EFERMEDADES RARAS 04/03/15

INTRODUCCIÓN Y GENERALIDADES

Enfermedad rara: enfermedad de baja frecuencia (de baja prevalencia). Afecta a un número limitado (en Europa, menos de 1 de cada 2000 ciudadanos; en USA, 1 de cada 1500; Japón, 1 de cada 2500). Depende del lugar de que se trate. Ejemplo: el ébola es enfermedad rara en España pero no en África.

Tipos de enfermedades raras: entre 6000-8000 enfermedades raras. En España alrededor de 3mll de personas las padecen. Hay muchas personas con enfermedades raras.

Características generales:

- Aparecen con baja frecuencia- Gran número y diversidad de desórdenes y síntomas que varían no sólo de

enfermedad a enfermedad, tb dentro de la misma enfermedad.- La misma condición puede tener manifestaciones clínicas diferentes de una persona a

otra; y hay gran diversidad de subtipos de la misma enfermedad.- La mayor parte son muy invalidantes y crónicas en muchos casos, lo cual supone un

consumo de recursos para los stas de salud importante. Además, pueden generar minusvalías múltiples en una misma persona (por ejemplo, si la enfermedad está relacionada con el DNA).

Origen:

- El 80% son de causa genética (monogénicas y poligénicas)- 20% cánceres raros (todos los cánceres infantiles son enfermedades raras), alergias,

enfermedades infecciosas, intoxicaciones (aceite de colza mezclado con aceites de combustibles, ver), auto-inmunes y causas desconocidas.

Características:

- Enfermedades crónicas graves la mayor parte de ellas.- Manifestación en el nacimiento, durante infancia o edad adulta. La mayoría se

diagnostica en nacimiento o durante infancia.- Muchas ER no tiene tto efectivo (se refiere a etiológico, sobre la causa de la

enfermedad; si es de base genética es muy difícil tratarlo etiológicamente; y muchas veces se desconoce la fisiopatología de la enfermedad). Por ello, la mayoría de tto son sintomáticos.

- Muchas ER no disponen de unas nociones básicas apropiadas sobre el cuidado. Cada vez se sabe más, gracias a las asociaciones formadas de las respectivas ER. En muchos casos se necesitan de trabajadores sociales, entre otros, no sólo de médicos

- Muchas con peligro de muerte.

Son, en general, crónicas y degenerativas, el 65% graves e invalidantes. Se caracterizan por:

- Comienzo precoz en la vida. Importante diagnosticarlo pronto.- Dolores crónicos

- Déficit motor, sensorial o intelectual- Casi el 50% de pronóstico vital en juego.

Curiosidades: la ER más rara es la de Refsum (en su forma infantil) y las de mayor prevalencia es la espina bífida y síndrome de Down.

Cálculo de prevalencia: ver diapositiva

Medicamento huérfano: aquellos que la industria farmacéutica no va a producir porque no es negocio. Son medicamentos que sirven para curar o mejorar el pronóstico de la enfermedad pero no se comercializa por no ser rentables económicamente para quien lo fabrica. En la UE hay unos 80 fármacos reconocidos de este tipo que curan enfermedades. En España sólo hay 40 disponibles de estos 80. Desde la Comisión Europea y EMEA hay algunos incentivos para favorecer la disponibilidad de estos medicamentos.

Marco sociológico:

- Número limitado de pacientes- Pacientes dispersos geográficamente- Pacientes sin diagnóstico (sin gen candidato, sin test diagnóstico,...). Hay ER que se han

descrito recientemente o aún no, con lo cual, si el médico no conoce no puede diagnosticarlo.

- Escasez de conocimiento.

Principales problemas de quienes padecen una ER:

- Falta acceso al diagnóstico- Falta a la información y de conocimiento científico.- Problemas de integración social, laboral y escolar.- Falta de apropiada calidad del cuidado de salud.- Alto coste de medicamentos, si existen; y del cuidado.

Problemas institucionales:

- Falta de políticas sanitarias específicas para ER- Dificultades en la asistencia sanitaria (falta especialización, diagnóstico, ttos

inadecuados, pérdida confianza en el sta sanitario).- Investigación escasa y dispersa en los laboratorios de la UE.

Objetivos de la UE:

- Mejorar reconocimiento- Etc

Estrategia de ER en el sistema nacional de salud: diapo

EL CIBERER: diapo

09/03/15

DEFICIT ALFA-1 ANTITRIPSINA

Orígenes:

Descrito en 1963 por Laurell y Erikson. Desarrollaron una técnicapara hacer proteinogramas en papel para aplicarlo en el diagnóstico. Pusieron a punto una técnica y recibieron alrededor de 1500 muestras de diferentes países. De ellas, en 5 había en una sección del proteinograma una pérdida de una banda. Miraron la historia clínica de esos 5 pacientes y vieron que se caracterizaban por el desarrollo de un enfisema temprano (en edad, 35-40 años) y además tenían antecedentes en miembros de su familia. Por tanto, establecieron las ppales características clínicas de la enfermedad (ver pdf).

Alfa-1 antitripsina:

Inhibidor serin-proteasas Se sintetiza ppalemente en hepatocitos. Inhibe la elastasa secretada por los

neutrófilos. Si la elastasa llega al pulmón, produce varios problemas. El déficit de la alfa se produce porque se acumula en el hepatocito dando lugar a inflamación crónica (puede producir cirrosis y cáncer hepático) y además al no llegar al pulmón, la elastasa no es inhibida, dando lugar a los distintos problemas (enfisema).

Inhibidor de proteasas más abundante Reactante de fase aguda. Tras proceso inflamatorio, infeccioso y tumoral, sus niveles

aumentan hasta 5 veces, lo cual hace que a la hora del diagnóstico suponga un problema, porque hay retraso de diagnóstico al no ser detectado como su forma normal, se confunde con proceso inflamatorio, tumoral o infeccioso.

Genética y biología:

Herencia autosómica co-dominante Muy polimórfico: + de 100 alelos identificados 14q32.1: proteasa inhibitor locus (SERPIN) Alelos PI: M (normal) S y Z (alelos deficientes. El Z es el de peor pronóstico (alelos ZZ)

Plegamiento y actividad:

Cuando están las mutaciones, se van produciendo polímeros de moléculas de alfa-1 que quedan retenidos en el hepatocito e impide que salga al exterior. Problema en el hígado por acumulación y en pulmón por no llegar e inhibir la elastasa.

Gráfica niveles alfa y tipos Pi:

Mayores niveles de tipo MM, menor de MS y solapamiento elevado con MM. Conforme se elevan las Z, aumenta el riesgo de enfermedad pulmonar y/o hepática. Los ZZ, entre el 80-100% con este fenotipo acaba desarrollando la enfermedad pulmonar/hepática. La interacción entre medio ambiente y el gen es elevado, pues con un fenotipo ZZ y un fumador, la

enfermedad se dispara. Los null-null son pacientes que no expresan la proteína. Por debajo de unos 100mg en serum, hay problema igualmente, independiente del fenotipo.

Origen de la mutación:

Parece, según estudios poblacionales, que todo empezó en la península escandinava. A partir de las difernretes migraciones de los vikingos, fueron transmitiendo la mutación.

Epidemiología:

Problema del infradiagnóstico, común en las enfermedades raras. Sin diferencia de sexo En España hay 7mll alelos S, 1mll de Z, etc. sólo hay diagnosticados un 0.10% de los

casos esperados.

Diagnóstico: recomendaciones, en casos de

- EPOC- Adultos broquiectasias- Familiares cosanguíneos de pacientes diagnosticados- Etc...

Modo de diagnóstico: si niveles normales, muy probable que no haya déficit; si son inferiores a valor de referencia, se pide un fenotipo (proteinograma). Si son valores menores del 35% de normalidad y el fenotipo es ZZ, esta claro. Si salen otros fenotipos se determina el genotipo. Si estan por arriba del 35%, si el fenotipo corresponde a uno de los mayoritarios, pues ya esta, si no son esos se hace el genotipo.

Tratamiento:

- Similar a la EPOC: broncodilatadores y esteroides- Administración de AAT exógena: intravenosa, inhalación (hay ensayos clínicos en la

actualidad) o terapias para inhibir la elastasa- Nuevas terapias: génica

PROYECTOS CON DAAT

TERAPIA GÉNICA DAAT: experimento realizado por el invitado

- Diseñaron herramientas para terapia génica: transferir genes a las células (ratones) utilizando lípidos y polímeros catiónicos, evitando usas virus para no introducir genoma vírico que no se sabe dónde se va a introducir.

- A partir de un plásmido (pTG7101, el más eficiente) se hicieron una serie de modificaciones eliminando la mayor cantidad posible de DNA extraño para introducirlos en las células.

- En las distintas curvas dosis-respuesta se estableció la dosis de plásmido óptima para el tratamiento.

- En ratones funcionó muy bien. Se está intentando con cerdos.

- Otro sistema: introducir el plásmido libre de liposomas y polímeros, lo que se conoce como inyección hidrodinámica.

Estrés oxidativo y DAAT: otro proyecto

Si la balanza es favorable para ROS, se produce estrés oxidativo y los radiales libres se unirán a lípidos, DNA, proteínas, etc., oxidándolas y dando lugar a la base del estrés oxidativo.

No obstante, algo de estrés oxidativo es necesario en nuestras células, para determinados procesos, como por ejemplo, la defensa de algunas infecciones bacterianas.

Hay diferentes fuentes de estrés oxidativo (mitocondria, procesos inflamatorios, polución, humo de tabaco, etc.)

El estrés oxidativo está implicado en muchas enfermedades, pero en el AAT todavía no estaba descrito. Se sabía que causaba problemas hepáticos y pulmonares. En su proyecto de investigación se pidió información de pacientes diagnosticados de DAAT (problemas de infradiagnóstico y gran variabilidad en la gravedad del enfisema). Contaban con evidencias (pdf).

Vieron un artículo de un grupo chileno que metían elastasa en el pulmón del hámster y de la rata. El hámster desarrollaba un enfisema muy severo pero la rata no. Se plantearon que si puede que esté pasando lo mismo en los pacientes, si gente desarrolla enfisema más grave y otros menos, independientemente del fenotipo. Podría ser por el estrés oxidativo.

Pacientes con un fenotipo tienen mayor estrés oxidativo que otros con el mismo fenotipo? Había diferente comportamiento en el ciclo de glutatión entre la rata y el hásmter.

Por tanto, colaborando con diferentes servicios de pediatría en Valencia, obtuvieron muestras de pacientes niños diagnosticados con DAAT, en ppio sanos (criterios de inclusión) y excluyeron otros con diferentes características que aumentan o modifican el estrés oxidativo (pdf). En la tabla se ven las pruebas y características que confirman que son niños clínicamente normales y que lo que se observa luego no es debido a diferencias.

Se obtuvo el perfil de estrés oxidativo: GSSG/GSH, 8-OHdG (marcador oxidación del DNA), MDA, carbonilación proteica y proteínas oxidadas.

- Los niveles de glutatión total y el reducido disminuían conforme aumentaba el riesgo de la enfermedad. En el glutation oxidado no se ven diferencias significativas; y el cociente GSSG/GSH aumenta conforme aumenta el riesgo. Si esto es así, las proteínas oxidadas deberían estar aumentadas:

- El MDA aumenta con el riesgo mayor, las proteinas oxidadas tmb y el 8-OHdG también.- La glutatión reductasa permanece igual, la catalasa disminuye, etc (pdf).- Puesto que la catalasa disminuye, cabe esperar que el agua oxigenada aumentaría, y

es lo que ocurrió

Conclusión: la acumulación de agua oxigenada (por disminución/lentitud actividad de catalasa, o superoxido dismutasa aumentada/rápida), los bajos niveles de glutation reducido hace que se acumule marcadores de estrés oxidativo. El agua oxigenada, además de poder producir

estrés oxidativo, esta involucrada en dif procesos de señalización celular, lo cual tmb podría estar afectando a rutas celulares.

Otro estudio: De esos niños se obtuvo también el aire exhalado que mediante un sistema de condensado se puede medir determinadas sustancias. Vieron la 8-OHdG CAE (marcador de estrés oxidativo) y vieron en los niños que aumenta, pero en adultos no ocurre (hay más factores de confusión: alcohol, tabaco, etc).

Otro proyecto: el estrés oxidativo está relacionado con el acortamiento de los telómeros.

Por tanto, es posible que pacientes con mayor riesgo de DAAT podría producir acortamiento de los telómeros. En diferentes publicaciones sobre EPOC y telómeros se ve esta relación, con DAAT?

Hipótesis: a mayor riesgo (alelos Z), mayor estrés oxidativo y mayor acortamiento de telómeros.

La expresión del mRNA de la telomerasa disminuye con el aumento de riesgo DAAT. También la actividad telomerasa disminuye conforme aumenta el riesgo (aparición de alelos Z). Al medir la longitud de los telómeros tmb se observa cierta disminución conforme aumenta el riesgo.

Otro proyecto: análisis microRNAs circulantes en los pacientes, para ver si sirve como marcador pronóstico de la enfermedad. Estos microRNAs provienen de la destrucción hepática y pulmonar

Hipótesis: si en los pacientes con más riesgo y riesgo intermedio hay daño por oxidación, es posible que haya diferencia a nivel de microRNAs entre éstos y los pacientes control.

El análisis de componentes ppales permite establecer una serie de grupos, aún con un grupo bajo de pacientes. En el Hillmap? Hay una serie de microRNA (marcadores) que están diferencialmente expresados con respecto al resto de pacientes. Se quiere hacer el mismo estudio en adultos (pues no se va a esperar a que los niños crezcan) con DAAT y enfermedad hepática pulmonar y sin DAAT con enfermedad hepática y pulmonar y comparar.

10/03/15

MODELOS INVERTEBRADOS PARA EL ESTUDIO DE ENFERMEDADES RARAS

Qué es una ER: enfermedad de baja prevalencia, hay muchas y cada una de ellas tiene pocos pacientes. La mayoría son de origen genético (puede ser útil usar modelos más baratos como rata/ratón, peces, y otros más asequibles, como invertebrados).

Estrategia SNS en EERR: investigación: importante el desarrollo de modelos celulares y animales distintos al ratón.

Los 2 ppales invertebrados que hay en estudios fisiopatológicos son C. elegans y G. melanogaster.

C. elegans:

Tiene exactamente 959 células somáticas. Dentro de la simplicidad, es lo bastante complejo como para poder estudiar

fisiopatologías (tiene epidermis, ap. digestivo, etc). Ciclo vital de 3 días, lo cual permite tener muchas generaciones en poco tiempo

(importante si se hace genética) Linaje celular invariante, importante para estudiar desarrollo embrionario Interferencia de ARN (ARNi) por plásmidos en la dieta. Se puede poner al gusano un

ARN complementario al ARN de uno de sus genes, apagando su expresión. Estos gusanos pueden comer determinadas bacterias que portan este ARNi y es capaz deincorporarlo y apagar su ARN.

D. melanogaster:

Modelo de estudio en genética, genética depoblaciones y evolución, para embriología, comportamiento, neurología y además, se esta extendiendo para estudiar características patológicas (por ejemplo, cáncer).

Ciclo vital de 10 días, lo cual favorece para hacer genética. Cierta complejidad biológica y muchos procesos celulares y moleculares son

comparables a sus equivalentes vertebrados. Aporta versatilidad experimental por la facilidad de trabajo y técnicas. El 70% de los genes responsables de una ER en humanos tiene un gen equivalente

(ortólogo) en Drosophila.

Repaso histórico con melanogaster:

Thomas Hunt Morgan empezó a trabajar con ella en 1907. Demostró que las leyes de Mendel eran válidas en animales.

El primer mutante encontrado fue white (w). Vieron que segregaba con el cromosoma X, por tanto fue el primer mutante que se pudo asignar a un cromosoma (en este caso el X).

Sturtevant (estudiante de Hunt) elabora el primer mapa genético, atendiendo a la probabilidad de recombinación según las distancias. Así se pudo ordenar los genes en los cromosomas.

Morgan descubrió el efecto mutagénico de los rayos X, lo cual contribuyó a una herramienta para crear mutantes.

Genes homeóticos: una parte del cuerpo se transforma en otra diferente. Hay una serie de mecanismos celulares y del desarrollo temprano comunes entre los vertebrados y la mosca.

Sistema inmunitario: vertebrados e invertebrados compartimos mecanismos de inmunidad innata.

Ventajas experimentales:

1. Herramienta 1: Cromosomas equilibradores (balancer). También están en C. elegans. Nos permiten crear cepas estables con mutaciones severas o letales y simplifican la genética. Ejemplo: si tenemos una mutación letal, si está en homocigosis el modelo de experimentación (ejemplo, ratones), muere. No interesa esto porque al cabo de las

generaciones, nuestra mutación se pierde. Con esta técnica se puede mantener el gen letal (se pone el gen letal en distintas zonas de los dos alelos, ver).

Hay trucos para poder ver las mutaciones a la lupa, sin necesidad de acudir a genotipados (mediante marcas visuales, como genes).

2. Herramienta 2: Transgénicos. El elemento P es un transposón natural de Drosophila, que se usa como vector de transformación. Trucos para hacer selección de cepas que han incorporado el elemento P con la mutación de interés (parecido a la incorporación de genes mediante plásmidos en bacterias). Proceso barato, rápido (pocas generaciones para seleccionar transformantes y tener cepas estables), alta eficiencia (10-20% de los inyectados producen progenie transformada).Los elementos P se usan para introducir cosas de interés y como mutágeno.

3. Técnica 1: clones somáticos por recombinación mitótica. Permite evitar la letalidad del organismo al crear un grupo de células mutantes que no afectan a la vitalidad del organismo y se pueden visualizar mediante técnicas de selección (ejemplo, GFP).

4. Técnica 2: el sistema GAL4-UAS para expresión dirigida. Para expresar el gen que queramos y en el lugar que queramos. Hay muchos genes que son específicos de un órgano y no se pueden expresaren otroslugares. Por ejemplo, el Glass se expresa sólo en el ojo. Si queremos expresar un gen que quiera en el ojo, se le puede poner el promotor de glass delante de nuestro gen, así se expresará en el ojo al realizar una inyección transgénica. También se puede hacer en dos pasos, creando dos transgenes (ejemplo, con GAL4, proteína de levadura que es un factor de transcripción que se une a su promotor (UAS). Al poner la GAL delante del promotor de Glass y al lado UAS y seguido el gen de interés, bla bla ver). Caso práctico (elav-Gal4 UAS-ParkDN): moscas que expresan Gal4 en todas las neuronas (SNC y periférico) con un gen mutante dominante de parkina. Aquellas que incorporan estos genes, no vuelan.Caso práctico (dpr-Gal4 UAS-mitoGFP): para ver cómo se mueven las mitocondrias. El dpr se expresa en nervios periféricos y se le ha metido una forma de la mitocondria GFP, de manera que lo que se observa en verde son mitocondrias y además se puede seguir su movimiento, pues la mosca está viva.

5. Técnica 3: rastreos genómicos. Para identificar genes implicados en un proceso determinado. Ejemplo: Rastreo de intensificadores o supresores: estudio de neurodegeneración (neuronas en el ojo de la mosca). Atendiendo al fenotipo del ojo (rugosidad), tenemos un fenotipo normal (no rugoso), otro moderado (algo rugoso) y otro severo (muy rugoso). La función neural esta muy bien conservada, no sólo en Drosophila, sino en más invertebrados. Por ello es un buen modelo para el estudio de enfermedades neurodegenerativas, tanto del SNC como del periférico.

NEUROPATÍA DE CHARCOT-MARIE-TOOTH

Afecta a los nervios de extremidades, con pérdida de masa muscular, deformación en pies y manos y más tardíamente con fallos en esqueleto debido al fallo muscular.

Hay formas de la enfermedad desmielizantes (CMT1: desmielinizante) y luego el axón muere y otras formas mielinizadas (CMT2: axonal) pero que el axón muere. Ello provoca la pérdida del nervio. Además, hay formas intermedias de CMT y dentro de todas estas formas, hay varios genes mutados que pueden causar la enfermedad.

En Drosophila hay un buen candidato equivalente al gen GDAP1 humano (uno de los posibles genes que su mutación afecta a la enfermedad). Han trabajado con este gen en la mosca, sobreexpresándolo o infraexpresándolo/bloqueándolo (con RNA interferencia) y viendo su efecto en la morfología de axones en el ojo de la mosca. Al expresar el gen humano en el ojo de la mosca, la función se reestablecía, lo cual confirma que tienen la misma función.

Importante: Saber por qué Drosophila es un buen modelo de estudio.

11/03/15

ENFERMEDAD DE LAFORA Carlos Romá

1. Qué tiene de raro la enfermedad de Lafora?

En 1911 Lafora se encontró con un adolescente que murió y había sufrido alguna serie de epilepsias. Post-mortem vio que neuronas suyas tenían unos acúmulos a los que llamó cuerpos amiloides (se sabe que es glucogeno). Se preguntó si era esto la causa de esa serie de epilepsia. Hoy en día aún hay dudas sobre si estos cuerpos son los causantes o no.

Características:

- Se llama epilepsia mioclónica progresiva (EPM) de tipo Lafora. - Prevalencia 1/106 habitantes.- Cursa con una serie de crisis epilépticas, mioclonías (sacudidas descontroladas), ataxia,

alucinaciones visuales, demencia. - Debut en la adolescencia. Tras 10 años de la primera crisis mueren.- Acumulación de cuerpos de Lafora (los cuerpos amiloides que llamó el propio Lafora),

vistos tras tinción específica de los cuerpos. Si aparecen, está claro el diagnóstico (por biopsia de piel)

- Neurodegeneración progresiva y rápida.- También se acumula en músculo y en piel, hígado, corazón, etc., no solo en las

neuronas. Los cuerpos se acumulan dentro de las células por todo el citoplasma, de tipo filamentoso.

2. Causas

Primer sospechoso: Laforina

- Proteína familia fosfatasas de tirosina. Crítico en señalización intracelular. Hay 4 tipos y dentro de ellos varios subtipos, algunos de ellos desfosforilan no solo tirosina. Laforina entra dentro del subgrupo llamado “atípicas”.

- Laforina tiene un núcleo catalítico conservado pero con dominios accesorios, entre ellos un dominio unido a carbohidratos único. desfosforila carbohidratos complejos (glucógeno, almidón, etc) que no hace otra fosfatasa.

- El glucógeno en estado normal tiene cierta solubilidad. Va incorporando fosfato y Laforina le va quitando ese fosfato. Cuando no está la Laforina, el fosfato impide la ramificación, siendo más insoluble el glucógeno y formándose esos cuerpos. Pero no sólo queda ahí, pues al ver si el gen de Laforina estaba mutado en esos casos, no en todos estaban mutados.

Segundo sospechoso: malina

- Con dominios NHL para interacción con otras proteínas- Es una E3 ubiquitina ligasa (importante para la degradación de proteínas, al unirse a

éstas las moléculas de Ub)- Ubiquitinación: proceso secuencial que depende de 3 tipos de enzimas. Es un proceso

altamente selectivo, pues en cada paso intervienen más enzimas porlo que es cada vez más específico. según cómo se pegue la Ub a las enzimas, la función final será distinta.

Laforina y malina forman un complejo funcional, interaccionan físicamente. Laforina recluta sustratos que son ubiquitinados por malina. A veces malina ubiquitina a Laforina y a sí misma. Laforina hace que los sustratos se acerquen a malina para que la ubiquitine, de esta forma malina puede ubiquitinar a más sustratos, de forma que son llevados al proteasoma o autofagia para ser degradados.

La glucógeno sintasa están reguladas por otras proteínas. Se vio que Laforina y malina juntas degradaban proteínas que conducen a la síntesis de glucógeno (glucógeno sintasa, por ejemplo). Si no hay Laforina y/o malina, el glucógeno no se degrada y éste se acumula dando lugar a esos cuerpos.

La interacción entre laforina y malina se ve facilitada cuando hay activación de AMPK (quinasa). Se comprobó que laforina era fosforilada en un aa concreto (Ser25), haciendo más estable el complejo lafora-malina, lo cual hace que funcione mejor. Recordar que si no hay laforina, el glucógeno se acumula.

3. Filogenia molecular como estrategia en el estudio de ER

Está conservado en la evolución el complejo laforina-malina? Muchos organismos quetienen glucógeno o algún carbohidrato complejo tiene laforina en su organismo. Por ello, se está diciendo que su función es ancestral. La pregunta es si esos mismos organismos también tiene malina, y si pueden tener la enfermedad de Lafora. Se vio que malina solo está en vertebrados, como complejo laforina-malina (laforina en otros organismos), por tanto la enfermedad sólo se da en vertebrados.

Malina está relacionada filogenéticamente con TRIM32, que es otra E3 ubiquitina ligasa y esta mutada en otra enfermedad rara (distrofia muscular Limb-Girdle). Por ello, intentaron

averiguar si a nivel funcional también se parecían, no sólo en la secuencia. Lo que vieron es que hay algunas mutaciones en malina en una región en concreto que daba enfermedad también en el caso de TRIM32. Por tanto, estas dos proteínas están emparentadas.

Además, se vio que malina también regulaba la actuación de micro-RNAs (silenciamiento de genes).

4. Mucho más que glucógeno

Se empezó a ver que en los cuerpos no solo habían acúmulos de glucógeno, tmb habían sustratos con ubiquitina, chaperonas, etc. Se empezó a pensar que tmb se podría acumular proteínas mal plegadas. Vieron que había estrés de retículo endoplásmico. Si no funciona bien el RE, el plegamiento de proteínas se ve afectado.

También se pensó si la ruta de autofagia también estaba afectada, ya que hay acúmulo de sustancias. Hay varios tipos de autofagia, una de ellas mediada por chaperonas. La ubiquitina tmb tiene mucho que ver con este proceso.

5. Técnicas y modelos experimentales de enfermedad de Lafora

Hay ratones que tienen o bien mutada laforina o bien la malina (ratones LD).

Hay cultivos celulares que provienen de enfermos: fibroblastos humanos LD.

Análisis proteómico en ER: electroforesis bi-dimensional (2D-DIGE). se analizó la expresión en tejidos de ratones KO para laforina y para malina (tres grupos: uno normal, uno sin laforina y otro sin malina).

El estrés oxidativo también está involucrado. Al hacer estudios se vio que había alterada una proteína de membrana de mitocondrias. La disfunción mitocondrial podría tener que ver con los fallos en la autofagia, lo cual puede afectar a la acumulación de glucógeno y otras sustancias. Por otro lado, la autofagia se incrementa cuando hay aumento de estrés oxidativo. Si hay aumento de radicales libres y falla la autofagia o la ruta de proteosoma, vamos mal apañados.

6. La enfermedad de Lafora. HOY

Se ha resuelto la estructura de laforina.

12/03/15

ESTRÉS OXIDATIVO EN EL SÍNDROME DE DOWN

Características generales:

Es de las menos raras. Lo primero que se ve es el fenotipo de la persona que lo padece, es fácil de reconocerlos debido a las características que poseen.

Es la ppal causa congénita de retraso mental de todas las de origen conocido. La causa genética es la presencia de un cromosoma extra en el par 21 (trisomía 21).

La prevalencia es de entre 1-5 casos cada 10000 habitantes. En los últimos años ha ido disminuyendo debido a la interrupción del embarazo al detectarse.

Tipo de herencia esporádica. No es hereditaria. La edad de inicio es desde antes de nacer.

Historia:

Primer dato que se obtiene es un craneo sajón del siglo VII con malformaciones compatibles con un varón con este síndrome

En el XVIII, en un cuadro aparece que uno de los niños tiene unos rasgos físicos típicos de esta enfermedad.

El primer documento escrito es en 1838, se describe un síndrome como “cretinismo” o “idiocia furfurácea”. En 1866 se describe algunos de los raasgos físicos en otro texto. En ese mismo año, John Langdon Haydon Down tmb describe diferentes observaciones en un grupo étnico de retrasados mentales. Ya es en 1932 cuando se empieza a hablar de la etiología cromosómica pero fue en 1959 cuando ya se confirma la aberración cromosómica causante del fenotipo especial. Aún así se seguía llamando a estas personas “mongólicos”, por la similitud con las personas de esta raza (ya los llamaba así John H Down).

Adelanto en investigación: Hace menos de un siglo, la esperanza de vida era de 9 años. En la década de los 80 pasa a 40 años. Casi en el siglo XXI pasa a 60-64 años.

Mayor mortalidad en los primeros años de vida (infecciones respiratorias, por su sta inmune disminuido; mayor riesgo de leucemia o malformaciones congénitas). Al llegar a la edad adulta, estos pacientes tienen menor incidencia de padecer cáncer que las personas sin laenfermedad.

Alteraciones genéticas:

Trisomía cromosoma 21 en todas las células (presencia en una copia extra o parte del cromosoma 21.

