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REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA
FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS
MAESTRÍA EN MICROBIOLOGÍA
EVALUACIÓN DE MICROALGAS Y DE BACTERIAS ASOCIADAS PRODUCTORAS DE EXOENZIMAS PARA TRATAMIENTO DE AGUAS
RESIDUALES DE UNA EXTRACTORA DE ACEITE DE PALMA
Trabajo de Grado presentado ante la División de Estudios para Graduados para optar el grado de Magister Scientarium en Microbiología.
Autor: Microbióloga Sandra Milena Rodríguez Puerta C.I. 26.946.094
Tutor: Dr. Ever D. Morales A. C.I. 3.638.303
Co-Tutor: Carmen Cárdenas C.I. 4.148.207
MARACAIBO-JULIO 2010
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EVALUACIÓN DE MICROALGAS Y DE BACTERIAS ASOCIADAS PRODUCTORAS
DE EXOENZIMAS PARA TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES DE UNA EXTRACTORA DE ACEITE DE PALMA
Sandra Milena Rodríguez Puerta Microbiólogo
C.I. 26.946.094
Dirección: Calle 27 No 5ª-149 Barrio Santa Rosa (Colombia-Cesar) Teléfono: 005755840394-3126288161
e-mail. [email protected], [email protected]
Dr. Ever D. Morales A. M.Sc. Carmen H. Cárdenas L. C.I. 3.638.303 C.I. 4.148.207 Tutor Co-Tutor
3
4
A mi Dios por todo su amor
A mis padres Israel y María Teresa
A mis hermanas Ximena y Adriana
A ti Julio por tu apoyo incondicional
5
Agradecimientos
6
A Dios padre Celestial, por su amor incondicional y por darme fuerza en los momentos
difíciles y por concederme este triunfo en mi vida.
A mis padres Israel Rodríguez y María Teresa Puerta, por brindarme esta oportunidad,
para un futuro mejor en mi vida, Gracias los quiero mucho.
A mis hermanas Ximena Paola y Adriana Patricia, a ti xime que me acogiste en tu casa
y me apoyaste en todo y mis seres queridos Carlos, Mi abuelo Marcos (QEPD) y toda
mi familia los quiero.
A la Empresa Palmas Oleaginosas de Casacará Ltda. por brindarme todo el apoyo en la
realización de este proyecto.
Al Laboratorio de Microorganismo Fotosintéticos y Laboratorio del Centro
Investigaciones del Agua por el financiamiento para la realización de este proyecto.
A mi profe Ever Morales por todos sus conocimientos transmitidos y sabiduría en todos
estos años, por su confianza y comprensión para con mi proyecto, y por toda su
colaboración, Gracias mi profe, y que Dios lo bendiga siempre.
A la profe Roberta Mora, por sus conocimientos, buenos consejos transmitidos, apoyo
en aquellos momentos difíciles por ser como una madre y una buena amiga.
A mis queridos profesores Laugeny Díaz, Mayela Yépez, Beltran Briceño y Gisela
Fuenmayor, por todos esos buenos momentos, ayudas y aclaratorias para la realización
de este proyecto.
A la profesora Carmen Cardenas por el apoyo en la realización de este proyecto.
A la Lic. Yadira y la Señora Oda por su apoyo y asesoría en la realización de este
proyecto.
A ti Julio Cesar, que en todo momento siempre has estado ahí apoyándome y dándome
ánimos para la culminación de este logro en mi vida Gracias.
A mis buenos compañeros y amigos Alexandra gracias por toda tu ayuda y paciencia,
José Leonardo (Cheleo), Jorge, Lita, Charity, Hugo, Nestor, Fidel, Tali, Fabiola Jorfran y
todos aquellos que me apoyaron de una forma u otra gracias por todo y por todos
aquellos momentos compartidos con ustedes.
A todos Los quiero mucho y mil Gracias que Dios los bendiga, no los olvidare!!!!!!!!!!.
7
Índice de Contenido
8
Pág.
RESUMEN 14
ABSTRACT 15
INTRODUCCIÓN 16
OBJETIVOS 24
MATERIALES Y MÉTODOS 25
ETAPA 1. Caracterización de las lagunas de estabilización de la planta
extractora de aceite de palma
26
3.1. Descripción del área de estudio y toma de muestras de las Lagunas
de Estabilización de la Planta Extractora de aceite de palma
26
3.2. Microorganismos fotosintéticos presentes en las Lagunas de
Estabilización de una Extractora de Aceite
27
3.2.1. Aislamiento y diversidad de los microorganismos fotosintéticos en
Lagunas de Estabilización de una Extractora de Aceite
28
3.2.2. Medios de Cultivo 28
3.2.2.1. Inorgánico 28
a. Medio comercial: ALGAL 28
b. Fertilizante comercial: NITROFOSKA 29
c. Medio comercial: BG11 30
3.2.3. Técnicas de Aislamiento 30
3.2.3.1. Rayado en Placas 30
3.2.3.2. Diluciones seriadas 31
3.2.3.3. Uso de Agentes antiparasitarios 31
9
3.3. Cultivo de microalgas aisladas de las lagunas de estabilización 31
3.3.1. Cultivos de los microorganismos fotosintéticos aislados en
condiciones autotróficas
31
3.3.1.1. Recuento celular 31
3.3.1.2. Contenido de pigmentos: clorofila y carotenoides 32
3.4. Aislamiento e identificación de cepas bacterianas asociadas a las
microalgas
32
3.4.1. Medio de Cultivo 33
3.4.2. Identificación bioquímica de las cepas bacterianas 34
3.4.2.1. Método de biomerieux vitek 34
ETAPA 2. Determinación de Exoenzimas de las microalgas identificadas y sus
bacterias asociadas
35
3.5. Determinación de Exoenzimas 35
3.5.1. Determinación de Amilasa 35
3.5.1.1. Método del almidón (0,2%) en medio sólido 35
3.5.1.2. Método del almidón (0,2%) en medio líquido 35
3.5.2. Determinación de Lipasa 36
3.5.2.1. Método con la yema de Huevo 36
3.5.2.2. Método con el detergente Tween 80 36
3.5.2.3. Método con Lecitina al 0,1% 37
3.5.2.4. Método cuantitativo con el p-nitrofenilpalmitato (p-NPP) 37
3.5.3. Determinación de Proteasa 37
3.5.3.1. Método de hidrólisis de la gelatina 38
3.5.3.2. Método de hidrólisis de la caseína 38
10
3.5.4. Determinación de Fosfatasa 38
3.5.4.1.Equipo Olympus AU480 38
3.5.5. Determinación de Celulasa 39
3.5.5.1.Método de la carboximetil celulosa 39
3.5.6. Determinación de Ureasa 39
3.5.6.1.Urea de Rustigian y Stuart 39
ETAPA 3. Ensayos realizados con agua residual de una extractora de aceite
de palma
40
3.6. Ensayos 40
3.6.1. Ensayos en condiciones autotróficas 40
3.6.2.Ensayos en condiciones mixotróficas 40
3.6.2.1. Primer Ensayo 41
3.6.2.2. Segundo Ensayo 42
3.6.2.3. Parámetros de Cultivo 43
3.6.2.4. Exoenzimas a ensayos 1 y 2 43
3.7. Recuento de bacterias asociadas a los cultivos 43
3.8. Determinación de los parámetros fisicoquímicos de las muestras de
aguas residuales
44
3.8.1. Nitrógeno Total Kjeldahl (Standard Methods, 2005) 45
3.8.2. Fósforo Total (Standard Methods, 2005) 46
3.8.3. Demanda Química de Oxígeno (Standard Methods, 2005) 46
3.8.4. Aceites y Grasas (Standard Methods, 2005) 47
3.8.5. Sólidos Suspendidos Totales SST (Standard Methods, 2005) 48
3.8.6.Sólidos Suspendidos Volátiles SSV (Standard Methods, 2005) 49
11
3.8.7.Determinación del pH (Standard Methods, 2005) 49
3.9. Análisis Estadístico 49
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 51
ETAPA 1. Caracterización de las lagunas de estabilización de la planta
extractora de aceite de palma
52
4.1. Microalgas y bacterias asociadas a las microalgas, aisladas de
Lagunas de Estabilización de una Planta extractora de aceite de
palma
53
4.1.1. Identificación de microorganismos fotosintéticos de lagunas de
estabilización de una planta extractora de aceite de palma
54
4.1.1.1. Cultivos unialgales de las microalgas aisladas de las lagunas de
estabilización
61
4.1.1.2. Aislamiento e identificación de bacterias asociadas a los cultivos
de microalgas y cianobacterias
63
a. Bacterias Asociadas a Chlorella sp. 1 y 2 63
b. Bacterias asociadas a Oocystis sp. 64
c. Bacterias asociadas a Scenedesmus sp. 64
d. Bacterias asociadas a la cianobacteria Geitlerinema sp. 65
e. Bacterias Asociadas a Chlorococcum sp. 66
4.1.2. Microalgas y su relación con los parámetros fisicoquímicos de las
lagunas de estabilización de una extractora de aceite de palma
67
4.1.2.1. Demanda Química de Oxigeno (DQO) 73
4.1.2.2. Sólidos Suspendidos Totales (SST) 73
4.1.2.3. Nitrógeno 75
12
4.1.2.4. Fosforo 76
4.1.2.5. Aceites y grasas 77
4.1.3. Variación del pH en las lagunas de estabilización de una planta
extractora de aceite
78
4.2. Exoenzimas en microalgas y en sus bacterias asociadas, aisladas
de Lagunas de Estabilización de una Planta extractora de aceite de
palma
80
4.2.1. Exoenzimas en microalgas y sus bacterias asociadas 81
4.2.1.1. Amilasa 81
4.2.1.2. Lipasa 84
4.2.1.3. Proteasa 89
4.2.1.4. Fosfatasa 91
4.2.1.5. Actividad de celulasa 93
4.2.1.6.Actividad de ureasa 95
4.3. Remoción de DQO, Nitrógeno, Fósforo y grasas en agua residual
de una Planta extractora de aceite de palma en presencia de
microalgas y sus bacterias asociadas
97
4.3.1. Cultivos mixtos de microalgas productoras de exoenzimas con
agua residual de la planta extractora de aceite de palma
98
4.3.1.1. Crecimiento y contenido de pigmentos en el primer ensayo 98
4.3.1.2. Crecimiento y contenido de pigmentos en el segundo ensayo 102
4.3.2. Efecto del pH en los cultivos mixtos de las Microalgas 105
4.3.3. Análisis de Remoción de materia orgánica y nutrientes 107
4.3.3.1. Demanda Química de Oxigeno (DQO) 107
13
4.3.3.2. Sólidos Suspendidos Totales (SST) y Sólidos Suspendidos
Volátiles (SSV)
109
4.3.3.3. Nitrógeno (Nitrógeno Total Kjeldahl) 113
4.3.3.4. Fósforo Total 116
4.3.3.5. Aceites y Grasas 119
4.3.4. Presencia de Exoenzimas 121
4.3.5. Población de bacterias asociadas a los cultivos 123
CONCLUSIONES 126
RECOMENDACIONES 129
Índice de Referencias 131
Índice de Figuras 147
Índice de Tablas 152
14
Rodríguez Puerta, Sandra Milena. Evaluación de Microalgas y Bacterias Asociadas productoras de Exoenzimas para Tratamiento de aguas Residuales de una Extractora de Aceite de Palma. Trabajo de grado para optar el grado de Magister Scientarium. Universidad del Zulia, Facultad Experimental de Ciencias, División de Estudios para Graduados, Maracaibo, Venezuela. 2010. 154 p.
RESUMEN La capacidad de los microorganismos fotosintéticos y su potencial como productores de exoenzimas puede ser aprovechado para el tratamiento de aguas residuales. Se evaluó la diversidad y abundancia de microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintéticas en lagunas de estabilización de una Planta extractora de aceite de palma (Elaeis guineensis) en relación a los parámetros fisicoquímicos. La presencia de lipasa, proteasa, fosfatasa, celulasa, amilasa y ureasa, también fue determinada en estos microorganismos y en su flora bacteriana asociada. Asimismo, se analizó la capacidad de remoción de DQO, nitrógeno, fósforo, sólidos totales, grasas y aceites en el agua residual en cultivos unialgales de microalgas y cianobacterias. El estudio se realizó con agua residual (AR) y enriquecida con fertilizante (ARN), en un primer bioensayo. Mientras que, se utilizó además, agua residual + fertilizante + mezcla orgánica (ARNO) y agua residual + mezcla orgánica (ARO), mezcla orgánica + fertilizante (NO) y en relación a los controles (control-AR) y agua destilada+ fertilizante (Control) en un segundo bioensayo. Se identificaron 18 microalgas, 8 cianobacterias y 1 bacteria fotosintética; de las cuales se cultivaron Chlorella sp. 1, Chlorella sp. 2 y Chlorella sp. 3, Scenedesmus sp. 1 y S. ecornis, Chlamydomonas sp., Chlorococcum sp., Oocystis sp. y Euglena sp. y 2 de cianobacterias Geitlerinema sp. y Synechocystis sp.; a partir de las cuales, también fueron aisladas 13 cepas de sus bacterias asociadas. La presencia de amilasa, lipasa, proteasa, fosfatasa, celulasa y ureasa fue detectada en Chlorella sp. 1, Chlorella sp. 2, Chlorella sp. 3, Synechocystis sp., Oocystis sp., Chlorococcum sp. y Geitlerinema sp. Los ensayos diseñados con agua residual permitieron deducir que, la remoción de DQO, parece no depender, al menos de las microalgas. En cambio, la de fósforo y de grasas fue más efectiva cuando dicho residual era más enriquecido con nutrientes inorgánicos y orgánicos (ARNO). De igual manera, con el agua residual enriquecida (ARN, ARO y ARNO) se produjo una remoción del 99,58% para el nitrógeno. Los resultados sugieren que las cepas de Chlorella sp., Oocystis sp., Scenedesmus sp., Chlorococcum sp. y Geitlerinema sp. productoras de exoenzimas pueden ser utilizadas para el tratamiento de residuales enriquecidas con almidones, proteínas y grasas. Palabras Claves: agua residual, exoenzimas, microalgas, bacterias, remoción. e-mail: [email protected].
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Rodríguez Puerta, Sandra Milena. Evaluation of microalgae and associated bacteria exoenzyme producing for wastewater treatment of an oil palm extractor plant. Grade work´s for to choose the grade master in microbiology. University of the Zulia, Experimental Ability of Sciences, Division of Studies for Graduate. Maracaibo, Venezuela. 2010. 154 p.
ABSTRACT The ability of photosynthetic microorganisms and potential as exoenzymes producers can be even useful for wastewater treatment. Diversity and abundance of microalgae, cyanobacteria and photosynthetic bacteria from a stabilization pond of palm oil (Elaeis guineensis) extracting plant were evaluated in relation to physicochemical parameters. Presence of lipase, protease, phosphatase, cellulose, amylase and urease were determinate in these microorganisms, as well as its associated bacterial flora. Furthermore, COD, nitrogen, phosphorous, total solids removal and fats and oils in unialgal cultures of microalga and cyanobacteria using wastewaters as a culture medium. The study is achieve with wastewater (WW) and enriched with nutrients (WWN), in an first experiment. While, were used also, wasterwater + fertilizant + organic mixture (WWNO) and wastewater + organic mixture (WWO) and in relation to culture controls (Control WW) and water distillate + fertilizant (Control) in an second experiment. Its identify eighteen microalgae, eight cianobacteria and one photosynthetic bacterial; the which was cultivate Chlorella sp. one, Chlorella sp. two y Chlorella sp. three., Scenedesmus sp. one y S. ecornis, Chlamydomonas sp., Chlorococcum sp., Oocystis sp. y Euglena sp. y two cyanobacterial Geitlerinema sp. y Synechcteocystis sp.; to split the which, also were aislates thirteen cepa associated bacterial. Presence of amylase, lipase, protease, phosphatase, cellulose and urease were determinate Chlorella sp. one, Chlorella sp. two, Chlorella sp. three, Synechocystis sp., Oocystis sp., Chlorococcum sp. and Geitlerinema sp. in experiment design with wastewater will let deduce, removal COD, appear did not depend to less the microalgae. In exchange, the phosphorous and fats were effective where wastewater was enriched with nutrients inorganic and organics (WWNO). While, wastewater enriched (WWN, WWO and WWNO) produced an removal 99,58% for nitrogen. Result to suggest the cepas Chlorella sp., Oocystis sp., Scenedesmus sp., Chlorococcum sp. and Geitlerinema sp. exoenzymes producers can were used for wastewater treatment enriched with almidon, protein and fats. Keywords: wastewater, exoenzymes, microalgae, bacterial, removal. e-mail: [email protected].
16
Introducción
17
Actualmente, se ha reducido la utilización del agua a causa del vertido de residuales
industriales, agropecuarios y domésticos, a fuentes hídricas produciendo, alteración y
limitando su capacidad de autodepuración con el incremento de la descarga de estos
residuales a los cuerpos de aguas (Seoánez, 1999). Sin embargo, constituyen un
recurso muy apreciado de gran valor económico para el riego y la acuicultura, en virtud
de la elevada concentración de nutrientes presentes en las aguas residuales.
La implementación de lagunas de estabilización para el tratamiento secundario de
aguas residuales, ha constituido un proceso de alta eficiencia en la remoción de
agentes contaminantes, exceso de nitrógeno, fósforo, DQO y metales, con la finalidad
de mejorar la calidad del agua, que pueda ser utilizada para otros fines. En este
sentido, los tratamientos biológicos en estos sistemas y los humedales construidos, han
representado una alternativa en el pulimento de aguas residuales, debido a que los
costos de operación y mantenimiento son bajos. Además, facilitan el reciclaje y
reutilización del agua (Lau y col. 1995; Romero, 1999). Estos sistemas de Lagunas de
estabilización se caracterizan también, por desarrollar una población microbiana,
integrada por bacterias heterótrofas, bacterias autotróficas, microalgas, cianobacterias y
protozoarios; que participan en el proceso de remoción de materia orgánica e
inorgánica (Romero, 2005).
Las microalgas y cianobacterias, presentes en estos residuales desempeñan un papel
importante en la purificación de aguas residuales; ya que tienen la capacidad de
remover cantidades elevadas de nitrógeno y fosforo, absorber metales y acelerar la
inactivación de bacterias patógenas (Abalde y col. 1995). La importancia y aplicación
de las microalgas en el tratamiento de aguas residuales, tiene sus antecedentes en la
época de Caldwell (1937), quien reporta la capacidad de remoción de nutrientes
contenidos en estos efluentes, para favorecer su crecimiento. Posteriormente Oswald
(1957), introduce un nuevo concepto al utilizar aguas residuales, para la producción
masiva de microalgas, con un alto contenido proteico, lo que finalmente se consideró
como un tratamiento terciario de las aguas residuales mediante el cultivo de microalgas
(Talbot y col. 1991; Valderrama y col. 2002; De-Bashan y Bashan, 2004).
18
Las microalgas utilizadas en el tratamiento de efluentes pueden ser consideradas como
una alternativa de tratamiento terciario, debido a los procesos acoplados entre las
bacterias aeróbicas, degradadoras de la materia orgánica y las microalgas, que
asimilan los productos de la degradación y compuestos inorgánicos, para realizar una
eficiente bioconversión de la energía solar. Generándose, así una producción de
biomasa microalgal, mejorando la calidad del efluente y aumentado la concentración de
oxigeno (Figura 1).
Las microalgas que se utilizan en el tratamiento de aguas residuales se caracterizan por
soportar elevadas concentraciones de nutrientes, presentar una actividad metabólica
elevada, contribuir con la oxidación bacteriana, capacidad de resistir variaciones
ambientales y estrategias fisiológicas para exhibir un crecimiento mixotrófico e
interacción favorable microalga-bacterias (Salazar, 2005).
Figura 1. Ciclo de oxigenación fotosintética de aguas residuales. Salazar, (2005).
Entre los microorganismos fotosintéticos comunes en lagunas de estabilización de
aguas residuales urbanas se encuentra una diversidad de microalgas (diatomeas,
euglenofitas, clorofitas), cianobacterias (coloniales, filamentosas y unicelulares) (Arauzo
y col. 2000) y bacterias fotosintéticas (Tabla 1).
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Tabla 1. Microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintéticas más comunes en Lagunas de Estabilización.
GRUPO GÉNEROS REPRESENTATIVOS
Diatomeas Cyclotella, Gomphonema, Nitzschia, Navicula.
Euglenofitas Euglena, Phacus,
Clorofitas
Ankistrodesmus, Chlorella sorokiniana, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus, Scenedesmus rubescens, Scenedesmus obliquus Chlamydomonas, Oocystis, Stichococcus.
Cianobacterias Microcystis, Anabaena, Oscillatoria, Phormidium, Anabaenopsis, Arthrospira, Spirulina, Synechocystis.
Bacterias Thiopedia
Fuente: Safonova (2004); Salazar (2005); Escorihuela (2007).
De igual manera, se incluyen un registro de microalgas y cianobacterias cultivadas en
diferentes efluentes y en diversos países para la producción de biomasa con fines
agroalimentario (Tabla 2). En estas experiencias se refleja el amplio cultivo de Chlorella
sp., Scenedesmus sp. y de Spirulina sp. en Asia y América; con la particular
característica análoga de que son cosmopolitas, crecidas en los diversos cuerpos de
agua y de elevada capacidad de crecimiento en nutrientes orgánicos.
Tabla 2. Uso de microalgas para el tratamiento de aguas residuales en lagunas de alta tasa de oxidación en diversos países.
PAÍS INFLUENTE MICROALGA PRODUCTIVIDAD
(g.m2.d-1) Israel Municipal doméstico Scenedesmus sp. Euglena sp. Chlorella sp. 44.2
Taiwán Digerido porcino Spirulina sp. Chlorella sp. 15-25
India Orina humana Spirulina sp. 10-12
India Melaza (caña) Scenedesmus sp. 15-20
Tailandia Tapioca Spirulina sp. 7-10
Singapur Desecho porcino Cultivo mixto 5.4-5.0
E.U. Estiércol de ganado Chlorella sp. 30
Malasia Aceite de coco Chlorella sp. 2.7-12.8
Brasil doméstico Scenedesmus sp. Chlorella sp. 27-10
Fuente: Kojima y col. (2001).
La biomasa microalgal obtenida en estos sistemas de tratamiento, puede ser
cosechada o recuperada con un adecuado manejo de parámetros fisicoquímicos,
variación en cuanto a los volúmenes de cultivo, con altas densidades microalgales de
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cepas de microalgas “activadas” (adaptadas al efluente) y con residuales con bajos
tiempos de retención (Tabla 3). Además, las microalgas se utilizan en diferentes
aplicaciones comerciales como alimento de valor nutricional, alimentos en animales,
industria cosmética y productos de alto valor nutricional como los ácidos grasos,
pigmentos e isotopos bioquímicos estables (Correa, 1994; Apt y Behrens, 2002;
Salazar, 2005; Yamaguchi, 2005; Spolaore, 2006).
Tabla 3. Uso de biomasa de microalgas cultivadas en aguas residuales.
MICROALGAS EMPLEO Chaetoceros, Chlamydomonas, Chlorella, Chlorococcum, Cyclotella, Dunaliella, Haematococcus, Haslea ostrearia, Nannochloropsis oculata.
Acuacultura Moluscos, bivalvos, crustáceos, rotíferos, Rhodomonas, Cladóceros, Copépodos y peces.
Arthrospira, Chlorella, Dunaliella salina, Aphanizomenon flos-aquae.
Alimentación en Humanos
Chlorella, Scenedesmus, Arthrospira. Alimentación animal Avicultura, ganado porcino, ganado vacuno, perros, gatos y caballos.
Anabaena, Nostoc
Fertilizantes diversos
Arrozales y cultivos diversos.
Chlorella vulgaris, Dunaliella salina, Arthrospira, Nannochloropsis oculata, Porphyridium pupureum, Phaeodactylum tricornutum, Isochrysis galbana, Nitzschia laevis.
Producción de hidrógeno, metanización y ácidos orgánicos e industria cosmética.
Fuente: Salazar, (2005); Spolaore, (2006)
Los cultivos microalgales, al igual que algunas especies de cianobacterias (Álvarez y
Gallardo, 1989; Sallal, 1986; Talbot y De la Noüe, 1993; De la Noüe y Picard, 1985;
Oswald, 1988a,b; Tam y Wong, 1990), se han empleado con éxito en la remoción de
nutrientes de aguas residuales con un alto contenido de nitrógeno y fósforo (Przytocka-
Jusiak y col. 1984; Rodrígues y Oliveira, 1987; Gantar y col. 1984; Voltonia y col. 2005;
Larsdotter y col. 2007) y en la absorción de metales (Devars y col. 2000; Tam y col.
2001).
Entre otras estrategias fisiológicas de estos microorganismos, se encuentran la
capacidad de producir exoenzimas degradadoras de compuestos orgánicos en las
aguas residuales, a fin de generar sustratos más asimilables para su crecimiento y
metabolismo. Esto significa, que la carga orgánica en estos efluentes puede ser
21
degradada por esta maquinaria enzimática; con lo cual la DBO5 es removida en función
del tiempo y actividad metabólica de bacterias, microalgas y cianobacterias presentes
(Hosetti y Patil, 1992). Las aplicaciones de los grupos de enzimas dependen de la
necesidad de hidrolizar polímeros complejos para incrementar su posterior degradación
microbiológica.
La producción de enzimas extracelulares, tales como; amilasa, proteasa, lipasa,
celulasa y fosfatasa constituye una propiedad bien conocida en microalgas y
cianobacterias; por ser utilizadas con carácter taxonómico, para identificación a nivel de
especies. Tal es el caso de las microalgas Chlorococcum y Spongiococcum quienes
producen enzimas proteolíticas extracelulares y enzimas amilolíticas (Archibald y Bold,
1970; Deason, 1976). Por ejemplo, la habilidad de hidrolizar gelatina es una
característica de las especies de Chlorella, Ankistrodesmus y Scenedesmus (Kessler,
1978; 1980). En las diatomeas, Navicula y Nitzschia se ha detectado actividad
agarolítica, proteolítica y fosfatasa (Tanaka y Ohwada, 1987). También se ha descrito,
en un estudio enzimático la fosfatasa alcalina en Phaeodactylum tricornutum,
Nannochloris y Nannochloropsis, que estas diatomeas usan fuentes de fosforo
inorgánico, mediante el uso de p-nitrofenil fosfato y 4-metil-umbeliferil fosfato (Ruiz y
col. 1997; Lubian y col. 1992).
Otra enzima degradante de polímeros utilizados de forma similar son las celulasas,
proteinasas y amilasas. Una aplicación particular que puede describirse como
tratamiento de residuos, es el empleo de proteinasas en las preparaciones comerciales
de detergentes, utilizadas como polvo de lavado biológico. Además de, estas hidrólisis
de materiales poliméricos, existen también aplicaciones de enzimas capaces de
degradar compuestos altamente tóxicos que podrían inhibir procesos de tratamiento
basado en el empleo microbiológico (Raymond, 2001).
