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14 n SUIS Nº 95 Marzo 2013

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14 n SUIS Nº 95 Marzo 2013

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Establecimiento de un procedimiento diagnóstico para Lawsonia intracellularis

Resumen

Tanto el cuadro clínico como la observación de las lesiones macroscópi-cas son insuficientes para el diagnóstico certero de la enteropatía prolife-rativa porcina (EPP). Además, Lawsonia intracellularis es una bacteria que no crece en medios in vitro convencionales en ausencia de enterocitos, así que tanto el aislamiento como el diagnóstico serológico resultan com-plicados (Huerta y col., 2003). De este modo el examen post mórtem de los animales con diarrea y retraso en el crecimiento resulta de gran interés para su diagnóstico. La constatación del aumento de tamaño del íleon, de los ganglios linfáticos y de las lesiones microscópicas proliferativas típicas son una herramienta determinante a la hora de caracterizar la enfer-medad, cuando se utilizan de forma conjunta. La técnica de Warthin Starry resultó ser rápida y simple en su desarrollo y permitió identificar, además del agente etiológico, estructuras histológicas, patológicas y la respuesta celular. Además, la técnica de inmunoperoxidasa fue la prueba de referen-cia para el diagnóstico de L. intracellularis y permitió identificar diferentes etapas en la patogenia de la enfermedad (incluyendo los animales en recuperación) y grado de infección. La técnica de PCR de mucosa ileal permitió identificar animales con poca cantidad de L. intracellularis en la mucosa y su asociación con las lesiones, por lo que se concluye que su aplicación podría ayudar a determinar infecciones subclínicas. La técnica de PCR de materia fecal dio lugar a la identificación de cerdos que siguie-ron eliminando bacterias de manera intermitente durante varias semanas.

Palabras claves: Lawsonia intracellularis, enteropatía proliferativa porcina, diagnóstico.

Summary

Diagnosis of Lawsonia intracellularis

Both clinical observation and gross lesions are insufficient for accurate diagnosis of porcine proliferative enteropathy (PPE), so it is recommended laboratory diagnosis, and can be direct or indirect. Furthermore, Lawsonia intracellularis is a bacterium which does not grow on conventional media in vitro in the absence of enterocytes, therefore isolation as serological diag-nosis is complicated (Huerta et al., 2003). Thus the post-mortem exami-nation of animals with diarrhea and growth retardation is of great interest for diagnosis. The finding of increased size of the ileum, the lymph nodes and microscopic lesions typical proliferative, is a reliable tool when cha-racterizing the EPP, when used together. Warthin Starry technique proved to be quick and simple in its development and identified, in addition to the etiologic agent, histological structures, pathological and cellular response. Moreover immunoperoxidase technique was the gold standard for the histo-pathological diagnosis of L. intracellularis, and identified different stages in the pathogenesis of the disease (including animals in recovery) and degree of infection. The PCR technique of ileal mucosa identified animals with little amount of L. intracellularis in mucosa and associated injuries, which conclu-des that its implementation could help determine subclinical infections. The PCR technique stool in turn led to the identification of bacteria eliminating pigs continued intermittently for several weeks.

Key words: Lawsonia intracellularis, porcine proliferative enteropathy, diagnosis.

JudithBertone,SilviaRomanini,RaúlYaciuk,NataliaIllanes,BibianaPellizayAnaCabral

Imágenescedidasporlosautores

Contactoconlosautores:DepartamentodePatologíaAnimal-UniversidadNacionaldeRíoCuarto-Córdoba-Argentina.Email:[email protected]

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SUIS Nº 95 Marzo 2013 n 15

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Laenteropatíaproliferativaporci-na(EPP)oileítisporcinaesconsi-deradapornumerososinvestiga-dorescomounadelasprincipales

