Download - Como clasificar hoy en dia las leucemias y linfomas · SLPC-B: ANOMALÍAS QUE AFECTAN A GENES DE CONTROL DE CICLO CELULAR Y DE LA APOPTOSIS SLPC-B Gen Función Alteración Frecuencia

Cómo clasificar hoy en día las Leucemias y los Linfomas?

El rol de la citometría de flujo

SANDRA QUIJANO GÓMEZ MSc. PhD.Octubre de 2011

El rol de la citometría de flujo

SÍNDROMES LINFOPROLIFERATIVOS CRÓNICOS B (SLPC-B)Expansiones (mono)clonales de linfocitos B maduros

clínicamente heterogéneas

Leucemias linfoides crónicas de células B maduras/periféricas:Leucemia linfática crónica/Linfoma linfocítico de célula B pequeñaLeucemia prolinfocíticaTricoleucemia

Linfomas de células B maduras/periféricos:

CLASIFICACIÓN DE LOS SLPC-B SEGÚN LA OMS

Linfomas de células B maduras/periféricos:Linfoma linfoplasmocíticoLinfoma de la zona marginal esplénicaLinfoma de la zona marginal extranodal tipo MALTLinfoma de la zona marginal nodal (células B monocitoides)Linfoma folicularLinfoma de células del mantoLinfoma B difuso de célula grandeLinfoma de Burkitt

Neoplasias de células plasmáticas:Mieloma múltiple/plasmocitoma

Campo E. et al. Blood 2011

SLPC-B: ANOMALÍAS QUE AFECTAN A GENES DE CONTROL DE CICLO CELULAR Y DE LA APOPTOSIS

SLPC-B Gen Función Alteración Frecuencia

LF BCL2 Inhibición de apoptosis t(14;18) 80%-90%

MALT BCL10 Inhibición de apoptosis t(1;14) <5%API2/MLT1 a través de NFκκκκB t(11;18) 30%-50%

MALT1 t(14;18) 20%FOXP1 Factor de transcripción t(3;14) 10%-50%

regulador de desarrollo B

LCM CICLINA D1 Ciclo celular (transición G1/S) t(11;14) >90%

LLC-B RB/D13S25 del(13q) 10%-60%LLC-B RB/D13S25 del(13q) 10%-60%ATM/MLL Control del ciclo celular del(11q) 5%-15%

P53 del(17p) 1%-5%MDM2? +12 15%-25%

LLP PAX5 Diferenciación B t(9;14) 50%

MW BLIMP1 Diferenciación BCiclo celular (arresto G0/G1) del(6q21) 30%-50%

LBDCG BCL6 Activación y diferenciación B t(3q27) 30%-40%C-MYC Control del ciclo celular t(8;14) 5%-10%BCL-2 Inhibición de apoptosis t(14;18) 30%-40%

LB C-MYC Diferenciación t(8;14) 80%Control del ciclo celular t(8;22) 5%Inducción de apoptosis t(2;8) 15%

Campo E. et al. Blood 2011Küppers R. Nat Rev Cancer 2005 Quijano S et al. Blood. 2008

MECANISMOS DE TRANSFORMACIÓN MALIGNA DE CÉLULAS B DE CENTRO GERMINAL EN SLPC-B

Célula plasmática

Centro germinal (CG)

Célula Bdel CG

Apoptosis

Linfoplasmocito

DC foliculares

B T

*Anomalías adicionales de P53, RB, P16, P27, ATM

MAYOR AGRESIVIDAD TUMORAL YVENTAJA PROLIFERATIVA

Apoptosis

C-MYC NFκκκκBBCL2

BCL-6PAX5

BCL6

Mecanismos oncogénicos

Küppers R. Nat Rev Cancer 2005

Alteraciones genéticas en Leucemias agudas

•60-80% de los casos presentan alteracionescromosómicas estructurales y/ó numéricas

*Pronóstico: buen pronóstico -t(12;21) e hiperdiploidia (51-65 cromosomas) malpronóstico -t(9;22); t(4;11), t(1,19) e hipodiploidia-.* Implicadas en proceso de transformación maligna, activación de vías mitógenas,inhibición de la apoptosis y la respuesta inmune anti-tumoral.

