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EFECTO DEL CAMBIO DE SUSTRATO EN LA PRODUCCIÓN DE
AROMAS EN CEPAS AISLADAS DE Trichoderma spp.
Muñoz González Brenda Karina, Yáñez Varela Juan Antonio
Tecnológico de Estudios Superiores de Ecatepec, División de Ingeniería Química y
Bioquímica
Introducción.
Los aromas y fragancias utilizadas en la
industria de alimentos, productos de limpieza
y cosméticos tienen gran interés comercial y
muchas de ellas se sintetizan químicamente
mediante largos procesos de producción
generando contaminación ambiental. Es por
esto que se han buscado alternativas
biotecnológicas para la obtención de estos
productos, mediante el uso de
microorganismos. Trichoderma spp es uno de
los géneros que poseen la habilidad de
producir ciertos aromas utilizados en la
industria de alimentos. Trichoderma
harzianum es un hongo con capacidades
biocinéticas muy interesantes. Produce
compuestos de aroma, en función de la fuente
de carbono que se utilice. Cuando se usa
aceite de resino, el metabolito producido es la
6-pentil-α-pirona (6-PP, aroma a coco),
mientras que cuando se usa glucosa, el
metabolito es γ-decalactona (aroma de
durazno). En este último proceso
biotecnológico, un problema fundamental es
el de la homogenización del aceite, el aire y
la biomasa. En este trabajo se realizara las
fermentaciones para ambos aromas con el fin
de observar el comportamiento del
microorganismo con sustrato glucosa y ácido
linoleico y así poder obtener cual sería el
metabolito más rentable para su producción [2,5].
Marco teórico
El entendimiento de la vía de biosíntesis para
ambos aromas no ha sido aún elucidado por
las investigaciones. Sin embargo Serrano y
colaboradores lograron etiquetar con carbono
catorce el ácido linoleico para poder descifrar
la ruta que lleva a la biosíntesis de la lactona
6-pentil-α-pirona mostrada en la Figura 1.
Esta investigación uso a Trichoderma
harzianum y obtuvieron datos suficientes para
comprobar que la β-oxidación del ácido
linoleico es el máximo paso para la vía bio-
sintetica de 6-PP. En estudios más recientes [#]
se ha demostrado que el gen de la
Lipoxigenasa está envuelto en el primer paso
de la biosíntesis pero esta es regulada por la
proteína G (Tga1) en cepas de Trichoderma
atroviride [5,6].
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Fig. 1 Ruta para la biosíntesis de la lactona 6-PP [5]
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Por otro lado Okui en 1963 realizó un estudio
para revelar la biocoversion del ácido
ricinoleico (𝐶18𝐻34𝑂3) a y-decalactona en
levaduras del genero Candida.
Para nuestro estudio en el cual se utilizó
como fuente de carbono glucosa para la
generación de dicho metabolito se deduce que
para llegar a la formación de ac. ricinoleico,
la glucosa entra a la vía de glucolisis, que
posteriormente con la formación de acetil
coA se realiza la síntesis de ácidos grasos
hasta llegar a la formación de ácido
ricinoleico y pasar a la trasformación de este
compuesto para llegar a la producción de y-
decalactona.
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Fig. 2 Ruta para la biosíntesis de la lactona γ-decalactona
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Materiales y métodos
Aislamiento de Trichoderma harzianum
Trichoderma harzianum se obtuvo mangos
enfermos con malformación, esta muestra se
cultivó en un medio solido de papa dextrosa y
se incubo durante 5 días a una temperatura
ambiente y a oscuridad con la finalidad de
generar en el medio la presencia de conidios.
Para asegurar que efectivamente se aisló el
hongo adecuado, este se observó por medio
de microscopia óptica.
Se preparó un pre inoculo de 150 ml con
extracto de Malta 20 g/L y Glucosa 10 g/L, se
tomó una muestra de 1 cm2 del hongo
obtenido en medio PDA, este se incubo en un
Shaker por 72 horas a temperatura ambiente
con una agitación de 100 rpm.
