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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALBIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
FCEyNFCEyN--INTIINTI
Materia de Especialización CEBI_E13Técnicas de formulación y
estabilización de biomateriales
Docente a cargo: Pilar BueraColaboradores: Florencia Mazzobre, Patricio Santagapita
Desarrollo del curso
22/04: Aspectos básicos de las formulaciones para conservación de biomoléculas y microorganismos.
Transiciones de fase y estado. Problemas 1 a 3.
29/04: Metodología para la caracterización de las transiciones. Problemas 4 a 8.
06/05 Procesos de congelación y liofilización. Problemas 9 a 11.
13/05: Secado por aspersión. Encapsulación. Demostraciones prácticas. Problemas 12, 13
20/05 Teórica. Isotermas de sorción de agua Problemas 14 a 18.
02/06: Estabilidad/reacciones de deterioro. RMN. Problemas 20-22.
05/06: TP. Revisión de problemas. Discusión general.
16/06 examen integrador.
•Aspectos básicos de las formulaciones paraconservación de biomoléculas y microorganismos.•Transiciones de fase y estado. •Metodología para la caracterización de lastransiciones.
1ª parte.
Ciencia de Materiales
AspectosEstructurales
Ciencia dePolímeros
Estabilidad de biomoléculas
2
Aplicaciones
Medicina Biotecnología
TecnologíaFarmacia
Biología
embriones
enzimascélulas
anticuerposliposomas
hormonas
Objetivo Objetivo
obtener biomolbiomolééculasculas conservablesconservables a a largo plazo, con actividad largo plazo, con actividad recuperablerecuperable..
Para ello:deben estar inhibidas las reacciones
químicas y biológicas que son responsables de la degradación.
Debe conservarse la estructura físicay funcionalidad
Mapa de estabilidad y aW
Opciones:
Congelación
Deshidratación
3
PeroPero……QuQuéé pasa si las pasa si las biomolbiomolééculasculas quedan quedan en ambientes restringidos de agua?en ambientes restringidos de agua?Puntos crPuntos crííticos:ticos:
•Membranas celulares
•Proteínas
En ambientes de humedad restringida las biomoléculassufren estrés causado por alteraciones en sus interacciones con el agua.agua.
La molLa moléécula de aguacula de agua es
altamente polar y noaltamente polar y no--lineal.lineal.
δ+ δ+
2δ−
4
La estructura y funcionalidad de biopolímeros está determinada en gran parte por su afinidad por el agua.
También el agua juega un papel decisivo en las estructuras celulares.
Los cambios en el estado físico del agua provocan alteraciones con distinto grado de irreversibilidad.
-El agua y la vida: mecanismos de protección en organismos vivientes en condiciones extremas de humedad y temperatura.
CCóómo se busca la solucimo se busca la solucióón?n?
1. Planteando c1. Planteando cóómo resuelve la mo resuelve la naturaleza el mantenimiento de la vida naturaleza el mantenimiento de la vida en condiciones extremas? en condiciones extremas? •Muy altas o muy bajas temperaturas
•Muy altas o muy bajas presiones
•Deshidratación
Los organismos que viven bajo condiciones des estrés hídrico o térmico tienen su bioquímica adaptada, o bien tienen los mecanismos que les permiten sobrevivir en estado de latencia hasta que las condiciones ambientales sean favorables:
Extremófilos
Criptobiotes
Anhidrobiotes
5
TardigradeTardigrade 500mm500mm
α, α -trehalosa
O
H
HO
H
HO
H
OHHH
OH
O
H
OH
H
OH
H
HO H
OH
H
O
CCéélulaslulas de de levaduralevadura3 ~ 8mm 3 ~ 8mm
ArtemiaArtemia salinasalina 0.1cm 0.1cm
O
H
HO
H
HO
H
OOHH
H
OH
H
HHO H
H OHO
OH
OH
SacarosaPlantasPlantas de la de la resurrecciresurreccióónn
PolenPolen
Plantas de la resurrección
Ej.Selaginella lepidophylla
AnhidrobiosisO
OCH2
OHOH
OH OH
OH
OH
CH2
OH
rafinosa
OCH2
OCH2OHOH
OH
OH
O
O
OCH2OH
OHOH
OH OH
OH
OH
CH2
OH
sacarosa
OCH2
β -fructofuranósidos
O
O
O
CH2OH
OHOH
OHOH
OH
OHCH2OH
α ,α- trehalosa
α-glucopiranósido
sacarosa
rafinosaβ-fructofuranósidos
SemillasSemillas
6
Lecciones de la Naturaleza:Lecciones de la Naturaleza:Solutos que acumulan organismos Solutos que acumulan organismos resistentes a la deshidrataciresistentes a la deshidratacióónn
Proteínas
Sales/aminoácidos
Azúcares
Contribuyen al ajuste osmótico
Puentes de H
Estabilización de proteínas y membranas
Medios de alta viscosidad
Capturan radicales libres
VidVidriosrios
Protector de proteínas
Protector de Protector de proteproteíínasnas
Protector de membranas
Protector de Protector de membranasmembranas
Pereira et al. Biophys J 2004
w.o. T, 200Cw.o. T, 52C
+ T 1M, 200C + T 2M, 200C
Efecto de trehalosa sobre membranas biológicas- Altas T
Totalmentehidratado
Parcialmentedeshidratado
Deshidratado
Totalmentehidratado
Parcialmentedeshidratado Deshidratado
7
DPPC en la región de estiramiento asimétrico del fosfato.