enfermedadestransmisiblesen laproduc-ciónintensivadecerdosentodoelmundo.EstáproducidaporLawsonia intracellula-ris,unabacteriaGram(-)quemanifiestacomoprincipalessignosclínicosanorexia,diarrea,retrasodelcrecimientoyaumentodelamortalidadenlaetapadefinalización(Jensenycol.,2006).La distribución de esta enfermedad esmundial. En Estados Unidos y algunospaísesdeEuropa,elporcentajedeexplo-tacionesafectadassuperaal90%(McO-ristycol.,2003).Enunestudiorealizadoen22explotacionesdelazonademayorproducción porcina de Argentina, me-diantelatécnicaELISAensueroyPCRenmateria fecal, seobservóqueun90,9%delasgranjaseranseropositivas.EnesteestudioseconcluyótambiénqueL. intra-cellularisestápresentedeformaendémicaalolargodelpaísydelasexplotaciones,yqueelmayorimpactodelaenfermedadsedaenlosanimalesde15semanasdeedad(Corralesycol.,2009).LaEPPsemanifiestaclínicamentededosformas en las granjas infectadas: unaformacrónica,contrestiposdelesionesmacroscópicas bien diferenciadas (queson la adenomatosis intestinal, la ente-ritisnecróticay la ileítis regional)yunaformaaguda,laenteropatíaproliferativahemorrágica (Gebhart y Guedes, 2001).Estasformasdifierenmuchoensusmani-festacionesclínicas,aunquemantienenlamismalesióndebase,macroscópicamen-tecaracterizadaporelengrosamientodelamucosadelíleony,enmenorgrado,delciego y del colon, y microscópicamentepor la hiperplasia de los enterocitos in-maduros de las criptas (Carvajal y col.,2005a). Además, presenta una terceraforma subclínica, sin diarrea evidenteperoconmayoromenorimpactoenlosparámetrosproductivoscomolosíndicesde conversión, ganancia de peso mediadiariayuniformidadencerdosdetermi-nación(McOristycol.,2007).Tantoelcuadroclínicocomolaobserva-cióndelaslesionesmacroscópicassonin-suficientes para el diagnóstico certero deEPP,porloqueserecomiendaundiagnós-ticolaboratorial,directooindirecto(Law-sonycol.,2000;Carvajalycol.,2005).Enfuncióndel incrementodecasosdeileítisenlacasuísticadenuestrodepartamentoy

surecienteasociaciónconotrosmicroor-ganismoscomoelcircovirusporcinotipo2(PCV2)(Jensenycol.,2006;Machucay col., 2008), nos propusimos establecerunarutinadediagnósticoconfiableyeco-nómicaparaseraplicadaenelserviciodediagnósticohistopatológicoquebrindaelDepartamentodePatologíaAnimal.

MATERIALES Y MÉTODOSSerealizóunmuestreonoprobabilísticodeconvenienciasobreuntotalde61cer-doscondiarrea,deentre8y21semanasdeedad,en21criaderosintensivosde8provinciasdeArgentina.Elmuestreoin-cluyó:necropsia,observacióndelaslesio-nesmacroscópicas,determinacióndelco-lorydelaconsistenciadelasheces,tomademuestrasdelosúltimos10cmdelíleonenformolal10%,raspadodemucosaymateriafecal.Lastécnicasempleadasenmucosaintestinalincluyeronhematoxili-naeosina(HE),WarthinStarry(WS),in-munoperoxidasa(IPX),PCRenmucosayenmateriafecal.Elestudioestadísticoserealizóatravésdelanálisisdecontingenciaparavariablescate-gorizadas,útilesparacomparardosomásvariablescategorizadasdelprogramaInfoS-tatversión2010(DiRienzoycols.,2010).

RESULTADO Y DISCUSIÓNLamayoríadeloscerdoscondiarreamos-traronunaimportantedisminucióndesucondicióncorporalen la totalidadde las

explotacionesloquellevaaunretrasodelaproducciónyheterogeneidaddeloslotes(figura 1).Enesteestudiosepudoverunagranvarie-daddeconsistenciasycoloresdelasheceslocalizadas en el recto. Las diarreas pre-dominantesnofueronlasdescritascomocaracterísticasenL. intracellularis,deco-lorgrisverdosoogriscemento(Carvajaly col., 2005a). Esto podría ocurrir pordiversascausas:variosagentespatógenospuedenestarpresentescomocausantesdeestasdiarreas,pudiendoexistirinfeccionesconcomitantes que modifiquen el colororiginaldeladiarrea,úlcerasgástricas,etc.Porloqueelcolorylaconsistenciadelasheces resultaron inespecíficasynosirvie-ronparacaracterizaraEPP.

Muestras de elección

Las muestras de elección para ser enviadas a los laboratorios de referencia, incluyen:■n Para histoquímica e inmunohistoquímica se remitirá una porción de íleon (2 cm), 10 cm por delante de la válvula ileocecal, en formol al 10% bufferado debidamen-te identificado.

■n Para PCR de mucosa se recomienda lavar la mucosa con una solución fisiológica estéril con la finalidad de disminuir los potenciales inhibidores que se encuentran en la materia fecal (Ladinig y col., 2009). Posteriormente se raspa la superficie de la mucosa ileal con una espátula de plástico estéril hasta obtener una muestra de aproximadamente un 1 cm3 de mucosa, que se introducirá en tubo Eppendorf es-téril correctamente identificado, conteniendo 1 ml de PBS estéril para evitar la des-hidratación. Se debe transportar la muestra refrigerada a 7 °C hasta el laboratorio.

