Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
41
DETERMINACIÓN DEL MECANISMO DE ACCIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE COMPUESTOS DE ORIGEN NATURAL
OBJETIVO ACADÉMICO Que el alumno sea capaz de determinar el mecanismo de acción mediante el cual un compuesto de
origen natural ejerce efecto antioxidante.
PROBLEMA
Determinar el mecanismo antioxidante de una sustancia química a través de la realización de las
pruebas de: 1. Inhibición de la Xantina oxidasa, 2. Captura del radical superóxido, 3. Captura de
peróxido de hidrógeno y 4. Captura de radical hidroxilo.
REACTIVOS
Xantina (Xan) Solución amortiguadora de carbonatos*
Xantina oxidasa (XO) Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)
Nitroazul de tetrazolio (NAT) Nitrato de cobre (II) (Cu(NO3)2)
Sulfato de amonio y hierro (II) hexahidratado
(Fe(NH4)2(SO4)2 6H2O)
Peróxido de hidrógeno (H2O2)
Ácido hexenóico Ácido sulfúrico (H2SO4)
Naranja de xilenol (NX) Butil hidroxitolueno (BHT)
Vainillina Ácido ferúlico
Alopurinol
*Ver APÉNDICE II MATERIAL POR EQUIPO DE 6 PERSONAS
12 Tubos Eppendorf de 1.5 mL 1 gradilla para tubos Eppendorf
1 micropipeta de 100-1000 Pl 1 espátula de cromo níquel
1 micropipeta de 10-100 Pl 1 nave de pesado
1 celda para la región visible (desechable) 2 matraces aforados de 250 mL
1 celda para la región U.V. (cuarzo) 1 pipeta 1 mL
2 matraces aforados de 10 mL 1 pipeta 10 mL
2 vasos de precipitados de 25 mL
BORRADOR, COLE
GIO D
E PROFESORES TOXICOLO
GÍA, FQ U
NAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
42
EQUIPO
Balanza analítica Baño María
Espectrofotómetro
DESARROLLO EXPERIMENTAL
A) Ensayo de inhibición de la Xantina oxidasa empleando el sistema Xantina-Xantina oxidasa
(Xan-XO)
1. Los profesores indicarána cada equipo el antioxidante a evaluar.
2. Marcar 3 tubos Eppendorf como control negativo (C-), control positivo (C+), antioxidante, y blanco para
antioxidante.
3. Para los antioxidantes ácido ferúlico, alopurinol y vainillina preparar los tubos de acuerdo a la Tabla 1,
siguiendo el orden de adición indicado en la columna titulada “reactivo”.
Tabla 1. Preparación de los tubos problema y control
Tubo Reactivo
Control negativo (PL)
Control positivo (PL)
Blanco para antioxidante
(PL)
Antioxidante (PL)
a. Xantina 1.5mM 100 100 100 100 b. EDTA 0.115mM 100 100 100 100 c. Solución amortiguadora
de carbonatos 84 mM pH=10.19
900 600 800 500
d. Solución acuosa de antioxidante 650PM - - 100 100
e. XO* - 300 - 300 VOLUMEN TOTAL 1100 1100 1100 1100
f. Agitar e Incubar ** 20 min 20 min 20 min 20 min * Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversión, colocar los tubos en una gradilla e incubarlos en baño maría a 27°C durante 20 min.
4. Para el antioxidante BHT preparar los tubos de acuerdo a la Tabla 2, siguiendo el orden de adición
indicado en la columna titulada “reactivo”.
BORRADOR, COLE
GIO D
E PROFESORES TOXICOLO
GÍA, FQ U
NAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
43
Tabla 2. Preparación de los tubos problema y control para BHT
Tubo Reactivo
Control negativo (PL)
Control positivo (PL)
Blanco para BHT (PL)
BHT (PL)
a. Xantina 1.5mM 100 100 100 100 b. EDTA 0.115mM 100 100 100 100 c. Solución amortiguadora de
carbonatos 84 mM pH=10.19 850 550 800 500
d. Metanol 50 50 - - e. Solución de BHT en
metanol/amortiguador de carbonatos (1:2) 650PM
- - 100 100
f. XO* - 300 - 300 VOLUMEN TOTAL 1100 1100 1100 1100
g. Agitar e Incubar ** 20 min 20 min 20 min 20 min * Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversión, colocar los tubos en una gradilla e incubarlos en baño maría a 27°C durante 20 min.
5. Transcurrido el tiempo de incubación leer el contenido de los tubos a 295 nm con celda de cuarzo,
empleando el contenido del tubo Control negativo como blanco para medir el Control positivo. Para
mayor comprensión, leer espectrofotométricamente el contenido de los tubos en el orden numérico
que se indica en la Tabla 3.
Tabla 3. Orden de lectura para la determinación de ácido úrico
Orden de lectura Blanco Muestra a leer
1 Control negativo (-)
2 Control positivo (+)
3 Blanco para antioxidante
4 Antioxidante
6. Interpretar los resultados obtenidos considerando que la absorbancia del control positivo representa
el 100% de producción de ácido úrico en el sistema Xan-XO de acuerdo a la siguiente fórmula.
% inhibición de la XO = 100 - [(AM) x 100/AC+] En donde: AM= absorbancia de la muestra que contiene antioxidante
BORRADOR, COLE
GIO D
E PROFESORES TOXICOLO
GÍA, FQ U
NAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
44
A C+= absorbancia del control positivo
7. Una vez obtenidos los resultados desechar el contenido de los tubos en un frasco etiquetado como
R1.