Las actividades enzimáticas asociadas a la pared celular de plantas vasculares, hongos
y bacterias, también se han encontrado en especies de Chlorella y Scenedesmus, dada
la existencia de glicosidasas, fosfatasas y esterasas (Burczyk y Loos, 1995). De igual
22
manera, en Chaetoceros ceratosporus se ha demostrado la actividad de una
fosfodiesterasa utilizando sustratos lipofílicos (Yamaguchi y col. 2005).
Esta capacidad de producción de exoenzimas por parte de las microalgas, de su flora
bacteriana asociada, y de otros microorganismos heterotróficos, puede ser utilizada
como herramienta para inducir una mayor eficiencia en la degradación de materia
orgánica existente en aguas residuales. Las enzimas extracelulares o ectoenzimas que
están unidas a la superficie de la célula y las de forma libre como las Exoenzimas son
absorbidas dentro de las sustancias poliméricas extracelulares (EPS) de la matriz del
lodo del tratamiento de aguas residuales (Cadoret y col. 2002); las hidrolasas son
importantes especialmente para la velocidad de la hidrólisis de la digestión anaerobia
(Figura 2).
Figura 2. Mecanismo de acción de las enzimas hidrolíticas sobre la materia orgánica. (1) Limitación de la transferencia de masa, (2) EPS, (3) Intermediarios metabólicos, (4) Condiciones del aceptor de electrones, (5) pH y Temperatura. Todos tienen un efecto sobre la actividad de las enzimas involucradas en el tratamiento de aguas residuales. Burgess y Pletschke, (2008).
En el tratamiento aeróbico las hidrolasas están libres en el medio o contenidas en una
matriz de EPS; y en el proceso anaeróbico estas enzimas están libres en el ambiente
extracelular o en este caso en las enzimas degradadoras de carbohidratos
23
(glicohidrolasas) contenidas o inmovilizadas en un complejo catalítico llamado
celulosoma (solo presente en algunas bacterias) (Burgess y Pletschke, 2008). Higuchi
y col. (2005) clasifico las enzimas extracelulares del lodo digestado anaeróbicamente
en aguas residuales en dos: “Enzimas de Células-libres” dispersada en el líquido y las
“Enzimas ligada-célula” asociadas a la superficie de la célula del microbio.
Al respecto, se ha descrito el uso de lipasas asociadas a cultivos de especies de
Nitrosomonas, Nitrobacter, Pseudomonas, Xanthomonas, Micrococcus, Planocococcus
y Criptococcus, para eliminar depósitos de grasa procedentes de las paredes de las
tuberías que transportan el efluente de aguas residuales (Arias y Lastra, 2002; Gaseosa
y Hube, 1990). Asimismo, Leal y col. (2002), han descrito la producción de una lipasa
extraída de Penicillium restrictum para la remoción de DQO en tratamientos
anaeróbicos de aguas residuales, con alto contenido de grasas.
En este sentido, se han desarrollado paquetes biotecnológicos integrados por fuentes
de microalgas y bacterias para formular productos comerciales (Enzymplus 16 y
Oxydol), capaces de remover y acelerar el proceso de depuración biológica de las
aguas residuales de procedencia doméstica, agropecuaria e industrial (Ecobiotec,
2006). Es por ello, que reviste sumo interés, en el área de la biotecnología de
microalgas en nuestros países, incursionar en nuevas líneas de investigación sobre
remoción de materia orgánica de aguas residuales en función del uso de exoenzimas.
Y considerando, la falta de experiencias y conocimiento sobre la aplicación de inóculos
enriquecidos con microalgas-bacterias productoras de exoenzimas como catalizadores
en el pulimento de aguas residuales, se ha realizado el presente estudio, referente a la
detección de exoenzimas por parte de microalgas y su flora bacteriana asociada,
aislada de aguas residuales y a su posterior evaluación como fuentes de remoción de
materia orgánica y de nutrientes de residuales.
En este sentido, se ha seleccionado un sistema de Lagunas de Estabilización de una
Planta extractora de aceite de palma africana (Elaeis guinenesis) de la República de
Colombia, para considerar la producción de exoenzimas por microorganismos
24
fotosintéticos presentes en estas aguas residuales, y en virtud del incremento constante
de la producción de estos residuales, por el ascenso de esta actividad agroindustrial en
Colombia y Venezuela. Por lo cual, se planteó como objetivo principal:
Evaluar microalgas y bacterias asociadas productoras de exoenzimas para tratamiento
de aguas residuales de una Planta extractora de aceite de palma.
Los objetivos específicos fueron los siguientes:
Identificar las microalgas y bacterias asociadas aisladas de lagunas de estabilización de
una extractora de aceite de palma.
Determinar presencia de exoenzimas en las microalgas y bacterias asociadas.
Relacionar las poblaciones de microalgas con el contenido de grasas y aceites,
Nitrógeno total Kjeldahl, Fosfato y DQO existentes en lagunas de estabilización.
Demostrar la remoción de DQO, nitrógeno y fósforo de aguas residuales de la Planta
extractora de aceite de palma, enriquecida con grasas, almidones y urea en presencia
de microalgas y sus bacterias asociadas productoras de exoenzimas.
25
Materiales y Métodos
26
Para el alcance de los objetivos planteados se realizaron las siguientes etapas
experimentales: la 1 etapa consistió en la caracterización de las lagunas de
estabilización de la planta extractora de aceite de palma Elaeis guinensis (aislar,
identificar y cultivar los microorganismos fotosintéticos y sus bacterias asociadas); la 2
etapa fue la determinación de exoenzimas de las microalgas identificadas y sus
bacterias asociadas y la 3 etapa fue la realización de los ensayos con agua residual de
una extractora de aceite de palma.
ETAPA 1. Caracterización de las lagunas de estabilización de la planta extractora de aceite de palma
3.1. Descripción del área de estudio y caracterización de las lagunas de estabilización de la planta extractora de aceite de palma
Se realizaron cuatro muestreos en las lagunas de estabilización de la Planta Extractora
de Aceite Palmas Oleaginosas de Casacará Ltda, ubicada en los predios de la hacienda
Centenario a 9° 50N y 73° 20W (Instituto Geográfico Agustín Codazzi) jurisdicción del
corregimiento de Casacará, municipio de Codazzi Departamento del Cesar, Colombia.
El sistema de lagunas de estabilización de la Planta Extractora de aceite, comprende
cinco lagunas en serie, comunicadas por medio de compuertas; de las cuales 2 lagunas
son facultativas y 3 de maduración o pulimento (Figura 3). El sistema se mantiene de
las aguas residuales provenientes del proceso de extracción de aceite de la planta. Las
muestras se colectaron en frascos de plástico (Ambar-Análisis Biológicos) y de vidrio
(Aceites y grasas) con capacidad de 1 litro en los seis sitios seleccionados del sistema
de estabilización.
De acuerdo a los sitios de muestreos fijados en el sistema de lagunas y en función de
las visitas realizadas se colectaron un total de 24 muestras; las cuales fueron evaluadas
para la determinación de los parámetros físico-químicos y la diversidad de
microorganismos fotosintéticos presentes en las muestras por recuento celular.
27
Figura 3. Sistema de Tratamiento de aguas residuales de las Lagunas de Estabilización de Palmas Oleaginosas de Casacará Ltda-Colombia.
3.2. Microorganismos fotosintéticos presentes en las lagunas de estabilización de una extractora de aceite
Recolección de Efluentes Tratados
(Agua para Riego de Cultivos)
L A G U N A S D E E S T A B I L I Z A C I Ó N
Colector y Bombeo Agua Residual
Fuente de Alimentación
(Agua Residual Cruda)
L-1
L-2
L-3
L-4
L-5
Punto de Muestreo
28
3.2.1. Aislamiento y diversidad de los microorganismos fotosintéticos en lagunas de estabilización de una extractora de aceite
De las muestras colectadas de las lagunas de estabilización se realizaron
observaciones en fresco tomando una alícuota de cada muestra, y de las
observaciones al microscopio se procedió a la toma de microfotografías de todas las
especies encontradas en las muestras. Para cada muestra en fresco se determinó
diversidad y población de los microorganismos fotosintéticos. La identificación de cada
espécimen fue realizado siguiendo los catálogos y claves taxonómicas de bibliografía
especializada (Yacubson, 1969; 1972; 1974a;b; 1980a;b; 1984-1985; Prescott, 1970;
Whitford y Schumacher, 1973; Jiménez, 1976; Ortega, 1984; Marshall, 1986; Infante,
1988; Dillard, 1999; Bérard-Therriaault y col. 1999; Rodríguez, 2000; Ramírez, 2000;
Lobo y col. 2002; Garduño y col. 2008). La identificación de las especies de
cianobacterias se realizó siguiendo las claves dicotómicas revisadas por Anagnostidis y
Komárek (1985; 1988; 1990); Komárek y Anagnostidis (1979; 1986, 1989); las claves de
Hoffman (1988) y Anand (1990) y Sant’Anna y col. 2006; De M. Bicudo, y col. 2006.
Para el aislamiento de los microorganismos fotosintéticos, se procedió a inocular
muestras procedentes de las lagunas, en medios de cultivos líquidos (ALGAL y
fertilizante NITROFOSKA). Estos fueron mantenidos durante 15 días y luego
transferidos a medio sólido mediante rayado en placa y diluciones seriadas. Una vez
observadas las colonias se hicieron crecer en medio líquido con la finalidad de
determinar las características morfológicas de cada cepa aislada.
3.2.2. Medios de Cultivo
3.2.2.1. Inorgánico
a. Medio comercial: ALGAL: Para los cultivos líquidos, se utilizó agua destilada
esterilizada por autoclave a 121°C y 15 libras de presión durante 20 minutos.
Posteriormente el agua se enriqueció con el medio nutritivo (Tabla 4) a una
29
concentración equivalente a 4,0 mM de NaNO3. (Fábregas y col. 1989). Los cultivos en
medio sólido se prepararon con agar-agar (1,5%), suplementados con nutrientes
“ALGAL”; y correspondieron a los medios autotróficos.
Tabla 4. Composición química del medio de cultivo ALGAL. COMPUESTO CANTIDAD (g/100g)
MICRONUTRIENTES
Oligoelementos
Citrato Férrico 1,000
Cloruro de Zinc 0,061
Cloruro de Manganeso 0,566
Molibdato Sódico 0,110
Cloruro de Cobalto 0,010
Sulfato de Cobre 0,010
EDTA 0,900
Vitaminas
Tiamina 0,200
Biotina (del 0.02%) 0,130
Cianocobalamina (del 0.09%) 0,180
MACRONUTRIENTES NO3Na 90,81
PO4H2Na.2H2O 6,41
*Ácido etilendiaminotetracético.
b. Fertilizante comercial: NITROFOSKA: Los cultivos líquidos se prepararon con
agua destilada o potable esterilizada por autoclave a 121°C y 15 libras de presión
durante 20 minutos, y posteriormente el agua enriquecida con el medio nutritivo (Tabla
5) a concentraciones de 1,0 y 5,0 mL/L.
Tabla 5. Composición química del fertilizante NITROFOSKA FOLIAR (Insecticidas Internacionales, CA).
MACROELEMENTOS
Nitrógeno 10,00% (N)
Fósforo 4,00% (P2O5)
Potasio 7,00% (K2O)
Magnesio 0,2% (MgO)
Azufre 0,8% (S)
MICROELEMENTOS (ppm)
Hierro (Fe) 70
Boro (B) 11
30
Cobre (Cu) 12
Manganeso (Mn) 8
Zinc (Zn) 2 Cobalto (Co) 12
Molibdato (Mo) 1
c. Medio comercial: BG11: Las cianobacterias fueron cultivadas en medios sólidos
y líquidos con nutrientes BG11 (Rippka, 1988); el cual presenta nitrógeno combinado de
concentraciones entre los medios KRATZ, MYERS y CHU-10; además de su extensa
utilización en muchos laboratorios para estimular el crecimiento de las cianobacterias
debido a su alto contenido en nitrógeno (NaN03 17,6 mM) y de concentraciones
adecuadas de calcio, zinc, manganeso, cobre, magnesio, borato, molibdeno y EDTA
(Tabla 6).
Tabla 6. Composición del medio BG11 (Rippka, 1988). COMPUESTO CONCENTRACIÓN (gr) VOLUMEN FINAL (mL)
NaNO3 75,0
MgSO4.7H2O 3,75
Solución I
CaCl2.2H2O 1,8
500
K2HPO4.3H2O 2,0 Solución II
EDTA 0,05
500
Ammonium(III) Citrato 0,3 Solución III
Acido Cítrico (C6H8O7) 0,03
500
H3BO3 2,86
MnCl2.2H2O 1,84
ZnSO4.7H2O 0,22
Na2MoO4.2H2O
CuSO4.5H2O
Solución IV
Co(NO3)
1000
El medio consta de cuatro soluciones: Para preparar 1,0L de medio completo, se añaden 10mL de Solución I; 10 mL de Solución II; 10mL de Solución III y 1 mL de solución IV.
3.2.3. Técnicas de aislamiento
3.2.3.1. Rayado en placas: Para esta técnica se utilizaron placas de medio
ALGAL, en donde se colocaron unas gotas de la muestra en un extremo de la placa y
luego se realizo una extensión por agotamiento con asa de platino. Las placas
sembradas se mantuvieron en condiciones controladas de Luz y temperatura. Al
31
visualizarse las primeras colonias aisladas se procedió a observar al microscopio
indicando el género, y se transfirió a una placa con medio sólido para su reaislamiento
para obtener cultivos unialgales. Las colonias aisladas se trasfirieron a medio líquido y
se revisaron periódicamente.
3.2.3.2. Diluciones seriadas: Se utilizo esta técnica debido a que permite reducir
la densidad celular y separar las especies presentes en las muestras de agua
colectadas. Se prepararon una serie de 5 tubos con 9,9mL de medio ALGAL y se les
añadió 0,1mL de agua de las muestras colectadas.
3.2.3.3. Uso de agentes antiparasitarios: Debido a la presencia de parásitos en
algunos cultivos unialgales o mixtos, se aplicó Zentel® a 500mg.L-1, entre 24 y 48
horas. Luego el cultivo fue lavado con medio de cultivo fresco, por decantación y al
lograr la eliminación de los protozoarios se transfirieron nuevamente a medio de cultivo
fresco.
3.3. Cultivos de microalgas aisladas de las lagunas de estabilización
3.3.1. Cultivos de los microorganismos fotosintéticos aislados en condiciones autotróficas 3.3.1.1. Recuento celular: La población de los organismos en las muestras
colectadas, se determino por recuento celular mediante cámara de Neubaüer. Estas
fueron fijadas previamente con 5-10 gotas de lugol y analizadas por triplicado. De igual
manera, a las muestras por triplicado de 10mL colectadas del cultivo líquido, se les
determinó el crecimiento de los microorganismos fotosintéticos cada tres (03) días hasta
alcanzar la fase estacionaria, de acuerdo a la siguiente fórmula:
DC = C x 104 x Fd No de cuadrantes
32
Donde: DC: Densidad celular en Células mL-1.
C: Número de células observadas.
Fd: Factor de dilución = (Volumen final)/(Volumen inicial).
Los valores de densidad celular reportados corresponden al promedio de las
densidades de las réplicas de cada tratamiento.
3.3.1.2. Contenido de pigmentos: clorofila y carotenoides: El contenido de
clorofila y de carotenoides fue determinado durante el crecimiento de los cultivos
unialgales o mixtos cada tres días. A estos se les extraía, 5 o 10mL por triplicado para
cada réplica de cultivo y luego sedimentados en una centrifuga HETTICH ROTINA 35.
Al precipitado se le adicionaba 2mL de acetona:metanol (2:1), y luego se resuspendía
en vortex y se guardaba a 4ºC durante 24h. El sobrenadante luego era analizado en un
Spectronic 21 a 480, 664 y 647nm para carotenoides y clorofilas a y b, respectivamente.
Los valores de clorofila fueron luego obtenidos a partir de las fórmulas de Jeffrey y
Humprhrey, (1975) para clorofitas:
Clorofila a (µg/mL) = (11,93 A664 – 1,93 A647)
Clorofila b (µg/mL) = (20,36 A647 – 5,50 A664)
Para determinar el contenido de carotenoides se utilizó la ecuación de Strickland y
Parson (1972):
Carotenoides (µg/mL) = (4 x A480)
3.4. Aislamiento e identificación de cepas bacterianas asociadas a las microalgas
33
Para el aislamiento de las bacterias asociadas a cada cultivo no axénico de microalgas
y cianobacterias, se utilizó de igual manera el medio de cultivo organotrófico con
extracto de levadura, peptona y glucosa (Tabla 7).
3.4.1. Medio de Cultivo: Se preparó medio sólido con agar-agar al 1,5%;
enriquecido con extracto de levadura, peptona y glucosa y con adición de medio
“ALGAL” a una concentración equivalente a 4,0mM de NaNO3, a fin de incrementar el
crecimiento de las bacterias asociadas y de las microalgas, el medio sólido se preparó
en agar 15g/L (Blanco, 1990).
Tabla 7. Composición del medio organotrófico complejo.
NUTRIENTES g/L
Extracto de levadura 5,0
Peptona 1,5
Glucosa 2,5
Medio Algal (4mM de NaNO3) 20ml/L
La población bacteriana asociada a la microalga se determinó mediante el recuento en
placa. La cuantificación bacteriana se realizó según el método de dilución en placas
(Madigan y col. 2004), mediante diluciones seriadas de las muestras hasta 10-7,
empleando solución salina fisiológica (SSF) al 0,85% como solvente. De cada tubo de
dilución y de la muestra madre, se tomó 0,1mL para ser sembrado en placas
preparadas del medio sólido organotrófico. La muestra se diseminó con asa de vidrio
estéril y las placas se incubaron a 37° C durante 48 y 72 horas (Incubadora P Selecta,
modelo 2000994).
Las cepas bacterianas seleccionadas se sembraron en placas de agar tripticasa de
soya (TSA), para proceder a la caracterización macroscópica de las colonias, tomando
en cuenta la elevación, borde, forma, tamaño, color, opacidad y superficie de la colonia.
Además, se realizó la tinción de Gram, en la cual se observo: forma, arreglo y tinción
(McFaddin, 2000; Mata y col. 2003; Murray y col. 1999; 2007). Las cepas ya
seleccionadas se reaislaron en placas de agar nutritivo, en caldo nutritivo y sembradas
en agar conservación para su preservación y congelamiento a –20°C, respectivamente.
34
3.4.2. Identificación bioquímica de las cepas bacterianas
Las cepas bacterianas seleccionadas y caracterizadas, se sometieron a pruebas
bioquímicas para su identificación. Para ello, se emplearon protocolos convencionales
reportados en la literatura para cada grupo morfotintorial bacteriano (Mc Faddin, 2000;
Murray y col. 1999; 2007). Entre las pruebas bioquímicas se aplicaron las de
crecimiento en Agar McConkey, comportamiento en agar TSI, catalasa, oxidasa,
reducción de nitratos, prueba de oxidación-fermentación en medio O/F glucosa,
producción de indol, gas y ácido; descarboxilación de lisina, ornitina, prueba de
DNAasa, fermentación de azúcares simples y polialcoholes (arabinosa, fructosa,
lactosa, maltosa, melobiosa, ramnosa, trehalosa, adonitol, inositol, manitol y sorbitol) y
producción de ureasa, entre otras (Mc Faddin, 2000; Murray y col. 1999; 2007).
3.4.2.1. Método de biomerieux vitek. Para la confirmación de las bacterias
aisladas se utilizó el equipo de Biomerieux Vitek. Inicialmente se preparó el inóculo
equivalente al patrón de turbidez No. 3 de MacFarland. Luego, se tomó un tubo de
12x75mm estéril y transferido al soporte de llenado, al cual se le agregó 1,8mL de
solución salina al 0,45-0,5%. Posteriormente, se extrajo suficiente cultivo de la
superficie de los medios de agar apropiados para lograr una suspensión densa
“Lechosa” (mínimamente un patrón de turbidez No. 3 de MacFarland) y luego se
introdujo el tubo en el colorimeter Vitek para comprobar el patrón de turbidez el tubo
tiene que estar en la Zona amarilla, 27%T-37%T. La tarjeta se marcó con el número
apropiado para la bacteria en estudio y también la prueba de oxidasa (+) o (–) para el
caso; luego se colocó la tarjeta y el tubo de transferencia en el soporte de llenado Vitek,
con la parte larga del tubo de transferencia insertado en el tubo de ensayo; si el tubo de
transferencia se insertó correctamente en la tarjeta, por el tubo se extendió bien la
muestra en la tarjeta. La tarjeta se selló utilizando el sistema Vitek 60/120 (modulo de
sellador); luego se colocó la unidad de tarjeta/tubo de transferencia en el soporte de
llenado del sellador. El sellador corto el tubo de transferencia de la tarjeta y sello el
puerto de la tarjeta, luego se incubo las tarjetas con las muestras hacia arriba durante 4
horas a 35-37 °C en una incubadora sin CO2 (Vitek, 2003).
35
ETAPA 2. Determinación de Exoenzimas de las microalgas identificadas y sus bacterias asociadas
3.5. Determinación de Exoenzimas
La presencia de las exoenzimas: amilasa, lipasa, proteasa, fosfatasa, celulasa y ureasa
en cada microalga, cianobacteria y bacteria asociada fue evaluada tanto en medio
líquido y sólido organotrófico.
3.5.1. Determinación de Amilasa
3.5.1.1. Método del almidón (0,2%) en medio sólido: Sobre las placas de agar-
almidón se realizaron pozos usando varilla de vidrio estéril de 1cm de diámetro y
removiendo el agar por succión y después se inocularon las cepas a examinar, hasta un
total de 4 o 6 pozos por placa máximo. Estas fueron incubadas a 30-35 °C durante 48
horas y hasta 5 días en los casos dudosos. Tras la incubación se inundan las placas
con una solución alcohólica de iodo al 2%. La hidrólisis del almidón se manifiesta por la
aparición de un halo claro alrededor del pozo de crecimiento, en tanto que el resto de la
placa se tiñe de color azul oscuro. Se considero que la actividad amilolítica es mayor
cuanto más amplia es la zona clara (Mc-Faddin, 2003; Aguilar y col. 2000; Moronta,
2001).
3.5.1.2. Método del almidón (0,2%) en medio líquido: Este ensayo se basó en la
reducción de la intensidad del color azul del lugol, resultado de la hidrólisis enzimática
del almidón y la formación del complejo iodina-almidón. Se utilizó 0,4mL del cultivo
unialgal de cada microalga, se centrifugó a 4.000r.p.m (el sobrenadante), 0,5mL de la
solución del almidón al 0,2% y 1mL del buffer fosfato (0,1M, pH 6,0). Luego la mezcla
fue incubada a 50 °C por 10min. De allí se le agregó 0,50mL de HCl a 0,1N y se le
adicionó 0,50mL de la solución I/KI (al 2% KI y al 0,2% I). Estas muestras fueron luego
analizadas mediante densidad óptica (DO) a 690nm en un espectrofotómetro Milton
Roy Spectronic 21D. Una unidad de la actividad enzimática se definió como la cantidad
de enzima que causa la reducción del 0,01% de la intensidad del color azul de la
36
solución iodina-Almidón a 50 °C en 1min/mL. La actividad enzimática se determinó
como unidades por gramo de sustrato seco (U/g) (Swain y Ray, 2007).
3.5.2. Determinación de Lipasa
3.5.2.1. Método con la yema de Huevo: Para la preparación de la emulsión de
yema de huevo se limpiaron y sumergieron los huevos de gallina en etanol al 95%
durante una hora. De manera aséptica, se separó la yema de huevo y con una pipeta
estéril se agregó a 500mL de agar base, hasta luego obtener un homogeneizado de la
suspensión. El medio de cultivo seleccionado fue el Agar-Agar 15g/L y después de la
esterilización, se agregó la suspensión de yema de huevo estéril a 500mL al medio
sólido fundido estéril con agitación constante con un vortex y se enfrió a 55-60 ºC.
Luego de solidificarse el gel, se realizaron pozos usando varilla de vidrio estéril de 1cm
de diámetro y se removió el agar por succión. Luego se adicionaron alícuotas de las
muestras de microalgas a un volumen de 0,5mL dentro de los pozos, cada
microorganismo se sembró por separado y se incubó a 25 ºC + luz y a 37 °C en
oscuridad durante 5 días (Mc-Faddin, 2003). La reacción fue positiva (+); cuando se
observó la presencia de una zona opaca en el medio alrededor del crecimiento, como
producto de la precipitación de los ácidos grasos. Negativo (-) cuando no ocurrió
ningún cambio en el aspecto de las colonias o del medio de cultivo.
3.5.2.2. Método con el detergente Tween 80: Se utilizó medio sólido con
peptona (5,0g), NaCl (2,5g), CaCl.2H2O (0,05g), Agar-Agar (15g) y Tween 80 (5mL/L).
Una vez preparadas las placas se realizaron pozos usando varilla de vidrio estéril de
1cm de diámetro y se removió el agar por succión. Luego se adicionaron las muestras
de 0,5mL dentro de los pozos. La reacción fue positiva (+); cuando se observó la
presencia de una zona clara alrededor del crecimiento, como producto de la
precipitación de los ácidos grasos. Negativo (-) ningún cambio en el aspecto de las
colonias o del medio de cultivo (Pratt y col. 2000; Mc-Faddin, 2003).
37
3.5.2.3. Método con Lecitina al 0,1%: Se utilizó medio sólido con lecitina de val
natural 1200mg (100% soya natural), con adición de 1,2mL/0.25L de tritón X-100, Agar-
Agar (15g/L) y se calentó el medio a 100º C con agitación constante hasta su disolución
completa. Una vez preparadas las placas, se realizaron pozos usando varilla de vidrio
estéril de 1cm de diámetro y se removió el agar por succión. Las muestras fueron
previamente centrifugadas tomando el pellet de 0,5mL y se adicionaron en los pozos.
La hidrólisis de la lecitina se manifestó por la aparición de un halo claro alrededor del
pozo de crecimiento; se considero que la actividad fue mayor cuanto más amplia fue la
zona clara.
3.5.2.4. Método cuantitativo con el p-nitrofenilpalmitato (p-NPP): Este ensayo se
realizó en función de la estimación colorimétrica del para-nitrofenol (p-NP) a 410nm, en
el cual se liberó como resultado de la hidrólisis de p-NPP. Una unidad de la actividad
enzimática fue definida como 1µmol de p-nitrofenol liberado por minuto (µmol/min).
Para ello, se utilizó el tritón X-100 como agente solubilizante. El cultivo de microalgas
fue centrifugado a 4000r.p.m por 10min y el sobrenadante se utilizó como fuente de la
enzima. A 30mg del sustrato p-NPP, se le adicionó 10mL de isopropanol y luego fue
mezclado con una disolución de 207mg de deoxicolato de sodio en 90mL de buffer
fosfato a pH 7,0. De esta disolución se utilizó 2,4mL por 0,1mL del sobrenadante libre
de células del cultivo unialgal. Luego fue incubada por 15min a 37° C y se midió la
densidad óptica (DO) a 410nm (Winkler y Stuckmann, 1978; Gupta y col. 2002). La
Actividad enzimática se calculó aplicando la siguiente expresión y las unidades
expresadas en U/mL.
