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CROMATOGRAFÍACROMATOGRAFÍA

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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

GENERALIDADESGENERALIDADES

Botánico ruso Mikhail Tsweet, en 1903 utilizó una columna rellena de carbonato de calcio para separar varios pigmentos vegetales.

A.J.P. Martyn y R.L.M. Singer recibieron el premio Nobel en 1952 por sus descubrimientos en éste campo.

El término CROMATOGRAFIACROMATOGRAFIA proviene del griego chromachroma, que significa “color”, y grapheingraphein, que significa “describir”.

Es un método analítico empleado ampliamente en la separación, identificación y determinación de los componentes químicos en mezclasmezclas complejascomplejas.

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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

GENERALIDADESGENERALIDADES

El concepto se ha aplicado a una gran variedad de sistemas y técnicas, pero todos tienen en común el empleo de una fase estacionariafase estacionaria y una fase móvilfase móvil.

Los componentes de una mezcla son llevados a través de la fase estacionaria por el flujo de una fase móvil gaseosa o líquida.

Las separaciones están basadas en las diferencias en la velocidad de diferencias en la velocidad de migraciónmigración entre los componentes de la muestra.

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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

La cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes de la muestra se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es fija o estacionariaestacionaria y la otra móvilmóvil.

La velocidad de desplazamiento es función del coeficiente de distribución de cada componente entre las dos fases.

][A][A

= DFM

FE

FEFE

sólido

líquido

gel

FMFM

gas

líquido

fluido sc

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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

Proceso por el cual la FM atraviesa la columna

Eluyente columna eluato

Velocidad de flujo (mL/min)Velocidad de flujo (mL/min)

volumen de disolvente que atraviesa la columna por minuto

Velocidad de flujo lineal (cm/min)Velocidad de flujo lineal (cm/min)

longitud de columna atravesada por el disolvente en un minuto

V0

Representa físicamente los espacios intersticiales entre las partículas empaquetadas en la columna que son accesibles a la FM, e incluye además los volúmenes internos del sistema

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Representación gráfica de la respuesta del detector en función del tiempo, volumen de eluyente o distancia en el lecho cromatográfico

funcionamiento del sistema cromatográfico

Información analítica relativa a la muestra

el tiempo que tarda el máximo de un pico en ser eluido después de la inyección

intervalo de tiempo que transcurre desde que el trazador es insertado al principio del lecho cromatográfico hasta que sale del mismo

t'R = tR - to

t0

tR

t’R

diferencia entre el tiempo de retención del analito y el volumen muerto de la columna, es decir, el tiempo que un analito es retenido en la columna comparado con un compuesto no retenido

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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

Fundamento del proceso cromatográfico

Forma de realizar dicho proceso

TIPOS DE CROMATOGRAFÍA

TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

La naturaleza de las fases móvil y estacionaria y la clase de equilibrios implicados en la transferencia de los solutos entre las fases, es decir, el mecanismo de interacción.

dispositivo utilizado para conseguir el contacto entre la fase móvil y la estacionaria.

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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

CLASIFICACIÓNCLASIFICACIÓN

Los métodos cromatográficos son de dos tipos:* Cromatografía en columna* Cromatografía plana

Cromatografía en columnaCromatografía en columna. Donde la fase estacionaria se mantiene dentro de un tubo angosto y la fase móvil es forzada a pasar a través del tubo bajo presión o por gravedad.

Cromatografía planaCromatografía plana. Donde la fase estacionaria esta sostenida por una placa plana o en los poros de un papel. En este caso, la fase móvil se mueve a través de la fase estacionaria por acción capilar o bajo la influencia de la gravedad.

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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

AFINIDADAFINIDAD

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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

APLICACIONESAPLICACIONES

Análisis cualitativo Análisis cuantitativo:

* Análisis basado en la altura del pico* Análisis basado sobre el área del pico* Calibración con estándares* Método del estándar interno

IMPORTANCIA DE LA CROMATOGRAFÍAIMPORTANCIA DE LA CROMATOGRAFÍA

Permite separar componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas, lo que en muchas ocasiones resulta imposible realizar por otros medios

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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

DATOS IMPORTANTES

Las separaciones cromatográficas pueden clasificarse en cromatografía en columna y cromatografía planar, esta clasificación esta basada en la forma como las fases estacionaria y móvil se ponen en contacto.

Los métodos cromatográficos en columna se clasifican en cromatografía de líquidos y cromatografía de gases.

De modo general las aplicaciones de la cromatografía están orientadas al Análisis Cualitativo y al Análisis Cuantitativo (basado en la altura del pico, áreas del pico, calibración y patrones, estándar interno, normalización de áreas).

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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

CROMATOGRAFIA PLANA

Cromatografía en papel

Cromatografía en capa delgada

TLC (Thin Layer Chromatography)

Cromatografía en capa delgada de alto rendimiento

HPTLC (High performance Thin Layer Chromatography)

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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

CROMATOGRAFIA EN CAPA DELGADA (TLC – HPTLC)

PROCEDIMIENTO

Elección de la fase estacionaria Elección de la fase móvil Acondicionamiento de la placa

¿Requiere activación? Aplicación de la muestra Acondicionamiento de la cámara de desarrollo Desarrollo del cromatograma Secado de la placa Visualización Interpretación de los resultados:RfCuantificación

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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

CROMATOGRAFIA EN CAPA DELGADA (TLC)

SOPORTE Vidrio, plástico o metal (20 x 20 cm) con o sin CaSO4

FASE ESTACIONARIA Sílica gel Kieselguhr (tierra de diatomeas) Alumina (Óxido de Aluminio) Celulosa y derivados Resinas de cambio Iónico Poliamidas (plásticos semicristalinos) Fase ligada

FASE MÓVIL Uno o varios disolventes según la polaridad deseada

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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

FACTORES QUE AFECTAN AL Rf

FASE ESTACIONARIA Calidad y presencia de impurezas Presencia o ausencia de CaSO4

Naturaleza del cromatoplato, espesor, homogeneidad y preparación (extemporánea)

Grado de activación en TLC de adsorción

FASE MÓVIL Composición y naturaleza Grado de saturación de vapor en el tanque

TEMPERATURADIMENSIONES DEL TANQUEDISTANCIA DE DESARROLLORELACIÓN MASA / SUPERFICIE EN LA PLACA

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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

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La muestra se diluye en un solvente volátil (0.01-0.1%)

Se aplica la muestra de 1-2 cm del extremo de la placa usando un capilar

Diámetro de la mancha de 5mm

La placa se instala dentro de una cámara o cubeta con disolvente

Cámara o cubeta

La muestra sube por capilaridad, arrastrando los componentes de la mezcla con él

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SeparaciSeparacióónn

DetecciDeteccióónn

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Identificación

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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

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