8. Lavar las puntas de pipeta y tubos Eppendorf empleados con metanol, jabón y agua destilada;
secarlos y entregarlos al profesor. Depositar el agua y metanol empleado para enjuagar en el
contenedor R1
B) Ensayo de captura de radical superóxido (O2x-) empleando el sistema Xantina-Xantina
oxidasa-Nitroazul de tetrazolio (Xan-XO-NAT)
1. Marcar 3 tubos Eppendorf como control negativo (C-), control positivo (C+), y antioxidante.
2. Para los antioxidantes ácido ferúlico, alopurinol y vainillina preparar los tubos de acuerdo a la Tabla
4, siguiendo el orden de adición indicado en la columna titulada “reactivo”.
Tabla 4. Preparación de los tubos problema y control para determinación de captura de radical superóxido (O2
x-)
Tubo Reactivo
Control negativo
(PL)
Control positivo
(PL)
Antioxidante (PL)
a. Xantina 1.5Mm 100 100 100
b. EDTA 0.115Mm 100 100 100 c. Solución amortiguadora de carbonatos 84
mM pH=10.19 600 300 200
d. NAT 0.1 M 300 300 300 e. Solución acuosa de antioxidante 650PM - - 100 f. XO* - 300 300
VOLUMEN TOTAL 1100 1100 1100 g. Agitar e Incubar ** 20 min 20 min 20 min h. Cu(NO3)2 1.3 mM 200 200 200
VOLUMEN TOTAL FINAL 1300 1300 1300 * Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversión, colocar los tubos en una gradilla e incubarlos en baño maría a 27°C. 3. Para el antioxidante BHT preparar los tubos de acuerdo a la Tabla 5, siguiendo el orden de adición
indicado en la columna titulada “reactivo”. BORRADOR, C
OLEGIO
DE PROFESORES TOXIC
OLOGÍA, F
Q UNAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
45
Tabla 5. Preparación de los tubos problema y control para determinación de captura de
radical superóxido (O2x-) empleando BHT
Tubo Reactivo
Control negativo
(PL)
Control positivo
(PL)
Antioxidante BHT (PL)
a. Xantina 1.5mM 100 100 100
b. EDTA 0.115mM 100 100 100 c. Solución amortiguadora de carbonatos 84
mM pH=10.19 550 250 200
d. Metanol 50 50 - e. NAT 0.1 M 300 300 300 f. BHT en metanol/amortiguador de carbonatos
(1:2) 650PM - - 100
g. XO* - 300 300 VOLUMEN TOTAL 1100 1100 1100
h. Agitar e Incubar ** 20 min 20 min 20 min i. Cu(NO3)2 1.3 mM 200 200 200
VOLUMEN TOTAL FINAL 1300 1300 1300 * Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversión, colocar los tubos en una gradilla e incubarlos en baño maría a 27°C. ¤Los profesores indicarán el antioxidante a evaluar 4. Transcurrido el tiempo de incubación leer el contenido de los tubos a 560 nm empleando como
blanco el contenido del tubo etiquetado como control negativo.
5. Interpretar los resultados obtenidos considerando que la absorbancia del control positivo representa
el 100% de formazán generado en el sistema Xan-XO-NAT de acuerdo a la siguiente fórmula.
% de captura del radical superóxido= 100 - [(AM) x100/A C+] En donde: AM= absorbancia de la muestra que contiene antioxidante A C+= absorbancia del control positivo
6. Una vez obtenidos los resultados desechar el contenido de los tubos en un frasco etiquetado como
R1.
7. Lavar las puntas de pipeta y tubos Eppendorf empleados con metanol, jabón y agua destilada;
secarlos y entregarlos al profesor. Depositar el agua y metanol empleado para enjuagar en el
contenedor R1.
BORRADOR, COLE
GIO D
E PROFESORES TOXICOLO
GÍA, FQ U
NAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
46
C) Ensayo de Captura de peróxido de hidrógeno (H2O2) y radical hidroxilo (x-OH) empleando
el método de FOX2 modificado.
1. Enjuagar con metanol los 5 tubos Eppendorf y marcarlos como blanco, control positivo H2O2,
control positivo x-OH, Captura H2O2 y Captura x-OH.
2. Preparar los tubos de acuerdo a la siguiente tabla, siguiendo el orden de adición indicado en la
columna titulada “reactivo”.
Tabla 6. Preparación de los tubos problema y control
Tubo Reactivo
blanco (PL)
Control positivo
H2O2 (PL)
Control positivo x-OH (PL)
Captura H2O2
(PL) Captura x-OH
(PL)
a. FOX-MeOH 900 900 900 - - b. FOX-Antioxidante - - - 900 900 c. Ácido hexenóico - - 40 - 40 d. H2O 100 80 40 80 40 e. H2O2* - 20 20 20 20
VOLUMEN TOTAL 1000 1000 1000 1000 1000 f. Agitar e Incubar ** 10 min 10 min 10 min 10 min 10 min
* Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversión, colocar los tubos en una gradilla e incubarlos en baño maría a 27°C. 3. Transcurrido el tiempo de incubación leer el contenido de los tubos a 560 nm empleando como
blanco el contenido del tubo etiquetado como blanco.
4. Interpretar los resultados obtenidos considerando que la absorbancia del tubo marcado como control
positivo de H2O2 representa el 100% del peróxido de hidrógeno adicionado al sistema y el tubo
marcado como control positivo x-OH representa el 100% del radical hidroxilo generado en el
sistema.
