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EVALUACIÓN DE DOS SISTEMAS DE MICROCOSMOS CON MATERIAL LIGNOCELULÓSICO PARA LA BIOTRANSFORMACIÓN con Pleurotus ostreatus DE
POLIETILENO DE BAJA DENSIDAD Oxo-DEGRADABLE (PEBD Oxo) PRETRATADO CON PLASMA DE OXÍGENO
Estudiante: Alejandra Castillo Toro
Director: Luis David Gómez Méndez, Microbiólogo. M.Sc, Ph.D.
Laboratorio de Películas delgadas y nanofotónica Laboratorio de Microbiología Ambiental y suelos
Pontificia Universidad Javeriana Bogotá-Colombia
Codirectora:
Aura Marina Pedroza Rodríguez, Bacterióloga. M.Sc, Ph.D. Laboratorio Microbiología Ambiental y suelos
Pontificia Universidad Javeriana Bogotá-Colombia
Asesor: Juan Felipe Mateus Maldonado, Microbiólogo Industrial.
Laboratorio Microbiología Ambiental y suelos Laboratorio Interacción Suelo Planta Microorganismos
Pontificia Universidad Javeriana Bogotá-Colombia
Trabajo de Grado
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTA D.C. 24 DE MAYO DE 2020
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EVALUACIÓN DE DOS SISTEMAS DE MICROCOSMOS CON MATERIAL LIGNOCELULÓSICO PARA LA BIOTRANSFORMACIÓN con Pleurotus ostreatus DE
POLIETILENO DE BAJA DENSIDAD Oxo-DEGRADABLE (PEBD Oxo) PRETRATADO CON PLASMA DE OXÍGENO
Alejandra Castillo Toro
APROBADO
_________________________ ___________________________
Concepción Puerta Bula, Bact, Ph.D. Marcela Franco Correa, Ph.D.
Decana académica Facultad de ciencias Directora carrera microbiología industrial
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EVALUACIÓN DE DOS SISTEMAS DE MICROCOSMOS PARA LA BIOTRANSFORMACIÓN con Pleurotus ostreatus DE POLIETILENO DE BAJA DENSIDAD Oxo-DEGRADABLE (PEBD Oxo) PRETRATADO CON PLASMA DE OXÍGENO
Alejandra Castillo Toro
APROBADO
___________________________ ______________________________
Luis David Gómez. Ph.D. Aura Marina Pedroza. Ph.D.
Director Co directora
______________________ ____________________________
Juan Felipe Mateus Maldonado Ivonne Gutiérrez. Ph.D.
Asesor Jurado
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
TRABAJO DE GRDO
BOGOTÁ D.C.
JUNIO 2020
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NOTA DE ADVERTENCIA
“La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velara porque no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la
verdad y la justicia”.
Artículo 23 de la Resolución No 13 de Julio de 1996
5
AGRADECIMIENTOS
A mi madre Diana Marcela Toro López por apoyarme, inspirarme y animarme en todo momento, sin su
esfuerzo, paciencia y amor mi crecimiento personal y profesional no hubiese sido posible.
A mi abuelo José Leonel Toro Echeverry Q.E.P.D por apoyarme, sus palabras de aliento, apoyo y amor
me llenaron de fuerzas para continuar, en honor a su memoria, gracias.
A Luis David Gómez Méndez por darme la oportunidad de realizar este bonito proyecto, por su guía, su
apoyo, por sus valiosos aportes en este trabajo y por su tiempo, por orientarme no sólo en este trabajo
sino a lo largo de mi formación académica, infinitas gracias.
A Aura Marina Rodríguez Pedroza por su dedicación, su constancia, su compromiso y su pasión, por su
paciencia, por sus valiosos aportes en este trabajo y por brindarme la oportunidad de trabajar y ser parte
del grupo de investigación de biotecnología ambiental y de suelos, infinitas gracias.
A Juan Felipe Mateus Maldonado por guiarme, apoyarme, animarme y acompañarme en todo momento.
A mis amigas Marcela Palacios y Jessica Moreno por su paciencia, su amistad y cariño.
6
CONTENIDO
1 Índice de figuras .............................................................................................................................................. 9
2 Índice de tablas ..............................................................................................................................................10
3 Tabla de abreviaturas ....................................................................................................................................11
4 Resumen .........................................................................................................................................................12
5 Introducción ...................................................................................................................................................14
6 Marco teórico .................................................................................................................................................17
6.1 PEBD Oxo ............................................................................................................................................17
6.2 Impacto ambiental ..............................................................................................................................18
6.3 Mecanismos de degradación de PEBD Oxo ...................................................................................19
6.3.1 Métodos físicos ................................................................................................................................19
6.3.2 Plasma de oxígeno (O2) ..................................................................................................................20
6.3.3 Termo y fotodegradación ...............................................................................................................21
6.4 Métodos biológicos ..............................................................................................................................22
6.4.1 Biotransformación con P. ostreatus ................................................................................................22
6.4.1.1 Factores que influyen en la biotransformación, con P. ostreatus, de PEDB Oxo y de
material lignocelulósico ............................................................................................................................24
6.4.1.1.1 Naturaleza del sustrato .....................................................................................................24
6.4.1.1.2 Relación Carbono/Nitrógeno (C/N) ............................................................................25
6.4.1.1.3 Humedad ............................................................................................................................26
6.4.1.1.4 pH ........................................................................................................................................26
6.4.1.1.5 Temperatura.......................................................................................................................26
6.4.1.1.6 Tipo de inóculo .................................................................................................................27
6.4.1.1.7 Mediadores redox .............................................................................................................27
6.5 Fermentación sólida como tecnología de transformación .............................................................27
6.5.1 Luz .....................................................................................................................................................28
6.5.2 Aireación ...........................................................................................................................................28
6.5.3 Tamaño de partícula ........................................................................................................................28
6.5.4 Tipo de envase/biorreactor ...........................................................................................................28
6.6 Aprovechamiento de residuos sólidos ..............................................................................................29
6.7 Biochar como subproducto derivado de los sistemas de microcosmos ......................................30
7 Justificación y planteamiento del problema ..............................................................................................32
8 Objetivo general ............................................................................................................................................34
8.1 Objetivos específicos ...........................................................................................................................34
7
9 Metodología....................................................................................................................................................34
9.1 Caracterización de PEBD Oxo ..........................................................................................................34
9.1.1 Hidrofobicidad .................................................................................................................................34
9.1.2 Rugosidad..........................................................................................................................................35
9.2 Descarga de plasma luminiscente de O2 como pretratamiento ....................................................35
9.3 Reactivación de Pleurotus ostreatus y propagación en medio de cultivo .........................................36
9.4 Biotransformación de láminas PEBD Oxo en sistema de microcosmos....................................37
9.4.1 Variables de respuesta asociadas a la biotransformación de la BLC en los dos sistemas de
microcosmos ..................................................................................................................................................38
9.4.1.1 Evaluación de parámetros enzimáticos ...............................................................................38
9.4.1.1.1 Actividad Lac (EC. 1.10.3.2) ...........................................................................................39
9.4.1.1.2 Actividad MnP (EC. 1.11.1.13) .......................................................................................39
9.4.1.1.3 Actividad LiP (EC. 1.11.1.14) .........................................................................................39
9.4.2 Evaluación de parámetros fisicoquímicos ...................................................................................40
9.4.2.1 Humedad .................................................................................................................................40
9.4.2.2 pH .............................................................................................................................................40
9.4.2.3 Determinación de carbono orgánico total (COT).............................................................40
9.4.2.4 Determinación de dióxido de carbono (CO2) ....................................................................41
9.4.2.5 Fraccionamiento de carbono ................................................................................................41
9.4.2.6 Fraccionamiento de sustancias poliméricas ........................................................................42
9.4.2.7 Fraccionamiento de sustancias fúlvicas...............................................................................42
9.4.2.8 Fraccionamiento de sustancias húmicas .............................................................................42
9.5 Producción y caracterización de biochar ..........................................................................................43
9.5.1 Producción de biochar ....................................................................................................................43
9.5.1.1 pH y porcentaje de humedad................................................................................................43
9.5.1.2 Determinación de la fracción o carbono volátiles (FV/CV) ...........................................43
9.5.1.3 Determinación del contenido de cenizas ............................................................................44
9.5.1.4 Determinación de carbono fijo ............................................................................................44
9.5.1.5 Determinación de rendimiento del biochar y rendimiento de carbono fijo .................44
9.6 Análisis estadístico ...............................................................................................................................45
10 Resultados y Discusión ................................................................................................................................45
10.1 Variables de respuesta asociadas a la biodegradación de PEBD Oxo .........................................46
10.1.1 Hidrofobicidad ...........................................................................................................................46
10.1.2 Rugosidad .....................................................................................................................................48
10.2 Variables de respuesta asociadas a la biotransformación de BLC ................................................50
8
10.2.1 Evaluación de parámetros fisicoquímicos y enzimáticos ......................................................50
10.2.1.1 Humedad .............................................................................................................................50
10.2.1.2 pH .........................................................................................................................................51
10.2.1.3 COT y CO2 .........................................................................................................................52
10.2.1.4 Actividad Enzimática ........................................................................................................54
10.2.2 Fraccionamiento de carbono .....................................................................................................58
10.3 Producción y Caracterización de biochar .........................................................................................61
10.3.1 Biochar generado a partir de BLC/R derivadas de los sistemas de microcosmos. ..........61
11 Conclusiones ..................................................................................................................................................62
12 Recomendaciones ..........................................................................................................................................63
13 Bibliografía .....................................................................................................................................................63
9
1 Índice de figuras
Figura 1. Estructura química de PEBD ..............................................................................................................17
Figura 2. Efecto del tratamiento con Plasma de O2..........................................................................................20
Figura 3. Reacción de fotooxidación de PEBD Oxo. ......................................................................................21
Figura 4. Proceso de adhesión micelial a la lámina de PEBD Oxo tratada con plasma de O2. .................23
Figura 5 Tipos de biorreactores para fermentación en sólido. ........................................................................29
Figura 6. Aplicaciones y propiedades benéficas de Biochar como enmendador de suelos agrícolas. .......32
Figura 7.Determinación del ángulo de contacto estático (SCA) .....................................................................35
Figura 8. Esquema de un aparato de plasma. .....................................................................................................36
Figura 9.Sistemas de microcosmos. .....................................................................................................................38
Figura 10. Preparación de BLC/R para producción de biochar. ....................................................................43
Figura 11. Determinación de SCA de láminas PEBD Oxo. ............................................................................46
Figura 12. Rugosidad de las láminas de PEBD Oxo mediante AFM. ...........................................................48
Figura 13. AFM de láminas de PEBD Oxo SMH y SMV. ..............................................................................49
Figura 14. Parámetros fisicoquímicos asociados a la biotransformación de BLC en SMH y SMV durante
135 días. ....................................................................................................................................................................51
Figura 15. Análisis enzimático en SMH y SMV durante 135 días. .................................................................54
Figura 16. UV-VIS espectro de SMH, SMV y Control. ..................................................................................59
Figura 17. Producto final Biochar. .......................................................................................................................61
10
2 Índice de tablas
Tabla 1. Resumen análisis de parámetros asociados a la biodegradación de PEBD Oxo y la BLC tanto
en SMH como el SMV……………………………………………………………………………......54
Tabla 2. Propiedades espectrales de HA, en UV-Vis………………………………………………….57
11
3 Tabla de abreviaturas
ABTS …..................................................... 2,2′-azino-di-(3-ethylbenzthiazoline ácido sulfónico
AFM …..................................................... Microscopía de fuerza atómica
BLC …..................................................... Biomasa lignocelulósica
BLC/R …..................................................... Biomasa lignocelulósica residual
CF …..................................................... Carbono fijo
COT …..................................................... Carbono orgánico total
CV …..................................................... Carbono volátil
DMP …..................................................... 2.6 dimetoxifenol
HPB …..................................................... Hongos de podredumbre blanca
Lac …..................................................... Lacasas
LiP …..................................................... Lignino Peroxidasas
LTP …..................................................... Plasma de baja temperatura
MC …..................................................... Material Crudo
MnP …..................................................... Manganeso Peroxidasas
PE …..................................................... Polietileno
PEBD …..................................................... Polietileno de baja densidad
PEBD Oxo …..................................................... Polietileno de baja densidad oxodegradable
SCA …..................................................... Ángulo de contacto estático
SF …..................................................... Sustancias fúlvicas
SH …..................................................... Sustancias húmicas
SHT …..................................................... Sustancias húmicas totales
SMH …..................................................... Sistema de microcosmos Horizontal
SMV …..................................................... Sistema de microcosmos vertical
UV-VIS …..................................................... Ultravioleta -Visible
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4 Resumen
La contaminación por plásticos es una problemática ambiental con enormes implicaciones para todas las
formas de vida en la tierra. Anualmente la humanidad genera millones de toneladas de residuos plásticos
que en la mayoría de los casos termina en rellenos sanitarios y en los ecosistemas marinos. Los plásticos
de un solo uso, como las bolsas plásticas, entre otros, están constituidos principalmente de polietileno de
baja densidad (PEBD), son producidos en grandes cantidades y son desechados casi al instante de ser
adquiridos, en consecuencia, los fabricantes adicionaron en el proceso de producción aditivos
prooxidantes, plásticos que ahora se comercializan como plásticos Oxodegradables (PEBD Oxo)
vendidos bajo la premisa de ser un producto biodegradable. Sin embargo, recientes investigaciones han
demostrado que los aditivos prooxidantes sólo catalizan la fragmentación del plástico bajo condiciones
de reacción específicas.
La problemática ambiental no sólo se da como consecuencia de la producción masiva de este material,
también, se da por la gestión irresponsable de los desechos plásticos y en especial aquellos fabricados con
PEBD Oxo. La gestión de los residuos incluye el tratamiento y la disposición adecuada de estos. Para
ello, se utiliza el tratamiento biológico de PEBD Oxo el cual consiste en emplear la habilidad de los
microorganismos de producir enzimas oxidativas que escinden la compleja estructura del plástico.
Pleurotus ostreatus es un hongo de podredumbre blanca (HPB) que se destaca frente a otros HPB debido a
que es capaz de producir un vasto complejo enzimático que oxida compuestos complejos que tienen en
su estructura enlaces C-C y anillos aromáticos, entre otros. Pese a que P. ostreatus es una alternativa
promisoria para la degradación del PEBD Oxo, este por sí sólo no puede asimilarlo debido a que el
PEBD Oxo es hidrofóbico, característica que dificulta la colonización de su superficie por parte de
cualquier microorganismo. Por ello, en este trabajo se realizó un pretratamiento a el PEBD Oxo con
plasma de O2 ya que el plasma, es capaz de modificar la superficie del PEBD Oxo volviéndolo hidrofílico
y con ello facilita la adherencia y colonización de P. ostreatus.
Por otra parte, las fermentaciones en sólido favorecen el crecimiento y la actividad enzimática de P.
ostreatus, debido a esto se emplearon sistemas de microcosmos que, además permiten controlar factores
que influyen sobre la efectividad de la fermentación. En una reciente investigación asociada a la
biodegradación de PEBD Oxo con P. ostreatus, se reportó la posibilidad de emplear un sistema de
microcosmos vertical (SMV) como tecnología para tratar PEBD Oxo. Sin embargo, el tratamiento
presentó problemas de humedad que dificultaron la biotransformación del PEBD Oxo, por ende, en este
trabajo se implementó un sistema de microcosmos horizontal (SMH) con el fin de controlar esta variable
y mejorar la biotransformación del PEBD Oxo. Además de modificar la geometría del sistema, para
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estimular el cometabolismo fúngico se adicionó biomasa lignocelulósica (BLC) compuesta de corteza de
pino, hidrolizado de levadura cervecera y papel como matriz para soportar el crecimiento de P. ostreatus.
Para determinar cuál de los sistemas (SMH y SMV) favoreció la biodegradación, tanto del PEBD Oxo
luego de ser sometido al plasma de O2 como de la BLC, después de someterlos al tratamiento biológico
durante 135 días, se evaluó la hidrofobicidad mediante la técnica de ángulo de contacto estático (SCA,
siglas en inglés) y la rugosidad mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) del PEBD Oxo. Al
finalizar el tratamiento (día 135) se observó una disminución de la hidrofobicidad del 63.63% para las
láminas de PEBD Oxo contenidas en el SMH. En contraste el PEBD Oxo contenido en el SMV presentó
un porcentaje de disminución del 74%. Los resultados en estas dos variables de respuestas asociadas al
PEBD Oxo indican que la biodegradación del PEBD Oxo en ambos sistemas (SMH y SMV) es similar.
Por su parte la actividad enzimática Lacasa (Lac) (14599 ± 3520 U Kg-1), Manganeso peroxidasa (MnP)
(1962.4 ± 220.3 U Kg-1) y lignino peroxidasa (LiP) (10008 ± 2406 U Kg-1), fue significativamente mayor
en el SMH que, en el SMV, Lac (10314 ± 1190 U Kg-1), LiP (2868 ± 941 U Kg-1) y MnP (576 ± 30 U
Kg-1). Estos resultados sugieren que el SMH favorece la actividad de las enzimas ligninolíticas asociada a
la biodegradación de compuestos recalcitrantes como el PEBD Oxo y la lignina.
En cuanto a la biodegradación de la BLC, se determinó de manera semicuantitativa el grado de
polimerización y condensación de la mezcla lignocelulósica mediante la técnica de fraccionamiento de
carbono y el análisis de la relación E4/E6, los resultados indican que en ambos sistemas se llevan a cabo
procesos de humificación directa y que en SMH empiezan a darse procesos de humificación indirecta,
sin que esto implique maduración y condensación completa de la BLC. Finalmente, a partir de la BLC
residual (BLC/R) se fabricó, de manera responsable, un biochar clase III. Este trabajo se realizó bajo el
marco del aprovechamiento de residuos sólidos, la gestión de residuos sólidos recalcitrantes, mediante
co-tratamiento de residuos en sistemas de microcosmos, así como, la generación responsable de un
producto con valor comercial.
14
5 Introducción
Existe una gran cantidad de productos contaminantes como bolsas, pitillos, envases y cubiertos, entre
otros. Dichos productos están hechos de diferentes clases de plásticos entre ellos el polietileno y
poliestireno, los cuales son maleables, baratos, universales, fáciles de adquirir y de producción masiva. La
mayoría de los productos plásticos son fabricados con polietileno (PE), el plástico más común y de mayor
demanda [Greyer et al., 2017]. Se estima que desde 1950 hasta el año 2015 se habían producido cerca de
8.3 mil millones de toneladas métricas de productos plásticos incluido el PE. Hasta el año 2015, 6.3 mil
millones de toneladas métricas se habían convertido en residuos, de esta cantidad el 12 % se habrían
incinerado, el 9 % reciclado y el 79 % restante depositado en rellenos sanitarios, cuerpos de agua y en
diversos ecosistemas naturales [Greyer et al., 2017]; en consecuencia, se ha dañado la integridad de los
ecosistemas naturales y de la capa de ozono, afectando todas las formas de vida, cambiando el
comportamiento, alimentación y supervivencia de muchas especies marinas y terrestres [Geyer et
al.,2017;Fauziah et al., 2015; Royer et al .,2018; Trotter et al .,2019]. De continuar con la misma
generación y gestión de residuos, se estima que para el año 2050 a nivel mundial, 12000 mil millones de
toneladas métricas de residuos plásticos estarán en rellenos sanitarios, cuerpos de agua y en los diversos
ecosistemas naturales [Greyer et al.,2017].