_ . _ DPPC seca ( 1258 cm-1)
--- hidratada ( 1229 cm-1)
___ seca con trehalosa ( 1227 cm-1)
Solutos protectores de biomoléculas
•Sacarosa.
•Manitol.
•Lactosa.
•Trehalosa.
•Sorbitol.
Propiedades estabilizantesde azúcares amorfos..
Inhibición de reacciones químicas
Protección de proteínas
Protección de membranas
Medios de alta viscosidad
Capacidad de interactuar por puentes H
Vidrio
No cristalino (vítreo o sobreenfriado)
}
Pasos para el desarrollo de sistemasde biomoléculas estables:
• Formulación
• Operación y control de proceso
• Evaluación de la calidad
• Estimación de la estabilidad
8
Principales aspectos:
•Características de los comp. activos del producto(proteínas, enzimas, pigmentos, membranas, microorganismos, etc.)
•Características de componentes del medio (biopolímeros, azúcares, sales, buffers)
•Proceso, equipos
•Acondicionamiento final de producto
•Estabilidad
Requerimientos:Requerimientos:
Las biomoléculas lábiles y estructuras deben ser :
• preservadas durante el proceso.
• preservadas durante su posterior almacenamiento.
• su actividad recuperable al rehidratar o descongelar.
Aspectos a considerar:
•Mecanismos involucrados
•Relación vitrificación estabilidad
Las Las transiciones de fase y estadotransiciones de fase y estado de las de las biomolbiomolééculasculas afectan su funcionalidad afectan su funcionalidad y pueden servir como y pueden servir como ííndice para ndice para predecir estabilidadpredecir estabilidad
Esencialmente corresponden a:Esencialmente corresponden a:
VitrificaciVitrificacióónn
Transiciones entTransiciones entáálpicaslpicas
9
VitrificaciVitrificacióónn
La estabilidad de muchas La estabilidad de muchas biomolbiomolééculasculasen medios congelados o deshidratados en medios congelados o deshidratados ha sido atribuida a la formaciha sido atribuida a la formacióón de n de vidrios.vidrios.
Matriz
Agua
Biomoléculas
Interacciones
VitrificaciVitrificacióón.n.
Los sLos sóólidos amorfos son materiales lidos amorfos son materiales metameta--estables estables con con alta viscosidadalta viscosidad y y baja movilidad molecularbaja movilidad molecular, , existen en un estado de existen en un estado de nono--equilibrio equilibrio yyexhiben cambios exhiben cambios dependientes del tiempodependientes del tiempo
a medida que se acercan al equilibrio.a medida que se acercan al equilibrio.Muchos cambios quMuchos cambios quíímicos y estructurales micos y estructurales ocurren muy lentamente en los sistemas ocurren muy lentamente en los sistemas vvíítreos, y no se perciben en marcos de treos, y no se perciben en marcos de tiempo prtiempo práácticos. cticos.