% de captura de peróxido de hidrógeno (H2O2) = 100 - [(AM) x100/AC+H2O2] En donde: AM= absorbancia del tubo marcado como “Captura de H2O2” AC+H2O2 = absorbancia del tubo marcado como “control positivo H2O2”
% de captura de radical hidroxilo (x-OH) = 100 - [(AM) x100/A C+x-OH ] En donde: AM = absorbancia del tubo marcado como “Captura de x-OH”
BORRADOR, COLE
GIO D
E PROFESORES TOXICOLO
GÍA, FQ U
NAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
47
AC+x-OH = absorbancia del tubo marcado como “control positivo x-OH” 5. Una vez obtenidos los resultados desechar el contenido de los tubos en un frasco etiquetado como
R2.
6. Lavar las puntas de pipeta y tubos Eppendorf empleados con metanol, jabón y agua destilada;
secarlos y entregarlos al profesor. Depositar el agua y metanol empleado para enjuagar en el
contenedor R2.
BORRADOR, COLE
GIO D
E PROFESORES TOXICOLO
GÍA, FQ U
NAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
48
CUESTIONARIO
1. Reporte sus resultados en la Tabla 1
Tabla 1. Resultados por equipo
Prueba Absorbancia
Control
positivo (C+)
Absorbancia de la muestra
antioxidante: ________________
Porcentaje
de actividad
antioxidante*
Inhibición XO
Captura O2x-
Captura H2O2
Captura x-OH
*Calcular el porcentaje de inhibición de XO o Captura de O2x-, H2O2 o x-OH según sea el caso de
acuerdo a las ecuaciones presentadas en cada una de las secciones. 2. De acuerdo a los resultados de la Tabla 1 ¿Cuál es el mecanismo de acción de la muestra de
antioxidante que analizó? Justifique su respuesta.
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
3. Compare las absorbancias de los controles positivos para cptura de H2O2 y x-OH. ¿A qué proceso o
procesos atribuye la diferencia?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
4. Esquematice con reacciones su respuesta anterior.
BORRADOR, COLE
GIO D
E PROFESORES TOXICOLO
GÍA, FQ U
NAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
49
5. Recopile los resultados grupales y repórtelos en la Tabla 2.
Tabla 2. Resultados grupales
Equipo Antioxidante % de inhibición
de la XO
% de Captura
O2x- H2O2 x-OH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
6. ¿Cuál de los antioxidantes muestra mayor capacidad para inhibir a la XO?
___________________________________________________________________________________
7. ¿Cuál de los antioxidantes muestra mayor capacidad para capturar al radical O2•-?
___________________________________________________________________________________
8. ¿Cuál de los antioxidantes muestra mayor capacidad para capturar al H2O2?
___________________________________________________________________________________
9. ¿A qué atribuye este último hallazgo?
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
BORRADOR, COLE
GIO D
E PROFESORES TOXICOLO
GÍA, FQ U
NAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
50
10. ¿Cuál de los antioxidantes muestra una mayor capacidad para capturar al radical x-OH?
________________________________________________________________________________
11. ¿Considera que el consumo habitual de estos antioxidantes contribuiría a disminuir el estrés
oxidante? Justifique su respuesta.
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
BIBLIOGRAFÍA
Cadenas, E. Packer L. Handbook of Antioxidants. Marcel Dekker, Inc., New York, 2002. Klaassen, C.D., Watkins, J.B. Manual de Toxicología de Casarett & Doull: la ciencia básica de los
tóxicos. (5ª ed.) McGraw-Hill, México, 2001. Klassen, C.D. Casarett and Doull’s Toxicologia. La ciencia de los venenos. (6a ed.). Ed. Mc Graw
Hill, Interamericana 2001. Jiang, Z.Y., Hunt, J.V., Wolff, S. P. (1991). Ferrous Ion Oxidation in the Presence of Xylenol Orange
for Detection of Lipid Hydroperoxide in Low Density Lipoprotein. Analytical Biochemistry 202, 384-389.
Nourooz-Zadeh, J., Tajaddini-Sarmadi, J., and Wolff S.P. (1994). Measurement of Plasma Hydroperoxide Concentrations by the Ferrous Oxidation-Xylenol Orange Assay in Conjunction with Triphenylphosphine. Analytical Biochemistry 220, 403-409.
Martínez-Flórez, S., González-Gallego, J., Culebras, J. M., y Tuñón, M.ª J. (2002). Los flavonoides: propiedades y acciones antioxidantes. Nutrición Hospitalaria. XVII, 271�278.
Owena, P.L., Johns, T. (1999). Xanthine oxidase inhibitory activity of northeastern north American plant remedies used for gout. Journal of Ethnopharmacology 64, 149�160.
Södergren, E., Nourooz-Zadeh, J., Berglund, L., Vessby, B. (1998) Re-evaluation of the ferrous oxidation in xylenol orange assay for the measurement of plasma lipid hydroperoxides. J. Biochem. Biophys. Methods 37 137-146.
Tsutomu, K., Susumu, T., Hidetaka, N., et al. (2003). A novel and potent biological antioxidant, kinobeon A, from cell culture off sunflower. Life Sciences 74, 87�97.
Wardman, P., (2007). Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosactive species in cells and tissues: Progress, pitfalls, and prospects. Free Radical Biology & Medicine 43, 995�1022.
World Health Organization monographs on selected medicinal plants. Volume 1. 1999, Geneva. Pp 16-32.
BORRADOR, COLE
GIO D
E PROFESORES TOXICOLO
GÍA, FQ U
NAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
51
APÉNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS
1. Definición del proceso de estrés oxidante.
2. Concepto de radical libre y especies reactivas.
3. Concepto de antioxidante y ejemplos.
4. Reacción de Fenton.
5. Concepto de peroxidación de lípidos.
6. Importancia de la solubilidad de los antioxidantes en agua y metanol en función del procedimiento
experimental, prestar particular atención a las tablas 2 y 5.
