CONTENIDO Justificación: ........................................................................................................................................ 2
Objetivos: ............................................................................................................................................ 3
General: ........................................................................................................................................... 3
Específicos: ...................................................................................................................................... 3
Problemas a resolver, priorizándolos .................................................................................................. 3
Procedimiento y descripción de las actividades realizadas: ............................................................... 4
Identificación de Sintomatología. ................................................................................................... 4
Toma de muestra. ........................................................................................................................... 5
Metodología para la toma de muestra. .......................................................................................... 5
Extracción de ARN. .......................................................................................................................... 6
Protocolo para la extracción de ARN Tripure de Roche. ................................................................. 7
Reactivos para la extracción de ARN. .............................................................................................. 7
Análisis cualitativo y cuantitativo de las muestras extraídas. ......................................................... 8
Protocolo para la cuantificación de ARN. ........................................................................................ 9
RetroTranscripción. ......................................................................................................................... 9
Protocolo para la Retrotranscripción de Promega. ....................................................................... 10
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). ................................................................................ 12
Protocolo para la PCR. ................................................................................................................... 13
Electroforesis en gel para verificar integridad de las muestras. ................................................... 14
Protocolo de electroforesis. .......................................................................................................... 15
Resultados, planos, gráficas, prototipos, maquetas, programas, entre otros .................................. 16
Conclusiones y recomendaciones: .................................................................................................... 22
Competencias desarrolladas y/o aplicadas: ...................................................................................... 24
JUSTIFICACIÓN:
La papaya se obtiene del árbol conocido como papayo, originario de las zonas tropicales de México
y Centroamérica. Se cultiva en terrenos de muy distinta naturaleza, pero es fundamental que éstos
sean ricos en materia orgánica y que contengan una humedad abundante (AMSDA, 2015).
La papaya es un frutal de gran producción en el mundo. México es el quinto productor con
764,514 toneladas, con un rendimiento de 514,166 Hg/Ha (FAOSTAT, 2013). Para el año 2014,
Colima tuvo una producción de papayo de 98, 499 toneladas, con un rendimiento de 53.58
Ton/Ha de papaya generando un valor de producción de 462.612 millones (SIAP, 2014). En Colima
se generan más de 1500 empleos directos, lo que convierte a este sistema producto en uno de los
tres principales con mayor derrama económica en el estado después del limón y plátano.
(Coepapaya, 2009).
El virus de la mancha anular de la papaya (Papaya ring spot potyvirus, PRSV) es la enfermedad más
limitante de la producción de esta fruta, causando una enorme devastación de cultivos en varios
países de todo el mundo, reflejándose en un descenso de la producción del fruto. Un ejemplo
claro de la naturaleza devastadora de este virus es la destrucción total de los cultivos comerciales
de la industria de la papaya hawaiana en los 1990s. La presencia de áfidos vectores durante todo
el año en las plantaciones de papaya constituye una importante vía para la diseminación del PRSV,
por lo que la industria papayera ha sufrido daños que se reflejan en cuantiosas pérdidas en campo
(50-80%) y en postcosecha (30 y 40%).
En la naturaleza, la supervivencia de los virus que infectan a las plantas depende en gran medida
de su capacidad para dispersarse a nuevos hospederos; las especies arvenses que se encuentran
en los cultivos de papaya pueden fungir como reservorios de varios virus, incluyendo el PRSV. Por
lo anterior, resulta relevante investigar la existencia de hospederos alternos del PRSV para así
poder tomar medidas para su control.
OBJETIVOS:
General:
- Detectar mediante RT-PCR la presencia del PRSV en especies arvenses del cultivo del
papayo.
Específicos:
- Realizar la colecta de muestras vegetales de papaya y especies arvenses en la comunidad
conocida como “las conchas” municipio de Ixtlahuacán, Colima.
- Extraer el ARN utilizando el protocolo del reactivo Tripure de Roche.
- Verificar la calidad e integridad del RNA extraído mediante espectroscopía y electroforesis
en geles de agarosa.
- Realizar las reacciones de retrotranscripción a las muestras con el kit “Reverse
Transcription System” de Promega.
- Realizar las reacciones de PCR con primers universales para Potyvirus.
PROBLEMAS A RESOLVER, PRIORIZÁNDOLOS
El control convencional del PRSV se realiza en campo con una cuadrilla de personal llamados “los
buscadores de virus”, los cuales están capacitados para identificar plantas enfermas en campo y
eliminarlas para evitar la propagación del virus en la plantación. Gran parte de los cultivos
comerciales de papayo en el estado de Colima tienen mal manejo o carecen de manejo
agronómico para el control de malezas. Por lo anterior, el principal problema es la elevada
cantidad de especies arvenses entre los surcos y periferia de los cultivos, de las cuales, algunas
presentan síntomas virales, que podrían estar asociados al PRSV. Para contribuir a minimizar los
daños ocasionados por PRSV es importante hacer del conocimiento de los productores cuales son
las especies de maleza que son hospederas del virus para que puedan tomar medidas directas de
control.