Tipos: 95% es completa, el 1% es mosaicismo; 4% traslocación

Trisomía Libre o completa: todas las células con 47 cromosomas

Causas multifactoriales: entre todas, como el envejecimiento del material genético, la más significativa es la edad de la madre (sólo en 15% de los casos el error se produce en el espermatozoide). Esta trisomía es compatiblecon la vida, en la mayoría de trisomías en otroscromosomas, no sería compatible con la vida, por eso no los vemos.

Mosaicismo:

Es a partir de la segunda división cuando hay un error. A partir de esas células, aparecerán células con 46 cromosomas y otras con 47. El fenotipo y las alteraciones son menos agresivas que en la trisomía completa. Dependerá de la cantidad de células o línea celular afectada.

Traslocación:

El número de cromosomas es normal pero el cromosoma 21 o parte de él se pega a otro cromosoma, normalmente al 14. Lo que está repetido es la información genética. Puede ocurrir que alguno de los progenitores lleve la traslocación pero no lo sepa. El hijo que herede latraslocación del cromosoma 14 y sólo uno 21 será portador sano y no lo sabrá. El caso en que el hijo tenga el 21 de la madre y el 14 con traslocación del padre...

Causas:

- Familias con miembros con algunos caracteres aislados del síndrome- Enfermedades infecciosas, crisis morales, psíquicas durante primeros meses de

gestación- La edad de la madre. Esta es la causa más probable.

El cromosoma 21: se sabe que se trata de este cromosoma pero no se sabe cómo se produce.

- Se dice que es por el efecto de gen-dosis. A mayor expresión, mayor número de proteínas, se ven alteradas varias vías metabólicas lo cual induciráalteraciones en desarrollo de órganos y tejidos. El órgano quemás interesa es el cerebro (SNC).

- No existe anomalía en ningún gen sino la presencia de copias de genes normales (mayor cantidad).

- El crom21 es pequeño (ocupa sólo el 1.5% del genoma humano), por ello de la altaviabilidad de la trisomía en este cromosoma.

- Genes en el cromosoma 21: 288500 pb en el brazo corto y 33,5 mll en el largo. En total son casi 300 genes (225). Los genes del brazo corto, su triplicación no afecta a la producción de los efectos del SD. Los del brazo largo sí afecta. En el brazo largo hay genes relacionadoscon producción de E en mitocondrias, los que metabolismo de las especies reactivas del O2, procesamiento de RNA, vía del proteasoma, metabolismo monocarbonado y metilación, etc., muy variado. De todos lo genes codificados en el crom21, hay varios (110-150) que se expresan en el SNC.

- El crom22 codifica casi 600 genes y el 21 sobre la mitd, aunque sean casi del mismo tamaño. Por eso se dice que el crom21 tiene como un desierto, por ello que sea más viable este error en este cromosoma que en otro.

- Lo que nos interesa más en esta clase es sobre los Genes del crom21 que intervienen en producción de E en mitocondrias, los que metabolismo de las especies reactivas del O2.

Modelos animales:

- Zona crítica responsable del fenotipo SD en humanos: lugar donde está el gen regulador de la calcidiurina? (DYRK1A)

- Se vio que había una zona del cromo16 del ratón con una región similar a la región crítica del SD. Se inventó un ratón transgénico donde se triplica sólo una parte del crom16, la que corresponde a la parte crítica en humanos

- Los ratones Ts65Dn (uno de los trasngénicos) tienen caracterrísticas muy similares a los humanos con SD. Pero en los ratones no aparecen cardiopatías congénitas (típico en SD). Por tanto se intenta mejorar un ratón transgénico. Cogieron un crom21 humano y se introduce en el genoma del ratón. A partir deahí se genera un ratón que

expresa genes humanos en el crom21. Seproducen alteraciones cognitivas, cardíacas, alteración en las neuronas, en el desarrollo. Pero estamos en un caso de mosaicismo (no todas las células han incorporado el crom21). Es el modelo más aproximado que sepuede usar para el estudio de SD (ratones trasncromosómicos)

Diagnóstico prenatal del SD:

- Primera prueba es con sangre. Se miden diferentes parámetros. Pero hay muchos falsos positivos. Y apenas falsos negativos.

- Al detectar un positivo se debe confirmar (porque hay falsos positivos). Hay una serie de pruebas, la más común es la amniocentesis (menos tasa de abortos espontáneas). Hay otra, biopsia de vellosidades coriónicas (se puede hacer más pronto); y hay otra llamada corocentesis (sangre del cordón, mayor tasa de abortos espontáneos).

- Si no se diagnostica prenatalmente, se puede confirmar sacando sangre del feto y haciendo cariotipo.

- También en la ecografía miden el pliegue de la piel en el cuello (muchos falsos positivos)

Rasgos fenotípicos:

Hay más de 100 rasgos que pueden aparecer, pero no todos los va a tener todas las personas ni en la misma probabilidad. Sí que hay 3 cosas comunes (que no se detectan en el momento del nacimiento)

- Retraso mental- Retraso en crecimiento- Hipotonía muscular (flacidez casi desde el momento del nacimiento)

Otros signos fisiológicos:

- Baja estatura- Cuello corto- Pliegue en el cuello- Cara plana, nariz poco prominente, narinas anchas y hacia arriba- Apertura de párpado hacia arriba y hacia fuera- Lacrimales más estrecho (tendencia a obstrucción)- Manchas de Brushfield alrededor del iris, blanquecinas- Poco pelo y fino- Boca, maxilar y dientes pequeños- Abdomen flácido (susceptible de hernias)- Tronco recto- Testículos pequeños en niños y lívido disminuida- Labios vaginales de gran tamaño, clítoris grande y mamas desarrolladas tarde, la lívido

no esta disminuida y son capaces de concebir.- Manos y dedos pequeñas. Único pliegue palmar. También de los pies.

Alteraciones patológicas:

- Alteraciones cardiovasculares. Más del 40% de los casos padecen cardiopatía congénita. La más común es la comunicación interventricular. Tto quirúrgico, farmacológico o ambos.

- Hematológicas: mayorriesgo de leucemias en niños. Si se diagnostica pronto, la mayoría es curable

- Endocrinológicas: enfermedad tiroideas- Respiratorias: infecciones leves que les lleva a desarrollar cuadro grave (sta inmune

débil, etc).- Oftalmológicas: cataratas en niños, queratocono en la pubertad- Auditiva: disminución- Intestinal: estenosis duodenal- Dentales- Neurológicas: convulsiones, síndrome de West, alzheimer temprano

Por todo ello, aparece envejecimiento prematuro. Se considera progeria.

Alteraciones cerebrales:

- No por tener mayor número de rasgos fenotípicos tendrá mayor retraso mental. La intensidad de la alteración cerebral no guarda relación con la de otros órganos.

- Menor nº de neuronas y de su funcionamiento- Tamaño cerebelo pequeño e hipoplásico.- Importante el aprendizaje desde el principio, pues pueden hacer lo mismo que el resto

de personas, aunque más lento.

ESTRÉS OXIDATIVO Y SD

Definición de estrés oxidativo: más radicales libres que sistemas antioxidantes.

Se pueden generar en la mitocondria. Entre el 1-2% del O2 que atraviesa la mito acaba formando radicales libres, que luego reacciona con compuestos con hierro formando radicales hidroxilo. También en sistemas enzimáticos se pueden producir radicales libres.

Si no son neutralizados atacarán a todos los componentes celulares del organismo (glúcidos, lipidos proteinas, acidos nucleicos) alterando su función. Los mecanismos que contrarrestan estos radicales libres son: sistemas biológicos, enzimáticos y no enzimáticos).

Enzimas antioxidantes:

- Primer paso de detoxificaicón realizado por la superóxido dismitasa (una citosólica y otra mitocondrial). Darán agua oxigenada que será eliminada por catalasa o glutatión peroxidasa. Una molécula de glutatión se oxidará para reducir el agua oxigenada.

- Genes del crom21 relacionados con esta función, generan radicales libres. Además uno de estos genera alzheimer, patología que por sí sola tmb genera radicales libres. Esto lleva a un aumento en el estrés oxidativo.

- Además, sus células tienen mayor susceptibilidad a la apoptosis.- Glutation oxidado y actividad telomerasa aumentada.

Diseño Experimental:

Estudio “in vivo”

- Sangre de 38 niños con SD (4-13 años de edad). Los controles fueron 16.- Determinaciones de liberación de citC (esta en la mitocondria) y niveles de p53.- En pacientes de SD el citC en plasma era mayor que en controles (salía de la

mitocondria)- El p53 retiene el ciclo celular si hay daño en DNA. Se vio en los leucocitos mayor

expresión de p53 en SD.- Estos dos parámetros aumentan la apoptosis en pacientes de SD.

Estudio “in vitro”

- Cultivo de fibroblastos.- Se quiere ver si el glutation influye en la proliferaciónd e fibroblastos.- Se observó la incorporación de BrdU en el DNA para saber las células que proliferan y

las que no. Los fibroblastos de fetos con SD proliferan menos que los controles.- Relación entre acortamiento de telómeros y envejecimiento. El telómero era más

corto enfibro de SD. Por eso estas células proliferaban menos, son células más envejecida, dejan de crecer antes.

- Relación entre el acortamiento de telómeros y el estrés oxidativo. Nivel de peróxidos aumentado que loscontroles, cociente GSSG/GSH mayor en SD pero al determinarlos por separado no hay diferencias. Esto indica estrés oxidativo. Ello puede afectar a las proteínas de las células. Se determino las protenias glutationidadas. En la epoca decrecimietno de las celulas estas proteínas eran mayores que en los fibro controles. Las proteinas oxidadas solo se observa dif a los 7 dias de cultivo (celulas ya confluentes), estan elevadas.

- Por qué se produce ese estrés oxidativo? Sistemas glutarredoxinas y tiorreduxinas. La expresión de tio casi esta anulada en SD y la gluta no hay casi diferencias. Si lo que determinamos es la expresión de éstas por western, se ve disminución en la expresión de tio y una disminución a los 7 dias no estad signifi de gluta. Estos sistemas antioxidantes están dañados.