7. Analice las reacciones planteadas en el siguiente diagrama y describa o complete lo solicitado en
los incisos 7a-7c
7a. Completar la longitud de onda a la que absorben las especies químicas que se determinan
espectrofotométricamente en las pruebas de inhibición de la Xantina Oxidasa y de captura del
radical superóxido, respectivamente.
Xantina
XantinaOxidasa (XO)Ácido úrico
O2 H2O2 + O2˙‐
2e‐
Reducción 2e‐
Azul de tetrazolio (NBT) Formazán
O= nm
O= nm
BORRADOR, COLE
GIO D
E PROFESORES TOXICOLO
GÍA, FQ U
NAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
52
7b. Propósito de la adición secuencial de: xantina, EDTA, solución amortiguadora de carbonatos
pH 10.2, nitroazul de tetrazolio, XO y Cu(NO3)2 en las pruebas de inhibición de la Xantina
Oxidasa y de captura de radical superóxido.
7c. Identificar las especies reactivas de oxígeno, indicando si son radicales o no.
8. Analice las reacciones planteadas en el siguiente diagrama y describa lo solicitado en los incisos
9a-9c
9a. Propósito de la adición de Naranja de Xilenol y H2SO4 en el reactivo de FOX2.
9b. Propósito de la adición de H2O2.
9c. Propósito de la adición de ácido hexenóico en los tubos de captura de radical OHx-.
9d. Identifique la reacción de Fenton en el diagrama
Método de FOX2 modificado
FeII FeIII + OH˙ + OH‐
H2O2 Naranja de Xilenol (NX)FeIII‐NX
+ L(Ácido hexenóico)
FeII FeIII + OH˙ + OH‐LOOH NX
FeIII‐NX
(O=560 nm)
(O=560 nm)
NX = Naranja de XilenolFeIII‐NX = Complejo colorido de hierro III y Naranja de XilenolL= Lípido = Ácido hexenóicoLOOH = Lípido hidroperóxido producto de la peroxidación de lípidos en presencia de OH˙
BORRADOR, COLE
GIO D
E PROFESORES TOXICOLO
GÍA, FQ U
NAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
53
APÉNDICE II: PREPARACIÓN DE REACTIVOS
Nota: Las soluciones 17 y 18 se deben preparar al inicio de cada sesión. Todo el material de vidrio
para preparar los antioxidantes deberá ser enjuagado previamente con EDTA. Se recomienda que
cada equipo prepare las soluciones acuosas o metanólicas del antioxidante que el profesor les haya
asignado a evaluar.
Xantina 1.5 mM
Pesar 11.3 mg de xantina, agregar Na2CO3 0.4 M hasta solubilizar y aforar a 50 mL con solución
amortiguadora de carbonatos.
Solución amortiguadora de bicarbonato de sodio-carbonato de sodio 84 mM, pH 10.2
Pesar 970 mg de NaHCO3 y 1.01 g de Na2CO3, disolverlos con agua destilada. Ajustar pH a 10.2 y
aforar a 250 mL.
Nitroazul de tetrazolio 0.1 M
Pesar 41 mg de nitroazul de tetrazolio y aforar a 50 mL con agua destilada. Guardar la solución en un
frasco ámbar en el refrigerador.
EDTA 0.1 mM
Pesar 33.6 mg de EDTA, disolver con agua destilada, aforar a 1L.
Xantina oxidasa
La enzima se preparará durante la sesión de laboratorio de acuerdo a la indicación de los profesores.
Nitrato de cobre 1.3 mM (Cu(NO3)2)
Pesar 12.2 mg de Cu(NO3)2 y aforar a 50 mL con agua destilada.
Solución acuosa de vainillina 0.65 mM
Pesar 1 mg de vainillina y aforar a 10 mL con solución amortiguadora de carbonatos pH 10.2
BORRADOR, COLE
GIO D
E PROFESORES TOXICOLO
GÍA, FQ U
NAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
54
Solución acuosa de ácido ferúlico 650PM
Pesar 1.3 mg de ácido ferúlico y aforar a 10 mL con solución amortiguadora de carbonatos pH 10.2
Solución acuosa de Alopurinol 650PM
Pesar 2.2 mg de alopurinol y aforar a 25 mL con solución amortiguadora de carbonatos pH 10.2
Solución de BHT en metanol/amortiguador de carbonatos (1:2) 650PM
Pesar 1.4 mg de butil hidroxitolueno y disolver en 5 mL de metanol; aforar a 10 mL con solución
amortiguadora de carbonatos pH 10.2
Solución acuosa de H2O2 250 PM
Tomar 0.1 mL de una solución de peróxido de hidrógeno al 50.4% y aforar a 10 mL con agua destilada;
de esta solución tomar 17 PL y aforar a 10 mL con agua destilada.
Solución metanólica de vainillina 4.4 mM
Pesar 6.7mg de vainillina y aforar a 10 mL con MeOH
Solución metanólica de Ácido ferúlico 4.4 mM
Pesar 8.5 mg de ácido ferúlico y aforar a 10 mL con MeOH
Solución metanólica de Alopurinol 4.4 mM
Pesar 6.0 mg de Alopurinol y aforar a 10 mL con MeOH
Solución metanólica de BHT 4.4 mM
Pesar 9.7mg de BHT y aforar a 10 mL con MeOH
Reactivo de FOX2
Mezclar 33.6 mg de naranja de xilenol, 50.2 mg de Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O y disolver en H2O destilada,
agregar 695 mL de H2SO4 concentrado y aforar a 50 mL con agua destilada.