PROCEDIMIENTO Y DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS:
Identificación de Sintomatología
La planta enferma presenta síntomas variados. Inicialmente se observan clorosis y moteados en
las hojas más nuevas acompañados de aclaramiento de las nervaduras. Posteriormente se
presentan mosaico y bolsas o vejigas en las hojas, lo que le da un aspecto rugoso o encarrujado a
la lámina foliar. Cuando el ataque es severo ocurre la deformación de los folíolos y reducción de la
lámina quedando restringida a las nervaduras principales (filiformes). Sobre el tallo, pecíolos y
pedúnculos se observan manchas en forma de bandas, o irregulares, de color verde oscuro y de
apariencia aceitosa. En los frutos estas manchas son en forma de anillos concéntricos. Así mismo
pueden deformarse, pierden el aroma y presentan descenso en el contenido de sólidos solubles.
Las plantas afectadas en alto nivel se estancan en su desarrollo, por lo cual su crecimiento se
retarda, las hojas formada son pequeñas y el pecíolo se acorta (Fig. 1).
Las malezas hospederas generalmente son plantas de la familia Cucurbitaceae, como la sandía,
melón, pepino, ahuyama, calabaza, mostacha, meloncillo (melón de golero) y balsamina. Igual
Fig. 1
Sintomatología del VMAP en papayo
ocurre con plantas de la familia Chenopodiaceae como cenizo y quinoa, y algunas leguminosas
silvestres, que son hospedantes asintomáticos (Fig. 2).
Fig. 2
Maleza hospedera de virus de la familia Curcubitaceae, en la foto de la izquierda se observa la
clorosis en hoja, síntoma típico de VMAP y a la derecha, la maleza en estado sano.
Toma de muestra
La toma de muestra se realizó en la comunidad conocida como “Las Conchas”, municipio de
Ixtlahuacán, Colima. Identificando la sintomatología en las plantas; recolectando malezas
reportadas como hospederas asintomáticas, así como posibles malezas portadoras que
presentaban síntomas virales en general.
Metodología para la toma de muestra
1. Identificación de plantas enfermas.
2. Corte de planta (conservando tallo y tejido foliar).
3. Colectar el tejido obtenido en bolsas de polietileno cerradas herméticamente para evitar
contaminación y rápida oxidación del tejido.
4. Almacenaje de muestras en hielo para su transporte y posterior análisis.
5. Realizar el protocolo de extracción de ARN en cuanto la muestra llegue al laboratorio.
Comentario [MB1]: En la carpeta que te mande hay fotos de cucurbitáceas. Utiliza fotos que tomamos y evita fotos de internet. Igual para las de papaya anteriores.
Comentario [ITC2]:
Extracción de ARN
El ARN es una molécula menos estable que el ADN, por consiguiente, se requiere de un manejo
cuidadoso para evitar su degradación. Esta inestabilidad se debe a que el azúcar de la ribosa del
ARN tiene dos grupos hidroxilo unidos al anillo de pentosa, mientras que el ADN tiene solo un
grupo hidroxilo. Esto es un problema, debido a que hace a la molécula propensa a los ataques de
ribonucleasas (RNAsas), las cuales son enzimas muy estables y por lo general no requieren
cofactores para funcionar. Es importante recalcar que una mínima cantidad de enzima es capaz de
degradar nuestra muestra.
Este problema puede ser resuelto tratando las soluciones a utilizar en el proceso de extracción con
dietilpirocarbonato (DEPC); este químico inactiva las RNAsas por modificación covalente. Para la
extracción de ARN, el químico tiocianato de guanidina (Fig. 3), es uno de los más eficaces
desnaturalizantes de proteínas utilizados, y es actualmente, uno de los más utilizados para
elaborar soluciones comerciales para extracción de ARN, tales como Trizol (Invitrogen) y Tripure
(Roche).
Fig. 3
Estructura química del Tiocianato de
Guanidina
Protocolo para la extracción de ARN Tripure de Roche
1. Agregar 1 ml de Tripure® por 50-100 mg de tejido pulverizado.
El volumen de la muestra no debe ser más grande que 10% del volumen de Tripure®
2. Homogeneizar tejido
La cantidad de moléculas de ADN en la purificación de ADN depende de la fuerza aplicada
durante la homogeneización.
3. Centrifugar a 12,000 g / 10 min. A 4 °C y recuperar el sobrenadante.
4. Incubar 5 minutos a una temperatura de 15-25 °C para disociar nucleoproteínas
complejas.
5. Agregar cloroformo (0.2 ml por cada ml de Tripure®), agitar vigorosamente 15 seg. Incubar
de 2 a 15 minutos a una temperatura de 15 – 25 °C
6. Centrifugar el tubo a 12,000 g por 15 minutos a 4 °C
No exceder 12,000 g durante la centrifugación
7. Tomar la parte superior incolora del tubo y transferirla a un tubo nuevo
Se obtienen 3 fases después de la centrifugación, en la fase acuosa encontramos ARN, en
la interfase blanca ADN y la parte orgánica de color rojo proteínas.