- Qué pasa con la SOD (superoxido dism)? Enzima primer paso de detoxificaicón. Aumento de mRNA y de expresion proteina y la actividad de la SOD que es codificada en el crom21 (la Cu/ZnSOD). La catalasa no varia y la glutation peroxidasa disminuye (mRNA y expresión proteina y actividad). Por ello, se acumula agua oxigenada-estres oxidativo.

- Proteina RCAN (DSCR1) la de calciurina? También es aumentada y actúa disminuyendo un factor de crecimiento endotelial vascular, lo que explicaría el menor porcentaje de tumores sólidos en los de SD.

Si el estrés oxidativo se convierte en agudo por cualquier causa, se produce un acúmulo de daños dando lugar a un fenotipo severo del SD.

23/03/15

DESCUBRIENDO GENES IMPLICADOS EN ENFERMEDADES RARAS

Polimorfismos:

Tres círculos solapados (genoma de tres personas): se ven los cambios comunes entre ellos y los cambios que son diferentes. Hay mucha similitud entre muchos individuos.

Definición:

- Cambio nucleotídico que no afecta al fenotipo (en algunos casos no lo cumpliría, como el caso de fibrosis quística por la frecuencia).

- Cambio con frecuencia de más de 1% en la población general (la más aceptada). - Coexistencia estable de más de un genotipo.

Tipos de polimorfismos:

- RFLPs son los primeros descritos- VNTRs (minisatélites) y STRs (microsatélites). Los quemás se usan actualmente son los

STRs (al trabajar con PCR se puede amplificar la muestra).- SNPs (de única base). Ampliamente distribuidos por nuestro genoma (aprox 54 mll) y

con tasa de mutación muy baja. No obstante, son bialélicos (cambio de una única base, no son muy informativos). Pero la mayoría están muy bien documentados en bases de datos. De muchos de ellos se dispone de su frecuencia en diferentes poblaciones

Diferencias entre los STRs y los SNPs, que son los más usados actualmente (nucleóticdos, tasas de mutación, características). Para los STRs pueden haber diversos alelos mientras que para los SNPs sólo dos. Para afinar (cartografiar bien) se usan los STRs porque son más informativos.

Cartografiado y ligamiento genético:

Cartografiado es la estrategia para identificar localizaciones en nuestro genoma que puedan albergar genes responsables de enfermedades. Para ello se usan marcadores (polimorfismos). Esta técnica aún se sigue haciendo pero mucho menos. La función de mapa marca la relación entre individuos recombinantes frente al número total de individuos. Así se establecen qué regiones en nuestro genoma puede haber un gen implicado o candidatos a ser responsable de una enfermedad. Ver valor LOD (Z):

- Z>3 evidencia ligamiento- Z<-2 ausencia ligamiento

Actualmente, se usa más otras metodologías, como técnicas de secuenciación masiva (NGS), que permiten obtener los resultados en un tiempo mucho menor y más barato. El problema de las NGS es la cantidad de datos que se obtienen (importante bioinformáticos). Además, hay que buscar la mutación que causa la enfermedad y muchas de las enfermedades genéticas son enfermedades raras (mala casuística, pocos individuos con la enfermedad, con ese cambio o la misma enfermedad con cambios diferentes). Aquí cobra importancia las bases de datos, para compartir con otros investigadores que están estudiando la misma enfermedad.

Para estudiar los mecanismos genéticos de una enfermedad, antes se empezaba disponiendo de una familia grande con esa enfermedad se hacía cartografiado, Sanger, etc y era costoso en tiempo y dinero. Ahora se puede empezar el estudio por donde se quiera. Ver significado de *Interactomas proteicos.

Estrategias para identificar un gen (Tabla):

Gen candidato (la forma más sencilla)

Caso práctico niña con niveles altos de ácido urocánico (Mutations in the urocanase...): el gen candidato del que se sospechaba era la urocanasa (pues si no funciona habrá niveles altos del ácido urocánico). Leyeron 2 publicaciones de casos similares y en una de ellas aparece un árbol genealógico con dos hermanas enfermas y muchos casos en la familia y fallecidos. Esto da información sobre que se trata de una enfermedad genética hereditaria. Por ello, interesa buscar mutaciones en un gen. Se buscaron estas mutaciones y se detectaron cambios exónicos (p.R450C). La paciente era heterocigótica para estos cambios (si no moriría). Se hicieron estudios insílicos (de predicción): BLAST (para ver conservación de residuos) y estudios de predicción de la estructura secundaria; también predicción de sustituciones aminoacídicas para ver si el cambio modifica la función de la proteína o la altera. En este caso se vio que la alteraba.

Se realizó un ensayo de la actividad enzimática de la proteína mutada. La mutación altera la función de forma que su actividad no es detectable.

Conclusiones: la deficiencia de urocanasa puede provocar la enfermedad (gen UROC1).

Secuenciación de exoma (WES)

Exoma es el conjunto de regiones codificantes del genoma. Si se secuencian todas las regiones codificantes de un individuo se pueden encontrar mutaciones relacionadas con una patología. Más del 80% de mutaciones patológicas que hoy en día se conocen se sitúan en los exones. Poco a poco las cifras cambian pues este porcentaje depende más de la metodología usada para detectar estas mutaciones. Aun así, aún se estudia el exoma pues es muy difícil barajar tantos datos.

Caso práctico: familia con forma concreta de Fenotipo CMT Axonal (detección de la mutación causal en EGR2 asociado a CMT axonal). Se decidió hacer una secuenciación de exoma. Se busca el elemento común entre los enfermos y si el parentesco de los enfermos es más alejado mejor pues compartirán menos genes de fondo). En esta familia habían 4 enfermos.

Se identifica el gen posible y mediante bases de datos se van descartando aquellos cambios más frecuentes en la población general y otros filtrados. Al final se quedaron con 25 cambios no sinónimos, de los cuales llamó la atención un cambio en el gen EGR2 (implicado en la enfermedad de Charcot). Este gen esta implicado en Charcot desmielinizante (pero enprincipio no en el tipo axonal). Se procedió a confirmar ese cambio mediante Sanger. Se estudió este cambio en individuos sanos y no se encontró. Se realizaron estudio in sílico y ensayos de expresión del gen (expresión menor del gen mutado con actividad alterada). Todo ello llegó a confirmar este gen como agente causal.

Análisis de ligamiento por cartografiado genómico y combinación con la secuenciación de exoma

Al hacer un exoma hay muchos cambios y es difícil encontrar al responsable de la enfermedad. Si además se limita para quedarse con los cambios en una determinada localización (cartografiado), se limita más el estudio y se descartan otros.

Caso: familia con neuropatía hereditaria recurrente. Herencia dominante (transmisión vertical con enfermos en todas las generaciones). Familia consanguínea, no tiene por qué relacionarse con una enfermedad recesiva. Pasos del estudio:

- Descartar los genes que se conocen o aquellos que puedan dar un fenotipo parecido.- Para identificar el gen causal, se hace un cartografiado genómico con 0.5 mll de SNPs). - Se espera encontrar la ubicación aproximada en el genoma del gen que se busca. En

este caso no se obtuvo ni una región en condiciones. - Se hizo la secuenciación de exoma. Se encontró que los 4 pacientes secuenciados

compartían 5311 cambios no sinónimos (y queremos sólo 1). - Filtros en bases de datos y se llegaron a 33 cambios. Uno de ellos, en el gen ABCD1 era

relevante porque esta descrito que esa mutación causa enfermedad. Causa adrenoleucodistrofia. No tenía sentido pero se siguió investigando este cambio.

- Se confirmó el cambio finalmente mediante Sanger. Resultó en un falso positivo, no tenían adrenoleucodistrofia.

- Se siguió investigando otros cambios y uno de ellos co-segregaba bien con la enfermedad. Los sanos no lo tenían y los enfermos sí. Pero el gen no esta relacionado con enfermedad humana hasta la fecha.

- Varios ensayos.

Caso: familia neuropatía hereditaria recurrente.

- Descartar genes que producen cuadros clínicos similares- Cartografiado genómico con SNPs con 3 localizaciones. Una de ellas con Z>3 (evidencia

ligamiento). No se descartan los otros dos, hay que seguir estudiándolos.- Descartar las localizaciones que no son causales. Se mantuvo la del cromosoma 21 (la

del z>3). - Todos los enfermos coincidían en un haplotipo que no lo tenían los sanos. - Combinando el cartografiado y análisis de satélites se acota una región en el

cromosoma 21. - Búsqueda de los genes de esa región que pueden dar cuadro clínico similar al que se

está estudiando. - Se identificaron unos 70 polimorfismos ya descritos y ninguno de ellos producía esa

patología. Podría ser una deleción o duplicación? Tras estudio de sondas tampoco se encontró deleción ni duplicación.

- No se encontró el gen. Qué se puede hacer? Secuencias toda la región candidata (de un SNPs al otro).

En la mayoría de enfermedades genéticas hay mucha variabilidad clínica, pseudodominancia, etc. Esto es por captores genéticos que modulan el fenotipo (modificador genético). Esto llega

a complicar mucho más el estudio de la enfermedad (personas con la misma enfermedad y con perfiles clínicos diferentes, unos más graves que otros, con fenotipos diferentes, etc).

24/03/15

PROGERIAS

Envejecimiento acelerado del organismo.

Tipos:

1. Progeria en el nacimiento o al nacimiento, cuyo exponente fundamental es el Síndrome de Hutchinson-Gilford.

2. Progerias del adulto (o segmentales). Son en principio menos graves, no tienen por qué ser mortales. Se produce un envejecimiento acelerado de algunos órganos, tejidos o sistemas del cuerpo. Ejemplo: síndrome de Werner, de Bloom, etc.

