Universidad Nacional
de Misiones
FCEQyN
Instituto Nacional de
Tecnología Agropecuaria
ANÁLISIS DE SEGREGACIÓN DE MARCADORES
MICROSATÉLITES EN UNA POBLACIÓN DE
MAPEO F2 PARA EL CARÁCTER ALTO OLEICO EN
GIRASOL CULTIVADO (Helianthus annuus var.
macrocarpus)
TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE LICENCIADO EN GENÉTICA
DIEGO ARIEL FERNÁNDEZ
Directora: Dra. María Valeria Moreno.
Co-directora: Lic. Nancy Gabriela Grandón.
Grupo de Biotecnología en Cultivos EEA MANFREDI
CÓRDOBA
2014
Universidad Nacional
de Misiones
FCEQyN
Instituto Nacional de
Tecnología Agropecuaria
ANÁLISIS DE SEGREGACIÓN DE MARCADORES
MICROSATÉLITES EN UNA POBLACIÓN DE
MAPEO F2 PARA EL CARÁCTER ALTO OLEICO EN
GIRASOL CULTIVADO (Helianthus annuus var.
macrocarpus)
TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE LICENCIADO EN GENÉTICA
DIEGO ARIEL FERNÁNDEZ
Grupo de Biotecnología en Cultivos EEA MANFREDI
CÓRDOBA
2014
A mi Mamá, que
siempre me esperó y de
quien aprendí a nunca
bajar los brazos.
"Para ver un mundo dentro de
un grano de arena y el cielo en una
flor silvestre, sostén el infinito en la
palma de tu mano y la eternidad en
una hora."
≈ William Blake ≈
v
AGRADECIMIENTOS
A Valeria y Gaby, mis directoras, no solo por guiarme durante este trabajo
y por atender minuciosamente incontables correcciones, sino también por confiar
en mí, por la paciencia en la enseñanza y por hacerme sentir casi como en
“casa” aconsejando, ayudando y preocupándose en todo lo posible. Gracias por
ser las personas que necesité.
A los chicos del Lab: Caro, siempre alegre y dispuesta a ayudarme; a
Eva, con sus geniales explicaciones de todo sin dejar dudas; y a Pablo, práctico
y técnico para resolver problemas. Gracias por la compañía del día a día y hacer
de la rutina algo agradable y llevadero.
A los amigos de la facu: los primeros, Ale (gracias por estar siempre),
Nati, Vale, Juanchi, Mauri y Julito con quienes compartí mucho de todo…
estudio, congresos, mates, reuniones, comidas y, por supuesto, mucha fiesta! A
Juli, Deni y Adri, personas geniales que me acompañaron los últimos años de
estudio. Y otros tantos que sin duda han estado y formaron parte de todo este
proceso.
A mis mejores amigos Pichi y Gancha con quienes comparto desde chico
tantas historias y buenos momentos. Gracias por ser tan geniales e
incondicionales, por el apoyo durante este último tiempo y el aguante de
siempre.
A Vane, que llegó a mi vida en este último tramo y quien desde entonces
es muy importante para mí. Gracias por ser mi apoyo emocional y mi cable a
tierra, por aguantar mis días malos y alegrarlos… Gracias por darme todo tu
cariño y amor!
Por último, no me queda más que agradecer profundamente a mi familia
por brindarme todo su apoyo de manera incondicional, en especial en esta última
etapa que sin duda fue difícil tanto en lo personal como en lo académico.
Gracias por no dejarme caer cuando más lo necesité. Son fuente de inspiración y
fortaleza. A mi Mamá y Papá, a mis hermanos Guille, Gabi y Cintia, y a mis
sobrinos Agustina, Victoria y Rafael, a quienes amo profundamente.
MUCHAS GRACIAS!!!
vi
RESUMEN
La construcción de mapas de ligamiento constituye una poderosa
herramienta para identificar regiones cromosómicas asociadas a
características de interés agronómico. Para ello, se requiere analizar la
segregación de marcadores polimórficos, la cual se espera que cumpla
con las proporciones 1:2:1 de acuerdo con la Ley de Segregación
Mendeliana. El objetivo del presente trabajo fue analizar la segregación
de 41 marcadores microsatélites polimórficos en una población de mapeo
F2 de girasol cultivado Helianthus annuus var. macrocarpus, proveniente
del cruzamiento entre los parentales contrastantes R285♂ (alto oleico) y
R023♀ (bajo oleico). Con el fin de completar el perfil molecular de la
población F2 segregante conformada por 180 individuos, se analizaron 58
de ellos como parte de esta tesina. La genotipificación se realizó con 30
marcadores SSRs polimórficos y los fragmentos amplificados se
resolvieron en geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 6%. De los 30
SSR analizados, nueve fueron descartados por su baja resolución en gel
y los 21 marcadores restantes se analizaron en conjunto con 20 SSRs
genotipificados en paralelo por el Laboratorio de Biotecnología (INTA-EEA
Manfredi). El análisis de segregación de los SSRs en el total de la
población F2 se realizó mediante el cálculo de X2 utilizando el programa
JoinMap 3.0. Los resultados obtenidos revelaron una distorsión de la
segregación (DS) significativa (p≤0,05) en todos los loci, con un marcado
desvío hacia el genotipo parental R285. Con el objeto de determinar la
causa de dicha distorsión, se calculó X2 para las frecuencias alélicas y
genotípicas. Estos resultados mostraron que el 85,4 % de los SSRs
presentaron DS significativa (p≤0,05) tanto alélica como genotípica,
sugiriendo la influencia de la selección gamética y cigótica actuando
simultáneamente. Sin embargo, los marcadores HA806, HA911, HA1938,
HA3349, ORS229 y ORS899 sólo mostraron DS significativa (p≤0,05) en
sus frecuencias alélicas, indicando la influencia de la selección gamética
únicamente. Estos resultados permiten concluir que la población de
vii
mapeo F2 proveniente del cruzamiento entre R285 y R023 no cumple con
la premisa de segregación 1:2:1 para marcadores co-dominantes según la
Primera Ley de Mendel. Por ello, se propone analizar otros cruzamientos
resultantes de parentales contrastantes para el carácter en estudio; como
así también otras poblaciones tales como las líneas endocriadas
recombinantes (RIL), las derivadas de retrocruzamientos (BC) o las
provenientes de cruzamientos recíprocos.
viii
ABSTRACT
Genetic linkage map constructions are a powerful tool to identify
genomic regions associated with interesting agronomic traits. For this
purpose, analyze polymorphic marker segregations is required, which are
expected to keep Mendelian ratio (1:2:1). The aim of this research was to
analyze segregation of 41 polymorphic microsatellite markers on a
segregant population of 180 F2 cultivated sunflower (Helianthus annuus
var. macrocarpus) derived from the cross between parental inbred lines
R285♂ (high oleic acid) and R023♀ (low oleic acid). In order to complete
F2 population molecular profiles, 58 of them were analyzed in this work.
Thirty polymorphic SSRs were genotyped and the PCR fragments were
resolved in 6% polyacrylamide denaturing gels. Only 21 of 30 SSR primer
pairs were used, which were chosen according to their amplification
profiles and analyzed together with 20 SSRs genotyped previously by the
Laboratorio de Biotecnología (INTA- EEA Manfredi). Chi-square-tests
were performed for segregation distortion of each locus using JoinMap
3.0. Results showed significantly distorted segregation (DS) (p≤0.05) in all
loci; deviated towards the male parent genotype R285. To analyze the
reason of the DS, chi-square-tests for allelic and genotypic frequencies
were calculated. These results indicated that 85.4 % of SSR studied
showed significant distortion (p≤0.05) in allelic and genotypic segregation,
suggesting influence of gametic and zygotic selections simultaneously.
However, the markers HA806, HA911, HA1938, HA3349, ORS229 and
ORS899 showed significant DS (p≤0.05) just in allelic frequencies
because they were influenced by gametic selection only. In summary, F2
mapping population derived from the cross between R285 and R023 does
not meet segregation 1:2:1 according to Mendel's First Law for co-
dominant markers. Therefore, we propose to analyze other contrasting
parents crosses for this agronomic trait, as well as recombinant inbred
lines (RIL), those derived from backcross (BC) or of reciprocal crosses.
ix
ÍNDICE
Agradecimientos
Resumen
Abstract
Abreviaturas
1. Introducción
1.1. Descripción botánica
1.2. Origen del girasol cultivado
1.3. Importancia económica
1.4. Producción de girasol en Argentina
1.5. Composición acídica del aceite de girasol
1.6. Síntesis de ácidos grasos
1.7. Genes involucrados en el carácter alto oleico
1.8. Uso de marcadores moleculares en el
mejoramiento genético de girasol
1.9. Mapa de ligamiento y análisis de segregación
1.10. Importancia para el INTA
2. Hipótesis
3. Objetivos
3.1. Objetivo general
v
vi
viii
1
2
2
4
5
5
6
7
8
10
11
13
15
16
16
x
3.2. Objetivos específicos
4. Materiales y Métodos
5. Resultados
6. Discusión
7. Conclusiones
8. Perspectivas Futuras
9. Bibliografía
10. Anexo
Protocolo 1: Cuantificación de ADN por fluorometría
Protocolo 2: Tinción con nitrato de plata y
pretratamiento con ácido nítrico
16
17
22
27
29
30
31
45
45
46
1
ABREVIATURAS
ACC: acetil CoA carboxilasa
ACP: proteína transportadora de
acilos
AG: ácidos grasos
AFLP: Amplified Fragment Lenght
Polymorphisms
BC: retrocruzamientos
CAPS: Cleaved Amplified
Polymorphic Sequences
DS: distorsión de la segregación
FAD: desaturasa de ácido graso
FAS: sintasa de ácidos grasos
g: gramo
GL: grupo de ligamiento
h: hora
HC: hidratos de catbono
ID: identificación del marcador
KAS: ketoacil-ACP sintasa
L: litro
m: metro
M: molar
MAB: retrocruzamiento asistido por
marcadores
MAS: selección asistida por
marcadores
mg: miligramo
min: minuto
mL: mililitro
mM: milimolar
MR: motivo de repetición
ng: nanogramo
p/v: peso/volumen
pb: pares de bases
PC: fosfatidilcolina
QTL: loci de caracteres cuantitativos
RAPD: Random Amplified
Polymorphic DNAs
RE: retículo endoplasmático
RFLP: Restriction Fragment Lenght
Polymorphisms
RIL: líneas endocriadas
recombinantes
s: segundo
SAD: estearoril-ACP desaturasa
SDL: loci de distorsión de la
segregación
SDR: región de distorsión de la
segregación
SNP: Single Nucleotide
Polymorphisms
SSCP: Single-Strand Conformation
Polymorphism
SSR: Simple Sequence Repeat
TILLING: Targeting Induced Local
Lesions In Genomes
tn: tonelada
U: unidad de actividad enzimática
W: watt
X2: prueba de Chi cuadrado
μL: microlitro
μM: micro molar
ºC: grado centígrado
2
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Descripción botánica del girasol
El género Helianthus pertenece a la familia Asteraceae, subfamilia
Asteroideae, tribu Heliantheae y contiene 48 especies con distintos
niveles de ploidía (diploides, tetraploides y hexaploides) (Seiler and
Riesberg, 1997). Uno de sus representantes diploides más conocido por
su importancia económica es el girasol cultivado, Helianthus annuus var.
macrocarpus (DC) Cockerell, con 2n=2x=34 cromosomas
(Arumuganathan and Earle, 1991).
El girasol cultivado es de ciclo anual con un desarrollo vegetativo
de 130 a 150 días. Su raíz principal es pivotante y las secundarias se
desarrollan horizontalmente cerca de la superficie, llegando a crecer hasta
varios metros de profundidad. El gran desarrollo radicular que posee lo
hace tolerante tanto al frío como a la sequía. En la etapa de floración, el
tallo de porte erecto puede llegar a medir hasta 3 m de altura
dependiendo de las condiciones del cultivo. Éste es pubescente al inicio y
se vuelve leñoso para formar en su extremo superior el botón floral que
dará lugar a la inflorescencia. La forma cultivada posee un solo capítulo,
aunque a veces se ramifica dando varias inflorescencias. Las hojas son
pecioladas, pubescentes en ambas caras y de bordes aserrados; las
inferiores son opuestas y las superiores alternas. Las flores se reúnen en
una inflorescencia denominada capítulo, aquellas que se disponen al
borde de éste son liguladas y neutras, mientras que las restantes son
bisexuadas. La fecundación alógama es principalmente entomófila, pero
es posible generar descendencia fértil por autogamia (Kugler and Godoy,
1964). La semilla o cipsela es un fruto seco, uniseminado, con pericarpio
separado de la verdadera semilla o “pepita”; la cual contiene la mayor
cantidad de aceite. Cada capítulo puede albergar cerca de 1300 semillas
(Aguirrezábal et al., 2001). (Figura 1).
3
Figura 1. Estructuras de la planta de girasol. (a) Sistema radical. (b) Tallo. (c) Disposición de las hojas. (d) Hoja. (e) Capítulo. (f) Planta multiflora. (g) Botón floral. (h) Semilla. Fuentes: (a) Extraído de http://asb.com.ar/cultivos/girasol/raiz/attachment/gi-a-132/. (b, c, d, g) Fotografías de Grandón, N. G.; (e, f) Fotografías de Cordes, D. (h) Adaptado de http://www.euita.upv.es/varios/biologia/web_frutos/Aquenio.htm
4
1.2. Origen del girasol cultivado
El girasol es originario de la región central de Estados Unidos. Las
poblaciones indígenas cultivaban formas silvestres de las que utilizaban la
semilla para alimento y para extraer el aceite. La especie cultivable, H.
annuus var. macrocarpus, surgió a partir de H. annuus var. annuus por
selección de mutantes menos ramificados y con semillas más grandes.
Esta especie cultivada por los nativos americanos fue llevada a España a
mediados del siglo XVI como planta ornamental. Más tarde, en el siglo
XVIII, el cultivo se extendió desde el oeste de Europa hasta Rusia, donde
adquirió importancia a principios del siglo XIX como planta oleaginosa
(Kugler and Godoy, 1964).
El girasol cultivado comenzó a cobrar importancia en América hacia
el siglo XX. En Argentina, las primeras referencias datan de mediados del
siglo XIX (Figura 2) (Kugler and Godoy, 1964). Este germoplasma
constituyó la base de viveros oficiales y privados para crear, mediante
selección, nuevas variedades adaptadas al país (Bertero de Romano and
Vázquez, 2003).
Figura 2. Centro de origen y distribución del girasol en el mundo. Fuente: ASAGIR, 2008.
5
1.3. Importancia económica
La producción mundial de semilla de girasol es de
aproximadamente 36 millones de tn y tiene cuatro principales
protagonistas: Ucrania (8,3 millones de tn), Federación Rusa (7,9 millones
de tn), Argentina como el único país relevante en el Hemisferio Sur (3,3
millones de tn) y China (2,3 millones de tn) (FAO - FAOSTAT, 2012). El
mercado argentino comercializa el 70,8% de la semilla producida (CIARA-
CEC, 2012). No obstante, una parte significativa del aceite elaborado se
exporta (50% del total) y el resto se refina principalmente para consumo
doméstico y, en menor proporción, para uso industrial (margarinas,
mayonesas, galletitas y otros alimentos). Las harinas proteicas y tortas
resultantes del proceso de extracción de aceite se procesan y transforman
en pellets para la fabricación de alimentos balanceados (CIARA). En el
mercado mundial de aceites, el de girasol es el tercero en orden de
importancia, con Argentina como segundo exportador después de Ucrania
(FAO - FAOSTAT, 2011).
1.4. Producción de girasol en Argentina
Argentina cuenta con ambientes agroecológicos sumamente
favorables para el cultivo del girasol; sin embargo, puesto que éste posee
rusticidad y adaptación a diversos ambientes, se siembra en áreas donde
el suelo y el clima condicionan severamente la productividad de otros
cultivos (Moreno, 2011). En la zona central de Argentina dedicada a la
agricultura, los primeros informes mencionan a H. annuus var.
macrocarpus como una especie inusual (Cabrera, 1974), pero Zuloaga
and Morrone (1999) y Poverene et al. (2002, 2008) demostraron que esta
especie ha aumentado su distribución geográfica alcanzando, en la
actualidad, ocho provincias (Figura 3). El cultivo se extiende desde el
sudeste de la región pampeana hasta la región chaqueña con una
superficie sembrada de aproximadamente 1,3 millones de hectáreas
(MAGyP-SIIA, 2014), siendo Buenos Aires la provincia con mayor
superficie sembrada.
6
Figura 3. Porcentaje de área promedio sembrada de girasol por provincia para la campaña 2013-2014. Fuente: MAGyP-SIIA, 2014.
1.5. Composición acídica del aceite de girasol
El 98% del aceite está constituido por ácidos grasos (AG), los
cuales se encuentran en las células de los granos, principalmente unidos
por enlaces ésteres a una molécula de glicerol formando los triglicéridos.
Estos se pueden clasificar en base a la presencia o ausencia de dobles
enlaces en la cadena de carbonos: AG insaturados o AG saturados,
respectivamente. La nomenclatura incluye el número y la posición de los
dobles enlaces que posee el aceite, como así también el número de
átomos de carbono que conforman la molécula. Los AG saturados más
frecuentes son el palmítico (C16:0) y el esteárico (C18:0), mientras que
los de cadena más larga como araquídico (C20:0), behénico (C22:0) y
lignocérico (C24:0) pueden encontrarse en concentraciones menores al
1%. Dentro de los insaturados, los más frecuentes son el ácido oleico
(C18:1), el linoleico (C18:2) y el linolénico (C18:3) con una, dos y tres
insaturaciones, respectivamente (Aguirrezábal et al., 2002; Izquierdo and
Aguirrezábal, 2010).
El aceite de girasol contiene cerca del 90% de AG insaturados
entre ácido oleico y ácido linoleico. Se ha descripto a éstos como
esenciales para el metabolismo humano, con potentes efectos
0,5 0,6 1,9 2,0
12,0 12,0
21,3
49,7
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
Provincias
Po
rce
nta
je d
e á
rea
sem
bra
da
Entre Ríos
Santiago del Estero
San Luís
Córdoba
Chaco
Santa Fe
La Pampa
Buenos Aires
7
hipocolesterolémicos (Kris – Etherton and Yu, 1997). Asimismo, los altos
niveles de ácido oleico extienden la estabilidad oxidativa y la vida útil del
aceite (Purdy, 1986). En consecuencia, el aumento en la demanda actual
del mercado se ha orientado a alimentos de calidad diferenciada y, por
ende, los programas de mejoramiento de girasol apuntan al desarrollo de
cultivares con mayor contenido de ácido oleico.
1.6. Síntesis de ácidos grasos
La síntesis de aceite en la semilla o grano se produce en las
células embrionarias durante el período comprendido entre la floración y
la madurez fisiológica. Como sustrato se utilizan los hidratos de carbono
(HC) sintetizados principalmente en las hojas y tallos en etapas anteriores
a la floración. Los HC son transportados hasta los granos a través del
floema, principalmente en forma de sacarosa (Aguirrezabal et al., 2002).
La síntesis de novo de los AG ocurre en los cloroplastos, donde la acetil-
CoA carboxilasa (ACC: acetyl-CoA carboxylase) cataliza el primer paso de
la biosíntesis (Figura 4). Dicha enzima forma el malonil-CoA a partir de
acetil-CoA y bicarbonato, constituyendo así la fuente de carbono para
cada ciclo de la biosíntesis. Los AG son producidos por un complejo
proteico de sintetasas (FAS: fatty acid synthase). El malonil-tioéster así
formado, sufre una serie de reacciones de condensación catalizadas por
las enzimas ketoacil-ACP sintetasas (KAS: ketoacyl-ACP synthase);
elongando la cadena hasta 16:0-ACP (complejo palmítico-ACP: acyl
carrier protein o proteína transportadora de grupos acilo) o hasta 18:0-
ACP (complejo esteárico-ACP). Una parte del 16:0-ACP se exporta al
retículo endoplásmico (RE), mientras que el resto son elongados hasta
18:0-ACP y desaturados en la posición Δ9 por la estearoil-ACP desaturasa
(SAD: stearoyl-ACP desaturase) para formar 18:1-ACP que se exportará
al RE. Allí, el oleoil-CoA se incorpora a la fosfatidilcolina (PC) de la
membrana y es desaturado en la posición Δ12 a 18:2-PC por la enzima
oleoil desaturasa (FAD2: fatty acid desaturase-2) generando linoleoil-PC
que puede ser desaturado en la posición Δ15 a 18:3-PC por la linoleoil
8
desaturasa (FAD3: fatty acid desaturase-3). El ensamblaje de los
triglicéridos tiene lugar dentro del RE y utiliza glicerol-3-fosfato y acil-CoA
como sustrato primario (Figura 4). Éstos luego serán transferidos y
almacenados en estructuras subcelulares llamadas cuerpos grasos u
oleosomas (Baud and Lepiniec, 2010).
1.7. Genes involucrados en el carácter Alto Oleico
Los primeros estudios genéticos en líneas de girasol con alto
contenido de ácido oleico reportaron un único gen parcialmente
dominante designado como Ol (Fick, 1984) o dominante (Urie, 1984) que
controla el carácter. Fernández – Martínez et al. (1989) informaron que
existen tres genes complementarios denominados Ol1, Ol2 y Ol3 que
regulan este carácter. Actualmente se sabe que dichos genes
corresponden a una oleato desaturasa microsomal denominada FAD2,
con sus tres isoformas FAD2-1, FAD2-2 y FAD2-3. Dichas enzimas se
encargan de la conversión del ácido oleico en ácido linoleico. FAD2-1 se
expresa exclusivamente en el embrión en desarrollo durante el llenado del
grano, mientras que FAD2-2 y FAD2-3 se expresan en los demás tejidos
durante la formación de los lípidos de membranas (Martínez – Rivas et al.,
2001). La mutación de Ol produce un aumento significativo en la
concentración de C18:1 y es esencial para la producción de fenotipos con
el carácter alto oleico. El gen Ol segrega como dominante en poblaciones
F2 en las que la progenie puede ser asignada de forma inequívoca a las
clases, ya sea dominante (Ol_: alto) o recesivo (olol: bajo) (Urie, 1984,
1985; Pérez – Vich et al., 2002). Sin embargo, las distribuciones
fenotípicas no mendelianas también pueden ocurrir en diferentes fondos
genéticos y esto se debería a la presencia de modificadores. Varias
hipótesis han sido propuestas para describir la herencia de los
modificadores (Urie, 1985). Miller et al. (1987) describieron el locus Ml,
que actúa como un modificador del locus Ol, mientras que Fernández et
al. (1999) sugirieron que Ml es un complejo de genes.
9
Figura 4. Esquema de las reacciones implicadas en la biosíntesis de AG y ensamblaje de triglicéridos en semillas de oleaginosas. ACC: acetil-CoA carboxilasa; ACP: proteína transportadora de grupo acil; CoA: coenzima A; CPT: CDP-colina:1,2-sn-diglicerido colina fosfotransferasa; DGAT: 1,2-sn-diglicerido aciltransferasa; ER: retículo endoplasmatico; FAD2: oleoil desaturasa; FAD3: linoleoil desaturasa; FAE complejo elongasa de AG; FAT: acil-ACP tioesterasa; G3PDH: glicerol-3-fosfato deshidrogenasa; GPAT: glicerol-3-fosfato aciltransferasa; HmACC: acetil-CoA carboxilasa homomérica; KAS: 3-cetoacil-ACP sintasa; LACS: acil-CoA sintetasa de cadena larga; LPAAT: ácido lisofosfatódico aciltransferasa; LPC: lisofosfatidilcolina; MAT: malonil-CoA:proteína transportadora de grupo acil S-maloniltransferasa; PAP: ácido fosfatódico fosfohidrolasa; PC: fosfatidilcolina; PDCT: fosfatidilcolina:diglicerido colinofosfotransferasa; PLA2: fosfolipasa A2; PDAT: fosfolípido:diglicerido aciltransferasa; *: malonil-CoA. Fuente: Baud and Lepiniec, 2010.
10
1.8. Uso de marcadores moleculares en el mejoramiento
genético de girasol
El mejoramiento tradicional se basa en la selección fenotípica de
genotipos superiores dentro de poblaciones segregantes obtenidas a
partir de cruzamientos. Éste a menudo presenta dificultades relacionadas
principalmente con las interacciones genotipo - ambiente (G x E).
Además, las caracterizaciones fenotípicas suelen ser costosas, consumen
mucho tiempo y pueden ser poco eficientes para caracteres cuantitativos
como rendimiento, calidad y tolerancia a estreses bióticos y abióticos. En
consecuencia, el desarrollo y la aplicación de los marcadores moleculares
en el mejoramiento asistido, ha permitido realizar diferentes estudios de
diversidad (Garayalde et al., 2011; Moreno et al., 2013), construcción de
mapas de ligamiento (Poormohammad Kiani et al., 2007; Talia et al.,
2010) y estudios poblacionales y filogenéticos (Iruela et al., 2002; Mian et
al., 2005). Por ello, actualmente se cuenta con una gran variedad de
marcadores moleculares tales como: RFLPs, AFLPs, microsatélites o
SSRs, RAPDs, CAPSs, SSCPs, SNPs (Rafalski, 2002; Delgado, 2006;
Filippi et al., 2014), entre otros. La utilidad de los marcadores depende de
su capacidad para discriminar polimorfismos, de la disponibilidad de
recursos y de la especie en estudio. Es así que, su aplicación al
mejoramiento de girasol se ha centrado principalmente en la tolerancia a
enfermedades (Bert et al., 2004; Ronicke et al., 2005), a estrés abiótico
(Ebrahimi et al., 2008; Poormohammad Kiani et al., 2009) y algunos
caracteres agronómicos importantes como rendimiento y calidad (Pérez –
Vich et al., 2002; Haddadi et al., 2010).
Entre los marcadores disponibles, los microsatélites muestran alta
reproducibilidad y cobertura genómica, herencia co-dominante,
neutralidad y polimorfismo elevado (Kalia et al., 2011). Estos marcadores
consisten en pequeñas secuencias de uno a cuatro pb de largo, repetidas
en tándem. En plantas, se distribuyen con una frecuencia de uno por cada
50.000 pb (Ferreira and Grattapaglia, 1996). La base genética del
11
polimorfismo detectado en los microsatélites se centra en la variabilidad
del número de repeticiones en tándem y, consecuentemente, del tamaño
del microsatélite amplificado en los individuos de una especie (Picca et
al., 2004). Los SSRs se utilizan para evaluar la variabilidad genética en
colecciones de germoplasma, en mapeo e identificación de regiones
relacionadas con caracteres agronómicos deseables, en selección
asistida (MAS: Marker Assisted Selection) y también en retrocruzamiento
asistido por marcadores (MAB: Marker Assisted Backcrossing). Además,
pueden ser empleados para estudios de estructura poblacional,
taxonómicos y análisis filogenéticos (Kalia et al., 2011). En girasol,
distintas iniciativas internacionales dieron lugar al desarrollo de este tipo
de marcadores. Argentina a través de INTA generó la colección
denominada HA, Europa por medio del grupo Cartisol originó la colección
denominada CRS y Estados Unidos, a través de la Universidad de
Oregon, la colección denominada ORS (Talia 2008). En la actualidad, se
dispone de 2.040 marcadores microsatélites públicos para girasol
(Dehemer and Friedt, 1998; Gedil, 1999; Paniego et al., 2002; Tang et al.,
2002; Yu et al., 2003), algunos de los cuales han sido integrados a
distintos mapas genéticos (Al-Chaarani et al., 2002, 2004; Tang et al.,
2002; Yu et al., 2003; Talia et al., 2010).
1.9. Mapa de ligamiento y análisis de segregación
Uno de los principales usos de los marcadores moleculares en la
agricultura ha sido la construcción de mapas de ligamiento para diversos
cultivos. La relación entre estos mapas y los datos fenotípicos del carácter
en estudio permite la detección de QTL (Quantitative Trait Loci); lo cual
constituye una poderosa herramienta para facilitar el progreso de los
programas de mejoramiento. Estos mapas son utilizados para la
identificación de regiones cromosómicas que contienen los genes
controladores de características simples o cualitativas (controladas por
uno o pocos genes) y caracteres cuantitativos, poligénicos o complejos.
12
Construir un mapa de ligamiento consiste en ordenar los
marcadores de acuerdo a sus posiciones relativas en los cromosomas,
indicando las distancias genéticas entre ellos y definiendo los grupos de
ligamiento. Este ordenamiento se realiza en función de la frecuencia de
recombinación o intercambio de material genético entre cromosomas
homólogos durante la meiosis. El porcentaje de recombinación se calcula
en función de la cantidad de progenie recombinante y su valor se utiliza
para estimar la distancia genética entre loci (Collard et al., 2005). Para
ello, se requiere como primer paso el análisis de segregación de los
marcadores polimórficos en la población de mapeo en estudio, la cual se
espera que cumpla con el tipo de segregación 1:2:1, de acuerdo con la
Ley de Segregación Mendeliana.
El análisis de segregación permite conocer la distribución de las
frecuencias genotípicas de los individuos en una población de estudio,
para un locus determinado. Mediante la prueba X2 es posible evaluar si
estos valores son consistentes con las proporciones Mendelianas
esperadas. La distorsión de la segregación (DS) se define como una
desvío de las frecuencias genotípicas observadas respecto de sus valores
esperados (Lu et al., 2002) y está influenciada por varios factores, tales
como la selección gamética y cigótica, la recombinación no homóloga, los
elementos transponibles y los agentes ambientales (Kinoshita, 1993; Xu
et al., 1997; Knox and Ellis, 2002). La DS fue reportada por primera vez
en maíz (Mangelsdorf and Jones, 1926) y, hasta el momento, se ha
registrado en tomate (Paterson et al., 1991 ), cebada (Konishi et al.,
1992), alfalfa (Brummer et al., 1993), lechuga (Kesseli et al., 1994), sorgo
(Pereira et al., 1994), girasol (Quillet et al., 1995), avena (Pawlowshi et al.,
1998) y arroz (Matsushita et al., 2003), entre otros cultivos. Cabe destacar
que la distribución de los marcadores con DS a lo largo de los GL puede
ser de dos tipos: 1- desviaciones numerosas en loci individuales y
distribuidas entre los cromosomas (Reinisch et al., 1994) o 2-
desviaciones agrupadas en una región cromosómica llamada región de
distorsión de la segregación (SDR: Segregation Distortion Region) (Byrne
13
et al., 1995). Estas desviaciones se relacionan con la existencia de loci de
distorsión de la segregación (SDL: Segregation Distortion Loci) que
evidencian el efecto selectivo en distintos momentos originando: 1-
aborto del polen, 2- competencia del tubo polínico (Liedl and Anderson,
1993), 3- fertilización competitiva o 4- selección cigótica (Kärkkäinen et
al., 1996). Los tres primeros corresponden a diferentes tipos de selección
gamética. Tanto ésta como la selección cigótica pueden estar controladas
por SDL que actúan antes y después de la fertilización. Los SDL que se
expresan antes de la fertilización sólo pueden cambiar la relación
genotípica de los cigotos indirectamente, alterando la proporción de
gametos. Mientras que los SDL que se expresan después de la
fertilización afectan la relación genotípica de los cigotos directamente. Se
han observado SDR en maíz (Austin and Lee, 1996; Senior et al., 1996;
Lu et al., 2002), arroz (Xu et al., 1997.), sorgo (Pereira et al., 1994.) y soja
(Liu et al., 2000). Sin embargo, no existen infornes de la presencia de
SDR en girasol.
1.10. Importancia para el INTA
En los últimos años se han realizado diversos trabajos para
explorar los recursos genéticos de germoplasma de girasol del Instituto
Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) mediante el mejoramiento
asistido con el objetivo de caracterizar el banco y detectar las bases
genéticas de caracteres agronómicos importantes (Paniego et al., 2002;
Maringolo, 2007; Fusari et al., 2008, 2012; Talia et al., 2010; Fusari, 2011;
Moreno, 2011; Filippi et al., 2012, 2013;;Zubrzycki et al., 2012; Moreno et
al., 2013). En este sentido, se analizaron 386 marcadores SSR en
parentales contrastantes para el contenido de ácido oleico (R285: alto
oleico y R023: bajo oleico). Se identificó un total de 82 (21,24%)
marcadores polimórficos entre ambas líneas (Grandón et al., 2012). Esta
etapa inicial permitió seleccionar aquellos SSR que se emplearán para
genotipificar una población F2 segregante obtenida a partir del
cruzamiento de los parentales (R285♂ x R023♀) anteriormente citados.
14
La población total está constituida por 180 individuos, de los cuales 122
ya fueron caracterizados para 41 marcadores SSR. Los individuos
restantes (58) fueron analizados como parte de la presente tesina. Esto
permitirá avanzar en el conocimiento del carácter en estudio y, a futuro,
definir estrategias de manejo dentro del programa de mejoramiento de
girasol de INTA.
15
2. HIPÓTESIS
La población de mapeo F2 proveniente del cruzamiento entre los
parentales R285♂ (alto oleico) y R023♀ (bajo oleico), cumple con la
premisa de segregación 1:2:1 para marcadores co-dominantes según la
Primera Ley de Mendel.
16
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo General
Analizar la segregación de un grupo de marcadores microsatélites
polimórficos en una población de mapeo F2 proveniente del cruzamiento
entre los parentales R285 y R023 contrastantes para el carácter alto
oleico.
3.2. Objetivos Específicos
1. Genotipificar 58 individuos de la población de mapeo F2 con
30 marcadores microsatélites polimórficos para ambos parentales.
2. Analizar la segregación de 30 marcadores (mencionados en
el objetivo anterior) junto con otros 20 marcadores (estudiados
previamente) en el total de la población F2 (180 individuos) mediante la
prueba de Chi cuadrado (X2).
17
4. MATERIALES Y MÉTODOS
Se analizaron 58 individuos pertenecientes a la población de
mapeo F2 derivada del cruzamiento de las líneas parentales R285♂ y
R023♀; las cuales se eligieron con base en el análisis químico realizado
por el Laboratorio de Calidad de Granos, INTA - EEA Manfredi (Tabla 1).
Tabla 1. Perfil de ácidos grasos de las líneas parentales
Parental C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 C22:0 C22:1 C24:0
R285 3,14 4,17 87,2 3,1 0,1 0 0,30 0,9 0,09 0,50
R023 6,02 4,21 25,4 62,8 0,1 0 0,15 0,7 0,11 0,26
C16:0: ácido palmítico, C18:0: ácido esteárico, C18:1: ácido oleico, C18:2, ácido linoleico, C18:3: ácido linolénico, C20:0: ácido araquídico, C20:1: ácido eicosanóico, C22:0: ácido behénico, C22:1: ácido erúcico, C24:0: ácido lignocérico. Los valores están expresados en porcentaje (%).
Para la extracción de ADN se muestrearon hojas jóvenes y sanas
de las plantas F2 que fueron liofilizadas por 60 h en liofilizador modelo
FreeZone 7949030 (LABCONCO, Estados Unidos), posteriormente
molidas y almacenadas en heladera. La extracción se realizó a partir de
0,025 g de material vegetal (R285, R023, F1 y F2) utilizando el kit de
extracción NucleoSpin Plant II (Macherey – Nagel, Alemania).
Para comprobar la calidad del ADN se realizó una electroforesis en
gel de agarosa al 0,8%, con buffer TAE 1X, durante 40 min a 5 V/cm en
una cuba horizontal modelo Horizon 11.14 Watman (Biometra, Alemania).
Para la tinción se utilizó el colorante GelRed Nucleic Acid Gel Stain
10000X (Biotium, Estados Unidos). La visualización del ADN se realizó
empleando un digitalizador de imagen (Bio-Rad, Estados unidos) y el
programa Quantity One 1 D (Bio-Rad, Estados Unidos). La cuantificación
se realizó con un fluorómetro Versafluor (BioRad, Estados Unidos);
siguiendo el protocolo 1 (ver Anexo, sección 10). Las curvas de
calibración se realizaron con el estándar de ADN de timo de ternero
(1mg/mL) (BioRad, Estados Unidos).
18
Con el objeto de completar el perfil molecular de los 180 individuos
pertenecientes a la población F2, los 58 individuos restantes se
genotipificaron con 30 marcadores SSRs; de los cuales, 27 corresponden
a la serie HA y tres a la serie ORS (Paniego et al., 2002; Tang et al.,
2002; Talia et al., 2010) (Tabla 2). La mezcla para la Reacción en Cadena
de la Polimerasa (PCR) se realizó según la Tabla 3. Las amplificaciones
se realizaron en un termociclador AB GeneAmp system 9700 (Applied
Biosystems, Estados Unidos) (Tabla 4). La amplificación de los
fragmentos se comprobó en geles de agarosa al 2% con buffer TAE 1X,
durante 30 min a 5 V/cm en una cuba horizontal modelo Horizon 11.14
Watman (Biometra, Alemania). Para la tinción del gel se utilizó el
colorante GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10000X (Biotium, Estados
Unidos). La visualización de los fragmentos amplificados se realizó
mediante un digitalizador de imagen (Bio-Rad, Estados unidos) y el
programa Quantity One 1 D (Bio-Rad, Estados Unidos).
Los fragmentos amplificados se resolvieron por electroforesis
vertical en geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 6% (p/v) en cuba
vertical Gibco-BRL modelo S2 (Biometra, Alemania), con buffer TBE 0,5X
en la cuba superior y buffer TBE 1X en la cuba inferior. La electroforesis
se realizó a 50 W, entre 90 y 150 min, dependiendo del tamaño del
fragmento. Para verificar el tamaño de los fragmentos en el gel, se usó un
patrón de peso molecular DNA ladder de 10 pb (Invitrogen, Brasil). Los
geles fueron teñidos con nitrado de plata según el protocolo 2 (ver Anexo,
sección 10).
19
Tabla 2. Marcadores polimórficos amplificados en 58 individuos F2 provenientes
del cruzamiento de R285 x R023
ID del
marcador Forward Reverse MR GL
Alelo en
R285
Alelo
en
R023
HA102 cctcaaaacacatctccctctc gaagaggggtgagggtgaagagg ga - 160 154
HA140 ctagcaaccaacctcattg gtctccttctctttctcggc ga 15 145 158
HA196 ggtgttagagtaaagtatgcc gaggggtttcctttcag ga - 176 179
HA360 ctcacccttcatctccttc caacaaggaaccgataactg ga 116 236 223
HA432 gggtttagtggccagtagttgtc ctttatcccccaccccctcc gt 14 170 165
HA557 caccatcattcaccaaccac cgtcgtcgctattcaccgtc gt - 126 128
HA729 ccaatatcaccatcattcacc ctattcaccgtccccatagg gt - 125 128
HA790 gcaaccggagagtgaggtgg ctcatatcttccgcggatatcg tgg - 145 152
HA806 gatgttccttcctgcac ggttggataatggggcagc ga gt - 186 192
HA969 cagttctcacttgtga catcaataagtggaagacggg tgg - 110 122
HA1108 ggaccttctatttaggaggg gggaacatggaataaggg att 110 185 144
HA1848 catccccttctgaatagaaa taggctcgttaaacttacgg att 17 242 260
HA1938 ccaaaatcgtcgaccttgcgac cgagagggaatgtcatttttg att - 229 226
HA2272 caattttcattccttgagatgagg cacaattgtattaaaagcgac att - 252 228
HA2499 gatatcttatcaccttcctgc gttccaaactgacacagcttc gta - 148 138
HA2500 caaactcacaccatccgtgtgg ggaaattgcaggtgtgtgatg atc - 137 141
HA2714 ccctagtgtatagcaacctttc gtagtgtgtatgagggagatgg ga g 114 223 227
HA2946 gggctggttttcattttagtg ccaatccttgagcaaatcag gt - 135 116
HA3298 catccaaatcgagcgcattc ggaaggatgatagttaggg atc - 134 131
HA3349 gggaatctaacttctatcacc cgtatccggagcataatatggag gt - 259 265
HA3373 gcggcgaagaagaaattgagg ggaaagggttcctgttctcc gt - 183 181
HA3703 caaatgctgattccacacta atggtttcctgtttgaattg - 24 213 215
HA3847 catcacttcaacatgcctcc cctagctcctttatgtaacctc gt 110 140 147
HA3878 tttgtttagcatcatcatcatc gagaccctaaccataacatga atc att 27 199 232
HA4057 aaacccttccgacttatctc taaagagagagcccaacaag gt 23 208 206
HA4149 tcaattcatcgtgcatatcg ccaaagtccaccaaatcttcc ga 217 188 199
HA4239 gaatgatagtgaattgagacagg ctggcatctatatccatggatag att 115 112 109
ORS229 tccgacccgaatcttatgaacc gacccgaatgagacccaaactg - 32 172 166
ORS457 tgcatacccaatctaccagcta aagacgaaggtgcaaccagt ac ct - 228 226
ORS662 cgggttggatatggagtcaa cctttacaaacgaagcacaattc ag 21 230 320
ID: identificación del marcador. GL: grupo de ligamiento de acuerdo a 1Poormohammad
Kiani et al., 2007; 2Talia et al., 2010 y
3Tang et al., 2002. -: sin dato. MR: motivo de
repetición. El tamaño de los alelos se expresa en pb.
20
Tabla 3. Mezcla para la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Componentes Concentración Vol. Final (6,5 µL)
Buffer 10 X 0,60 µL
MgCl2 50 mM 0,18 µL
dNTP 10 mM 0,12 µL
Primers F+R 5 µM 0,15 µL
Taq polimerasa (Invitrogen) 0,5 U/µL 0,05 µL
ddH2O (agua bidestilada) 4,40 µL
ADN 15 ng 1,00 µL
Tabla 4. Programa de amplificación para marcadores SSR en Girasol
Etapa Tiempo
Desnaturalización inicial a 94 ºC 4 min
Touchdown (12 ciclos)
Desnaturalización a 94 ºC
Hibridación a 64 ºC (-1 ºC/ciclo)
Elongación a 72 ºC
45 s
45 s
45 s
Amplificación (35 ciclos)
Desnaturalización a 94 ºC
Hibridación a 52 ºC
Elongación a 72 ºC
45 s
45 s
45 s
Extensión final a 72 ºC 10 min
El análisis de segregación de los marcadores SSR (30 SSRs
amplificados como parte de la presente tesina y 20 SSRs estudiados en
paralelo como actividad dentro del proyecto de mapeo biparental del
grupo de trabajo, Tabla 6) en el total de la población F2 (180 individuos),
se realizó mediante el cálculo de X2, utilizando el programa JoinMap 3.0
(Van Ooijen and Voorrips, 2002). Para ajustar los valores de X2 se
procedió a la eliminación, por medio del programa antes mencionado, de
aquellos individuos cuyos genotipos resultaron idénticos en más del 97 %
de los marcadores analizados. Asimismo, la distorsión de la segregación
para las frecuencias alélicas (p=q) y genotípicas (p2:2pq:q2) se analizó
21
mediante la prueba de X2 con el objeto de determinar la influencia de la
selección gamética y selección cigótica.
Tabla 6. Marcadores SSR estudiados previamente y usados para el análisis en este
trabajo
Marcador Forward Reverse MR GL Alelo en
R285
Alelo en
R023
HA293 ggggacatctcccgtccacc cctcatccatctccatccaatc ga 114 121 113
HA911 caaagttcacctcgtttttc aagtgggaaggtctacgagt ga 28 180 178
HA1155 ctgcaggaattataacaatc taaagaaaaagacacgaaag ga gt 212 96 90
HA2057 cacacatctcttctca gaatccatctttgta att - 117 121
HA2178 gaagtaccacctcca cacgtagtacctccc ga - 156 154
HA2191 ggcaactcaatatcc gggttcttcaaggag ga 116 204 206
HA3288 accatagggactga ctagggttttgaggg ga - 193 218
HA3348 ttcaaacgtcgacac ggtcgcacgttaaaa gt ga ta - 203 185
HA3700 gaaaagattgggagagacct ttcttcttccacccacctat ga 15 172 176
ORS16 gaggaaataaatctccgattca gcaaggactgcaatttaggg - - 125 137
ORS420 tcatggtgtttggtttgtgtc tgccaaattcctcttctttct gt 215 136 132
ORS510 catcgcgtccctctctctaa ccaaccatcacagcaatcag gt 39 248 256
ORS687 accgttacacttattggttatttcatt ggggtttgttgttctgttttg ct 315 166 163
ORS844 acgatgcaaagaatatactgcac catgtttaataggttttaattctaggg ac 39 305 307
ORS878 tgcaaggtatccatattccacaa tatacgcaccggaaagaaagtc ac 310 191 200
ORS887 tcgaaaacgactaatccaactttc gagcatgaacaagaattgacaca ac 39 243 249
ORS899 gccacgtataactgactatgacca cgaatacagactcgataaacgaca ac 316 322 312
ORS1085 gacctcaaggcatgctaacactc actaagtgtgtggacggggaaa ct 312 277 281
ORS1146 ggctcatcacttgcatctattgt tgaagacaccatctccaatgc ag 311 344 380
ORS1265 gggtttagcaaataataggcaca acccttggagtttagggatca ct 39 228 226
GL: grupo de ligamiento de acuerdo a 1Poormohammad Kiani et al., 2007;
2Talia et
al., 2010 y 3Tang et al., 2002. -: sin dato. MR: motivo de repetición. El tamaño de
los alelos se expresa en pb.
22
5. RESULTADOS
Con el objetivo de genotipificar 58 individuos de la población de
mapeo F2 se analizaron 30 marcadores SSR, de los cuales nueve se
descartaron por su baja resolución en el gel de poliacrilamida (HA102,
HA729, HA969, HA2946, HA3298, HA3847, HA4239, ORS457, ORS662).
Los 21 marcadores restantes se analizaron en conjunto con 20 SSRs
estudiados en paralelo por el grupo de trabajo.
En la Figura 4 se observa el perfil de amplificación del marcador
HA4149 para 24 individuos de la población F2 y sus respectivos
parentales. Veintiún individuos resultaron homocigotos para el alelo
detectado en el parental R285 (188 pb), dos resultaron homocigotos para
el alelo detectado en el parental R023 (199 pb) y sólo un individuo (260)
evidenció el genotipo heterocigoto.
Figura 4. Perfil de amplificación de los parentales y de 24 individuos F2 para HA4149 en gel de poliacrilamida 6%. M: patrón de peso molecular. Las flechas indican los alelos en R285 (188 pb) y en R023 (199 pb).
En la Tabla 7 se muestran los valores de X2 obtenidos a partir del
análisis de 41 loci en el total de la población en estudio (se consideró
hasta 11 % de datos faltantes). Es así que, para un valor crítico de
X2=5,991 y un nivel de significación α=0,05, se observó una fuerte DS
respecto a la proporción genotípica esperada (1:2:1) para todos los loci.
23
Tabla 7. Resultados del análisis de segregación de 41 marcadores en 180
individuos de la población F2
Marcador A/A A/a a/a DF X2
HA140 103 50 18 9 114,0
HA196 112 35 28 5 143,6
HA293 112 41 24 3 138,5
HA360 149 9 19 3 333,8
HA432 97 58 22 3 84,6
HA557 112 51 16 1 136,1
HA790 103 51 21 5 107,3
HA806 97 54 17 12 97,6
HA911 86 62 25 7 56,9
HA1108 100 40 25 15 112,0
HA1155 117 36 15 12 178,7
HA1848 100 44 25 11 105,4
HA1938 100 52 12 16 116,4
HA2057 106 44 22 8 123,1
HA2178 102 56 19 3 101,7
HA2191 99 47 26 8 97,3
HA2272 97 50 18 15 101,3
HA2499 106 47 24 3 114,9
HA2500 110 44 25 1 127,0
HA2714 109 41 29 1 124,1
HA3288 108 44 24 4 124,2
HA3348 111 35 31 3 137,0
HA3349 98 60 17 5 92,3
HA3373 105 41 29 5 115,4
HA3700 103 39 18 20 132,3
HA3703 102 55 22 1 98,1
HA3878 98 41 26 15 104,6
HA4057 117 42 21 0 153,6
HA4149 104 52 20 4 109,6
ORS16 107 41 27 5 122,6
ORS229 107 45 12 16 143,4
ORS420 104 51 16 9 118,4
ORS510 113 42 22 3 142,4
ORS687 114 34 17 15 171,1
ORS844 109 33 18 20 158,7
ORS878 99 43 25 13 104,9
ORS887 106 44 21 9 124,8
ORS899 99 49 14 18 114,5
ORS1085 103 46 22 9 113,2
ORS1146 98 46 16 20 113,0
ORS1265 92 47 26 15 83,4
A/A: número de individuos homocigotas para el alelo detectado en R285 para cada marcador. a/a: número de individuos homocigotas para el alelo detectado en R023 para cada marcador. A/a: número de individuos heterocigotos para cada marcador. DF: número de datos faltantes. X
2: valores de Chi cuadrado. Nivel de significación (α)= 0,05.
24
El mismo análisis se llevó a cabo eliminando 41 individuos que
presentaron un porcentaje de similitud genotípica (para todos los loci
estudiados) mayor al 97 %. A pesar que los valores de X2 en general
disminuyeron considerablemente, aún se detectó una distorsión de la
segregación elevada (Tabla 8).
En ambos análisis se observó un fuerte desvío de la distorsión
hacia el genotipo del parental R285. Es por ello que, con el objetivo de
determinar la causa de dicha distorsión, se calculó X2 para las frecuencias
alélicas y genotípicas (Tabla 9). De los 41 marcadores analizados, 35
presentaron una DS significativa (p≤0,05) tanto alélica como genotípica.
No obstante, los seis marcadores restantes (HA806, HA911, HA1938,
HA3349, ORS229 y ORS899) solo mostraron DS significativa en sus
frecuencias alélicas.
25
Tabla 8. Resultados del análisis de segregación de 41 marcadores en 139
individuos de la población F2 (con porcentaje de similitud genotípica
menor o igual al 97 %)
Marcador A/A A/a a/a DF X2
HA140 64 50 18 7 39,8
HA196 71 35 28 5 58,2
HA293 71 41 24 3 53,9
HA360 108 9 19 3 218,9
HA432 58 57 22 2 22,8
HA557 71 51 16 1 53,2
HA790 62 51 21 5 32,7
HA806 56 54 17 12 26,8
HA911 56 51 25 7 21,4
HA1108 60 40 25 14 35,8
HA1155 76 36 15 12 82,4
HA1848 60 44 25 10 32,0
HA1938 59 52 12 16 38,9
HA2057 65 44 22 8 42,3
HA2178 64 54 19 2 35,7
HA2191 58 47 26 8 26,1
HA2272 59 49 18 13 32,9
HA2499 65 47 24 3 37,7
HA2500 71 42 25 1 51,8
HA2714 68 41 29 1 44,8
HA3288 67 44 24 4 43,8
HA3348 70 35 31 3 54,4
HA3349 58 59 17 5 27,0
HA3373 65 41 29 4 40,0
HA3700 62 39 18 20 46,7
HA3703 61 55 22 1 27,7
HA3878 57 41 26 15 29,7
HA4057 78 40 21 0 71,8
HA4149 63 52 20 4 34,5
ORS16 66 41 27 5 42,9
ORS229 66 45 12 16 56,3
ORS420 63 51 16 9 40,0
ORS510 72 42 22 3 56,7
ORS687 74 34 17 14 78,0
ORS844 68 33 18 20 65,6
ORS878 58 43 25 13 30,0
ORS887 65 44 21 9 43,4
ORS899 58 49 14 18 36,4
ORS1085 62 46 22 9 35,7
ORS1146 58 46 16 19 35,9
ORS1265 56 42 26 15 27,4
A/A: número de individuos homocigotas para el alelo detectado en R285 para cada marcador. a/a: número de individuos homocigotas para el alelo detectado en R023 para cada marcador. A/a: número de individuos heterocigotos para cada marcador. DF: número de datos faltantes. X
2: valores de Chi cuadrado. Nivel de significación (α)= 0,05.
26
Tabla 9. Resultados del análisis de distorsión de las frecuencias alélicas y
genotípicas para 41 marcadores analizados en 180 individuos F2
Marcador Frecuencias alélicas X
2
P Q p=q p2:2pq:q
2
HA140 0,75 0,25 84,50 8,53
HA196 0,74 0,26 80,64 40,36
HA293 0,75 0,25 87,50 26,18
HA360 0,87 0,13 190,96 107,46
HA432 0,71 0,29 63,56 7,17
HA557 0,77 0,23 102,97 7,17
HA790 0,73 0,27 76,85 11,22
HA806 0,74 0,26 76,19 *4,77
HA911 0,68 0,32 43,02 *5,69
HA1108 0,73 0,27 68,18 24,95
HA1155 0,80 0,20 123,86 17,33
HA1848 0,72 0,28 66,57 20,89
HA1938 0,77 0,23 94,44 *1,96
HA2057 0,74 0,26 82,05 18,52
HA2178 0,73 0,27 77,84 6,31
HA2191 0,71 0,29 61,97 19,12
HA2272 0,74 0,26 75,65 7,53
HA2499 0,73 0,27 75,98 18,56
HA2500 0,74 0,26 80,73 23,88
HA2714 0,72 0,28 71,51 32,72
HA3288 0,74 0,26 80,18 21,87
HA3348 0,73 0,27 72,32 44,78
HA3349 0,73 0,27 74,98 *2,83
HA3373 0,72 0,28 66,01 31,24
HA3700 0,77 0,23 90,31 16,47
HA3703 0,72 0,28 71,51 9,64
HA3878 0,72 0,28 62,84 24,60
HA4057 0,77 0,23 102,40 21,78
HA4149 0,74 0,26 80,18 9,70
ORS16 0,73 0,27 73,14 29,08
ORS229 0,79 0,21 110,06 *4,96
ORS420 0,76 0,24 90,57 6,08
ORS510 0,76 0,24 93,57 22,30
ORS687 0,79 0,21 114,05 22,62
ORS844 0,78 0,22 103,51 24,37
ORS878 0,72 0,28 65,58 21,55
ORS887 0,75 0,25 84,50 17,13
ORS899 0,76 0,24 89,20 *4,42
ORS1085 0,74 0,26 76,74 16,05
ORS1146 0,76 0,24 84,05 7,76
ORS1265 0,70 0,30 52,80 17,09
p: alelo detectado en R285. q: alelo detectado en R023. X2: Chi cuadrado. *: Sin
distorsión (α=0,05).
27
6. DISCUSIÓN
Del total de 82 marcadores polimórficos detectados entre los
parentales R285 y R023, sólo se analizó la segregación en 41 de ellos
debido a que en un análisis previo con 20 SSRs se observó que el 100%
de los marcadores presentaron DS (datos no publicados). Para analizar la
causa de la distorsión se realizó la prueba de X2 para las frecuencias
alélicas y genotípicas. Es así que, los resultados obtenidos en este trabajo
mostraron DS significativa (p≤0,05) para ambos tipos de frecuencias en
35 marcadores analizados. Estos resultados sugieren la influencia de la
selección gamética y cigótica simultáneamente. Sin embargo, los
marcadores HA806, HA911, HA1938, HA3349, ORS229 y ORS899 sólo
mostraron DS de las frecuencias alélicas indicando que dicha segregación
estaría influenciada por la selección gamética únicamente. Estos
resultados coinciden con los publicados por Zhao et al. (2006) y Wu et al.
(2007) que analizaron la DS de marcadores SSR en poblaciones F2 de
arroz y algodón, respectivamente. Zhao et al. (2006) analizaron la
segregación de 148 marcadores SSR en 90 líneas de arroz, detectando
que el 50% de los marcadores presentaron DS; la cual resultó significativa
(p≤0,05) en 49 marcadores y muy significativa (p≤0,01) en 25 de ellos. De
los 49 SSRs, 36 se desviaron hacia el parental masculino y 13 hacia el
genotipo heterocigoto. Los marcadores con DS tendieron a agruparse en
regiones coincidentes con loci gametofíticos (ga) y genes de esterilidad
dentro de los GL. Esto también fue publicado por Yan (2003), quien
encontró que los loci ga influyen en la DS detectada en poblaciones F2 de
maíz. Cheng et al. (1996) asumen que la DS en un locus marcador se
debería principalmente al ligamiento de dicho marcador con un locus ga
cercano en el mismo cromosoma; aunque también se han sugerido genes
duplicados, anomalías cromosómicas y fertilización competitiva como
posibles causas de la distorsión. De todos modos, no se ha informado la
presencia de este tipo de loci en girasol. Para este cultivo, sólo se dispone
28
de información en cuanto a la DS asociada a regiones genómicas de
viabilidad del polen en híbridos interespecíficos (Quillet et al., 1995).
En cuanto a la distribución de los alelos en los marcadores
analizados, se observó que las desviaciones de las proporciones
mendelianas se dirigieron hacia el alelo detectado en el parental R285.
Esto también fue observado por Zhang et al. (1997) y Liu et al. (2000)
quienes usando los mismos parentales para construir mapas de
ligamiento genético en soja, encontraron que los marcadores con mayor
DS se desviaron hacia la variedad Changnong4. Estos autores postularon
que la principal razón de DS correspondió a la selección gamética. Esta
explicación fue coincidente con la publicada por Shen et al. (1998) y Yang
et al. (2004) en trabajos de mapeo genético en arroz y maíz,
respectivamente. En concordancia con esta idea, se han informado
desviaciones extremas de la segregación hacia alguno de los parentales
(Prince et al., 1993; Lu et al., 2002) o hacia el heterocigoto (Prince et al.,
1993; Kesseli et al., 1994; Kaló et al., 2000; Song et al., 2005) en
diferentes especies de cultivo. Sin embargo, resulta interesante destacar
que la selección gamética es más común que se evidencie en el parental
donador del polen (Song et al., 2006). No así en esta población de estudio
donde la selección parece actuar en contra del parental femenino.
Es posible también que los errores en la genotipificación de los
marcadores y las mutaciones sitio-específicas originen desviaciones
sistemáticas de las proporciones esperadas de segregación (Sibov et al.,
2003); sin embargo, no serían una justificación aceptable en el contexto
de este trabajo dado que se repitió el análisis por triplicado de todos
aquellos individuos cuyo patrón de amplificación fue dudoso. