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DETECCIÓN DE RESISTENCIA EN BACILOS GRAM NEGATIVOS

Enterobacterias

GLORIA D. PACHECO S. Especialista de Aplicaciones Senior BDDS México

[email protected] Cel.: 5541947702

Importancia de estudiar la Resistencia Bacteriana

Ø  Amenaza Pública Mundial Ø  Microorganismos multirresistentes Ø  La diseminación hospitalaria Ø  Aumento en los costos de

hospitalización Ø  Utilizar adecuadamente los antibióticos

actuales y hacer un uso racional de ellos.

A qué nos enfrentamos en nuestra rutina?

•  En E. coli o Klebsiella •  Cuando el fenotipo no está de acuerdo con prueba de confirmación

de ESBL en Vitek, MicroScan, Phoenix u otro sistema de susceptibilidad automatizado (e.j. Ceftazidima es I o R pero la prueba confirmatoria de ESBL es Negativa).

•  En cualquier Enterobacteriaceae •  Una de las Cefalosporinas de 3ª. Generación es I o R y el resultado

de la prueba confirmatoria de ESBL no esta dispone. •  Exista un patrón de resistencia atípica a varios antibióticos (e.j. P.

mirabilis resistente a múltiples fármacos). •  Resistente a todos los antibióticos excepto Imipenem •  Resistente a Ertapenem, Imipenem o Meropenem.

Guía e Interpretación (Rev. 2-21-12) – Paul C. Schreckenberger, Ph. D., Violeta Rekasius, MT(ASCP)

Ø Método confirmatorio de Difusión en Disco para ESBLs, AmpC, K1 y KPC

Ø  Incluye 12 discos de antibióticos: CAZ, CAZ/CLA, CTX, CTX/CLA, ATM, CRO, FOX, CTT, FEP, ERT, IMP, MEM

Ø  Se usan placas de MH de 150 mm

Ø  Todas las especies de Enterobacterias con patrones de susceptibilidad: ESBLs, AmpC, K1, KPC, MLB

Método de Potenciación del Doble Disco (Test de 12 discos)

Método de Potenciación del Doble Disco (Test de 12 discos)

1.   Agar MH y los sensidiscos a la temperatura ambiente

2.   Preparar una suspensión bacteriana a 0,5 McFarland

3.   Sembrar en 3 planos sobre la superficie del agar MH

4.   Colocar los todos los sensidiscos sobre la placa de agar MH en

la misma placa de agar MH y en orden especificado

5.   Incubar durante la noche a 35 °C

6.   Al día siguiente leer y registrar todas las zonas de inhibición.

M02- Sección 9.2 CLSI

MÉTODO DE POTENCIACIÓN DEL DISCO DOBLE (TEST de 12 discos)

2

3

4

1

5 6

7

8

9

10

11

12

CTX-CLA

ATM

FEP

CRO FOX CTT

MEM

ERT

IMP

CTX

CAZ

CAZ-CLA

Plantilla para colocar los discos en el Test de 12 discos

Detección fenotípica de β-Lactamasas Bacilos Gram Negativos Entéricos

Familia Enterobacteriacea: Ø  ESBLs Ø  AmpC Ø  K1 Ø  KPC y MLB

β-Lactamasas de Espectro Extendido

ESBLs

ESBLs: Características funcionales •  Hidrólisis de:

•  Penicilinas / Cefalosporinas (vía oral) •  Cefalosporinas de 3ª y 4ª Generación •  Monobactámicos

•  No tiene actividad frente a: •  Cefamicinas (Cefoxitina Sensible) •  Carbapenems (IMP, MER, ERT)

•  Usualmente es inhibida por: •  Clavulanato •  Sulfonas •  Avibactam (NXL-104)

•  Plasmídicas

Clase A (Ambler) – Grupo 2be

ESBLs en microorganismos diferentes de Klebsiella, E. coli y P. mirabilis

•  La mayoría de Laboratorios no intentan detectar ESBLs en microorganismos diferentes de E. coli y Klebsiella

•  Dos indicaciones para la prueba de ESBLs en otros microorganismos: •  ESBLs detectada en Klebsiella, E. coli y P. mirabilis •  Fenotipo sospechoso

•  Cual prueba? •  Usar una prueba especifica (confirmatoria)

Test de Sinergia de Doble Disco para la detección de ESBLs

Ceftriaxona

Cefoxitina Ceftazidima

Cefotaxima

Amoxicilina-Clavulanato

Test de Sinergia de Doble Disco para la detección de ESBLs

Ceftazidima

Cefotaxima

Ceftazidima Clavulanato

Cefotaxima Clavulanato

CLSI M100-S23, 2013

Detección de ESBLs β-Lactamasas de Espectro Extendido Para la detección de ESBLs se usan discos de Ceftazidime y Cefotaxime con y sin Ac. Clavulánico Método del disco combinado (CLSI M100-S23) E.coli con ESBLs

11mm

CAZ/CLAV =22 mm

CAZ =11 mm 22 –11 = > 5mm

ESBL

22 mm

Como reconozco una ESBL en Enterobacterias

•  Resistencia neta a Cefalotina •  Sensibilidad a IMP y/o MER •  Sensibilidad a FOX (Kl-, Pmi, Eco, Sal, Shi) •  Efecto huevo entre AMC y las C3aG •  Halos/MICs de Penicilina, C2aG, C3aG,

C4aG y AZT afectados

Dificultades la Prueba de ESBLs

•  Alto nivel de expresión de AmpC puede impedir el reconocimiento de una ESBLs

•  Problema con especies que producen β-lactamasa AmpC inducible codificada cromosómicamente (ej. Enterobacter, Serratia, Providencia, etc.)

