual Find by
Chromatogram
Deconvolution
MassHunter Qual MFE,
Find by Formula,
Find by Ion
Alignment &
Statistics
Mass Profiler
Professional
(MPP)
Identify
ID Browser
Mass Profiler
(MP)
Pathways //
Profiling
Pathway
Architect
57
Profiling
ITP 2013
NM
R
ICP
-MS
GeneSpring Software Platform Statistical and Visualization Tool with Pathway Analysis
LC/MS
GC/MS
MassHunter
Qual/Quant
Microarrays Feature
Extraction
GeneSpring
Platform
Pathway
Architect
• Commitment to the GeneSpring platform systems biology software
58
Abundance
color key
Average compound abundance
by sample group
ITP 2013
Agilent Metabolomics Workflow G
CM
S
CE
/LC
MS
Separate &
Detect
GC/MSD
GC-QQQ
CE-LC-TOF/QTOF
CE-LC-QQQ
Feature
Finding
MassHunter Qual Find by
Chromatogram
Deconvolution
MassHunter Qual MFE,
Find by Formula,
Find by Ion
Alignment &
Statistics
Mass Profiler
Professional
(MPP)
Identify
ID Browser
Mass Profiler
(MP)
Pathways //
Profiling
Pathway
Architect
59
Prediction
Model
JAPAN
Country B
Country C
Country A
ITP 2013
Statistical Analysis: Mass Profiler Professional
Designed for Mass Spectrometry data
Import, store, and visualize
• Agilent CE-LC/MS TOF, QTOF, and QQQ
• Agilent GC/MS Quad, QQQ, and QTOF
• Agilent ICP/MS
• Agilent NMR
• Generic file format import
Performs many types of statistical analysis
• ANOVA, clustering, PCA, class prediction tools
ID Browser for compound identification
Pathway Architect for biological contextualization
60 ITP 2013
Agenda
61
Enfoque Metabolómico
Introducción al “Food Profiling”
Autenticidad
Degradación de alimentos
Desarrollo del producto
Introducción al “Food Profiling”
Preguntas que el análisis tradicional de contaminantes no puede responder :
• ¿Este vino es Cabernet o Pinot noir?
• ¿Este aceite es realmente de Oliva Virgen Extra?
• ¿Este arroz es de Japón o de algún otro sitio?
• ¿Como afecta a mi producto los cambios en el proceso de elaboración o fermentación?
Para poder dar respuesta a estos interrogantes necesitamos Food Profiling
63
Introducción al “Food Profiling”
Perfilado en el Campo Alimentario
Perfilado de alimentos(def.) – Procesado de datos de espectros de MS de dos o más muestras de alimentos para discernir los compuestos que tienen una concentración estadísticamente diferencial.
Perfilado de Alimentos
Autenticidad
Degradación
Proceso Producción
Agilent’s Solution:
MassHunter Mass Profiler Professional (MPP)
Agilent Sample Class
Predictor (SCP)
Software Solution for
Automated Rule Based
Sample Classification
66 ITP 2013
Introduction to Food Profiling How MPP Performs Sample Class Prediction (SCP)
Step 1. Develop a Prediction Model
Test a range of qualified samples to create a prediction model
• Different wine varietals
• Rice grown in different regions
• High quality and low quality or degraded food
February 26, 2014 67 ITP 2013
SCP - Step 1: Prediction Model Generation
• The front-end of the class prediction model generation is consistent with standard chemometric profiling workflows
• After data is acquired and imported, a class prediction model is built inside MPP
• Each model’s internal parameters can be exported to a sample class prediction model file (.SCP)
Acquisition Feature Extraction Chemometric
Analysis
Model
Prediction Model
Available Class Prediction Algorithms
• Partial Least Squares Discrimination
• Naïve Bayes
• Decision Tree
• Support Vector Machine
• Neural Network
68 ITP 2013
Agenda
69
Enfoque Metabolómico
Introducción al “Food Profiling”
Autenticidad
Degradación de alimentos
Desarrollo del producto
Tests de Autenticidad Uso del Sample Class Prediction
Ejemplos de test de Autenticidad:
• Tipo de producto
• Variedad del vino (uva)
• Zumo puro vs. zumo de mezclas
• Punto de Origen (¿En que país o
región ha crecido?)