■n Para PCR de materia fecal se debe tomar, con una espátula de plástico estéril, aproximadamente 1,5 ml de contenido intestinal del íleon y colocarlo en el interior de un tubo Eppendorf estéril adecuadamente identificado, que contenga 1 ml de PBS estéril para evitar la deshidratación. La extracción se debe realizar siguiendo las precauciones recomendadas, como en las bacteriologías, para evitar conta-minaciones con ADN extraño (Huerta y col., 2003) y, finalmente, remitir las mues-tras refrigeradas a 7 °C al laboratorio.

Figura 1. Cerdo de 8 semanas de edad con retraso en el

crecimiento y diarrea.

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Enlanecropsia,enelexamenexternodelíleonseobservóunengrosamientodifusode la serosa, conpliegues longitudinalesy transversales engrosados, edematososehiperémicos,queconferíanunaspectoreticularalamisma(figura 2).Elmesenteriodealgunoscerdosseobser-vóengrosado,blanquecinoypresentabaunexudado líquidoalcorte,ademásde

lapresenciadehiperplasia en la cadenaganglionarlinfáticamesentéricaconhipe-remiayedema(figura 3).Elengrosamientode lamucosadel íleonpresentópliegueslongitudinalesytransver-salesque ledabanunaspectocerebroidehúmedoperonomucoso,debidoaledemapresente (figura 4). El estudio estadísticoindicaque el examenmacroscópicopost

Figura 2. La superficie de la serosa se observa reticulada,

edematosa y algo hiperémica.

Figura 3. Mesenterio con edema e hiperemia y aumento

de tamaño de la cadena de ganglios linfáticos (flecha).

Figura 4. Mucosa ileal estriada y con edema en su

superficie.

Figura 5. Cripta ramificada tapizada por enterocitos inmaduros y ausencia de células caliciformes, e infiltrado mononu-

clear en la lámina propia (flecha), HE 40×.

Figura 6. Cripta ramificada con parte del epitelio aún hiperplásico y el resto con hiperplasia de células caliciformes,

indicativo de recuperación y células gigantes en lámina propia (flechas), HE 10×.

mórtem tiene un valor limitado para eldiagnósticodeL. intracellularis,comoin-dicanotrosestudios(Ladinigycol.,2009),apesardeque lapresenciadeedemademesenterio asociado con engrosamientodelíleonesunvaliosoindicativodeEPP,segúnsugierenGuedesycol.(2002b).Laslesionesmicroscópicasencontradasenla tinción con hematoxilina-eosina (HE)

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fueronlastípicasEPPeníleon:atrofiadevellosidades,hiperplasiadelepiteliodelascriptas,criptasalargadasyramificadas,au-senciadecaliciformeseinfiltradomononu-clear;yseencontróasociaciónconlapre-senciadelabacteriaintracelularatravésdedistintastécnicasdiagnósticasaplicadasenmucosayenmateriafecal(figura 5).Ademássedeterminaroncriptasdelamu-cosailealenvíasderecuperación,quesecaracterizanpor lahiperplasiade célulascaliciformes (McOrist y col., 1996), y larespuesta inflamatoria percibida por lapresenciadecélulasdetipomononuclear,célulasgigantesehistiocitosenláminapro-piadelíleondistal,depleciónlinfoideaenfolículosdelasplacasdePeyer,abscesos,cristalesylinfocitosintraepitelialesinfiltra-dosentre losenterocitoshiperplásicosdelascriptasdelamucosaileal(figura 6).Comoeradeesperar,elhechodehallarunaasociaciónestadísticasignificativaentrelapresenciadelesionesmicroscópicastípicasy el hallazgo frecuente de microorganis-mos intracelulares con las característicasmorfológicas y de coloración de la bac-teria L. intracellularis, permitió concluirquelaenfermedadseencontrabapresente(p=0,008)(Rodríguezycol.,2004).ConlatincióndeWarthinStarry(WS)sedetermi-nólapresenciadeunabacteriaintracelularconformadeSsigmoideadecolornegroenlaporciónapicaldelcitoplasmadelosenterocitos inmaduros, de las criptas deLieberkühn(figura 7).AligualqueJensenycol.(2010)conside-ramosquelainmunoperoxidasa(IPX)eslapruebadeelecciónparaeldiagnósticohistopatológicodeinfecciónporL. intra-cellularis,yaquemarcóinsitualantígenobacteriano,revelócambiosenlostejidosypermitiódeterminarlaasociacióndelasbacteriasconlaslesiones(p<0,0001).Seobservóunareaccióndecolormarrónenelinteriordelcitoplasmaapicaldelosenterocitos inmadurosde las criptas, enlosmacrófagosdelaláminapropiayenlascélulasgigantesqueconformanlare-accióninflamatoriagranulomatosaenlamucosadeanimalescon infección(figu-ra 8)ysóloenmacrófagosdelaláminapropiayprincipalmentedelasubmucosa,enanimalesenvíasderecuperación,sinpresenciadeantígenoenlosenterocitos.Cabe destacar la menor sensibilidad deWSenestosanimales,yaquenoproduceningúntipodereaccióndistinguibleenlascélulasinflamatoriasdelamucosaydelasubmucosa.