Van Dongen et al, Lancet 2010. Onciu M. Hematol Oncol Clin N Am. 2009

Malignidades hematológicasMalignidades hematológicas: : APLICACIONES CLINICAS DEL APLICACIONES CLINICAS DEL

INMUNOFENOTIPOINMUNOFENOTIPO

Diagnóstico: identificación de célulasneoplásicas (presencia vs ausencia)

Clasificación: identificación de línea, Clasificación: identificación de línea, estadio madurativo, screening de

alteraciones cromosómicas

Evaluación PronósticaMonitorización del tratamiento

CaracterizaciónCaracterización inmunofenotípicainmunofenotípica de de célulascélulastumoralestumorales porpor citometríacitometría de de flujoflujo

EN QUE SE PARECEN LAS CELULAS LEUCEMICAS A EN QUE SE PARECEN LAS CELULAS LEUCEMICAS A LAS CELULAS NORMALES ?LAS CELULAS NORMALES ?

-- Reflejan línea celular y estadio madurativo.Reflejan línea celular y estadio madurativo.

EN QUE SE DIFERENCIAN LAS CELULAS LEUCEMICASEN QUE SE DIFERENCIAN LAS CELULAS LEUCEMICASDE LAS CELULAS NORMALES ?DE LAS CELULAS NORMALES ?

-- Reflejan distintos patrones de expresión de Reflejan distintos patrones de expresión de proteínas proteínas

(alteraciones genéticas)(alteraciones genéticas)

La interpretación adecuada de neoplasias La interpretación adecuada de neoplasias hematológicas requiere el hematológicas requiere el

“CONOCIMIENTO““CONOCIMIENTO“del del InmunofenotipoInmunofenotipo dededel del InmunofenotipoInmunofenotipo dede

MUESTRAS NORMALESMUESTRAS NORMALES

Saavedra, C., Quijano S, Orfao A. et al. Biomédica 2010Wood B. et al. Clinical Cytometry 2007Van Lochem. et al. Clinical Cytometry 2004 Pérez de Andrés M. et al. Clinical Cytometry. 2010

Inmunofenotipo de poblaciones B de Médula Ósea normal:Citometría de flujo de 4 fluorescencias

Clinical Cytometry 2004

Inmunofenotipo de poblaciones B de Médula Ósea normal:Citometría de flujo de 4 fluorescencias

Selección decélulas CD19+

Pre-pre B

Pre-B

Célula B inmadura

Célula B madura

Van Lochem. et al. Clinical Cytometry 2004

Clinical Cytometry 2010Inmunofenotipo de células B de distintos tejidos normales

Inmunofenotipo de células B de distintos tejidos normalesCitometría de flujo de 6-8 fluorescencias

Pre-B I

Pre-B II

B inmadurasB maduras

Plasmáticas

B inmaduras

B maduras

Plasmablastos

SP= 614 individuos sanos20-90 años

Pérez de Andrés et al. Clinical Cytometry 2010

Plasmablastos

B inmaduras

B vírgenes

B memoriaPB

B vírgenes

B memoria

Plasmablastos

B centro germinal

Población de estudio: 10 muestras de MO de individuos 61-79 años

1. Cuantificar distintas subpoblaciones celulares hematopoyéticas deMO normal en términos absolutos y relativos.

2. Analizar la expresión de diferentes marcadores celulares cuyareactividad está asociada a la diferenciación linfoide y mieloide, con el

OBJETIVOS

reactividad está asociada a la diferenciación linfoide y mieloide, con elfin de establecer rangos de expresión para los mismos.

3. Utilizar estos resultados como parámetros de análisis para eldiagnóstico y clasificación de las leucemias mieloides agudas ysíndromes mielodisplásicos que se estudien en la Unidad de Citometríadel Hospital Universitario San Ignacio.

Muestras de MO disgregadas (aprox. 5 mL)

Pasadas por jeringa (diámetro X)

100 uL muestra

Marcaje celularFITC PE PERCP APC ESFERAS

EDTA

Análisis de muestras de MO mediante citometría de flujo

Adquisición y análisis en el Citómetro de flujo FACSCalibur BDBProgramas informáticos CellQuest Pro y Paint A Gate BDB

FITC PE PERCP APC ESFERAS

cyTdT cyMPO CD45 CD34 +CD34 CD11b CD45 CD34 +

HLA-DR CD117 CD45 CD34 +CD64 CD14 CD45 CD34 +CD71 CD36 CD45 CD34 +CD15 CD16 CD33 CD34 +

Análisis de precursores CD34+

Precursores linfoidesPrecursores mieloides

LLA-B Momento del Diagnóstico (90% de linfoblastos)