8. Agregar isopropanol (0.5 ml por cada ml de Tripure®) y mezclar por inversión, incubar de
5-10 min a una temperatura de 15-25 °C
9. Centrifugar a 12,000 g por 10 min a una temperatura de 4 °C y retirar el sobrenadante
10. Lavar el pellet con etanol al 75% (1 ml de etanol por cada ml de Tripure®)
11. Centrifugar a 7,500 g 5 min a 4 °C, retirar el sobrenadante
12. Secar por 7 min, resuspender en agua-Depc, incubar de 10 a 15 min a una temperatura de
55-60 °C.
13. Almacenar a una temperatura de -15 a -25 °C.
Reactivos para la extracción de ARN. Tripure
Etanol al 75%
Dietilpirocarbonato en agua libre de RNAsas o en solución de SDS al 0.5%
Isopropanol.
Análisis cualitativo y cuantitativo de las muestras extraídas.
La espectrofotometría es un método de análisis óptico que nos permite comparar la radiación
absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una
que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.
Para el análisis de las muestras extraídas de los tejidos vegetales obtenidos, se utilizó el equipo
Nanodrop 2000, este aparato puede medir con precisión muestras purificadas de ADN y ARN con
concentraciones cercanas a <15,000 ng/μl y sin dilución. El software utiliza automáticamente la
trayectoria óptima de la longitud de la luz para medir la absorbancia de cada muestra.
La relación de absorbancias 260/280 nm (Fig. 4), se utiliza para evaluar la pureza del ADN y ARN.
Una proporción de aproximadamente 1.8 es generalmente aceptable como un ADN puro, mientras
que para el ARN la proporción es de 2.0. Si la relación es un poco más baja, en cualquiera de los
casos, esto es indicador de la presencia de proteínas, fenol u otros contaminantes que absorben
fuertemente en longitudes de onda sobre los 280 nm.
Fig. 4 Relación de absorbancias 260/280 para ácidos nucleicos.
La relación de absorbancias a 260 y 230 nm es una medida secundaria de la pureza de los ácidos
nucleicos, los valores de la proporción 260/230 son superiores a los de la relación 260/280 y se
encuentran en el rango de 1.8 a 2.2. Si estos coeficientes son menores, es indicativo de la
presencia de contaminantes que absorben a 230 nm tales como fenol y carbohidratos (Gallager,
2008).
Protocolo para la cuantificación de ARN.
1. Encender el Nanodrop y computadora para que se establezca la conexión entre ellos, esperar a
que se muestre el display del software, indicar el parámetro a medir (ácidos nucleicos, type RNA).
2. Calibrar el equipo con un microlitro de solución buffer (el utilizado para diluir la muestra),
colocándolo en el detector, dar click en la opción “Blank”, esperar la lectura del Nanodrop y
posteriormente limpiar el pedestal.
3. Una vez calibrado el equipo, se coloca un microlitro de muestra a cuantificar, ahora damos click
en la opción “Measure” y se limpia el pedestal. Cuando se hace la primera lectura, el equipo ofrece
la opción de guardar la corrida, se guarda en la carpeta y el nombre a elegir y se prosigue con el
protocolo.
4. Se repite el paso 3 hasta terminar de leer todas las muestras.
RetroTranscripción.
La retrotranscripción es un proceso de la biología molecular que implica la generación de una
cadena de ácido desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena a partir de un ácido ribonucleico
(ARN) de cadena simple. El Producto de doble cadena obtenido recibe el nombre de ADNc (ADN
complementario). Dicha actividad está mediada por varias enzimas, si bien la clave es la
transcriptasa inversa o retrotranscriptasa.
Se describió por primera vez en virus de la familia Retroviridae (Fig. 5), de forma independiente
por los investigadores Howard Temin and David Baltimore en 1970, su descubrimiento supuso la
primera excepción del dogma central de la biología molecular, en el que la información génica fluía
solo desde el ADN al ARN.
Fig. 5 Proceso de la RetroTranscripción realizada por los Retrovirus.
El kit para la retrotranscripción utilizado fue el de Reverse Transcriptios System de Promega
de la casa Promega, este procedimiento requiere de hasta 5μg de ARN total por reacción, poli ( A)
+ mRNA o ARN sintético, y se lleva a cabo en 20μl de componentes del Sistema Reverse
Transcriptios System de Promega™ .
Protocolo para la Retrotranscripción de Promega.
El siguiente procedimiento se basa en convertir 5µg de ARN en aproximadamente 500ng de
poli(A) ARN que será la hebra simple de ADNc.