BORRADOR, COLE
GIO D
E PROFESORES TOXICOLO
GÍA, FQ U
NAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
55
Solución FOX-MeOH
Mezclar 1 mL del reactivo de FOX2 con 9 mL de MeOH
Solución FOX-Antioxidante
Mezclar 1 mL del reactivo de FOX2 con 9 mL de la solución metanólica de antioxidante
correspondiente.
Solución acuosa de ácido hexenóico 500 PM
Pesar 6.6 mg de ácido hexenóico y aforar a 50 mL con agua destilada, tomar de esta solución 5 mL y
aforar a 10 mL con agua destilada.
APÉNDICE III: DISPOSICIÓN DE RESIDUOS
R1: xantina, xantina oxidasa, EDTA, solución amortiguadora de carbonatos pH 10.2, nitroazul de
tetrazolio, ácido ferúlico, vainillina, butil hidroxitolueno, alopurinol, Cu(NO3)2, azul de tetrazolio,
formazán, ácido úrico, H2O2, metanol.
R2: Naranja de xilenol, sulfato de amonio y hierro (II), H2SO4, ácido hexenóico, H2O, H2O2, vainillina, alopurinol, butil hidroxitolueno, ácido ferúlico metanol.
BORRADOR, COLE
GIO D
E PROFESORES TOXICOLO
GÍA, FQ U
NAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
56
DETERMINACIÓN DE MUTÁGENOS AMBIENTALES A TRAVÉS DE LA PRUEBA DE AMES.
OBJETIVO ACADÉMICO
Determinar la presencia de compuestos mutagénicos en muestras de interés o de impacto ambiental
empleando la prueba de Ames
PROBLEMA
Que el alumno obtenga a partir de muestras de interés ambiental, la fracción que contiene los
compuestos de naturaleza orgánica y realice la prueba de Ames para determinar si las fracciones
contienen compuestos con potencial mutagénico.
MATERIAL BIOLÓGICO.
Cultivo nutritivo de 16 horas a 37°C de Salmonella typhimurium, cepa TA98, cuyos marcadores
genéticos son: requerimiento de histidina (His-), sensibilidad al cristal violeta (mutación en rfa),
presencia del plásmido R (resistencia a ampicilina), sensibilidad a la luz U.V. (mutación en uvrB) y
frecuencia de reversión espontanea.
MUESTRA AMBIENTAL POR EQUIPO
Traer por equipo de 6 personas una de las dos muestras siguientes:
a) Colillas de cigarro: Recolectar en una bolsa plástica limpia 20 colillas de cigarro a las que
deberán retirar el papel envolvente y conservar únicamente el algodoncillo del filtro.
b) Residuos de escape automotriz: Recolectar con un algodón el hollín remanente en el escape de
un autobús y guardarlo en una bolsa plástica limpia; si es necesario emplear unas pinzas largas
para tener acceso hasta el lugar en donde el hollín se acumula.
BORRADOR, COLE
GIO D
E PROFESORES TOXICOLO
GÍA, FQ U
NAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
57
MATERIAL POR EQUIPO (6 personas).
Extracción Prueba de Ames
1 Anillo metálico 1 Agitador “vortex”
1 Embudo de cola corta 1 Mechero Bunsen
1 Embudo de separación 1 Mechero Fisher
1 Matraz de bola de 100 mL 1 Micropipeta 10-100μL
1 Probeta de 100 mL 1 Micropipeta 100-1000μL
1 Vaso de precipitados de 100 mL 4 Pipetas graduadas 2 mL estériles
1 Vidrio de reloj 8 Puntas desechables estériles para
micropipetas (6 amarillas + 1 azul)
2 Pedazos de papel filtro 7x7cm 1 Vaso de precipitados de 100 mL
1 Parrilla de calentamiento
10 Tubos de ensayo de plástico
desechables de 5 mL estériles
Material para el conteo: 1 Pinzas para tubos de ensayo
1 Plumón indeleble de punto fino 1 Termómetro
1 Lámpara Hielo
1 Lupa 1 Bolsa de plástico para residuos
10 Cajas Petri con medio mínimo E de
Vogel-Bonner
2 Tubos de ensayo 16x150 mm con 15
mL de agar de superficie
1 Tubo Eppendorf
1 Unidad Swinex (Millipore, 0.45 µm)
BORRADOR, COLE
GIO D
E PROFESORES TOXICOLO
GÍA, FQ U
NAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
58
REACTIVOS
Extracción
Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4)
Diclorometano (CH2Cl2)
Dimetilsulfóxido (DMSO)
Prueba de Ames
Hipoclorito de sodio
Solución L-histidina 0.5mM / biotina 0.5 mM
Mezcla fracción S9:
Amortiguador de fosfatos 0.2 M pH 7.4
Solución de MgCl2 6H2O 0.4 M/ KCl 1.65 M
Glucosa 6-fosfato
NADP+
Medio mínimo de Vogel-Bonner (en cajas Petri)
Agar de superficie (15 mL en tubos de ensayo 16x150mm)
EQUIPO
Incubadora
Refrigerador
Rotaevaporador
Lámparas
DESARROLLO EXPERIMENTAL PRIMERA SESIÓN
NOTA 1. Antes de comenzar el trabajo experimental, los encargados de higiene y seguridad deben
verificar que todos los integrantes del equipo porten bata, guantes, cubrebocas y lentes de seguridad.
NOTA 2. Colocar las cajas de Petri con medio mínimo de Vogel-Bonner en la incubadora a 37°C al
inicio de la clase.
BORRADOR, COLE
GIO D
E PROFESORES TOXICOLO
GÍA, FQ U
NAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
59
EXTRACCIÓN DE MUTÁGENOS A PARTIR DE MUESTRAS AMBIENTALES.