Vidrio (amorfo)
Demasiado quebradizo y muy alta Tm
Vidrio común
vidriosvidriosSiO2 en su estado cristalino: cuarzo
cristalcristal
10
El estudio de los El estudio de los vidriosvidrios se se realizrealizóó inicialmente en sinicialmente en sóólidos lidos inorginorgáánicos, y se desarrollnicos, y se desarrollóó en en ciencia de polciencia de políímeros, pero meros, pero sustancias como azsustancias como azúúcares cares pueden generar estructuras pueden generar estructuras vvíítreas y esttreas y estáán ampliamente n ampliamente relacionados con la estabilidad relacionados con la estabilidad de biomolde biomolééculas.culas.
El cambio en el estado fEl cambio en el estado fíísico que sufre un sico que sufre un material material amorfo vamorfo víítreotreo al pasar al estado de al pasar al estado de llííquido quido sobreenfriadosobreenfriado se conoce comose conoce comotransicitransicióón vn víítreatrea..
Esta transformaciEsta transformacióón ocurre a cierta n ocurre a cierta temperatura,temperatura, temperatura de transicitemperatura de transicióón n vvíítrea (Ttrea (Tgg),), que depende del contenido de agua que depende del contenido de agua y de las caractery de las caracteríísticas de cada sistema. sticas de cada sistema.
Los vidrios dejan de comportarse como sólidos amorfos cuando la temperaturasupera el valor de TTgg, temperatura detransición vítrea.
En este punto pierden la rigidez que los caracteriza y se tornan flexibles o gomosos.
En sistemas biológicos se le atribuye a este cambio efectos nocivos sobre su conservabilidad.
Colapso estructural por Colapso estructural por almacenamiento de muestras de almacenamiento de muestras de maltosa liofilizadas a temperaturas maltosa liofilizadas a temperaturas superiores a su Tsuperiores a su Tgg..
control Almacenada a T>Tg
11
Los diagramas temperatura/composición permiten mostrar la influencia de los solutos en las transiciones de fase del agua.
Por simplicidad solo se muestran los cambios de fase sólido/líquido, que son los que interesan en la liofilización.
Hay que considerar 2 casos:
•Sistemas en equilibrioen equilibrio con formación de eutéctico.
•Sistemas que forman vidriosforman vidrios fuera del equilibrio.Reid, 2006
Caso 1.Caso 1. Sistemas en equilibrio termodinámico que forman eutécticos. Ej.: sales, manitol
A
D
C
BE La línea DBE
determina la menor temperatura a la cual puede existir líquido
Tm
Tms
Tm es la temperatura de fusión/cristalización de agua pura (0°C) y Tms es la temperatura de crist/fusión de soluto puro.
A medida que se agrega agua al soluto o soluto al agua, las correspondientes temperaturas de fusión disminuyen (curvas AB y CB).
La curva CB corresponde a la de solubilidad.
Al enfriar una solución inicialmente a la temperatura TT y composición CC22 , en forma lenta para permanecer en permanecer en equilibrioequilibrio, disminuye la temperatura y no hay cambio de fase, permaneciendo líquida hasta TT11 que es la temperatura de cristalización correspondiente a esa composición. Se forman los primeros cristales de hielo.
T
T1
solución
Solución + soluto Solución
+ hielo
Al seguir enfriando hay menos agua en la solución, que se concentra. En el punto UU tenemos un mezcla de cristales de hielo y una solución de comp. C3
U
12
Si consideramos ahora una solución de composición CC33 a la temperatura TT, podemos ver que es necesario enfriarla hasta TT22para que se formen los primeros cristales de hielo. En este punto la solución no congelada de CC33 será idéntica a la de CC22enfriada hasta TT22. La diferencia entre ambas es la cantidad de hielo formado.
T
T2
T
solución
Solución + soluto Solución
+ hielo
Cuanto mCuanto máás s concentrada es concentrada es la solucila solucióón n inicial, menos inicial, menos cantidad de cantidad de hielo presente.hielo presente.
Reid, 2006
La realidad:La realidad:
Muchas veces el equilibrio termodinámico no se alcanza en escalas de tiempo compatibles con los experimentos, y los solutos no cristalizan, dando lugar a una prolongación de la curva ABAB.
En cierto punto, alcanzamos una T y conc. de soluto donde la cristalización de hielo está cinéticamente impedida, y corresponde a la intersección con la curva del vidrio.