En Colombia en el año 2017 se produjeron 60 mil toneladas de bolsas plásticas marcadas, sin marcar y
de empaque al vacío; en el mismo año los colombianos compraron cerca de 482 mil toneladas de bolsas
plásticas [MASP et al., 2019], lo que quiere decir que 422 mil toneladas fueron importados al país para
suplir la demanda. En 2016, 268 mil toneladas de residuos sólidos fueron depositados en rellenos
sanitarios, celdas transitorias, cuerpos de agua y, parte de dichos residuos fueron quemados a cielo abierto
[MASP et al., 2019]; sin embargo, no existe una cifra precisa de la cantidad de toneladas de residuos
plásticos tipo (PE) que fueron depositados en los cuerpos de agua y en los rellenos sanitarios del país,
pese a esto, la acumulación acelerada de estos residuos no degradables ha generado problemas en el
tratamiento, control y descarte apropiado debido a que disminuye la capacidad de carga y la vida útil de
los rellenos sanitarios[MASP et al., 2019].
Para mitigar el impacto negativo del PE sobre el medio ambiente, se han desarrollado aditivos
prooxidantes que se adicionan durante la fabricación de este material con el fin de acelerar su proceso de
fragmentación y así su biodegradación [Chiellini.,2003]. Estos plásticos son conocidos como
Oxodegradables y se distribuyen a nivel mundial bajo el concepto comercial de ser un producto “amigable
con el ambiente”; por ende, también es común que los productos hechos con PE de baja densidad
15
(PEBD), como las bolsas plásticas que se encuentran en los supermercados, se fabriquen con aditivos
prooxidantes (PEBD Oxo) [da Luz et al., 2013].
El PEBD Oxo es un polímero complejo, recalcitrante y difícil de degradar; sin embargo, en vista de la
problemática que genera su acumulación, existen diversas estrategias para degradarlo entre las que se
destacan la foto-degradación con luz UV, termo-degradación mediante pirólisis y la biodegradación
empleando microorganismos [Gómez-Méndez et al., 2018, Moreno-Bayona et al., 2019]. Hasta el
momento ninguna de las estrategias mencionadas por sí solas es capaz de reducir el PEBD Oxo a
compuestos sencillos no recalcitrantes, sin embargo, frente a la termo, foto y biodegradación de PEBD
Oxo, la biodegradación es la opción más económica y amigable con el medio ambiente; para que se lleve
a cabo, es necesario asegurar que las condiciones de crecimiento y propiedades bioquímicas del
microorganismo sean las adecuadas para biodegradar PEBD Oxo [Moreno-Bayona et al., 2019].
En la biodegradación de PEBD Oxo, se emplean hongos de podredumbre blanca (HPB) debido a que
tienen la capacidad de formar redes de micelios y de producir exopolisacáridos que favorecen la
colonización del PEBD Oxo [Gómez-Méndez et al., 2018], además, producen una gran variedad de
enzimas extracelulares ligninolíticas estables e inespecíficas como Lacasas (EC. 1.10.3.2) (Lac),
Manganeso Peroxidasas (EC. 1.11.1.13) (MnP), Lignino Peroxidasas (EC. 1.11.1.14) (LiP), las cuales
actúan sobre diferentes residuos sólidos [Gómez-Méndez et al., 2018; Moreno-Bayona et al., 2019;
da Luz et al., 2014]. Adicionalmente, los subproductos derivados de la actividad metabólica de los HPB,
como el peróxido de hidrógeno, catalizan en presencia de hierro reacciones de óxido-reducción, dicho
proceso se denomina Fenton biológico [Zhu et al.,2016].
Entre los HPB productores de las enzimas mencionadas se destacan, Phanerochaete chrysosporium, Poliporus
versicolor, Pleurotus sajor caju y Pleurotus ostreatus, los cuales, además, han sido reportados como potenciales
degradadores de PE, PEBD, PEBD Oxo y PVC [da Luz et al., 2013; Gómez-Méndez et al., 2018; da
Luz et al.,2014; Moreno-Bayona et al.,2019; Klrbas et al.,1999]. Estudios más recientes han
mencionado la habilidad de Pleurotus ostreatus para biodegradar PE y PEBD Oxo, dicha habilidad está
relacionada además de producir ligninasas y celulasas, con su capacidad de producir un vasto complejo
enzimático que actúa sobre estos polímeros, a la actividad sinérgica entre las enzimas producidas y las
reacciones de fenton biológico [da Luz et al., 2013; Gómez-Méndez et al., 2018; Moreno-Bayona et
al., 2019; Krueger et al .,2017].
Para que el microorganismo produzca los metabolitos asociados a la biodegradación de PEBD Oxo, es
necesario controlar ciertos factores de cultivo como son: temperatura, humedad, pH y aireación; entre
otros. Dichos factores tienen un efecto directo en la actividad enzimática y, por ende, en la
16
biodegradación del PEBD Oxo. Asimismo, es importante estimular y mejorar las condiciones de
crecimiento, en este sentido el cultivo sólido asemeja condiciones de cultivo naturales promoviendo el
crecimiento, la colonización, síntesis y secreción de enzimas [Ferreira da Silva et al.,2019; Sadiq et al.,
2019], además, la adición de mediadores redox estimulan la actividad enzimática de Lac sobre el PEBD
Oxo. Igualmente, la incorporación de sustratos orgánicos complejos como los residuos agroindustriales,
en cultivos de HPB, promueven la síntesis de enzimas lignocelulósicas, así como el crecimiento fúngico
[Sadiq et al., 2019].
En el cultivo de HPB es común el uso de residuos agroindustriales debido a que, favorecen el crecimiento,
la producción de enzimas de interés biotecnológico, proveen elementos nutricionales requeridos, son
económicos y, proveen la posibilidad de dales valor agregado a los residuos que se deriva de actividades
tales como el aserrío, la fabricación de cerveza y papel [Sadiq et al.,2019]; estos residuos, pueden ser
incorporados en modalidad de co-tratamiento tanto del PEBD Oxo y como de los residuos
agroindustriales [Gómez-Méndez et al.,2018; Moreno-Bayona et al.,2019].La combinación de
diversos sustratos y/o BLC favorece la eficiencia biológica de P. ostreatus y la co-biodegradación de
contaminantes mediante cometabolismo [Bellettini et al.,2016].
En este trabajo se evaluó la co-biodegradación de PEBD Oxo pretratado con plasma de O2 y de biomasa
lignocelulósica (BLC), mediante la actividad enzimática de P. ostreatus bajo condiciones controladas en
dos sistemas de microcosmos, con el fin de generar una alternativa que, promueva la biodegradación de
PEBD Oxo usando como cosustrato BLC como corteza de pino, hidrolizado cervecero y servilleta.
Además, en el marco de la gestión de residuos sólidos y del aprovechamiento de estos, se realizó la
formulación de un nuevo tipo de biochar que puede ser utilizado en la biorremediación de aguas
contaminadas, como enmendador de suelos y “biocarrier”, entre otros.
17
6 Marco teórico
6.1 PEBD Oxo
Los plásticos son materiales sintéticos compuestos por largas cadenas de átomos de carbono con
morfología semicristalina [Peacocock.,2000]. Existen diversos tipos de plásticos clasificados de acuerdo
con sus propiedades fisicoquímicas. El PE es el plástico más popular en el mundo, se caracteriza por ser
un excelente aislante de conductividad, a bajas temperaturas mantiene su flexibilidad, no absorbe el agua,
es resistente a los químicos y se divide en grupos de acuerdo con su densidad: alta, baja y linear baja, la
cual depende del grado de cristalinidad; si aumenta la cristalinidad la densidad también aumenta [Billatos
et al.,1997].
El PEBD está constituido por cadenas alifáticas amorfas cortas, compuestos de enlaces C-C (figura 1),
es de baja cristalinidad, se caracteriza por ser un material flexible con bajo punto de fusión, su reología
no Newtoniana permite que al derretirse sea poco viscoso facilitando su maleabilidad, por ende, se emplea
en la fabricación de láminas usadas en el comercio principalmente como empaques de diversos productos
[Billatos et al., 1997; Rungswang et al.,2017 ] así como la fabricación de bolsas de uso cotidiano, entre
otros.
Figura 1. Estructura química de PEBD
Fuente: [Sogancioglu et al.,2017]
Los objetos fabricados con este material están distribuidos a nivel mundial y al ser no degradable, su
acumulación es una problemática ambiental global debido al impacto negativo que este tiene sobre la
biodiversidad y la integridad de los ecosistemas. Una de las estrategias para evitar la acumulación de este
material es acelerar el proceso de degradación del plástico; para ello, se incorporan aditivos prooxidantes
durante su fabricación adjudicándoles el nombre de plásticos Oxodegradables.
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Los aditivos prooxidantes se dividen entre sales metálicas de transición y sistemas libres de metales de
transición [Subhas et al., 2019], los cuales actúan como iniciadores de la termo y fotodegradación de las
cadenas carbonadas del PE y en general de los polímeros derivados de los hidrocarburos [Chiellini.,
2003]. La reacción de los aditivos prooxidantes depende de la exposición de los plásticos al calor, a la luz
UV y al oxígeno, sin estos factores que estimulen la reacción, las características de los PEBD Oxo son
las mismas que los PEBD sin aditivos [Al-Salem et al., 2019; Subhas et al., 2019].
La degradación del PEBD con adición de metales de transición como el Fe, Co y Mn inicia cuando el
contaminante es expuesto al calor y a la luz UV formando hidroperóxidos que reaccionan con oxígeno
atmosférico y con los metales presentes en los aditivos generando como producto compuestos de bajo
peso molecular como ácidos carboxílicos, alcoholes y cetonas [da Luz et al., 2013]. La acción de los
aditivos en el plástico debilita sus propiedades térmicas y mecánicas favoreciendo el rompimiento y la
sensibilidad en la foto y termo oxidación del polímero [Nam et al., 2016]. Adicionalmente, genera grietas
y huecos en la superficie del plástico [da Luz et al., 2013]. Los aditivos prooxidantes no mineralizan el
PEBD, sólo favorecen la fragmentación [da Luz et al., 2013; Chiellini., 2003; Benítez et al., 2012;
Gutiérrez-Villareal et al., 2014; Gómez-Méndez et al., 2018; da Luz et al., 2014; Moreno-Bayona
et al., 2019], y liberación de algunos compuestos que, bajo condiciones específicas, pueden contribuir a
la degradación del plástico a compuestos asimilables por microorganismos [Ferreira da Silva et al.,
2019].
6.2 Impacto ambiental
La degradación de este material por termo-foto-degradación genera la liberación de gases de efecto
invernadero tales como, metano (CH4) y etileno el cual favorece el incremento en la formación de ozono
troposférico y de monóxido de carbono; en condiciones naturales la liberación de estos gases se da debido
a los cambios estructurales generados durante la exposición del PEBD a los rayos UV derivados de la luz
solar [Royer et al.,2018]. Un factor agravante en la liberación de dichos gases es que se incrementa
cuando el PEBD está en pedazos; el estudio de Royer et al., (2018) indica que entre más pequeña sea la
morfología del PEBD más superficie de contacto parece haber entre los rayos UV y los hidroxilos del
PEBD que reaccionan generando CH4 y etileno; además los PEBD que terminan en rellenos sanitarios y
en el agua continúan liberando metano aún si no hay una exposición constante a la luz solar. Lo anterior
es relevante frente al PEBD Oxo ya que los aditivos prooxidantes del PEBD Oxo aceleran el proceso de
fragmentación del plástico, lo que puede incrementar y favorecer la liberación de dichos gases.
Además de los gases de efecto invernadero, los microplásticos de PEBD Oxo resultantes del proceso de
oxidación caen en los cuerpos de agua, allí, son consumidos por algunos animales marinos como el
19
plancton y los peces; esto es grave ya que este material no aporta los requerimientos nutricionales
necesarios para su desarrollo [Fauziah et al.,2015] causándole la muerte por inanición, en consecuencia,
altera la cadena trófica. Así mismo, los microplásticos afectan la comunicación química de los organismos
debido a que los químicos asociados con la comunicación se adhieren en los microplásticos, lo que
conlleva a una interferencia en la comunicación y cambios en el comportamiento de las especies [Trotter
et al., 2019].
El efecto nocivo del PEBD Oxo sobre los ecosistemas es resultado de la inadecuada disposición de los
residuos plásticos luego de ser usados. En Colombia, como medida para mitigar y controlar el impacto
de estos residuos, se establece en la resolución 1407 de 2018 [MinAmbiente., 2018] la gestión ambiental
de los residuos de envases y empaques de papel, cartón, plástico, vidrios y metales, además de otras
determinaciones las cuales tiene por objeto responsabilizar tanto al productor, vendedor y consumidor,
además de impulsar la disminución en la generación de residuos y, aumentar la recuperación y tratamiento
de estos. Así mismo, de la mano de la resolución 1407 de 2018, el documento 3874 de la CONPES
[CONPES., 2016], destaca que el modelo lineal de compra, consumo y desecho ha generado problemas
en materia de disponibilidad de materias primas usadas en el proceso de producción y, un incremento en
la demanda de suelos necesarios para su disposición final; por ende, la gestión de residuos sólidos en el
marco de la economía circular responde a estas problemáticas y apoya la iniciativa nacional de disminuir
y tratar residuos sólidos agroindustriales y compuestos contaminantes como el plástico.
6.3 Mecanismos de degradación de PEBD Oxo
6.3.1 Métodos físicos
El deterioro del PEBD Oxo es más rápido que los PEBD sin aditivo, sin embargo, el acelerado proceso
de deterioro del PEBD Oxo consiste en la fragmentación del material y no involucra precisamente
mineralización u otro proceso de degradación completa. La degradación completa es difícil debido a que
el PEBD Oxo tiene una estructura química inerte que consiste en cadenas de enlaces carbono-carbono
no hidrolizables, su naturaleza macromolecular es grande y no pasa por la membrana porosa de los
microorganismos, además su complejidad incrementa la dificultad de recibir un ataque enzimático
[Krueger et al ., 2017]. Finalmente, una de las características físicas del PEBD Oxo es que es hidrofóbico
por lo que no es posible que los microorganismos puedan asimilarlo. Para solucionar ese problema existen
métodos físicos que disminuyen la hidrofobicidad del PEBD Oxo, como las descargas de plasma de O2
sobre las láminas del material [Gómez-Méndez et al., 2018; Moreno-Bayona et al., 2019].
20
6.3.2 Plasma de oxígeno (O2)
El plasma es un estado físico de alta conductividad eléctrica que en su mayoría tiene propiedades
mecánicas gaseosas a altas temperaturas [Hora., 2000], está compuesto de iones y electrones libres que
se mueven en todas las direcciones del espacio. El plasma, se diferencia de los gases convencionales
porque está compuesto exclusivamente de partículas eléctricamente neutras, además, la interacción entre
las partículas se da a distancia primero de forma atractiva y luego, antes del contacto, de manera repulsiva,
adicionalmente presentan un comportamiento colectivo cuando en el campo electromagnético hay una
perturbación que desplaza a una sola carga [Moisan et al., 2014].
El plasma se forma cuando un gas es sometido a calentamiento térmico, a iluminación por rayos X o UV,
o al bombardeo de partículas energéticas [Inan et al., 2011], además existen diversos tipos de plasma
que difieren tanto en la temperatura de formación como en la partícula energética; el plasma de oxígeno
es generado mediante la ionización del gas O2 en condiciones de vacío.
En la actualidad el plasma de O2 es utilizado para diversos fines, el más destacado se relaciona con la
modificación de las características moleculares de las superficies. En materiales y/o nanopartículas
conductoras o semi conductoras se utiliza para mejorar la conductividad y la actividad catalítica [Nam et
al., 2016; Kalygina et al., 2014], también se aplica sobre superficies poliméricas como el polietileno
tereftalato (Figura 2), con el objetivo de incrementar la hidrofilia, disminuir la estática y la presencia de
contaminantes como el quitosano, además se aplica para desinfectar superficies y membranas [Lv et al.,
2016]. Estudios más recientes sugieren utilizar el plasma de O2 como pretratamiento de polímeros como
el PE con el fin de debilitar su estructura y favorecer su degradación [Holc et al., 2018; Friedrich., 2012;
Gómez-Méndez et al.,2018].
Figura 2. Efecto del tratamiento con Plasma de O2
En láminas de polietileno tereftalato (PET) después de dos minutos de tratamiento, oxidación de la lámina de
PET como consecuencia de la exposición con plasma de O2 . Fuente: [Lv et al., 2016].
Los cambios en la hidrofobicidad de las superficies poliméricas se deben a la ruptura de los enlaces
carbono - carbono y a la formación de enlaces entre átomos de carbono y oxígeno [Holc et al., 2018]
(Fig. 2), adicionalmente, se forman poros que incrementan la rugosidad y comprometen la densidad del
21
PE favoreciendo la adherencia de algunos microorganismos [Gómez-Méndez et al., 2019; Moreno-
Bayona et al., 2019].
6.3.3 Termo y fotodegradación
El proceso de oxodegradación involucra la foto-degradación, este mecanismo consiste en la ruptura
homolítica de la parte poliolefínica de los enlaces C-C del PEBD Oxo en los puntos de ramificación,
debido a la acción directa de los rayos UV sobre el material se forman radicales libres [Raquez et al.,
2011] que pueden reaccionar con el oxígeno atmosférico dando lugar a la formación de hidroperóxidos,
peróxido, etc. La captación del oxígeno atmosférico es un paso esencial en la oxodegradación, en este
mecanismo los metales de transición presentes en los aditivos prooxidantes captan el O2 y extraen el
hidrógeno de los hidroperóxidos mediante la escisión intramolecular de los enlaces, como consecuencia,
se da la descomposición de los hidroperóxidos dando lugar a la formación de carbonilos e hidroxilos
(Figura 3) [Roy et al., 2009] que debilitan la estructura del PEBD Oxo, haciéndolo más frágil [Raquez
et al., 2011]. El debilitamiento en la estructura del PEBD Oxo favorece la fragmentación del material y
la acción enzimática de algunos microorganismos.
Figura 3. Reacción de fotooxidación de PEBD Oxo.
Fuente: [Raquez et al., 2010]
Cabe resaltar que además de los procesos de oxodegradación, el PEBD Oxo también podría ser sometido
a procesos de termo degradación como una alternativa para descomponer este contaminante. La termo
degradación o pirólisis es un método térmico (300º C -900° C) que fomenta la escisión de los enlaces
carbono - carbono, generando como resultado aceites con potencial para la producción de
biocombustibles y gases [Shahnaz.,2017]. Los productos de la pirólisis varían dependiendo de la
temperatura de reacción, presión, gases y tipo de catalizador que se esté aplicando [Park et al.,2002], sin
embargo, la pirólisis de materiales plásticos tiene varios retos, el más relevante tiene que ver con la
contención de los gases que se producen tales como el metano, etano y el propano que son gases
asociados al efecto invernadero, causante del calentamiento global. Una inadecuada contención de los
gases puede afectar la integridad del medio ambiente y causar daños irreparables; adicionalmente, el calor
22
necesario para realizar la pirólisis es enérgicamente más costoso que otros métodos asociados a la
degradación del plástico.