Concentración de p-NPP = A410 x 2,71 x 103 M-1 cm-1
3.5.3. Determinación de Proteasa
Para la proteasa se aplicaron dos métodos con el objeto de identificar las enzimas de
tipo proteolítico (gelatinasas) que licuan/hidrolizan la gelatina (Método cualitativo) y la
caseína (Método cuantitativo).
38
3.5.3.1. Método de hidrólisis de la gelatina: Se utilizaron tubos conteniendo
gelatina (caldo nutritivo a 4,0mM de medio algal + gelatina 10-20%) en forma de taco y
sembrados por punción con el inóculo de cada microalga. Tanto los tubos inoculados
como los controles fueron incubados a 37 °C durante 6 días. La prueba fue positiva
para aquellas microalgas y bacterias capaces de hidrolizar la gelatina con la
subsecuente pérdida de la habilidad de gelificarse de nuevo, una vez colocados los
tubos a 4 °C durante 30 minutos (Mc-Faddin, 2003; Kassana y col. 2007).
3.5.3.2. Método de hidrólisis de la caseína: Para esta prueba, se preparó antes
una disolución de caseína al 2% en buffer Tris fosfato pH 7,8 de la cual se tomaron
5mL, para ser añadidos a un volumen igual del sobrenadante del cultivo de bacterias o
de microalgas. Esta mezcla luego fue incubada a 37 °C durante 5 minutos. La reacción
se detuvo con la adicción de 5mL de ácido tricloroácetico al 5% (TCA). Para la caseína
se definió la unidad de la enzima por la cantidad liberada en TCA equivalente a 0,001
A280 por minuto a 37 °C a un pH de 7,8. La actividad se calculó con la siguiente formula
(Sharma y col. 1996).
Unid/mL = A280 (ensayo) – A280 (blanco) tiempo x mL de enzima
3.5.4. Determinación de Fosfatasa
3.5.4.1. Equipo olympus AU480: Para esta enzima utilizamos los siguientes
reactivos: Amortiguador de ALP-SL; R2, y Sustrato de ALP-SL. Las concentraciones
para la prueba fueron: 0,84mol/L de 2-amino-2-metil-1-propanol (pH 10,4 a 25 °C),
2,0mmol/L de acetato de magnesio, 1,0mmol/L de sulfato de zinc, 2,0mmol/L de EDTA,
50mmol/L de p-nitrofenilfosfato, 50mmol/L de fenol y un conservador. Las condiciones
establecidas fueron: longitud de onda (Primaria) 415nm, (Secundaria) 660nm,
temperatura de 37 °C, paso de luz 1cm, tipo de reacción cinética, tiempo de reacción 5
minutos, volumen de muestra 5μL, volumen de reactivo, R1 280μL; R2 70μL, volumen
total 355μL y una relación de muestra/reactivo 1/70.
39
El equipo olympus Au480 tiene dos sondas permanentes: una sonda de muestreo (2 a
50μL) y una sonda de reactivo (20 a 300μL); las cuales tomaron los volúmenes precisos
para cada reactivo indicado para la determinación de fosfatasa. En la Fosfatasa
Alcalina en olympus AU480: El Sustrato es p-nitrofenilfosfato en 2-amino-2-metil-1-
propanol; el tipo de la reacción en la presencia de magnesio es medido
dicromáticamente a 410/520nm (Hodgin y col. 1988). El valor normal es 31 a 110U/L
(unidades por litro) en plasma. Las fosfatasas alcalinas son enzimas que se encuentran
presentes en casi todos los tejidos del organismo, siendo particularmente alta en
huesos, hígado, placenta, intestinos y riñón. Tanto el aumento, así como su
disminución en plasma tienen significado clínico. Su elevación puede indicar una
enfermedad hepática, pero también pueden elevarse en otras enfermedades o incluso
ser parte de fenómenos fisiológicos como crecimiento y embarazo. Los rangos de los
valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios.
3.5.5. Determinación de Celulasa
3.5.5.1. Método de la carboximetil celulosa: El medio sólido se preparó con
carboximetilcelulosa de sodio (0.1%), y agar (1%) en 0,1M buffer de fosfato de sodio pH
6,3 y luego se autoclavó a 120 °C por 2 minutos. Después de solidificarse el gel se
horadaron unos pozos usando varilla de vidrio estéril de 1cm de diámetro y se removió
el agar por succión. Las muestras de 0,5mL fueron inoculadas dentro de los pozos e
incubadas a 37 ºC por 16 horas. El rojo congo fue utilizado como indicador para
mostrar las zonas claras de la actividad celulolítica (Bremer y col. 1995).
3.5.6. Determinación de Ureasa
3.5.6.1. Urea de Rustigian y Stuart: Se utilizó el caldo con urea de Rustigian y
Stuart, pH 6,8. El medio utilizado contenía: fosfato monopotásico KH2PO4 9,1g, fosfato
disódico Na2HPO4 (buffer de Sorensen) 9,5g, extracto de levadura 0,1g, urea 1-2% 1-
2g, rojo de fenol 0,01g y agua estéril 1000mL. Como indicador se utilizó el rojo de fenol
(Morou y col. 2000). Se consideró positiva (+) la prueba cuando el medio cambió
40
completamente a un color lila tenue. A diferencia del resultado negativo (-), el medio no
cambio quedando del mismo color inicialmente (Mc-Faddin, 2003).
ETAPA 3. Ensayos realizados con agua residual de una extractora de aceite de palma
La evaluación de la microalgas como tratamiento terciario de aguas residuales de una
extractora de aceite de palma africana, se realizó mediante cultivos discontinuos en dos
ensayos:
3.6. Ensayos
3.6.1. Ensayos en condiciones autotróficas: Para las microalgas se utilizaron los
nutrientes inorgánicos ALGAL y NITROFOSKA; para las cianobacterias se aplicó el
medio BG11. El inóculo para cada cultivo líquido procedía de un cultivo en medio sólido
con estos nutrientes hasta que eran escalados a volúmenes suficientes para desarrollar
cultivos hasta de 500mL (Figura 4). Para ello, se utilizaron envases cilíndricos de vidrio
de 250 y 1000mL de capacidad.
Figura 4. Cultivos en condiciones de laboratorio.
3.6.2. Ensayos en condiciones mixotróficas: En este caso se utilizó como medio
de cultivo, el agua residual vertida antes de su entrada al sistema de Lagunas de
estabilización de la Planta extractora de Aceite (Figura 5). Muestras de estos efluentes,
de 50 litros, con un pH inicial de 3,75 fueron neutralizados previamente hasta pH 7 con
41
NaOH, para luego ser incubadas con agitación constante mediante vortex y durante 10
días. Una vez finalizada la agitación, se obtuvo un sobrenadante y un sedimento
correspondiente al lodo del residual. Solo, se seleccionó la fracción soluble al 25% y
sin esterilizar, como fuente de nutrientes para los cultivos y para la determinación de la
remoción de los compuestos presentes en el residual soluble.
Figura 5. Agua residual antes de ser vertidas a las Lagunas de Estabilización.
3.6.2.1. Primer Ensayo. Los cultivos se realizaron con agua residual no estéril,
respecto al volumen de cultivo de 150mL y fueron iniciados con un inóculo mixto de 2,0
x106 cel.mL-1 de las microalgas Chlorella sp. y Scenedesmus sp. (Figura 6). Además,
también se contempló una serie de cultivos con agua residual enriquecida con
NITROFOSKA. Entre los controles se seleccionaron dos: uno con agua residual sin
microalgas, y otro control, correspondiente a un cultivo autotrófico (agua potable estéril
enriquecida con NITROFOSKA 5mL/L). Es decir, los tratamientos en dicho
experimento, fueron los siguientes:
a) Agua residual con microalgas (AR).
b) Agua residual con microalgas + NITROFOSKA (ARN).
c) Agua Residual (Control)-(AR).
d) Agua estéril con microalgas + NITROFOSKA (Control).
42
Figura 6. Primer Ensayo (Tratamientos).
3.6.2.2. Segundo Ensayo. En este caso, el medio de cultivo fue el agua residual,
previamente incubada mediante agitación y a una concentración del 25%. Los cultivos
se iniciaron con una densidad celular de 2,0 x106 cel.mL-1 de cada especie de microalga
(Chlorella, Chlamydomonas, Oocystis, Scenedesmus, Chlorococcum y Geitlerinema); y
luego mezcladas para iniciar el cultivo mixto. Además, el medio de cultivo fue
enriquecido con almidón* (0,1%), urea* (0,1%) y Lecitina* (0,1%) (Figura 7), a fin de
simular un medio residual con alta carga orgánica. El cultivo de control se desarrolló en
condiciones autotróficas, cuyo medio de cultivo fue agua potable estéril enriquecida con
NITROFOSKA a 5mL/L.
Los tratamientos evaluados fueron los siguientes:
a) Agua residual + inóculo mixto de microalgas (AR).
b) Agua residual + inóculo mixto de microalgas + NITROFOSKA (ARN).
c) Agua residual + inóculo mixto de microalgas + mezcla orgánica* (ARO).
d) Agua residual +inóculo mixto de microalgas + NITROFOSKA + mezcla orgánica
(ARNO).
e) Agua residual (Control)-(AR).
f) Agua potable estéril + inóculo mixto de microalgas+ NITROFOSKA (Control).
g) Agua potable estéril+ inóculo de microalgas + NITROFOSKA + mezcla orgánica
(NO).
43
Figura 7. Segundo Ensayo* (Tratamientos).
3.6.2.3. Parámetros de Cultivo: Los cultivos autotróficos y mixotróficos (agua
residual) fueron iniciados con una densidad celular entre 1,0 y 2,0x106 cel.mL-1 y
mantenidos con aireación constante, iluminación lateral suministradas por lámparas
fluorescentes, fotoperiodo de 12:12 horas, utilizando lámparas fluorescentes Philips
Daylight de dos tubos de 40W, a una intensidad luminosa de 156 µmol quanta.m-2.s-1, y
a 28±2ºC.
3.6.2.4. Exoenzimas en Ensayos 1 y 2: En este caso se tomó 10mL de cada uno
de los tratamientos realizados para cada tipo de ensayo se centrifugó a 4.000r.p.m. en
una centrifuga tipo HETTICH ROTINA 35, tomando el pellet para realizarle las
exoenzimas en medio sólido a las cuales se les realizó pozos usando varilla de vidrio
estéril de 1cm de diámetro y removiendo el agar por succión y después se inocularon
0,5mL de cada tratamiento, las exoenzimas determinadas fueron lipasa, amilasa 02%,
celulasa y urea al 0,1% para el ensayo 1, y en el ensayo 2 a parte de estas se le realizó
además la lecitina al 0,1%.
3.7. Recuento de bacterias asociadas a los cultivos
Se realizó por el método de Contaje de Placa Heterotrófico (9215.B), al inicio y final de
cada experimento. Para ello, se tomaron 10mL de la muestra y se diluyeron en 90mL
de solución salina al 0,85% estéril, lo cual representó la dilución 10-1, y luego hasta
44
obtener una dilución de 10-7. La finalidad de realizar estas diluciones es que el número
de colonias en las placas se encuentre entre 30 y 300. Se tomó 0,1mL de cada dilución
utilizando una micropipeta y se agregaron en placas de petri estériles de Agar nutritivo,
dispersando el inoculo con una asa de Hockey y se incubaron las placas invertidas a
35ºC durante 24-48 horas, luego de las cuales se realizó la observación y contaje de las
colonias formadas (Standard Methods, 2005).
Para realizar el cálculo de las Unidades Formadoras de Colonias por mililitro (UFC/mL)
se utilizó la siguiente ecuación:
UFC/mL = (Nº de colonias x Fd)/Vm
Donde: Fd: Factor de dilución (Volumen final/Volumen de muestra)
Vm: volumen de muestra (mL).
3.8. Determinación de los parámetros fisicoquímicos de las muestras de aguas residuales
Para el análisis físico-químico de las diferentes muestras agua se siguieron los
procedimientos descritos en el Standard Methods for Examination the Water and
Wastewater (21th Edition 2005).
Las muestras de agua residual colectadas, eran preservadas en volúmenes de 1 litro
por cada una de las muestras por duplicado, con 1mL de Ácido Sulfúrico concentrado
(H2SO4) para la realización de DQO y para los demás análisis, el resto de las demás
muestras fueron mantenidas en refrigeración. Todos los análisis fueron realizados en el
Centro de Investigaciones del Agua (CIA) de la Universidad del Zulia. Así mismo,
fueron analizadas muestras de los cultivos realizados con agua residual, tanto al inicio y
como al final de cada ensayo. Todas las muestras fueron pasadas a través de un filtro
de borosilicato GF7547MM con la finalidad de eliminar la interferencia causada por las
45
microalgas. Los análisis se hicieron por duplicado, a excepción de la DQO que se
realizó por triplicado.
3.8.1. Nitrógeno total kjeldahl (Standard Methods, 2005): El nitrógeno total
Kjeldahl se hizo un proceso de digestión previo a la destilación en el que el nitrógeno
orgánico se convierte en amoníaco. Por lo tanto el nitrógeno total Kjeldahl incluye el
nitrógeno orgánico y el amoniacal. El método a emplear es el Semi-Micro Kjeldahl
(4500-Norg-C). Para la digestión se agregaron 6mL de solución digestora de Ácido
Sulfúrico/Peróxido de Hidrógeno (H2SO4/H2O2) en una relación 1/3. Luego se coloco la
muestra en el digestor Tecator 2020 a 250ºC hasta que el volumen se reduje
aproximadamente a 25mL. Luego se realizo el método de Destilación Preliminar-
Titulación (4500-NH3.B). Este ensayo se basa en la conversión de equilibrio entre el ión
amonio y el amoníaco libre, y la liberación del amoníaco gaseoso junto con el vapor que
es producido con la ebullición del agua. Para este análisis se emplearon muestras de
50mL, a las cuales se le agregaron 15mL de solución de Hidróxido de Sodio (NaOH)-
Tiosulfato de Sodio (Na2S2O3) para incrementar el pH.
La muestra se destiló en una unidad de destilación Büchi 315 y se colectó en un
Erlenmeyer de 125mL de capacidad que contenía 25mL de solución mixta de ácido
bórico (H3BO3), hasta obtener un volumen entre 75 y 100mL. La cantidad de amonio en
la muestra se determina por la cantidad de ácido bórico consumido en el Erlenmeyer.
Esto se midió titulando la muestra con una solución de ácido sulfúrico (H2SO4) 0,02N.
Para determinar la concentración de nitrógeno total Kjeldahl se empleó la siguiente
fórmula:
Nitrógeno (mg/L) = [(T – B) x N x 14 x 1000)] Vm
Donde: T: Volumen de ácido gastado en la titulación (mL).
B: Volumen de ácido gastado en la titulación del blanco (mL).
N: Normalidad del ácido (0.02N).
46
Vm: Volumen de muestra (mL).
3.8.2. Fósforo total (Standard Methods, 2005): Se determinó el contenido de
fosfato mediante el método Colorimétrico con Ácido Vanadomolibdofosfórico (4500-
P.C), para esto se emplearon 25mL de muestra y se le agregó 1mL de reactivo
vadanato–molibdato, constituido por una solución de molibdato de amonio
((NH4)6Mo7O24.4H2O) y metavanadato de amonio (NH4VO3) produciéndose un complejo
de color amarillo con el fosfato. El desarrollo del color se midió cuantitativamente luego
de 20 minutos usando un espectrofotómetro HACH DR/2000 midiendo la absorbancia a
430nm. Con el valor de la absorbancia, y la curva de calibración obtenida en el
laboratorio se calculó el contenido de fosfato (mg/L) mediante la siguiente expresión:
PO4-3 (mg/L) = Abs430 – 0,0039479
0,1164871
Donde: Abs430: Absorbancia de la muestra medida a longitud de onda de 430nm.
3.8.3. Demanda Química de Oxígeno (Standard Methods, 2005): El contenido de
materia orgánica se oxida empleando un agente químico fuerte (K2Cr2O7) en medio
ácido (H2SO4) utilizando un catalizador (AgSO4) para facilitar la oxidación de
determinados tipos de compuestos orgánicos. Para la determinación de la DQO se
empleó el método Colorimétrico de Reflujo Cerrado (5220 D). Se tomaron 2mL de
muestra en tubos de ensayo con tapa refractaria de 16 x 100mm previamente
preparados con 3mL de solución de Ácido Sulfúrico concentrado (H2SO4) + Sulfato de
Plata (AgSO4) y 1mL de solución de Dicromato de Potasio (K2Cr2O7) preparado con
Sulfato de Mercurio (HgSO4). Los tubos se agitaron hasta lograr una mezcla
homogénea y se colocaron en un digestor HACH modelo 2100A a 140 C durante dos
horas. Luego de la digestión se midió la absorbancia de los tubos en el
espectrofotómetro HACH DR/2800 a 600nm. Con el valor de la absorbancia, y la curva
de calibración obtenida en el laboratorio se calculó la DQO (mg/L) mediante la siguiente
expresión:
47
DQO (mg/L) = (Abs600 x 3204,5135) – 5,884
Donde: Abs600: Absorbancia de la muestra medida a 600nm.
3.8.4. Aceites y Grasas (Standard Methods, 2005): Para la determinación de
Aceites y grasas se empleó el método gravimétrico (5520-B, F.). Para esto se tomó
50mL de la muestra en un erlenmeyer de 100mL previamente secado y pesado hasta
un peso constante (P1) (diferencia entre pesadas consecutivas no mayor a 0.0005 g).
Luego se transfirió el volumen de la muestra a un embudo de separación verificando
que la llave de salida este cerrada. Posteriormente, se lavó la botella que contenía la
muestra y el cilindro donde se midió el volumen con 30mL del solvente de extracción
(mezcla de n-Hexano/metil-terbutil-éter). Después, se transfirió el líquido de lavado a
uno que contenía la muestra; se agitó el embudo de separación por dos minutos.
Seguidamente, se separó la capa acuosa y la orgánica en el embudo de separación,
drenándose el solvente a través de un embudo, al cual previamente se le había
colocado un disco de papel de filtro Whatman No. 1 y con aproximadamente 10g de
sulfato de sodio (Na2SO4) anhidro en un erlenmeyer de 100mL, llevado a peso
constante.
El paso siguiente, consistió en adicionar 30mL de solvente, al embudo de separación
con la muestra, y se repitieron las fases de agitación y extracción, por lo menos dos
veces. Finalmente, se combinaron las capas orgánicas en el mismo erlenmeyer de
100mL, se lavó el papel filtro y el Na2SO4 con 10 ó 20mL del solvente de extracción, la
evaporación del solvente fue en un rotavapor a una temperatura de 85 ºC hasta que
estuviera totalmente seco, se enfrió en un desecador durante 30min y se peso el balón
(sea este valor P2). El resto de la muestra contenida en el embudo de separación se
descartó. Con el peso del erlenmeyer sin la muestra y el del erlenmeyer con la muestra
se calculó, el contenido de grasas y aceites, mediante la siguiente expresión:
Grasas y Aceites (mg/L) = (P2 – P1) x 106 Vm
48
Donde: P2: Peso del balón + residuo (g).
P1: Peso del balón vacío (g).
Vm: Volumen de muestra (mL).
3.8.5. Sólidos Suspendidos Totales SST (Standard Methods, 2005): Para la
determinación de la concentración de sólidos suspendidos totales (2540-D) en la
muestra se procedió de la siguiente manera: se realizó una preparación previa al papel
de filtro de fibra de vidrio GC50 de 47mm de diámetro, el mismo se lavó con agua
destilada y se colocó en una capsula de aluminio, la cual se calentó durante 5 minutos
en una mufla marca Thermolyne tipo 48000 furnace a una temperatura de 600ºC,
transcurrido ese tiempo se sacó y se dejó enfriar en un desecador durante
aproximadamente 15 minutos para luego pesarlo, correspondiendo este al peso uno (1).
Una vez pesado se colocó el papel de filtro en el equipo de filtración al vacío, se
midieron 50mL de muestra con un cilindro graduado y se filtró dicho volumen de
muestra, quedando en el papel de filtro los sólidos suspendidos contenidos en ese
volumen de muestra, el papel de filtro se colocó de nuevo en la capsula de aluminio y
se llevó a una estufa donde se secó a una temperatura de 103–105ºC durante una
hora. Transcurrido ese tiempo, se sacó de la estufa y se dejó enfriar en un desecador
durante aproximadamente 15 minutos para luego pesarlo, correspondiendo este al peso
dos (2). La concentración de sólidos suspendidos totales se determinó mediante la
siguiente expresión:
SST (mg/L) = (P2 – P1) x 106
Vm
Donde: P1: Peso del papel de filtro + Cápsula de aluminio (g).
P2: Peso del papel de filtro + Cápsula de aluminio + sólidos de la muestra
(g).
Vm: Volumen de la muestra (mL).
49
3.8.6. Sólidos Suspendidos Volátiles SSV (Standard Methods, 2005): Para la
determinación de la concentración de sólidos suspendidos volátiles (2540-E) en la
muestra se procedió de la siguiente manera: Luego de la determinación de los sólidos
suspendidos totales se coloca la capsula con el papel de filtro en una mufla a 600ºC
durante 5 minutos, transcurrido ese tiempo se sacó y se dejó enfriar en un desecador
durante aproximadamente 15 minutos para luego pesarlo, correspondiendo este al peso
tres (3). La concentración de sólidos suspendidos volátiles se determinó mediante la
siguiente expresión:
SSV (mg/L) = (P2 – P3) x 106
Vm
Donde: P2: Peso del papel de filtro + Cápsula de aluminio + SST (g).
P3: Peso del papel de filtro + Cápsula de aluminio + sólidos no volátiles (g).
Vm:Volumen de la muestra (mL).
3.8.7. Determinación del pH (Standard Methods, 2005): Se realizo in situ a las
muestras de agua colectadas de las Lagunas de estabilización la medición de
temperatura con un termómetro de mercurio de apreciación 0,1°C (marca Bannan), pH
(pH-metro de campo marca Orion) y salinidad (salinómetro-refractrómetro C-1, modelo
SZJ-S), con el fin de determinar las condiciones ambientales donde se encontraron las
microalgas y cianobacterias; y las bacterias asociadas a estas. A los cultivos de
microalgas, luego de su aislamiento y purificación, se midió el pH (Método 4500-H+.B),
realizándose cada dos (02) días hasta alcanzar la fase estacionaria, utilizando un pH-
metro CORNING, que lee directamente en unidades de pH. Para evitar la
contaminación, el electrodo se lavó con alcohol isopropílico al 70% y luego con agua
destilada estéril antes de introducirlo a los cultivos.
3.9. Análisis estadístico
Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de un factor para la comparación de
50
medias, aplicando la prueba Tukey a un nivel de significancia de 0,05 y un análisis de
correlación lineal utilizando el coeficiente de correlación de Pearson para realizar la
comparación entre grupos y estudiar la relación entre los mismos (Pardo y Ruíz, 2002).
Estos análisis se realizaron utilizando programa SPSS 10.0 para Windows.
51
Resultados y Discusión
52
ETAPA 1. Caracterización de las Lagunas de Estabilización
de una Planta extractora de aceite de palma
53
Microalgas y bacterias asociadas a las microalgas, aisladas de Lagunas de Estabilización de una Planta extractora de
aceite de palma
54
4.1.1. Identificación de microorganismos fotosintéticos de lagunas de estabilización de una planta extractora de aceite de palma
En las lagunas de Estabilización de la planta extractora de aceite de palma (Elaeis
guineensis) de la empresa “Palmas Oleaginosas de Casacará Ltda”, Colombia, se
observo la presencia de microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintéticas en todas
las lagunas, indicando su adaptación en estas aguas residuales. Todas, crecieron bien
en medios sólidos y líquidos, con el medio comercial ALGAL, BG11 y NITROFOSKA.
Así como también, las bacterias asociadas a los cultivos de microalgas crecieron
satisfactoriamente en agar nutriente.
La diversidad de los organismos en las lagunas de oxidación se evidencio en todos los
muestreos, encontrando mayor diversidad en las lagunas 2, 3 y 4. En la laguna 2 se
encontró al grupo de microalgas y bacterias fotosintéticas. Mientras que, en la laguna 3
y 4, el grupo con mayor diversidad fue el de microalgas y cianobacterias. En todas las
lagunas se observo una predominancia de las Chlorophyta con un alto índice de
dominancia del género Chlorella. En cambio, Cyanophyta y Euglenophyta presentaron
índices de dominancia intermediarios, seguido por las Crysophyta.
Las microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintéticas observadas en las lagunas de
estabilización, fueron 27 cepas (Tabla 8), con predominio de 5 cepas, correspondiente a
las especies de Chlorella, Scenedesmus, Euglena, Phacus y Thiopedia en todas las
lagunas y para todos los muestreos; mientras que las otras 22 cepas se encontraron en
menor proporción.
Tabla 8. Microorganismos observados en los muestreos de las lagunas de Estabilización. LAGUNAS DE ESTABILIZACIÓN
NÚMERO NOMBRE DEL ORGANISMO 1 2 3 4 5
1 Oocystis sp. ++ 2 Kirchineriella lunaris ++ + 3 Chlorella sp. +++++ +++ +++++ +++ ++ 4 Clorofita N.I. + + 5 Hyaloraphidium sp. + + + 6 Coelastrum sp. ++ 7 Scenedesmus sp. . +++++ +++++
55
8 Chlorococcum sp. ++ ++ + 9 Ankistrodesmus sp. ++ 10 Monoraphidium sp. + 11 Chlamydomonas sp. ++ 12 Closteriopsis sp. +++ 13 Pandorina sp. ++ 14 Haematococcus sp. ++ +++ 15 Euglena sp. +++++ +++++ +++ +++++ 16 Phacus sp. ++ +++++ ++ ++++ 17 Navicula sp. + +++ ++ 18 Nitzschia sp. + ++++ +
Cianobacterias 19 Lyngbya sp. + ++ 20 Oscillatoria sp. ++ 21 Synechococcus sp. ++ + 22 Merismopedia sp. +++ + 23 Synechocystis sp. ++ ++ 24 Geitlerinema sp. + ++ 25 Pseudanabaena sp. +++ + + 26 Chroococcus sp. +++
Bact. Fotosintética 27 Thiopedia sp. +++++ +++++ ++ ++
+: Presente, ++: Escasa cantidad, +++: Regular Cantidad, ++++: Abundante, +++++: Dominante. N.I.: no identificada.
Las microalgas observadas en fresco de las Lagunas de Estabilización fueron 27
géneros; de las cuales solo se lograron aislar en medios de cultivos sólidos, las
Chlorophyta: Chlorella, Scenedesmus, Oocystis, Chlamydomonas, Chlorophyta N.I.