1. Mezcle y centrifugue cada componente antes de utilizarlo, se preparará el coctel inicial de la
siguiente manera:
ARN extraído (aproximadamente 5µg/reacción) X µl
Primer [Oligo(dT)15 (0.5µg/reacción) y/o
Random Primer (0.5µg/reacción)
o gene-specific primer (10–20pmol/reacción)] X µl
Agua libre de nucleasas X µl
Volumen final 5µl
2. Cierre cada tubo de ARN con fuerza. Coloque los tubos en un baño maría a 70 ° C durante 5
minutos. Inmediatamente enfríe en agua con hielo durante al menos 5 minutos. Centrifugar cada
tubo durante 10 segundos en una microcentrífuga para recoger el condensado y mantener el
volumen original. Mantener los tubos cerrados y en hielo hasta que se añade la mezcla de reacción
de transcripción inversa.
3. Preparar la mezcla de reacción de transcripción inversa mediante la combinación de los
siguientes componentes del Sistema de Transcripción Inversa ™ en un tubo de microcentrífuga
estéril en hielo. Preparar suficiente mezcla para permitir que se realice cada reacción de síntesis
de ADNc. Determinar los volúmenes necesarios para cada componente, y combinarlos en el orden
indicado. Vortexear suavemente para mezclar, y mantener en hielo antes de la dispensación en los
tubos de reacción.
Concentración de componentes:
Agua libre de endonucleasas (para un volumen final de 15µl) X µl
5X Reaction Buffer 4.0µl
MgCl2 (Concentración final 1.5–5.0mM) 1.2–6.4µl
PCR Nucleotide Mix (Concentración final de cada dNTP 0.5mM) 1.0µl
Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor (opcional) 20u
Reverse Transcriptase 1.0µl
Volumen final 15.0µl
4. Añadir alícuotas de 15μl de la mezcla de reacción de transcripción inversa a cada tubo de
reacción en hielo. Tenga cuidado para evitar la contaminación cruzada. Añadir 5μl de ARN y
mezcla de primers a cada reacción para un volumen final de reacción de 20μl por tubo. Si hay una
preocupación acerca de la evaporación en los pasos posteriores, superponer la reacción con una
gota de aceite mineral libre de nucleasas para evitar la evaporación y la condensación.
5. Ensamble: Coloque los tubos en un bloque de calor a temperatura controlada, equilibrada
a 25 ° C, e incubar durante 5 minutos.
6. Extensión: Incubar los tubos en un bloque de calor de temperatura controlada a 48 ° C por un
máximo de una hora. La temperatura de extensión puede ser optimizada entre 37 ° C y 55 °C.
Las reacciones se pueden mantener congelado para el almacenamiento a largo plazo
7. Desactivar transcriptasa inversa: Si el objetivo experimental es proceder con PCR, la
transcriptasa inversa debe inactivarse térmicamente antes de la amplificación. Incubar los tubos
de reacción en un calor de temperatura controlada a 95 ° C durante 15 minutos y después a 0°C
por 5 minutos.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
La PCR fue conceptualizada por Kary Mullis en 1983, y ésta ha revolucionado el análisis molecular
de las ciencias de la vida hasta el punto que el Dr. Mullis recibió su premio nobel de química en
1993 por su “invención”.
Los requerimientos para una mezcla de reacción estándar para PCR son: una ADN polimerasa
dependiente, la cual es termoestable, un ADN molde, un par de oligonucleótidos (cebadores,
primers) de interés, solución buffer de reacción, deoxi-ribonucleótidos trifosfatados (dNTP´s) y
agua grado molecular. Toda esta mezcla se coloca en tubos para PCR y se someten a determinadas
condiciones de temperaturas por tiempos determinados en un termociclador programado de
manera automática.
Un programa típico de PCR consiste de una etapa de desnaturalización, una etapa de alineamiento
y una etapa de extensión.
En la desnaturalización, se rompen los puentes de hidrógeno existentes entre las cadenas de los
ácidos nucleicos, logrando de esta manera que las dos hebras de la plantilla de ADN se separen;
este proceso en su etapa inicial dura aproximadamente 5 min a una temperatura de 94°C, una vez
que inician los ciclos, su tiempo se reduce a 30 s a la misma temperatura.
En el alineamiento, ocurre la hibridación de las cadenas separadas con los primers, la temperatura
a la cual se lleva a cabo este proceso es generalmente de 55°C (aunque depende de las
características de los oligonucleótidos), su tiempo dentro del ciclo es de aproximadamente 30s.
En la extensión, la polimerasa emplea los dNTP´s para llevar a cabo la elongación de la cadena, es
un proceso que se lleva a cabo a una temperatura de 72°C, con una duración por ciclo de 90 s, y la
extensión final tiene una duración de aproximadamente 5 min.
Protocolo para la PCR.
1. Descongelar los reactivos y hacer los cálculos necesarios de acuerdo al número de muestras a
amplificar.