La degradación de PEBD Oxo por mecanismos químicos también involucra reacciones Fenton químicas
y biológicas, dichas reacciones hacen parte de procesos de oxidación avanzada en la que se genera
radicales hidroxilos; la química Fenton involucra procesos foto-catalíticos en presencia de radiación UV,
hierro y peróxido de hidrógeno, los cuales son frecuentemente usados para la degradación de
contaminantes orgánicos. El éxito de estas reacciones está condicionado a la concentración de hierro, así
como al valor del pH que se esté manejando [Ameta et al., 2013].
6.4 Métodos biológicos
Las alternativas biológicas para degradar el plástico involucran tratamientos con microorganismos ya que
tienen la capacidad de producir enzimas que catalizan reacciones de oxido-reducción promoviendo la
degradación del PEBD Oxo. Los HPB se destacan por tener la habilidad de producir enzimas oxidativas
que actúan sobre diversos sustratos que tienen en su estructura compuestos aromáticos, alifáticos y
fenólicos; entre estos se destaca P. ostreatus por producir polifenol oxidasas y peroxidasas que actúan sobre
las estructuras mencionadas, su actividad enzimática se extiende a compuestos que no poseen anillos
aromáticos [Gómez-Méndez et al., 2019] como es el caso del PEBD Oxo.
6.4.1 Biotransformación con P. ostreatus
Los HPB son basidiomicetes que comúnmente crecen sobre la madera; los hongos del género Pleurotus
son conocidos por formar cuerpos fructíferos comestibles con forma de “oreja”. P. ostreatus es el hongo
más cultivado y consumido en el mundo que se destaca por sus cualidades organolépticas y medicinales;
contiene varios metabolitos bioactivos como exopolisacáridos, esteroides y lectinas que son extraídos del
cuerpo fructífero, del micelio y de las secreciones extracelulares [Atli et al., 2019]; también, tiene la
capacidad de expresar diversas enzimas extracelulares con alta actividad sobre diferentes sustratos [Zhuo
et al.,2019]. Pertenecen al orden Agaricales, clase Basidiomycota, y a la subclase Hollobasidio mycetidae.
Se encuentran naturalmente en zonas montañosas, subtropicales y templadas [Siddqi et al., 2018], crecen
en casi todas las maderas duras y en lo subproductos de la madera como el aserrín, los residuos de papel,
lodos de pulpa y, en todas las pajas de cereales, en el maíz, en bagazos de caña de azúcar y en residuos de
café; entre otros [Suwanno et al., 2019].
P. ostreatus tienen la capacidad de producir enzimas oxidativas que permiten la degradación completa de
la madera; en este proceso actúan una gran variedad de enzimas peroxidasas y oxidasas extracelulares que
interactúan entre sí despolimerizando, mineralizando y degradando la lignina, además, secretan celulasas
23
y hemicelulosas que escinden los polisacáridos que conforman la pared celular vegetal [Zhu et al.,2016;
Cueva et al., 2017]. Su actividad metabólica, favorece la degradación de compuestos recalcitrantes como
la madera y, diferentes tipos de PE. La degradación de PEBD Oxo por P. ostreatus se lleva a cabo mediante
colonización, adhesión, secreción de enzimas y por Fenton biológico. La colonización de P. ostreatus,
sobre las láminas de PEBD Oxo previamente tratadas con plasma de O2 se debe a la producción, por
parte del hongo, de exopolisacáridos para la formación de biopelículas sobre el material [da Luz et al.,
2013; Moreno-Bayona et al., 2019]; Posteriormente, la adhesión a éste (Figura 4) se da como
consecuencia de las modificaciones en la carga superficial del PEBD Oxo generadas por la descarga de
plasma O2 y, la formación de grupos polares en la estructura del material que favorecen la formación de
puentes de hidrógeno entre el PEBD Oxo y la superficie de la pared fúngica [Gómez-Méndez et
al.,2018]. Luego, se lleva a cabo la liberación de enzimas asociadas a la degradación; los grupos de enzimas
más destacados producidos por P. ostreatus son las polifenol oxidasas, entre ellas Lacasas (Lac) y,
peroxidasas como Manganeso Peroxidasas (MnP) y Lignino Peroxidasas (LiP). Las ligninasas participan
en la degradación de PEBD Oxo oxidando sus estructuras amorfas alifáticas [Moreno-Bayona et al.,
2019; da Luz et al., 2014; Sel et al.,2015]. Adicionalmente, en presencia de mediadores redox aumenta
la secreción de enzimas tipo lacasas, también, frecuentemente asociadas con la oxidación de compuestos
contaminantes [Moreno-Bayona et al., 2019; Zhuo R et al 2017]. Simultáneamente la degradación
mediante Fenton biológico se da gracias a los productos intermediarios de la secreción de las enzimas
ligninolíticas, como el peróxido de hidrógeno y el Fe-2, los cuales oxidan la porción alifática del PEBD
Oxo generando un rompimiento del enlace C-C [Krueger et al.,2017].
Figura 4. Proceso de adhesión micelial a la lámina de PEBD Oxo tratada con plasma de O2.
Fuente: Propia.
24
Las enzimas ligninolíticas, celulasas, hemicelulosas, entre otras, producidas por P. ostreatus, son utilizadas
en la fabricación de pulpa de papel, en la biopolimerización de Jeans, en la fabricación de biocombustibles,
en el tratamiento de agua residual contaminada con colorantes [Zhuo et al.,2017; Haider et al.,2017] y
en la biodegradación de plásticos [da Luz et al., 2013; Gómez-Méndez et al., 2018; da Luz et al.,
2014; Moreno-Bayona et al., 2019]. Recientes aproximaciones enfocadas a la degradación de plásticos
demostraron la capacidad de P. ostreatus de generar halos de degradación sobre láminas PEBD Oxo de
color rojo en un cultivo sólido diseñado para la formación de cuerpos fructíferos [da Luz et al., 2013]
y, su habilidad colonizadora sobre PEBD Oxo [da Luz et al., 2014]. Se ha demostrado que bajo
condiciones controladas de crecimiento P. ostreatus puede biodegradar láminas de PEBD y PEBD Oxo
tratadas previamente con plasma de O2 [da Luz et al., 2014; Moreno-Bayona et al., 2019]; sin embargo,
la degradación completa de PEBD Oxo pretratado con plasma de O2 depende de los factores limitantes
de crecimiento que promueven la producción de enzimas asociadas a la biotransformación de este
contaminante [Moreno-Bayona et al., 2019].
6.4.1.1 Factores que influyen en la biotransformación, con P. ostreatus, de PEDB Oxo y de
material lignocelulósico
6.4.1.1.1 Naturaleza del sustrato
En la naturaleza P. ostreatus crece sobre los troncos de los árboles, en ambientes con baja actividad de
agua (aw) y con elevadas relaciones C/N. Debido a las condiciones naturales en las que crece, la
producción de enzimas por parte de P. ostreatus aumenta en fermentaciones sólidas [Sel et al.,2015]. El
término fermentación se refiere a toda aquella transformación de materia orgánica mediante la actividad
de enzimas producidas por microorganismos [Pearson et al.,2019]. Así mismo, la fermentación en sólido
es el crecimiento de microorganismos en materiales sólidos en ausencia de agua libre [Sel et al.,2015].
En este tipo de fermentaciones es común utilizar residuos agroindustriales sólidos debido a que,
promueven el crecimiento fúngico y la producción de una gran variedad enzimas; adicionalmente, son
económicos, disminuyen el riesgo de contaminación y problemas ambientales [Ferreira da Silva et
al.,2019].
La composición de los residuos agroindustriales tiene influencia directa sobre la actividad enzimática.
Como ejemplo, los residuos agroindustriales derivados de la actividad de aserrío están compuestos
mayoritariamente de lignina y en menor proporción de celulosa y hemicelulosa [Sel et al.,2015]. La
lignina tiende a atraer las enzimas celulíticas lo que genera una atracción no productiva que afecta el
rendimiento de las celulasas; en contraste, un alto porcentaje de lignina induce la producción de LiP
[Ferreira da Silva et al.,2019; Bellettini et al.,2016]; adicionalmente, los compuestos aromáticos de la
lignina estimulan la expresión de lacasas [Zhuo et al.,2017]. Además de la lignina, celulosa y
25
hemicelulosa, algunos residuos agroindustriales contienen iones de metales que pueden inducir la
actividad enzimática, pese a esto, los excesos de iones metálicos también pueden incurrir en un
detrimento en el crecimiento fúngico que resulta en una prolongada fase de latencia [Ferreira da Silva
et al.,2019], por lo tanto, la composición del sustrato debe estar en equilibrio con el fin de favorecer la
producción, secreción y actividad de las enzimas que se producen. En el cultivo de P. ostreatus, la adición
de residuos agroindustriales, como corteza de pino, hidrolizado de levadura cervecera y servilletas de
papel favorece la actividad enzimática ligninolítica asociada a la degradación de estos materiales y del
PEBD Oxo pretratado con plasma de O2 [Moreno-Bayona et al., 2019], a través de un proceso
denominado cometabolismo [da Luz et al.,2013]. La degradación y asimilación de ambas fuentes de
carbono no se da de forma simultánea. Generalmente en fermentaciones sólidas donde se induce el
cometabolismo, una de las fuentes de carbono suministrada es energéticamente más fácil de degradar. En
este caso, la degradación de estos residuos es parcialmente oxidada por la acción de las enzimas
ligninolíticas producidas por P. ostreatus, favoreciendo la producción de micelio y de enzimas ligninolíticas
que actúan también sobre el PEBD Oxo [Moreno-Bayona et al.,2019].
Así mismo, la mezcla de los residuos agroindustriales (BLC) posee una alta relación C/N por ello, para
garantizar el adecuado crecimiento de P. ostreatus se requiere que el sustrato posea una fuente de nitrógeno
adicional como, tartrato de amonio, hidrolizado de proteína, fosfato dibásico de amonio, entre otros
[Ferreira da Silva et al., 2019]. La adición de nitrógeno es fundamental para estimular la producción de
micelio e incrementar la producción enzimática [Bellettini et al.,2016]. Finalmente, la proporción de los
sustratos es importante para favorecer los procesos de fermentación, en este sentido, la relación entre
C/N es un factor relevante en el crecimiento y desarrollo fúngico.
6.4.1.1.2 Relación Carbono/Nitrógeno (C/N)
La relación C/N determina el crecimiento y la producción enzimática, una relación 10:1 indica un medio
rico en carbono que favorece la producción de enzimas ligninolíticas y pobre en nitrógeno, lo que inhibe
la producción de micelio [Bellettini et al.,2016]. Cuando se trata de materiales con alto contenido de
lignina la relación tiende a disminuir por debajo de 15, esto es indicio de maduración del material
[Moreno-Bayona et al., 2019]. La producción de biomasa y enzimas ligninolíticas por parte de P. ostreatus
en fermentaciones sólidas con cosustrato, tiende a variar de acuerdo con la relación C/N para que el
microorganismo produzca los metabolitos necesarios para la codegradación de los compuestos
recalcitrantes (PEBD Oxo) y BLC; la relación mínima de C/N es 10:1 y la máxima es 30:1, con óptima
producción de enzimas en una relación 20:1 [Economou et al.,2017]. Pese a que la relación C/N varía
de acuerdo con los sustratos que se adicionen, la relación mejora cuando se añaden al medio materiales
ricos en nitrógeno, como hidrolizados de nitrógeno o amonio [Cueva et al., 2017]. Además de la relación
26
C/N, el tiempo de fermentación tiene un efecto directo en la degradación de compuestos recalcitrantes.
En fermentaciones sólidas la tasa de degradación es baja por lo que requiere más tiempo (entre más
tiempo de cultivo mayor actividad enzimática); el tiempo en cultivos de P. ostreatus le toma más de 120
días a ese punto degradar el 50 % de los sustratos [Wan y Li., 2012]. Sin embargo, la degradación eficiente
de los cosustratos depende no solamente del tiempo y de la relación C/N, sino también de la humedad
del sustrato.
6.4.1.1.3 Humedad
La humedad es un parámetro importante en fermentaciones sólidas, ya que de esta depende la
transferencia de oxígeno, la colonización del sustrato y la actividad de las enzimas producidas por parte
de P. ostreatus. En este sentido, el exceso de humedad interfiere en la transferencia de oxígeno debido a la
formación de agregados y a la colmatación del material favoreciendo el establecimiento de nichos
anoxigénicos, así como el crecimiento de microorganismos contaminantes [Bellettini et al., 2016]. Pese
a esto, se ha visto que una humedad hasta del 80 % puede ser favorable para el crecimiento micelial, sin
que esto necesariamente represente una alta actividad ligninolítica [Wang et al.,2012]. Por otro lado,
sustratos con baja humedad favorecen la rápida colonización de P. ostreatus sobre residuos lignocelulósicos
[Bellettini et al., 2016] pero limitan la solubilidad de los nutrientes y, por ende, su disponibilidad. Valores
por debajo de 60 % y mayores al 70 % perjudican el desarrollo fúngico, así como la producción de
enzimas [Yoon et al., 2014].
6.4.1.1.4 pH
Fuertes variaciones en el valor de pH pueden incurrir en la inhibición del crecimiento, así como la
inactivación de la actividad enzimática; en el caso de P. ostreatus, los valores de pH que se han reportado
para el cultivo micelial están en el rango entre 4.0 y 7.0 [Bellettini et al., 2016]. Adicionalmente, la carga
de los sustratos es un factor que contribuye a la adhesión celular; el PEBD Oxo posee una carga
superficial positiva que repele las proteínas de adhesión, presentes en la superficie de la pared celular de
los microorganismos, sin embargo, la oxidación del PEBD Oxo cambia la carga superficial favoreciendo
la interacción entre la pared celular y el PEBD Oxo [Gómez-Méndez et al., 2018].
6.4.1.1.5 Temperatura
La temperatura para el crecimiento de HPB varía de acuerdo con la especie que se esté cultivando, sin
embargo, los rangos oscilan entre 25º C y 37˚ C, Si el proceso de fermentación se lleva a temperaturas
superiores puede causar desnaturalización de las enzimas [Yoon et al., 2014]. En fermentaciones sólidas
la temperatura tiende a aumentar como resultado de la actividad enzimática del hongo, lo que incurre en
muerte e inhibición del crecimiento y metabolismo fúngico [Wang et al., 2012]. En cuanto a la
27
temperatura óptima de crecimiento de P. ostreatus oscila entre 25˚ C - 35˚ C [Yoon et al., 2014; Bellettini
et al., 2016].
6.4.1.1.6 Tipo de inóculo
La manera en que se inocula un sistema de fermentación sólido es fundamental en términos de tiempo
de cultivo y colonización de sustrato. La inoculación con suspensión de esporas es un método fácil, sin
embargo, el crecimiento micelial del hongo es prolongado y no es favorable en especies de Basidiomicetes
ya que no producen esporas [Wang et al.,2012]. Por otro lado, la adición de discos de micelio reduce el
tiempo de crecimiento, pero no es recomendable para consorcios fúngicos debido a los diferentes
tiempos de crecimiento; por su parte la suspensión de micelio, aunque requiere bastante tiempo para
producirse e involucra pasos de lavado y centrifugación, facilita su homogenización en el medio sólido y
favorece la colonización completa del sustrato [Yoon et al.,2014]. La colonización completa de los
sustratos favorece la adhesión y la penetración hifal, además, la red de micelio genera daños mecánicos
en los sustratos permitiendo el establecimiento de las hifas a través de la BLC, el establecimiento de un
entramado sobre los sustratos favorece e incrementa la biodegradación [Gómez-Méndez et al. 2018;
Schwarze F.,2007].
6.4.1.1.7 Mediadores redox
Los mediadores redox se adicionan a las fermentaciones sólidas para favorecer la producción y actividad
enzimática de P. ostreatus. Iones de magnesio (Mg), calcio (Ca), manganeso (Mn), zinc (Zn) y cobre (Cu)
son necesarios para el crecimiento, adicionalmente, actúan como cofactores en la producción y actividad
enzimática, el fósforo (P), el potasio (K) y el Mg también son fundamentales para promover su desarrollo
[Ferreira da Silva et al., 2019]. Asociado a la actividad LiP, los iones de hierro (Fe), Mn, Cu y P
favorecen la producción de radicales libres que promueven su producción, los iones de Cu aumentan la
actividad proteasa que le confiere estabilidad enzimática y, los iones de Mn y Ca aumentan la actividad
celulolítica [Ferreira da Silva et al., 2019]. Entre tanto, los niveles de transcripción génica de todas las
lacasas aumentan en presencia de iones de Cu y Mn [Zhuo et al.,2017]. El ABTS es un mediador redox,
es decir, un portador y movilizador de electrones entre los sustratos y las enzimas, de este modo los
electrones son capaces de llegar al sitio activo de las enzimas promoviendo la oxidación de los compuestos
recalcitrantes como el PEBD Oxo y la BLC [Gómez -Méndez et al.,2018; Moreno-Bayona.,2019].
6.5 Fermentación sólida como tecnología de transformación
Una de las características fundamentales de un cultivo en sólido, es la aparente ausencia de agua libre y la
implementación de BLC [Yoon et al., 2014]. Además, es posible estimular la actividad enzimática de
HPB y específicamente de P. ostreatus, adicionando un cosustrato al medio de tal forma que el
28
microorganismo pueda obtener la energía suficiente para su desarrollo, mediante la degradación de la
BLC y para la posterior producción de enzimas especializadas en escindir la estructura alifática del PEBD
Oxo [da Luz et al., 2014; da Luz et al., 2013; Moreno-Bayona et al., 2019]. Los procesos de co-
tratamiento son una ventaja de las fermentaciones sólidas, pues reduce tiempo y costos de operación, así
como permite explotar de manera sostenible los recursos [Suwanno et al., 2019]. Un ejemplo de co-
tratamiento es la biotransformación de BLC y de PEBD Oxo [Moreno-Bayona et al., 2019; da Luz et
al., 2013; Gómez-Méndez et al., 2019]. En los sistemas de fermentación en sólido es necesario tener
en cuenta factores que pueden afectar la biotransformación de los residuos como son:
6.5.1 Luz
La luz puede regular genes y extender ciertas vías de regulación que involucran el desarrollo y viabilidad
celular en fermentaciones sólidas. La presencia de luz en especies de Pleurotus estimula la liberación de
fenol oxidasas que oxidan fenoles y forma melanoides [Bellettini et al., 2016] y la producción de enzimas
extracelulares que están involucradas en la degradación de compuestos recalcitrantes [da Luz et al.,
2014].
6.5.2 Aireación
Debido a que muchas de las enzimas implicadas en procesos de degradación de contaminantes son de
tipo oxidativas, la disponibilidad del aire es fundamental [Wang et al., 2012], el flujo de aire además de
incrementar la actividad enzimática permite controlar el calor que se libera de la actividad metabólica,
disminuir la humedad del medio y ajustar la liberación de algunos metabolitos volátiles [Bellettini et al.,
2016].