-140
-120
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
0 0.2 0.4 60 80 100
Fracción másica de sólidos (%)
Tem
pera
tura
(°
C) Tm
Tg
Ts
solución
100
120
Curva
del v
idrio
13
-140
-120
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
0 0.2 0.4 60 80 100
Fracción másica de sólidos (%)
Tem
pera
tura
(°
C) Tm
Tg
Ts
solución
100
120
Curva
del v
idrio
En En loslos procesosprocesos de de deshidratacideshidratacióónn o o congelacicongelacióónn se se puedenpueden generargenerar sistemassistemasvvíítreostreos. .
La fusiLa fusióón de sn de sóólidos cristalinos, seguido lidos cristalinos, seguido por un enfriamiento rpor un enfriamiento ráápido tambipido tambiéén n genera estructuras vgenera estructuras víítreas. treas.
Sólidos amorfos y estado vítreo
Esquema de la formaciEsquema de la formacióón de n de ssóólidos amorfos o cristalinoslidos amorfos o cristalinos1. Durante la congelaci1. Durante la congelacióónn
Congelado rápido
matriz amorfa
Congelado lento
hielo
aguasoluto
Esquema de la formaciEsquema de la formacióón de n de ssóólidos amorfos o cristalinoslidos amorfos o cristalinos2. Durante la deshidrataci2. Durante la deshidratacióónn
Deshidratación rápida
Deshidratación lenta
Cristales de soluto
aguasoluto
matriz amorfa
14
-140
-120
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
0 0.2 0.4 60 80 100
Fracción másica de sólidos (%)
Tem
pera
tura
(°
C) Tm
Tg
Ts
solución
100
120
Vitrific
ación
Cristalización de agua
Cris
taliz
ació
n
de so
luto
s
Diagrama de estado Determinación de las temperaturas de transición de fase y estado
Propiedades térmicasDTA
DSC
TGA
Propiedades espectroscópicasRMN
IR
Raman
RSE
Propiedades eléctricasDETA
DEA
Conductividad
Propiedades mecánicasMS
DMA
DMTA
Técnicas microscópicas y análisis de imágenes
DSC Differential Scanning Calorimetry
Horno
Sensores
Referencia
Muestra
DeterminaciDeterminacióón de las n de las temperaturas de transicitemperaturas de transicióón n
DSC Differential Scanning Calorimetry
Tm = Temperatura de la muestraTR = Temperatura de la referenciaTC = Temperatura de la celda
Tm - TR = dT
Flujo de calorhacia la referenciaTm TR
TC
Flujo de calorhacia la muestra
15
Sensor-vista superior
Tanque de N2 (l)
Tanque de N2 (g)
DSC
caudalímetro
CalorimetrCalorimetríía diferencial de barrido: a diferencial de barrido: TermogramaTermograma ttíípico de un pico de un azazúúcar liofilizado (adaptado de car liofilizado (adaptado de RoosRoos, 1992)., 1992).
TRANSICITRANSICIÓÓNNVVííTREATREA
Región vítrea
Regiónsobreenfriada
Formación decristales
Fusión decristales
Temperatura/tiempo
Fluj
ode
cal
or
Transiciones de fase de un sólido amorfo
DeterminaciDeterminacióón de la n de la temperatura de transicitemperatura de transicióón n
vvíítrea por DSCtrea por DSC
Temperatura
Δcp
Τg onset
Τg endsset
Τg midpoint
Fluj
o ex
otér
mic
o de
cal
or
16
Efecto del agua:Efecto del agua:
VariaciVariacióón de n de TTgg en funcien funcióón n del contenido del contenido de agua para de agua para glucosa y glucosa y maltosa.maltosa.
TransiciTransicióón vn víítrea de mezclastrea de mezclas
AdemAdemáás del agua, otros compuestos miscibles s del agua, otros compuestos miscibles modifican la Tmodifican la Tgg de un dado componente de un dado componente
TransiciTransicióón vn víítrea de mezclastrea de mezclas
EcuaciEcuacióón de n de Gordon y Taylor:Gordon y Taylor: Relaciona Relaciona TTgg de mezclas de mezclas binarias con la fraccibinarias con la fraccióón en masa y la Tn en masa y la Tgg de los componentes de los componentes individuales. individuales.