1. Preparar un sobre doble de papel filtro de aproximadamente 5 x 5 cm de longitud de acuerdo a la
Figura 1.
Figura 1. Elaboración de sobre doble de papel filtro.
2. Colocar el material de estudio en el sobre y depositarlo en un vaso de precipitados de 250 mL,
añadir 100 mL de CH2Cl2, tapar y agitar delicadamente 30 segundos. Macerar durante 30
minutos. (No agitar durante ese tiempo).
3. Filtrar por gravedad el extracto obtenido y recolectarlo en un vaso de precipitados.
BORRADOR, COLE
GIO D
E PROFESORES TOXICOLO
GÍA, FQ U
NAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
60
4. Colocar el sobre doble de papel filtro sobre papel periódico en la campana de extracción. Al
finalizar la sesión los responsables de seguridad e higiene deberán colocarlos en una bolsa de
plástico, cerrar y etiquetar como R1.
5. Adicionar al disolvente de extracción del inciso 3 sulfato de sodio anhidro para eliminar la
presencia de agua en la muestra, posteriormente filtrarlo por gravedad a través de algodón y
concentrar in vacuo.
6. Reconstituir el residuo final con 500 µL de DMSO.
PRUEBA DE AMES.
NOTA 3. Antes de montar el área de trabajo es importante asegurarse que ya NO haya disolventes
orgánicos en las mesas.
1. Sanitizar el área de trabajo limpiando con jabón e hipoclorito de sodio.
2. Enseguida sanitizar con etanol al 70%.
3. Adecuar el área de trabajo a un ambiente estéril de acuerdo a la Figura 2.
Figura 2. Área de trabajo ordenada y sanitizada.
4. En la parrilla de calentamiento, fundir con mucha precaución los 15 mL de agar de superficie
contenido en el tubo de ensayo para evitar proyecciones y pérdidas de reactivo.
5. Añadir 1.5 mL de solución L-Histidina/Biotina.
BORRADOR, COLE
GIO D
E PROFESORES TOXICOLO
GÍA, FQ U
NAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
61
6. Mantener la mezcla anterior a 45°C en baño maría como indica la Figura 2.
7. Los encargados de seguridad prepararán para todo el grupo la mezcla S9 de acuerdo a las
instrucciones del APÉNDICE I. A los equipos que les corresponda utilizar dicha mezcla se les
proporcionará en tubos Eppendorf 1.3 mL de mezcla S9 para el bioensayo la cual deberá
mantenerse todo el tiempo en baño de hielo.
NOTA 4: Los pasos del 7 al 12 deben hacerse lo más rápido posible para evitar riesgos de
contaminación.
8. Tomar uno o dos tubos de ensaye de plástico estériles, según el tratamiento que se esté
realizando, quitarles la tapa por presión sin tocar los bordes y añadir a cada tubo 2 mL de agar
de superficie previamente tratado en el paso 4. Mantenerlos a 45°C como los muestra la Figura
2.
9. Realizar sólo los tratamientos expuestos en la Tabla 1 o 2 según el equipo correspondiente,
comenzando por el control negativo. CADA REACTIVO DEBE AGREGARSE EN EL ORDEN
INDICADO.
10. Desechar las puntas para micropipetas en la bolsa de residuos colocada a un costado del área de
trabajo y etiquetada como R2.
Tabla 1. Prueba de Ames con la Cepa TA 98 para el equipo A
Tratamientos Control negativo
Reversión espontánea
(por duplicado)
Sin S9 (por duplicado)
CÓDIGO Reactivo
C- RE1 RE2 S/S91 S/S92
1.- Agar de superficie* 2mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL
2.- Cultivo bacteriano - 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL
3.- Mutágeno ambiental - - - 25μL 25μL
BORRADOR, COLE
GIO D
E PROFESORES TOXICOLO
GÍA, FQ U
NAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
62
Tabla 2. Prueba de Ames con la Cepa TA 98 para el equipo B
Tratamientos Control negativo
fracción S9
Sólo mutágeno
(por duplicado)
Con S9
(por duplicado)
CÓDIGO Reactivo
C-S9 M1 M2 C/S91 C/S92
1.- Agar de superficie* 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL
2.- Cultivo bacteriano 100 PL - - 100 µL 100 µL
3.- Mutágeno ambiental - 25μL 25μL 25μL 25μL
4.- Mezcla S9** 500 PL - - 500 µL 500 µL
*Mantener siempre a 45°C en baño maría **Mantener siempre en hielo. 11. Sacar de la incubadora dos cajas Petri, etiquetar las cajas en la tapa según el código indicado en
las tablas 1 y 2, para cada tratamiento agregando el número de grupo y equipo.
12. Mezclar el contenido de cada tubo en el agitador “vortex”.
13. Verter el contenido de cada tubo en la caja de Petri con medio mínimo de Vogel-Bonner
correspondiente.
14. Desechar los tubos de plástico en la bolsa de residuos colocada en un costado del área de trabajo
y etiquetada como R2.
15. Distribuir cuidadosa y homogéneamente el agar de superficie realizando movimientos circulares.
16. Dejar solidificar las cajas a temperatura ambiente en una superficie plana durante 10 minutos.
17. Repetir los pasos 7 al 15 para los otros dos tratamientos.
NOTA 5: Recordar en todo momento que se está trabajando con compuestos con posible actividad
mutagénica y con un cultivo bacteriano que no es inócuo.