6.5.3 Tamaño de partícula
En este tipo de cultivos las partículas pequeñas son ideales porque aumentan la superficie de contacto,
sin embargo, partículas demasiado pequeñas pueden comprimir el sustrato, interferir en la oxigenación y
aireación del sistema; en contraste, partículas grandes incrementan el espacio entre partículas y
promueven la transferencia de oxígeno [Bellettini et al., 2016], además obstaculizan la penetración al
interior de la biomasa celulósica, por parte del hongo [Wang et al., 2012].
6.5.4 Tipo de envase/biorreactor
Existen diversos tipos de fermentadores sólidos y su clasificación depende del tipo de sustrato que se
emplee, del microorganismo y de la escala. Los fermentadores sólidos rotatorios tipo tambor o con paletas
mezcladoras son utilizados para incrementar la homogeneidad de la mezcla y mejorar la transferencia de
oxígeno [Soccol et al., 2017]; una de las desventajas de este sistema es que es costoso en términos
29
energéticos. Por su parte, los fermentadores sólidos estáticos son utilizados tanto a escala de laboratorio
como a escala industrial. A escala de laboratorio, pueden ser frascos de vidrio dispuestos en forma de
columna o de bandeja y se emplea un sistema de aireación asistido [Soccol et al., 2017]. Los biorreactores
en forma de columna son sistemas cerrados que permiten evaluar el flujo de CO2 mediante respirometría
y mantener el sistema libre de contaminantes; el suministro de aire no es costoso y permite controlar
diversos factores del proceso. Sin embargo, uno de los problemas de este modelo es que el rendimiento
y eficacia del proceso en escala industrial cambia considerablemente frente a los procesos realizados a
escala de laboratorio (figura 5) [Soccol et al., 2017]. Los biorreactores tipo bandeja, se utilizan con
mayor frecuencia en la producción de cuerpos fructíferos de HPB, posee las mismas ventajas del sistema
vertical y, adicionalmente, permite fácilmente la transferencia de calor, aumenta la superficie de contacto
entre el oxígeno y la biomasa celular y, los resultados a escala de laboratorio pueden llevarse a escalas
superiores si el grosor de la matriz es equivalente a la implementada en el laboratorio [Khanahmadia et
al., 2018].
Figura 5 Tipos de biorreactores para fermentación en sólido.
(A) Biorreactor tipo Tray o bandeja, (B) Biorreactor tipo lecho empacado o cilíndrico [Fuente: Yoon et al., 2014].
En el presente trabajo se utilizaron las dos configuraciones geométricas con algunas modificaciones que se
presentarán en metodología.
6.6 Aprovechamiento de residuos sólidos
La biomasa generada en procesos agroindustriales y madereros se transforma y se utiliza como materia
prima para diversos productos, dicho proceso es considerado un sistema de aprovechamiento de residuos
sólidos. Este sistema, en conjunto con las políticas de economía circular, buscan promover la utilización
de residuos sólidos [MinAmbiente., 2018; CONPES., 2016] tales como, corteza de pino, hidrolizado
cervecero y residuos de papel [Moreno-Bayona et al., 2019]. Para ello, la materia prima pasa por un
30
sistema de conversión mediante tratamientos biológicos (biorrefinería) [Yamakawa et al., 2018]. En la
conversión biológica de residuos ricos en lignina se utilizan microorganismos como P. ostreatus [Suwanno
et al., 2019; Bellettini et al., 2016; Yoon et al., 2014; da Luz et al., 2014], porque tienen la capacidad
de degradar compuestos complejos como la lignina, celulosa y hemicelulosa en sus monómeros
constituyentes como para lignina alcohol p-cumarílico, alcohol coniferílico y alcohol sinápilico, estos a su
vez son degradados a compuestos aromáticos tales como vainillina y ácido ferúlico que actúan como
promotores de actividad enzimática de Lac [Zhuo et al., 2017]. Los compuestos aromáticos tienen un
gran contenido de carbono que al ser sometido a tratamientos térmicos se condensa y puede ser utilizado
para diversos fines [Moreno-Bayona et al., 2019; Gómez-Méndez et al., 2018].
El uso de BLC como sustrato para la biotransformación de PEBD Oxo, estimula el cometabolismo
fúngico, lo que incrementa la producción enzimática implicada en la biodegradación de compuestos
recalcitrantes. De esta manera, es posible no sólo darles valor agregado a los residuos agroindustriales
sino también, explotar al máximo los valores nutricionales de los residuos y la actividad fúngica, reducir
problemáticas ambientales y al mismo tiempo generar productos que pueden ser incorporados
nuevamente en la naturaleza [Suwanno et al., 2019; Moreno-Bayona et al., 2019; Gómez-Méndez et
al., 2018; Yamakawa et al., 2018].
6.7 Biochar como subproducto derivado de los sistemas de microcosmos
Biochar o biocarbón es un residuo orgánico rico en carbono, generado a partir de procesos térmicos
como la pirólisis. Su composición fisicoquímica es compleja y heterogénea ya que depende del residuo
que se utilice para producirlo, de la temperatura y de la duración de pirólisis; sin embargo, generalmente
está compuesto por una porción orgánica que tiene alto contenido de carbono condensado y una porción
inorgánica que contiene minerales como Ca, Mg y K, es poroso y tiene en su superficie algunos grupos
funcionales [Ok et al., 2016].
La producción de biochar mediante pirólisis involucra la descomposición termoquímica del material
orgánico a altas temperaturas en ausencia o bajas concentraciones de oxígeno [Weber et al.,2018]. Este
proceso empieza con el secado del material, luego, las partículas se calientan generando el
desprendimiento, en baja cantidad, de compuestos volátiles como dióxido de carbono (CO2), monóxido
de carbono (CO), metano (CH4) e hidrógeno (H2) y, algunos compuestos orgánicos condensables como
metanol (CH3OH) y ácido acético (CH3COOH); finalmente en la fase gaseosa, se llevan a cabo reacciones
de craqueo y polimerización. Así mismo, el proceso de pirólisis se clasifica de acuerdo con el tiempo en
que se lleve a cabo; el proceso lento consiste en tasas de calentamiento lentas a bajas temperaturas de este
31
proceso se genera carbón vegetal; por su parte el proceso rápido involucra tasas de calentamiento
acelerado a mediana temperatura favoreciendo la producción de aceites [Yang et al., 2017].
Son muchos los materiales que pueden ser utilizados para la producción de biochar, entre ellos: madera,
residuos de madera, lodos, lecho sanitario avícola, aguas residuales, cascarilla de arroz, borras de café,
entre otros [Siddiqui et al., 2016]. El uso de corteza de pino para la producción de biochar es una
alternativa que promueve la productividad, el reciclaje y la introducción de este producto en el sector
productivo [Barros et al., 2017]. Sin embargo, el biochar puede ser producido mezclando diversos
productos agroindustriales ricos en celulosa, hemicelulosa y lignina los cuáles presentan un alto contenido
de carbono y el rendimiento en su producción es mayor frente a otros sustratos no lignocelulósicos [Kua
et al., 2019; Barros et al., 2017]. Debido a la diversidad de componentes que reaccionan a diferentes
temperaturas, el proceso de pirólisis a 300˚ C para este tipo de residuos puede favorecer el rendimiento
en la producción de Biochar [Yang et al., 2017]. Así mismo, la temperatura de pirólisis en la que se da
mayores cambios de la materia prima está entre el rango de los 200˚ C - 400˚ C [Weber et al., 2018].
Pese a que las características de los biochar varían de acuerdo con su proceso de fabricación, los biochar
se caracterizan por poseer en su superficie grupos funcionales cargados negativamente lo que les confiere
la capacidad de intercambio iónico con cationes de Calcio (Ca+2), Magnesio (Mg +2), Potasio (K+), Sodio
(Na+) y Amonio (NH+4), por ende puede ser utilizado como enmendador de suelo [Weber et al ., 2018]
y como promotor en la producción de plántulas [Barros et al., 2017]. Así mismo, la porosidad del
material permite que pueda ser utilizado para captar moléculas de CO2 y de colorantes mediante
fenómenos de fisisorción y adsorción (Figura 6) [Kua et al., 2019; Weber et al ., 2018]; los canales
que se forman en el biochar por el proceso de pirólisis facilita la colonización de bacterias fosfato
solubilizadoras [Moreno-Bayona et al., 2019; Siddiqui et al., 2016], además la porosidad también
favorece que el material absorba agua y de esta manera también aumenta la retención de agua en el suelo
[MinAmbiente., 2018], la cual también se beneficia por la gran superficie de contacto entre el biochar
y el suelo [Cha et al., 2016].
32
Figura 6. Aplicaciones y propiedades benéficas de Biochar como enmendador de suelos agrícolas.
Fuente: Modificada de [Kavita et al., 2018].
7 Justificación y planteamiento del problema
Según la Comisión de la Unión Europea existe la preocupación de que se incremente la dispersión y el
desecho inapropiado del PEBD Oxo como consecuencia de su venta bajo la premisa de ser una
alternativa sostenible para disminuir su acumulación en los ecosistemas naturales [Comisión Europea.,
2018]. Sin embargo, los aditivos no disminuyen este problema, por el contrario, al fomentar la
fragmentación del plástico Oxo se incrementa la formación de microplásticos y estos a su vez, en la
mayoría de los casos, terminan en los ecosistemas marinos [Fauziah et al., 2015]. Además, hasta el
momento no se ha desarrollado un método que permita contener, controlar y acelerar las condiciones de
biodegradación de los residuos de PEBD Oxo, adicionalmente, no hay un método que genere la
degradación completa del material, es decir que sea reducido a CO2, H2O y a compuestos inorgánicos
simples sin generar un impacto negativo en el medio ambiente.
Existen investigaciones enfocadas a generar alternativas ecológicas que promueven la degradación de
PEBD Oxo [da Luz et al., 2013; Gómez-Méndez et al., 2018; da Luz et al., 2014; Moreno-Bayona
et al., 2019]. Dichas investigaciones han resaltado la necesidad de aplicar sobre el plástico otros
tratamientos que favorezcan la biodegradación de este material [Gómez-Méndez et al., 2018; Moreno-
33
Bayona et al., 2019]. Para tal fin, el pretratamiento de láminas de PEBD Oxo con descargas de plasma
de Oxígeno es una alternativa viable, ya que genera una serie de modificaciones estructurales, que
aumentan la hidrofilia del PEBD Oxo favoreciendo el crecimiento y la colonización de los
microorganismos, así como la biotransformación del material [Gómez-Méndez et al., 2018; Moreno-
Bayona et al., 2019]. Las modificaciones en la estructura del PEBD Oxo, luego de ser tratado con plasma
de oxígeno, permiten que las moléculas que componen el PEBD Oxo interactúen con el medio,
favoreciendo procesos de degradación mediante Fenton biológico [Krueger et al.,2017].
Por otra parte, los sistemas de microcosmos ofrecen la oportunidad de controlar factores que influyen
sobre la efectividad de los procesos de fermentación en sólido; anteriores investigaciones han
implementado como tecnología de biodegradación sistemas de microcosmos [da Luz et al.,2013;
Moreno-Bayona et al., 2019]; recientemente, en una previa investigación sobre degradación de PEBD
Oxo con P. ostreatus, se implementó un sistema de microcosmos vertical (SMV); los resultados del estudio
indicaron que, luego de la descarga con plasma de oxígeno, el PEBD Oxo mantiene la hidrofilia adquirida
después de la descarga de plasma mejorando la colonización de Pleurotus ostreatus sobre la superficie del
material y, por ende, mejorando la biotransformación. Sin embargo, el porcentaje de humedad en el
microcosmos estuvo entre el 70 % y el 80 %, lo que pudo generar una disminución en la transferencia de
oxígeno en el sistema [Moreno-Bayona et al., 2019]. La alta humedad del sistema está asociada al diseño
del microcosmos vertical en donde la superficie de contacto con el oxígeno es limitada, por ende, cambiar
la forma del microcosmos a tipo bandeja, es decir a forma horizontal (SMH) podría aumentar la superficie
de contacto entre el hongo, la BLC y el plástico; además, podría fomentar el flujo de aire, disminuir el
porcentaje de humedad y mejorar, aún más, la biotransformación [Yoon et al., 2014]. Estos sistemas de
microcosmos se presentan como una alternativa para la gestión de residuos sólidos y para la disminución
de la contaminación con PEBD Oxo.
La gestión de residuos sólidos es una de las estrategias más importantes para mitigar y evitar más daño
en los ecosistemas naturales [CONPES., 2016]. En este sentido, el tratamiento controlado de PEBD
Oxo usando como cosustrato BLC en sistemas de microcosmos es una alternativa para la gestión de
dichos residuos, la producción de biochar a partir de la BLC resultante del co-tratamiento de PEBD Oxo
y los BLC es una forma de aprovechamiento de residuos sólidos [CONPES., 2016; Weia et al.,2020].
Con relación a lo anterior, este trabajo se realizó bajo el marco del aprovechamiento de residuos sólidos,
la gestión de residuos sólidos recalcitrantes, mediante co-tratamiento de residuos en sistemas de
microcosmos, así como, la generación responsable de un producto con valor comercial.
34
8 Objetivo general
Evaluar la biotransformación de PEBD Oxo, pretratado con plasma de oxígeno y de biomasa
lignocelulósica (BLC), para la producción de biochar, a través de dos sistemas de microcosmos
(horizontal y vertical) empleando Pleurotus ostreatus.
8.1 Objetivos específicos
1. Evaluar los cambios del PEBD Oxo y de la BLC después de tratamiento con Pleurotus ostreatus en los
dos sistemas de microcosmos (SMV y SMH).
2. Producir y caracterizar el biochar generado a partir de pirolisis rápida de BLC residual, sin plástico,
derivada de los dos sistemas de microcosmos luego del tratamiento con P. ostreatus.
9 Metodología
9.1 Caracterización de PEBD Oxo
A partir de láminas de PEBD Oxo de (3.0 ± 0.1) cm de largo y (1.0 ± 0.1) cm de ancho, se determinaron
las siguientes características:
9.1.1 Hidrofobicidad
Se determinó mediante la técnica del ángulo de contacto estático (SCA, por sus siglas en inglés), el método
consiste en la relación entre el equilibrio del líquido (gota de agua) sobre la superficie estática (lámina de
plástico) y la tensión superficial (aire)[Jiang et al., 2018]; para ello, se limpiaron con cuidado las láminas
para asegurar que no tuvieran algún residuo que pueda interferir en la prueba y posteriormente se
adicionaron 3 gotas de agua desionizada cada una de 50 µl sobre la superficie de la lámina; finalmente,
con ayuda de una video-cámara JVC™ GZ-EX355 Everio se tomaron las fotografías de cada lámina y
se determinaron los valores del SCA (Figura 7) a partir de las siguientes ecuaciones [Gómez-Méndez
et al., 2018; Moreno-Bayona et al., 2019].
𝑅 =𝑏2 − ℎ2
2 × ℎ
(1)
∝= 𝑠𝑒𝑛−1𝑏
𝑅
(2)
35
Figura 7.Determinación del ángulo de contacto estático (SCA)
a: Radio de la gota, h: Altura de la gota, R: Diámetro de la gota, Fuente: [Sorrentino et al., 2007]
9.1.2 Rugosidad
Para la determinación de este parámetro se utilizó un microscopio de fuerza atómica (AFM por sus siglas
en inglés) marca Nanosurf ™ easyscan 2, en modo contacto. Los parámetros fueron: Size: 61.8 μm, Set
point: 20 nN; P-Gain: 1000; I-Gain: 100; D-Gain: 0, Se realizaron tres mediciones de rugosidad en
diferentes puntos de la misma lámina, se promediaron los valores y se determinó la desviación estándar.
[Gómez-Méndez et al., 2018; Moreno-Bayona et al., 2019].
9.2 Descarga de plasma luminiscente de O2 como pretratamiento
Una vez caracterizadas las láminas, éstas fueron sometidas a descargas de plasma de baja temperatura
(LTP, siglas en inglés) con gas O2 en una cámara cilíndrica tipo jarra de 18 cm de altura por 18 cm de
diámetro con electrodos de disco separados 5.6 cm entre sí y acoplados a una bomba turbo-molecular de
vacío (Pfeiffer Vacuum), Después de generar vacío en la cámara se realizó el tratamiento con plasma
empleando las condiciones reportadas por [Gómez-Méndez et al 2018; da Luz et al., 2014].
Sorrentino et al, (2007) realizaron un esquema del aparato de plasma que es semejante al aparato usado
en este trabajo (Figura 8).
36
Figura 8. Esquema de un aparato de plasma.
Fuente: [Sorrentino et al. 2007]
9.3 Reactivación de Pleurotus ostreatus y propagación en medio de cultivo
La cepa de Pleurotus ostreatus se obtuvo del banco de microorganismos del Laboratorio de Microbiología
Ambiental y de Suelos de la Pontificia Universidad Javeriana sede Bogotá. Posteriormente, La
reactivación de la cepa se realizó en agar salvado suplementado con cloranfenicol (salvado de trigo marca
Toning 175 gL-1, glucosa 10 gL-1, extracto de levadura 2 gL-1, peptona 5 gL-1, MgSO4 7H2O 0.05 gL-1,
MnSO4 H2O 0.076 gL-1, KH2PO4 0.1 gL-1, cloranfenicol 0.1 gL-1, agar-agar 20 gL-1) en cajas de Petri de
60 x 15mm incubándolo a (28 ± 2)ºC durante 10 días[Moreno-Bayona et al., 2019]. Finalmente, se
realizó la propagación del hongo en cuatro Erlenmeyer de 1000 ml cada uno con 300 ml de caldo salvado
suplementado con cloranfenicol, cada Erlenmeyer se inoculó con 5 discos de agar colonizado tomado de
la periferia de la caja de Petri, posteriormente se incubó a 25° C en agitación constante a 130 rpm, durante
10 días en un agitador rotatorio-incubadora New Brunswick Scientific ™ Innova [Gómez-Méndez et
al., 2018; Moreno-Bayona et al., 2019]. Después de la incubación el cultivo se centrifugó a 9790 x g, en
una centrifuga Sorvall™ RC 6 plus, durante 10 minutos a (4±1)º C, la biomasa se lavó cinco veces en
condiciones de esterilidad para eliminar restos del medio de cultivo, las primeras cuatro veces con
solución salina al 0.85 % (m/v) y la última con solución de glucosa 0.625 gL-1 y cloruro de amonio 0.050
gL-1) [Moreno-Bayona et al., 2019].