(Forma de banano) y Chlorococcum. En cuanto a representantes de la División
Cyanophyta, se encontró Oscillatoria, Pseudanabaena, Lyngbya, Synechocystis y
Geitlerinema. Phacus y Euglena de la División Euglenophyta, y de la División
Chrysophyta, Nitzschia y Navicula.
Al momento de realizar reaislamiento en medio de cultivo líquido se obtuvieron solo
cultivos unialgales de las especies de Chlorella, Scenedesmus, Chlamydomonas,
Oocystis y Chlorococcum, Geitlerinema y Euglena. No obstante, el cultivo de Euglena
se mantuvo activo hasta 12-15 días. En cuanto a los cultivos mixtos, se lograron
mantener tres combinaciones: (Chlorella + Scenedesmus), (Euglena + Chlorella),
(Navicula + Chlorella + Thiopedia) (Tabla 9).
56
Tabla 9. Microalgas y cianobacterias observados durante el periodo de estudio en las Lagunas de Estabilización de una Planta extractora de aceite de palma.
MEDIO LIQUIDO (OBSERVACIÓN DIRECTA)
MEDIO SÓLIDO MEDIO LÍQUIDO
(CULTIVOS UNIALGALES-MIXTOS)
Oocystis sp. Oocystis sp. Oocystis sp.
Kirchineriella lunaris Chlorella sp. Chlorella sp.
Chlorella sp. Scenedesmus sp. Scenedesmus sp.
Clorofita N.I. Chlorococcum sp Chlorococcum sp.
Hyaloraphidium sp. Chlamydomonas sp. Chlamydomonas sp.
Coelastrum sp. Haematococcus sp. Geitlerinema sp.
Scenedesmus sp. Oscillatoria sp. Euglena sp.-Chlorella sp.
Chlorococcum sp. Geitlerinema sp. Euglena sp.-Navicula sp.
Ankistrodesmus sp. Pseudanabaena sp. Chlorella sp.-Navicula sp.-Thiopedia
Monoraphidium sp. Euglena sp. Chlorella sp.-Scenedesmus sp.
Chlamydomonas sp. Navicula sp.
Closteriopsis sp. Nitzschia sp.
Pandorina sp.
Haematococcus sp.
Lyngbya sp.
Oscillatoria sp.
Synechococcus sp.
Merismopedia sp.
Synechocystis sp.
Geitlerinema sp.
Pseudanabaena sp.
Chroococcus sp.
Euglena sp.
Phacus sp.
Navicula sp.
Nitzschia sp.
Thiopedia sp.
De las 27 cepas de microalgas, cianobacterias y bacteria fotosintética, observadas en
las lagunas de estabilización solo se aislaron 12 cepas en medio sólido, y 6 cepas en
medio líquido, y las microalgas que se mantuvieron en medio líquido pero en conjunto
con otras microalgas fueron 4 cepas. Esto indica que al final del proceso de aislamiento
se pudieron aislar y mantener bajo condiciones de laboratorio, solo 6 cepas.
Algunos de los géneros encontrados en estas aguas residuales coinciden con las
encontradas en aguas residuales municipales, industriales, agrícolas y de acuacultura.
Tal es el caso de las especies de: Chlorella, Scenedesmus, Ankistrodesmus, Oocystis,
Euglena, Chlamydomonas, y Nitzschia. Entre las especies de Cianobacterias, se han
57
reportado Oscillatoria, Chroococcus, Synechocystis, Synechococcus, Geitlerinema,
Pseudanabaena, Lyngbya y Merismopedia.
Figura 8. Micrografias (400x). (1) Primer Muestreo. a. Scenedesmus sp. b. Oscillatoria sp. c. Oocystis sp. d. Pandorina sp. e. Lyngbya sp. f. Chroococcus sp. (2) Segundo muestreo. g. Thiopedia sp. h. Pseudoanabaena sp. i. Euglena sp. j. Monoraphidium sp. k. Synechococcus sp. l. Ankistrodesmus sp. (3) Tercer muestreo. m. Haematococcus sp. n. Geitlerinema sp. o. Kirchineriella lunaris.
a b c
d e f
g h i
j k l
m n o
58
Mientras que, entre las bacterias fotosintéticas, Thiopedia (Sallal, 1986; Peinador, 1999;
Oudra y col. 2000)
En el primer, segundo, tercer y cuarto (1-2-3-4) muestreo respectivamente (Figura 8) se
encontraron diversidad de microorganismos fotosintéticos (Tabla 10); indicándonos que
las microalgas pueden encontrarse en las lagunas en cualquier época del año, sin
embargo, una sucesión de tipos de microalgas se produce durante las temporadas.
Algunos estudios han reportado microalgas, cianobacterias, diatomeas, ciliados y
bacterias fotosintéticas en varios lugares del mundo y por ende en varios tipos de clima.
Así; Peinador (1999); Colon, (2008) encontraron especies de Microcystis y Oscillatoria
en época seca y Calothrix, Merismopedia, Microcystis, Leptolyngbya, Oscillatoria,
Pseudanabaena, Phormidium y Planktothrix en época de lluvia, en dos ríos usados
como receptores de agua residuales y en el cabo rojo de Costa Rica.
Thajuddin y Subramanian (2005), reportaron en las costas de India a Trichodesmium
erythraeum, Ammeatoidea normanii, Dichothrix spiralis, Oscillatoria borneti,
Pseudoanchobrosa fluminenensis, Radaisia violácea, Siphononema polonicum,
Anabaena, Aulosira, Calothrix, Cylindrospermum, Gloeocapsa, Nostoc, Rivularia,
Scytonema y Tolypothrix. Y en lagos de la Florida: Anabaena, Aphanocapsa,
Dactylococopsis, Merismopedia, Oscillatoria, Dactylococcopsis, Microcystis y Lingbya
reportado. Y en Sao Paulo, Brasil en aguas tropicales y subtropicales del sur de
América 4 especies del genero Romeria, Geitlerinema unigranulatum, Arthrospira,
Planktothricoides y Hormoscilla por Komárek y Komárková (2007).
La Chlorophyta, como Chlorella, Scenedesmus, Micractinium, Ankistrodesmus y
Chlamydomonas y las Euglenophyta como Euglena suelen predominar en las lagunas
de tratamiento de aguas residuales y los géneros de microalgas flagelares como
Euglena, Leponicinclis, Chlamydomonas asociados con Micratinium; la biomasa es baja
en las lagunas 1, 2 y 3 probablemente al efecto del pH alto y concentraciones de NH3-N
altas y en las lagunas 4 y 5 es mayor (Wrigley y Toerien, 1990).
59
Las especies predominantes de algas dependen de las condiciones de crecimiento, en
particular la temperatura, carga orgánica, oxígeno, disponibilidad de nutrientes, y la
depredación. Otras especies son encontradas en estas lagunas como las
cianobacterias como Aphanothece, Microcystis, Anabaena y Oscillatoria
Tabla 10. Diversidad de microorganismos fotosintéticos en Lagunas de estabilización de una Planta extractora de aceite.
MICROALGAS LAGUNAS
ANAEROBIAS (1-2)*
LAGUNAS FACULTATIVAS
(3-4-5)**
MUESTREOS (VECES)***
Oocystis sp. X 2 Kirchineriella lunaris X X 1-2-3-4 Chlorella sp. X X 1-2-3-4 Hyaloraphidium sp. X 1 Coelastrum sp. X 1 Scenedesmus sp. X 2-3 Chlorococcum sp. X X 1-2-3 Ankistrodesmus sp. X X 1-2-3 A.falcatus X 1 Monoraphidium sp. X 1-2 Chlamydomonas sp. X 1-2 Closteriopsis sp. X 1 Pandorina sp. X 1-2 Lyngbya sp. X 1 Oscillatoria sp. X X 1-2-3-4 Synechococcus sp. X X 1-2 Merismopedia sp. X X 1-2-3-4 Synechocystis sp. X X 1-2-3 Geitlerinema sp. X 2-3-4 Pseudanabaena sp. X 2 Chroococcus sp. X 1-2-3-4 Euglena sp. X X 1-2-3-4 Phacus sp. X 1-2-3-4 Navicula sp. X X 1-2-3-4 Nitzschia sp. X 1-4 Thiopedia sp. X X 1-2-4 Haematococcus sp. X 2-3
(1-2)* Número de lagunas anaerobias. (3-4-5)** Número de lagunas facultativas. Veces*** se realizaron hasta 4 muestreos.
Los géneros encontradas en las lagunas de estabilización de un planta extractora de
aceite de palma coinciden con los estudios realizado por Vinces y col. (1971) indicando
que en este estudio se estudiaron lagunas de estabilización de agua residuales
60
municipales en San Juan Lima-Perú observando mayor diversidad de Chlorophyta (19
géneros) Actinastrum, Crucigenia, Chlorogonium, Elakatothrix, Gleocystis, Micractiniun,
Palmella, Pascheriella, Sphaerocystis, Stephanoptera, Tetraspora, Myrmecia y
Tetrastrum. Cyanophyta (12 géneros) Anacystis, Anabaena, Aphanocapsa, Calothrix,
Chroococcus, Gleocapsa, Nostoc, Scytonema, Spirulina, y Thalpophila. Euglenophyta
(2 géneros) Euglena y Phacus. Crysophyta (4 géneros) Chloromeson, Diceras,
Ceratoneis y Surirella y Pyrrophyta (1 género) Peridinium. Esta diversidad mayor es
debido a que la lagunas tienen longitudes de 7000m2; siendo más grandes que lagunas
de empresas industriales. Salazar, (2005); indico otro grupo como las Cryptophytas con
el género de Chryptomonas con una aplicación del 25% para lagunas de oxidación del
agua residual domestica de las instalaciones (laboratorios de docencia e investigación,
cafetería, actividades deportivas, aulas de clases) de la Universidad Autónoma
Metropolitana de Iztapalapa. Escorihuela y col. (2007), en un estudio de una laguna
con agua residual en la Universidad del Zulia Maracaibo (Centro de Investigaciones del
Agua CIA), reportó mayor incidencia del grupo Cyanophytas (Synechocystis),
Chlorophyta (Chlorella) y Euglenophytas (Euglena).
En sistema de tratamiento de agua residual municipal de Esmoruz-Portugal como
Planktothrix mougeotii, Microcystis aeruginosa, Pseudanabaena mucicola y en
industrias de papel encontramos dominancia de cianobacterias como Oscillatoria,
Phormidium, Geitlerinema y Pseudanabaena; además de Chroococcusa (Vanconcelos
y Pereira, 2001; Kirkwood y col. 2001).
a b c
61
Figura 9. Micrografias (400x). (4) Cuarto Muestreo. a. Navicula sp. b. Synechocystis sp. c. Phacus sp. d. Nitzschia sp. e. Merismopedia sp.
Las bacterias fotosintéticas purpuras, tales como, Chromatium, Thiocystis, Thiocapsa y
Thiopedia también crecen en lagunas facultativas, y en nuestro caso, sólo se observó
Thiopedia, en el cuarto muestreo (Figura 9). Estas bacterias dependiente de sulfuros
para su crecimiento, aportan la coloración rosada-roja a las aguas residuales y son
indicadoras de sobrecarga orgánica. En lagunas de estabilización de aguas residuales
municipales de Rosario-Argentina, se han descrito, la presencia de Thiocapsa y
Thiopedia como bioindicadoras de condiciones anóxicas y frecuentes durante todo el
tiempo de estudio (Igallinella y col. 2000).
4.1.1.1. Cultivos unialgales de las microalgas aisladas de las lagunas de estabilización
Todas las microalgas (Chlorella sp., Scenedesmus sp., Chlorococcum sp., Oocystis sp.
y Chlamydomonas sp.) crecieron satisfactoriamente en cultivos autotróficos con el
fertilizante, inclusive de inmediato exhibieron fase exponencial, desde el inicio del
cultivo hasta los días 9 y 12 (Figura 10a). Scenedesmus sp. produjo la mayor densidad
celular, con 36,89 x106 cel.mL-1; seguido de Chlorella sp. Mientras que la menor
densidad lo fue para Oocystis con 16,85 x106 cel.mL-1. Sin embargo, esta microalga es
de poco crecimiento, comparada al resto de las clorofitas evaluadas.
Para el caso de, la cianobacteria Geitlerinema sp., cuyo crecimiento se siguió mediante
turbidez, también expresó su fase exponencial desde el inicio hasta los 21-22 días, para
d e
62
luego alcanzar la fase estacionaria (Fig. 10b). De acuerdo a las curvas de crecimiento
obtenidas, se sugiere que todas estas microalgas se adaptaron fácilmente al medio y
condiciones de cultivo; lo cual significa, su posible utilización para estudios a nivel de
laboratorio.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
DC
(x 1
06ce
l.mL
-1)
Edad del cultivo (días)
Chlorella sp.
Scenedesmus sp.
Chlamydomonas sp.
Oocystis sp.
Chlorococcum sp.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
DC
(DO
75
0n
m)
Edad del Cultivo (días)
Geitlerinema sp.
Figura 10. a. Crecimiento comparativo de microalgas Chlorophyta. b. Crecimiento de la cianobacteria Geitlerinema sp., seguido mediante turbidez.
a
b
63
4.1.1.2. Aislamiento e identificación de bacterias asociadas a los cultivos de microalgas y cianobacterias.
De acuerdo a las diferentes pruebas bioquímicas, se identificaron cepas de:
Corynebacterium durum, Bacillus sphaericus, Delftia acidovorans, Actinobacillus
actinomycetemcomitans, Pasteurella stomatis, Pasteurella aerogenes,
Stenotrophomonas maltophilia, Brevundimononas diminuta y Staphylococcus hominis
(Tabla 11 y 12). Al menos en, agua residual de aceite de oliva se ha detectado Bacillus
sphaericus (Eusébio y col. 2007) y Stenotrophomonas maltophilia, asociada a la
biodegradación de polifenoles (Lee y col. 2002).
a. Bacterias Asociadas a Chlorella sp. 1 y 2: Se identificó a Corynebacterium
durum, bacilo gram positivo con forma de bastón, en el frotis teñido aparecen en
empalizada o como células individuales que yacen en ángulos agudos unas con otras
en formaciones en V (Figura 11). Las colonias son pequeñas, de color blanco, con
bordes irregulares y un poco mucoide. También, se encontró Bacillus sphaericus;
cuyas características morfológicas son las siguientes: bacilos gram-positivo grandes
con esporas terminales esféricas en agar nutriente las colonias son de color blanco con
bordes irregulares y grandes; en agar sangre las colonias son de color amarillo opaco
con bordes irregulares algunas son pequeñas y otras grandes (Figura 12).
Figura 11. Corynebacterium durum.
64
Figura 12. Bacillus sphaericus.
b. Bacterias asociadas a Oocystis sp.: En esta microalga se identificaron
Bacillus sphaericus, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Pasteurella stomatis y P.
aerogenes. Entre las características de A. actinomycetemcomitans se distinguen, las
de ser un bacilo gram-negativo pequeño, con colonias lisas o rugosas y opacas, con
apariencia del borde de un cigarrillo cuando es cortado. En cambio, las especies de
Pasteurella son bacilos gram-negativos, no motiles, cocoides pequeños individuales, en
pares o en cadenas. En agar sangre son grisáceas opacas y son mucoides, con bordes
irregulares y pequeñas. P. aerogenes las colonias en placas de Agar sangre en 1 día
están a 0,5 a 1mm de diámetro, convexas, lisas, translucientes y no hemolíticas; al igual
que otras especies P. aerogenes es ureasa + y produce gas en glucosa. P. stomatis su
diferenciación incluye acidificación de maltosa y manitol, producción de Indol y
descarboxilación de Ornitina.
c. Bacterias asociadas a Scenedesmus sp.: De esta microalga se aislaron e
identificaron: Corynebacterium durum, Bacillus sphaericus, Delftia acidovorans y
Staphylococcus hominis. Las características de D. acidovorans, la distinguen como
bacilo gram-negativo, aislado o en pares. Además, son catalasa y oxidasa positiva,
reducen el nitrato a nitrito, oxidan fructosa y manitol y producen una pigmentación
amarilla en los cultivos. D. acidovorans también, ha sido descrita como una bacteria
ambiental, localizada en suelo y agua, y al parecer no es patógeno en humanos (Rocco
y Knutson, 2005). Para el caso de, Staphylococcus hominis, este se presenta como un
65
coco gram-positivo, que ocurre en grupos y menos a menudo en pares, tétradas o
cadenas (3 o 4 células), no es motil, ni formador de esporas. Las colonias en agar
sangre son pequeñas de color amarillas-naranjas o cremas y no pigmentadas, lisas y
con bordes irregulares.
d. Bacterias asociadas a la cianobacteria Geitlerinema sp.: .De las cincos
bacterias, solo se identificaron tres y a continuación se describen sus características:
Stenotrophomonas maltophilia, bacilo gram-negativo, cuyas colonias son lisas, brillantes
y de color blanco a amarillento (Figura 13). Brevundimononas diminuta bacilos gram-
negativo sus colonias son circulares, convexas y brillantes, con márgenes lisos y son de
color amarillas o rosadas en agar sangre (Figura 14). Staphylococcus hominis, ya
descrita y asociada también a Scenedesmus. La cepa C-12 Blanca, bacilos Gram (-),
de tamaño grande y con esporas subterminales y la cepa C-12 Naranja, de cocobacilos
Gram (+) y oxidasa y catalasa positivas.
Figura 13. B. diminuta bacilo gramnegativo.
Figura 14. Colonias de Stenotrophomonas maltophilia.
66
e. Bacterias Asociadas a Chlorococcum sp.: En esta microalga se encontraron
tres bacterias asociadas: otra especie de Delftia diferente a la aislada de cultivo de
Scenedesmus, la cepa C-42, de bacilos Gram (–) pequeños y la cepa C-13, de bacilos
Gram (+) con esporas subterminales; y con oxidasa y catalasa positivas.
Los procesos biológicos del agua residual domestica pueden ser aerobios y anaerobios;
en donde se producen unos floculos los cuales pueden permanecer en la superficie o
se hunde y alcanzan un diámetro de 20-50cm. Entre las bacterias de los floculos
predominan las representantes de géneros con metabolismo aerobio-oxidativo como
Zooglea, Pseudomonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Corynebacterium, Acinetobacter,
Micrococcus y Flavobacterium. Pero también se presentan bacterias anaerobias
facultativas, que son fermentativas en ausencia de sustratos oxigenados, de los
géneros Aeromonas, Enterobacter, Escherichia, Streptococcus y distintas especies de
Bacillus. Todas las bacterias contribuyen con las cápsulas de mucílago y con las
microfibrillas al crecimiento colonial y a la formación de los floculos reportado por
Chacón, (2010); coincidiendo algunos de estos géneros con los cultivos de microalgas y
cianobacterias aisladas de las aguas residuales de una extractora de aceite de palma.
Otros microorganismos que también intervienen en el tratamiento aerobio de aguas
residuales son: Citrobacter, Serratia, mohos y levaduras que actúan mas de
componentes acompañantes que de degradantes y algunas algas como Anabaena sp.
que convierte los poliuretanos en H2; Chlorella sp. los alginatos los convierte en
glicolato y Dulaniella sp. los alginatos en glicerol reportado por Chacón, (2010).
Los resultados obtenidos indican que se aislaron 12 cepas en medio sólido, y 6 cepas
en medio líquido. Además, de lograrse cultivos mixtos con otras 4 microalgas. Esto
indica que al final del proceso de aislamiento se pudieron aislar y mantener bajo
condiciones de laboratorio, solo 6 cepas. De estos cultivos unialgales, se identificaron y
aislaron 13 cepas de bacterias, asociadas a los cultivos de Chlorella sp. 1 y sp. 2,
Scenedesmus sp., Oocystis sp., Geitlerinema sp. y Chlorococcum sp. en donde
predominaron 5 cepas como Chlorella sp., Scenedesmus sp., Euglena sp., Phacus sp. y
67
Thiopedia sp. en todas las lagunas y para todos los muestreos, las otras 22 cepas se
encontraron en menor proporción.
En cuanto a las pruebas bioquímicas, se identificaron 13 cepas de bacterias, de las
cuales se identificaron: Corynebacterium durum, Bacillus sphaericus, Delftia
acidovorans, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Pasteurella stomatis, Pasteurella
aerogenes, Stenotrophomonas maltophilia, Brevundimononas diminuta y
Staphylococcus hominis. Mientras que, se aislaron las C-12 Blanca, C-12 Naranja, C-
13 y la C-42, no identificadas.
4.1.2. Microalgas y su relación con los parámetros fisicoquímicos de las lagunas de estabilización de una extractora de aceite de palma
Los muestreos realizados a las lagunas de estabilización de una planta extractora de
aceite de palma permitieron determinar la abundancia y diversidad de los
microorganismos fotosintéticos por muestreo. De igual manera fueron caracterizadas
las muestras de aguas en función de los parámetros fisicoquímicos a fin de establecer
posibles relaciones con la población de microalgas, cianobacterias y bacterias
fotosintéticas presentes en este sistema de estabilización. Para ello, se realizaron
cuatro muestreos en las siguientes fechas: 30 de junio 2008, 14 de septiembre del
2008, 01 de diciembre 2008 y el 05 de mayo 2009.
En el muestreo 1, la población de microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintéticas
fue de 17,65; 4,35 y 0,04 x106 cel.mL-1 respectivamente. Entre las microalgas, las
Chlorophyta fueron las más abundantes, con 16,50 x106 cel.mL-1; mientras que, las
Euglenophyta y las Crysophyta presentaron los valores más bajos a nivel de clorofita,
con 0,73 y 0,42 x106 cel.mL-1 (Figura 15).
Entre los géneros de mayor abundancia en Chlorophytas, se observó a Chlorella sp.
con 13,86 x106 cel.mL-1 y seguido en orden descendente por Scenedesmus sp.,
Chlamydomonas sp., Monorhaphidium sp., Ankistrodesmus sp., Oocystis sp. y
68
Tabla 11. Características bioquímicas y diferenciales de Bacterias Gram-positivas asociadas a las Microalgas.
Chlorella
Scenedesmus
Chlorella
Oocystis
Cat
alas
a
Cal
do E
scul
ina
Ure
a
Esc
ulin
a
Características
- R +
Mel
obio
sa
Fen
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nina
Imel
ina
Bacillus sphaericus NR - + +
Mal
tosa
Man
itol
Cel
obio
sa
Mel
ixito
sa
Xilo
sa
Sac
aros
a
Bilis
Esc
ulin
a 10
%
Bilis
Esc
ulin
a 40
%
Clo
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de
Na
6%
Opt
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Glu
cosa
Lact
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Oxi
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Gel
atin
a al
4%
+ -
Bacterias Asociadas a las Microalgas
Sal
icin
a
Tre
halo
sa
Arg
inin
a
+ -
Corynebacterium durum NR
+ - - -- - + - - -+ + +
Glic
erol
D.C
.
O.F
.
Rib
osa
Indo
l
VP
Sal
icin
a
Sor
bito
l
Tet
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lium
- + - + - -
Nov
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cina
Piru
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Bac
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ina
Mot
ilidad
Alm
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Gel
atin
a
Nitr
ato
L-A
rabi
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Raf
inos
a
R - S - + ++ - - + + R
+/- R + - + ++ + - - + + + + - NR- - - + - NR - R NR NR +NR NR + +/- R RNR NR + +/- - -NR NR
Tabla 12. Caracterización bioquímica y de proliferación de las Bacterias Gram-negativas asociadas a los cultivos de microalgas.
Scenedesmus
Chlorococcum
A. actinomycetemcomitans + + - - + - + + - - - - - - NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR - - - - - NR + - - - - - NR NR NR NR NR NR NR NR NR
Pasteurella stomatis + + - - + - - - - - + - - - NR NR + NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR - - - - - - + - - - + - NR NR NR NR NR NR + NR NR
Pasteurella aerogenes - + + - + - + - - + + - - - NR NR + NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR - + - - - - + + - - - - NR NR NR NR NR NR - NR NR
S. maltophilia - + - + - - + - - - - - + + NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR - - - - - + + - NR + - NR + NR NR NR NR NR NR NR NR
Brevundimononas diminuta + + - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + + - - - - - - NR NR - NR NR - + NR NR NR NR NR NR
Scenedesmus
Geitlerinema+ + -
Características
+ - -NR NR NR NR+ - NR NR NR
D-T
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α-La
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Coa
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Aas
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l
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Geitlerinema
Staphylococcus hominis - + + -
L-S
erin
a
Ace
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Aco
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NR NR NR NR NR NR
+ - - - -- - + -
But
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Bacterias Asociadas a las Microalgas
Oocystis
L-A
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luta
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Cat
alas
a
NR NR
Ure
a
Esc
ulin
a
Glu
cosa
Lact
osa
Delftia acidovorans + + - + + - + - - - - - - - NR NR NR NR NR NR NRNR - - - - - NR + NR
a. (VP)Voges-Proskauer; (RM) Rojo de Metilo; (A-A) Arginina-Arilamidasa; (P-A) Pirolinodil-Arilamidasa.
69
Chlorococcum sp., con un total de 2,64 x106 cel.mL-1. Las cianobacterias, estuvieron
representadas por Merismopedia sp. con 1,93 x106 cel.mL-1, Synechocystis sp. con 1,92
x106 cel.mL-1 y en menor proporción por Oscillatoria sp. con 0,51 x106 cel.mL-1. En
cambio, se cuantificaron 0,51 y 0,22 x106 cel.mL-1 para Euglena sp. y Phacus sp.,
respectivamente, como euglenofitas.
0
5
10
15
20
25
30
35
12
34
17,65
8,48
31,19
4,60
4,35
3,33
0,520,30
0,040,11
0,000,02
DC
(x10 6
cel.m
L -1
)
Muestreos
Microalgas Cianobacterias Bac. Foto.
Figura 15. Población de microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintéticas en Lagunas de estabilización de una Planta extractora de aceite de palma, orden cronológico de los muestreos. Muestreo 1: junio-2008, muestreo 2: Septiembre 2008, muestreo 3: diciembre 2008, muestreo 4: mayo 2009.
En el muestreo 2, la abundancia de microorganismos fotosintéticos, continuó en el
siguiente orden descendente: microalgas>cianobacterias>bacterias fotosintéticas, con
densidades de 8,48; 3,33 y 0,11 x106 cel.mL-1, respectivamente. De igual manera, las
Chlorophyta las más abundantes con 7,97 x106 cel.mL-1 y su representante Chlorella sp.
con 5,73 x106 cel.mL-1. Entre las clorofitas, continuaron presente en un 2,24 x106
cel.mL-1, los géneros Scenedesmus, Chlamydomonas, Chlorococcum, Monorhaphidium,
Oocystis y Ankistrodesmus (Chlorophyta). Entre las diatomeas y euglenofitas, se
encontró la más abundante, Navicula sp. y Euglena sp. con 0,10 y 0,36 x106 cel.mL-1
respectivamente. Mientras que, de las cianobacterias, Merismopedia sp. fue la más
observada, con 2,01 x106 cel.mL-1.