21
2211
wkwTwkTw
gmezclaggT ⋅+
⋅⋅+⋅=
TTg mezcla g mezcla = T= Tgg observado para una mezcla binariaobservado para una mezcla binariaww11 y wy w22 = fracci= fraccióón en masa de los componentes puros n en masa de los componentes puros TTg1g1 y Ty Tg2 g2 = T= Tgg de los componentes purosde los componentes purosk = constante (representa la fuerza de interaccik = constante (representa la fuerza de interaccióón entre los n entre los componentes del sistema).componentes del sistema).
17
Ec. de Gordon y Taylor 21
2211
wkwTwkTw
gmezclaggT ⋅+
⋅⋅+⋅=
Transiciones entTransiciones entáálpicaslpicas
Agua, azúcares, lípidos Fusión Cristalización
polioles,
Almidón gelatinización retrogradación
Proteínas desnaturalización agregación
DSC Differential Scanning Calorimetry
mW
-6
-4
-2
0
min
C130 132 134 136 138 140 142 144
0 1 2 3 4 5 6 7
1
2 Exot.
Endot.
Deflección inicial
Area = calor involucrado
Flujo de calor (dh/dt) = TS - TR
dU/S
18
Ejemplos. 1. Desnaturalización de proteínas
Integral -28.76 mJ normalis. -4.23 Jg^-1
Integral -92.73 mJ normalis. -17.17 Jg^-1
Soybean
Lupines
Spelt
WheatmW2
°C50 60 70 80 90 100
^exo Vegetable Proteins (1) 13.03. 1998 10:14:32
DEMO Vers ion SystemeRTAMETTLER TOLEDO S
2. Gelatinización de almidón
Integral -36.31 mJ normalized -7.52 Jg^-1Peak 69.61 °C
Wheat
Corn
Potato
Rice
mW2
°C40 50 60 70 80
^exo Gelatinization of Starch (7) 13.03.1998 10:12:38
DEMO Vers ion Syst emeRTAMETTLER TOLEDO S
3. Fusión/crist. de lípidos
19
Extracto lipídico
-50 -25 0 25 50-1.00
-0.75
-0.50
-0.25
0.00
T (°C)
mW
Termogramas de semillas de sauce
SAUCE
0 2 4 6 8 10 12 140
20
40
60
80
100
C.A.
T g, °
C
Diagrama de estado de semillas de nim (neem o lila india)
Sacandé y col., 2002
TTéécnicas complementarias:cnicas complementarias:MicroscopMicroscopíía a
MicroestructuraMicroestructura de de sistemas amorfossistemas amorfos
20
50µm
AUTO SEQUENTIAL SWITCHING UNIT
Heating and Freezing stage
Temperaturecontrol system
N tank2
Videocamera
Optical microscope
ClausseClausse, 2006, 2006
Platina térmica
Platina térmica Sistema de control de temperatura
Tanque de N2 L
-300
-200
-100
0
100
200
300
-60 -40 -20 0 20 40Temperature (°C)
Hea
t flo
w (m
W)
Exot
herm
icEn
doth
erm
ic
+20°C
Free
zing
Icemelting
-17°C-20°C
-1°C +4°C
Unfrozenwater
Ice
ClausseClausse, 2006, 2006
masa = 28 mg; energía de congelación: 66.06 Cal/g ; energía de fusión: 78.45 Cal/g
Termogramas de agua (DSC)
Rayos X
Para analizar cristalinidad o amorficidad
TTéécnicas complementarias:cnicas complementarias:
21
Todos los solutos forman vidrios?
Dulcitol
(galacti-tol)
Sorbitol
Iditol
Maltitol
Manitol
solucisolucióón cristal n cristal
Conformaciones moleculares de polioles
cc
vv
vv
vv
cc
No deben modificar su conformación al cristalizar
Manitol y dulcitol, que tienen mayor tendencia a cristalizar, tienen mayores temperaturas de fusión y mayores ΔHf
-140
-120
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
0 0.2 0.4 60 80 100
Solid mass fraction (%)
Tem
pera
ture
(°C
) Tm
Tg
Ts
cg'
solution
ice+glass
glass
Tg'
ice crystal growthMaximum
Maximum ice nucleation
100
120
V
G
Max
imum
solu
tecr
ysta
l gro
wth
Maxim
umso
lute
nucl
eatio
n
Maximum ice crystallization rateice + freeze-concentrated solution
crys
talliz
ation
rate
Maxim
unso
lute
C
B E
ce
A
D
F
VitrificaciVitrificacióón n por por congelacicongelacióón n rráápida o pida o secadosecado
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