DESARROLLO DE NANOPARTÍCULAS BIODEGRADABLES PARA EL
TRATAMIENTO DE SÍNDROMES PROVOCADOS POR ALTERACIONES
EN LA ACTIVIDAD TELOMERASA
Susana Egusquiaguirre y José Luis Pedraz Bilbao, 19 de Noviembre de 2013
Disqueratosis Congénita (DC)
Savage, Sharon A and Alter, Blanche P. (2009)
Alteraciones mucocutáneas
Distrofia ungueal
Pigmentación anormal
Leucoplasia en la mucosa oral
Envejecimiento prematuro Fallos en la médula ósea
Fibrosis pulmonar Predisposición al cáncer
ENFERMEDADES RARAS: < 5 casos por 104 hab
DC: 1 - 9 casos por 106 hab PREVALENCIA
MANIFESTACIONES CLÍNICAS
2
Repetición secuencia ADN (TTAGGG)n Protección extremos cromosomas
Acortamiento en cada replicación
Patología
Daño ADN reconocido como lesión
Arresto ciclo celular
Senescencia Muerte celular
Células de pacientes con DC presentan telómeros cortos
TELÓMEROS TELÓMEROS CORTOS
TELOMERASA
ELONGAMIENTO TELOMÉTICO 3
Telomerasa
DEFECTOS EN EL MANTENIMIENTO TELOMÉRICO
Acortamiento telomérico prematuro
DEFECTOS EN LA TELOMERASA
Bessler M. et al. (2010) Dyskeratosis Congenita. FEBS Lett.
Mutaciones en genes que codifican los componentes de la telomerasa
Esencial para el mantenimiento de la longitud de los telómeros
4
Reactiva la actividad telomerasa
Rescata células de pacientes con DC de senescencia prematura
Estrategia terapéutica en investigación
Péptido GSE24.2 Dominio interno de la disquerina
Recuperación actividad telomerasa
MANTENIMIENTO DE LA TELOMERASA
5
Baja estabilidad Susceptibilidad a la degradación Corta semivida
APLICACIÓN CLÍNICA DE PÉPTIDOS: LIMITACIONES
Nanopartículas
ENCAPSULACION DE GSE24.2 EN NANOPARTÍCULAS
Nanopartículas biodegradables
(PLGA)
Nanocápsula
Nanoesfera
Eliminación por sistemas de defensa Dificultades para internalizarse
en las células
NANOPARTÍCULAS: VENTAJAS
Incremento solubilidad Protección frente a degradación Mejora la estabilidad y biodisponibilidad Control cinética de liberación Vectorización Disminución efectos adversos por reducción de dosis Varias vías de administración
6
Polímeros biodegradables: PLGA
Aprobado por FDA Biodegradable y biocompatible
Buenas propiedades mecánicas
Procesamiento sencillo
Fácil de modificar su superficie para vectorizar, incrementar su
captación celular, evitar opsonización y fagocitosis…
ÁCIDO POLI(LÁCTICO-CO-GLICÓLICO): PROPIEDADES
PLA PGA
Estructura del PLGA 7
Incremento captación celular
POLICATIONES: POLIETILENIMINA (PEI)
PEI
PÉPTIDOS DE PENETRACIÓN CELULAR (CPPs)
Traspasan a través de membranas celulares para transportar el péptido a nivel intracelular Baja toxicidad
Eficientes en diferentes líneas celulares
Péptidos no naturales derivados de γ-prolina
Interacciones electroestáticas entre NPs positivas con membranas plasmáticas negativas
8 O
O
OH
O
OH
O
N N
N
ONH
O
N N
NO
NH
O
N N
NON
H
NHO
ONH
OO
O
ONH
O
O
O
OHO
OH
O N
ONH
N
ONH
N
ONH
N
ONH
N
ONH
N
ONH NH2