2. Realizar la Coctel madre de reactivos en un tubo eppendorf de 1.5 ml estéril de acuerdo a la
siguiente tabla:
Reactante Concentración inicial Concentración final μl por reacción
Buffer de reacción 10X 1X 2.5
MgCl2 50mM 1.5 mM 0.75
dNTP´s 250 μM 100 μM 10
Primer F 25 μM 0.5 μM 0.5
Primer R 25 μM 0.5 μM 0.5
ADN polimerasa 5 U/ μl 1.5 U 0.3
ADN molde 20 ng/μl 100 ng 5
H2O - - 5.2
Tabla 1.
Concentraciones requeridas para una corrida de PCR estándar.
3. distribuir 20 μl de esta mezcla de cada uno de los tubos para PCR previamente etiquetados y
colocar 5 μl de ADNc a 20 ng/ μl.
4. Colocar los tubos en el termociclador y programar los ciclos adecuados para el ADN blanco que
se desea amplificar.
5. Analizar los productos amplificados por electroforesis en gel de agarosa al 1% (p/v) en
amortiguador TAE 1X.
Electroforesis en gel para verificar integridad de las muestras.
La electroforesis es una técnica comúnmente usada en Biología Molecular que consiste en el
movimiento de una molécula cargada bajo la influencia de un campo eléctrico. En una
electroforesis típica, la muestra se carga cerca del electrodo negativo del depósito del gel.
Cuando se aplica una corriente eléctrica, las moléculas cargadas negativamente migraran hacia el
electrodo positivo. Los ácidos nucleicos tienen carga negativa debido a sus grupos fosfato
orientados hacia el exterior (Gallagher,2008).
La separación de ácidos nucleicos por electroforesis en gel de agarosa es el método de elección
para el análisis de productos de PCR, así como para el análisis de ADN plasmídico digerido por
enzimas de restricción. Esta técnica se utiliza también para purificar fragmentos de ADN generados
por las enzimas de restricción y los productos de PCR para fines de clonación.
Un amortiguador con un pH de 8 a 8.3 es incluido en la cámara de electroforesis para
contrarrestar los cambios de pH y permitir el paso de la corriente (Armstrong y Schulz, 2008).
El gel está conformado por lo general por agarosa, la matriz de agarosa permite la separación de
ácidos nucleicos de acuerdo a sus tamaños, las moléculas más pequeñas migran más rápido a
través de los poros de la matriz, en tanto que moléculas más pesadas migran más lentamente.
El rango de voltaje empleado normalmente para esta técnica es de 1 a 10 V por cm de longitud de
electrodo a electro de la cámara de electroforesis (V/cm) y depende también del tamaño de la
macromolécula de ácido nucleico. La resolución de fragmentos grandes de ADN (por encima de 5
Kbp) se mejora si el gel corre más lentamente. Un voltaje demasiado alto provoca el
sobrecalentamiento del buffer y una mala resolución del gel, mientras que un voltaje demasiado
bajo ocasiona la difusión de los ácidos nucleicos de menor tamaño (Armstrong y Schulz, 2008).
Los ácidos nucleicos no son visibles por si solos, se requiere utilizar una solución colorante que
migren a la par con el ADN para de esta manera, observar el recorrido que realiza a través de la
cámara de electroforesis. Algunas de las soluciones utilizadas son el naranja G 6X, y el
amortiguador de carga azul de Bromofenol 6X.
Protocolo de electroforesis.
1. Preparar un gel de agarosa al 1% (p/v). Para eso se pesa 1 gramos de agarosa y se disuelve
calentándolo en 100 ml de buffer TAE 1X.
2. Dejar enfriar un poco sin que llegue a gelificar, y vaciar en la base de la cámara de electroforesis
con el peine puesto.
3. Dejar que solidifique el gel y colocarlo dentro de la cámara de electroforesis. Adicionar buffer
TAE 1X hasta cubrir por completo el gel.
4. colocar las muestras a analizar con amortiguador de carga azul de bromofenol 6X.
5. Colocar el marcador de pesos moleculares en el primer pocillo del gel.
6. Cerrar la cámara y conectarla a la corriente eléctrica a un voltaje de 100 V, en un tiempo
considerable hasta que el avance sea de ¾ del gel.
7. Apagar la fuente eléctrica.
8. Colorearlo con una solución de BrEt durante 5 min. Sacarlo y enjuagarlo con agua.
9. Visualizar en un transiluminador de luz UV.
10. Guardar imágenes y analizar.
RESULTADOS, PLANOS, GRÁFICAS, PROTOTIPOS, MAQUETAS,
PROGRAMAS, ENTRE OTROS
Se tomaron muestras de la comunidad Las Conchas, municipio de Ixtlahuacán Colima.
Coordenadas: 18°53’56.16” N, 103°37’52.32”
Se recolectaron muestras de maleza que presentaban los síntomas más visibles del virus, la
clorosis y moteado en tejido foliar, las malezas de las que se tomó muestra fueron: A. cristata, C.
afoetidissima, A. abutilastrum, y 2 muestras no identificadas que fueron enviadas al herbario
para su identificación morfológica.