37
9.4 Biotransformación de láminas PEBD Oxo en sistema de microcosmos
Para evaluar la biodegradación de las láminas de PEBD Oxo pretratadas con plasma de O2 empleando a
P. ostreatus, se utilizaron sistemas de microcosmos usando frascos de vidrio de 0.75 L colocados en dos
posiciones durante todo el experimento: unos se dispusieron de forma vertical o de columna (SMV)
(Figura 9B) y otros se colocaron horizontales o en forma de bandeja (SMH) (Figura 9A). A cada uno
de los recipientes se le adicionó, previamente esterilizados durante 60 minutos a (121±1)º C y 15 lbs de
presión, 24.0 ± 0.1 g de corteza de pino, 27.0 ± 0.1 g de servilletas de papel picadas y 9.0 ± 0.1 g de
levadura hidrolizada de cerveza, pesándolos en una balanza analítica Ohaus®; luego, los microcosmos
sin inocular, con la mezcla de BLC se esterilizaron durante tres ciclos de 60 minutos cada uno , a 121° C
y 15 libras de presión [Gómez-Méndez et al., 2018; Moreno-Bayona et al., 2019]. Posteriormente,
bajo condiciones estériles, se adicionaron 4 láminas de PEBD Oxo pretratadas, 3 mL de solución de
nutrientes traza (glucosa 0.625 gL-1, KH2PO4 2 gL-1, NH4Cl 0.05 gL-1, MgSO4 0.5 gL-1, CaCl2 0.1 gL-1,
CuSO4 1.5 gL-1, ABTS 0.05 gL-1) y 3 g de biomasa húmeda peletizada de P. ostreatus, según la metodología
reportada por Gómez-Méndez [Gómez-Méndez et al., 2018] y Moreno-Bayona [Moreno-Bayona et
al., 2019]. Las láminas de PEBD Oxo, el inóculo fúngico y la BLC se mezclaron manualmente con baja
lenguas estériles, en condiciones de esterilidad con el fin de homogenizar todos los materiales y garantizar
que las láminas de PEBD Oxo quedaran inmersas en la BLC y en contacto con P. ostreatus.
Posteriormente, cada unidad experimental se selló con un tampón de caucho con tres puertos para:
inyección de aire, suministro de nutrientes y captura de CO2 empleando una trampa con una solución de
NaOH 0.4 N. La aireación se suministró con un motor de pecera Xilong® AP-005 (110V-60Hz) con un
flujo intermitente de 135 Lmin-1 el cual fue suministrado tres veces por semana durante 1 hora; finalmente
se adicionaron, cada 15 días, 3 ml de solución de nutrientes traza [Gómez-Méndez et al., 2018; Moreno-
Bayona et al., 2019].
Se determinó, para las láminas PEBD Oxo, la hidrofobicidad y la rugosidad antes del tratamiento con
plasma de Oxígeno y al iniciar el tratamiento biológico en los microcosmos a los días 0, 75, 107 y 135.
38
Figura 9.Sistemas de microcosmos.
(A)Sistema de microcosmos horizontal (SMH) y (B) Sistema de microcosmos vertical (SMV). La mezcla llenante en
ambos sistemas se compone de corteza de Pinus Caribaea, hidrolizado de levadura, servilletas de papel, biomasa
fúngica y láminas PEBD Oxo.
9.4.1 Variables de respuesta asociadas a la biotransformación de la BLC en los dos
sistemas de microcosmos
Con el fin de evidenciar la co-transformación de la BLC durante 135 días, se realizaron muestreos por
sacrificio al día 0, 75, 107 y 135. Para cada intervalo de muestreo se retiró la totalidad de las láminas de
PEBD Oxo y, a la BLC colonizada con P. ostreatus que se denominó Biomasa Lignocelulósica Residual
(BLC/R), se analizaron las siguientes variables de respuesta: actividad enzimática, Lac (EC. 1.10.3.2),
MnP (EC. 1.11.1.13), LiP (EC. 1.11.1.14), pH, humedad, contenido de carbono orgánico total (COT),
también, se analizó indirectamente la actividad metabólica del hongo por la producción de CO2. Así
mismo se determinó el grado de polimerización de la BLC después de 135 días de tratamiento, mediante
la técnica de fraccionamiento de carbono [Gondar et al., 2005].
9.4.1.1 Evaluación de parámetros enzimáticos
Para determinar las actividades enzimáticas en los dos sistemas de microcosmos, se realizó una extracción
sólido-líquido adicionando 5.00 ± 0.01 g de la BLC sin plástico a un tubo Falcón™ de 50 mL con 25 mL
de agua destilada. La extracción se mantuvo en agitación constante durante 25 minutos a 200 ± 1) rpm
en un Shaker orbital Scilogex ® SK-O330, posteriormente, la mezcla se filtró por gravedad en un filtro
de papel Whatman No 3 y se centrifugó a 8000 x g por 15 minutos para obtener un extracto crudo con
el cual se evaluaron las actividades enzimáticas [Moreno-Bayona et al., 2019].
39
9.4.1.1.1 Actividad Lac (EC. 1.10.3.2)
La actividad Lac se determinó usando el método de Tinoco (2001), para ello se mezcló en celdas de
cuarzo, 800 µl de muestra, 100 µl de buffer acetato 600 mM a pH 4.5 (ácido acético 1.300 % (v/v) y 5.226
% (p/v)) y 100 µl de 2,2′-azino-di-(3-ethylbenzthiazoline ácido sulfónico (ABTS) 5 mM con ayuda de una
micropipeta se mezcló, evitando la producción de burbujas, y se leyó durante tres minutos a una longitud
de onda de 436 nm en un espectrofotómetro Thermo Spectronic Genesys ™ 10 V, empleando como
blanco agua destilada. Las unidades enzimáticas se calcularon a partir de la ecuación (3) y la unidad
enzimática (U) se definió como la cantidad de enzima capaz de oxidar 1 µmol de ABTS por minuto
[Moreno-Bayona et al., 2019].
𝑈𝐿𝑎𝑐
𝐿= (
∆ 𝐴𝑏𝑠 × 106
3 × 29300 × 0.8) × 𝐹𝑑
(3)
9.4.1.1.2 Actividad MnP (EC. 1.11.1.13)
La actividad MnP se evaluó mezclando en celdas de cuarzo: 450 µl de buffer acetato 100 mM (ácido
acético 0.217 %(v/v) y acetato de sodio 0.871 % (p/v)) a pH 5.0, 500 µl de 2.6 dimetoxifenol (DMP) al
10 mM preparado en buffer acetato 100 mM, 50 µl de sulfato de manganeso 0.4 mM y 30 µl de peróxido
de hidrógeno; el blanco fue la mezcla de 450 µl de buffer de acetato 100 mM, 500 µl de DMP 10 mM,
50 µl de sulfato de manganeso 0.4 mM y 30 µl de peróxido de hidrógeno. Inmediatamente después de
mezclar suavemente se leyó la absorbancia a 468 nm durante tres minutos en un espectrofotómetro
Thermo Spectronic Genesys™ 10 V. Las unidades MnP se calcularon a partir de la siguiente ecuación
(4) y se definió como una unidad de actividad enzimática a aquella cantidad de enzima capaz de oxidar 1
µmol de 2,6 dimetoxifenol por minuto [Moreno-Bayona et al., 2019].
𝑈𝑀𝑛𝑃
𝐿= (
∆ 𝐴𝑏𝑠 × 106
3 × 49600 × 0.45) × 𝐹𝑑
(4)
9.4.1.1.3 Actividad LiP (EC. 1.11.1.14)
Para determinar la actividad enzimática LiP, se tomaron 750 µl de la muestra filtrada, posteriormente, se
mezcló en celdas de cuarzo con 200 µl de buffer tartrato de sodio 10 mM a pH 4.5 (ácido tartárico 0.803
% (p/v) y tartrato de sodio 4.464 % (p/v)) en proporciones iguales, 40 µl de alcohol velatrilico 10 mM y
50 µl de peróxido de hidrógeno recién preparado, se mezclaron con rapidez en la celda evitando la
40
formación de burbujas y se leyó a 310 nm por tres minutos en un espectrofotómetro Thermo Spectronic
Genesys™ 10 V ; como blanco se mezcló 960 µl de buffer tartrato y 40 µl de alcohol velatrilico. Las
diluciones se realizaron usando como diluyente buffer tartrato. Las unidades LiP se determinaron
mediante la siguiente formula (5) y se definió como una unidad enzimática a la cantidad de enzima capaz
de oxidar 1 µmol de alcohol velatrilico por minuto [Moreno-Bayona et al., 2019].
𝑈𝐿𝑖𝑃
𝐿= (
∆𝐴𝑏𝑠 × [𝑚𝑀𝑜𝑙] × 𝑐𝑚 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑒𝑙𝑑𝑎 × 1 𝑐𝑚 × 1 𝑚𝐿
0.71𝐿 × 165) × 𝐹𝑑
(5)
9.4.2 Evaluación de parámetros fisicoquímicos
9.4.2.1 Humedad
Se determinó pesando 2.0 ± 0.1 g de BLC sin plástico, en una termobalanza marca Precisa ™ usando el
método humedad, el cual consiste en la disminución del peso inicial de la muestra a (120 ±1)º C hasta
que el peso de la muestra fuera constante, tal valor se dividió por el peso inicial y se multiplicó por cien
para dar un valor porcentual (ecuación 6). La determinación se realizó por triplicado en cada intervalo de
muestreo [Gómez-Méndez et al., 2018; Moreno-Bayona et al., 2019; NTC 5167].
% 𝐻𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑: (𝑀ℎ − 𝑀𝑠
𝑀𝑠) × 100%
(6)
Mh: Material húmedo, Ms: Material Seco
9.4.2.2 pH
Se adicionaron 5.0 ± 0.1 g de muestra en un tubo Falcón™ de 50 mL con 25 mL de agua destilada,
posteriormente se dejó en agitación constante durante 25 minutos a (200 ± 1) rpm en un Shaker orbital
Scilogex ® SK-O330, luego la muestra se filtró por gravedad usando un filtro Whatman No.3, finalmente
el pH de la muestra filtrada se midió con un pHmetro Okaton ™; este procedimiento se realizó por
triplicado en cada intervalo de muestreo [Moreno-Bayona et al., 2019; CTS,5167].
9.4.2.3 Determinación de carbono orgánico total (COT)
En una bolsa de papel Kraft se depositaron 5.0 ± 0.1 g de muestra, la cual se secó durante 12 horas a (75
± 1)° C; luego 1.0 ± 0.1 g de la muestra secada fue sometida a calcinación a (400 ± 1)° C durante tres
horas en una mufla Labtech ™. Finalmente, se pesaron los residuos de la calcinación. El porcentaje de
41
COT se calculó usando la fórmula presentada a continuación (7), este procedimiento se realizó por
triplicado en cada intervalo de muestreo [Moreno-Bayona et al., 2019]:
% 𝐶. 𝑂. 𝑇 = (𝐴 − 𝐵
1,724) × 100%
(7)
A= peso de muestra antes de la calcinación, B= peso de muestra después de la calcinación
9.4.2.4 Determinación de dióxido de carbono (CO2)
Para determinar la cantidad de CO2 que se produce en los sistemas de microcosmos, se utilizó la técnica
de titulación de Jenkinson & Powlson (1976), siguiendo la metodología desarrollada por Moreno-Bayona
[Moreno-Bayona et al., 2019], en la cual se usaron frascos trampa de 30 mL con 25 mL de hidróxido
de sodio (NaOH) a una concentración de 0.4 N; cada frasco conectado a un microcosmos capturó el
CO2 derivado de la actividad de biodegradación llevada a cabo por P. ostreatus. Para cuantificar la cantidad
de gas que se produjo, se adicionaron tres gotas de fenolftaleína 0.5 % (m/v) al NaOH contenido en la
trampa, posteriormente la solución se tituló con ácido clorhídrico (HCl) 0.3 N hasta que el contenido de
la trampa se tornó completamente incolora, dicho procedimiento se realizó cada ocho días [Moreno-
Bayona et al., 2019]. El método indica que por cada dos moles gastadas de NaOH se produce un mol
de CO2. Tal relación se evidenció siguiendo las siguientes fórmulas (8 y 9):
𝐴 = 0.3 𝑁 ×1
1000× 𝐵 ×
1𝑚𝑜𝑙 𝐻𝐶𝑙
1 𝑒𝑞. 𝑔 𝐻𝐶𝑙×
36.46 𝑔 𝐻𝐶𝑙
1𝑚𝑜𝑙 𝐻𝐶𝑙
(8)
𝐶 = (0.4 𝑁 − 𝐴) ×44
(42 × 2)× 100
(9)
A: Gramos de HCl equivalentes a hidróxido titulado, B: Volumen de HCl 0.3N gastado, C: mg de CO2
producido
9.4.2.5 Fraccionamiento de carbono
El grado de madurez y polimerización de la BLC/R sin PEBD Oxo, se determinó a través de la técnica
de fraccionamiento de carbono; dicha técnica consta de tres protocolos de extracción con soluciones
ácidas y alcalinas [Gondar et al.,2005]. Una vez realizadas las extracciones se realizó un barrido espectral
42
de los extractos obtenidos en las longitudes de onda que van desde 200 nm hasta 700 nm, utilizando un
espectrofotómetro Thermo Spectronic Genesys™ 10 V. Finalmente, la relación entra la absorbancia de
los ácidos húmicos (460nm) y los ácidos fúlvicos (665nm) se conoce como relación o índice E4 y E6,
dicho índice se relaciona con el grado de condensación de carbono aromático [Zalba et al., 2016;
Gondar et al.,2005]. Para determinar dicho índice se identificaron las absorbancias a las longitudes de
onda 460 nm y 665 nm, posteriormente se realizó la relación entre las absorbancias obtenidas a dichas
longitudes de onda, como lo muestra la siguiente ecuación (10).
𝐴𝑏𝑠 460𝑛𝑚
𝐴𝑏𝑠 665 𝑛𝑚
(10)
9.4.2.6 Fraccionamiento de sustancias poliméricas
Para el fraccionamiento de sustancias poliméricas presentes en BLC/R fue necesario hacer una extracción
alcalina, para esto se tomaron (4.0 ± 0.1) g de la BLC/R y se depositaron en un tubo Falcon de 50 mL,
posteriormente se adicionaron 50 mL de hidróxido de sodio 0.5 M y se dejó en agitación constante
durante 24 horas a (200 ± 1) rpm en un Shaker orbital Scilogex ® SK-O330, luego la muestra se filtró
por gravedad usando un filtro Whatman No. 3; finalmente se realizó la curva espectral entre 200 y 700
nm utilizando un espectrofotómetro Thermo Spectronic Genesys™ 10 V [Gondar et al.,2005].
9.4.2.7 Fraccionamiento de sustancias fúlvicas
Para detectar las sustancias fúlvicas en la BLC/R, se tomaron 5 mL del filtrado de la extracción alcalina
y se mezclaron con 5 mL de HCL 6M y se dejaron en agitación constante por 24 horas a (120 ± 1) rpm
en un Shaker orbital Scilogex ® SK-O330 a 19°C; luego la muestra se centrifugó durante 10 minutos a
(5000 ± 1) rpm, posteriormente el sobrenadante se separó del sedimento y, a partir del sobrenadante se
realizó la curva espectral entre 200 y 700 nm utilizando un espectrofotómetro Thermo Spectronic
Genesys™ 10 V[Gondar et al.,2005].
9.4.2.8 Fraccionamiento de sustancias húmicas
Las sustancias con menos grado de polimerización se concentraron en el sedimento resultante de la
extracción con HCL 6M, dicho sedimento se suspendió en 25 mL de NaOH 0.1 M y 25 mL KCl 0.3 M,
posteriormente se dejó en agitación constante por 24 horas a (120 ± 1) rpm en un Shaker orbital Scilogex
® SK-O330 a (19 ± 1) ° C. Luego, se realizó la curva espectral entre 200 y 700 nm con la muestra
suspendida utilizando un espectrofotómetro Thermo Spectronic Genesys™ 10 V [Gondar et al.,2005].
43
9.5 Producción y caracterización de biochar
Después de 135 días de tratamiento se mezcló todo el bioproducto es decir la BLC/R, sin incluir PEBD
Oxo transformado. Los residuos provenientes de los microcosmos se usaron para la producción de
biochar, para ello la BLC/R se dejó secando durante 12 horas a (70 ± 1)º C en una horno marca HACEB;
una vez seco, luego se tamizó para obtener partículas de 5 mm aproximadamente usando un tamiz No.
12 y 20 (Figura 10); tanto la BLC/R como el biochar se caracterizaron tomando como variables de
respuesta pH, porcentaje de humedad, carbono fijo, carbono volátil, cenizas, rendimiento biochar y
rendimiento de carbono fijo [Yang et al.,2017].
Figura 10. Preparación de BLC/R para producción de biochar.
(A) BLC/R antes del presecado, (B) BLC/R secada y en tamizaje, (B) BLC/R secada y tamizada.
9.5.1 Producción de biochar
La producción de biochar se realizó mediante pirólisis lenta. Para ello se tomaron (62.75 ± 0.01) g de
material crudo, se depositaron en bandejas de aluminio de 100 g y se sometieron a condiciones de
anaerobiosis haciendo uso de campanas de Anaerogen™ durante 12 horas a (30 ± 1) ° C. Cumplido este
tiempo, el proceso de pirólisis se llevó a cabo en una mufla marca Labtech™ a (300 ± 1) º C por una
hora. Una vez la muestra se enfrió, se pesó y se realizó la caracterización.
9.5.1.1 pH y porcentaje de humedad
El pH y el porcentaje de humedad se determinaron siguiendo la metodología reportada en la Norma
Técnica Colombiana 5167 del 2011 y consignada en la publicación de Pedroza-Rodríguez et al.
[Rodríguez-Pedroza et al.,2007] y Moreno-Bayona et al., [Moreno-Bayona et al 2019].
9.5.1.2 Determinación de la fracción o carbono volátiles (FV/CV)
La determinación de la fracción volátil (FV) o carbono volátil (CV) se realizó por el método gravimétrico,
pesando un crisol vacío, luego se adicionó (4.0 ± 0.1) g de muestra previamente seca a (152 ± 1)º C en la
termobalanza Precisa ™ hasta obtener un peso constante; luego se introdujo el material en la mufla
(Labtech ™) ajustada a una temperatura de (950 ± 1)º C manteniendo esta temperatura durante cinco
minutos, finalmente se dejó enfriar la muestra y se determinó el peso final. Los resultados se determinaron
44
mediante la fórmula presentada a continuación (11). La técnica se realizó por triplicado [Moreno-
Bayona et al., 2019].
𝐹𝑉 (%) = (𝐵 − 𝐶
𝐵) × 100%
(11)
FV (%): el porcentaje de la fracción o carbono volátiles. B: el peso de la muestra seca inicial (155 ± 1)º
C y C: peso de la muestra después de secar muestra a (950 ± 1)º C.
9.5.1.3 Determinación del contenido de cenizas
La determinación del porcentaje de cenizas se realizó por el método gravimétrico, pesando un crisol vacío
y adicionándole (1.0 ± 0.1) g de una muestra proveniente de la determinación de CV, luego se ingresó en
la mufla (Labtech ™) ajustada a una temperatura de (650 ± 1) º C durante cuatro horas. Una vez
terminado el proceso y la muestra fría, se pesó y se determinó el contenido de cenizas mediante la
siguiente ecuación (12) [Moreno-Bayona et al., 2019].
𝐶𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 (%) = (𝐷
𝐵) × 100%
(12)
D: el peso del residuo después de calcinar (650 ± 1) º C por 4 h y B es: el peso de muestra seca de la
fracción volátil (152 ± 1) º C.
9.5.1.4 Determinación de carbono fijo
Para determinar el carbono fijo se realizó la sumatoria del porcentaje de la fracción volátil más el
porcentaje de las cenizas, así (13) [Moreno-Bayona et al., 2019]:
100 − (𝑓𝑉 + % 𝐶)
(13)
9.5.1.5 Determinación de rendimiento del biochar y rendimiento de carbono fijo
Para determinar la cantidad de biochar obtenido a partir del material crudo bajo las condiciones de
producción que se evaluaron, se empleó la ecuación presentada a continuación (14), para calcular el
rendimiento en carbono fijo [Yang et al.,2017].