18. Colocar el sobrante de la muestra ambiental en DMSO en el contenedor etiquetado como R3.
19. Fijar las tapas de las cajas Petri a su contraparte con cinta adhesiva e introducirlas de manera
invertida a la incubadora a 37°C por 48 horas.
20. Una vez terminado el tiempo de incubación, guardar las cajas de Petri invertidas en el
refrigerador a 4°C.
BORRADOR, COLE
GIO D
E PROFESORES TOXICOLO
GÍA, FQ U
NAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
63
DESARROLLO EXPERIMENTAL SEGUNDA SESIÓN
21. Antes de comenzar el conteo de colonias, verificar que el crecimiento sea homogéneo, es decir,
que las colonias tengan las mismas características, de lo contrario informar al profesor para
recibir instrucciones.
22. Identificar si existe algún tipo de contaminación por hongos u otras bacterias. En caso de que las
cajas presenten estas condiciones, informar al profesor para rechazarlas.
23. Contar el número de colonias revertantes que crecieron en la caja con ayuda de una lámpara y
una lupa, marcándolas con un plumón indeleble de punto fino.
24. Registrar en la Tabla 3 los resultados obtenidos.
25. Una vez terminada la cuenta, recolectar las cajas de Petri y sujetarlas con cinta adhesiva,
colocarlas en la bolsa roja para RPBI y etiquetarlas como R4
NOTA 6. Se considera un resultado positivo cuando el número de revertantes inducidas es igual o
superior al doble del número de colonias revertantes espontáneas.
BORRADOR, COLE
GIO D
E PROFESORES TOXICOLO
GÍA, FQ U
NAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
64
CUESTIONARIO 1. Anote el número de revertantes encontradas en la Tabla 3
Tabla 3. Resultados con la cepa TA98
Equipo Muestra: Repetición Control negativo
Control negativo
fracción S9Reversión
espontánea
Sin fracción
S9
Con fracción
S9
Sólo mutágeno
1
1 2
Promedio 2
1 2
Promedio 3
1 2
Promedio 4
1 2
Promedio 5
1 2
Promedio 2. ¿En cuál de las muestras evaluadas, el número de revertantes inducidas es igual o superior al doble
del número de colonias revertantes espontáneas?
___________________________________________________________________________________
3. ¿Considera que logró identificar la presencia de mutágenos en la muestra ambiental evaluada?
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
4. ¿Qué tipo de mutaciones provocan?
___________________________________________________________________________________
5. ¿Cómo influye la biotransformación en estos procesos?
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
6. ¿Qué características de solubilidad poseen los xenobióticos presentes en la muestra evaluada?
BORRADOR, COLE
GIO D
E PROFESORES TOXICOLO
GÍA, FQ U
NAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
65
___________________________________________________________________________________
7. ¿Qué importancia tiene la concentración de los mutágenos en la muestra con respecto a la
confiabilidad de la prueba?
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
BORRADOR, COLE
GIO D
E PROFESORES TOXICOLO
GÍA, FQ U
NAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
66
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Maron, D. & Bruce, A. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Research 113 (1980)173-215.
Cortinas, C. & Ostrosky, P. (Editoras) Manual de métodos para la identificación de mutágenos y carcinógenos químicos ambientales, Volumen 1. Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM. México, 1980. Págs. 31-50.
Calderón-Segura, M. E., Gómez-Arroyo, S., Villalobos-Pietrini, R., Butterworth, F. M., Amador-Muñoz, O. The effects of seasonal weather on the genotoxicity, cytokinetic properties, cytotoxicity and organochemical content of extracts of airborne particulates in Mexico City. Mutation Research 558 (2004) 7–17.
Villalobos-Pietrini, R., Hernández-Mena, L., Amador-Muñoz, O., Munive-Colín, Z., Bravo-Cabrera, J. L., Gómez-Arroy, S., Frías-Villegas, A., Waliszewski, S., Ramírez-Pulido, J., Ortiz-Muñiz, R. Biodirected mutagenic chemical assay of PM10 extractable organic matter in Southwest Mexico City. Mutation Research 634 (2007) 192–204.
APENDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS
1. Concepto de contaminación atmosférica.
2. Posibles compuestos mutagénicos existentes en las muestras seleccionadas.
3. Efectos generales que sobre el organismo tienen los contaminantes ambientales.
4. Características generales de solubilidad de dichos compuestos.
5. Fundamento de la prueba de Ames.
6. Concepto de revertante espontánea.
7. Características generales de las cepas Salmonella typhymurium utilizadas en la Prueba de Ames
y especialmente la cepa TA 98.
8. Utilidad del agar de superficie.
9. Importancia del baño de temperatura a 45°C.
10. Finalidad de colocar en el medio una solución que contenga histidina y biotina.
11. Características de la fracción S9 y su utilidad.
12. Numero de colonias revertantes necesarias para considerar un resultado positivo.
13. Precauciones que se deben considerar para obtener resultados óptimos de la prueba en el
laboratorio.
BORRADOR, C
OLEGIO
DE PROFESORES TOXIC
OLOGÍA, F
Q UNAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
67
APÉNCIDE II: PREPARACIÓN DE REACTIVOS.
a) Sales de Vogel-Bonner 50X.
En 600 mL de agua destilada tibia disolver las sales en el siguiente orden:
MgSO4·7 H2O 10 g
Ácido cítrico·H2O 100 g
K2HPO4 anhídro 500 g
NaHPO4·4 H2O 175 g
Aforar a 1 litro. Esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente.
b) Bacto-agar
En un matraz de 1 L colocar 15 g de Bacto-agar más 500 mL de agua destilada. Esterilizar en
autoclave el material a anterior 121°C durante 15 minutos
c) Dilución de las sales Vogel-Bonner 50x
En un matraz de 1 L colocar 20mL de las sales de Vogel-Bonner 50x más 500 mL de agua destilada.