Producción de γ-decalactona a nivel
reactor
Se preparó 4.5 L de medio de cultivo para la
generación de γ-decalactona con glucosa
como fuente de carbono con 20 g/L de
glucosa, suplementado con 1.0 g/L de
extracto de levadura, 2.0 g/L de caseína
hidrolizada, 1.5 g/L de 𝐾𝐻2𝑃𝑂4 y 1.0 g/L de
𝑀𝑔𝑆𝑂4 .7𝐻2𝑂. Dicho medio se inoculo con
una suspensión de conidios de la cepa
Trichoderma harzianum.
El reactor se colocó a una temperatura de 27
°C, con 1 VVM de aireación, y una agitación
de 200 rpm durante 5 días.
Producción de 6-pentil-α-pirona a nivel
reactor
Se preparó 4.5 L de medio de cultivo para la
generación de 6-pentil-α-pirona con 10 g/L
de ácido linoleico como fuente de carbono,
suplementado con 0.94 g/L (𝑁𝐻4)2 , 7 g/L
𝐾𝐻2𝑃𝑂4 , 2 g/L 𝑁𝑎2𝐻𝑃𝑂4 , 1.5 g/L
𝑀𝑔𝑆𝑂4 .7𝐻2𝑂 , 0.008 g/L 𝐶𝑎𝐶𝑙2 0.0001
𝑍𝑛𝑆𝑂4 .7𝐻2𝑂.
El reactor se colocó a una temperatura de 27
°C, con 1 VVM de aireación, y una agitación
de 200 rpm durante 5 días. Se realizó la
cuantificación de peso seco durante las
fermentaciones para conocer el
comportamiento de crecimiento del hongo
con cada sustrato expuesto.
Condiciones de operación
Dicho reactor está construido de acero
inoxidable, con una camisa que contiene una
entrada de agua fría y una salida del mismo
fluido. Además contiene un eje que es girado
por medio de un motor, este eje cuenta con
aspas de paleta, esto junto con los bafles que
mantienen una buena difusión del medio
durante la fermentación, además consta de
una entrada para aire que pasa a través de
una trampa de agua regulada con un medidor
de flujo. Este reactor contiene una entrada
para la incorporación del inoculo y del medio
de cultivo y otra entrada para un termopar
que permitirá mantener la temperatura
adecuada para el proceso.
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Figura 3: Diseño de reactor
Metodología de extracción del metabolito
Para extraer el metabolito γ-decalactona y 6-
pentil-α-pirona, una vez pasado el tiempo de
fermentación, el contenido de cada reactor se
sometió a una centrifugación durante 20 min
a 3500 rpm para eliminar biomasa y trabajar
con el sobrenadante.
En dos embudos de separación se colocó una
alícuota de 26 ml de cada sobrenadante
respectivamente, con 13 ml de ciclohexano y
65 ml de solución salina al 10%. Ambos
embudos se mezclaron perfectamente y se
dejó en reposo durante 12 horas para la
separación de fases.
La capa de ciclohexano con cada lactona se
separaro de la solución salina, y se pasó a
través de 9.75 g de sulfato de sodio anhidro
para eliminar el agua y secarlos.
Figura 4. Comparación macroscópica de la cepa aislada (A) con una foto de una cepa de Trichoderma spp obtenida de
bibliografía (B)
Motor
Medidor de aire
Trampa de aire
Termostato
Regulador de rpm Camisa
Entrada y salida de agua
fría
Agitador
A B
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Resultados y Discusión
Aislamiento y comprobación.
El aislamiento se corroboro analizando la
morfología macroscópica y microscópica de
la cepa aislada en Papa Dextrosa Agar. Se
comparó con morfologías antes reportadas [1].
