[Cultivo Lote

Alimentado y

Esterilizacin]

by

[Camila Durn V]

[ICB552-Ingenieria Procesos de

Fermentacin]

[JC Gentina] 2012

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INDICE

CAPITULO 1 : CULTIVO POR LOTE ALIMENTADO #

CAPITULO 2: ESTERILIZACION MEDIO DE CULTIVO #

CAPITULO 3: ESTERILIZACION AIRE #

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S,P,X

F, Sf

Vo

Vf

CL CLATiXiSiPiV0

T0=0X0S0P0V0

TfXfSfPfVf

F alimentacin

CAPITULO 1: CULTIVO POR LOTE ALIMENTADO

25-05//La corriente de alimentacin puede ir cualquier nutriente, pero el que no puede

faltar es el limitante (Sf).

Se divide en dos etapas, y cada etapa una modalidad diferente,

comenzamos con CL, para conseguir condiciones iniciales para

el CLA, y producto de lo que ocurra en l, obtendremos los

valores finales.

CLA es un balance que se realiza durante el cultivo, un balance del sustrato limitante y

decide cmo crece el m.o, nos permite influir sobre del m.o y por ende sobre el

metabolismo de la clula en la condicin que nos interesa (proceso productivo). Lo ideal es

poder encontrar las condiciones de operacin para que el m.o se exprese o se comporte de

la manera que deseamos.

Si el m.o est limitado por Sf, entones m.o< max. Si la oferta > demanda, entonces = max y

al revs si oferta< demanda y S0=0, entonces < max. Donde Oferta =FSf [g/L] y

Demanda=(XV)/Yx/s donde el sistema es variable, X(t) y V(t).

El ambiente no se cambia en CL, lo que puede significar problemas inhibitorios si se

acumula alguna sustancia txica.

La gran VENTAJA de CLA es que se puede modular a diferencia de CL.

CL CLA CC

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Cte

Linea

l

Y=x2

FSf

t

El ambientes Es mejor en CLA, ya que se asimila al cultivo continuo al modular , pero

puede ocurrir envejecimiento del medio y de las clulas.

En la corriente de alimentacin (F) la concentracin del sustrato (Sf) debe ser lo ms

concentrado, de manera de trata que el V sea lo menor posible.

Tenemos que saber los requisitos que fijamos y modelar la oferta con ello, sin importar la

forma que tenga (lineal, exponencial, constante, etc)

Existen dos opciones:

Alternativa 1: F(t) variable y Sf cte

Alternativa 2: F cte y Sf variable.

Lo ms utilizado es la alternativa 1).

-Suposiciones que nos simplifica la vida para modelar fermentaciones:

1. El microorganismo tiene crecimiento balanceado (YX/S es Cte)

2. Consumo de Fuente de Carbono y Energa para mantencin es despreciable

3. V en el fermentador es consecuencia solo de F (densidad es la misma, no se considera V por

biomasa)

4. Producto inicial =0

La Fermentacin en CLA se justifica cuando se requiere algn tipo de control sobre . Sino

usualmente se utiliza CL.

ECUACIONES CARACTERSTICAS CLA

Biomasa (X)

Sustrato (S)

Volumen (V)

Veloc. Crecimiento ()

Flujo F=F(t)

Hasta este punto tenemos 5 incgnitas (,X,S,F,V) y 4 ecuaciones. Entonces debemos definir una

de ellas, como por ejemplo F o bien fijaremos comportamiento del m.o a travs de ( buscamos

cte pero distinta de su mximo valor) Analizaremos ambos casos.

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CASO 1: CTE => S=CTE

Entonces

Y

28-05// Reemplazamos y despejamos F

Donde

y

De esta obtenemos:

(slo si el aumento de volumen depende del flujo de alimentacin)

Luego:

Luego la biomasa no tendr un crecimiento exponencial, pero si algo similar.

-CLA ALIMENTACION EXPONENCIAL (AE)

= Cte, S=Cte Sf=Cte

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El otro caso es cuando F es constante, debemos realizar anlisis cualitativo:

Dividimos CLA en 2 zonas de distinta duracin (por el momento da lo mismo

cuanto) y las trabajaremos de manera independiente, pero unidas.

Base: Disponibilidad nutriente limitante.

Entonces fermentacin que realizamos parte con una oferta que supera la poblacin

celular y que se va a acumular el nutriente. Si se acumula [S]limitante superar

criterio 10Ks, entonces tendremos crecimiento exponencial a max. (Esto en la

primera parte)

Cunto dura?

Como estamos F constante y S constante, entonces el Valimentacin es constante por

ello si tenemos poblacin creciendo en algn momento la Vconsumo=Valimentacin y

luego la supera y se hace negativa esta V porque se consume.

Es decir : 1 acumulo :

luego

(donde FSf es cte) e indica que

se agota nutriente. La Biomasa(X) sigue aumentando en el fermentador, entonces

se acelera (aumenta)

y se llega a concentraciones cercanas a Ks .

El microorganismo debe modificar , el m.o sigue creciendo pero ajusta

(disminuye) y se genera una compensacin/equilibrio.

Cuando [S]

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Luego de la ecuacin :

Arreglamos para que funcione en todo el proceso:

integramos la variable compuesta:

Ahora vamos a las zonas:

1) Z.C.E (ZONA CRECIMIENTO EXPONENCIAL) S>>KS => =M AX

Podemos integrar sin problemas porque =max. Reemplazando S de las ecuacines

desarrolladas anteriormente:

A tiempos cortos afecta y tenemos acumulacin, a medida que avanza

Luego:

Perfil no exponencial. Tt: Tiempo de transicin (tiempo que termina) 0< t < Tt

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Z.C.E

t

Z.C.L

XVumax

X0V0

S0

Tt

u

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Donde a media que aumenta la biomasa (aumenta el tiempo) esto implica que

disminuye y por ende S tambin. La poblacin e m.o se va adaptando a las

condiciones de alimentacin.

Finalmente S se obtiene directamente de la Ecuacin de Monod

Luego reemplazamos y obtenemos lo siguiente:

Donde esta tambin disminuye, conforme avanza el tiempo(t)

Ahora para la biomasa:

X no crece linealmente (t). Ahora debemos unir ambas zonas (aproximacin), no

necesariamente coinciden todas las variables, se fuerza a que al menos una de las

variables sea idntica en ambas zonas. En este caso escogemos a la biomasa (lo +

nos interesa). Se impone que ambas expresiones X sean iguales, en igual tiempo de

transicin ( Tt)

Ah podemos observar la unin de la transicin. A pesar que analizamos el

cultivo en 2 zonas, el tiempo es uno solo, desde que comienza CLA hasta que

termina. ( ver grfico anterior).

La zona entre ambas zonas, es una zona de cambios muy rpidos, en la simulacin

se asume efecto inmediato por la [S] sobre , ya que el cambio no es instantneo.

Existen m.o que se estresan y demoran ms, no es exacto su comportamiento.

No hemos hablado de lo que ocurre inicialmente, la transicin puede pasar

desapercibida, la alimentacin comienza cuando Sf > 0 (menos traumtica)

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Arbitrariamente se decide esperar que Sf=0, y recin all comienza la

alimentacin., hay m.o que se estresan en estas condiciones y otros que no

Por qu se usa [Si]=0?

Porque resulta cmodo y debemos tener indicios para comenzar alimentacin, ya

que tambipen podramos analizar biomasa (espectrofotometra), pero no es muy

prctico. Ahora algo til es medir OD, si se agota la Fuente de carbono limitante,

tendramos un aumento de la [OD] y nos dice, par de crecer el m.o, y con este

mtodo, se determina en 2 min y all comenzamos a alimentar. Ahora si la

fermentacin es anaerobia, debisemos utilizar otro mtodo lo mismo si la fuente

de nutriente limitante es distinto del carbono.

Comenzamos con una oferta menor que la demanda para eliminar la 1 zona :

Valim < V max consumo

Donde V max consumo= X0V0max/Yx/s Adems S0 debe ser cercana a cero, o en su

defecto cero. Sino el m.o crecer a max y eso no es lo que queremos. Con esto

hacemos que ZCE no exista. Beneficios? Menor tiempo de operacin.

31-05// Para que X=cte => dx/dt =0 ( E.E)

En CLA-AC( Alimentacin constante) Z.C.L :

Entonces

donde Sf y S0 son cte, por ende Sf est ligado a S0 y X0 y

rendimiento

Si reemplazamos Sf en X, tendremos el valor de X en E.E :

Entonces primero derivamos X, obtenemos Sf, lo reemplazamos en X y obtenemos

la ltima ecuacin:

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Llegaremos a que:

Igual que en Cultivo continuo Quimiostato E.E, se asemeja al factor de dilucin,

pero aqu el volumen es variable en el tiempo. Pero lo importante es que vara

dependiendo de las condiciones de operacin, es decir, del Flujo. Pero aqu difiere

el significado de la dilucin.

Sistema Continuo: Sale biomasa a medida que esta va creciendo y mantenemos

distribucin de esta fisiolgico homogneo.

El concepto de dilucin en un CLA, la biomasa es constante. Se genera amplia

distribucin de estado fisiolgico. La dilucin est dada por el aumento de volumen

debido al flujo, este diluye la composicin celualr, pero no saca/elimina biomasa, a

diferencia del continuo.

Si hacemos el anlisis:

En P.E.E dx/dt=0 y dV/dt =F, reemplazando

Llegamos a lo mismo, pero V es dependiente del tiempo.

Ahora realicemos lo mismo para En CLA-AE :

Se tienen que cumplir ciertas condiciones, como por ejemplo el estado P.E.E donde

X=cte, =Cte => Sf=cte ( Sf sustrato limitante) y aadiremos X=cte y es p.e.e

porque el volumen vara. Debe ocurrir que

= cte =>

reemplazamos en :

, donde obtenemos X=X0

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Z.C.E

t

Z.C.L

XVumax

X0V0

S0

Tt

u

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DNDE SE PROPONE USAR CLA EN P.E.E?

Hay fermentaciones que ocurren de mejor manera con un decreciente, como lo

son los metabolitos 2. En CL es imposible encontrar esa condicin, entonces aqu

( CLA en P.E.E) tenemos la posibilidad de manejar y disminuirla. Pero cuando

estamos en P.E.E, realizamos un procedimiento parecido al pie de cuba. En este

caso hacemos CLA Cclicos, as nos evitamos la etapa por lotes.

Hacemos 1CL, termina fermentacin, saco algn %caldo de cultivo y quedo con

V0, comienzo con la alimentacin F(t) es decir, repito CLA con condicin de la 1

fermentacin.

Si no lo hacemos en P.E.E lo que sucede es que al final:

Donde X02>X01>X0 con esto limitamos la capacidad del reactor y en pocos ciclos

llegamos a concentraciones de biomasa que el reactor no puede mantener por

transferencia de oxgeno y calor.

Ahora podemos decir que V01P01 y aspero esto

podra ser un problema.

Para P.E.E como operamos a X=cte, en cada ciclo tendremos la misma

concentracin de biomasa, y esto permite sacarle el mejor provecho a la

fermentacin.

Ciclo tras ciclo, X es muy cercana a la capacidad del recator de sostener, debido a

las propiedades fsicas y calor. Existen cambios de biomasa y consumo de O2, pero

en esa variacin la acercamos al mximo KLa(transf. De O2) a esto le sacamos

partido y obtenemos mayor productividad.

La Biomasa en P.E.E NUNCA se mantiene cte, lo que permite que el flujo y

consumo de oxigeno inicial y final, disminuya su diferencia e igualarlo como una

ecuacin, para considerar formacin de producto intracelular.

1Fermentacin 2Fermentacin 3Fermentacin

X0V0

X01V01P1

X02V02P2

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Nosotros vemos la tasa de cambio, donde:

*Suponemos que no se destruye el producto

Si se degradara el producto por pH u otro mvil debisemos aadir ese factor

CMO INTEGRAMOS ESTO A LAS DEMS ECUACIONES?

Debemos conocer funcionalidades respecto del tiempo de y XV, respetando si

es AE-AL-AC, etc. Por que esto afecta la funcionalidad de

Podra ser que : , solo nos falta conocer XV. Supongamos .

En CLA-AE, es cte.

Ordenando e integrando, obtenemos :

Donde P, no aumenta exponencialmentem pero s parecido. Ahora para otro caso

variar.

El CLA se desarroll en la industria, fue fundamental para la industria de la

fermentacin. Se dieron cuenta que CL no les daba productividad y resultados

esperados con ensayo y error.

Llegaron CLA y obtuvieron mejores resultados, hacan levaduras y les sala con

alcohol, esto implicaba un menor rendimientos y tenan que lavar lo que aumentaba

los costos. CLA anduvo bien hasta 1960 app. Luego se aadieron otras

fermentaciones con un buen CLA y aparecen muchos reviews (1980) y luego se

estanc

Cuando el proceso requiere control sobre algn sustrato o , la

mejor alternativa es CLA en la industria.

Otra opcin es CC : + complejo y tremendas probabilidades de contaminacin

porque se prolonga en el tiempo. En Biolix, ferm alcohlica puede servir, no se

contaminan( Gracias a los pH, trabajan materia inertes)

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METABOLITOS Y FERMENTACIN

04-06// Metabolitos 1: Cuya produccin depende de auxotrofas, el m.o tiene la

necesidad de algn sustrato/nutriente esencial.

Para la sobreproduccin se deben realizar mutaciones (eliminar mecanismos de

control, para mxima eficiencia y economa) Esto lleva a una condicin de

auxotrofa, entonces el m.o es sobreproductor, pero se debe alimentar al medio el

nutriente esencial. Por ejemplo para la lisina, su sntesis comienza con el Ac.

Aspartico y se utiliza Corynebacterium glutamicum. Con el mutante del m.o se

logr modificar una enzima que interrumpe sntesis de metioninan y treonina, y se

genera auxotrofia , entonces debemos aadir estas al medio de manera que no se

concentre con la lisina; estas concentraciones son muy bajas y afectan la

produccin. Adems nos interesa una gran biomasa.

En CLA se puede manejar la [Treonina]mnimo pero no ms alta que la [Lisina].

Entonces tendremos m.o sobreproduciendo lisina y esto nos sirve, Hoy en dia

tambien se utiliza E.coli.

Tambin es interesante el uso de Metabolitos 2: Aquellos que no se requiere oara

que el m.o crezca. Se sintetiza en idiofase. En CL =max, luego disminuye S y

con ello y seguimos en idiofase. Algunos sobreviven concentraciones criticas del

nutrientes y otros no.

Una de las estrategias usadas fue cambiar la Fuente de carbono y energa por una

de metabolismo ms lento. Luego se volvi a la glucosa, pero manejando su

disponibilidad (CLA)

1 CL : Hasta cierta concentracin de biomasa. Se agota glucosa

2 CLA: Se aade glucosa medida (apenas crece) y comienza sntesis de metabolito

secundario.

Periodo Crecimiento Biomasa : 1 da

Periodo Produccin : 6-7 das

Lo que se trata de simular con el CL es la zona de desaceleracin que es pequea y

en CLA ms extensa. En CLA se extiende la idiofase.

Un tercer caso, + caracterstico: Inhibicin por Sustrato

Importante para produccin de Biomasa, sobre todo en cultivos de alta densidad.

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umax

Inhibicin

[S]

De acuerdo a Monod:

Se trabaja a las concentraciones de sustratos, que se obtiene en el

mximo valor de en un sistema de inhibicin, porque es el mximo

valor que podemos obtener y eso es lo que buscamos el ms alto, pero

menor que max. Por ejemplo el metanol tiene un precio razonable,

Fuente de carbono muy limpia, pero el problema es que es inhibitorio.

Algunas bacterias metilotroficas pueden asimilarlo. La mayora m.o

metilotrficos, sopportan 6-7 g/L, y mayor que eso debe dejar de crecer

el m.o

El CLA aparece como una alternativa favorable ya que podemos manejar . Donde

nos convendra una alimentacin exponencial y queremos cte, con una [S] que

mantenga el valor de deseado. Debemos encontrar la funcin alimentacin que

nos mantenga en esos rangos.

Esto puede ocurrir con otras fuentes, como el nitrgeno, el sulfato de amonio,

afecta a algunos m.o. En E.coli el sulfato de amonio es inhibitorio, para ello se

reemplaz mediante la regulacin del pH, a travs del hidrxido de amonio.

Existen m.o que no soportan 10 g/L de fosfato.

El 4 caso es el caso en que el m.o presenta el efecto crabtree.

Efecto Crabtree: Saturacin va oxidativa, lo que obliga que se abran las vas

reductivas (fermentativa). Existen levaduras que muestran este efecto (

facultativas). Este es un problema ms bien de velocidades, por ejemplo si el m.o

crece a max entonces estn abiertas las vas reductivas.

Pero si deseo ruta oxidativa, debemos controlar el ingreso de fuente de carbono y

energa para que m.o crezca a

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Otro caso es el de produccin de enzimas hidrolticas, cuando existe Represin

Catablica.

Enzimas hidroliticas: requieren presencia de inductor para producirse y la

[inductor] tambin puede inferir en el crecimiento celular.

Recin sintetizamos enzimas hidroliticas cuando se agota la fuente de carbono

metabolizable.

F.C --REPRESION CATABLICA Enzimas hidroliticas

Un ejemplo es la -amilasa, para producirla el cultivo debe ser con almidon soluble

y se genera un compuesto que induce sintesis de -amilasa. Pero cuando esto

ocurre, se metaboliza rpido la fuente de carbono y se deha de producir -amilasas,

porq se concentra el otro azcar e inhibe.

Se equilibran la Vhidrolisis y V consumo del sustrato alimenta que debe ser hidrolizado

El almidn antes de ser consumido debe ser previamente hidrolizado.

CLA-AE ms productivo que CL : Controla Alimentacin y

INDUCTORES

Poseen 3 carateristicas/condiciones :

1. Inducen

2. Inhibidores

3. Consumid por el m.o

Cuando se dan estas 3 condiciones en la penicilina acilasaque necesita un inductor :

AFA y su concentracin no puede ser mayor a 1,5 g/L sino hace una gran

inhibicin. Pero al mismo tiempo el m.o lo degrada y pierde capacidad de inductor.

La solucin sera aadir AF, adems se ha visto que a concentraciones < 1,5 la

produccin es menos de penicilina acilasas.

Entonces lo razonable es usar CLA:

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Alimentacin de AFA : Constante ( para equilibrar de velocidad de consumo y

alimentacin) y para aumentar productividad de la enzima.

Comn denominador: Control de , a travs de control de alimentacin, quizs lo

mejor sera Cultivo continuo, porque tiene mayor produccin pero a nivel

industrial, no goza de la fama porque es ms complejo de manejar y mayores

probabilidad de contaminacin.

Lo ltimo tiene que ver con 2 situaciones que entraban la aplicacin industrial de

CLA.

1) Optimizacin: fermentacin, modelacin matemtica, muchas variables que

intervienen. Aun no hay mtodo simple y efectivo para encontrar condiciones

optimas de operacin de CLA. Multivariable complejo.

Se ha resuelto con muy buen criterio de las personas que desarrollan la

fermentacin.

Mejoras: modalidad fermentacin, mejor el proceso y se logra optimizacin.

2.) Control, Alimentacin (Veloc. Alimentacin): Uno disea con un tipo de

alimentacin ( lineal, exponencial) y Qu pasa cuando la fermentacin no

responde de esta manera?

El cultivo se descontrola, lo que implica, una menor productividad. Lo ideal sera

tener sistema cerrado. Sensor mide biomasa y [S] limitante y que con esto se vea el

modelo o forma de cambiar velocidad de alimentacin.

Entonces tenemos 2 extremos:

i. Medir X y Slimitante

ii. No se puede medir.

Lo mejor que se hace en una situacin intermedia donde se busca medicin de

variables que se relacionen con la biomasa (generacin de CO2, pH, OD, cociente

respiratorio) y con la concentracin de sustrato limitante.

Hay intenciones que a travs de mediciones indirectas se crea estrategia de control,

por ejemplo, la levadura de panificacin: donde existe un sensor de alcohol basado

en el efecto crabtree. Si la velocidad de alimentacin aumenta, implica que hay

efecto crabtree, entonces se genera etanol, el sensor mide y enva seal al

controlador y disminuye la velocidad de alimentacin.