3. Otros con componentes progeroides, como el Síndrome de Down, Disqueratosis congénita, etc. podrían formar parte de las progerias segmentales pero son más leves, el proceso de envejecimiento no es lo más llamativo en este tipo de enfermedades.

Fisiopatología del síndrome de Hutchinson-Gilford

Envejecimiento de todo el organismo. Empieza a manifestar signos clínicos a los meses del nacimiento.

El proceso patológico se debe a una alteración en una ruta metabólica (vía de maduración de la proteína lamina A). Esta proteína forma parte de la membrana nuclear interna. El proceso de maduración se realiza mediante una serie de enzimas que cursa con farnesilación, corte de secuencias de aa hasta la pérdida de 18 aa del extremo carboxilo terminal hasta formar la proteína madura.

En estos pacientes hay múltiples mutaciones en estas enzimas (metaloproteasa sobre todo), quedando la prelamina A que no puede ser modificada ni cortada (se queda la forma farnelisada), quedando la forma inmadura. Lo que ocurre es que la membrana nuclear adquiere una forma abultada. Esto provoca que no se produzca la división celular (no hay renovación celular o su tasa es muy baja).

El tto con estatinas y aminobifosfatos (eliminación de radicales farnesilo) mejora sensiblemente la renovación celular en estos pacientes (Carlos Otín).

Modelos de envejecimiento ( in vivo e in vitro )

In vivo (Proyecto EUROS)

Síndrome de Werner

Progeria segmental. Enfermedad autosómica recesiva producida por una mutación en el gen WRN (involucrado en muchas patologías relacionadas con la inestabilidad genómica: grupo de enfermedades con alteraciones en mecanismo de reparación del DNA, es decir, muchos procesos neoplásicos). Situado en el cromosoma 8 de seres humanos. Enfermedad causada

porque este gen codifica para una helicasa, cuya función importante en el proceso de duplicación del DNA, abren la doble hebra. También relacionada con la disminución de la longitud del telómero (protege de las aberraciones cromosómicas, lo más importante de sus funciones, para que no se produzcan uniones intercromosómicas). Cada vez que se divide el DNA se acortan sus hebras. Muchas de las enfermedades progerias se deben al acortamiento telomérico.

Gran parte del proceso patológico en este síndrome es debido no sólo a la baja actividad helicasa (mala división celular) sino también al acortamiento de los telómeros.

El telómero tiene una estructura complicada. Hay gran cantidad de proteínas (entre las que están la WRN y las Ku) y forman una estructura llamada telosoma o complejo Shelterin (ADN + proteínas). Cuando WRN esta mutado no se forma bien este complejo Shelterin (y no funciona como helicasa normal) y la telomerasa no puede entrar a dicho complejo, por tanto la posibilidad de alargar el telómero disminuye.

Caso: 3 pacientes consanguíneos adultos (25, 35 y 47 años) con fenotipo característico de este síndrome.

Se realizó un estudio de estrés oxidativo (desequilibrio entre oxidantes y antioxidantes a favor de los oxidantes).

- Uno de los parámetros es la 8-OHdG (oxidación de DNA y tmb mide el proceso de reparación de DNA al medirlo en orina). Se sacó sangre periférica de los pacientes y se calculó la 8-OH del núcleo de leucocitos (WBC). Hay un aumento muy significativo de 8-OH de estos pacientes al compararlos con los padres y con controles.

- Otro parámetro medido es el de Glx y MGlx (metabolismo de glúcidos), siendo altos sus niveles.

- Glutation (antioxidante fisiológico más importante en células de mamífero, esta dentro de células y en elplasma de la sangre). La forma reducida es GSH y la oxidada es GSSG. Medir estas formas puede ser un índice sistémico de todo el organismo de estrés oxidativo (más de GSSG que de GSH). Cuanto más alto el cociente GSSG:GSH, más estrés oxidativo. Esto ocurría en estos pacientes.

Se puede decir que hay un estrés oxidativo en estos pacientes. *Con la edad este cociente también aumenta en todas las personas, porque cada vez hay más estrés oxidativo.

Síndrome de Bloom

Alteración de helicasas (gen BLM). Se producen roturas del DNA y de su reordenamiento.

Ver características clínicas: importante el aumento de la susceptibilidad al cáncer, por lo cual suelen morir.

Caso: 4 pacientes. Bajo peso al nacer, retraso crecimiento, eritrema facial, desarrollo psicomotor retrasado y tres de ellos consanguíneos.

Marcadores de estrés oxidativo:

- No había alteraciones en el perfil de estrés oxidativo (GSSG y GSH). Similares e incluso por debajo de los controles

- Sin embargo, los niveles de 8-OH en leucocitos y en orina si eran superiores a los controles, sobretodo en los leucocitos. Esto se debe a que la alteración generada a nivel nuclear (de DNA) no llega a ser sistémico (en el sistémico saldría estrés oxidativo del cociente GSSG:GSH).

Síndrome de Down

Este síndrome tiene un componente de estrés oxidativo, debido a la formación de radicales libres del oxígeno (ROS). Ver esquema: el radical superóxido tiene la capacidad de unirse a estructuras químicas y oxidarlas. Hay una series de enzimas antioxidantes como es la superóxido dismutasa (SOD). La SOD convierte el radical superóxido en agua oxigenada (no es un radical libre), que es un dador de hidroxilos (menos abundante pero mucho más oxidante que el superóxido). La catalasa (CAT) y la glutation peroxidasa (GPx) catabolizan el agua oxigenada generando agua molecular, desactivando finalmente el agente oxidante. La GPx usa como cofactor al glutation reducido (GSH), reduciéndolo y generando agua molecular por otro lado. Ante una baja actividad de estas dos últimas enzimas, se produce más daño oxidativo con daño celular, al producirse la reacción en dirección hacia la producción de hidroxilos.

Caso: el aumento de 8-OH y TBARS, etc. había un estrés oxidativo.

Tienen un componente progeroide porque tienen aterosclerosis con mayor frecuencia, disminución expectativa de vida, diabetes, hipertensión, alopecia, pérdida de piezas dentarias y, salvo algunos tipos de cánceres hematológicos, en general tienen una disminución de la incidencia de tumores óseos (por disminución de proliferación celular).

Marcadores proliferación celular: Por ello, midieron la BrdU (referente de la formación de nuevo ADN). Se vio que la capacidad de proliferación celular en SD está disminuida ya en un fibroblasto fetal. La expresión de proteinas relacionadas con laproliferación celular tmb esta disminuida. Lalongitud del telómero tmb estaba disminuida.

Parámetros de estrés oxidativo; aumentados (GSSG:GSH y otros). LA SOD de ZN/Cu aumentada y la de manganeso disminuida (posible mecanismo compensatorio); GPx y CAT disminuidas; tioredoxina (antioxidante en núcleo celular) disminuida mucho.

Los fibroblastos fetales tienen una disminución de la longitud del telómero, de la proliferación celular y mayor estrés oxidativo.

Disqueratosis congenita

Mutación en la disquerina, enzima involucrado en la regulación dela actividad telomerasa. Por eso, en esta enfermedad se produce un acortamiento de los telómeros, y tiene lugar en la piel.

Características clínicas: hiperpigmentación de piel, pelo gris, distrofia unglar, leucoplaquia. Lo más grave es el fallo en la médula ósea, que es lo que da lugar a la muerte (no formación en células sanguíneas).

Telomerasa: posible función antioxidante? Cuando hay un estrés (entre ellos oxidativo) la telomerasa migra a la mitocondria y la protege de la formación de especies reactivas. Cuando hay menos estrés vuelve al núcleo.

Correlación entre actividad telomerasa y Glutation peroxidasa (a mayor de una mayor de otra?) (ver).

Por otro lado, durante el envejecimiento la conformación de la cromatina se ve alterada.

En la disqueratosis se producían las mismas alteraciones en la conformación de la cromatina que tienen lugar durante el envejecimiento normal. También disminuye la actividad telomerasa y otros parámetros se ven alterados (diapos).

25/03/15

ALTERACIONES HEREDITARIAS EN EL CICLO DE LA UREA Y ENCEFALOPATIA HEPATICA

La encefalopatía hepática mínima es una enfermedad de alta prevalencia (no es una enfermedad rara) pero hay efectos de esta enfermedad que se consideran raros (hiperamonemia). Es una patología caracterizada por alteraciones cerebrales derivadas de un fallo hepático (alcohol o hepatitis) que cursa con una cirrosis. Del 33-50% delos cirróticos puede llegar a sufrir encefalopatía hepática. Esta enfermedad esta infradiagnosticada.

El fallo hepático es la relación entre la EH y las ER. Concretamente, lo raro se refiere a las alteraciones hereditarias en el ciclo de la urea (fallo en alguna de las enzimas del ciclo de la urea).

Las funciones del ciclo de laurea es la eliminación de tóxicos en el cual las proteínas se degradan en aa y luego en amonio. Si hay fallo en alguna de las enzimas se produce hiperamonemia.

Las alteraciones hereditarias en este ciclo la forma un conjunto de deficiencias, clasificadas según la enzima deficiente. Todas son autosómicas recesivas excepto la OTC (ligada al cromosoma X).

Sintomatología: da igual de qué deficiencia se trate: confusión, disminución ingesta de alimento, degradación de alimentos proteínicos (más aa, amonio), aumento somnolencia, náuseas y vómitos

Complicaciones: trastornos aprendizaje, hiperamonemia, coma, muerte, edema cerebral, etc.

Tratamiento: no hay. Seguir dieta hipoproteica

Detoxificación en caso de acumularse: laxantes y diuréticos, lavados, diálisis, etc. para eliminar el amonio.

Hiperamonemia: Aumento amonio en sangre. El amonio atraviesa la barrera hematoencefálica produciendo en el cerebro inflamación, trastornos en algunas vías que afectan al final al aprendizaje y el resto de alteraciones cerebrales.