10 10 10 10 100 1 2 3 4

2008001040_CD20,2f,CD10#ABF.fcs

CD34 PE-A ->10 10 10 10 100 1 2 3 4

2008001040_CD20,2f,CD10#ABF.fcs

CD19 FITC-A ->

0 256 512 768 1024

2008001040_CD20,2f,CD10#ABF.fcs

FSC-A ->

LINEA BCELULASINMADURAS

FRECUENCIA ELEVADA

10 10 10 10 100 1 2 3 4

2008001040_CD20,2f,CD10#ABF.fcs

CD45 PerCP-A ->10 10 10 10 100 1 2 3 4

2008001040_CD20,2f,CD10#ABF.fcs

CD10 APC-A ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

2008001040_CD20,2f,CD10#ABF.fcs

CD38 PE-Cy7-A ->

HEMATOPOYETICAS CELULASINMADURAS

MARCADORESABERRANTES

SPLCSPLC--B: fenotipo normal vs aberranteB: fenotipo normal vs aberranteCélula B normalCélula B normal Células B aberrantesCélulas B aberrantes

Tricoleucemia

LLC-B

Tricoleucemia

Tricoleucemia

0 256 512 768 1024

Leucemia Promielocítica Aguda: INMUNOFENOTIPO DE CASO t(15;17)+

SSC-

A

SSC-

A

SSC-

A

CD33++ CD117-/+0 256 512 768 1024

MO_MUESTRA.fcs

FSC-A -> 10 10 10 10 100 1 2 3 4

MO_MUESTRA.fcs

CD33 PerCP-Cy5-5-A ->10 10 10 10 100 1 2 3 4

MO_MUESTRA.fcs

CD117 APC-A ->FSC-A CD33 PERCPCY5.5 CD117 APC

Promielocito normal CD15+ Promielocito aberrante CD15+ débil

LLA-B: INMUNOFENOTIPO DE CASO BCR/ABL+

10 10 10 10 100 1 2 3 4

RFR7690.007

CD34 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

RFR7690.008

CD10 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

RFR7690.008

CD13 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

RFR7690.011

CD34 ->

CD19

CD45

CD20CD19

CD10 CD13 CD34 CD34

CD19++,CD13+, CD45-/+, CD20-/+

CD20

FMC7

CD24

CD19

SSC

FSC

CD27

CD25

CD22

sIgM sIg

CD79

b

CD11

cCD

38

CD23

CD43

CD5

bcl2

Grupo A (n=38)

Marcador13q-trisomía 1211q-17p-

Grupo fenotípicoA B C

% +12

% -13q

11%

78%

37%

43%

46%

33%

Alteración genética

FENOTIPO Y ALTERACIONES GENÉTICAS EN LLC-B

n= 180 pacientes

-3.00 0.00 +3.00

Grupo B (n=19)

Grupo C (n=33)

Pacientes

% -13q

% -11q

% -17p

78%

5%

5%

43%

5%

5%

33%

18%

3%

FenotipoCD38-

CD79b-/dsIg-/d

FMC7-

CD23-CD38+

CD20+

FMC7+

sIg+CD79b+

Quijano S et al. Clinical Cytometry. 2008

LLC-BNEGATIVA

LLC-BPOSITIVA

LINFOCITOS T LINFOCITOS T

CELULAS B TUMORALES

CELULAS B TUMORALES

Casos ZAP70+:- Peor pronóstico- Ausencia de mutaciones genesIGVH (fenotipo de linfocito Bvirgen)-Trisomía 12- Asociado a estadiosavanzados

CD3 PercP

CD3 PercP

Zap70 PE Zap70 PE

Expresión de Zap70 en LLC-B por citometría de flujo

Carreras J et al. J of Pathol 2005

Inmunohistoquímica

Crespo M et al. N Engl J Med 2003

Lanasa M. Hematology 2010Rivkina A et al. Exp Oncol 2011

Zap70 PE Zap70 PE

Análisis del ciclo celular en neoplasias hematológicaspor citometría de flujo

- Identifican grupos de pacientes con mayor riesgo detransformación a variantes más agresivas de la enfermedad.

- La tasa proliferativa y la aneuploidia de ADN se asociancon la agresividad tumoral y son factores pronósticosindependientes.

- Las leucemias y linfomas muestran una tasa proliferativamuy heterogénea que, puede reflejar la de sucontrapartida madurativa normal y que varía según laalteración genética asociada y el microambiente celular.

Quijano S et al. Blood. 2008

transformación a variantes más agresivas de la enfermedad.