OOOOOO
NH NH NH NH NH NHNH NH2
NHNH2
NH NH2NH NH2NH NH2NH NH2
Estructura de CPP1(izquierda) y CPP2 (derecha)
Desarrollar una nueva aproximación terapéutica para el tratamiento de síndromes provocados por alteraciones en la actividad telomerasa,
mediante la encapsulación del péptido GSE24.2 en nanopartículas biodegradables de PLGA
Objetivo
9
PLGA +
DCM
Solución acuosa
(GSE 24.2)
Disolución acuosa
del tensioactivo (PVA)
Disolución alcohólica
acuosa (IPA 2%)
Agitación de la suspensión de
NP
1ª EMULSIÓN O/W
2ª EMULSIÓN W/O/W
Elaboración NPs PLGA
Evaporación-Extracción del Solvente
10
Caracterización de GSE24.2-NPs
Formulación Tamaño (nm)
PDI Potencial Zeta (mV)
SAP (%p/p) Carga (µg GSE24.2/mg NPs)
PLGA NPs 231,2 0,126 -20,1 22,16 2,35
PEI-PLGA NPs 221,9 0,144 +30,4 23,03 2,08
CPP1-PLGA NPs 209,6 0,060 -19,6 5,89 1,11
CPP2-PLGA NPs 202,9 0,084 -16,4 5,67 0,81
Imágenes SEM de NPs de PLGA (A), PEI-PLGA NPs (B) o CPP1-PLGA NPs (C)
A B C
11
36 KDa 29 KDa
1 2 3 4 5 6 7
Integridad estructural de GSE24.2
Electroforesis en gel de poliactilamida (SDS-PAGE)
Péptido GSE24.2 encapsulado en NPs
Liberación in vitro de GSE24.2
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50
% li
bera
ción
GSE
24.2
Tiempo (días)
Liberación in vitro GSE24.2
PLGA NPs
PEI-PLGA NPs
CPP1-PLGA NPs
CPP2-PLGA NPs
12
Viabilidad celular
CPP1-PLGA NPs PLGA NPs PEI-PLGA NPs
Captación celular
0
20
40
60
80
100
120
0 1,25 2,5 3,75 5
% V
iabi
lida
d
mg NPs/ml
Citotoxicidad
PLGA NPs
CPP1-PLGA NPs
CPP2-PLGA NPs
PEI-PLGA NPs
13
Bioactividad de GSE24.2 encapsulado
Rescate del daño de ADN en células F9A353V
Formulación %inhibición daño de ADN
PLGA NPs 20.1
PEI-PLGA NPs 38.2
CPP1-PLGA NPs 54.6
CPP2-PLGA NPs 49.0
Reactivación telomerasa en células F9
Formulación % reactivación telomerasa
PLGA NPs 6.0
PEI-PLGA NPs 36.0
CPP1-PLGA NPs 6.5
CPP2-PLGA NPs 54.0
14
Se han desarrollado NPs de PLGA encapsulando el péptido GSE24.2 para el tratamiento de enfermedades debidas a alteraciones en la actividad telomerasa
Las NPs presentan propiedades fisicoquímicas óptimas, un perfil
de liberación sostenido y no resultaron ser tóxicas
Los estudios de captación celular demuestran que las NPs conjugadas a CPPs son internalizadas más eficientemente llegando al núcleo de las células
El péptido GSE24.2 encapsulado en las NPs es capaz de rescatar el
daño de ADN y reactivar la telomerasa en cultivos celulares
Conclusiones
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CIBERER/IIB: Rosario Perona Cristina Manguán Laura Pintado
UQC/PCB: Miriam Royo Fernando Albericio Daniel Carbajo
CIBER-BBN/NanoBioCel: José Luis Pedraz Rosa Hernández Manoli Igartua Susana Egusquiaguirre
16
Financiación:
Gobierno Vasco (Grupos Consolidados, IT-407-07) Ministerio de Economía y Competitividad (INNPACTO, IPT-2012-0674-090000)
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