70
En el muestreo 3, la mayor abundancia también correspondió a las microalgas con
31,19 x106 cel.mL-1; la cual fue las más elevada de todos los muestreos. Además, las
clorofitas mantuvieron su hegemonía en cuanto a las más abundantes en el sistema de
estabilización, con 30,08 x106 cel.mL-1. Es relevante, destacar que Chlorella sp.
contribuyó con el 96,3%, en relación a la población total de microorganismos
fotosintéticos y tan solo Chlorococcum sp. y Monorhaphidium sp., aportaron con 0,03
x106 cel.mL-1. En cambio, las cianobacterias estuvieron representadas en un 3,5%, de
la población total y mientras que, no fue observada presencia de bacterias fotosintéticas
en este muestreo (Figura 15).
Para el muestreo 4 observamos que la abundancia mayor fue en la microalgas con 4,45
x106 cel.mL-1, cianobacterias con 0,30 x106 cel.mL-1 y las bacterias fotosintéticas con
0,02 x106 cel.mL-1. De acuerdo a la distribución poblacional de los microorganismos
fotosintéticos en las diferentes lagunas y por muestreo se obtuvo, la mayor abundancia
de clorofitas en las lagunas 2, 3 y 4 en el primer muestreo, 2,64 x106 cel.mL-1, 2,79 x106
cel.mL-1 y 4,84 x106 cel.mL-1, respectivamente. Y para el caso de las cianobacterias con
3,09 x106 cel.mL-1 en la laguna 3. En el segundo muestreo en las lagunas 3, 4 y 5
también hubo la mayor dominancia en las clorofitas con 1,61 x106 cel.mL-1, 1,76 x106
cel.mL-1 y 1,87 x106 cel.mL-1 respectivamente; mientras que en la laguna 3, continuaban
predominando las cianobacterias con 2,95 x106 cel.mL-1. Para el tercer muestreo
observamos que las clorofitas mantuvieron su dominio en las lagunas 1, 2 y 3 con 1,42
x106 cel.mL-1, 14,22 x106 cel.mL-1 y 11,41 x106 cel.mL-1 respectivamente. De igual
manera, para el muestreo 4 se obtuvo la mayor densidad en clorofitas con 1,47 x106
cel.mL-1, 1,31 x106 cel.mL-1 y 1,33 x106 cel.mL-1 respectivamente en las lagunas 1, 2 y
3. Con respecto a las cianobacterias se determinó su predominio en la laguna 1 con
0,27 x106 cel.mL-1 y 0,22 x106 cel.mL-1 respectivamente para el tercer y cuarto muestreo
(Figura 16). Estos resultados también, indican que el mayor índice de abundancia se
encontró en las lagunas anaerobias del sistema, específicamente la laguna número 2.
71
0
1
2
3
4
5
E1AS1A
E2AE3F
E4FE5F
S5F
DC
(x10
6cel.m
L-1
)
Lagunas de Estabilización
Microalgas Cianobacterias Bfot
0
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2
3
E1AS1A
E2AE3F
E4FE5F
S5F
DC
(x10
6cel.m
L-1
)
Lagunas de Estabilización
Microalgas Cianobacterias Bfot
72
0
2
4
6
8
10
12
14
16
E1AE2A
E3FE4F
E5F
DC
( x
10
6cel.m
L-1
)
Lagunas de Oxidación
Microalgas Cianobacterias Bfot
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
E1AE2A
E3FE4F
E5F
DC
( x
10
6cel.m
L-1
)
Lagunas de Oxidación
Microalgas Cianobacterias Bfot
Figura 16. Abundancia de microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintéticas según los sitios de muestreos en lagunas de estabilización de una Planta extractora de aceite de palma, de acuerdo al orden de los muestreos. a. Muestreo 1. b. Muestreo 2. c. Muestreo 3 y d. Muestreo 4.
73
4.1.2.1. Demanda Química de Oxigeno (DQO): La demanda química de oxigeno
constituye un parámetro esencial para caracterizar la calidad del agua residual y su
análisis permanente indicará la efectividad de su remoción en el transcurso del tiempo,
del tipo de laguna y de las condiciones de operación de la misma. Los resultados
obtenidos a través de los muestreos en las diferentes lagunas, aportan una variabilidad
de los valores de remoción, los cuales aproximan hacia una reducción de la DQO con la
transferencia del efluente desde la laguna 1 hasta la 5 (Tabla 13).
Tabla 13. DQO (mg.L-1) en las lagunas estabilización de acuerdo a cada muestreo.
Muestreos
Laguna 1 2 3 4
1 787,66 14.804,49 1.243,25 1.830,43*
2 941,21 14.847,22 8.004,04* 1.381,23*
3 914,51 7.626,38* 4.771,58 569,83
4 687,52* 13.736,32 4.303,79 883,20
5 460,54 8.267,28 1.723,33 1.031,83 *: Lagunas con los valores más elevados de densidad celular de microalgas y cianobacterias.
De igual manera, estos resultados parecen no relacionarse con los obtenidos para el
nitrógeno, fósforo y grasas, en el sentido que se registra un claro descenso de los
niveles respectivos, según se va transfiriendo el agua residual de una laguna a otra,
hasta llegar a la número 5, en donde se considera teóricamente que debe contener los
valores más bajos, como producto del proceso de remoción obtenidos gradualmente.
4.1.2.2. Sólidos Suspendidos Totales (SST): Los sólidos indican que a
medida que el residual va pasando por las diferentes lagunas este va disminuyendo a
valores bajos de 78,00mg.L-1 removiendo casi la totalidad de los sólidos en estas
lagunas de estabilización. Asimismo se puede afirmar que este parámetro no tiene
ninguna relación con la densidad encontrada de microalgas, cianobacterias y bacterias
fotosintéticas en estas lagunas, a su vez estas no co-ayudan al aumento de la
concentración de los sólidos en las lagunas de estabilización.
74
Tabla 14. SST (mg.L-1) en las lagunas estabilización de acuerdo a cada muestreo.
Muestreos
Laguna 1 2 3 4
Laguna 1 266,00 3.060,00 11.400,00 530,77*
Laguna 2 432,00 1.436,00 390,00* 330,00*
Laguna 3 80,00 600,00* 263,33 185,00
Laguna 4 60,00* 420,00 127,50 133,33
Laguna 5 80,00 166,00 78,00 440,00 *: Lagunas con los valores más elevados de densidad celular de microalgas y cianobacterias.
Tabla 15. SSV (mg.L-1) en las lagunas estabilización de acuerdo a cada muestreo.
Muestreos
Laguna 1 2 3 4
Laguna 1 160,00 20,00 14.800,00 392,31*
Laguna 2 316,00 5,00 650,00* 290,00*
Laguna 3 64,00 0,00* 1.663,33 155,00
Laguna 4 40,00* 2,50 1.032,50 110,00
Laguna 5 44,00 4,00 330,00 376,00 *: Lagunas con los valores más elevados de densidad celular de microalgas y cianobacterias.
Para los muestreos, M-1 (Muestreo 1); M-2 (Muestreo 2); M-3 (Muestreo 3) y M-4
(Muestreo 4); para la materia orgánica compuesta por (DQO, SST y SSV), en DQO
indica que para M-1, M-2 y M-3 (941,21-14.847,22-8.004,04mg.L-1 respectivamente), la
laguna 2 aporta la mayor DQO, mientras que en M-4 la laguna 1 (1.830,43mg.L-1)
aporta la mayor DQO (Tabla 13). En SST indica que, en M-1 la laguna 2 (432,00mg.L-1)
aporto la mayor cantidad de SST, y en el muestreo M-2, M-3 y M-4, la laguna 1
(3.060,00-11.400,00-530,77mg.L-1) aporto la mayor cantidad de este parámetro (Tabla
14). Para SSV, en M-1 la laguna 2 (316,00mg.L-1) aporto la mayor cantidad de SSV,
pero en M-2, M-3 y M-4, la laguna 1 (20,00-14.800,00-392,81mg.L-1) aporto la mayor
cantidad de SSV (Tabla 15).
El fitoplancton puede aprovechar estos compuestos, junto con el dióxido de carbono
atmosférico, el amoníaco y el ortofosfato del agua residual, como sustancias nutritivas
para su crecimiento; es de considerar, que una parte de los sólidos en suspensión
están formados por materia orgánica, algas o microorganismos; observamos que en los
75
muestreos la variación de los sólidos es debida a la cantidad de materia orgánica que
poseen las aguas residuales de una extractora de aceite.
La actividad fotosintética del fitoplancton genera oxígeno que puede ser utilizado por las
bacterias aerobias heterótrofas para degradar la materia orgánica y disminuir la DBO5
del agua residual (García, 1998). Pero observamos también que cuando hay poca
cantidad de nutrientes las microalgas y bacterias fotosintéticas proporcionan una
población alta indicándonos que estos microorganismos al tener la cantidad suficiente
de materia orgánica la óptima crecen bien; y cuando hay unos valores intermedios en
DQO, SST y SSV las microalgas como bacterias bajan en su población. También la
cantidad de materia orgánica se ve influenciada por la calidad del fruto de la Palma de
Aceite (Elaeis guineensis), debido a que en los periodos de lluvia el fruto viene con un
alto índice de descomposición debido a que los recolectores (Camiones) se demoran
para transportarlos hasta el sitio donde este es procesado (Extractora de Aceite). A su
vez la carga orgánica en las lagunas de oxidación de una extractora de aceite es
influenciada por los periodos de mayor producción y toneladas de la palma africana
recibidos para el proceso de extracción del aceite, indicándonos que los meses de
mayor producción son de abril a noviembre donde es el periodo de Invierno y HAY
mayor producción para este tipo de plantaciones (Fedepalma, 2008)
4.1.2.3. Nitrógeno: En relación al orden de entrada de los efluentes desde la
laguna 1 hasta la laguna 5, se registró igualmente, la mayor concentración de nitrógeno
en este sentido y con los valores más elevados en el muestreo 2 y 4 (Tabla 16). Es por
ello que, a la salida del sistema se verifica una excelente remoción de nitrógeno; con lo
cual se sugiere que el sistema de estabilización es eficiente.
En términos de la cantidad de microalgas como referencia, se describe una amplia
distribución de dicha población en todos los rangos de concentración de nitrógeno, el
hecho de que los valores más elevados de población se fueron obteniendo para las
lagunas 4, 3, 2 y 1; conforme se realizaron los muestreos 1, 2, 3 y 4, se sugiere la
existencia de otros factores combinados que expliquen la variabilidad de la población
76
por laguna. Incluso, el elevado contenido de nitrógeno en la laguna 1, de acuerdo al
cuarto muestreo deduce que, tampoco esta condición restringe el crecimiento
microalgal.
Tabla 16. Nitrógeno Total (mg.L-1) en las lagunas estabilización de acuerdo a cada muestreo.
Muestreos
Laguna 1 2 3 4
1 104,72 6.594,00 252,00 5.474,00*
2 111,72 1.358,00 60,48* 3.796,80*
3 6,72 770,00* 43,68 2.811,20
4 3,36* 175,00 23,52 896,00
5 3,92 161,00 4,48 201,60 *: Lagunas con los valores más elevados de densidad celular de microalgas y cianobacterias.
4.1.2.4. Fósforo: Los análisis de fósforo realizados por laguna y muestreo,
también son indicativos de una buena remoción a partir de la laguna 1, hasta terminar
en la laguna 4 y 5 (Tabla 17). Por otra parte, se observa que los residuales no portan
concentraciones elevadas de fósforo y por lo tanto, se registran valores bajos en la
laguna 5. Es conocido, que la remoción de fósforo no alcanza niveles óptimos, tanto en
procesos químicos como en los biológicos.
Tabla 17. Fósforo Total (mg.L-1) en las lagunas estabilización de acuerdo a cada muestreo.
Muestreos
Laguna 1 2 3 4
1 47,86 223,21 28,07 28,03*
2 46,49 94,01 14,72* 15,56*
3 4,53 91,22* 8,09 10,80
4 3,50* 56,88 4,55 9,57
5 5,84 28,98 3,59 7,64 *: Lagunas con los valores más elevados de densidad celular de microalgas y cianobacterias.
Igualmente, la población microalgal, de cianobacterias y bacterias fotosintéticas,
también se ubicaron en diferentes niveles de concentración de fósforo, desde los más
bajos, de 3,50 hasta de 91,22 mg.L-1 (Tabla 17); lo cual indica que la distribución de
estos microorganismos no dependió exclusivamente del fósforo para su crecimiento.
77
4.1.2.5. Aceites y Grasas: Los valores más elevados de grasas y aceites en los
cuatro muestreos fueron obtenidos en la laguna 1; lo cual evidencia la alta carga de
materia orgánica que directamente recibe este reservorio como producto de la
extracción del aceite de palma. Además, se demuestra la eficiente remoción de grasas
desde la laguna 1 hasta la 5 (Tabla 18). Es decir, se observa la tendencia de una
remoción drástica en la laguna 2, para luego definirse otra remoción en la quinta
laguna.
En relación a la población de microalgas encontrada por laguna y por muestreo (Figura
16a, 16b, 16c y 16d) se infiere que los valores de población de microalgas se
determinaron a una concentración de grasas y aceites, entre 31,03 y 16.244,44mg.L-1;
lo que significa que su contenido no parece influir en el crecimiento de las microalgas.
Sin embargo, a los niveles más elevados entre 19.465,54 y 411.251,11mg.L-1 (Tabla
18), presentes en la laguna 1, hubo crecimiento significativo de microalgas, pero no
alcanzaron poblaciones que superara a las obtenidas en otras lagunas.
Por otra parte, es importante destacar que, la concentración más elevada de grasas y
aceites se detectó en el muestreo 1 (Figura 17); lo cual estaría relacionado
principalmente con el volumen de extracción de aceite de palma procesado para esa
fecha del muestreo.
Tabla 18. Grasas y aceites (mg.L-1) en las lagunas de estabilización de acuerdo a cada muestreo.
Muestreos
Laguna 1 2 3 4
1 411.251,11 125.042,57 119.465,54 31,03*
2 13.151,11 3.998,65 8.264,19* 8,33
3 12.022,22 3.655,41* 15.073,65 5,38
4 16.244,44* 4.939,19 27,03 3,89
5 8.962,22 2.725,00 13,51 3,33 *: Lagunas con los valores más elevados de densidad celular de microalgas y cianobacterias.
78
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
Muestreos
92326,22
28072,16 28568,78
10,39
Gra
sas
y A
ceite
s (m
g.L-
1)
M-1 M-2 M-3 M-4
Figura 17. Grasas y aceites (mg.L-1) en las lagunas de estabilización de acuerdo a los muestreos.
4.1.3. Variación del pH en las lagunas de estabilización de una planta extractora de aceite
La determinación del pH constituye un parámetro esencial para detectar grado de
acidez o de alcalinidad de las aguas residuales según el tipo de laguna, sea anaeróbica
facultativa o de maduración. De tal forma, que los diferentes procesos biológicos,
químicos y fisicoquímicos sean considerados en función de los valores obtenidos de
pH. De acuerdo, a los muestreos realizados se observó poca variabilidad desde la
entrada de la primera laguna (L1) hasta la salida de la última laguna de maduración
(L5). En este orden se apreció un incremento del pH desde 7,51 hasta 8,95 en el
primer muestreo. De la misma manera, ocurrió en los otros muestreos, en donde se
registra el menor pH en la primera laguna y a medida que avanza el sistema de laguna
el pH incrementa, de pH 9,07 a 10,51 en el segundo muestreo y de pH 6,00 a 8,30 en el
cuarto muestreo (Tabla 19).
79
Tabla 19. Monitoreo del pH en las Lagunas de Estabilización.
Muestreos Laguna 1 2 3 4
L1E 7,51 9,07 8,00 6,00
L1S 7,70 9,35 8,38 6,98
L2S 7,60 9,90 7,70 7,20
L3S 7,73 10,30 8,30 7,70
L4S 9,44 10,88 8,75 7,90
L5E 9,42 10,37 8,80 8,20
L5S 8,95 10,51 8,90 8,30
Diversos estudios reportan una oscilación del pH en torno a la neutralidad y alcalinos
dependiendo del tipo de residual que se esté procesando. A propósito, Hosetti y Patil,
(1992), indican que, el pH varía también en función de la concentración de CO2 que se
esté generando como producto metabólico y dado que las actividades de los consorcios
microbianos se adaptan a los cambios que puede afectar el pH.
Los elevados valores de los parámetros fisicoquímicos del sistema de estabilización
durante los cuatro muestreos, reflejan el exceso característico de materia orgánica, N, P
y de grasas típicos de estos residuales. Sin embargo, a pesar de estos niveles
elevados en todas las lagunas, estos ejercen un efecto sobre la adaptación, diversidad,
abundancia y competencia de los microorganismos fotosintéticos. Es decir, la
variabilidad en el tamaño de la población de las microalgas y cianobacterias, está
condicionada al acceso de estos; a la materia orgánica, fuentes de nitrógeno y fósforo,
entre otros. De tal manera que, las variaciones de la población estarían modulas por
las concentraciones de DQO, N y P, existentes en las lagunas. Así, se puede inferir,
que la mayor población observada en el primer y tercer muestreo, podría estar
influenciada por las concentraciones de Nitrógeno (46,09 y 76,83mg.L-1); ya que las
concentraciones más elevadas para el segundo y cuarto muestreo (1.811,60 y
2.635,92mg.L-1) se reduce la población total de 11,92 x106 cel.mL-1 a 4,91 x106 cel.mL-1.
En cambio, el fósforo y las grasas-aceites, parecen no ejercer influencia directa sobre
los cambios poblaciones de microalgas y cianobacterias.
80
Exoenzimas en microalgas y en sus bacterias asociadas, aisladas de Lagunas de Estabilización de una Planta
extractora de aceite de palma
81
4.2.1. Exoenzimas en microalgas y sus bacterias asociadas
La presencia de las exoenzimas amilasa, fosfatasa, ureasa, proteasa y celulasa, fue
estudiada en las microalgas Chlorella (cepas sp. 1, sp. 2 y sp. 3), Scenedesmus (sp. 1 y
S. ecornis), Chlorococcum, Oocystis, Chlamydomonas, Euglena y en las cianobacterias:
Synechocystis y Geitlerinema; así como en sus bacterias asociadas (Tabla 20, 22 y 24);
ya que en estos microorganismos demostraron excelente crecimiento y adaptación en
condiciones de laboratorio.
4.2.1.1. Amilasa: De acuerdo al método en medio sólido con almidón (0,2%), se
encontró, que los mayores diámetros de los halos estuvo en el siguiente orden
descendente: Chlorella sp. 2> Chlorococcum sp.> Scenedesmus ecornis> Chlorella sp.
1; siendo los valores promedios para Chlorella sp. 2, y Chlorococcum de 6,29±0,16cm y
3,18±1,42cm respectivamente. Mientras que, la menor producción del halo se obtuvo
en las especies de Chlamydomonas, Geitlerinema y Synechocystis con 0,45±0,18cm,
0,60±0,57cm y 0,63±0,07cm respectivamente (Figura 18).
En cuanto a la detección de amilasa en las bacterias asociadas, se observó una
formación de halos muy pequeños como para ser medidos sus diámetros. En cambio,
no se demostró presencia de amilasa en las bacterias A. actinomycetemcomitans y P.
aerogenes asociadas a la microalga Oocystis sp.; en Brevundimononas diminuta y cepa
blanca C-12 asociadas a la cianobacteria, Geitlerinema sp. y en las cepas C-42 y C-13
asociadas a la microalga Chlorococcum sp. (Tabla 20).
El hecho de encontrar una mayor producción de amilasa en bacterias, que en
microalgas, sugiere que estas presentan capacidad mixotrófica, de utilizar compuestos
orgánicos, como el almidón como sustrato para la asimilación de glucosa en el medio
de cultivo. No obstante, se esperaba una elevada actividad en las bacterias, en función
de su mayor versatilidad y velocidad para utilizar diversos sustratos en su medio
natural; ya que al menos en otras especies de bacterias, esta descrita una alta actividad
82
de amilasa. Tal es el caso de cepas de Thermoactynomyces y Thermomonospora
productoras versátiles de α-amilasas. Además, del género Bacillus sp. caracterizado
por una gran variedad de amilasas, producida por B. licheniformes, B. subtilis y B.
coagulans. En bacterias acido lácticas también se ha descrito en Lactobacillus
amylophilus, L. amylovorans, L. plantarum y L. manihotivorans. Así como en
Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius, Streptococcus pneumoniae y en
Salmonella typhimurium (Simpson y Russell, 1998; Aguilar y col. 2000; Haq y col. 2003;
Swain y Ray, 2007).
Figura 18. Presencia de amilasa en medio sólido (almidón al 0,2%) en microalgas y bacterias asociadas. a. Oocystis, b. Chlorella, c. Scenedesmus, d. cepa bacteriana C-12 Naranja, e. A. actinomycetemcomitans, f. S. maltophilia.
Los resultados sobre la detección de amilasa en las microalgas, también indican que en
los cultivos sólidos con almidón, no hubo presencia de crecimiento bacteriano; con lo
cual se sugiere que la expresión de dicha enzima, obedece más a la actividad
intrínseca de cada microalga, y no a la de su flora bacteriana asociada.
Los análisis de amilasa determinados en cultivo líquido y mediante espectrofotometría,
también indicaron que la cepa de Chlorella sp. 2, fue la de mayor capacidad hidrolítica
sobre almidón, con 1,155U/g, seguido de Scenedesmus sp. y Chlorococcum sp. con
a b c
d e f
83
0,960U/g y 0,956U/g respectivamente. Mientras que, para el cultivo mixto de Chlorella
sp. 1 y S. ecornis se determinó una actividad de 1,050U/g (Figura 19).
0
0,4
0,8
1,2
1,6
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
U/g
Edad del Cultivo (horas)
Chlorella sp. 2
Scenedesmus sp.
Chlorococcum sp.
Chlorella sp./S. ecornis
Figura 19. Variación de la actividad amilasa (U/g) en microalgas, en función del tiempo (h).
Tabla 20. Amilasa en microalgas y bacterias asociadas. Microalga Amilasa Halo(cm) Microalga Bacterias asociadas Amilasa
Chlorella sp 1 +++ 2,11 C. durum +
Scenedesmus sp. 1 ++ 1,70 Chlorella sp.
B. sphaericus +
C. durum + Oocystis sp. ++++ 1,77
B. sphaericus + Euglena sp. ++ 0,80 D. acidovorans +
Chlorococcum sp. ++++ 3,18
Scenedesmus sp.
S. hominis +
Synechocystis sp. ++ 0,63 B. sphaericus + Scenedesmus ecornis.
+++++ 2,73 A. actinomycetemcomitans -
Chlorella sp 2 +++++ 6,29 P. stomatis +
Chlorella sp 3 ++ 1,35
Oocystis sp.
P. aerogenes -
Geitlerinema sp. + 0,60 S. hominis +
Chlamydomonas sp + 0,45 S. maltophilia +
. B. diminuta -
C-12 Blanca -
Geitlerinema sp.
C-12 Naranja +
C-42 -
Delftia sp. +
Chlorococcum sp.
C-13 -
84
Es importante resaltar que la actividad de amilasa expresó un incremento con el tiempo
de exposición del sustrato en el cultivo, hasta unas 6 y 8 horas, para las diferentes
microalgas, y luego parece describir una fase estacionaria, por el mantenimiento de la
actividad enzimática más o menos constante. Aun cuando a las 12 horas, se observó
un incremento ligero de la hidrólisis del almidón para todas las microalgas. Esto
significa que, la amilasa puede ser detectada a cualquier tiempo a partir de la
inoculación del sustrato (Figura 19).
En cultivos líquidos con diferentes concentraciones de almidón (0.5, 1.0, y 3.0%)
también se ha descrito presencia de actividad de amilasa en condiciones mixotróficas y
heterotróficas de Chlorella sorokiniana, aislada de un embalse de agua; lo cual
demostró la elevada capacidad de esta microalga en condiciones axénicas de expresar
una amilasa inducible a la presencia de almidón en el medio de cultivo (Moronta, 2001).
La presencia de amilasas en estas microalgas procedentes de aguas residuales de una
planta extractora de aceite de palma, confiere un aporte valioso para el diseño de
inóculos productores de estas enzimas hidróliticas que puedan acelerar el proceso de
remoción de materia orgánica. A propósito, se ha reportado que las amilasas alcalinas
son las principales responsables de la hidrólisis del lodo biodigerido en el tratamiento de
aguas residuales y constituyen una herramienta para prevenir contaminantes
ambientales; además de ser utilizadas en la industria de detergentes (Burgess y
Pletschke, 2008). De igual manera, Nybroe y col. (1992) demostraron que el almidón
hidrolizado en lagunas de estabilización municipal, es un reflejo del incremento en la
actividad de la α-glucosidasa presente en el lodo activado del sistema, aunado a la
intervención del sulfuro, como activador de la actividad de β-glucosidasas en la
degradación de celulosa (Watson y Pletschke, 2006).
4.2.1.2. Lipasa: La presencia de lipasa mediante el uso del medio de cultivo con
yema de huevo fue observada en especies de Chlorella, Scenedesmus,
Chlamydomonas y Euglena. De acuerdo, al diámetro del halo de hidrólisis se encontró
que el mayor halo se produjo en las cepas de Chlorella sp. 2 y 1, respectivamente con
85
4,97±0,39cm y 4,73±0,01cm, seguido de Scenedesmus sp. con 3,14±0,70cm y S.
ecornis con 2,56±0,58cm con y sin peptona. La menor hidrólisis se presento en
Chlorella sp. 3, y Chlamydomonas sp. con halos de 0,15±0,00cm y 0,15±0,00cm
respectivamente, seguido por el género Euglena sp. con un halo de 0,24±0,08cm
(Figura 20).
Figura 20. Lipasa en microalgas. Medio Yema de Huevo: a. Chlorella sp.1, b. Chlorococcum, c. Oocystis. Medio Tween 80: d. Euglena, e. Oocystis, f. Chlorella sp. 3.
Cuando se analizó la presencia de lipasa con tween 80 (con o sin peptona), se observó
el mayor halo de actividad en Chlorella sp. 2 con 3,15±0,15cm y en Oocystis sp. con
1,50±0,35cm. En cambio, Geitlerinema sp. y Euglena sp. demostraron poca actividad
hidrolítica sobre este sustrato, con 0,33±0,04cm y 0,37±0,01cm respectivamente. Para
el caso del método espectrofotométrico con para-nitrofenil palmitato (p-NPP), se detectó
la mayor actividad en las tres cepas de Chlorella con 0,804±0,001; 0,608±0,03 y
0,504±0,002U/mL, en Chlorella sp. 2, Chlorella sp. 1 y Chlorella sp. 3 respectivamente.
Este método también permitió detectar en Chlamydomonas, la presencia de otra lipasa,
debido a que se obtuvo una actividad de 0.302±0,001U/mL, al menos moderada, en
relación a las otras microalgas y cianobacterias. Caso similar para Oocystis sp., que a
a b c
d e f
86
pesar de haber exhibido una actividad moderada en los medios con yema de huevo y
tween 80, no acusó actividad significativa con el sustrato p-NPP (Tabla 21).