Quijano S et al. Clinical Cytometry. 2008

ANÁLISIS DEL CICLO CELULAR:- Muestras control:

� MO (n=10): CD45/CD19/DRAQ5CD38/CD19/DRAQ5

� SP (n=5): CD20/CD23/DRAQ5

� GGLL (n=5): CD38/CD20/DRAQ5CD20-FITC

CD23

-PE

10 10 10 10 100 1 2 3 4

1010

1010

100

12

34

Cantidad de ADN0 256 512 768 1024

200

300

400

0

100

No de

eventos %S+G2/M= 0.1%

- Linfomas B (n = 432 pacientes):Kit Cycloscope-NHL (Cytognos; Salamanca)

CD19/CD20/CD22/CD23-FITC +Yorudo de propidiop (IP)

SSC

Cantidad de ADN

100

200

300

400

CD19/20/22/23 FITC410 10 10 10 100 1 2

No de

eventos

3

1024

0 25

6 51

2 76

8

00 256 512 768 1024

%S+G2/M= 18%

Quijano S et al. Blood. 2008

fase

S+G2

/MGGLL

10%

15%

20%

25%

30%

MO SP MO

*

*

TASA PROLIFERATIVA DE LAS CÉLULAS B NORMALES A LO LARGO DE LA DIFERENCIACIÓN B

%de

célulasen

fase

0%

5%

10%

*

* * *

*

*

*

CD45lo

CD19loCD45+

CD19hi

Precursores B

CD45hi

CD19+CD20+

CD23+CD20+

CD23-CD38lo

CD20+CD38+

CD20hiCD38hi

CD20loCD38hi

CD19+

Linfocitos B maduros Células Plasmáticas

*p<0.05

Quijano S, et al. Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 2008.Quijano S, et al. Blood 2008.

TASA PROLIFERATIVA DE LOS LINFOMAS BVS SU CONTRAPARTIDA NORMAL

fase

S+G2

/M

MON: Linfocitos BCD45hiCD19+

SPN: Células B

CD20+CD23+

GL: Células B CD38loCD20+ CP normales deMO y GL

20%

30%

40%

50%

*

*

GL: Células B CD38+CD20hi

***

*

*Fase S+G2/M significativamente elevada **Fase S+G2/M significativamente disminuida

%de

célulasen

LLC-B (MO)

LLC-B (SP) LZME TL LCM

(MO/SP) MALTLCM(GL) LF LBDCG LB LLP/MW

0%

10%

**

*

**74% 60%

37%

*

93% 83%21%

50%16% 16%

LINFOMAS B: FRECUENCIA DE LAS ALTERACIONES GENÉTICAS ANALIZADAS

% de

casos aneuploides

LLC-B LCM MALT LF LBDCG LB LLP/MW0%5%

10%15%20%25%30%35%40%

5% 21% 10% 18% 42% 29% 6%

% de

casos aneuploides

LLC-B LCM MALT LF LBDCG LB LLP/MW0%

% de

casos alterad

os

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

+12 11q- 17p- t(11;14) t(14q32) t(14;18) t(3q27) t(8;14) 6q21- t(14q32)

LLC-B

LCM

MALT

LF

LBDCG

LB

LLP/MW

13q-

22%37%

9% 7%

77%

25%

61

38%

13

30%

8%

86% 93%

Ploidia de ADN en pacientes pediátricos con LLA-B

*

n=14 n=30

LLA-B Indice de ADNMedia ± DS Rango P

Diploides 0,94 ± 0,02 0,94-1 <0,001Hiperdiploides 1,15 ± 0,2 1,01-1,9

Quijano S, Saavedra C et al. Artículo en preparación 2011.

*

*

**

Tasa proliferativa de blastos en pacientes pediátricos con LLA-B

n=7 n=44

*

Quijano S, Saavedra C et al. Artículo en preparación 2011.

ENFERMEDAD MINIMA RESIDUALENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL

Leucemia Mieloide Aguda

*Realizados con técnicas altamente sensibles: Biología molecular ycitometría de flujo

PCR cuantitativa (RQ-PCR):-Detección de WT1, FLT3, AML1-ETO,CBFbeta/MYH11 en casos con t(8;21) einv(16): identificación de pacientes conalto riesgo de recaída.-Sensibilidad: 0.1%-0.001% (1/1000-1/100.000) (leucémicas/normales)

% de células residuales post-tratamiento (15

días)

Probabilidad de recaída

<0.01% Baja

0.01%-0.1%0.1%-1%

Intermedia

>1% Alta (84%)

Citometría de Flujo:*fenotipos anormales: 75-85% de loscasos- Sensibilidad: puede variar según lasaberraciones fenotípicas detectadas aldiagnóstico

San Miguel JF et al. Blood 2001. Shook D et al. Clin Lymphoma Myeloma 2009.

ENFERMEDAD MINIMA RESIDUALENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL

Leucemia Linfoide Aguda

PCR cuantitativa (RQ-PCR):-Detección de BCR-ABL, MLLAF4,E2A-PBX1 y TEL-AML1 consensibilidad: 0.1%-0.001% (1/1000-1/100.000) (leucémicas/normales)

Citometría de Flujo:*Requiere conocimiento de perfilesfenotípicos de MO y SP en condicionesnormales y EXPERIENCIA en el análisis declones y selección de los marcadoresadecuados- Muy útil en fases pre y post-trasplantede células stem.-Sensibilidad: puede variar según lasaberraciones fenotípicas detectadas al

1/100.000) (leucémicas/normales)-Sensibilidad: puede variar según lasaberraciones fenotípicas detectadas aldiagnóstico- Límite de positividad: 0.01%

Adultos LLA-B% de células

residuales post-tratamiento

Probabilidad de recaída (durante

3 años)

Días 11 y 24 <0.01%

0%

Hasta la semana 16:

0.01%>0.01%

47%94%

Bruggemann M. Blood 2006 Campana D. Semin Hematol. 2010.

I Consenso Colombiano de Citometría: Manejo de muestras para estudios inmunofenotípicos

Tipo de muestra

Tiempo* Lavados Estabilizantes Centrifugación Anticoagulantes Solución salina/PBS estéril para transporte

Sangreperiférica**

Hasta 24 horas

Si No Si EDTA, Heparina No

Médula Ósea Hasta 24 horas

Si No Si EDTA, Heparina No

Sangre decordónumbilical+

Hasta 24 horas

No No No EDTA, Heparina No

Productos deleucaféresis

Hasta 24 horas

No No No EDTA, Heparina NoProductos deleucaféresis

Hasta 24 horas

No No No EDTA, Heparina No

Biopsias detejidossólidos**

60 minutos Si No Si No Si

Punciones detejidos sólidos(PAAF)**

60 minutos Si No Si No SiTemperatura

Líquidocefalorraquídeo(LCR)

30 minutos (sin

estabilizar)

Si Si*** Si (máximo dos pasos)

EDTA No

Otros fluidoscorporales**

60 minutos Si Si Si EDTA Si

*Tiempo máximo comprendido entre la obtención, transporte, y procesamiento de la muestra.**Las muestras pueden ser estabilizadas si se requieren confirmar estudios posteriores .***El empleo de una solución estabilizante previene la pérdida celular por periodos de tiempo superiores a las 24-48horas de su obtención.+: Viabilidad celular

Saavedra, C., Quijano S, Orfao A. et al. Biomédica 2010

Rastreo diagnóstico de meningitis neoplásica por citometría de flujo

“El manejo de muestras de LCR requiere unas condicionesespeciales de almacenamiento, transporte, preparación ymarcaje”.

Kraan J et al. Current Protocols Cytometry 2008

FaseFase prepre--analíticaanalítica

Muestras de LCR estabilizadas (Transfix, Immunostep SL)

Canonico B et al. J Immunol Methods 2004Quijano S et al. J. Clin Oncol. 2009Quijano S et al. Eur. J. Hematol. 2010

Previene pérdida celular por periodosSuperiores a 24-48horas (MO y SP)

LCR: mantiene celularidad >10d a 2-8°CEDTA

Kraan J et al. Current Protocols Cytometry 2008

FaseFase prepre--analíticaanalítica

DETECCIÓN DE INFILTRACIÓN DE SNC EN LNH-B AGRESIVO:

CMF versus Citología (n=123)

100%

CMF Citología PInfiltraciónde LCR 27/123 (22%) 7/123 (6%) <0,0001

100%

75%

50%

25%

0%CMF Citología

PositivosNegativos

Quijano S et al. J. Clin. Oncol. 2009; 27(9): 1462-9

FRECUENCIA DE CÉLULAS B NEOPLÁSICASEN MUESTRAS DE LCR INFILTRADAS POR CMF

Nº de

células/ µµ µµL

% de células

50

100

150

200 *p<0,001

60%

80%

100% *p<0,001

Nº de

células/

% de células

Citología+/CMF+ Citología-/CMF+

0

50

*

Punto de corte: <20% y <1 célula Bneoplásica/µµµµL

0%

20%

40%

Citología+/CMF+ Citología-/CMF+

*

Quijano S et al. J. Clin. Oncol. 2009; 27(9): 1462-9

ANALISIS DE RECAIDAS DURANTE EL SEGUIMIENTO

Seguimiento: 105/123 (85%)20 meses (rango 10-33 meses)

Sancho JM, Orfao A; Quijano S. European J. Hematology 2010; 85 (4): 821-8.

GRACIASGRACIASGRACIASGRACIAS