Variosautorescoincidenenque laPCRdemucosa ileal es tan sensible como laIPX, aún en casos sospechosos de EPPsin engrosamientoo cambios histopato-lógicos visibles (Guedes y col., 2002a).Apesardequeennuestroestudiovariosanimales se encontraron en la etapa derecuperación y no presentaban cambiosproliferativosevidentes,fuecapazdede-tectarlos(p<0,0001),aúnconunnúmero

pocosignificativodereaccióncomosede-terminómediantelaIPX.QuizásporestoesconvenienteutilizarlaPCRenestudiosepidemiológicos, para detectar infeccio-nessubclínicas(Ladinigycol.,2009).AdiferenciadeloexpresadoporJonesycol.(1993a)enesteestudionoseencon-tró una asociación significativa entre lapresenciadeL. intracellularis en lasdes-cargas fecalesy las lesionesproliferativas

Figura 7. Estructuras bacterianas intracelulares con forma sigmoidea o coma de color negro (flecha), correspondientes a

L. intracellularis, WS 100×.

Figura 8. Reacción positiva en glándulas, macrófagos y células gigantes de la lámina propia (flecha), IPX 40×.

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(p=0,1191).LaPCRMFpodríadetectarlaliberacióndeL. intracellularisenanimalesqueestánenfermos,enrecuperación,coninfecciónsóloencolonoquehaningeridoL. intracellularis de heces contaminadaspero que no desarrollan la enfermedad.Losanimalesquelasliberanalargoplazoenlashecessoncerdosinfectadossinsig-nosclínicosaparentes,queactuaríancomoreservoriomanteniendolacargaenelam-biente, loque coincide con lo expresadoporGuedesyGebhart(2003a).Porúltimo,alrevisarlabibliografíaseob-servóquealgunosautores indicabanquelasvariablespodíancomportarsededife-rentemaneraencuantoaloqueaportana la presentación de la enfermedad, porloqueseanalizóquésucedíacuandosóloalgunasvariableseranconsideradas,comoengrosamientode lapared intestinal,au-mentodetamañodelgangliolinfático,to-daslaslesionesmicroscópicaseIHQ.Enestecasoseobservóunaasociaciónsigni-ficativa(p=0,0088),loqueconcuerdaconJonesycol.(1993a),quedemostróasocia-ciónentreunintestinomacroscópicamenteengrosadoylapresenciadecambiosproli-ferativosymicroorganismosintracelularesconunasignificaciónaunvalorp=0,0078.

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Conclusiones

■n Las lesiones macroscópicas en general, el color y la consistencia de las heces no permiten caracterizar la EPP, por lo tanto no pueden ser utilizadas como únicas herramientas de diagnóstico.

■n El aumento de tamaño del íleon, de los ganglios linfáticos y las lesiones microscó-picas proliferativas típicas son una herramienta determinate a la hora de caracte-rizar la EPP cuando son utilizadas en forma conjunta en el examen post mórtem.

■n Los estudios microscópicos se hacen necesarios para dar un diagnóstico pre-suntivo de EPP, ya que dan información sobre la existencia de la enfermedad, la presencia del agente etiológico, la patogenia, la respuesta inflamatoria y la recuperación del tejido.

■n La técnica de WS resultó ser rápida y simple en su desarrollo y permitió identificar, además del agente etiológico, estructuras histológicas, patológicas y la respues-ta celular.

■n La técnica de IPX es la prueba de referencia para el diagnóstico histopatológico de L. intracellularis y permitió identificar diferentes etapas en la patogenia de la enfermedad y diversos grados de infección. Además, permitió determinar la aso-ciación entre la presencia de la bacteria y las lesiones macroscópicas y micros-cópicas. Su aplicación es relativamente sencilla.

■n La técnica de PCR de mucosa ileal permitió identificar animales con poca canti-dad de L. intracellularis en mucosa y su asociación con las lesiones, por lo que su aplicación puede ayudar a determinar infecciones subclínicas.

■n La técnica de PCR de materia fecal dio lugar a la identificación de cerdos que siguieron eliminando bacterias de manera intermitente durante varias semanas.

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