Estos resultados sugieren que, la detección de lipasa obedece también al tipo de
sustrato utilizado y en consecuencia, al tipo de esterasa que pueda actuar sobre los
mismos. Es decir, en presencia de yema de huevo se describe a una lecitinasa
(fosfolipasa); con p-nitrofenilpalmitato se demuestra una lipasa específica para hidrolizar
el ester entre un grupo aromático y el ácido graso; y en presencia de tween 80, la de
una lipasa actividad y solubilizada con este detergente.
Las lipasas o enzimas lipolíticas son usadas para la hidrólisis de grasas, síntesis de
glicéridos-esteres y modificación de lípidos, se caracterizan por intervenir la interface
agua/lípido y dada su alta especificidad respecto al tipo y posición especifica del residuo
del acido graso, tiene aplicaciones en el área de los biosurfactantes, industria
alimentaria, oleoquímica, procesamiento del café, en cosmética, perfumería y en el
tratamiento de aguas residuales (Khan y col. 2003; Singh y col. 2006; de Azeredo y col.
2007). De tal manera que, las lipasas encontradas en las microalgas evaluadas,
pudiesen ser base de estudios destinados a la producción de las mismas; con lo cual se
destaca que Chlorella, Scenedesmus y Oocystis, exhibieron la mayor actividad lipasa,
comparada a otras microalgas y cianobacterias evaluadas. Mientras que, de acuerdo a
los dos métodos utilizados se estableció el siguiente orden descendente de actividad:
Chlorella sp. 2>Chlorella sp.1>Scenedesmus sp.1>Scenedesmus ecornis>Oocystis sp.
En relación, a las bacterias asociadas a los cultivos de microalgas, se encontró una
baja actividad de lipasa. Al menos con yema de huevo, se obtuvo, un mayor diámetro
de los halos. En este caso, Pasteurella stomatis asociada a Oocystis sp., las cepas C-
12 Naranja y C-12 Blanca asociada a Geitlerinema sp. y la cepa C-42 asociada a
Chlorococcum sp., resultaron más evidentes para lipasa (Figura 21). Mientras que,
para el ensayo con p-NPP todas las cepas bacterianas exhibieron valores entre 0,01-
0,03 U/mL (Tabla 22).
87
Estos resultados contribuyen a sugerir que, las bacterias en comparación con las
microalgas presentaron una menor hidrólisis enzimática de lipasa. No obstante, las
actividades lipolíticas de las cepas aisladas de microalgas y bacterias asociadas, de
residuales de una extractora de aceite de palma, pueden tener un papel importante en
la eliminación de grasas de las plantas de tratamiento de aguas residuales con una
elevada cantidad de grasa.
Es posible, que en condiciones ambientales y en presencia de los residuales de la
laguna estudiada, se pueda estimular la producción de lipasas en las bacterias y quizás
en mayor grado en las microalgas. Al respecto, se ha descrito la participación de
Acinetobacter, en la degradación de grasas en los procesos de tratamiento de lodos
activados de una planta extractora de aceite de oliva (Chappe y col. 1994).
Figura 21. Presencia de lipasa en bacterias asociadas. Medio Yema de Huevo: a. Stenotrophomonas maltophilia, b. Staphylococcus hominis, c. Actinobacillus actinomycetemcomitans, Medio Tween 80: d. cepa C-12 Naranja, e. cepa C-42 Bacillus sphaericus, e. Staphylococcus hominis.
Las lipasas son utilizadas para hidrolizar aceites y grasas en el tratamiento de aguas
residuales industriales y en el tratamiento diario de aguas residuales; la utilización de
una tecnología enzimática asociada con el tratamiento biológico anaeróbico de aguas
a b c
d e f
88
Tabla 21. Lipasa en Microalgas. Microalga Tween 80* Halo Tween 80** Halo Yema Huevo* Halo Yema Huevo** Halo Lipasa p-NPP (U/mL)
Chlorella sp. 1 ++ 0,70 + 0,35 +++++ 4,72 +++++ 4,74 0,608 Scenedesmus sp. ++ 1,21 +++ 1,20 +++++ 3,64 ++++ 2,65 0,038 Oocystis sp. +++ 1,74 +++ 1,25 ++++ 2,62 +++ 1,79 0,009 Euglena sp. + 0,37 + 0,38 + 0,18 + 0,30 0,011 Chlorococcum sp. ++ 0,85 + 0,15 ++ 0,95 ++ 0,85 0,022 Synechocystis sp. + 0,55 ++ 0,65 + 0,35 ++ 0,60 0,008 Scenedesmus ecornis ++ 1,35 +++ 1,10 ++++ 2,15 ++++ 2,97 0,075 Chlorella sp. 2 +++++ 3,04 +++++ 3,25 +++++ 4,70 +++++ 5,25 0,804 Chlorella sp. 3 ++ 1,55 + 0,45 + 0,15 + 0,15 0,504 Geitlerinema sp. + 0,35 + 0,30 +++ 1,45 +++ 1,20 Chlamydomonas sp. ++ 0,75 + 0,20 + 0,15 + 0,15 0,302
*Con peptona; **Sin Peptona. Halo (cm).
Tabla 22. Lipasa en bacterias asociadas a microalgas, método en placa y espectrofotométrico (p-NPP).
Microalga Bacterias Asociadas Tween 80 Yema Huevo Lipasa p-NPP (U/mL)
C. durum + + 0,02 Chlorella sp.
B. sphaericus + + 0,03 C. durum + + 0,02 D. acidovorans + - 0,01 Scenedesmus sp. S. hominis + + 0,02 B. sphaericus + + 0,03 A. actinomycetemcomitans - - 0,02 P. stomatis - +++ 0,01
Oocystis sp.
P. aerogenes - - 0,02 S. hominis + + 0,02 S. maltophilia + + 0,01 B. diminuta - + 0,02 C-12 Blanca - +++ 0,02
Geitlerinema sp.
C-12 Naranja ++ +++ 0,03 C-42 + ++++ 0,02 Delftia sp. + + 0,01 Chlorococcum sp.
C-13 - - 0,02
89
residuales disminuye la grasa que afecta el lodo en reactores anaeróbicos (Leal y col.
2002; 2006).
Mudryk y Skórczewski, (2006), estudiaron el lago estuarino Gardno encontrando una
comunidad fototrófica dominada por cianobacterias Anabaena flos-aquae,
Aphanizomen-non flos-aquae y microcystis aeuginosa y cepas bacterianas
heterotróficas que son activamente lipolíticas, las cuales transforman y modifican los
compuestos de lípidos en cuerpos de agua. También se ha reportado que las
actividades lipolíticas en digestores anaeróbicos de aguas residuales aumentan su
actividad por la presencia de sulfuros y sulfitos y son inhibidas por sulfatos (Whiteley y
col. 2003a;b).
4.2.1.3. Proteasa: Todas las microalgas dieron positivo para la licuefacción de la
gelatina e hidrólisis de la caseína (Figura 22), con lo cual se infiere que ambos sustratos
pueden ser utilizados por estos microorganismos fotosintéticos. Para el caso, de la
actividad sobre caseína se reportaron los valores más altos para Scenedesmus sp.,
Chlorococcum sp. y Chlorella sp. 3 con 0,701±0,009U/mL, 0,695±0,007U/mL y
0,656±0,005 U/mL respectivamente. Solo Euglena sp. y Chlamydomonas sp. mostraron
bajas actividades, con 0,295±0,006U/mL y 0,486±0,003U/mL (Tabla 23).
Tabla 23. Exoenzimas (proteasa, ureasa, celulasa y fosfatasa) en microalgas.
PROTEASA FOSFATASA (U/mL) CELULASA UREASAMicroalga
Gelatina (caseína)
(U/mL) Rango
(31-115) Celulosa Halo (cm)
Urea (0,1%)
Chlorella sp. 1 + 0,578 35 + 0,4 + Scenedesmus sp. + 0,701 0 + 0,3 + Oocystis sp. + 0,579 0 + 0,3 + Euglena sp. + 0,295 0 + 0,1 + Chlorococcum sp. + 0,695 0 + 0,1 + Synechocystis sp. + 0,627 1 + 0,2 + S. ecornis + 0,510 0 + 0,3 + Chlorella sp. 2 + 0,593 33 + 0,5 + Chlorella sp. 3 + 0,656 32 + 0,4 + Geitlerinema sp. + ND 39 + 0,1 + Chlamydomonas sp. + 0,486 0 - - +
ND: determinada
90
La presencia de proteasa en estas microalgas y al menos en Synechocystis, favorece la
opción de incluir la factibilidad de ser utilizadas también, para la hidrólisis de derivados
de proteínas en residuales. De tal manera que, contribuirían en su desempeño como
agentes removedores de materia orgánica en aguas residuales enriquecidas.
Figura 22. Licuefación de la gelatina en microalgas.
En las bacterias asociadas a las microalgas como Corynebacterium durum, Bacillus
sphaericus, Staphylococcus hominis, Stenotrophomonas maltophilia, Brevundimononas
diminuta, C-13, C-42 y C-12 Naranja en la prueba de Gelatina fueron negativas para
esta prueba a diferencia de Delftia acidovorans, C-12 Blanca, Pasteurella stomatis,
Pasteurella aerogenes y Actinobacillus actinomycetemcomitans que fueron positivas
para la licuefacción de la gelatina.
Para la determinación de proteasa con el método de la caseína, las cepas C-12 Naranja
obtuvo una actividad enzimática de 0,836±0,003U/mL, la cepa C-12 Blanca con
0,758±0,013U/mL, Bacillus sphaericus con 0,699±0,015U/mL y Delftia acidovorans con
0,659±0,008U/mL; siendo los valores más altos (asociadas a las microalgas Chlorella
sp., Scenedesmus sp. y Geitlerinema sp.) a diferencia de las demás bacterias que
produjeron los valores más bajos entre 0,149-0,535U/mL.
91
El género Bacillus constituye uno de las más importantes fuentes de proteasas. Al
respecto, se han indicado diversas cepas alcalofilas de este género, tales como: B.
licheniformes, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. megaterium, B. polymyxa,
B. thermoproteolyticus, B. thurigensis y B. pumilus; y en el género Exiguobacterium sp.
con actividad de proteasa en placas de agar leche, similar al método utilizado en este
estudio (Takami y col. 1990; Kumar y Bhalla, 2004; Kasana y Yadav, 2007). Asimismo,
se ha descrito en B. sphaericus, la purificación y caracterización de una proteasa
alcalina extracelular aislado de suelo alcalino en los Himalayas (Singh y col. 2001).
Actualmente, en el campo de la biotecnología ambiental, se ha tomado en cuenta, la
actividad proteolítica de biopelículas en lodos de aguas residuales (Cadoret y col.
2002). Tales enzimas están asociadas a la chlorophyta Mougeotia, diatomeas
pennadas, a la cianobacteria Oscillatoria y a la comunidad de bacterias en dichos
tapetes microbianos. Entre la metodología desarrollada, en estos consorcios, se ha
postulado la determinación de proteasa extracelular involucrando moléculas
fluorescentes unidas a celulosa con una lecitina (Francoeur y col. 2001).
En ambientes extremos de bajas temperaturas, como en la Antártida, se han evaluado
bacterias heterotróficas proteolíticas; de las cuales, casi la mitad, producen proteasas
extracelular dependientes de temperatura, pH o concentraciones de sal. De igual
manera, se les ha detectado también, presencia de amilasa, ureasa, fosfatasas, β-
glucosidasas y lipasas (Alam y Singh, 2002).
4.2.1.4. Fosfatasa: En las tres cepas de Chlorella sp. 1, 2 y 3 y en la
cianobacteria, Geitlerinema sp. sólo se detectó la presencia de fosfatasa con valores
entre 32 y 39U/mL (Tabla 23). Es posible, que la concentración de fosfato en el medio
de cultivo utilizado para las microalgas, sea aun inhibitorio, como para detectar
actividad significativa de fosfatasa. Los niveles de fosfatasas se disparan cuando se
aproxima una limitación o deficiencia de fosfato en el medio. Diversos autores han
demostrado que la expresión de la fosfatasa está involucrada con la estrategia
fisiológica de detectar el poco fosfato que pueda estar presente en el medio de cultivo o
92
natural (Kumar y col. 2000). Es decir, a medida que se incrementa el consumo de
fosfato en el medio, se van expresando actividades de fosfatasas extracelulares.
Quizás, para Chlorella sp. y Geitlerinema sp., se mantenga la actividad bajo las
condiciones de cultivo que se estudiaron o realmente tengan mayor capacidad de
producción de estas enzimas.
Para las bacterias asociadas que exhibieron actividad fosfatasa, se produjeron valores
más bajos que las microalgas; los cuales estuvieron entre 1-8U/mL y siendo estas
actividades las correspondientes a las bacterias asociadas a Chlorococcum sp. y
Chlorella sp. (Tabla 24). Es posible que, estos resultados también se relacionen con las
concentraciones remanente de fosfatos en los medios de cultivos de las bacterias, y por
lo tanto, se requieren también, ajustes de pH, para valorar la presencia de fosfatasas
alcalinas y ácidas.
La presencia de fosfatasas alcalinas y ácidas han sido reveladas en especies de grupos
diferentes de microalgas marinas. Así, Kuenzler y Perras, (1965) reportaron la actividad
de fosfatasa en 27 cepas de 6 clases diferentes de algas, encontrando en 13 cepas,
ambos tipos de fosfatasa. Por otro lado, Burzyk y Loos, (1995) reportaron actividad de
fosfatasas en células y pared celular de Chlorella vulgaris, C. kessleri, C. pyrenoidosa,
C. fusca y Scenedesmus obliquus.
La actividad de la Fosfatasa alcalina ha sido detectada también en Anabaena oryzae,
Anabaena flos-aque, Synechococcus sp., Plectonema boryanum, Anabaena sp. y la
diatomea Phaeodactylum tricornutum Bohlin (Ruiz y col. 1997; Kumar y col. 2000).
Estos autores demostraron que los niveles altos de fosfatos en el medio de cultivo
disminuye la expresión de la actividad, y los cultivos deficientes en fosforo bajo
oscuridad, reflejaron un 77% menos actividad que los cultivos con iluminación. Lubián y
col. (1992), reportaron fosfatasa ácida para cepas de Nannochloris sp. y fosfatasa
alcalina en N. maculata, Nannochloropsis salina y N. gaditana. De igual manera,
demostraron que la actividad de la fosfatasa alcalina disminuye por el consumo de
fósforo intracelular.
93
Tabla 24. Exoenzimas (Proteasa, Ureasa, Celulosa y Fosfatasa) en bacterias asociadas a las microalgas.
C. durum + 0,404 2 + -
B. sphaericus + 0,699 5 + -
C. durum + 0,404 2 + -
D. acidovorans - 0,659 0 + +
S. hominis + 0,535 1 + -
B. sphaericus + 0,699 5 + -
A. actinomycetemcomitans - 0,166 0 - -
P. stomatis - 0,203 0 - -
P. aerogenes - 0,329 0 - -
S. hominis - 0,535 0 + -
S. maltophilia + 0,389 1 - -
B. diminuta + 0,490 0 - -
C-12 Blanca - 0,758 1 - -
C-12 Naranja + 0,836 1 + -
C-42 + 0,149 8 - -
Delftia sp. - 0,659 5 - +
C-13 + 0,490 2 - -
Microalga Bacterias
PROTEASA
CELULOSAUREASA
Gelatinacaseína (U/mL)
FOSFATASA
Rango 31-115 U/mL
Urea 0,1%
Chlorella sp.
Scenedesmus sp.
Oocystis sp.
Geitlerinema sp.
Chlorococcum sp.
4.2.1.5. Actividad de celulasa: Todas las microalgas evidenciaron actividad
celulolítica (Figura 23). En cuanto a las diversas cepas, fueron las cepas de Chlorella
que presentaron una hidrólisis parcial obteniéndose halos entre 0,4-0,5 cm de diámetro.
En cambio, para el resto de las microalgas, los valores de los halos oscilaron de 0,1-0,4
cm (Tabla 23).
En las bacterias asociadas como Corynebacterium durum, Bacillus sphaericus,
asociado a Chlorella sp., Corynebacterium durum, Delftia acidovorans y Staphylococcus
hominis asociadas a las microalga Scenedesmus sp., y Staphylococcus hominis, C-12
Naranja, asociadas a la microalga Geitlerinema sp. fueron positivas para la actividad de
celulosa, a diferencia de los demás géneros que fueron negativos (Tabla 24). De tal
manera que, tanto Chlorella sp. y Scenedesmus sp., continúan acaparando las
capacidades de producción de exoenzimas, conjuntamente con su flora bacteriana
asociada, en algunos casos, como para sugerir, las cepas correspondientes a estos dos
géneros, como las de mayor factibilidad para la remoción de materia orgánica.
94
Las cianobacterias Anabaena flos-aquae, Aphanizomen-non flos-aquae y microcystis
aeuginosa y ciertas cepas bacterianas heterotróficas han sido reportadas en un lago
estuarino, con capacidad celulolítica. Una de las razones por la baja población de
microorganismos celulolíticos es el hecho de que la celulosa es relativamente resistente
a los procesos de degradación de bacterias y su transformación en glucosa requiere
una cantidad considerable de energía. De tal manera que, para una despolimerización
microbiológica de la celulosa se requiere una actividad sinérgica de muchas enzimas
hidróliticas sintetizadas por bacterias, actinomicetales, hongos y protozoos (Mudryk y
Skórczewski, 2006).
La presencia de celulasa es de suma importancia para los sistemas de estabilización de
aguas residuales, procedentes de actividades de procesamiento de madera, extracción
de grasas, aceites, pectinas y otros compuestos de plantas de interés comercial. El
hecho de que las microalgas, aisladas de aguas residuales de una planta extractora de
aceite de palma, supone un valor agregado, a este consorcio de microalgas, puesto que
contribuirían a remover, los excedentes de celulosas presentes en los efluentes del
proceso de extracción del aceite.
Figura 23. Celulasa en las microalgas a. Chlorella sp.1, b. Scenedesmus sp. c. Euglena sp.
4.2.1.6. Actividad de ureasa: De acuerdo a las condiciones de cultivo, todas las
microalgas fueron positivas, la prueba para ureasa (Figura 24); indicando que las
microalgas Chlorella sp. 1, 2 y 3, Scenedesmus, Oocystis, Euglena, Geitlerinema y
a b c
95
Chlorococcum fueron las microalgas que evidenciaron la reacción de ureasa a los 5
días, las otras especies (Synechocystis, S. ecornis, Chlamydomonas) evidenciaron al 7
y 8 día. Infiriendo, que las cepas de Chlorella sp., Scenedesmus sp., Oocystis sp.,
Euglena sp., Geitlerinema sp. y Chlorococcum sp. tuvieron una mayor velocidad de la
expresión de urea que las demás microalgas evaluadas para esta exoenzima.
Figura 24. Presencia de ureasa en las microalgas Synechocystis sp. S. ecornis, Chlamydomonas sp. Geitlerinema sp. Chlorella sp.2 Scenedesmus sp. Oocystis sp. Euglena sp. Chlorococcum sp. y el Control.
En cuanto a las bacterias asociadas, solo Delftia acidovorans y Delftia sp. resultaron
con actividad de ureasa, estando las mismas, asociadas con Scenedesmus sp. y
Chlorococcum sp.
La actividad de las exoenzimas es principalmente confinada a las enzimas hidrolasas,
las más notables las Lipasas, Fosfatasas, Glucosidasas y Proteasas; indicando que el
contacto de estas enzimas con los sustratos son importantes en la digestión anaerobia
del proceso biológico del tratamiento de aguas residuales; y declinan su actividad
durante la digestión aeróbica y anaeróbica (Jain y col. 1992; Novak y col. 2003; Burgess
y Pletschke, 2008). Whiteley y col. (2002) muestran que las enzimas proteasas y
fosfatasas están predominantemente asociadas con la materia orgánica particulada del
lodo del agua residual municipal.
96
En Lagunas de estabilización de una planta extractora de aceite de acuerdo a los
resultados podemos decir, Chlorella sp. 1, 2 y 3, Scenedesmus sp. y S. ecornis
muestran la mayor producción de exoenzimas como amilasa, proteasa, lipasa, ureasa,
celulasa y fosfatasa; y Oocystis sp. estando también como una de las especies con
mayor cantidad de producción como amilasa, lipasa, ureasa y celulasa; mientras que
con menor producción las especies de Chlorococcum sp. (amilasa y proteasa), Euglena
sp. (ureasa) y Geitlerinema sp. (fosfatasa).
97
Remoción de DQO, Nitrógeno, Fósforo y grasas en agua residual de una Planta extractora de aceite de palma en presencia de microalgas y sus bacterias asociadas
98
4.3.1. Cultivos mixtos de microalgas productoras de exoenzimas con agua residual de la planta extractora de aceite de palma
En este estudio se seleccionaron las microalgas Chlorella sp., Chlorococcum sp.,
Chlamydomonas sp., Oocystis sp., Scenedesmus sp. y Geitlerinema sp.; previamente
aisladas de aguas residuales de la Planta extractora de aceite de palma y las cuales
demostraron ser fuentes de las exoenzimas: amilasa, lipasa, proteasa, fosfatasa,
celulasa y ureasa. Es por ello, que en el presente estudio se reportan los resultados
sobre niveles de remoción de DQO, nitrógeno, fósforo y grasas de muestras de aguas
residuales de una Planta extractora de aceite de palma, a fin de relacionar el posible
efecto de estas microalgas como co-participantes en los procesos de remoción. Los
experimentos fueron iniciados con un inóculo mixto de estas microalgas y la
concentración de estos parámetros químicos y biológicos, al inicio y final del ensayo.
Estos resultados derivan de dos diseños experimentales, cuyo Primer Ensayo se
relacionó con la evaluación de un control sin agua residual (cultivo autotrófico de
microalgas), un control AR (con agua residual sin ningún aditivo químico o biológico), y
un cultivo con agua residual complementada con un fertilizante comercial (Nitrofoska) e
inoculado con el consorcio de microalgas (ARN). En cambio, para la ejecución del
Segundo Ensayo se incluyeron los siguientes tratamientos: agua residual suplementada
con una mezcla orgánica (O), compuesta por lecitina (0,1%), urea (0,1%) y almidón
(0,1%), como materia orgánica referencial añadida al agua residual (ARO); agua
residual enriquecida con fertilizante (ARN), agua residual con el fertilizante y la mezcla
orgánica (ARNO), otro tipo de control integrado por el fertilizante y la mezcla orgánica
(NO). Para ambos experimentos se analizó el crecimiento y contenido de pigmentos,
pH, remoción de DQO, nitrógeno, fósforo, sólidos totales, grasas y aceites. Además de,
monitorear la presencia de exoenzimas y de bacterias al inicio y final de cada
experimento.
4.3.1.1. Crecimiento y contenido de pigmentos en el primer ensayo: Este
experimento realizado con agua residual de la extractora de aceite de palma africana,
colectada antes de entrar al sistema de lagunas de estabilización (AR) (Figura 25), se
99
obtuvo el máximo crecimiento (p<0,05) en agua residual con Nitrofoska (ARN) con
12,34±2,32 x106 cel.mL-1. Mientras que, en el control (agua destilada + fertilizante) y
AR fue de 11,14±2,17 y 5,53±1,31 x106 cel.mL-1 (Figura 26). También se observó que,
con la adición del fertilizante al agua residual (ARN), se incrementó el crecimiento en un
45%. Es posible, que el bajo crecimiento producido en AR, sea debido a que los
nutrientes contenidos en el agua residual no estén del todo disponibles para las
microalgas. De tal manera que, acusa deficiencia para el crecimiento, y que la misma
es superada con la adición del fertilizante, el cual elevó dicho crecimiento a 2,2 veces.
Figura 25. Sistema de tratamiento aguas residuales (Extractora de Aceite de Palma).
En cuanto al contenido de clorofila y carotenoides (Figura 27 y 28), se alcanzaron
valores significativamente mayores (p<0,05) con valores similares de 19,13±0,42 y
17.94±0,32µg.mL-1 clorofila en ARN y control, respectivamente.
Agua Residual antes de suingreso a las Lagunas de
Estabilización (AR)
Muestra Agua Residual
Recolección de Efluentes Tratados
(Agua para Riego de Cultivos)
L A G U N A S D E E S T A B I L I Z A C I Ó N
L-1
L-2
L-3
L-4
L-5
100
0
2
4
6
8
10
12
14
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
DC
(x 1
0 6
cel.m
L -1
)
Edad del Cultivo (días)
Control AR ARN
Figura 26. Crecimiento de microalgas en función de la edad del cultivo con agua residual. Control: AR: agua residual, ARN: agua residual enriquecida con Nitrofoska.
En cambio la clorofila, con el agua residual sin adición de fertilizante (AR) se produjo un
valor de 10,22±1,29µg.mL-1 (Figura 27), lo que solo representa un 50,4% del obtenido
cuando era adicionado el fertilizante.
0
5
10
15
20
25
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Clo
rofil
a a
(µg.
mL
-1)
Edad de Cultivos (días)
AR ARN Control Control (AR)
Figura 27. Variación del contenido de clorofila (µg.ml-1) con la edad del cultivo.
101
El seguimiento de la concentración de los carotenoides en función de la edad del
cultivo, también contribuyó a ratificar que en ARN, seguido del control y luego de AR, se
reflejó el crecimiento en este orden descendente, y que apenas el bajo contenido de
carotenoides detectado en el control (AR), sea debido al poco crecimiento de las
microalgas presentes en las muestras colectadas del agua residual.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Car
oret
onio
des
(µg.
mL
-1)
Edad del Cultivo (días)
AR ARN Control Control (AR)
Figura 28. Variación del contenido de carotenoides (µg.ml-1) con la edad del cultivo.
Estudios anteriores han demostrado la posibilidad de utilizar las aguas residuales
urbanas como medio de cultivo para el crecimiento de microalgas. Chacón y col. (2002)
realizaron cultivos a nivel de laboratorio utilizando las microalgas Chlorella sp. y
Scenedesmus sp. en aguas residuales urbanas de la serie A del sistema de lagunas de
estabilización del CIA-LUZ, obteniendo un crecimiento satisfactorio de las mismas en el
agua residual y superando significativamente el crecimiento presentado por el
tratamiento de control, con lo que se demuestra el potencial estimulador del crecimiento
y de la producción de pigmentos esta agua residual.
102
11,14
5,53
12,34
17,94
9,64
19,13
1,29 1,15 1,68
0
5
10
15
20
25
Control AR ARN
DC
(x10
6ce
l.mL
-1);
Pig
men
tos
(µg.
mL
-1)
Crecimiento Clorof ila Carotenoides
Figura 29. Densidad celular (x106 cel.mL-1), clorofila y carotenoides (µg.mL-1) del cultivo mixto de microalgas en control, AR y ARN.