Fig. 6
Predio “los cuates”, Comunidad de “las conchas”, Municipio de
Ixtlahuacán, Colima.
Para C. Papaya, se tomaron muestras de plantas que presentaban los síntomas típicos: clorosis en
hoja, pequeños halos concéntricos en el fruto (Fig. 8), deformación en el fruto y oscurecimiento
del tejido dérmico del fruto.
Fig. 7
Maleza con sintomatología típica de VMAP, colectada en la
comunidad de las conchas.
Fig. 8
Halos concéntricos en el fruto de papayo, síntoma
más visible en el fruto.
Comentario [MB3]: Muy distorsionada la foto
Las muestras tomadas fueron trasladadas al Instituto Nacional de Investigaciones Forestales,
Agrícolas y Pecuarias Unidad Tecomán para su análisis. El traslado se realizó a una temperatura
media de 4°C para evitar la oxidación acelerada del tejido. Las muestras se procesaron en cuanto
llegaron al laboratorio de Biotecnología Vegetal del INIFAP, esto para garantizar la frescura de las
muestras y evitar la sobreproducción de mucílago, el cual interfiere de una manera importante en
el análisis de resultados.
El protocolo de extracción de ARN utilizado fue el de Tripure de Roche, cuidando celosamente el
material a utilizar; esterilizado en autoclave por 15 min a 1.5lbf/plg2, además de un riguroso
enjuague con agua estéril y reposo con agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC), para evitar
contaminación con RNAsas.
Posterior a la extracción, se realizó una lectura de integridad de ARN en Nanodrop, las lecturas
obtenidas para las malezas analizadas, se muestran en la tabla siguiente:
Sample ID
User
Date and Time Nucleic
Acid Unit A260 (Abs) A280 (Abs) 260/280 260/230 Sample Type
Calabacilla
IRVING 22/09/2015 09:03:34 a. m. 2472.3 ng/µl 61.809 29.492 2.1 1.6 RNA
IRVING 22/09/2015 09:04:10 a. m. 3143.5 ng/µl 78.587 39.367 2 1.49 RNA
Cristata -1
IRVING 22/09/2015 09:04:44 a. m. 1335.2 ng/µl 33.379 17.74 1.88 0.64 RNA
IRVING 22/09/2015 09:05:10 a. m. 1030.4 ng/µl 25.759 14.207 1.81 0.53 RNA
Cristata - 2
IRVING 22/09/2015 09:05:53 a. m. 1183.2 ng/µl 29.581 16.221 1.82 0.61 RNA
IRVING 22/09/2015 09:06:18 a. m. 1019.4 ng/µl 25.486 14.196 1.8 0.53 RNA
Cristata - 3
IRVING 22/09/2015 09:06:53 a. m. 303.2 ng/µl 7.58 3.948 1.92 0.9 RNA
IRVING 22/09/2015 09:07:40 a. m. 247.4 ng/µl 6.184 3.311 1.87 0.71 RNA
Cristata - 4
IRVING 22/09/2015 09:08:09 a. m. 978.4 ng/µl 24.459 12.624 1.94 1.47 RNA
IRVING 22/09/2015 09:08:35 a. m. 1042.6 ng/µl 26.066 13.445 1.94 1.09 RNA
Tabla 2.
Cuantificación del RNA extraído de las muestras de maleza y papaya.
Se observa que las purezas en la extracción oscilan en el rango de 1.8 – 2.1, lo cual nos indica un
ARN que se puede trabajar para la RT. En la muestra “Cristata-3”, observamos un bajo rendimiento
en el proceso de la extracción, esto se debe a la presencia de tejido mucilaginoso, el cual está
compuesto por carbohidratos complejos e impide que la extracción de ARN se lleve a cabo con
éxito, sin embargo, la relación de absorbancias 260/280 nos da un rango aceptable para
procesamiento, por lo que la muestra seguirá el protocolo establecido de análisis.
#
Sample ID
User Date and Time Nucleic
Acid Unit A260 (Abs) A280 (Abs) 260/280 260/230 Sample Type
Abutilon -1
INIFA 22/09/2015 09:14:34 a. m. 556.7 ng/µl 13.918 6.888 2.02 0.74 RNA
INIFA 22/09/2015 09:15:01 a. m. 519 ng/µl 12.976 6.48 2 1.71 RNA
Abutilon -2
INIFA 22/09/2015 09:15:28 a. m. 278.3 ng/µl 6.956 3.51 1.98 0.43 RNA
INIFA 22/09/2015 09:15:58 a. m. 344.5 ng/µl 8.612 4.489 1.92 0.56 RNA
X1 - 1
INIFA 22/09/2015 09:16:32 a. m. 363.1 ng/µl 9.078 8.882 1.02 0.71 RNA
INIFA 22/09/2015 09:17:13 a. m. 178.5 ng/µl 4.462 2.619 1.7 0.39 RNA
X1 - 2
INIFA 22/09/2015 09:19:14 a. m. 165.8 ng/µl 4.145 3.197 1.3 0.69 RNA
INIFA 22/09/2015 09:19:38 a. m. 116.8 ng/µl 2.921 2.953 0.99 0.21 RNA
X2 - 1
INIFA 22/09/2015 09:20:12 a. m. 268.5 ng/µl 6.713 3.523 1.91 0.89 RNA
INIFA 22/09/2015 09:20:36 a. m. 337.4 ng/µl 8.435 4.347 1.94 1.02 RNA
X2 - 2
INIFA 22/09/2015 09:21:04 a. m. 1080.1 ng/µl 27.002 13.368 2.02 1.53 RNA
INIFA 22/09/2015 09:21:33 a. m. 1212.5 ng/µl 30.312 15.223 1.99 1.55 RNA
Tabla 3.