Esterilizar en autoclave el material anterior a 121°C durante 15 minutos
d) Solución de glucosa al 40% p/v
En un matraz de 125 mL colocar 20 g de glucosa más 50 mL de agua destilada. Esterilizar en
autoclave el material anterior a 121°C durante 15 minutos
e) Cajas Petri con Medio mínimo E de Vogel-Bonner
En un matraz de 2 L limpio, seco y esterilizado en autoclave a 121 °C por 15 minutos, añadir los 500
mL de bacto-agar, 500 mL de la dilución de las sales Vogel-Bonner y 50 mL de solución de glucosa al
40% p/v, mezclar perfectamente y distribuir en cajas Petri de 15x100 estelizadas por rayos gamma
hasta cubrir la base (aproximadamente 30 mL/caja). Esta cantidad de medio alcanza para preparar
aproximadamente 33 cajas.
BORRADOR, COLE
GIO D
E PROFESORES TOXICOLO
GÍA, FQ U
NAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
68
f) Solución Histidina 0.5 mM/Biotina 0.5 mM
Pesar 0.0077 g de L-histidina, 0.0122 g de D-biotina, disolver con agua destilada y con calentamiento,
aforar a 100 mL. Esterilizar por filtación o autoclave. Almacenar a 4°C en oscuridad.
g) Agar de Superficie
Pesar 0.6 g de Bacto Agar y 0.5 g de NaCl, agregar 100 mL de agua destilada. Alicuotar 15 mL de la
mezcla en tubos de 16x150 mm, cubrirlos con algodón, esterilizar en autoclave y almacenar a
temperatura ambiente
h) Amortiguador de fosfatos 0.2 M pH 7.4 Solución A. Disolver 2.84 g de Na2HPO4 en 100 mL de agua destilada.
Solución B. Disolver 2.76g de NaH2PO4·H2O en 100 mL de agua destilada.
Para el amortiguador pH 7.4, tomar 81 mL de la Solución A y 19 mL de la Solución B. Almacenar a
4°C. Esterilizar la solución final en autoclave.
i) Solución de Cloruros: MgCl2 6H2O 0.4 M/ KCl 1.65 M
Disolver 8.1332 g de MgCl2 6H2O + 12.302 g de KCl en agua destilada, aforar a 100 mL. Esterilizar
en autoclave y almacenar a 4°C.
j) Mezcla fracción S9
Para preparar esta mezcla se requieren dos tubos estériles de 16 x 150 mm y descongelar previamente
la fracción S9 en baño de agua con hielos (4°C). Tomar las alícuotas indicadas en la Tabla 4 y mezclar
siguiendo las instrucciones posteriores. Pesar la glucosa 6P y el NADP+, usando aplicadores de madera
para poder pesar los reactivos, (con una navaja, una de las puntas del aplicador de madera se plana para
poder tomar el reactivo y pesarlo), vaciarlos cada uno a tubos Eppendorf de 1.5 mL.
BORRADOR, COLE
GIO D
E PROFESORES TOXICOLO
GÍA, FQ U
NAM
Laboratorio de Toxicología
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA
69
Tabla 4. Alícuotas para preparar la mezcla S9
Reactivos Para 1 mL de mezcla S9
Para 8 mLde mezcla S9 (Cantidad recomendada para un grupo)
Amortiguador de fosfatos 0.2 M pH 7.4 Solución de Cloruros: MgCl2 6H2O 0.4 M/ KCl 1.65 M Glucosa-6-fosfato* NADP+* S9
0.9 mL 0.02 mL
0.0013 g 0.0030 g 100 μL
7.2 mL 0.16 mL
0.0104 g 0.024 g 0.8 mL
*Antes de iniciar pedir al profesor que proporcione los tubos Eppendorf de 1.5 mL con la glucosa 6P
y el NADP+ pesados en la cantidad correspondiente, empleando para ello aplicadores de madera
desechables.
En un tubo estéril de 16x 150mm, añadir el amortiguador de fosfatos y la solución de cloruros, mezclar
en vortex, tomar una alícuota de 500 PL(con micropipeta) y añadirla en el tubo Eppendorf que contiene
a la glucosa 6P para disolverla y agregarla al resto del tubo de 16 x 150 mm, mezclar nuevamente en el
vortex. Tomar nuevamente otra alícuota de 0.5 mL y añadirla al tubo Eppendorf que contiene el
NADP+ para disolverlo, agregar al resto del tubo de 16 x 150 mm. Mezclar la fracción S9 y tomar la
alícuota correspondiente para añadirla al tubo de 16 x 150 mm, mezclar en vortex perfectamente y
filtrar utilizando una unidad Swinex (Millipore, 0.45 µm), obteniendo el filtrado en otro tubo de
16x150mm ESTÉRIL. Alicuotar 1.3 mL de la mezcla para cada equipo en tubos Eppendorf.
NOTA 6: Tomar en cuenta que la mezcla siempre debe estar en hielo.
APÉNDICE III: DISPOSICIÓN DE RESIDUOS
R1: Sobre doble con muestra ambiental y disolvente CH2Cl2.
R2: puntas para micropipeta y tubos de plástico.
R3: Concentrado de muestra ambiental en DMSO, este extracto puede contener hidrocarburos
aromáticos policíclicos y otros compuestos mutagénicos.
R4: Cajas de Petri con cultivo bacteriano de Salmonella typhimurium, cepa TA98. BORRADOR, C
OLEGIO
DE PROFESORES TOXIC
OLOGÍA, F
Q UNAM