ENCEFALOPATIA HEPATICA

Cirrosis hepática: estadio final de un proceso de fibrosis progresiva secundario a un daño hepático crónico. Esto conduce a hiperamonemia, a una inflamación local (mediadores de la inflamación) y sistémica (SIRS), a estrés oxidativo/nitrosativo y a la encefalopatía hepática (clínica: ya se manifiesta; o mínima).

La EH es un síndrome neuropsiquiátrico complejo que cursa con alteración funcional del SNC después de un fallo hepático.

Prevalencia: 2mll en EEUU y otros tantos en UE. Manifestaciones clínicas desde alteraciones sutiles en las funciones mentales pudiendo

llegar hasta coma y muerte. Alteración parcialmente reversible pero con mal pronóstico Factor predictivo de muerte.

Hay diferentes grados de gravedad (EHMínima hasta grado 4) con diferentes alteraciones. En la EHM es crítico su diagnóstico.

EHM: primera etapa asociada a empeoramiento en la calidad de vida del paciente. No hay síntomas clínicos evidentes pero sí un leve deterior cognitivo/enlentecimiento psicomotor, aumento de accidentes domésticos, laborales, de tráfico, aumenta el nº de caídas, fracturas y hospitalizaciones. Todo ello da lugar a un problema médico social y económico importante que podría evitarse con un diagnóstico precoz de esta enfermedad.

Para el diagnóstico de la EHM hay una batería de test psicométricos (PHES) que miden atención y coordinación motora. Se realiza sobre personas cirróticas que presentaban algunas alteraciones con posibilidad de EHM. Se obtiene una puntuación, se corrige por edad y nivel educativo, y dependiendo de la puntuación se separa en positivos o negativos. Puesto que requiere tiempo y personal no es muy utilizado en la práctica clínica.

Principales factores contribuyentes a EH y EHM

- Aumento de amonio: hiperamonemia. BHE (neurotóxico y Glu-NO-GMPc.- Inflamación periférica: aumento interleucinas (Il-6, Il-18)- Estrés oxidativo/nitrosativo: aumento de la 3-nitrotirosina (3-NT). Es un marcador de

estrés nitrosativo proveniente de un aumento en el óxido nítrico. Gran valor predictivo de EHM de pacientes cirróticos.

Estrés oxidativo/nitrosativo

Fuentes endógenas de ROS/RNS: cadena transporte electrónico mitocondrial, el sta hipoxantina/xantina oxidasa, reacción de Fenton-Harber-Weiss y de la NOS.

Daño oxidativo producido por desequilibrio entre los oxidantes y los mecanismos antioxidantes del organismo. Las especies reactivas del nitrógeno se produce por la combinación del superóxido con NO, que terminará por producir la 3-NT.

Test psicométricos

Medición de la atención:

- Test Stroop de palabras y colores: evaluar la capacidad de seleccionar información relevante inhibiendo la irrelevante. Los pacientes con EHM tenían disminuida la velocidad de procesamiento mental diferenciándose de los pacientes cirróticos que no tenían EHM (clasificados así anteriormente por el test PHES) y de los controles.

- Test oral de claves: evalúa la velocidad de procesamiento mental. Símbolos y números. Se vio que los que tenían EHM fallaban más que los que no la tenían y que los controles. Los de sin EHM tmb tenían disminuida la velocidad de procesamiento mental, pues fallaban más que los controles. Esto no fue detectado con el PHES (es suficientemente sensible?)

- Test d2: evalúa la atención selectiva/sostenida y la concentración mental. Se evalúan muchos parámetros que miden diferentes características. Los pacientes con EHM lo hacen peor que los cirróticos sin EHM y que los controles. Parecía ser un test más sensible que el PHES.

- Otros: Test Oral de Dígitos y Test Oral de Letras y Números. Los EHM lo hacían peor (disminuida la memoria de trabajo). De nuevo, habían pacientes sin EHM catalogados así con el PHES que sí tenían alteraciones.

Medición Psicomotora:

- Test de coordinación bimanual y Test de coordinación visuomotora. Los EHM lo hacían peor y tardaban más y de nuevo, los sin EHM también fallaban más que los controles.

La batería de PHES no parece lo suficientemente sensible para detectar finamente algunas alteraciones cognitivas y motoras de pacientes EHM, pudiendo ser infradiagnosticados. Hay otros test que detectan algunas alteraciones en funciones cognitivas y motoras con mayor sensibilidad y especificidad que la PHES.

Parámetros bioquímicos analizados:

Amonio en sangre, nitratos/nitritos en plasma, GMPc en plasma, IL-6 y IL-18. Hiperamonemia y aumento de nitratos en pacientes con y sin EHM no mostraban diferencias pero el resto de parámetros sí.

Si los niveles de hiperamonemia e inflamación es suficientemente elevados, en pacientes con enfermedades hepáticas el deterioro cognitivo puede aparecer antes de la progresión a cirrosis.

Mecanismos antioxidantes:

Se midieron diferentes niveles de enzimas antioxidantes en general y estaban elevadas (cómo?). Se produce como mecanismo adaptativo compensatorio pero es insuficiente para combatir el estrés oxidativo (el daño oxidativo). Habían diferencias significativas en EHM frente a no EHM en la GPx, GR y GSH.

Correlación de las alteraciones neurológicas con los biomarcadores de inflamación, hiperamonemia y estrés oxidativo, para evaluar su posible papel en el deterioro neurológico en EHM.

Aumento inflamación, hiperamonemia, actividad GPx y GR en eritrocitos, y de la actividad de GPx en células mononucleares, de la 3-NT, MDA, disminución de GSH, etc.

CONCLUSIONES (ver pdf).

26/03/15

INESTABILIDAD GENETICA Y CANCER HEREDITARIO. BASES EPIGENETICAS DE ALGUNAS ER

Transmisión de la información genética: replicación, transcripción y traducción. A parte existen silenciamiento de genes en determinados momentos, etc (epigenética).

¿Qué es la epigenética?

Conexión entre regulación genética a corto y largo plazo con el ambiente. No somos todo lo que está escrito en nuestros genes.

Son los cambios/características heredables en la función génica que no son codificados por el genoma.

- Metilación del DNA- Modificación de histonas- MicroRNA: silenciamiento de genes- Otros: organización de la cromatina y código de barras de histonas

Organización de la cromatina:

- Eucromatina: abierta y transcribible- Heterocromatina: cerrada y no transcribible.

Composición de la cromatina: Conjunto de histonas (octámero) con DNA.

Regulación de la conformación de la cromatina: tres mecanismos básicos

- Metilación del ADN: introducción grupo metilo en posición 5. Hipermetilación (compactación de la cromatina), hipometilación (transcripción). Importante su regulación porque podría aumentar la susceptibilidad alcáncer si hay determinados genes que no se transcriben o si se transcriben los que no deben cuando no deben y donde no deben.Ver DNA metiltransferasas (metilan el DNA). S-adenosin metionina. Enfermedades con el patrón de metilación alterado: tabla (ataxia friedreich, síndrome ICF, síndrome Rett.

- Modificaciones de las histonas: sobretodo las H3, 4, 2A y 2B (histonas canónicas). Metilación (SILENCIA genes) y acetilación (ACTIVA genes) de histonas. En principio.

- MicroRNAs (RNAs no codificantes): regulan trascripción génica bloqueando la transcripción de un gen concreto.

- Otros: estructura tridimensional de la cromatina y códigos de barras de histonas. Ver hipótesis del código de barras. Cómo sabe la célula qué partes de la cromatina transferir a las hijas? Cómo reconoce si es heterocromatina o eucromatina? Existen unas cisteínas en una región concreta de las histonas H3 que podrían tener implicación en la formación de eucromatina y heterocromatina, así como en la arquitectura nuclear (memoria epigenética).

Hay una serie de mecanismos que dan lugar tanto a la activación como al silenciamiento de un gen, no es un paso único.

EPIGENETICA DEL ENVEJECIMIENTO

La estructura de la cromatina cambia con la edad. El estrés, el ambiente, el daño al DNA alteran la cromatina (epigenética) y forman los SAHF, los cuales provocan silenciamiento de genes que estaban activos y al revés. En la progeria de Hutchinson-Gilford esta estructura nuclear se pierde (Hay una desregulación génica acelerada).

Epigenética de los telómeros: Elongación del telómero para asegurar la estabbilidad génica. Los telómeros son estructuras de heterocromatina, lógico pues necesitamos una región sólida y estable donde no actúe ninguna maquinaria celular. Hay genes no necesario enregiones sub-teloméricas que si ocurre el acortamiento del telómero pueden ser activados y producir diversas alteraciones (enfermedad de Werner).

ENFERMEDADES RARAS RELACIONADAS CON LA REGULACION DE LA CROMATINA

Síndrome de ICF metilación DNA

Mutaciones en el gen DNMT3 (dna metil transferasa importante en reparación de la replicación del DNA y en el desarrollo embrionario). Síndrome de inmunodeficiencia, inestabilidad de la región centromérica y anomalías faciales. DNMT3 A y B metilan citosinas que se ha dejado por metilar DNMT1.

Son recurrentes las infecciones y deficitarios en Igs. Cuando hay un fallo en la heterocromatización ikaros (importante en proceso de producción de Igs) no puede actuar.

Síndrome de Rett metilación de DNA

Mutación en gen MeCP2, que codifica una proteína de unión metil-CpG. MeCP2 reconoce dominios metilados y reclutan a otra maquinaria de reclutamiento, entre ellas histonas desacetilasas(o acetilasas?), para silenciar la transcripción génica, o a otras para activar la

transcripción. Cuando falla lo que ocurre es que se silencian genes necesarios o se activan genes no necesarios.

Síndrome de Rubinstein-Taybi modificación de Histonas

Autosómica dominante. Deleciones en el gen CBP (o en el p300) que codifica para una HAT (histona acetil transferasa).