Lecturas de malezas en Nanodrop (continuación).
Para la siguiente relación de malezas (Tabla 2), se observa que para la muestra catalogada como
“X-1”, se tiene un nivel de pureza aceptable, mientras que la concentración es muy baja en
comparación con las demás muestras, esta muestra en especial, tenía mucha cantidad de
mucílago, lo que dificultaba su extracción.
Para las demás muestras, la dificultad no fue mucha, por lo que se obtuvieron resultados
favorables desde la primera extracción.
Para verificar la integridad del ARN extraído, se procedió a realizar un gel de Agarosa utilizando
como base el buffer SB (Sodium Borate), esto debido a que los buffer convencionales para la
corrida, tales como TAE y TBE, contienen Tris en su formulación; El Tris reacciona con el DEPC
inactivado su mecanismo de acción dentro de la solución y por ende, se desnaturaliza nuestra
molécula de ARN.
Se corrió el gel dentro de la cámara de electroforesis por un tiempo de 2.5 horas
aproximadamente con un voltaje de 150 volts, utilizando como buffer de carga una mezcla de azul
de metileno con naranja de metilo.
Para la lectura del gel, se metió en una solución con bromuro de etidio al 1% por 15 minutos,
enjuagando el gel en una solución con agua destilada por 10 minutos, se dejó secar el gel y se
pasó al fotodocumentador Bio-rad de Biosystems, se tomó una fotografía exponiendo el gel a luz
UV por 35 segundos.
Fig. 9
Gel de Agarosa con las muestras de ARN por carriles de izquierda a derecha: 1. Calabacilla, 2.
Cristata-1, 3. Cristata-3, 4. Cristata-4, 5. Papayo-1, 6. Papayo-3, 7. Papayo-5, 8. Abutilon-1, 9.
abutilon-2, 10. X1-1, 11. X2-1, 12. X2-2.
.
Se puede observar que en el carril 1, que pertenece a la muestra de Calabacilla, hay una especie
de barrido, en el que la muestra no se alcanza a distinguir de una manera uniforme como en los
carriles subyacentes, esto se puede deber a la presencia de carbohidratos en la muestra o a una
mala manipulación a la hora de cargar la muestra, de la misma manera en el carril 8, que
pertenece a Abutilon-1, se observa el mismo barrido.
Las muestras de ARN fueron almacenadas a -20°C para mantener su integridad y permitir su
reprocesamiento. Las muestras almacenadas a estas temperaturas, tienen una viabilidad
aproximada de una semana, debido a la naturaleza inestable de la molécula, por ello se debe
realizar una RT-PCR para pasar de una cadena de ARN a una doble cadena de ADNc.
Para el protocolo de Retro Transcripción, se tomó por reacción 2μl de MgCl2 25mM, 1μl de Buffer
10x, 1μl de DNTP´s 10 mM, 0.25 μl de inhibidor, 8U de RTasa, 0.5 μl de Random Primers, 3 μl de
RNA molde y 1.93 μl de Agua grado molecular.
Se trabajaron 17 reacciones de RT, cuidando en todo momento las temperaturas a emplear y que
las muestras no hayan sufrido ningún daño previo por choque térmico, manipulación,
contaminación ambiental, etc.
Las temperaturas y tiempos de trabajo se establecieron de acuerdo al protocolo de la siguiente
manera.
La muestra de ARN se mantuvieron por 10 minutos a una temperatura de 70°C, antes de que se le
agregara el coctel preparado para la reacción, posteriormente ya agregado el coctel se dejó 10
minutos a temperatura ambiente, después se pasó a una temperatura de 48°C por un tiempo de
15 minutos, por último, se mantuvo 5 minutos a 95°C y se le dio un choque térmico a 0°C por 5
minutos para después almacenar las muestras a una temperatura de -20°C.
El siguiente paso es la amplificación del segmento de ADNc que pertenece al PRSV, para ello se
trabajó con primers universales para Potivirus, el NIb2F y NIb3R, con secuencia
GTITGYGTIGAYGAYTTYAAYAA y TCIACIACIGTIGAIGGYTGNCC 1 respectivamente, estos primers
producen un amplicón de 350 pares de bases y se usaron de acuerdo a los trabajos realizados por
(Zhen et. al., 2008).