El seguimiento de la concentración de la clorofila y carotenoides con la edad del cultivo,
también es una medida del crecimiento de las microalgas, y permite complementar el
comportamiento de las mismas ante medios de cultivos experimentales, como lo fueron
las aguas residuales. Es por ello que, la producción de clorofila se selecciona como
parámetro de crecimiento; puesto que se correlaciona con la densidad celular o peso
seco de las microalgas, conforme van transcurriendo los días del cultivo (Jonte, 2003).
En este estudio se aprecia (Figura 29) que el máximo crecimiento (p<0,05) fue en agua
residual con nitrofoska (ARN) con 12,34±2,32 x106 cel.mL-1. Mientras que, en el control
(agua destilada + fertilizante) y AR fue de 11,14±2,17 y 5,53±3,00 x106 cel.mL-1.
4.3.1.2. Crecimiento y contenido de pigmentos en el segundo ensayo: La mayor
densidad celular se produjo en el control (solo fertilizante) con 28,99±3,23 x106 cel.mL-1
(p>0,05); a pesar de que presentó un comportamiento similar con el control NO
103
(fertilizante con la mezcla orgánica), hasta el día 16. De acuerdo a la curva de
crecimiento, ambos cultivos, parecen formar un subconjunto, muy diferente al resto de
los tratamientos (Figura 30). Por otro lado, en los cultivos mixotróficos (AR
complementados o no con NO y/o Nitrofoska), se encontró el mejor crecimiento en NO,
con lo cual, refleja el siguiente orden descendente: NO> ARO> AR > ARN> ARNO.
Además, se evidenció que NO, superó a ARO, AR, ARN y ARNO en 1.5, 2.10, 2.32 y
4.3 veces respectivamente, con diferencia significativa (p≤0,05), en los subconjuntos
homogéneos a,b,c; y sin diferencia significativa (p>0,05) entre subconjuntos
homogéneos.
0
5
10
15
20
25
30
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
DC
(x 1
0 6
cel
. mL
-1)
Edad del Cutivo (días)
Control NO AR ARN ARO ARNO
Figura 30. Cultivo de microalgas en función de la edad del cultivo con diferentes tratamientos. NO: Nitrofoska + O, AR: Agua residual, ARN: Agua residual con Nitrofoska, ARO: Agua residual + O,
ARNO: Agua residual Nitrofoska + O.
Es de indicar, además que, los cultivos ARN y ARNO presentaron una inhibición del
crecimiento más acentuada, que los cultivos ARO y AR, quizás como resultado de la
excesiva carga orgánica y falta de disponibilidad de nutrientes del agua residual. Dicho
104
efecto, fue observado hasta el día 16 de iniciado el experimento. A partir del cual, se
observó un crecimiento real de estos cultivos, probablemente debido, a alguna actividad
de biodegradación de los componentes del agua residual, que hizo luego disponibles
los nutrientes necesarios para el incremento de la densidad celular. No obstante, en el
cultivo control, tampoco hubo un crecimiento adecuado hasta el día 16, presentando un
bajo crecimiento, para luego elevar su densidad celular drásticamente en el día 18. En
tal sentido, se sugiere algún efecto ambiental a los cultivos, que durante el período del
experimento, produjo bajo crecimiento hasta el día 16 en todos los cultivos (Figura 30).
El control autotrófico también superó al resto de los tratamientos (p≤0,05), en cuanto al
contenido de clorofila y carotenoides y ligeramente en cuanto a los valores de densidad
celular (Figura 31). Esto sugiere que las condiciones mixotróficas de los cultivos: AR,
ARN, ARO, ARNO y NO, parecen no favorecer la síntesis de pigmentos. Tal efecto, se
refleja en mayor grado, para ARNO, al cual se le ha adicionado al agua residual, el
fertilizante y la mezcla orgánica. De tal manera, que pudo haberse producido
compuestos que inhibieron tanto su crecimiento, como la acumulación de clorofila y de
carotenoides.
Es decir, si se compara el contenido de clorofila entre los cultivos con agua residual y el
control, se detecta que hubo una inhibición del 70,3; 68,1; 56,2 y 54,64 en ARNO, AR,
ARO, ARN, respectivamente. Mientras que en el cultivo control con fertilizante y la
mezcla orgánica (NO) también lo hubo, pero en un y 45,4%. Lo que permite, deducir
que, las condiciones mixotróficas en presencia de alto contenido de compuestos
orgánicos, influyeron en la baja acumulación de clorofila. El valor más alto del control
fue de 28,99±3,23 x106 cel.ml-1 y el de ARNO apenas alcanzo los 6 millones, tal como
se ve en la figura 31.
105
28,99
18,92
12,50
9,05
13,79
6,75
21,86
11,96
6,98
12,2911,07
6,49
5,043,32
1,623,19
2,18 1,74
0
5
10
15
20
25
30
35
Control NO AR ARN ARO ARNO
DC
(x 1
0 6
cel.m
L -1
); P
igm
ento
s (µ
g.m
L -1
)
Crecimiento Clorof ila Carotenoides
Figura 31. Densidad celular (x106 cel.mL-1), clorofila y carotenoides totales (µg.mL-1) del cultivo mixto de microalgas con los diferentes tratamientos.
4.3.2. Efecto del pH en los cultivos mixtos de las microalgas
El pH del agua residual colectada (antes de entrar al sistema de lagunas de
estabilización) varió entre 3,75 y 4,28 a 3,75, el cual era ajustado hasta la neutralidad,
al momento de ser utilizada como medio de cultivo. Al realizar el Primer ensayo, el
agua residual cruda tuvo un pH de 6,5 después de realizar los diferentes tratamientos,
el pH vario. Para el control (AR) fue de 8,07, con AR fue de 7,67 y con ARN de 7,69.
Para el segundo ensayo, el agua residual tuvo un pH de 3,35 y ajustado luego a 7,00.
Mientras que, los valores iniciales de pH para el control, control (AR), AR, NO, ARN y
ARNO fueron de 7,68; 7,10; 8,24; 7,11; 7,23 y 7,20 respectivamente.
El monitoreo del pH con la edad del cultivo (Fig. 32a) en el primer ensayo y en el
segundo ensayo (Fig. 32b) a lo largo del periodo experimental, indican un ascenso del
pH entre 9 y 10 en los tratamientos con agua residual, en comparación con los del
control y NO, que solo se mantenían entre 8,5 y 8,0 y entre 7,8 y 8,2, respectivamente.
106
0
2
4
6
8
10
12
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
pH
Edad del Culltivo (días)
Control Control (AR) AR ARN
0
2
4
6
8
10
12
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
pH
Edad del Cultivo (días)
Control Control (AR) NO AR ARN ARO ARNO
Figura 32. Variación del pH durante el periodo experimental. a. Ensayo 1 b. Ensayo 2.
Es posible que, el elevado pH en los cultivos con agua residual, ejerzan influencia en la
precipitación de nutrientes, y en consecuencia disminuyan la disponibilidad de los
mismos para las microalgas, si se compara con el control, cuyo pH permaneció en el
rango optimo para el crecimiento de microalgas (Abalde y col. 1995). El incremento del
pH en cultivos con microalgas utilizadas en el tratamiento de aguas residuales también
se ha descrito un incremento del pH desde 7 a valores superiores a 9 (Lau y col. 1995).
a
b
107
4.3.3. Análisis de Remoción de materia orgánica y nutrientes
4.3.3.1. Demanda Química de Oxigeno (DQO): La remoción de DQO fue
observada en el primer ensayo en los tratamientos y el control con diferencias
significativas (p<0,05). De acuerdo a los resultados obtenidos, se produjo una remoción
de 23,46±4,42mg.L-1, 9123,02±331,84mg.L-1, 5411,93±536,72mg.L-1 y de
11859,06±379,33mg.L-1 en el control, control (AR), AR y ARN respectivamente; lo cual
representó el 52,93; 97,66; 95,51 y 96,77% en el control, control (AR), AR y ARN
(Figura 33).
La demanda química de oxígeno presente al inicio del control autotrófico, de
23,46±4,42mg.L-1, obedece a la carga orgánica que aportan el inóculo mixto de
microalgas a inicio del experimento, y luego esta misma es removida en un 52,93% al
final del primer ensayo (Figura 33). Asimismo, el incremento de la DQO a
2.924,19±57,04 mg.L-1 para el control utilizado en el segundo ensayo, se debe a que el
inóculo procedía del mismo cultivo mixto utilizado en el primer ensayo, con lo cual era
más envejecido y en consecuencia, tendría un mayor aporte de materia orgánica,
producto del metabolismo de las microalgas y de las bacterias asociadas.
En el segundo ensayo, la remoción de DQO fue también elevada con un 90,60% en
NO, 95,09% en ARN, 96,13% en el Control, 97,50 en ARO, 97,80% en ARNO, 98,14 en
AR y 98,39% en el Control (AR), sin diferencia significativa entre los tratamientos y
Controles (p>0,05). En referencia a las concentraciones removidas se encontró el valor
más bajo de 2281,07±33,01mg.L-1 en NO y el más alto, de 14700,73±564,97mg.L-1 en
AR (Figura 34).
El elevado porcentaje de remoción obtenido en el control (AR), deduce una alta
eficiencia por parte del consorcio bacteriano asociado al agua residual, además del
efecto de volatilización, que también contribuiría a la reducción de la materia orgánica
existente. Para el primer ensayo se obtuvo un valor inicial de DQO de 9341,67±329,34
mg.L-1; mientras que para el segundo ensayo fue de 14.166±665,97 mg.L-1 (Tabla 25 y
108
26). Esta diferencia se debe a que para cada ensayo se utilizaron muestras de
residuales de diferentes muestreos. Además, la muestra de residual para el segundo
ensayo fue sometida a agitación constante durante una semana y luego se seleccionó
el 25% y el resto completado con agua potable; lo cual significa, que aun así, el residual
del segundo ensayo, fue superior en DQO en 1,5 veces respecto a la utilizada en el
primer ensayo. Sin embargo, las remociones de un 97,66% y 98,39% en el primer y
segundo ensayo, ratifica la elevada eficiencia de los microorganismos heterótrofos en
reducir la DQO, y a la presencia adicional de microalgas propias del agua residual, que
se mantuvieron hasta el final del experimento; las cuales en conjunto contribuyeron a la
elevada remoción de la materia orgánica en el segundo ensayo.
Figura 33. Remoción de DQO [(mg.L-1) (%)] en el primer Ensayo. Control (AR): agua residual no inoculada con microalgas, AR: agua residual, ARN: agua residual +
Nitrofoska.
En relación a la reducción de DQO en los tratamientos con agua residual (AR, ARN,
ARNO) y en el control NO inoculados con las microalgas, también hubo altos
porcentajes de remoción, en orden descendente: control (AR)> AR> ARNO>
ARO>control >ARN >NO (Figura 34).
109
Figura 34. Remoción de DQO [(mg.L-1) (%)] en el segundo ensayo. O: mezcla con lecitina, urea y almidón, NO: Nitrofoska + O, Control (AR), ARN: agua residual+
Nitrofoska, ARO: agua residual + O, ARNO: agua residual + Nitrofoska + O.
Por otra parte, se encontró también que, no hubo diferencia entre el control (AR) y AR;
ya que se removió 14.700,73 y 13.938,63mg.L-1, respectivamente. Lo que parece
deducirse que, aparentemente no es necesario adicionar el inóculo mixto de
microalgas, porque con tan solo la presencia del consorcio microbiano nativo (bacterias,
hongos, microalgas) en el agua residual, se logra la reducción de la DQO con
resultados similares (Figura 34 y Tabla 26). En cambio, cuando se le adicionó al agua
residual la mezcla orgánica (ARO), el fertilizante (ARN) y tanto la mezcla orgánica como
el fertilizante (ARNO), la remoción de la materia orgánica fue menor; aun cuando los
porcentajes de remoción fueron similares entre los tratamientos y el control (AR). Al
respecto, se ha encontrado al menos en este trabajo, una mayor remoción de DQO,
que en trabajos realizado con aguas residuales en Samara (Rusia), en el cual se
produjo una remoción del 51%, correspondiente a una reducción a 590±48,9mg.L-1 a
partir de 1200±66,5mg.L-1 (Safonova y col. 2004).
4.3.3.2. Sólidos Suspendidos Totales (SST) y Sólidos Suspendidos Volátiles
(SSV): Durante el desarrollo de los cultivos, en el primer y segundo ensayo,
110
observamos una producción de microalgas en las paredes de las unidades de cultivos,
que se supone una cantidad adicionar de sólidos suspendidos. Es de considerar, que
una parte de los sólidos en suspensión están formados por detritus, restos de las
microalgas y bacterias; por lo que los procesos de colmatación en los diferentes
ensayos fue evidente. La remoción de SST en el primer ensayo (Figura 35), fue más
efectiva en AR (p<0,05), con una remoción de 148,00mg.L-1; equivalente al 87,06%;
seguido por el control con 42,00mg.L-1 y un 47,73%; luego ARN con 18,00mg.L-1 y
25,71% y por último, se produjo la menor remoción en el control (AR) con 30, 00mg.L-1
y con tan solo un 14,29%. Sin embargo, en sólidos volátiles, tanto AR como en el
control (AR), se obtuvo la misma remoción con un 70% (Figura 36). En relación a la
remoción de SST y SSV, en el segundo ensayo, aunque fue por lo general baja, se
encontró que en el control (AR), se redujo la mayor concentración, de 110 mg.L-1
(p<0,05), equivalente al 37,93%. En ARNO fue de un 12,00% y en NO, de un 50,00%
con 40,00 mg.L-1 (Figura 37 y 38). Roman y col. 2006. Reporto en lodo primario de la
digestión anaerobia de agua residuales disminución de SST en un 80% (20% en el
control) y de 25g/L a 5g/L, lo cual indica que solo las enzimas como celulasa y pronasa
tienen poco o no impacto sobre la solubilización de los sólidos.
Figura 35. Remoción de sólidos totales [SST-(mg.L-1) y SST-(%)] en el primer ensayo.
111
Figura 36. Remoción de sólidos volátiles [SSV-(mg.L-1) y SSV-(%)] en el primer ensayo.
Figura 37. Remoción de sólidos totales [SST-(mg.L-1) y (SST-(%)] en el segundo ensayo.
112
Figura 38. Remoción de sólidos volátiles [SSV-(mg.L-1) y (SSV-(%)] en el Segundo ensayo.
En general cuando la remoción de sólidos totales de aguas residuales en condiciones
de laboratorio, tiende a no ser eficiente, en el sentido de que a pesar de una
participación importante de las bacterias del residual, también se acumulan productos
de su metabolismo y el de las microalgas, con lo cual, puede existir remoción, pero a la
vez también hay producción de materia orgánica, que pasa a caracterizarse como
sólidos totales. En cambio, a cielo abierto, el efecto de la irradiación solar, lluvias y
mayor población bacteriana, puede contribuir a una remoción más efectiva de los
sólidos totales. No obstante, la biota presente en las lagunas de estabilización
incrementa, la producción de sólidos totales. Así se ha relacionada a las microalgas,
como influyentes en el mantenimiento de elevada carga de SST y al respecto, se ha
descrito un estudio realizado con aguas residuales industriales de la ciudad de
Hamadan en Iran, en el cual se demostró una correlación entre la concentración de
sólidos totales y microalgas. Además, de lograr una remoción del 100% de microalgas
y del 99.5% de SST, después de aplicar el método de electro-coagulación a las aguas
residuales del sistema (Azarian y col. 2007).
113
4.3.3.3. Nitrógeno (Nitrógeno Total Kjeldahl): La remoción de Nitrógeno en el
primer ensayo fue superior en los cultivos con agua residual inoculados con microalgas
(AR), respecto al control autotrófico y al control de agua residual no inoculado con
microalgas. Es decir, la remoción se presento en el siguiente orden descendente: AR
(99,98%) > ARN (98,36%) >Control-AR (65,56%) >Control (22,37%) (Figura 39), con
diferencia significativa (p<0,05), en relación a los dos controles. Entre los resultados
más sorprendentes, se reflejan los obtenidos en la remoción de nitrógeno en AR, ya
que a partir de 291.200,00±1.400,00mg.mL-1 hubo una reducción hasta
70,93±6,47mg.mL-1 (Tabla 25) de nitrógeno; lo cual representó un 99,98% de remoción.
En el segundo ensayo (figura 40), se produjo una remoción del 67,35% para el control y
del 89,60% en el control (AR), siendo estos los valores más bajos (p<0,05) respecto a
los demás tratamientos. El valor más alto fue en ARNO con 99,58%, pero sin diferencia
significativa (p<0,05) en cuanto a NO, AR, ARN, ARO y ARNO, siendo estos
subconjuntos homogéneos.
En el tratamiento que hubo la menor remoción de nitrógeno fue en NO, con
872,1±11,83mg.L-1; mientras que, la más elevada de 9.328,85±562,24mg.L-1 se produjo
en ARNO (Tabla 26). Es posible que, la adición del fertilizante y de la mezcla orgánica
al agua residual, contribuyo al crecimiento de la población de bacterias inherentes al
residual, y al de las microalgas y sus bacterias asociadas, como para que de manera
sinergística asimilaran las diferentes formas de nitrógeno para su crecimiento; además
del que pudo haber sido volatilizado, como para haberse consumido casi el total del
nitrógeno (99,58%) presente al inicio del experimento.
A pesar de que la remoción de la DQO en el control con solo agua residual (AR) fue
más eficiente que cuando el agua residual fue inoculada con el cultivo mixto de
microalgas, para el caso de la remoción del nitrógeno fue lo contrario. Es decir, en el
control (AR) se inició con una concentración de nitrógeno de 4.200,00±280,00mg.L-1 se
finalizó con un contenido de 429,33±140,93mg.L-1; lo cual representó un 89,60%. Sin
embargo, en el cultivo ARNO, con la mayor concentración de nitrógeno de todos los
114
tratamientos, la remoción de nitrógeno supero todas las expectativas, se revela como
uno de los resultados más interesantes de este estudio.
Figura 39. Remoción de Nitrógeno Kjeldahl [(mg.L-1), (%)] en el primer ensayo.
Figura 40. Remoción de Nitrógeno Kjeldahl [(mg.L-1), (%)] en el segundo ensayo.
115
Tabla 25. Concentración inicial y final de DQO, nitrógeno, fósforo, grasas y aceites (mg.mL-1) en el Primer ensayo. Nutriente mg.mL-1
DQO Inicial DQO Final Nitrógeno inicial Nitrógeno Final Fósforo Inicial Fosforo final A. y G. Inicial
A. y G. Final
Control 44,13±3,74 20,66±2,22 1418,67±8,08 1101,33±21,39 277,59±20,13 158,65±25,13 0,00 0,00
Control (AR) 9341,67±329,34 218,65±5,67 168,00±56,00 58,40±2,58 56,00±11,20 17,57±0,60 580,00 180,00
AR 5661,67±486,93 249,73±54,43 291200,00±1400,00 70,93±6,47 258,13±4,08 14,86±1,55 63,89 20,86
ARN 12267,96±377,91 408,91±100,47 6626,67±168,00 108,27±6,47 995,43±43,57 51,60±0,20 85,00 10,86
Control: agua destilada con Nitrofoska, control (AR): agua residual sin microalgas, (AR): agua residual+microalgas, (ARN): agua residual con Nitrofoska.
Tabla 26. Concentración inicial y final de DQO, nitrógeno, fósforo, grasas y aceites (mg.mL-1) en el Segundo ensayo. Nutriente mg.mL-1
DQO Inicial DQO Final Nitrógeno inicial Nitrógeno Final Fósforo Inicial Fosforo final A. y G. Inicial
A. y G. Final
Control 2924,19±57,04 113,19±4,44 992,51±14,00 324,05±2,59 760,43±6,01 386,17±31,59 0,00 00,00
Control (AR) 14166±665,97 227,53±31,64 4200,00±280,00 429,33±140,93 52,96±2,36 24,59±1,37 212,00 180,00
NO 2517,59±30,21 236,52±2,83 893,01±21,39 20,91±2,59 309,31±4,29 133,90±13,22 530,00 28,00
AR 14978,83±570,32 278,10±26,20 5600,00±280,00 34,35±2,59 140,38±2,58 94,64±3,09 110,00 18,00
ARN 10690,53±285,97 525,20±1,77 5169,18±161,66 40,32±0,00 355,86±0,43 154,39±6,18 206,00 20,50
ARO 9591,17±394,06 239,60±31,16 5878,50±427,71 34,35±2,59 220,65±0,86 71,06±14,25 432,00 12,00
ARNO 11073,03±155,01 243,97±25,78 9367,68±560,00 38,83±2,59 551,31±1,08 138,94±3,78 460,00 4,00
Control: agua destilada con Nitrofoska, control (AR): agua residual no inoculada con microalgas , (AR): agua residual+microalgas, NO: Nitrofoska y O (mezcla orgánica), (ARN): agua residual +Nitrofoska, (ARO): agua residual y O (mezcla orgánica), ARNO: agua residual + Nitrofoska + mezcla orgánica, (G y A): grasas y aceites. Concentración inicial: al inicio del experimento. Concentración final: al finalizar el experimento.
116
En diversos estudios ya se ha demostrado, altas eficiencias en la remoción de nitrógeno
de aguas residuales. Así, efluentes de granjas de cerdos con alta carga de nutrientes e
inoculadas con las microalgas Microspora willeana, Ulothrix ozonada, Rhizoclonium
hieroglyphicum y Oedogonium sp. han reportado una remoción del 90%, equivalente a
una cantidad mayor a 1000mg.l-1 de nitrógeno total (Kebede y col. 2006). Por otro lado,
Chacón y col. (2006); encontraron remociones de nitrógeno amoniacal (100%) en aguas
residuales urbanas cultivadas con Chlorella sp. y Scenedesmus sp.
Entre otros trabajos, Andrade, (2007) también reporto remociones de 95,49% y de
99,78% nitrógeno amoniacal y de nitratos de aguas residuales con Scenedesmus sp.
En cuanto a las diferentes fuentes de nitrógeno existentes en los medios de cultivo, se
ha descrito una asimilación preferencial en el siguiente orden (N-NH4+)>(N-NO2
-)>(N-
NO3-)>Nitrógeno orgánico simple (como urea y aminoácidos). Es decir, la microalga
consumirá en primer lugar el NH4+ en función del grado de reducción de las diferentes
fuentes de nitrógeno, debido al gasto energético requerido para asimilar las fuentes
más oxidadas (Lau y col. 1995; Morales, 1996).
Voltolina y col. (2005) obtuvieron una remoción de Nitrógeno 43,7% utilizando una
dilución del 30% de agua residual artificial y luego a una dilución del 40%, la remoción
disminuyo a 26,4% con cultivo semicontinuo de Scenedesmus obliquus. No obstante,
en el presente estudio se utilizó una dilución del 25% del residual, produciéndose una
remoción de nitrógeno de 99,17% (AR).
4.3.3.4. Fósforo Total: La remoción de fosfatos en el primer ensayo (Figura 41)
alcanzó un 98,50% y 94,24% en ARN y AR respectivamente y ambos con diferencia
significativa (p>0,05) respecto a los controles. La mayor cantidad fue removida en ARN
y presento una relación directa con el mayor crecimiento microalgal presentado en este
tratamiento. Sin embargo, no se encontró relación directa entre la remoción de fosfato
y los tratamientos restantes. El control presentó el valor más bajo con
118,94±5,10mg.L-1 y 43,09% de remoción tanto en concentración como en el
porcentaje.
117
Figura 41. Remoción de Fosfatos [(mg.L-1), (%)] en el primer ensayo.
En el segundo ensayo (Figura 42) observamos que los valores mayores de remoción de
fósforo fueron alcanzados en ARNO, con 412,38±2,71mg.L-1 y 74,80%, ARO con
149,60±15,11mg.L-1 y 67,78%, y NO con 175,41±56,74mg.L-1 y 56,74% y ARN con
201,48±5,75mg.L-1 y 56,62% respectivamente, sin diferencia significativa (p>0,05) entre
los mismos. En cambio, los controles presentaron los valores más bajos con una
remoción de 374,26±49,20; 45,74±5,67 y 28,37±3,74mg.L-1, equivalentes a un 53,43,
49,20 y 32,54% y para el control (AR), control autotrófico y AR.
En estos dos ensayos observamos que la remoción de fosforo se evidencio mejor en
los tratamientos en donde el agua residual fue enriquecida con Nitrofoska y la mezcla
orgánica, indicándonos que las bacterias en estas agua residuales tienen un papel
importante en la remoción de este parámetro. No obstante; al observar el tratamiento
en donde están las microalgas y bacterias con un medio enriquecido hay mayores
remociones de este parámetro, como es el caso de ARN en el primer ensayo y ARNO
en el segundo ensayo.
118
Figura 42. Remoción de Fosfatos [(mg.L-1), (%)] en el segundo ensayo.
Es conocido que, la eliminación de los fosfatos del agua residual tratada mediante
sistemas biológicos, como en el caso de las microalgas tiene lugar por asimilación de
las mismas. Así mismo, la actividad fotosintética diurna también contribuye a la
eliminación de este nutriente, ya que al elevar el pH del líquido de mezcla, produce la
precipitación del mismo (El Halouani y col. 1993). Estudios anteriores realizados con
aguas residuales urbanas colectadas del sistema A de lagunas de estabilización de la
Universidad del Zulia, Venezuela, las microalgas Chlorella sp. y Scenedesmus sp.
registraron remociones de fosfato en el orden de 2,40mg.L-1 (44,0%) y 2,65mg.L-1
(48,7%), respectivamente, en un periodo de 27 días (Chacón y col. 2004). De igual
forma en el tratamiento aplicado a aguas residuales del sistema B del mismo Sistema
de lagunas utilizando la microalga Chlorella sp. se logró una remoción máxima de
12,6mg.L-1 representado el 73,5% de la concentración inicial (Andrade y col. 2002).
Andrade, (2007) en los tratamientos a aguas residuales del sistema B de las lagunas
(CIA-LUZ) B3 y las Lagunas Piscícolas enriquecidas con medio de cultivo comercial
alcanzaron las mayores remociones de este parámetro con 1,83mg.L-1 (91,04%) y
1,65mg.L-1 (86,39%).
119
El tratamiento de aguas residuales de cerdo con alta carga de nutrientes también ha
sido reportado, mediante la utilización de microalgas filamentosas (Microspora willeana,
Ulothrix ozonada, Rhizoclonium hieroglyphicum y Oedogonium sp.), y para lo cual se
obtuvieron eficiencias de remoción de fósforo entre 68 y 76%; lo que equivale a
cantidades entre los 231,2 y 258,4mg.L-1. Estos resultados, permitieron sugerir que el
tratamiento con microalgas es eficiente para la depuración de efluentes con alta carga
de nutrientes (Kebede y col. 2006).
Por otra parte, Lau y col. (1995), demostraron que la capacidad de asimilación de
fosfato por Chlorella vulgaris no se redujo por la presencia de bacterias nativas; sino
que, por el contrario, ambas, bacterias y microalgas fueron capaces de captar y asimilar
fosfatos del agua residual y que además de este mecanismo, el fosfato pudo haber sido
eliminado del medio a través de la precipitación del mismo. De igual manera,
tratamientos con agua residual domestica (en tandem, con pre-muerte y microalga co-
inmovilizada (Chlorella sorokiniana y Chlorella vulgaris) contribuyeron a incrementar a
una remoción del 72% de fosforo en el agua residual (Hernández y col. 2006).