•  Problema con E. coli y K. pneumoniae que adquieren plásmidos de AmpC

•  Clavulanato puede actuar como un inductor de alto nivel de AmpC e incrementar resistencia a los antibióticos de screening, dando falsos negativos en la prueba confirmatoria de ESBLs

¿Cuándo realizar el Test de los 12 Discos para detectar ESBLs?

Para confirmar la presencia de ESBLs:

Ø  E. coli o Klebsiella spp. con un fenotipo que no concuerde con la prueba de confirmación de ESBLs en los sistemas automatizados (por ejemplo, Ceftazidima es I o R, pero la prueba confirmatoria de ESBLs es Neg)

Ø  Enterobacteria presente una de las Cefalosporinas 3ª I o R y no tener un resultado de confirmación de ESBLs

Ø  Enterobacteria con un patrón atípico de resistencia (Por

ejemplo, P. mirabilis resistente a múltiples drogas)

Ø  Enterobacteriaceae resistente a: •  Todos los fármacos, excepto Imipenem •  Ertapenem, Imipenem o Meropenem

Detección de ESBLs β-Lactamasas de Espectro Extendido Método de Potenciación del Disco Doble P. mirabilis con ESBLs

Efecto del Clavulánico indicativo de ESBLs

β-Lactamasas AmpC

β-Lactamasa tipo AmpC Clase C (Ambler) – Grupo 1

•  Cromosómica •  Exp. Inducible / Derreprimida •  No se inhibe por:

•  Acido Clavulánico •  Sulbactam •  Tazobactam

•  Inhibida por: •  Oxacilina •  Cloxacilina •  Acido Borónico

•  Variantes plasmídicas •  FOX R/I/S

β-Lactamasa AmpC

M Y S P A C E

-  Morganella -  Yersinia - Serratia - Providencia/P. aeruginosa - Aeromonas - Citrobacter freundii - Enterobacter, Hafnia

•  Cefalosporinasa •  Hidroliza todos los antibióticos β-lactámicos excepto

Carbapenems y Cefepime •  Algunas son inducibles •  Características de ciertos géneros:

E. coli con AmpC

mediada por plásmidos

Como reconozco en Enterobacterias AmpC Plasmídica

•  Resistencia neta a Cefalotina •  Sensibilidad a IMP y/o MER •  Resistencia o Sensibilidad a FOX (Kl-, Pmi, Eco, Sal, Shi) •  Sinergia entre APB y las C3G (y FOX) •  Halos/MICs de C3G y AZT afectados

(bajo nivel de Resistencia) •  Halos/MICs de C4G no afectados

ESBLs vs. AmpCs ESBLs AmpCs

Inhibidores (Pip/tazo, Amp/sulbactam, Amox/clav) S R

Cefoxitina, Cefotetan S R

Ceftazidima Ceftriaxona R R

Cefepime S/R S

S. marcescens con AmpC Cromosomal y ESBL

E. cloacae con AmpC Cromosomal y ESBL

Detección de β-Lactamasas AmpC E. coli con AmpC mediada por plásmidos- Método de Potenciación del disco doble

No efecto clavulánico

Cefepime (FEP) – S

Cefoxitin (FOX) – R

= AmpC

E. cloacae con AmpC Cromosomal y ESBLs positiva

Método de Potenciación del disco doble

Detección de β-Lactamasas AmpC

Efecto Clavulánico entre Cefepime

y el disco que contiene el Ácido Clavulánico

= ESBL

Cefepime (FEP) – S

Cefoxitina (FOX) – R = AmpC

Detección de β-Lactamasas K1

Ø  Producidas por K. oxytoca con resistencia a Ampicilina

Ø  Hiperproducción confiere resistencia a Penicilinas, Cefuroxima, Aztreonam, Ceftriaxona pero son sensibles a CAZ y CTX

Ø  Se usan los discos de ATM, CRO, CTX, CAZ para detectar estas Beta-Lactamasas

Detección de β-Lactamasas K1 Método de Potenciación del disco doble K. oxytoca con β-lactamasa cromosomal K1 , ESBL Negativo, AmpC Neg

Ceftazidime-S

No efecto clavulanico Neg ESBLs

Cefoxitina S =AmpC Neg

Aztreonam-R

Cefotaxime-S

Ceftriaxona-R

CARBAPENEMASAS

Resistencia a Carbapenems

•  No Enzimáticos: •  Eflujo + Impermeabilidad •  Otras β-Lactamasas + Impermeabilidad

•  CTX-M / AmpC

•  Enzimáticos: •  Clase A carbapenemasas (KPC, SME,…) •  Clase B metalo-β-lactamasas (IMP, VIM,…)

Detección de Carbapenemasas Método de Potenciación del disco doble – K. pneumoniae con β-Lactamasa KPC

Imipenem - S

Ertapenem - R

Posible KPC o metalo-β-lactamasa. Confirmar con Test de Hodge y Test de sinergismo de MBL con EDTA

Detección de Carbapenemasas Metalo β-Lactamasa resistencia a todos los antibióticos. Sensible al Aztreonam

Aztreonam-S

Detección de Carbapenemasas: Test de Hodge

Prueba de Hodge

•  Confirma Carbapenemasas

•  Cepas con CTX-M - no es confirmatoria por elevada proporción de falsos positivos.

IPM

MEM

ERP

Sinergia (se forma bien el huevo)

No es típico

Carbapenemasa KPC

Imágenes Dr. Marcelo Galas, Fernando Pasterán (Instituto Malbrán Bs Aires Argentina)

K. pneumoniae con ESBL, AmpC y Carbapenemasa