DETECCIÓN DE RESISTENCIA EN BACILOS GRAM NEGATIVOS
Enterobacterias
GLORIA D. PACHECO S. Especialista de Aplicaciones Senior BDDS México
[email protected] Cel.: 5541947702
Importancia de estudiar la Resistencia Bacteriana
Ø Amenaza Pública Mundial Ø Microorganismos multirresistentes Ø La diseminación hospitalaria Ø Aumento en los costos de
hospitalización Ø Utilizar adecuadamente los antibióticos
actuales y hacer un uso racional de ellos.
A qué nos enfrentamos en nuestra rutina?
• En E. coli o Klebsiella • Cuando el fenotipo no está de acuerdo con prueba de confirmación
de ESBL en Vitek, MicroScan, Phoenix u otro sistema de susceptibilidad automatizado (e.j. Ceftazidima es I o R pero la prueba confirmatoria de ESBL es Negativa).
• En cualquier Enterobacteriaceae • Una de las Cefalosporinas de 3ª. Generación es I o R y el resultado
de la prueba confirmatoria de ESBL no esta dispone. • Exista un patrón de resistencia atípica a varios antibióticos (e.j. P.
mirabilis resistente a múltiples fármacos). • Resistente a todos los antibióticos excepto Imipenem • Resistente a Ertapenem, Imipenem o Meropenem.
Guía e Interpretación (Rev. 2-21-12) – Paul C. Schreckenberger, Ph. D., Violeta Rekasius, MT(ASCP)
Ø Método confirmatorio de Difusión en Disco para ESBLs, AmpC, K1 y KPC
Ø Incluye 12 discos de antibióticos: CAZ, CAZ/CLA, CTX, CTX/CLA, ATM, CRO, FOX, CTT, FEP, ERT, IMP, MEM
Ø Se usan placas de MH de 150 mm
Ø Todas las especies de Enterobacterias con patrones de susceptibilidad: ESBLs, AmpC, K1, KPC, MLB
Método de Potenciación del Doble Disco (Test de 12 discos)
Método de Potenciación del Doble Disco (Test de 12 discos)
1. Agar MH y los sensidiscos a la temperatura ambiente
2. Preparar una suspensión bacteriana a 0,5 McFarland
3. Sembrar en 3 planos sobre la superficie del agar MH
4. Colocar los todos los sensidiscos sobre la placa de agar MH en
la misma placa de agar MH y en orden especificado
5. Incubar durante la noche a 35 °C
6. Al día siguiente leer y registrar todas las zonas de inhibición.
M02- Sección 9.2 CLSI
MÉTODO DE POTENCIACIÓN DEL DISCO DOBLE (TEST de 12 discos)
2
3
4
1
5 6
7
8
9
10
11
12
CTX-CLA
ATM
FEP
CRO FOX CTT
MEM
ERT
IMP
CTX
CAZ
CAZ-CLA
Plantilla para colocar los discos en el Test de 12 discos
Detección fenotípica de β-Lactamasas Bacilos Gram Negativos Entéricos
Familia Enterobacteriacea: Ø ESBLs Ø AmpC Ø K1 Ø KPC y MLB
ESBLs: Características funcionales • Hidrólisis de:
• Penicilinas / Cefalosporinas (vía oral) • Cefalosporinas de 3ª y 4ª Generación • Monobactámicos
• No tiene actividad frente a: • Cefamicinas (Cefoxitina Sensible) • Carbapenems (IMP, MER, ERT)
• Usualmente es inhibida por: • Clavulanato • Sulfonas • Avibactam (NXL-104)
• Plasmídicas
Clase A (Ambler) – Grupo 2be
ESBLs en microorganismos diferentes de Klebsiella, E. coli y P. mirabilis
• La mayoría de Laboratorios no intentan detectar ESBLs en microorganismos diferentes de E. coli y Klebsiella
• Dos indicaciones para la prueba de ESBLs en otros microorganismos: • ESBLs detectada en Klebsiella, E. coli y P. mirabilis • Fenotipo sospechoso
• Cual prueba? • Usar una prueba especifica (confirmatoria)
Test de Sinergia de Doble Disco para la detección de ESBLs
Ceftriaxona
Cefoxitina Ceftazidima
Cefotaxima
Amoxicilina-Clavulanato
Test de Sinergia de Doble Disco para la detección de ESBLs
Ceftazidima
Cefotaxima
Ceftazidima Clavulanato
Cefotaxima Clavulanato
CLSI M100-S23, 2013
Detección de ESBLs β-Lactamasas de Espectro Extendido Para la detección de ESBLs se usan discos de Ceftazidime y Cefotaxime con y sin Ac. Clavulánico Método del disco combinado (CLSI M100-S23) E.coli con ESBLs
11mm
CAZ/CLAV =22 mm
CAZ =11 mm 22 –11 = > 5mm
ESBL
22 mm
Como reconozco una ESBL en Enterobacterias
• Resistencia neta a Cefalotina • Sensibilidad a IMP y/o MER • Sensibilidad a FOX (Kl-, Pmi, Eco, Sal, Shi) • Efecto huevo entre AMC y las C3aG • Halos/MICs de Penicilina, C2aG, C3aG,
C4aG y AZT afectados
Dificultades la Prueba de ESBLs
• Alto nivel de expresión de AmpC puede impedir el reconocimiento de una ESBLs
• Problema con especies que producen β-lactamasa AmpC inducible codificada cromosómicamente (ej. Enterobacter, Serratia, Providencia, etc.)