La ADN polimerasa utilizada fue la amplificasa® de BioTecMol, utilizando sus complementos del
mismo lote para asegurar su correcto funcionamiento.
La amplificación con PCR se llevó aplicando 95°C por 3 minutos para la Desnaturalización inicial,
después 35 ciclos de 95°C por 45 s, 45°C por 45 s and 72°C por 45 s; al final se dio una extensión
final por 5 min a 72°C. La concentración utilizada de primers, amplificasa y otros componentes de
la PCR se realizaron de acuerdo a (Pappu et al., 1993; Gibbs & Mackenzie, 1997; Thompson et al.,
2003).
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES:
Las muestras colectadas en la comunidad de las conchas presentaban la sintomatología referida
en la literatura referente a la enfermedad del Virus de la Mancha Anular del Papayo; La mayoría
de las muestras no presentaron mucha dificultad en el proceso de extracción, sin embargo,
1 Para las secuencias referidas, N = A+C+G+T, V = A+C+G, R = A+G, W = A+T, Y = C+T, I = deoxyinosine.
Comentario [MB4]: Se manejo anteriormente en ingles PRSV, mantenerlo de esta forma y no en español
algunas de las muestras presentaban una cantidad abundante de carbohidratos complejos tipo
goma que se conoce como “mucilago”.
La función principal del mucilago dentro de la planta es proveer de humedad a la planta en el
proceso de germinación de la semilla, además de ser la respuesta a una herida provocada en esta.
La dificultad de trabajar con este producto de la planta, es que es insoluble en sustancias
orgánicas, como las que se utilizan en el proceso de extracción de ARN; Por ello las lecturas en
Nanodrop arrojan contaminación por carbohidratos y las corridas en el gel de integridad se ven
barridas.
En general, las extracciones realizadas ofrecen valores de pureza aceptables, por lo que el
protocolo pudo ser reproducible sin ningún problema, sin embargo, fue necesario realizar varias
veces el protocolo para afinarlo; El trabajar con protocolos nuevos y herramientas que no son
parte de nuestra formación dentro de la carrera, nos obliga a practicar para poder mejorar la
técnica y el manejo de las herramientas.
Las muestras de ARN se deben almacenar a -80°C después de extraídas, se pueden guardar a
mayor temperatura como a -20°C, teniendo en cuenta que la molécula de ARN es más inestable
que la de ADN, y más fácil que se desnaturalice a esas condiciones, por lo que el almacenamiento
a esta temperatura no deberá rebasar una semana antes de su reprocesamiento.
La integridad de las muestras se vio reflejada también en el gel de agarosa, con excepción de 2
casos donde se presentó barrido, las demás se muestran más diferenciadas con respecto a las
bandas de las diferentes sub unidades de ARN. En este punto también fue necesario afinar el
método de cargado, la técnica del buffer a emplear y el voltaje requerido, ya que en un principio
se utilizaba el buffer convencional “TAE”, que al contener Tris, reaccionaba con el DEPC y las
bandas de ARN se veían difusas en el fotodocumentador; Se trabajó con buffer “SB” para evitar
esa interacción de compuestos químicos, y observar unas bandas más definidas.
La RT y la PCR dieron resultados favorables, se logró la amplificación de 6 muestras, de las cuales 3
corresponden al Papayo (Carica Papaya), 2 a la familia Curcubitaceae y 1 a una de las muestras de
las que no se tiene identificación.
El próximo paso es realizar la secuenciación de los fragmentos amplificados, y de esta manera
confirmar que se trata del VMAP.
COMPETENCIAS DESARROLLADAS Y/O APLICADAS:
Comprender, identificar, analizar y relacionar los mecanismos de control y
regulación del metabolismo celular, para aplicar en el aprovechamiento de los
procesos y recursos bióticos.
Comprender, identificar, analizar y relacionar los conceptos de la genética,
estructura y función de los ácidos nucleicos.
Comprender, identificar, analizar y relacionar los mecanismos y regulación de la
replicación, trascripción y traducción genética, para aplicar en el aprovechamiento
de los procesos y recursos bióticos.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Y VIRTUALES.
AMSDA. (24 de 09 de 2015). AMSDA. Obtenido de AMSDA:
http://www.amsda.com.mx/Prnacionales/Nacionales/Prnpapaya2.Pdf
Coepapaya. (2009). El cultivo de papaya en Colima. Colima: Campo Colima.
FAOSTAT. (2013). Producción en cultivos. México: Organización de las Naciones Unidad para la
Alimentacion y la Agricultura Dirección de Estadistica.
Gallager, S. R. (2008). Overview of electrophoresis. Curr. Protoc. Essential Lab., 7.1.1-7.1.6.
SIAP. (2014). Producción Agricola por Cutivo. Colima: Servicio de Información Agroalimentaria y
Pesquera.
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