45
𝛾𝐵𝑖𝑜𝑐ℎ𝑎𝑟(%) = (𝑀2
𝑀1) × 100%
(14)
Ybiochar: rendimiento Biochar, M2: peso seco del Biochar al finalizar el tratamiento térmico, M1 peso inicial
del material crudo y seco.
𝛾𝐶𝐹 (%) = 𝛾𝐵𝑖𝑜𝑐ℎ𝑎𝑟 × 𝐶𝐹
100 − % 𝐶𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 𝑒𝑛 𝑚𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑙 𝑐𝑟𝑢𝑑𝑜
(15)
YCF: rendimiento en carbono fijo, Ybiochar:: rendimiento Biochar. CF % carbono fijo, % cenizas:
porcentaje de cenizas la mezcla llenante.
9.6 Análisis estadístico
Los resultados de biotransformación de las láminas de PEBD Oxo se evaluaron por medio de la prueba
de T student (nivel de significancia= 0.05), para las variables de respuesta hidrofobicidad y rugosidad.
Los resultados de la producción de biochar, producción de enzimas, CO2 y de características de la
biomasa lignocelulósica se les realizaron un análisis de varianza (ANOVA) para determinar las diferencias
entre tratamientos complementado con una prueba de comparaciones múltiples post-hoc (Prueba de
Tukey). Adicionalmente se realizó una prueba de homogeneidad de varianzas (Test de Levenne).
10 Resultados y Discusión
Las fermentaciones en sólido permiten desarrollar estrategias biológicas para el aprovechamiento de
residuos sólidos, específicamente de PEBD Oxo en co-tratamiento con BLC, debido a que se pueden
dar, de manera secuencial, procesos de biodegradación de diferentes compuestos que difieren tanto en
su estructura química como en su complejidad. Se pueden llevar a cabo en sistemas de microcosmos, los
cuales se pueden disponer de forma horizontal, simulando la producción de hongos comestibles tipo
holandés o tipo bandeja (Tray bioreactors). También, pueden disponerse de forma vertical semejante a
los reactores de lecho empacado (Packed bed reactors) y al sistema de producción de champiñones
francés. [Yoon et al., 2014; Bellettini et al, 2018; Khanahmandi et al, 2018; Gutarra et al, 2005; Soccol
et al, 2016]. En este trabajo se evaluó la biodegradación de láminas de PEBD Oxo y de BLC en SMH y
SMV con P. ostreatus.
46
10.1 Variables de respuesta asociadas a la biodegradación de PEBD Oxo
10.1.1 Hidrofobicidad
Durante 135 días de tratamiento con P. ostreatus se determinó, en SMH y SMV, la hidrofobicidad de las
láminas de PEBD Oxo por medio de SCA. Antes de ser sometidas al tratamiento con plasma de O2, las
láminas de PEBD Oxo presentaron un SCA de (88.3 ± 2.9) °. Al finalizar el tratamiento (Día 135) se
evidenciaron cambios en la hidrofobicidad de las láminas de PEBD Oxo, tanto en el SMH como en el
SMV. Para el SMH, el SCA fue de (32.11 ± 8.38) °, presentando una disminución del 63.63 %
(p=0.00824) con respecto al SCA del PEBD Oxo prístino. Por su parte, el valor del SCA en el SMV fue
de (22.56 ± 2.89) °, presentó una disminución significativa del 74.45 % (p=0.00219). (Figura 11).
Con respecto a los resultados individuales de cada sistema de microcosmos, el ángulo de contacto final
en el SMH (32.11 ± 8.38) ° fue mayor frente al SMV (22.56 ± 2.89) °, pese a esto, los valores en el SMH
entre cada intervalo de muestreo no cambiaron drásticamente y la desviación estándar en todos los casos
fue baja frente al comportamiento observado en SMV, donde, la desviación estándar es mayor y el ángulo
durante 107 días se mantiene alrededor de los 30°. Dichas desviaciones se deben a que, en el SMV el
contacto entre el microorganismo y el plástico es limitado comparado con el SMH, donde la
homogeneidad de la mezcla, así como la superficie de contacto, aumenta como consecuencia del libre
crecimiento radial de P. ostreatus, que se extiende a lo ancho del SMH.
Figura 11. Determinación de SCA de láminas PEBD Oxo.
(A) SCA de láminas de PEBD Oxo en el SMH y SMV en cada punto de muestreo. A los 135 días las láminas
presentaron un SCA de (32,12 ± 11,86) ° y (22.56 ± 2.89) ° respectivamente, (B) ángulo de contacto de lámina de
PEBD Oxo Prístino (90.0±0,01) °, (C) Ángulo de contacto de lámina de PEBD Oxo después de 135 días de
tratamiento en el SMH (21.1±2.43) °. Las barras corresponden a la desviación estándar del promedio de tres réplicas
47
de SCA para cada intervalo de muestreo. Las letras representan los subgrupos homogéneos de Tukey, donde a
indica el mejor resultado.
La disminución inicial (día 0) de la hidrofobicidad de las láminas de PEBD Oxo en ambos sistemas de
microcosmos se debió al tratamiento con plasma de O2, (datos no determinados en este estudio, pero
realizados por Gómez-Méndez et al., 2018), el cual actúa sobre el PEBD Oxo incorporando grupos
funcionales de oxígeno polares e hidrofílicos que favorecen la transformación del material hidrofóbico a
hidrofílico [Weia et al., 2020; Shikova et al., 2019; Gómez-Méndez et al., 2018]. El bombardeo con
iones y fotones de rayos ultravioleta al vacío, generan en conjunto reacciones similares a la fotólisis
catalizando el rompimiento de los enlaces -C-C- y/o -C-O-, en consecuencia, la degradación de las
láminas de PEBD Oxo también se lleva a cabo mediante procesos de fotooxidación catalizados por la
luz UV presente en el plasma de O2[Holc et al., 2018; Shikova et al., 2019; Weia et al., 2020]. Este
tratamiento ha resultado particularmente efectivo sobre las láminas de PEBD Oxo ya que los aditivos
prooxidantes favorecen la formación de poros en la estructura del plástico, esto facilita la penetración del
plasma a través de la estructura generando un material super hidrofílico [Weia et al., 2020].
Sin embargo, sin el tratamiento biológico con P. ostreatus las láminas podrían recuperar la hidrofobicidad.
Se ha reportado el retorno a la hidrofobia de algunos materiales poliméricos después de 10 días de haber
expuesto el polímero al plasma de O2, [Weia et al., 2020]. En este trabajo, después de someter las láminas
al plasma de O2 durante 6 minutos y luego a 135 días con el hongo en el SMH, el ángulo no retornó a su
valor inicial, esto se debe a un proceso sinérgico entre la fotodegradación y la biodegradación derivada
de la actividad enzimática de P. ostreatus. P. ostreatus coloniza y forma una red de hifas sobre el PEBD Oxo
impidiendo que retorne a su condición hidrófoba inicial. Los grupos carbonilos e hidroxilos que se
forman sobre la superficie del material, luego de la exposición con plasma de O2, cambian la carga
superficial del PEBD Oxo favoreciendo la interacción entre los cationes de la pared fúngica y los aniones
de la superficie del PEBD Oxo, por ende, facilita la adherencia de P. ostreatus a la lámina de PEBD Oxo
[Gómez-Méndez et al.,2018]. Adicionalmente, luego de la adherencia, P. ostreatus secreta oligómeros y
polisacáridos que se adhieren de manera covalente a la superficie del material, esto es relevante ya que
estas sustancias funcionan como transportadores de las enzimas producidas por P. ostreatus hacia el PEBD
Oxo. Además, el ataque enzimático de las polifenol oxidasas (C.E. 1.11.1.7) y peroxidasas (C.E. 1.14.18.1)
generan radicales libres sobre la superficie del PEBD Oxo, dichos radicales son vulnerables al ataque
oxidativo de las peroxidasas, así como del peróxido de hidrógeno mediante Fenton biológico [Gómez-
Méndez et al.,2018; da luz et al.,2014; Krueger et al.,2017]. El ataque oxidativo generado por la
actividad enzimática y por el peróxido de hidrógeno, rompe los enlaces del PEBD Oxo, como resultado
el material mantiene la hidrofilia adquirida luego de la descarga de plasma. Debido a que la biodegradación
del material responde a reacciones oxidativas, es fundamental que exista una superficie de contacto amplia
48
entre el oxígeno disponible y el hongo, el oxígeno no sólo está implicado en el proceso de respiración de
P. ostreatus, también, está implicado en la oxidación de los sustratos ya que este proceso es una reacción
acoplada a la reducción de O2 [Rivera-Hoyos et al.,2013]. En el SMH la superficie de contacto entre el
oxígeno, el microorganismo y los sustratos es mayor, por esta razón el valor de SCA es menor y se
mantiene durante 107 días en comparación con los resultados del SCA del SMV. Pese a esto, al final del
tratamiento (día135) el SCA en el SHV es menor. Estos resultados indican que en ambos sistemas de
microcosmos hay una sinergia entre el plasma y el crecimiento fúngico, además indican que la geometría
del sistema incide en la homogeneidad de la mezcla y por ende en la homogeneidad de los resultados, en
este sentido el SMV es menos homogéneo y por ende presenta tantas desviaciones, sin embargo, los
resultados de esta variable entre ambos sistemas son similares.
10.1.2 Rugosidad
La rugosidad inicial de las láminas de PEBD Oxo prístinas de ambos sistemas de microcosmos fue de
10,1 ± 1 nm. Después de 135 días de tratamiento con P. ostreatus en el SMH la rugosidad de las láminas
de PEBD Oxo fue 10.29 ± 0.73 nm, este resultado no es significativamente diferente con respecto al
valor inicial (p=0.3428), el porcentaje de cambio tan sólo fue de 1.75 %. En contraste, la rugosidad final
de las láminas en el SMV fue significativamente diferente frente al valor inicial presentando un p= 0.02534
con 13.62 ± 0.931 nm, al final del tratamiento en este sistema, las láminas de PEBD Oxo cambiaron en
un 26% con respecto al valor inicial (Figura 12).
Figura 12. Rugosidad de las láminas de PEBD Oxo mediante AFM.
Determinación de la rugosidad en láminas de PEBD Oxo depositadas en el SMH y SMV durante 135 días con un
valor final de 10.29 ± 0.74 nm y 12.14 ± 1.84 nm respectivamente. Las barras corresponden a la desviación estándar
del promedio de tres réplicas para cada intervalo de muestreo. Las letras representan los subgrupos homogéneos de
Tukey, donde a indica el mejor resultado.
49
Después de la exposición del PEBD Oxo a la descarga de plasma de O2 y del tratamiento biológico en
los sistemas de microcosmos se evidencia, a través del AFM, la formación de hendiduras y fisuras en la
superficie del plástico (Figura 13). Sin embargo, estas deformaciones no se distribuyen uniformemente
sobre la superficie de las láminas [Weia et al.,2020], tal vez es la razón por la cual, en el análisis final de
la rugosidad en SMH no se evidencian diferencias significativas con respecto a la rugosidad inicial. En
contraste, el resultado final de la rugosidad de las láminas de PEBD Oxo en el SMV (13.62 ± 0.93) nm
concuerda con los resultados obtenidos en otras investigaciones donde la rugosidad después del plasma
obtuvo valores similares [Holc et al., 2018; Weia et al.,2020]. Además, los aditivos prooxidantes del
PEBD Oxo también son un factor que incide sobre la rugosidad debido a que el ataque de los fotones
de la luz UV catalizan la reacción de los aditivos prooxidantes; esta reacción, facilita la eliminación de
componentes amorfos débilmente ligados en la superficie del plástico; en consecuencia, se generan
microporos y microfisuras que, sumado a la ablación, aumentan la rugosidad [Gómez-Méndez et al.,
2018; Holc et al., 2018; Kregar et al.,2011].
La formación de huecos y fisuras en el material es relevante para la adecuada adherencia, colonización y
posterior actividad enzimática por parte de P. ostreatus. En la naturaleza, P. ostreatus utiliza las hifas para
penetrar la pared celular de los sustratos a través de poros y huecos, a continuación, expande los orificios
por los que entra liberando enzimas ligninasas y celulasas hasta que el sustrato es degradado [Schwarze
et al., 2007]. El mecanismo que utiliza P. ostreatus para degradar en la naturaleza compuestos recalcitrantes
como la lignina, puede llevarse a cabo in-vitro en compuestos como el PEBD Oxo; la deformación del
PEBD Oxo después del plasma favorece su degradación. En este trabajo, la rugosidad final de las láminas
de PEBD Oxo en ambos sistemas de microcosmos no presentó diferencias significativas (p=0.285), en
este caso la rugosidad no depende de la geometría del microcosmos.
Figura 13. AFM de láminas de PEBD Oxo SMH y SMV.
(A) Lámina PEBD Oxo prístina (10,1 ± 1) nm, (B) Lámina perteneciente al SMV día 107, la flecha señala un microporo generado por la reacción del aditivo prooxidante del PEBD Oxo, catalizada por el plasma de O2, (C) Lámina perteneciente al SMV día 107 el corchete señala hifas de P. ostreatus. También se evidenció colonización de P. ostreatus en láminas correspondientes al SMV.
50
10.2 Variables de respuesta asociadas a la biotransformación de BLC
10.2.1 Evaluación de parámetros fisicoquímicos y enzimáticos
La biodegradación del PEBD Oxo se llevó a cabo mediante un modelo de co-tratamiento, donde además
de biodegradar el PEBD Oxo, también se degradó la BLC. Asociado a ese proceso, se llevaron a cabo
una serie de evaluaciones sobre la BLC con el fin de evidenciar la biotransformación asociada a la
actividad metabólica de P. ostreatus tanto en SMH como en SMV durante 135 días, haciendo muestreo
por sacrificio a los 0, 75, 107 y 135 días (Figura 14).
10.2.1.1 Humedad
El porcentaje de humedad del sistema puede afectar la actividad enzimática de P. ostreatus, un porcentaje
de humedad mayor al 80 % puede generar colmatación del medio e interferir en la transferencia de
oxígeno a la célula y en la oxidación de los sustratos. Para evitar que la humedad interfiera en la
degradación de PEBD Oxo y de BLC se debe controlar la humedad, para ello, se determinó el porcentaje
de humedad de ambos microcosmos durante los 135 días del experimento.
Al iniciar el tratamiento, los porcentajes de humedad fueron ligeramente bajos 68.1 ± 3.3 % y 69.3 ± 1.1
%, para SMH y SMV respectivamente (Figura 14 A), si se compara con los valores óptimos reportados
por la literatura para cultivos sólidos con hongos ligninolíticos (70- 80 %) [Wan and Li, 2012; Yoon et
al., 2014]. Se ha reportado que valores de humedad entre el 60 - 70% favorecen la producción y secreción
de enzimas tipo celulasas, hemicelulosas y ligninasas, entre otras; también, ayuda a que se mantengan
condiciones aeróbicas y a que se lleve a cabo el proceso de deslignificación de BLC ya que este es un
proceso oxidativo [Wan and Li, 2012; Bellettini et al., 2018; Khanahmandi et al, 2018].Esto es
relevante ya que, valores muy altos o bajos de humedad podrían causar crecimiento fúngico débil y
procesos de fermentación ineficientes [Schwarze,2007; Khanahmandi et al,2018]. En el transcurso de
la biotransformación en el SMH, el porcentaje de humedad presentó valores que oscilaron entre el (64.3
± 5.32) % y el (72.18 ± 1.95) % y, luego de 135 días, el porcentaje finalizó en (71.7 ± 1.49) %. El
incremento de la humedad en el SMH estaría relacionado con un mayor crecimiento de P. ostreatus ya que
aproximadamente el 50 % del peso húmedo de P. ostreatus corresponde a agua [Bellettini et al., 2016;
Moreno-Bayona et al., 2019]y, a la adición de los pulsos de ABTS que se adicionaban cada 15 días en
ambos sistemas. Al finalizar el tratamiento el porcentaje de humedad aumentó; esto es indicio de un
metabolismo activo con alta producción de enzimas, así como de crecimiento extenso sobre la BLC
[Khanahmandi et al, 2018]. En el SMH la disposición de la BLC formó una capa más delgada que en
el SMV, lo que generó mayor área superficial, facilitó la transferencia de oxígeno y ayudó a disipar los
gases derivados del metabolismo [Bellettini et al, 2016].
51
Figura 14. Parámetros fisicoquímicos asociados a la biotransformación de BLC en SMH y SMV durante
135 días.
(A) Contenido de humedad (%), (B) pH, (C) Carbono Orgánico Total (% COT), (D) Producción de CO2 (mg g-1).
En contraste, los resultados de la humedad en SMV tienden a disminuir hasta el día 107 del tratamiento,
presentando valores que oscilaron entre (57 ± 19.89) % y el (69.33 ± 1.09) %; al finalizar el tratamiento
(135 días) la humedad aumentó a (74.86 ± 7.19) % (Figura 14A). El comportamiento diferente de P.
ostreatus en cada sistema de microcosmos está estrechamente relacionado con la geometría de éstos. Frente
al SMH, los porcentajes de humedad fueron más bajos en el SMV, esto se debe a que la actividad
metabólica del hongo calienta el sistema favoreciendo la evaporación de nutrientes y metabolitos,
adicionalmente, el bajo porcentaje de humedad es indicio de que el microorganismo no está produciendo
la cantidad de enzimas requeridas para la conversión del material lignocelulósico [Suwanno et al., 2019;
Khanahmandi et al., 2018].
10.2.1.2 pH
Con respecto a el pH, el valor inicial de pH en SMH fue de (6.2±0.1) y (5.9±0.2) para el SMV, a 135 días
de tratamiento no se observaron diferencias significativas entre el SMH y SMV (p>0.0001). Los valores
52
obtenidos en el tratamiento sugieren que las condiciones referentes a pH fueron las adecuadas para
favorecer la producción de micelio y la posterior colonización del sustrato [Sel et al.,2015] (Figura 14
B). Los valores se mantuvieron casi constantes gracias a la relación entre los productos asociados con el
metabolismo del carbono y del nitrógeno. Durante el tratamiento, se llevaron a cabo procesos de
mineralización/amonificación de la fuente de nitrógeno orgánica (hidrolizado de levadura cervecera), de
este proceso se puede generar amonio, esta sería la razón por la que los valores de pH aumentaran sin
que llegara a finalizar en el rango de la alcalinidad (pH >7.0). Autores como Yoon et al., (2004) reportaron
que en las fermentaciones sólidas para la producción de celulasas empleando hongos, deben iniciarse con
pHs por debajo de 7.0; según los autores, durante la fermentación se puede presentar acidificación y al
final puede volver a la neutralidad e inclusive aumentar hasta valores de pH 8.0 [Yoon et al., 2014].
Velioglu y Urek (2015), también reportaron que en la producción de P. ostreatus en fermentación sólida el
pH debe ser 6.0, para que se favorezca la producción inicial de micelio [Veloiglu and Urek, 2015].
En los dos sistemas la mezcla de residuos (corteza de pino, servilletas de papel e hidrolizado de levadura
cervecera) favoreció el proceso de colonización y crecimiento de P. ostreatus. Al ser un hongo saprófito
debe extraer los nutrientes a partir del sustrato, por lo tanto, la colonización inicial y extensión de sus
hifas es fundamental para la obtención de fuentes de carbono, nitrógeno y elementos traza, la cual se
favorece cuando se usan mezclas de sustratos con diferente grado de complejidad y no solamente lignina.