• Problema con E. coli y K. pneumoniae que adquieren plásmidos de AmpC
• Clavulanato puede actuar como un inductor de alto nivel de AmpC e incrementar resistencia a los antibióticos de screening, dando falsos negativos en la prueba confirmatoria de ESBLs
¿Cuándo realizar el Test de los 12 Discos para detectar ESBLs?
Para confirmar la presencia de ESBLs:
Ø E. coli o Klebsiella spp. con un fenotipo que no concuerde con la prueba de confirmación de ESBLs en los sistemas automatizados (por ejemplo, Ceftazidima es I o R, pero la prueba confirmatoria de ESBLs es Neg)
Ø Enterobacteria presente una de las Cefalosporinas 3ª I o R y no tener un resultado de confirmación de ESBLs
Ø Enterobacteria con un patrón atípico de resistencia (Por
ejemplo, P. mirabilis resistente a múltiples drogas)
Ø Enterobacteriaceae resistente a: • Todos los fármacos, excepto Imipenem • Ertapenem, Imipenem o Meropenem
Detección de ESBLs β-Lactamasas de Espectro Extendido Método de Potenciación del Disco Doble P. mirabilis con ESBLs
Efecto del Clavulánico indicativo de ESBLs
β-Lactamasa tipo AmpC Clase C (Ambler) – Grupo 1
• Cromosómica • Exp. Inducible / Derreprimida • No se inhibe por:
• Acido Clavulánico • Sulbactam • Tazobactam
• Inhibida por: • Oxacilina • Cloxacilina • Acido Borónico
• Variantes plasmídicas • FOX R/I/S
β-Lactamasa AmpC
M Y S P A C E
- Morganella - Yersinia - Serratia - Providencia/P. aeruginosa - Aeromonas - Citrobacter freundii - Enterobacter, Hafnia
• Cefalosporinasa • Hidroliza todos los antibióticos β-lactámicos excepto
Carbapenems y Cefepime • Algunas son inducibles • Características de ciertos géneros:
Como reconozco en Enterobacterias AmpC Plasmídica
• Resistencia neta a Cefalotina • Sensibilidad a IMP y/o MER • Resistencia o Sensibilidad a FOX (Kl-, Pmi, Eco, Sal, Shi) • Sinergia entre APB y las C3G (y FOX) • Halos/MICs de C3G y AZT afectados
(bajo nivel de Resistencia) • Halos/MICs de C4G no afectados
ESBLs vs. AmpCs ESBLs AmpCs
Inhibidores (Pip/tazo, Amp/sulbactam, Amox/clav) S R
Cefoxitina, Cefotetan S R
Ceftazidima Ceftriaxona R R
Cefepime S/R S
Detección de β-Lactamasas AmpC E. coli con AmpC mediada por plásmidos- Método de Potenciación del disco doble
No efecto clavulánico
Cefepime (FEP) – S
Cefoxitin (FOX) – R
= AmpC
E. cloacae con AmpC Cromosomal y ESBLs positiva
Método de Potenciación del disco doble
Detección de β-Lactamasas AmpC
Efecto Clavulánico entre Cefepime
y el disco que contiene el Ácido Clavulánico
= ESBL
Cefepime (FEP) – S
Cefoxitina (FOX) – R = AmpC
Detección de β-Lactamasas K1
Ø Producidas por K. oxytoca con resistencia a Ampicilina
Ø Hiperproducción confiere resistencia a Penicilinas, Cefuroxima, Aztreonam, Ceftriaxona pero son sensibles a CAZ y CTX
Ø Se usan los discos de ATM, CRO, CTX, CAZ para detectar estas Beta-Lactamasas
Detección de β-Lactamasas K1 Método de Potenciación del disco doble K. oxytoca con β-lactamasa cromosomal K1 , ESBL Negativo, AmpC Neg
Ceftazidime-S
No efecto clavulanico Neg ESBLs
Cefoxitina S =AmpC Neg
Aztreonam-R
Cefotaxime-S
Ceftriaxona-R
Resistencia a Carbapenems
• No Enzimáticos: • Eflujo + Impermeabilidad • Otras β-Lactamasas + Impermeabilidad
• CTX-M / AmpC
• Enzimáticos: • Clase A carbapenemasas (KPC, SME,…) • Clase B metalo-β-lactamasas (IMP, VIM,…)
Detección de Carbapenemasas Método de Potenciación del disco doble – K. pneumoniae con β-Lactamasa KPC
Imipenem - S
Ertapenem - R
Posible KPC o metalo-β-lactamasa. Confirmar con Test de Hodge y Test de sinergismo de MBL con EDTA
Detección de Carbapenemasas Metalo β-Lactamasa resistencia a todos los antibióticos. Sensible al Aztreonam
Aztreonam-S
Prueba de Hodge
• Confirma Carbapenemasas
• Cepas con CTX-M - no es confirmatoria por elevada proporción de falsos positivos.
IPM
MEM
ERP
Sinergia (se forma bien el huevo)
No es típico
Carbapenemasa KPC
Imágenes Dr. Marcelo Galas, Fernando Pasterán (Instituto Malbrán Bs Aires Argentina)
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