En la Figura 4 se muestra la comparación
macroscópica de la cepa. Se puede observar
que tienen una gran similitud en los colores
verde y blanco, y en la forma amorfa del
crecimiento. Para la obtención de una mayor
certeza en la Figura 5 se muestra la
comparación microscópica donde se observan
el mismo tipo de conidióforos, estos son
erectos, hialinos, en su mayoría ramificados.
Las conidios son unicelulares y subglobosas
algunos ramificados y otros solitarios,
característicos de la cepa [1] y se observa una
gran similitud entre la cepa aislada (A) y la
foto obtenida de bibliografía (B).
Comportamiento del crecimiento
microbiano en la producción de aromas
En la figura 6 se muestran las curvas de
crecimiento microbiano para ambas
fermentaciones. Se puede observar
claramente cómo es que la fermentación para
la γ-decalactona hay un crecimiento mayor
que para la del 6-PP. Esto se puede explicar
debido a la naturaleza de las fuentes de
carbono ya que la dilución del sustrato en la
producción de γ-decalactona es mucho mejor
desde un principio ya que es un compuesto
soluble en agua, y la difusión en el reactor es
mucho mejor. En contraste, la fuente de
carbono para la producción de 6-PP es el
aceite linoleico, el cual es difícil que se
difunda por todo el reactor ya que esta
fermentación es conocida como una
fermentación trifásica (agua, aceite, aire) y
por lo tanto la poca difusión de los nutrientes
ocasionó un menor desarrollo de la biomasa [2].
Figura 5. Comparación microscópica de un frotis con azul de lactofenol de la cepa aislada (A) contra una tinción de
Trichoderma spp (B)[1]
40X
A B
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8
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Pes
o S
eco
(g/
L)
Tiempo (días)
Curva de Crecimiento
γ-decalactona 6-pentil-α-pirona
Separación de los metabolitos
Figura 7. Embudos de separación
Figura 6. Comportamiento del crecimiento durante las fermentaciones
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Figura 8. Embudos de separación de y-decalactona Figura 9. Embudos de separación de 6PP
Extracción de los aromas
Tabla 1: Rendimiento de aromas producido a partir de Trichoderman harzianum
Aroma Fuente de carbono Alícuota (ml) Volumen de
metabolito (ml)
y-decalactona
(durazno) Glucosa 26 10
6PP (coco) Ácido linoleico 26 7
Figura 10. Fase de extracción del metabolito
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Referencias.
1. Chávez García Mónica Paola. 2006.
Producción de Trichoderma sp. Y
evaluación de su efecto en cultivo de
crisantemo (Dendranthema
grandiflora). Tesis de Licenciatura.
Pontificia Universidad Javeriana.
Facultad de ciencias, Microbiología
Industrial.
2. Galindo Fentanes Enrique. 2014.
Aspectos de ingeniería en
fermentaciones: cómo mezclar
gases, líquidos y sólidos. Instituto de
Biotecnología, Universidad
Autónoma de México.
3. Sanchez Perez, Maria Isabel, 2009,
Aislamiento y caracterización
molecular y agronómica
Trichoderma spp nativos del norte
de Tamaulipas. México. Instituto
Politécnico Nacional, Centro de
Biotecnología Genómica.
4. Michel-Aceves Casimiro Alejandro,
Otero-Sánchez Marco Antonio, 2004,
Producción y Actividad Antibiótica
del 6 pentil-αpirona de Trichoderma
spp., Sobre Especies de Fusarium.
México. Fitotecnia, Colegio Superior
Agropecuario del Estado de
Guerrero, Centro de Estudios
Profesionales
5. L. Serrano-Carreon, Y. Hathout, M.
Bensoussan and J.-M. Belin, 1993.
Metabolism of Linoleic Acid or
Mevalonate and 6-Pentyl- a-Pyrone
Biosynthesis by Trichoderma
Species. Journals.
6. Rosa Da Silva Arleida. 2002.
Biotransformacion de ácido
linoleico en presencia de levaduras
de genero Candida oleophila y
Candida guillermondi.
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