Los compuestos más sencillos se hidrolizarán primero ya que requieren menos energía para ser
metabolizados, una vez se asimilen las fuentes primarias de carbono, el microorganismo ya tendrá la
energía suficiente para descomponer la lignina que al ser degradada se forman subunidades de
fenilpropano unidas fuertemente por enlaces C-C y éter, esto es beneficioso para la célula ya que a partir
de estos compuestos puede obtener intermediarios alifáticos de tres carbonos que pueden ingresar al ciclo
de Krebs y así obtener energía[Owaid et al., 2015; Moreno et al., 2019].
10.2.1.3 COT y CO2
El porcentaje de carbono orgánico total (COT) y la producción de CO2 son indicadores de
biotransformación, el COT es fuente vital en el suelo y su proporción depende de la actividad microbiana
[Mishra y Sarkar, 2020]. El porcentaje de COT al iniciar el tratamiento en el SMH y SMV no fue muy
diferente, presentaron valores de (60.2 ± 2.1) % y (60.7 ± 1.7) %, respectivamente (figura 14 C). Se
esperaba que este valor fuera alto debido a la composición de la BLC, la cual estaba compuesta por
sustratos con alto contenido de carbono. En el transcurso del tratamiento en SMH el porcentaje de COT
disminuyó en un 42 % con valores finales promedio de (14.2 ± 0.2) frente al valor inicial, mientras que
la disminución en el COT en el SMV fue de 40.1 % presentando valores promedio de (20.1 ± 1.3). Los
valores finales de COT en SMH y en SMV (135 días) presentan diferencias significativas (p=0.043),
53
indicando que el SMH favorece la biodegradación (Figura 14 C). Las diferencias significativas entre el
SMH y SMV se debe a la conformación de los microcosmos, en el SMH la disminución del COT es más
elevada debido a que la capa de la BLC es más delgada lo que facilita la transferencia de aire, calor y masa,
en consecuencia, el proceso de fermentación es mucho más productivo [Khanahmandi et al., 2018].
En contraste, en el SMV el proceso de fermentación no fue el más exitoso debido a que la forma cilíndrica
del microcosmos crea una capa gruesa que disminuye la superficie de colonización, adicionalmente la
conformación vertical favorece la formación de gradientes de oxígeno que dificultan y retrasan el
crecimiento de P. ostreatus [Velioglu and Urek, 2015; Bellettini et al., 2018].
La producción de CO2 es una variable que permite identificar si se están llevando a cabo procesos de
biodegradación asociados a la actividad metabólica de P. ostreatus tanto de la BLC como de las láminas de
PEBD Oxo. Durante los primeros 75 días la producción de CO2 aumentó a (4.78 ± 0.01) mg g-1 y (4.98
± 0.01) mg g-1 para SMH y SMV respectivamente. Posteriormente, disminuyó hasta obtener un valor de
(4.47 ± 0.01) mg g-1 y (4.02 ± 0.01) mg g-1 en el SMH y SMV, respectivamente a los 135 día. El aumento
de CO2 en los primeros 75 días de la fermentación se relacionan con la biotransformación de materiales
más fáciles de degradar como glucosa, presente en la solución de elementos traza y en parte del
hidrolizado de levadura, la celulosa y hemicelulosa, en la corteza de pino y en las servilletas de papel
[Moreno-Bayona et al.,2019]. Además, el aumento de CO2 se debe a que luego del plasma de O2 los
aditivos prooxidantes actúan favoreciendo la oxidación del PEBD Oxo y, como producto también se
libera bajas concentraciones de CO2 [Shikova et al., 2019], que pueden sumarse a las que se producen
por la biodegradación de la BLC. Los resultados obtenidos en este trabajo fueron similares a los
reportados por Rojas et al., (2016) y Moreno-Bayona et al., (2019). En el trabajo de Rojas emplearon
un consorcio fúngico (Ganoderma lucidum, Pleurotus ostreatus, Trametes versicolor y Phanerochaete chrysosporium)
para biotransformar aserrín de Tabebuia roseae y Eucalyptus pellita a escala de microcosmos, observando que
la producción de CO2 más alta se obtuvo durante los primeros 45 días, luego observaron una disminución
[Rojas et al., 2016]. En el trabajo de Moreno emplearon la misma mezcla de BLC utilizada en el presente
trabajo y observaron la producción de CO2 en dos fases. La primera fue menor y duro hasta los 45 días,
posteriormente se observó una segunda fase con mayor producción que se extendió hasta los 75 días
[Moreno-Bayona et al., 2019]. En este trabajo, después del día 75 se observó un declive en la
producción de CO2 tanto en el SMH como en el SMV debido a que, posiblemente se esté empezando a
biodegradar la lignina y el PEBD Oxo ya que, al ser compuestos difíciles de degradar P. ostreatus tarda
más tiempo en degradarlos. En SMH la liberación de CO2 presenta una oscilación, esto es un indicador
de que se están dando procesos de humificación directa e indirecta por cuenta de la actividad metabólica
de P. ostreatus y que se está metabolizando los diferentes sustratos (Figura 14 D).
54
10.2.1.4 Actividad Enzimática
Por otra parte, las actividades enzimáticas de las enzimas ligninolíticas producidas por P. ostreatus se
determinaron durante 135 días en los intervalos anteriormente mencionados, ya que están estrechamente
relacionadas con los procesos de biotransformación tanto de las láminas PEBD Oxo como de la BLC
(Figura 15). En el día 0 del microcosmos, no se esperaba obtener actividad enzimática en ningún sistema
de microcosmos; sin embargo, los valores de la actividad enzimática inicial fue (U Kg-1) para LiP (63.75
± 27.6) y (79.68 ± 55.208), para el SMH y SMV, respectivamente, MnP (25.4 ± 9.78) y (23.701 ±0.543),
para el SMH y SMV, respectivamente y Lac (41.1 ± 16.57 y 41.145 ± 4.475), para el SMH y SMV,
respectivamente, quizás se deba a que parte del medio salvado de trigo fue adsorbido por el micelio y este
a su vez fomentara la actividad enzimática, a pesar de que la biomasa usada como inóculo se lavó con
solución salina al 0.85% (p/v).
Figura 15. Análisis enzimático en SMH y SMV durante 135 días.
(A) actividad Lac (U Kg-1) y (B) actividad ligninolíticas LiP y MnP (U Kg-1). Los resultados presentados en las figuras
corresponden al promedio de tres replicas. Las barras corresponden a la desviación estándar del promedio de tres
réplicas para cada intervalo de muestreo. Las letras representan los subgrupos homogéneos de Tukey, donde a
indica el mejor resultado.
En el SMH, la actividad LiP y MnP fue significativamente mayor con respecto a el SMV con un p valor
de (p=0.0026) y (p=0.031) respectivamente durante los 135 días de tratamiento. En el SMH el máximo
valor obtenido de LiP se presentó a los 107 días en el cual produjo (10008 ± 2406 U Kg-1) y MnP obtuvo
un máximo a los 135 días (1962.4 ± 220.3 U Kg-1). En contraste, en el SMV las actividades enzimáticas
fueron considerablemente menores; LiP alcanzó su máximo valor (2868 ± 941 U Kg-1) a los 135 días,
mientras que, MnP obtuvo el valor más alto a los 75 días de tratamiento con un valor de (576 ± 30 U Kg-
1) (Figura 15A). Por su parte la actividad Lac en el SMH alcanzó su valor máximo a los 75 días de
tratamiento con un valor de (14599 ± 3520 U Kg-1), este resultado fue significativamente mayor
(p<0.0007) que en SMV, en el cual obtuvo su máxima actividad al día 135 con un valor (10314 ± 1190
U Kg-1) (Figura 15B).
55
Pese a que se evidenciaron diferencias significativas entre el SMH y el SMV (LiP, p=0.0026; MnP,
p=0.031 y Lac p<0.0007) la actividad de la enzimas ligninolíticas incrementaron en función del tiempo
en ambos sistemas, esto se debe a que la fermentación en sólido estimula actividad enzimática de P.
ostreatus [Sel et al., 2015]. Sin embargo, la tendencia y las actividades fueron diferentes en peroxidasas y
Lac. Las diferencias en las actividades enzimáticas entre ambos sistemas son atribuibles a la distribución
de la BLC que forma una capa delgada dentro del SMH, lo que favorece la colonización y crecimiento
vegetativo, permitiendo tener mayor cantidad de biomasa fúngica viable metabólicamente activa y
actividad enzimática con respecto al SMV.
En el SMH se observó mayor actividad Lac que en el SMV (SMH 14599 ± 3520 U Kg-1 y SMV10314 ±
1190 U Kg-1) esto podría atribuirse, además de la geometría del microcosmos que ya se mencionó, al
aumento en la producción de micelio, varios autores reportaron que durante el crecimiento vegetativo de
P. ostreatus se evidencia mayor producción de Lac frente a otras enzimas, lo que sugiere que dicha enzima
está relacionada con la colonización inicial de los sustratos durante los primeros días de fermentación
sólida [Economou et al., 2017; Bellettini et al., 2018; Savoi et al., 2007; Sel et al., 2015], por ende, la
alta actividad Lac en el SMH apoya la hipótesis de que este sistema favorece la colonización de P. ostreatus
sobre el PEBD Oxo y de la BLC. Adicionalmente, la transferencia de gases y oxígeno es mucho más
eficiente en sistemas tipo bandeja [Khanahmandi et al., 2018], posiblemente el sistema tenía mayor
concentración de O2, permitiendo que la enzima Lac tuviera mayor cantidad de O2 como cosustrato
generando como subproducto de agua, lo cual también se refleja en el porcentaje de humedad [Savoi et
al., 2007; Rivera-Hoyos et al., 2013; Bellettini et al., 2018].
Otro aspecto que favoreció la actividad de esta enzima fue la presencia del mediador redox ABTS, así
como de iones de cobre, presentes en la solución de elementos traza; gracias a estos, se potencializó la
actividad y se promovió la formación de especies reactivas que complementaron la oxidación [Wang et
al.,2018]. La estructura química aromática del ABTS y los iones de Cu promueven la actividad Lac, al
inducir la expresión de genes que codifican para esta enzima [Zhou et al.,2017], además, producto de la
degradación de la BLC en especial de la lignina, se generan compuestos aromáticos semejantes al ABTS,
como la vainilla y el ácido ferúlico, que estimulan la actividad Lac [Sel et al., 2015]. Adicionalmente, el
potencial redox del ABTS es mayor que la actividad Lac sin mediador, por lo que la presencia de este
mediador favorece la capacidad de oxidación de la enzima sobre enlaces C-C [Gómez-Méndez., 2018].
La producción de Lac es relevante no sólo a nivel de la degradación de la BLC, sino también a nivel de
la degradación del PEBD Oxo, la enzima oxida los enlaces C-C que conforman la zona amorfa del PEBD
Oxo [Gómez-Méndez et al., 2018]. Derivado de la actividad primaria de Lac se producen compuestos
oxigenados que son esenciales para la actividad MnP y LiP, dichas enzimas tienen la capacidad de atacar
compuestos no fenólicos como el PEBD Oxo mediante reacciones oxidativas que escinden los enlaces
56
C=O y C-C. [Hofrichter., 2002]. La actividad de las enzimas ligninolíticas sobre compuestos como el
PEBD Oxo y la BLC responden a un proceso sinérgico entre cada una de las enzimas producidas por P.
ostreatus, en el momento en que se inicia la actividad Lac, se producen otras enzimas ligninolíticas como
MnP y LiP que utilizan las especies reactivas de oxígeno, en la escisión de moléculas generadas por la
actividad Lac, en consecuencia se generan una serie de reacciones en cascada que dan como resultado la
degradación y la formación de ácido carboxílico que es asimilado metabólicamente mediante la ruta del
ácido tricarboxilico (TCA, siglas en inglés)[da Luz et al.,2013]. Adicionalmente, el peróxido de
hidrógeno, entre otras especies reactivas de oxígeno, se asocian con la degradación de compuestos
recalcitrantes mediante Fenton biológico, estudios recientes indican que, estos compuestos oxigenados
tendrían efecto sobre la oxidación de los anillos aromáticos de la lignina facilitando su apertura [Khatami
et al.,2019]. Finalmente, en el proceso de degradación de la lignina, mediada por la actividad de HPB, se
expresan un conjunto de enzimas redox como las oxidasas, radicales de cobre y las oxidorreductasas de
glucosa-metanol-colina acopladas a la producción de peróxido de hidrogeno, mediante el cual se
promueve el mecanismo oxidativo basado en química Fenton [Zhu et al., 2016]. En este trabajo el SMH
facilitó la producción de Lac estrechamente relacionada con la colonización de los sustratos como son el
PEBD Oxo y la BLC, en consecuencia, aumenta la presencia de compuestos intermediarios que estimulan
la producción de MnP y LiP que oxidan compuestos recalcitrantes como lo es el PEBD Oxo.
La degradación de PEBD Oxo y de la BLC mediada por la actividad enzimática de P. ostreatus es mejor
en SMH que en el SMV debido a la geometría del microcosmos el cual favorece la transferencia de
oxígeno que actúa como aceptor final en la cadena transportadora de electrones en la respiración y juega
un papel clave en las actividades oxidativas de las enzimas, entre mayor superficie de contacto exista entre
el hongo y el oxígeno mayor degradación. Lo anterior se evidencia en el resumen de los parámetros
asociados a la biodegradación (Tabla 1), en el SMH la actividad enzimática fue mayor, se evidenció una
correlación entre la actividad Lac asociada a la colonización del hongo sobre los sustratos y la actividad
LiP y MnP, donde se observó mayor actividad LiP y MnP las cuales están ligadas a la biodegradación de
compuestos no aromáticos de la lignina y a compuestos alifáticos presentes en el PEBD Oxo. Ligado a
la actividad enzimática, la humedad en el SMH fue ligeramente mayor que en el SMV además de los
pulsos adicionados del mediador redox que aumenta la actividad enzimática, la humedad se incrementa
debido a que, derivado de la escisión de los compuestos recalcitrantes, se generan moléculas de agua que
aumentan la humedad del sistema. Pese a que en el SMH la actividad enzimática fue mayor que en el
SMV, las variables de respuestas asociadas al plástico en ambos sistemas son similares con excepción del
último día (135) dónde el SCA fue menor en el SMV. Este resultado indica que con respecto a la
biodegradación del PEBD Oxo, el SMH no tiene mayor incidencia frente al SMV. Sin embargo, ampliar
el tiempo de fermentación permitiría esclarecer la efectividad del sistema sobre la biodegradación del
57
PEBD Oxo. En cuanto al COT y al CO2 ambos parámetros son indicadores de que en ambos sistemas
se está llevando a cabo procesos de biodegradación y humificación directa de la BLC, en el SMH las
oscilaciones presentadas son indicio de humificación directa e indirecta.
Tabla 3. Resumen análisis de parámetros asociados a la biodegradación de PEBD Oxo y la BLC tanto
en SMH como el SMV.
Los valores presentados corresponden a la determinación inicial del PEBD Oxo prístino frente al resultado del
tratamiento en cada sistema de microcosmos a día 135.
SMH SMV
Parámetro Inicial (prístino) Final Inicial(prístino) Final
Ángulo de contacto
estático (SCA) (°)
88.3 ± 2.9 32.11 ± 8.38 88.3 ± 2.9 22.56 ± 2.89
Rugosidad (nm) 10,1 ± 0.1 10.28 ± 0.74 10,1 ± 0.1 13.62 ± 0.93
% cambio de SCA 63.63 74.45
% cambio
Rugosidad
1,75 26
COT 60.2 ± 2.1 14.2 ± 0.98 60.2 ± 1.7 20.1 ± 1.3
pH 6.18 ± 0.02 6.51 ± 0.10 5.94 ± 0.212 6.33 ± 0.03
CO2 (mg/g) 5.2 ± 0.61 4.5 4.16 ± 0.0 4.02 ± 0.0
Humedad 68.1 ± 3.3 71.7 ± 1.49 69.3± 1.1 74.9 ± 7.2
LiP 63.7 ± 27.6 6151.7 ± 2681.4 79.7 ± 55.2 2868.7 ± 941.8
Lac 41.1 ± 16.6 10229.4 ± 1269.5 41.1 ± 4.5 10314. 75 ± 1190.6
MnP 25.40 ± 9.8 1962.37 ± 220.3 23.701 ± 0.5 150.090 ± 59.2
58
10.2.2 Fraccionamiento de carbono
Para ver la biotransformación de la BLC asociada a procesos de humificación tanto en el SMH como en
el SMV, se realizaron estudios espectrofotométricos en el rango UV-VIS. Los análisis espectofométricos
a diferentes longitudes de onda permiten identificar compuestos que se encuentran en una solución.
Adicionalmente, la capacidad de absorber luz es una característica de las moléculas y dependiendo del
tipo de solución es posible identificarlas. El fraccionamiento de carbono se basa en la solubilidad de las
sustancias húmicas, dicha solubilidad se divide en tres fracciones en las que se encuentran: ácidos o
sustancias húmicos totales (SHT) solubles en soluciones alcalinas, ácidos o sustancias fúlvicas (SF)
solubles en todos los valores de pH y, sustancias húmicas (SH) insolubles en todas las fracciones
[Giovanela et al.,2010].
Los estudios espectrales están asociados de forma cualitativa con las sustancias húmicas totales (SHT) en
extracción alcalina, sustancias fúlvicas presentes en el sobrenadante en extracción ácida (SF) y húmicas
en extracción alcalina del sedimento resuspendido (SH) en función del tiempo (Figura 16).Para comparar
los resultados de ambos sistemas frente a BLC sin P. ostreatus; se realizó un control abiótico tanto para el
SMH como el SMV, en el cual la mayor absorción se observó en la región del espectro UV con tendencia
descendente hacia el espectro visible en todas las fracciones. Filcheva y colaboradores, reportaron picos
de absorbancia a longitudes de onda que se encuentran en el espectro ultravioleta (300 nm y 465nm),
[Filcheva et al., 2017]. Este resultado concuerda con los resultados obtenidos ya que, se observaron
varios picos que oscilaron entre los 210 nm y 290 nm, dicha absorción corresponde a la presencia de
lignina y de subunidades de fenilpropano los cuales están compuestos de anillos aromáticos que presentan
mayor absorción en el espectro ultravioleta (Fig 16A y 16B). Las curvas espectrales de la BLC sin PEBD
Oxo, procedente del SMH al iniciar el tratamiento y al finalizar a los 135 días con P. ostreatus, se presentan
en las figuras 16B y 16C. Inicialmente se presentó una disminución en la señal de las SHT con respecto
al control abiótico, esto se debe a la presencia de la biomasa fúngica presente en la BLC. La señal de las
SF aumentó en la región UV y las SH presentaron patrones similares al control abiótico. A los 135 días
de transformación, la señal de las SHT y SF aumentó levemente con respecto a los espectros de absorción
inicial (tiempo cero e inoculados con P. ostreatus). La señal de las SH presentó una leve disminución frente
a los espectros iniciales, así mismo, los espectros del SMV fueron semejantes al SMH. Las SF presentaron
mayor intensidad el inicio y a los 135 días en el SMH y, las SH tuvieron menor intensidad, pero una
tendencia semejante al inicio y a los 135 días (Fig 16E y 16F).