4.3.3.5. Aceites y Grasas: El análisis de aguas residuales derivadas de
actividades industriales de extracción o de procesamiento de materia prima rica en
grasas, es de suma importancia al momento de determinar, los niveles de remoción de
DQO y de grasas, en función del tiempo de residencia de los residuales, y de la
comunidad microbiana existente en las lagunas de estabilización respectiva. Es por ello
que, también se sometió a evaluación el grado de reducción de grasas y aceites en los
cultivos con los diferentes tratamientos. Así, observamos en el primer ensayo, que la
mayor remoción se produjo en el control (AR) con 400mg.L-1; lo que equivale a un
68,97%. Para el caso de AR y ARN hubo una remoción de 43,03mg.L-1 y 74,14mg.L-1,
equivalentes a 67,35% y 87,23% respectivamente con diferencia significativa (p<0,05) y
de igual forma en los diferentes tratamientos con diferencia significativa (p<0,05) con
respecto al control (Figura 43).
120
En la figura 44, observamos que para el segundo ensayo, este parámetro obtuvo la
mayor remoción en los tratamientos de NO y ARNO con 502mg.L-1, 456,00mg.L-1 y
94,72% y 99,13% respectivamente, con respecto al control (AR) y AR en donde se
obtuvo los valores más bajos de remoción con 32,00mg.L-1 y 15,09% y 92,00mg.L-1 y
83,64%, observándose diferencia significativa (p<0,05) entre todos los tratamientos.
La remoción significativa de residuales de aceite de oliva se ha reportado en sistemas
de tratamiento de residuales industriales y realizado por filtros de arena, con una
concentración de 7,5±1,03mg.L-1 a la entrada y de 0.3±0,07mg.L-1, a la salida,
obteniéndose una reducción del 96%. En este estudio se demostró la participación de
Lyngbia, Microcoleus chthonoplastes, Phormidium corium, Phormidium sp., Oscillatoria
salina, Plectonema terebrans y Aphanocapsa sp., en asociación con bacterias
heterotróficas (Safonova y col. 2004).
Figura 43. Remoción de aceites y grasas [(mg.L-1), (%)] en el primer ensayo.
121
Figura 44. Remoción de aceites y grasas [(mg.L-1), (%)] en el segundo ensayo.
Bhumibhamon y col. (2002), estudiaron dos grupos de bacterias (cultivos individuales–
cultivos mixtos) productores de lipasas, habiendo mayor remoción de DQO y Aceites y
grasas (81-99% y 73-88% respectivamente) con cultivos simples (cepas KUL8
Acinetobacter sp., KUL39 Bacillus sp. y KLB1 Pseudomonas sp.) durante 7 días de
tratamiento; las aguas residuales de palma de aceite y aguas residuales de panadería
utilizadas, demostraron que las cepas KUL8 y KUL39 remueven grasas y aceite en una
proporción de 87,7% y 80,6% en aguas residuales de palma de aceite, mientras que
solo el 70% y 64% en aguas residuales de panadería dentro de 48 horas de
tratamiento.
4.3.4. Presencia de exoenzimas
La presencia de exoenzimas en los diferentes cultivos con el agua residual inoculada
con microalgas y en el control, fue confirmada para amilasa, lipasa, celulasa y ureasa
(Tabla27). En cambio, en el control (AR), no inoculado con microalgas, solo se apreció
halos de actividad para amilasa y lipasa.
122
Tabla 27. Exoenzimas (halo-cm) presentes en los diferentes tratamientos del primer ensayo.
TRATAMIENTO AMILASA LIPASA* CELULASA UREASA
Control 0,8 0,5 0,4 +++
Control (AR) 0,4 0,3 - -
AR 0,5 0,6 0,4 ++
ARN 0,9 0,2 0,1 +
LIPASA*: yema de huevo, Ureasa: intensidad del color rojo-naranja.
En el segundo ensayo, se ratificó que el control (AR), solo registra una ligera actividad
de amilasa y celulasa; lo cual evidencia que la presencia de las microalgas inoculadas
al residual, favorece la producción significativa de las enzimas analizadas (Tabla 28).
Para el caso de la prueba de la ureasa, dicha actividad fue positiva después del tercer
día de incubación con muestras procedentes de los cultivos ARO y ARNO y AR;
mientras que en los otros tratamientos se detectó al quinto día.
Tabla 28. Exoenzimas (halo-cm) presentes en los diferentes tratamientos del segundo ensayo.
TRATAMIENTO AMILASA LIPASA* LIPASA** CELULASA UREASA
Control 1,6 1,2 0,7 - ++
Control (AR) 0,3 - - 0,3 -
NO 0,4 1,1 0,4 0,9 ++
AR 1,8 1,3 0,5 1,2 +++
ARN 1,8 1,2 0,3 0,1 ++
ARO 1,3 0,7 0,5 0,1 ++++
ARNO 1,5 1,6 0,5 0,1 ++++
Lipasa*: medio sólido con yema de huevo, Lipasa**: medio sólido con lecitina comercial (Val natural®), Ureasa: intensidad del color rojo-naranja.
Hosetti y Patil (1988, 1992), han determinado la presencia de catalasa, proteasa,
fosfatasa y amilasa en lagunas de estabilización de aguas residuales domésticas en
tres lagunas y comparadas durante los primeros 9 días y 60 días. Entre otros
resultados, reconocieron que las mayores actividades se encontraron en la laguna 3,
durante el periodo de pre-estabilización y de estabilización. Además, indicaron que las
actividades de catalasa, proteasa y amilasa fueron las más elevadas durante el período
de pre-estabilización, en relación a las actividades detectadas en el periodo de
estabilización.
123
Es de destacar que, el tratamiento biológico de aguas residuales está relacionado con
los microorganismos existentes y sus enzimas asociadas, tanto en condiciones
aeróbicas como en anaeróbicas. Por ejemplo, las proteasas y glicosidasas
desempeñan un papel esencial en la degradación de lodos residuales; pero sus
actividades están condicionadas a los niveles de oxígeno, fuentes de azufre y de otros
sustratos. Por ejemplo, la adición de almidón hidrolizado estimuló la actividad de las ß–
glicosidasas en los lodos activados (Nybroe y col. 1992). En los exopolisacáridos
asociados a los flóculos producidos durante los procesos de biodegradación de aguas
residuales, se han detectado un 17% de aminopeptidasas, 5% de α-glucosidasas, 23%
de proteasas y un 44% de α-amilasas (Cadoret y col. 2002); lo que corrobora la
importancia de los microorganismos productores de estas exoenzimas para incrementar
la velocidad de remoción de proteínas, grasas, ácidos nucleicos, exopolisacáridos y
almidones presentes en aguas residuales. Actualmente, se continua investigando
sobre el efecto de los procesos de transferencia de masa, intermediarios metabólicos,
exopolisacáridos, aceptores de electrones, pH y temperatura en las diferentes enzimas
hidrolíticas que incrementan la remoción de los componentes en aguas residuales
(Burgess y Pletschke, 2008). De acuerdo a los resultados obtenidos en nuestra
experiencia, las exoenzimas asociadas a microorganismos fotosintéticos y heterótrofos
de aguas residuales, deben de ser más estudiadas y lograr, su mayor expresión para
incrementar la velocidad de remoción de residuales.
4.3.5. Población de bacterias asociadas a los cultivos
Con la finalidad de complementar los factores involucrados en los procesos de
remoción de N, P, DQO y de grasas, se determinó la población de bacterias
heterotróficas en cada uno de los tratamientos, tanto al inicio como al final del segundo
experimento. Los resultados indican que en ARN se alcanzó la mayor número de
colonias de bacterias, con 25x105 UFC/mL (Tabla 29); mientras que en el resto de los
cultivos la población bacteriana estuvo en el siguiente en orden descendente:
ARN>control=ARNO>ARO>NO>AR> Control (AR).
124
Se observa, igualmente que, en todos los tratamientos hubo un ascenso del número de
bacterias, desde el inicio hasta el final del ensayo. Posiblemente, debido al aumento de
la disponibilidad de nutrientes que se fueron liberando, como producto de la
biodegradación de los compuestos en dichos medios de cultivos. Efecto observado
también en el control autotrófico, que con tan solo el fertilizante añadido y el inóculo
mixto de microalgas, se estimuló el crecimiento bacteriano asociado a estas microalgas
(Tabla 29). En cambio, tanto en ARNO como en ARO, se esperaba una mayor
población bacteriana, debido a la carga bacteriana asociada al agua residual (25%); a la
adición del fertilizante y a la mezcla orgánica (ARNO), los cuales estimularían aun más
el crecimiento bacteriano, conforme se fuese desarrollando el cultivo. No obstante, el
exceso de sustrato o de carga orgánica existente, pudiese haber inhibido el incremento
de bacterias a niveles más elevados que en el control.
Tabla 29. Población de bacterias (UFC/mLx105) al inicio y final del segundo ensayo.
TRATAMIENTOS INICIO FINAL
Control 0,03 19,4
Control (AR) 0,05 2,70
NO 0,04 10,9
AR 2,99 6,40
ARN 2,84 25,0
ARO 3,00 17,3
ARNO 2,91 19,3
Tal es el caso del control (AR) y AR, con las más bajas densidades de bacterias, que
coinciden con las más elevadas concentraciones iniciales de DQO de 14.166±665,97 y
14.978,83±570,32mg.mL-1 respectivamente (Tabla 26). Esto parece deducir, que la alta
carga orgánica inhibió desde un inicio la proliferación de la población bacteriana;
mientras que al adicionársele al agua residual el fertilizante y la mezcla orgánica, se le
suministró nutrientes mas disponibles para el crecimiento bacteriano, o que ambos
ingredientes contribuyeron a incrementar la biodegradación de la materia orgánica,
como para hacer mas disponibles los nutrientes liberados, para las bacterias e incluso
para el crecimiento microalgal. Razón por la cual, se incrementaría la población de
bacterias, tanto de las asociadas, como las inherentes al agua residual. Y de esta
125
manera, es como se puede explicar que, en NO, ARO, ARNO y ARN fue incrementando
la población bacteriana. Pero, con una mayor estimulación cuando se adicionaba el
fertilizante.
Los resultados obtenidos en el primer y segundo ensayo, reflejan que todos los factores
involucrados en el proceso de remoción de DQO, nitrógeno, fósforo, sólidos totales,
grasas y aceites contenidos en el agua residual derivada de la extracción del aceite de
palma, ejercen influencia sobre el crecimiento, producción de pigmentos y exoenzimas
en las microalgas; así como en el crecimiento bacteriano. Por otra parte, la remoción
de DQO pareció no depender de la adición de microalgas; ya que en su ausencia y
presencia hubo remociones de 14700,73±564,97 y 13.938,63mg.L-1 en el control (AR) y
A, lo cual representó un 98,14 y 98,39% respectivamente.
En cuanto al fósforo, se logró con el agua residual enriquecida con fertilizante y la
mezcla orgánica, la mayor remoción con el 74,80% (ARNO), un 67,78% en ARO y un
56,62% en ARN, cuando fue comparada a los controles (AR), autotrófico y AR. Las
grasas y aceites, también fueron removidas en mayor medida en ARNO con un 99,13%
(p<0,05), y con la eficiencias más baja en el control (AR). El tratamiento preliminar al
agua residual; así como su enriquecimiento con nutrientes orgánicos e inorgánicos,
también condicionan la eficiencia de remoción en cuanto a sólidos totales; ya que las
condiciones del segundo ensayo permitieron una mejor remoción que en el segundo
experimento. Por otra parte, la presencia de exoenzimas y de las bacterias asociadas
en los diferentes tratamientos, contribuyeron en menor o mayor grado a promover la
remoción de la DQO, Nitrógeno y fósforo; así como a interpretar el crecimiento y
desempeño de las microalgas en los diferentes tratamientos.
126
Conclusiones
127
En el Sistema de Estabilización de la planta extractora de aceite de palma se
identificaron 27 especies de microorganismos fotosintéticos; de las cuales el género
Chlorella sp., fue la más abundante. Asimismo, fueron aisladas y cultivadas 9 cepas de
microalgas (Chlorella sp. 1, sp. 2 y sp. 3., Scenedesmus sp. 1 y S. ecornis,
Chlamydomonas sp., Chlorococcum sp., Oocystis sp. y Euglena sp.) y 2 de
cianobacterias (Geitlerinema sp. y Synechocystis sp.).
De estos cultivos unialgales, se identificaron y aislaron 13 cepas de bacterias,
asociadas a los cultivos de Chlorella sp. 1 y sp. 2 (Corynebacterium durum y Bacillus
sphaericus), Scenedesmus sp. (Corynebacterium durum, Delftia acidovorans y
Staphylococcus hominis) Oocystis sp. (Bacillus sphaericus, Actinobacillus
actinomycetemcomitans, Pasteurella stomatis y Pasteurella aerogenes), Chlorococcum
sp. (Delftia sp. C-13 y C-42) y Geitlerinema sp. (Staphylococcus hominis,
Stenotrophomonas maltophilia, Brevundimononas diminuta, cepa C-12 Blanca, C-12
Naranja).
Los elevados valores de nutrientes, materia orgánica, aceites y grasas del
sistema de estabilización, reflejan un efecto sobre la adaptación, diversidad y
abundancia de los microorganismos fotosintéticos. La influencia del pH, nitrógeno,
fósforo y DQO parecen determinar en mayor grado, el crecimiento de las microalgas y
cianobacterias.
Chlorella sp. 1, Chlorella sp. 2, Chlorella sp. 3, Synechocystis sp., Oocystis sp. y
Geitlerinema sp. demostraron actividad de amilasa, lipasa, proteasa, fosfatasa, celulasa
y ureasa; sugiriendo estos resultados que las cepas de Chlorella sp., Oocystis sp.,
Scenedesmus sp., Chlorococcum sp. y Geitlerinema sp. pueden ser utilizadas para el
tratamiento de residuales enriquecidos con almidones, proteínas y grasas.
Los diferentes tratamientos involucrados en los experimentos, para el caso de los
controles (autotrófico, AR y NO), y de los cultivos con aguas residuales (AR, ARN, ARO
y ARNO), permitieron deducir que, la remoción de DQO, parece no depender, al menos
128
de las microalgas. En cambio, fue más efectiva la remoción del fósforo y de las grasas
cuando dicho residual era más enriquecido con nutrientes orgánicos e inorgánicos
(ARNO). De igual manera, con el agua residual enriquecida (AR, ARN, ARO y ARNO)
se remueve hasta un 99,58%, en relación a los controles.
El tratamiento preliminar al agua residual así como su enriquecimiento con
nutrientes orgánicos e inorgánicos, también condicionan la eficiencia de remoción en
cuanto a sólidos totales; ya que las condiciones del segundo ensayo permitieron una
mejor remoción que en el primer ensayo.
Los resultados obtenidos en condiciones de laboratorio reflejan que, todos los
parámetros fisicoquímicos analizados ejercen influencia sobre la población de bacterias
y sobre el crecimiento, producción de pigmentos y exoenzimas en las microalgas; las
cuales contribuyeron a promover la remoción de la DQO, Nitrógeno, fósforo, grasas y
aceites con alta eficiencia.
129
Recomendaciones
130
Monitorear el funcionamiento de las Lagunas de estabilización de la planta
extractora de aceite exhaustivamente, a fin de determinar la dinámica poblacional y
distribución de microorganismos fotosintéticos y heterotróficos para valorar su
contribución en los procesos de remoción de los residuales en función de los
parámetros fisicoquímicos.
Diseñar sistemas de cultivos de microalgas a diferentes proporciones de agua
residual de plantas extractoras de aceite a fin de establecer cual estimula un mayor
crecimiento que permita mejorar la calidad del agua a la salida del sistema.
Proponer a la empresa un estudio para utilizar la biomasa microalgal como
biofertilizante en los centros de propagación de la palma africana o de otros rubros
agrícolas.
Realizar estudios conducentes a la sobreproducción de exoenzimas de
microalgas y sus bacterias asociadas, a fin de aplicar inóculos altamente productores
para catalizar la velocidad de remoción en aguas residuales y para expandir su uso en
la industria.
Proponer a la empresa extractora de aceite de palma un estudio definitivo para
validar consorcios microbianos mixtos que aceleren la remoción de DQO, N, P y el
exceso de grasas y aceites en función del tiempo.
131
Índice de Referencias
132
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147
Índice de Figuras
148
Pág.
Figura 1. Ciclo de oxigenación fotosintética de aguas residuales. Salazar,
(2005).
18
Figura 2. Mecanismo de acción de las enzimas hidrolíticas sobre la materia
orgánica. (1) Limitación de la transferencia de masa, (2) EPS, (3)
Intermediarios metabólicos, (4) Condiciones del aceptor de electrones, (5) pH
y Temperatura. Todos tienen un efecto sobre la actividad de las enzimas
involucradas en el tratamiento de aguas residuales. Burgess y Pletschke,
(2008).
22
Figura 3. Sistema de Tratamiento de aguas residuales de las Lagunas de
Estabilización de Palmas Oleaginosas de Casacará Ltda-Colombia.
27
Figura 4. Cultivos en condiciones de laboratorio. 40
Figura 5. Agua residual antes de ser vertidas a las Lagunas de Estabilización. 41
Figura 6. Primer Ensayo (Tratamientos). 42
Figura 7. Segundo Ensayo (Tratamientos). 43
Figura 8. Micrografias (400x). (1) Primer Muestreo. a. Scenedesmus sp. b.
Oscillatoria sp. c. Oocystis sp. d. Pandorina sp. e. Lyngbya sp. f. Chroococcus
sp. (2) Segundo muestreo. g. Thiopedia sp. h. Pseudoanabaena sp. i.
Euglena sp. j. Monoraphidium sp. k. Synechococcus sp. l. Ankistrodesmus sp.
(3) Tercer muestreo. m. Haematococcus sp. n. Geitlerinema sp. o.
Kirchineriella lunaris.
54
Figura 9. Micrografias (400x). (4) Cuarto Muestreo. a. Navicula sp. b.
Synechocystis sp. c. Phacus sp. d. Nitzschia sp. e. Merismopedia sp.
56
Figura 10. a. Crecimiento comparativo de microalgas Chlorophyta. b.
Crecimiento de la cianobacteria Geitlerinema sp., seguido mediante turbidez.
59
Figura 11. Corynebacterium durum. 68
Figura 12. Bacillus sphaericus. 68
Figura 13. B. diminuta bacilo gramnegativo. 73
Figura 14. Colonias de Stenotrophomonas maltophilia. 74
Figura 15. Población de microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintéticas
en Lagunas de estabilización de una Planta extractora de aceite de palma,
75
149
orden cronológico de los muestreos. Muestreo 1: junio-2008, muestreo 2:
Septiembre 2008, muestreo 3: diciembre 2008, muestreo 4: mayo 2009.
Figura 16. Abundancia de microalgas, cianobacterias y bacterias
fotosintéticas según los sitios de muestreos en lagunas de estabilización de
una Planta extractora de aceite de palma, de acuerdo al orden de los
muestreos. a. Muestreo 1. b. Muestreo 2. c. Muestreo 3 y d. Muestreo 4.
76
Figura 17. Grasas y aceites (mg.L-1) en las lagunas de estabilización de
acuerdo a los muestreos.
76
Figura 18. Presencia de amilasa en medio sólido (almidón al 0,2%) en
microalgas y bacterias asociadas. a. Oocystis, b. Chlorella, c. Scenedesmus,
d. cepa bacteriana C-12 Naranja, e. A. actinomycetemcomitans, f. S.
maltophilia.
77
Figura 19. Variación de la actividad amilasa (U/g) en microalgas 79
Figura 20. Lipasa en microalgas. Medio Yema de Huevo: a. Chlorella sp.1, b.
Chlorococcum, c. Oocystis. Medio Tween 80: d. Euglena, e. Oocystis, f.
Chlorella sp. 3.
83
Figura 21. Presencia de lipasa en bacterias asociadas. Medio Yema de
Huevo: a. Stenotrophomonas maltophilia, b. Staphylococcus hominis, c.
Actinobacillus actinomycetemcomitans, Medio Tween 80: d. cepa C-12
Naranja, e. cepa C-42 Bacillus sphaericus, e. Staphylococcus hominis.
88
Figura 22. Licuefación de la gelatina en microalgas. 88
Figura 23. Celulasa en las microalgas a. Chlorella sp.1, b. Scenedesmus sp.
c. Euglena sp.
89
Figura 24. Presencia de ureasa en las microalgas Synechocystis sp. S.
ecornis, Chlamydomonas sp. Geitlerinema sp. Chlorella sp.2 Scenedesmus
sp. Oocystis sp. Euglena sp. Chlorococcum sp. y el Control.
93
Figura 25. Sistema de tratamiento aguas residuales (Extractora de Aceite de
Palma).
99
Figura 26. Crecimiento de microalgas en función de la edad del cultivo con
agua residual. Control: AR: agua residual, ARN: agua residual enriquecida
con Nitrofoska.
100
Figura 27. Variación del contenido de clorofila (µg.ml-1) con la edad del 100
150
cultivo.
Figura 28. Variación del contenido de carotenoides (µg.ml-1) con la edad del
cultivo.
101
Figura 29. Densidad celular (x106 cel.mL-1), clorofila y carotenoides (µg.mL-1)
del cultivo mixto de microalgas en control, AR y ARN.
102
Figura 30. Cultivo de microalgas en función de la edad del cultivo con
diferentes tratamientos. NO: Nitrofoska + O, AR: Agua residual, ARN: Agua
residual con Nitrofoska, ARO: Agua residual + O, ARNO: Agua residual
Nitrofoska + O.
103
Figura 31. Densidad celular (x106 cel.mL-1), clorofila y carotenoides totales
(µg.mL-1) del cultivo mixto de microalgas con los diferentes tratamientos.
105
Figura 32. Variación del pH durante el periodo experimental. a. Ensayo 1 b.
Ensayo 2
106
Figura 33. Remoción de DQO [(mg.L-1) (%)] en el primer Ensayo.
Control (AR): agua residual no inoculada con microalgas, AR: agua residual,
ARN: agua residual + Nitrofoska.
108
Figura 34. Remoción de DQO [(mg.L-1) (%)] en el segundo ensayo.
O: mezcla con lecitina, urea y almidón, NO: Nitrofoska + O, Control (AR),
ARN: agua residual+ Nitrofoska, ARO: agua residual + O, ARNO: agua
residual + Nitrofoska + O.
109
Figura 35. Remoción de sólidos totales [SST-(mg.L-1) y (SST-(%)] en el
primer ensayo.
110
Figura 36. Remoción de sólidos volátiles [SSV-(mg.L-1) y (SSV-(%)] en el
primer ensayo.
111
Figura 37. Remoción de sólidos totales [SST-(mg.L-1) y (SST-(%)] en el
segundo ensayo.
111
Figura 38. Remoción de sólidos volátiles [SSV-(mg.L-1) y (SSV-(%)] en el
Segundo ensayo.
112
Figura 39. Remoción de Nitrógeno Kjeldahl [(mg.L-1), (%)] en el primer
ensayo.
114
Figura 40. Remoción de Nitrógeno Kjeldahl [(mg.L-1), (%)] en el segundo
ensayo.
114
151
Figura 41. Remoción de Fosfatos [(mg.L-1), (%)] en el primer ensayo. 117
Figura 42. Remoción de Fosfatos [(mg.L-1), (%)] en el segundo ensayo. 118
Figura 43. Remoción de aceites y grasas [(mg.L-1), (%)] en el primer ensayo. 120
Figura 44. Remoción de aceites y grasas [(mg.L-1), (%)] en el segundo
ensayo.
121
152
Índice de Tablas
153
Pág.
Tabla 1. Microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintéticas más comunes
en Lagunas de Estabilización.
19
Tabla 2. Uso de microalgas para el tratamiento de aguas residuales en
lagunas de alta tasa de oxidación en diversos países.
19
Tabla 3. Uso de biomasa de microalgas cultivadas en aguas residuales. 20
Tabla 4. Composición química del medio de cultivo ALGAL. 29
Tabla 5. Composición química del fertilizante NITROFOSKA FOLIAR
(Insecticidas Internacionales, CA).
29
Tabla 6. Composición del medio BG11 (Rippka, 1988). 30
Tabla 7. Composición del medio organotrófico complejo. 33
Tabla 8. Microorganismos observados en los muestreos de las lagunas de
Estabilización.
57
Tabla 9. Microalgas y cianobacterias observados durante el periodo de
estudio en las Lagunas de Estabilización de una Planta extractora de aceite
de palma.
61
Tabla 10. Diversidad de microorganismos fotosintéticos en Lagunas de
estabilización.
62
Tabla 11. Características bioquímicas y diferenciales de Bacterias Gram-
positivas asociadas a las Microalgas.
63
Tabla 12. Caracterización bioquímica y de proliferación de las Bacterias
Gram-negativas asociadas a los cultivos de microalgas.
64
Tabla 13. DQO (mg.L-1) en las lagunas estabilización de acuerdo a cada
muestreo.
65
Tabla 14. SST (mg.L-1) en las lagunas estabilización de acuerdo a cada
muestreo.
65
Tabla 15. SSV (mg.L-1) en las lagunas estabilización de acuerdo a cada
muestreo.
69
Tabla 16. Nitrógeno Total (mg.L-1) en las lagunas estabilización de acuerdo a
cada muestreo.
72
Tabla 17. Fósforo Total (mg.L-1) en las lagunas estabilización de acuerdo a 78
154
cada muestreo.
Tabla 18. Grasas y aceites (mg.L-1) en las lagunas de estabilización de
acuerdo a cada muestreo.
82
Tabla 19. Monitoreo del pH en las Lagunas de Estabilización. 83
Tabla 20. Amilasa en microalgas y bacterias asociadas. 85
Tabla 21. Lipasa en Microalgas. 87
Tabla 22. Lipasa en bacterias asociadas a microalgas, método en placa y
espectrofotométrico (p-NPP).
90
Tabla 23. Exoenzimas (proteasa, ureasa, celulasa y fosfatasa) en microalgas. 94
Tabla 24. Exoenzimas (Proteasa, Ureasa, Celulosa y Fosfatasa) en bacterias
asociadas a las microalgas.
95
Tabla 25. Concentración inicial y final de DQO, nitrógeno, fósforo, grasas y
aceites (mg.mL-1) en el Primer ensayo.
115
Tabla 26. Concentración inicial y final de DQO, nitrógeno, fósforo, grasas y
aceites (mg.mL-1) en el Segundo ensayo.
115
Tabla 27. Exoenzimas (halo-cm) presentes en los diferentes tratamientos del
primer ensayo.
122
Tabla 28. Exoenzimas (halo-cm) presentes en los diferentes tratamientos del
segundo ensayo.
122
Tabla 29. Población de bacterias (UFC/mLx105) al inicio y final del segundo
ensayo.
124