Síndrome de Coffin-Lowry Modificación de Histonas

Mutaciones en el gen RPS6KA3.

Ataxia de Friedreich

Déficit en la proteina mitocondrial frataxina. Es una expansión del triplete GAA (TTC). Problema en la heterocromatina del promotor.

Terapia epigenética: cambio en la cromatina del promotor haciéndola abierta.

FALTA 30/03

31/03/15

ENFERMEDADES DE DEPÓSITO LISOSOMAL

Introducción general. ¿Qué son?

Autosómicas recesivas excepto la enfermedad de Hunter y la de Fabry (ligada al X). Enfermedades metabólicas muy heterogéneas.

Síntomas aparecen en la niñez o adolescencia (con alguna forma adulta, menos habitual). Disminuye las capacidades del paciente y muerte prematura. Por ello, son un roblema sanitario y se está recomendando introducir cribados neonatales para el diagnóstico temprano.

Heterogeneidad genética pero todas las mutaciones producen una incapacidad para degradar macromoléculas que se acumulan en el lisosoma y en el interior de las células, dando lugar a una disfunción de los órganos afectados.

Los stas de degradación intracelular de proteinas (DIP) (lisosomas) tienen unas funciones muy importantes para la supervivencia. Regulan procesos como:

- Ciclo celular- Muerte celular (apop y necro)- Presentan Ag al sta inmune- Provienen a la célula de aa y otras moléculas - Eliminación de proteínas

La DIP la llevan a cabo proteasas: lisosomas y proteasomas en el citosol, y otras (calpainas, etc).

Sistema ubicuitina-proteasomas: degradan proteinas no funcionales y factores de transcripción, es decir, productos intracelulares. El marcaje de ub da lugar a un paso de degradación (proteasoma) donde la proteina desplegada entra al hueco, lugar donde es cortada a aa.

Lisosomas: ph ácido en su interior y hay de 40-60 hidrolasas ácidas descritas. El ph se mantiene por unabomba de protones en la membrana lisosomal. En la cara interna de la membrana hay un halo azucarado que protege al lisosoma de su interior. Tienen proteinas transportadoras que permiten entrada y salida de proteinas. Degrada material extracelular (endocitosis) e intracelular (autofagia). (Varios tipos de autofagia). La más importante de las autofagias es la macroautofagia.

Macroautofagia: formación de las vacuolas autofágicas: importante el complejo formado por PI3K III y Beclin 1 (son atg). Permitirá que otras atgs (LC3I, II y III) se unan a la membrana preautofagosomal y la elonguen para formar el autofagosoma (en su interior solo quedarán las LC3II). LC3II es la proteina más reconocida como marcador de autofagia (esta unida prácticamente a todas las estructuras.

ENFERMEDADES DE ALMACENAMIENTO LISOSOMAL

Divididas en 8 grupos: los 4 primeros por mutaciones en genes que codifican para enzimas lisosomales. Las otras 4 por mutaciones en genes de proteinas transportadoras, o complejos que ayudan a maduración de enzimas lisosomales, de su activación etc. esto da una idea de la heterogeneidad genética que se comenta en el principio.

Esfingo-lipidosis

Hasta el momento hay descritos 10 síndromes diferentes.

- La enfermedad de Gaucher es una de las más prevalentes de lipidosis.- Enf de Niemann-Pick, Tay-Sachs, Wolman y Krabbé son de las más devastadoras

cuando los síntomas aparecen muy pronto.- Faber: fallo en enzima lisosomal (ceramidasa) que cursa con acúmulo en

articulaciones.

Mucopolisacaridosis

Acumulación de proteoglucanos. En general los síntomas clínicos pueden ayudar al pediatra a dar un diagnóstico inicial.

- Sanfilippo A: mutación de heparan N sulfatasa. - Síndrome de Morquio: fallo en la galactosa 6-sulfatasa

Sacaridosis

Alteraciones neurológicas y del esqueleto.

Clucogenosis

Sólo descrita la enfermedad de Pompe. Acúmulo de glucógeno que afectará al corazón, SNC y todos los órganos donde el glucógeno es importante.

Otros

- Niemann-Pick (variantes C y D). material acumulado en loslisosomas que dan lugar a vacuolas gigantes en el interior de la célula, dejando infuncional a ésta.

- Lipofuscinosis ceroideas neuronales

SIGNOS Y SINTOMAS

Dependerá de qué mutación sea y de la distribución fisiológica del acúmulo.

Los síntomas aparecen de forma muy variable, unas aparecen antes que otras, etc. esta variabilidad dependerá de la mutación de que se trate y el lugar donde se produzca la acumulación, así de lo pronto o tarde en que aparezcan los síntomas (fenotipos dependiendo de la edad de aparición).

Siempre habrá un componente degenerativo cuando la enfermedad afecta al SNC.

DIAGNOSTICO

La mayoría aparecen en la niñez, por lo que a la mínima sospecha se realiza un diagnóstico inicial que suele ser una enfermedad de acúmulo lisosomal. Se suele hacer un estudio anatomo-patológico y otro bioquímico (a parir de suero, leucocitos, fibroblastos del paciente). Los ensayos bioquímicos no son muy interesantes para pacientes portadores. Además, no todas estas enfermedades se deben a un fallo de un enzima. Por ello se recurre a un estudio genético (secuenciaciones de genes sospechosos). Los estudios químicos estudian la composición del material acumulado.

Importante el cribado neonatal. A partir de sangre del talón, se intenta detectar las sustancias que se acumulan , pues la mayoría de estas enfermedades el acúmulo ya se produce durante el desarrollo.

TRATAMIENTO y PREVENCION

Terapia enzimática sustitutiva: en enf de Pompe y de Gaucher. El SNC no mejora

Trasplantes de médula ósea: problema: los lisosomas son importantes para el sta inmune. Si estan afectados, su sta inmune también estará algo afectado. Además, este tto no revierte el fenotipo completamente.

Terapia génica (Sanfilippo): introducir un dna exógeno en células para sintetizar la enzima deficitaria. Ventajas (atraviesa barrera hemato, especifidad de tejido, etc) y desventajas (tamaño del gen, seguridad y no se sabe el nivel de enzima producido por los vectores, si son seguros) de los adenovirus.

Prevención: consejo genético para saber el tipo de herencia, riesgo de recurrencia, el desarrollo clínico más probable, etc. mejorar la calidad de vida de los pacientes.

LIPOFUSCINOSIS CEROIDEAS NEURONALES (trabajo experimental)

Son las enfer neurodegenerativas más frecuentes de la infancia. Grupo de las epilepsias mioclónicas pregresivas (por sintomatología). Herencia auto recesivas.

Hay unos 10 genes implicados, conocidos como CLN (lisosomal, endosomal y retículo endoplásmico).

Trabajan con las variantes CLN2 y 3 porque son las más prevalentes.

Estudio con macroautofagia

CLN2 mutado da lugar a deficiencia en proteína TPP1 (forma infantil tardía). Corta tripéptidos de proteinas pequeñas del extremo amino terminal.

CLN3 mutada produce la forma juvenil (batenina). Codifica para una proteina cuya licalización y función aún no esta clara. Lo más típico es una deleción que da lugar a una proteina truncada sin función.

Mutaciones en ambos genes a la vez da lugar a la acumulación del mismo compuesto.

Se ha querido estudiar las similitudes y diferencias que hay entre diferentes alteraciones (pdf).

Gráfica actividad TPPI: *Alta proteólisis: ayuno. En pacientes CLN2 la actividad de TPPI era significativamente inferior.

Estudio genético para CLN3 (pues se desconoce localización). La CLN3 estaba mutada y en microscopía se veían los lisosomas aumentados. Confirmaron el modelo de estudio.

Realizaron experimentos de “pulso y caza”. Solo con las proteinas de vida media larga habia una disminución de la funcionalidad de CLN2 y 3 para condiciones de alta proteólisis.

Había una menor formación de vacuolas autofágicas y su masa también era menor de lo normal.

Los CNL3 tenian el pH de los lisosomas aumentados. Además, en pacientes CNL3 la actividad de la TPPI también estaba disminuida. De ahí que la alteración sea común en pacientes CNL3 y CNL2.??

Actividad de proteasomas: no estaban alterados, solo esta alterada la macroautofagia.

Estudio de kinasas: mTOR regula negativamente la autofagia. En estos pacientes mTOR esta muy fosforilada (activada), por tanto la macroautofagia estaba disminuida.

Estudio del Trafico vesicular

Endocitosis: se estudian las diferentes vías de endocitosis en sus modelos.

- Macropinocitosis: disminución en pacientes CLN2 y 3 con el tiempo.- Endocitosis mediada por receptor de EGF (clatrina): no hay diferencias en la

internalización. Pero en la degradación y el reciclaje sí se vio alteraciones. Esto se

estudia usando diferentes concentraciones del receptor (a bajas se estudia el reciclaje y a altas la degradación). Mayor reciclaje de CLN3.

- Endo mediada por caveolas: no diferencias significativas

Fallo en autofagia por motivos diferentes: tráfico y alteración gen CLN2 y 3. Y en el ciclo celular?

Las células CLN2 y 3 crecían más lento. Vieron que en GNL2 la fase G0 estaba aumentada.

Radicales libres? Las mitocondrias estaban intactas. Se estudiaron los peroxisomas: disminuida actividad catalasa en CLN2.

Las enzimas lisosomales se sintetizan en la cara trans de golgi, son tranportadar hasta el endosoma tardío y luego devueltas a la cara trans de golgi. Tras varios experimentos de degradación se observó que CLN3 no se estaba degradando. Todo esto posiblemente sea or el aumento del pH que impide su fusión correcta, maduración de autofagosomas más lento, etc.

Las diferencias entre CLN2 y 3 nos puede explicar por qué en pacientes con CLN2mutada la enfermedad se produce antes.