• Grado de calidad
• Aceite Oliva Virgen Extra vs. Otros…
71
Authenticity: Food Type Determining Wine Varietal by LC/MS
• 45 red wine samples used to create a prediction model
• 15 Cabernet
• 16 Merlot
• 14 Pinot Noir
• Wines sampled varied in geographic origin and vintage
• 5 additional wines which were not part of the original sample set were correctly classified using model
72
Application note 5990-8451
Authenticity: Point of Origin Testing Rice Origin with ICP-MS
February 26, 2014 73
JAPAN
Country B
Country C
Country A
Agricultural products
absorb metals contained
in soil and water
Elemental composition in
agricultural products
from different regions
reflect composition in soil
from their region of origin
ITP 2013
Authenticity: Classification Verifying Olive Oil Grade by GC/MS
• Standards exist for classifying
Extra Virgin Olive Oil (EVOO)
• Sensory tests are often used to
qualify EVOO, but are
expensive and subjective
• Prediction model created in
MPP based on known EVOO
samples
• “Pass/Fail” model set up to
accurately determine whether
Olive Oil samples could be
labeled Extra Virgin
February 26, 2014 74
Pass/Fail
ITP 2013
Agenda
75
Enfoque Metabolómico
Introducción al “Food Profiling”
Autenticidad
Degradación de alimentos
Desarrollo del producto
Degradación del alimento Creación de un análisis dirigido para identificar
la degradación
Las condiciones ambientales durante el transporte y
almacenaje de un producto alimentario pueden mermar su
estado y degradarse.
• El análisis de productos degradados permite identificar
compuestos que son Indicadores o Marcadores de la calidad
o degradación.
• Esto permite la creación de un método de análisis dirigido de
los marcadores que permite aceptar o rechazar materia
prima o producto final basado en la calidad.
77
Degradación del alimento Sake (Licor Japonés) por GC/MS
Una muestra de Sake de buena calidad se divide en 2 viales
• La muestra de referencia (control) se refrigera
• La otra muestra se somete a luz UV y se analiza tras 1 semana y
otra vez tras un mes de exposición.
• El acido piruvico se identifica como buen marcador de la
degradación.
February 26, 2014 78
Increasing entities Decreasing entities
down up
1 week
1 month
Reference
Compuesto menguante: Pyruvic acid (m/z=174)
ITP 2013
Agenda
79
Enfoque Metabolómico
Introducción al “Food Profiling”
Autenticidad
Degradación de alimentos
Desarrollo del producto
Desarrollo del Producto Caracterización de la Calidad o Propiedades
Algunos productos alimentarios como la cerveza y el vino estan experimentan cambios con el tiempo “envejecimiento”. Este paso del tiempo en ocasiones provoca efectos no deseados pero en otros casos mejora el producto.
• Identificación de los compuestos presentes en el producto deseado
• Optimización del proceso de producción y almacenaje para potenciar el efecto deseado y atenuar el NO deseado.
Algunos investigadores en alimentación buscan las propiedades genéticas de un alimento para poder entender sus efectos beneficiosos y los efectos medicinales que provocan en un organismo.
• Comparación de muestras normales frente a aquellas que provocan un efecto beneficioso. (Nutracéuticos)
• Examinar diferencias genéticas y realizar una análisis de rutas metabólicas para entender los mecanismos biológicos relacionados.
81
Desarrollo del Producto Caracterización de cerveza por LC/MS
• Los cromatogramas TIC parecen similares a lo largo de los días de envejecimiento
• Un análisis Multivariante utilizando MPP reveló compuestos que sí variaban durante el envejecimiento
• Si extraemos los EIC de éstos compuestos percibimos cambios de más de > 10x en los compuestos de interés después de 14 días de envejecimiento
82
Day 0
Day 5
Day 2
Day 8
Day 14
2 x10
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1 1
2 x10
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
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Counts (%) vs. Acquisition Time (min) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
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Day 0
Day 2
Day 5
Day 8 Day 14
Introducción al “Food Profiling”
Perfilado en el Campo Alimentario
• MPP Test de Calidad y Autenticidad en el campoo Alimentario
• Se aplican modelos estadísticos a dos más grupos de muestras
• Los enfoques y algoritmos automatizados producen resultados claros y simples con el mínimo tiempo y esfuerzo.
• La disponibilidad de potentes herramientas como el análisis de rutas metabólicas lleva la investigación alimentaria a niveles superiores para una mayor comprensión y entendimiento del efecto de los alimentos en los organismos.
Perfilado de Alimentos
Autenticidad
Degradación
Proceso Producción
Agilent’s Solution:
MassHunter Mass Profiler Professional (MPP)
Folleto MPP Aplicado a Alimentación
Page 85
Confidentiality Label
Publicación: 5991-0900EN
Control calidad
y Origen materias primas
todo tipo de fábricas