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Page 1: Cinetica Enzimatica

Enzimas

Page 2: Cinetica Enzimatica

Un poco de historia…

Se reconocen catalizadores biológicos al estudiar la degradación de carnes por secreciones estomacales

Se observa conversión de almidón a azúcar por saliva y extractos vegetales

La fermentación de azúcar a alcohol por levaduras es catalizada por fermentos que son inseparables de las células vivas de levadura

1700s

1800s

1850s

Page 3: Cinetica Enzimatica

Un poco de historia…

Buchner: extractos de levaduras pueden fermentar azúcar a alcohol

Sumner: aísla y cristaliza ureasa todas las enzimas son proteínas

Pepsina, tripsina y otras enzimas digestivas se aíslan y cristalizan y son proteínas

1897

1926

1930s

ENZIMAS (Gk enzymos = levado)Kühne

1930s Haldane: interacciones débiles entre enzima y sustrato podrían usarse para catalizar reacción

Page 4: Cinetica Enzimatica

Los Protagonistas…

Page 5: Cinetica Enzimatica

¿ Qué sabemos hoy de las enzimas ?

Exceptuando las ribozimas, son todas proteínas

Actividad catalítica requiere proteína nativa

Tamaño muy variable: PM entre 104 - 106

Algunas requieren componente químico adicional para su actividad

COFACTOR

Page 6: Cinetica Enzimatica

Algunos cofactores son iones metálicos…

Page 7: Cinetica Enzimatica

…Otros son moléculas orgánicas complejas

Coenzimas que transfieren grupos de átomos

Coenzimas que transfieren electrones

COENZIMAS

Page 8: Cinetica Enzimatica

Coenzimas que

transfieren electrones

Page 9: Cinetica Enzimatica

Coenzimas que transfieren grupos de

átomos

Page 10: Cinetica Enzimatica

Muchas coenzimas son metabolitos de las vitaminas

Page 11: Cinetica Enzimatica

¿ Qué son las vitaminas ?

Compuestos que son esenciales para la salud y que no pueden ser sintetizados por el

organismo

Deben ser incorporados en la dieta

Su deficiencia genera enfermedades por carencia

Se dividen en dos grupos de acuerdo con su solubilidad

Page 12: Cinetica Enzimatica

Vitaminas Liposolubles

Page 13: Cinetica Enzimatica

Vitaminas Hidrosolubles

Page 14: Cinetica Enzimatica

Vitaminas Hidrosolubles

Page 15: Cinetica Enzimatica

Volvamos a nuestras enzimas…

Page 16: Cinetica Enzimatica

Clasificación de enzimas…

E.C.w.x.y.z.

Page 17: Cinetica Enzimatica

Un ejemplo…la hexoquinasa

ATP + D-glucosa ADP + D-glucosa-6-fosfato

E.C.2.7.1.1.transferasa

fosfotransferasa

P-transferasa con HO como aceptor

D-glucosa como aceptor del P

Page 18: Cinetica Enzimatica

Las enzimas son catalizadores extraordinarios

Especificidad

Magnitud de la aceleración de la velocidad de reacción

Condiciones de funcionamiento

Page 19: Cinetica Enzimatica
Page 20: Cinetica Enzimatica

¿ Cómo funcionan las enzimas ?

Page 21: Cinetica Enzimatica

S

P

ST

Dirección de Reacción

Energía Libre (G)

Energía requerida

T = Estado de transiciónAdapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.166

Page 22: Cinetica Enzimatica

E S+ P+SE E

¿ Qué pasa en presencia de una enzima ?

Page 23: Cinetica Enzimatica

La enzima estabiliza el Estado de Transición

S

PES

EST

EP

ST

Dirección de Reacción

Cambio en Energía

Energía requerida (no catálisis)

Energía disminuye (catálisis)

Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.166

Page 24: Cinetica Enzimatica

¿ Cómo lo logra ?

Sitio activo

Page 25: Cinetica Enzimatica

El sitio activo…El sitio activo…

Proporciona una superficie catalíticaProporciona una superficie catalítica

EEstabiliza estado de transiciónstabiliza estado de transición

Transforma el estado de transición en productoTransforma el estado de transición en producto

B

BA Superficie catalítica

A

Juang RH (2004) BCbasics

Page 26: Cinetica Enzimatica

¿ Cómo estabiliza el sitio activo el estado de transición ?

Evita influencia del agua

Posee grupos reactivos+

-

Juang RH (2004) BCbasics

Optimiza interacción con S

Page 27: Cinetica Enzimatica

La enzima no es perfectamente complementaria al sustrato sino al estado de transición

(Linus Pauling, 1946)

Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.252

X Ajuste inducido(Koshland, 1958)

Page 28: Cinetica Enzimatica
Page 29: Cinetica Enzimatica

Hexoquinasa

D-glucosa

Page 30: Cinetica Enzimatica

El sitio activo…El sitio activo…

Proporciona una superficie catalítica

Estabiliza estado de transición

Transforma el estado de transición en producto

B

BA Superficie catalítica

A

Juang RH (2004) BCbasics

Page 31: Cinetica Enzimatica

Grupos específicos en el sitio activo contribuyen a la catálisis a través de

distintos mecanismos

Catálisis covalente

Catálisis con ión metálico

Catálisis ácido-base

Page 32: Cinetica Enzimatica

Catálisis ácido-base

Page 33: Cinetica Enzimatica

Asp102

His57

Ser195

Tríada CatalíticaTríada Catalítica

HH

Mecanismo Catalítico de Quimotripsina A1

NC

CN

[HOOC]H

O

CC

NC

C[NH2]

CC

O

Chequear especificidad de sustrato

Page 34: Cinetica Enzimatica

Asp102

His57

Ser195HH

Mecanismo Catalítico de Quimotripsina A2

NC

CN

[HOOC]H

O

CC

NC

C[NH2]

CC

O

Primer Estado de Transición

Page 35: Cinetica Enzimatica

HH

Mecanismo Catalítico de Quimotripsina A3

NC

CN

[HOOC]H O

CC

NC

C[NH

2]CC

O

Intermediario Acil-Enzima

Page 36: Cinetica Enzimatica

H

Mecanismo Catalítico de Quimotripsina D1

N-H

CC

N[HOOC]

H

O

CC

NC

C[NH

2]CC

O

H OH

Intermediario Acil-Enzima Agua

Page 37: Cinetica Enzimatica

H

Mecanismo Catalítico de Quimotripsina D2

O

O

CC

NC

C[NH

2]CC

H

Segundo Estado de Transición

OH

Page 38: Cinetica Enzimatica

H

Mecanismo de Catálisis de Quimotripsina D3

O

CC

NC

C[NH2]

CC

O

OH

Des-acilación

H

Page 39: Cinetica Enzimatica

Ca

rga e

n e

l Sitio

Activo

Ser195

His 57

Asp 102

H–O–CH2

O

C–O -

=

Ser Activa

H–N N

C C

C

H

H

CH2

Ser195

His 57

Asp 102

- O–CH2

OC–O–H

=

N N–H

C C

C

H

H

CH2

Ad

ap

ted

fro

m A

lbe

rts

et

al (

20

02

) M

ole

cula

r B

iolo

gy o

f th

e C

ell

(4e

) p

.15

8

Page 40: Cinetica Enzimatica

HO

H

Catálisis Acido-Base

Ad

ap

ted

fro

m N

els

on

& C

ox

(20

00

) L

eh

nin

ger

Prin

cip

les

of

Bio

che

mis

try

(3e

) p

.25

2

Induce el estado de transición

CO=

NH

HCH

NH

+

C

- OOHO

H

-

+

HO

H

CO=

NH

HCH

CO=

NH

HCH

CO=

NH

HCH

Lenta Rápida Rápida Muy rápida

CatálisisAcido-base Catálisis

Acida

CatálisisBásica

Ambas

Ad

ap

ted

fro

m A

lbe

rts

et

al (

20

02

) M

ole

cula

r B

iolo

gy o

f th

e C

ell

(4e

) p

.16

7

NH

+

C

- OO

HO

H

Especificidad

Page 41: Cinetica Enzimatica

Mecanismo Concertado de Catálisis

1

2

3 4

5O

-H

+ H

COO -

(270)Glu

(248)Tyr

O -

H

His(196)

His (69)

Glu(72)

+Arg (145)

Carboxipeptidasa A

C-terminal

SITIOACTIVOSITIO

ACTIVO

Chequear porC-terminal

Sitio paraespecificidad

Bolsillodel SitioActivo

Cadenapeptidica del

Sustrato

RNCN C

COO -

O -

C

2+Zn

Jua

ng

RH

(2

00

4)

BC

ba

sics

Page 42: Cinetica Enzimatica

O ON–C–C–N–C–C N–C–C–N–C–C R H R’

Quimotripsina Tiene Un Sitio de Especificidad

O -

CSer

Sitio ActivoSitio Activo

Sitio deEspecificidad

Sitio deEspecificidad Sitio Catalítico

Juang RH (2004) BCbasics

Page 43: Cinetica Enzimatica

Especificidad de la Familia de Ser-Proteasas

COO-

CAsp

COO-

CAsp

Sitio Activo

Tripsina Quimotripsina Elastasacorta en Lys, Arg corta en Trp, Phe, Tyr corta en Ala, Gly

Bolsillo No-polar

Bo

lsill

o P

rofu

ndo

y C

arga

doN

ega

tiva

men

te

Bolsillo Poco Profundoy

no-polar

O O–C–N–C–C–N– C C C C NH3

+

O O–C–N–C–C–N– C

O O–C–N–C–C–N–

CH3

Jua

ng

RH

(2

00

4)

BC

ba

sics

Page 44: Cinetica Enzimatica

Especificidad Espacial

BC

DBC

DBC

D

Estos dos triángulos no son idénticos

A

La estructura tetrahédricade los orbitales del carbonotiene una tensión estéricaque conforma la unidadbase de la conformaciónproteica

Juang RH (2004) BCbasics

sp3

Superficie Enzima

Page 45: Cinetica Enzimatica

Cinética Enzimática

Page 46: Cinetica Enzimatica

[S]

Orden 0

Orden 1

VoV

ES

Page 47: Cinetica Enzimatica

Otra vez un poco de historia…

Victor Henri: reacción E + S → ES etapa necesaria en catálisis enzimática

Michaelis y Menten: Teoría General de la Catálisis Enzimática

1903

1913

Page 48: Cinetica Enzimatica

Las condiciones de M-M

rápida lenta*

ESTADO ESTACIONARIO: producción y consumo del complejo ES proceden a la misma

velocidad se mantiene constante la concentración de ES

E + S ESk1

k2

E + Pk3

k4

Page 49: Cinetica Enzimatica

S P

EES

Tiempo de reacción

Concentr ación

Juang RH (2004) BCbasics

ET

EE

Page 50: Cinetica Enzimatica

[S]

Vo

Vm

½ Vm

Km

Vo = Vm

Vo = Vm [S] Km

Vo = Vm [S] Km + [S]

Page 51: Cinetica Enzimatica
Page 52: Cinetica Enzimatica

Y siguiendo con la hexoquinasa…

Glucosa + ATP → Glc-6-P + ADPGlucosa Alosa Manosa

Km = 8 8.000 5 mM

CHO H-C-OH HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

CHO H-C-OH H-C-OH H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

CHO HO-C-H HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

Juang RH (2004) BCbasics

Page 53: Cinetica Enzimatica

Cinética Michaeliana

Page 54: Cinetica Enzimatica

[S]

Vo

Vm

½ Vm

Km

Vo = Vm

Vo = Vm [S] Km

Vo = Vm [S] Km + [S]

Page 55: Cinetica Enzimatica

¿ Qué pasa con MM cuando reacción catalizada tiene más de un sustrato ?

ATP + D-glucosa ADP + D-glucosa-6-fosfato

Page 56: Cinetica Enzimatica

Distintos mecanismos posibles…

Page 57: Cinetica Enzimatica

¿Cómo hacemos en la práctica para obtener

Vm y Km?

Page 58: Cinetica Enzimatica
Page 59: Cinetica Enzimatica
Page 60: Cinetica Enzimatica
Page 61: Cinetica Enzimatica
Page 62: Cinetica Enzimatica

Recopilando…

Vmax

Km S

vo

1/S

1vo

Doble recíproca

Gráfico Directo

1)1) Usar una cantidad definida de Enzima → E 2)2) Agregar sustrato en varias concentraciones → S

3)3) Determinar Producto a Tiempo Fijo (P/t)→ vo

4)4) Estimar Vmax y Km

1Vmax

- 1 Km

1/2

Jua

ng

RH

(2

00

4)

BC

ba

sics

Page 63: Cinetica Enzimatica

¿Cómo medimos la cantidad de enzima?

UNIDAD ENZIMÁTICA

Page 64: Cinetica Enzimatica

UNIDAD ENZIMÁTICA (UE)

Cantidad de enzima que cataliza formación de determinada cantidad de producto en la unidad de

tiempo, en condiciones de velocidad máxima

UE

Proteína (mg)ActividadEspecífica =

Page 65: Cinetica Enzimatica

¿Cómo puedo comparar la eficiencia de distintas

enzimas?

Page 66: Cinetica Enzimatica

E + S ES E + Pk2

k1 k3

En condiciones saturantes Vm = k3 ET

k catalíticaNúmero de recambio

Page 67: Cinetica Enzimatica

Algunos ejemplos…

Page 68: Cinetica Enzimatica

kcat / kmConstante de especificidad

Page 69: Cinetica Enzimatica

Inhibición de la actividad enzimática

Page 70: Cinetica Enzimatica

Algunos inhibidores son irreversibles…

Se unen covalentemente (o no) o destruyen grupo funcional clave para

catálisis

Inhibidores suicidas

Diseño racional de fármacos

Page 71: Cinetica Enzimatica

Un ejemplo real…la Enfermedad del Sueño

Trypanosoma brucei

Inhibidor suicida de la Ornitín decarboxilasaprimera enzima en biosíntesis poliaminas

Difluorometilornitina

Page 72: Cinetica Enzimatica
Page 73: Cinetica Enzimatica

Y otros inhibidores son evidentemente reversibles!!!!!

Page 74: Cinetica Enzimatica

Existen distintos tipos de inhibición reversible…

I

I

S

S

S I

I

I II

S

Competitiva No-competitiva Incompetitiva

EE

Sitio diferenteCompite por Sitio activoInhibidor

Sustrato

Dib

ujo

Guí

aEc

uació

n y

Desc

ripció

n

[II] se une a [E] libre solo,y compite con [S];aumento de [S] eliminala Inhibición por [II].

[II] se une a [E] libre o [ES] complejo; aumento de [S] noelimina [II] inhibición.

[II] se une al [ES] complejo Solo; aumento [S] favorecela inhibición por [II].

E + S → ES → E + P + II↓EII

E + S → ES → E + P + + II II↓ ↓EII + S →EIIS

↑ ↑

E + S → ES → E + P + II ↓ EIIS

EI

S X

Juang RH (2004) BCbasics

Page 75: Cinetica Enzimatica

Km

Inhibición Reversible

I II Competitiva No-competitiva Incompetitiva

Grá

fico

Dire

cto

Dob

le R

ecí

proc

a

Vmax Vmax

Km Km’ [S], mM

vo

[S], mM

vo

II II

Km [S], mM

Vmax

II

Km’

Vmax’Vmax’

Vmax no cambiaKm aumenta

Vmax disminuyeKm no cambia

Vmax & Km disminuyen

II

1/[S]1/Km

1/vo

1/ Vmax

IIII1/vo

1/ Vmax

1/[S]1/Km 1/[S]1/Km

1/ Vmax

1/vo

= Km’

Juang RH (2004) BCbasics

Page 76: Cinetica Enzimatica

Una aplicación clínica y curiosa de la inhibición competitiva…

¡ Emborrachar a los individuos intoxicados con metanol !

metanol Formaldehído Alcohol

deshidrogenasa

etanol es inhibidor competitivo

Infusión lenta y continuada de etanol ☺

Page 77: Cinetica Enzimatica

Otra aplicación clínica importante de la inhibición competitva: las sulfamidas

-COOHH2N-

-SONH2H2N-

Precursor Acidofólico

Sulfanilamida

Acido p-aminobenzoico (PABA)

Bacterias necesitan PABA para

biosíntesis de ácido fólico

Estructura similar al PABA, inhibe el crecimiento bacteriano.

Adapted from Bohinski (1987) Modern Concepts in Biochemistry (5e) p.197

Page 78: Cinetica Enzimatica

Cinética Michaeliana: Resumen

vo=Vmax [S]Km + [S]

Km Vmax &

1er orden

Orden cero

Competitiva

No-competitiva

Incompetitiva

Directo

Doble recíprocaAfinidad consubstrato

VelocidadMáxima In

hibición

k3 [Et]

kcat

Número derecambio

kcat / Km

UE

1 molmin

Significa:

Juang RH (2004) BCbasics

Page 79: Cinetica Enzimatica

Enzimas Regulatorias

Page 80: Cinetica Enzimatica

Retroalimentación negativa

Page 81: Cinetica Enzimatica

Enzimas Alostéricas

Gk: allos = otros steros = forma

Page 82: Cinetica Enzimatica

Enzimas Alostéricas

Proteínas multiméricas y complejas

Modulador y S se unen a distintas subunidades

Modulador puede ser positivo o negativo

Un sitio específico para cada modulador

Unión modulador produce cambio conformacional que altera actividad enzimática

Modulador puede ser el mismo S (homotrópico) o no (heterotrópico)

Page 83: Cinetica Enzimatica
Page 84: Cinetica Enzimatica

Un ejemplo real: aspartato transcarbamilasa

12 cadenas polipeptídicas2 clusters catalíticos con 3 cadenas

3 clusters regulatorios con 2 cadenas

Page 85: Cinetica Enzimatica

Enzima Alostérica Aspártico transcarbamilasa

+

Forma Activa relajada

Forma tensa Inactiva

ATCasa

COO-

CH2

HN-C-COO-

H H-

---

OH2N-C-O-PO3

2-

= OH2N-C-

=

COO-

CH2

N-C-COO-

H H

---

-

ATP

CTP

MetabolismoNcleicos

Feedback inhibición

AspartatoCarbamilfosfato

Carbamil aspartato

CTP

CTP

CTP

CTP

CTP

CTP

Juang RH (2004) BCbasics

Page 86: Cinetica Enzimatica

Cinética alostérica

Cooperatividad

Page 87: Cinetica Enzimatica

Dos modelos para explicar este comportamiento…

Concertado(Monod)

Ajuste inducido(Koshland)

2 formas R y T en equilibrio que se desplaza a un lado u otro según presencia modulador

1 forma única que va ajustando su actividad de acuerdo con entrada

modulador

S y modulador + sólo se unen a RModulador – sólo se une a T

Page 88: Cinetica Enzimatica

El modulador puede afectar K0.5…

Page 89: Cinetica Enzimatica

El modulador puede afectar Vm…

Page 90: Cinetica Enzimatica

Volvamos a la ATC…

Page 91: Cinetica Enzimatica

Efe

cto C

urva

Sig

mo

ide

a

Si exageramos la curva sigmoideaVemos el puntoOn/Off claramente

Efector positivo (ATP)lleva curva sigmoidea a hiperbólica

Efector Negativo (CTP) mantiene

Una enzima alostérica puede “detectar” la concentración en el ambiente y ajustar suactividad

CTPATP

vo

vo

[Sustrato]Off On

Juang RH (2004) BCbasics

Page 92: Cinetica Enzimatica

Enzimas reguladas por clivaje proteolítico

Regulación irrversible

Proteólisis expone sitio activo

Se necesita otro mecanismo para inactivar

Inhibidor que se une fuertemente a sitio activo

Page 93: Cinetica Enzimatica
Page 94: Cinetica Enzimatica

Enzimas reguladas por modificación covalente

Grupos de átomos unidos o removidos generalmente por otras enzimas

Page 95: Cinetica Enzimatica
Page 96: Cinetica Enzimatica
Page 97: Cinetica Enzimatica

Fosforilaciones catalizadas por proteín quinasas específicas

Page 98: Cinetica Enzimatica

Fosforilación tiene que ser reversible

Fosfo proteín fosfatasas

Page 99: Cinetica Enzimatica

Un ejemplo: la glucógeno fosforilasa

(glucosa)n + Pi (glucosa)n-1 + glucosa-1-P

Page 100: Cinetica Enzimatica

A veces una misma enzima tiene varios sitios de fosforilación

Page 101: Cinetica Enzimatica

(glucosa)n + Pi (glucosa)n-1 + glucosa-1-P

GP

GS

Page 102: Cinetica Enzimatica

Rápida Respuesta a Concentración Azúcar en Sangre

Glucógeno fosforilasa Glucógeno sintasaA

ctiv

idad

Enz

imát

ica

0 2 4 6 8Tiempo (min)

Glucosa

Adapted from Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.597