En los espectros de las SH, SMH y SMV a 135 días se observó un leve efecto “shoulder” entre los 220 y
270 nm, que podrían estar asociados con un sobrelapamiento de absorbancias de un gran número de
grupos cromóforos presentes en el núcleo de SH (Fig 16C y 16F).
59
Figura 16. UV-VIS espectro de SMH, SMV y Control.
(A) Control abiótico SMH (B) SMH al inicio del experimento (C) SMH a 135 días (D) Control abiótico SMV. (E)
SMV al inicio del experimento. (F). SMV at 135 d. Línea negra: Sustancias Húmicas Totales (SHT). Linea roja:
Sustancias Fúlvicas (SF). Línea Azul: Sustancia Húmicas (H).
Debido a que en el espectro de luz visible se observaron pocos cambios, tanto en el SMH como en el
SMV, fue necesario realizar un análisis detallado en el cual, se calcularon las relaciones de condensación
y polimerización E4/E6. Esta relación permite determinar de forma semicuantitativa si, a partir de un
material orgánico inicial que es biodegradado por factores bióticos y abióticos, se pueden formar en
función del tiempo, sustancias húmicas que se relacionan con procesos de humificación indirecta
[Moreno-Bayona et al., 2019]. En el control abiótico la relación E4/E6 presentó valores que estaban
entre (1.09 ± 0.23) y (2.67 ± 0.92), respectivamente siendo los valores más bajos que se obtuvieron
(Tabla 2). En el SMH y SMV inicial e inoculado con P. ostreatus, las relaciones E4/E6 para SHT fueron
de (9.33 ± 1.12) y (7.42 ± 1.13), respectivamente. En cuanto a la extracción de SF, los valores fueron de
(2.74 ± 0.97) y (12.59 ± 1.09) para SMH y SMV, los valores obtenidos para SH fueron semejantes en
SMH y SMV con (2.60 ± 0.15) y (2.20 ± 0.33) respectivamente. Después, a los 135 días de
biotransformación las relaciones E4/E6 en SHT fueron de (9.05 ± 0.48) y (9.08 ± 1.02) para SMH y SMV.
Además, en las extracciones para SF y SH las relaciones aumentaron notablemente frente a los valores
iniciales (8.58 ± 0.97), (13.84 ± 1.16), (3.07 ± 0.35) y (3.66 ± 0.92), para SF y SH en SMH y SMV,
60
respectivamente (tabla 2). A medida que el material madura y se estabiliza, la relación E4/E6 puede llegar
a disminuir y presentar valores por debajo de 2.0 cuando predominan las SH [Gondar et al., 2005]. La
literatura reporta que la relación E4/E6 es inversamente proporcional con el grado de condensación de
los anillos aromáticos. Valores altos en la relación E4/E6 sugieren un bajo grado de condensación y
madurez, indican la presencia de una proporción alta de compuestos alifáticos, que se relacionan con la
existencia de materia orgánica reactiva soluble que indica que hasta ahora se están formando SF [Zalba
et al., 2016; García-Gómez et al., 2005]. Por lo tanto, al obtener valores altos se infiere que la
humificación indirecta ha iniciado y que se están formando en menor proporción SH. Las SH son
indicadores de procesos de oxidación que pueden estar ocurriendo sobre el material lignocelulósico,
asimismo, indican el grado de biodegradación de los compuestos, entre más biodegradado esté el
compuesto, habrá mayor presencia de SH [Filcheva et al., 2017]. No obstante, no se puede afirmar que
la BLC está completamente transformada y estabilizada y, que hay predominancia de SH en la BLC/R ya
que para que esta afirmación sea válida, es necesario que la relación E4/E6 en el rango de las SH sea
inferior a 2.0. En contraste en este trabajo la relación no fue inferior a 2.0, por el contrario, presentó
valores de (3.07 ± 0.35 y 3.66 ± 0.92 para SMH y SMV, respectivamente). Por otro lado, la fuerte
adsorción en el espectro UV en las longitudes de onda entre 210 y 280 nm se podría relacionar con
compuestos cromóforos similares, como fenólicos, ácidos benzoicos, anilinas derivadas, polienos, entre
otros [Giovanela et al.,2010]. Los resultados sugieren que en ambos sistemas se inició un proceso de
biotransformación o condensación de las SF y SH, pese a esto, aún falta tiempo para alcanzar la
maduración completa y para que la relación de SH alcance valores inferiores a 2.0.
Tabla 4. Propiedades espectrales de HA, en UV-Vis
Tiempo(d) SMH SMV
E4/E6 E4/E6
SHT SF SH SHT SF SH
Control
abiótico 1.09 ± 0.23 2.33 ± 0.51 2.67 ± 0.92 1.09 ± 0.23 2.33 ± 0.11 2.67 ± 0.54
0 9.33 ± 1.12 2.74 ± 0.97 2.60 ± 0.15 7.42 ± 1.13 12.59 ± 1.09 2.20 ± 0.33
61
135 9.05 ± 0.48 8.58 ± 0.97 3.07 ± 0.35 9.08 ± 1.02 13.84 ± 1.16 3.66 ± 0.92
10.3 Producción y Caracterización de biochar
Los bioproductos orgánicos obtenidos después de 135 días de biotransformación de la BLC en los dos
sistemas de microcosmos, se mezclaron para utilizarlo como materia prima o material crudo (MC) para
producir un biochar por una (1) hora a 300º C (Figura 17). En la caracterización general del MC se
determinó que tenía un pH de (5.7 ± 0.14), humedad del (6.9 ± 0.35) % y COT de (45.1 ± 5.2) %.
Mediante el análisis próximo se estableció que el MC tenía un porcentaje de carbono fijo bajo (1.2 ± 0.4)
%, con elevado contenido de carbono volátil (85.1 ±2.0) % y cenizas del (13.7 ± 2.0) %.
Figura 17. Producto final Biochar.
10.3.1 Biochar generado a partir de BLC/R derivadas de los sistemas de
microcosmos.
Al producir el biochar se observó una disminución en los porcentajes de humedad, COT, y carbono
volátil obteniendo valores del (4.7 ± 0.16) %, (29.5 ± 1.3) y (73.2 ± 0.9), respectivamente. Por el contrario,
el pH, el carbono fijo y el contenido de cenizas se incrementaron con valores de (6.1 ± 0.1) %, (6.55 ±
0.12) % y (20.2 ± 1.9) %, respectivamente. De acuerdo con el contenido de carbono y rendimiento en
biochar (53.6 ± 6.7) el biochar producido se clasificó dentro de la clase III [IBI.,2015] (carbono total >
al 10 % y menor a 30 %); esto quiere decir que, bajo las condiciones experimentales empleadas, el
porcentaje de COT fue inferior al 30 %, el CF fue de (6.55 ± 0.12) % y las cenizas fueron de (20.2 ± 1.9)
%. Estos resultados indicaron que durante el tratamiento térmico se perdió agua, un elevado porcentaje
62
de carbono y otros elementos en la fracción volátil, determinando que la fracción de carbono que se
condensa como parte del biochar fuera baja. Adicionalmente, el MC tenía otros elementos de tipo mineral
que se concentraron en las cenizas e incrementaron el pH (6.1 ± 0.1 %). Los cambios producidos por el
tratamiento térmico han sido reportados por otros autores [Moreno et al., 2019; Blanco et al., 2020 y
Céspedes et al., 2020].
El rendimiento y el porcentaje de carbono en biochar depende de las condiciones en las que se lleve a
cabo el proceso térmico, este a su vez depende de la materia orgánica y su composición. Una de las
características de biochar fabricado con lignina es que luego del tratamiento térmico puede presentar un
contenido de carbono de más del 95 % cuando es sometido a los 1000°. Sin embargo, los compuestos
de estos residuos presentan puntos de fusión de cenizas a temperaturas que oscilan entre 200° C hasta
700° C, en consecuencia, la temperatura a la que se fabrica biochar con estos residuos no supera los 700°
C [Weber et al.,2018]. La corteza de pino y papel están compuestos de celulosa, hemicelulosa y lignina;
a su vez la hemicelulosa está compuesta de polisacáridos ramificados que se descompone mediante
torrefacción (220-315) °C. La celulosa se compone de polisacáridos no ramificados y se caracteriza por
ser térmicamente estable; su descomposición se lleva a cabo a temperaturas que oscilan entre 280° C y
400° C. Finalmente la lignina, una macromolécula compleja que se compone de diversos enlaces y
estructuras químicas se descompone a temperaturas que van desde 200° C hasta 900° C [Weber et
al.,2018]. Debido a la diversidad de materiales presentes en el MC y al alto gasto energético que conllevaría
realizar este proceso a temperatura mayores a 700° C, en este trabajo la temperatura con la que se llevó a
cabo el proceso de pirólisis fue 300° C y como consecuencia el rendimiento y el contenido de carbono
fue bajo.
11 Conclusiones
• En ambos sistemas de microcosmos (SMH y SMV) se llevó a cabo procesos de biodegradación
de compuestos recalcitrantes como PEBD Oxo y BLC, sin embargo, el SMH se destaca frente a
SMV ya que mejoró las condiciones de cultivo y promovió una alta actividad de enzimas
lignocelulósicas asociadas a la biodegradación de BLC y posiblemente a la degradación del PEBD
Oxo.
• La geometría del sistema no tuvo influencia sobre las variables de respuesta asociada al PEBD
Oxo, además 135 días no son suficientes para biodegradar y mineralizar el PEBD Oxo. Pese a
esto, la biotransformación de la BLC fue mayor en el SMH, pero requiere mayor tiempo de
fermentación para obtener un material completamente madurado y condesando.
63
• Como estrategia de estrategia de aprovechamiento de residuos sólidos, la BLC/R fue utilizada
para la producción de biochar por pirólisis rápida esto permitió generar, de manera responsable
según los lineamiento de la normativa colombiana, en un biochar con aplicabilidad comercial
clase III con un rendimiento del 53.6%.
12 Recomendaciones
• Evaluar la biodegradación de láminas de PEBD Oxo pretratadas con plasma de O2 en el SMH
ampliando el tiempo de tratamiento.
• Realizar escalamiento del tratamiento SMH
• Realizar ensayos de geminación de semillas y de adsorción de colorantes con el biochar generado
a partir de la BLC/R.
13 Productos derivados
• Diana A. Moreno-Bayona, Luis D. Gómez-Méndez, Andrea Blanco-Vargas, Alejandra Castillo-
Toro, Laura Herrera-Carlosama, Raul A. Poutou-Piñales, Juan C. Salcedo-Reyes, Lucía A. Díaz-
Ariza, Laura C. Castillo-Carvajal, Naydú S. Rojas Higuera, Aura M. Pedroza-Rodríguez,
“Simultaneous bioconversion of lignocellulosic residues and oxodegradable polyethylene by
Pleurotus ostreatus for biochar production, enriched with phosphate solubilizing bacteria for
agricultural use”. PLoS ONE, 14(5): e0217100, 2019.
doi: 10.1371/Journal.pone.0217100
• Alejandra Castillo-Toroa†, Juan Felipe Mateusa, Natalia Céspedesa, Felipe Pereza, Luis D.
Gómez-Méndeza, Raúl A. Poutou-Piñalesb, Juan C. Salcedo-Reyesc, Aura M. Pedroza-Rodríguez.
Efecto de dos sistemas de fermentación sólida sobre la transformación de polietileno
oxodegradable y biomasa lignocelulósica, empleando a Pleurotus ostreatus. En revisión
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72
ANEXO 1
CARTA DE AUTORIZACIÓN DE LOS AUTORES
(Licencia de uso)
Marzo de 2018
Bogotá, D.C., 01- julio-2020
Señores
Biblioteca Alfonso Borrero Cabal S.J.
Pontificia Universidad Javeriana
Cuidad
Los suscritos:
Alejandra Castillo Toro , con C.C. No 1016080596
En mi (nuestra) calidad de autor (es) exclusivo (s) de la obra titulada:
EVALUACIÓN DE DOS SISTEMAS DE MICROCOSMOS PARA LA BIOTRANSFORMACIÓN con Pleurotus
ostreatus DE POLIETILENO DE BAJA DENSIDAD Oxo-DEGRADABLE (PEBD Oxo) PRETRATADO CON
PLASMA DE OXÍGENO
(por favor señale con una “x” las opciones que apliquen)
Tesis
doctoral
cual:___________________________________________________________________________
presentado y aprobado en el año 2020 , por medio del presente escrito autorizo
(autorizamos) a la Pontificia Universidad Javeriana para que, en desarrollo de la presente licencia
de uso parcial, pueda ejercer sobre mi (nuestra) obra las atribuciones que se indican a
continuación, teniendo en cuenta que en cualquier caso, la finalidad perseguida será facilitar,
difundir y promover el aprendizaje, la enseñanza y la investigación.
En consecuencia, las atribuciones de usos temporales y parciales que por virtud de la presente
licencia se autorizan a la Pontificia Universidad Javeriana, a los usuarios de la Biblioteca Alfonso
Borrero Cabal S.J., así como a los usuarios de las redes, bases de datos y demás sitios web con los
que la Universidad tenga perfeccionado un convenio.
Información de confidencialidad: Esta Tesis o Trabajo de Grado contiene información privilegiada,
estratégica, secreta, confidencial o similar, o hace parte de una investigación que se adelanta y
cuyos resultados finales no se han publicado Si No
Si su respuesta es Si por favor indique el motivo y el tiempo de restricción.
PUJ– BG Normas para la entrega de Tesis y Trabajos de grado a la Biblioteca General – Marzo de 2018
Trabajo de grado X Premio o distinción: Si No X
, con C.C. No , con C.C. No , con C.C. No , con C.C. No
X
73
Motivo:
Tiempo de restricción:
Nota: La Tesis o Trabajo de Grado quedaran restringidos para la consulta por el tiempo de embargo indicado, o indefinidamente en caso de que éste no se registre, una vez concluido dicho periodo (si aplica), indicar a continuación el tipo de consulta que se autoriza.
Marque a continuación con una X el tipo de consulta que autoriza.
AUTORIZO (AUTORIZAMOS) SI NO
1. La consulta electrónica a través del catálogo Biblos y el Repositorio Institucional, así como la inclusión en bases de datos y en sitios web sean éstos onerosos o gratuitos, existiendo con ellos previo convenio perfeccionado con la Pontificia Universidad Javeriana para efectos de satisfacer los fines previstos. En este evento, tales sitios y sus usuarios tendrán las mismas facultades que las aquí concedidas con las mismas limitaciones y condiciones.
Nota: Aceptamos los términos de la licencia Creative Commons de Reconocimiento-No comercial-Sin obras derivadas 2.5 Colombia.
Para más información consulte:
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/co/
X
De acuerdo con la naturaleza del uso concedido, la presente licencia parcial se otorga a título
gratuito por el máximo tiempo legal colombiano, con el propósito de que en dicho lapso mi
(nuestra) obra sea explotada en las condiciones aquí estipuladas y para los fines indicados,
respetando siempre la titularidad de los derechos patrimoniales y morales correspondientes, de
acuerdo con los usos honrados, de manera proporcional y justificada a la finalidad perseguida, sin
ánimo de lucro ni de comercialización.
De manera complementaria, garantizo (garantizamos) en mi (nuestra) calidad de estudiante (s) y
por ende autor (es) exclusivo (s), que la Tesis o Trabajo de Grado en cuestión, es producto de mi
(nuestra) plena autoría, de mi (nuestro) esfuerzo personal intelectual, como consecuencia de mi
(nuestra) creación original particular y, por tanto, soy (somos) el (los) único (s) titular (es) de la
misma. Además, aseguro (aseguramos) que no contiene citas, ni transcripciones de otras obras
protegidas, por fuera de los límites autorizados por la ley, según los usos honrados, y en proporción
a los fines previstos; ni tampoco contempla declaraciones difamatorias contra terceros; respetando
el derecho a la imagen, intimidad, buen nombre y demás derechos constitucionales.
Adicionalmente, manifiesto (manifestamos) que no se incluyeron expresiones contrarias al orden
público ni a las buenas costumbres. En consecuencia, la responsabilidad directa en la elaboración,
PUJ– BG Normas para la entrega de Tesis y Trabajos de grado a la Biblioteca General – Marzo de 2018
74
presentación, investigación y, en general, contenidos de la Tesis o Trabajo de Grado es de mí
(nuestro) competencia exclusiva, eximiendo de toda responsabilidad a la Pontifica Universidad
Javeriana por tales aspectos.
Sin perjuicio de los usos y atribuciones otorgadas en virtud de este documento, continuaré
(continuaremos) conservando los correspondientes derechos patrimoniales sin modificación o
restricción alguna, puesto que, de acuerdo con la legislación colombiana aplicable, el presente es
un acuerdo jurídico que en ningún caso conlleva la enajenación de los derechos patrimoniales
derivados del régimen del Derecho de Autor.
De conformidad con lo establecido en el artículo 30 de la Ley 23 de 1982 y el artículo 11 de la
Decisión Andina 351 de 1993, “Los derechos morales sobre el trabajo son propiedad de los autores”,
los cuales son irrenunciables, imprescriptibles, inembargables e inalienables. En consecuencia, la
Pontificia Universidad Javeriana está en la obligación de RESPETARLOS Y HACERLOS RESPETAR, para
lo cual tomará las medidas correspondientes para garantizar su observancia.
NOMBRE COMPLETO No. del documento
de identidad FIRMA
Luis David Gómez 79557580
Aura Marina Pedroza 46368716
Juan Felipe Mateus Maldonado 1020773938
Alejandra Castillo Toro 1016080596
FACULTAD Ciencias
PROGRAMA ACADÉMICO Microbiología Industrial – Pregrado
PUJ– BG Normas para la entrega de Tesis y Trabajos de grado a la Biblioteca General – Marzo de 2018
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CARTA DIRECTORES
Doctor(a)
Marcela Franco Correa
Director(a) Carrera de Microbiología Industrial
Facultad de Ciencias
Respetado(a) Doctor(a):
Con la presente comunicación, hacemos constar que el trabajo de grado titulado:
Evaluación de dos sistemas de microcosmos para la biotransformación con Pleurotus
ostreatus de polietileno de baja densidad Oxo-degradable (PEBD Oxo) pretratado con
plasma de oxígeno.
realizado por los(as) estudiantes Alejandra Castillo Toro y ________________________, ha
sido revisado y corregido de acuerdo con las observaciones sugeridas por los jurados en la
sustentación.
En constancia se firma, a los 01 días del mes de Julio del año 2020. Cordialmente,
NOMBRE Luis David Gómez NOMBRE Aura Marina Pedroza
FIRMA _______________________
DIRECTOR TRABAJO DE GRADO CODIRECTOR TRABAJO DE GRADO
NOMBRE Juan Felipe Mateus
FIRMA _______________________
ASESOR TRABAJO DE GRADO
NOMBRE Ivonne Gutiérrez NOMBRE_______________________
FIRMA _______________________ FIRMA _______________________
JURADO TRABAJO DE GRADO JURADO TRABAJO DE GRADO
FIRMA_______________________
MARCELA FRANCO CORREA, Ph.D, DIRECTORA CARRERA DE MICROBIOLOGIA
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