Dr. Jaime RodríguezLaboratorio de cultivo celular
Facultad de Ciencias de la SaludUniversidad de Talca
Julio 2005
Activación del endotelio por citoquinas proinflamatorias:
TNF (factor necrosis tumoral)
IL-1 (interleuquina 1)
Expresión de moléculas de adhesión ICAM-1, VCAM-1, E-selectina
Expresión de moléculas de atracción química MCP-1
(proteína-1 de quimioatracción de monocitos)
NF-κB
AMs
AMs
Marcadores biohumorales de activación endotelial:
Moléculas de adhesión (Ams):
• ICAM-1 (molécula 1 de adhesión intercelular)
• VCAM-1 (molécula 1 de adhesión celular vascular)
• E-selectina
La acción de TNF e IL-1 es mediada por las MAPKs (proteina-quinasas activadas por
mitógenos):
1. JNK (quinasa aminoterminal Jun)
2. p38
La deformación del endotelio provocada por el flujo sanguíneo es una importante fuerza ateroprotectora.
Activación de la MAPKs:
ERK 1/2 (quinasas relacionadas con señales extracelulares
BMK 1 (MAPK 1 grande)
Síntesis de NO
NO inhibe la expresión de moléculas de adhesión (Ams) por inhibición de NF-κB (factor nuclear kappa B).
NF- κB cuando transloca al núcleo activa genes: citoquinas, Ams, ciclooxigenasa, Nos.
ERK 1/2 inhibe la actividad de JNK, promueve la expresión de NOs (sintetasa del oxido nítrico).
BMK 1 antagoniza efectos de JNK y p38 (mecanismo en estudio).
AISLAMIENTO DE CELULAS ENDOTELIALES DE VENA UMBILICAL HUMANA
Retirar un segmento de vena umbilical y mantenerlo a 4 °C, hasta 1 hora en buffer
Canular y perfundir con buffer (lavado)
Llenar el trozo de vena con solución 0,2 % colagenasa y ligar en ambos extremos
Incubar en buffer a 37 °C, durante 15 min
Lavar con buffer y recibir el contenido en tubo de centrífuga
Sedimentar las células a 250 g por 10 min.
Lavar y resuspender
Condiciones de cultivo:
Medio 199, 20 % FCS, penicilina estreptomicina, 37 °C, 5 % CO2
Rendimiento: 0,5-1,5 millones de células
OTRAS CELULAS ENDOTELIALES:
HDMEC: Human dermal microvascular endothelial cells (Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA).
PMVEC: Human pulmonary microvascular endothelial cells (Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA).
Estudiar los efectos de pirrolidina ditiocarbamato (PDCT) y
espermina NONOato (Sper-NO) sobre la expresión de
moléculas de adhesión y la activación del factor nuclear kappa
B (NF-κB) inducidas por TNF- en HDMEC.
OBJETIVO
PDCT: antioxidante, Sper-NO: donante de NO
EXPRESION DE MOLECULAS DE ADHESION
TRATAMIENTO TNF 4 h
NAC (N-acetilcisteina): antioxidante.
SNAP S-nitroso-N-acetilpenicilamina: donante de NO.
EXPRESION DE MOLECULAS DE ADHESION
TRATAMIENTO TNF 4 h
EXPRESION DE MOLECULAS DE ADHESION
TRATAMIENTO TNF 8 h
EXPRESION DE mRNA de MOLECULAS DE ADHESION
TRATAMIENTO TNF 2 h
NAC (N-acetilcisteina): antioxidante.
SNAP S-nitroso-N-acetilpenicilamina: donante de NO.
EXPRESION DE mRNA de MOLECULAS DE ADHESION
TRATAMIENTO TNF 2 h
TRANSLOCACION NUCLEAR DE NF-Κb p65
Control TNF
PDCT+TNF Sper-NO+TNF
RAZON NUCLEO/CITOPLASMA DE NF-Κb p65
Estudiar el efecto de concentraciones de glucosa estable
“normal” (5 mM), estable alta (20 mM) e intermitente
(20/5 mM), sobre la producción de ICAM-1, VCAM-1 y
E-selectina, así como la actividad de PKC y la expresión de las
isoformas de PKC βI, βII y en HUVEC.
OBJETIVO
ACTIVIDAD PKC A LOS 14 DIAS DE TRATAMIENTO
LY379196: inhibitor of PKC β, BIMI-I: PKC inhibitor, TTFA: inhibitor of mitochondrial complex II, MnTBAP: SOD mimetic, Mannitol: osmotic control.
EXPRESION DE PKC β1
EXPRESION DE PKC β2
EXPRESION DE PKC
CONTENIDO DE ICAM-1 EN EL SOBRENADANTE
CONTENIDO DE VCAM-1 EN EL SOBRENADANTE
CONTENIDO DE E-SELECTINA EN EL SOBRENADANTE
EXPRESION DE mRNA ICAM-1
EXPRESION DE mRNA VCAM-1
EXPRESION DE mRNA E-SELECTINA
8-Hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG): a sensitive indicator of oxidative damage to DNA.
DAÑO OXIDATIVO DEL DNA
LY379196: inhibitor of PKC β, BIMI-I: PKC inhibitor, TTFA: inhibitor of mitochondrial complex II, MnTBAP: SOD mimetic, Mannitol: osmotic control.
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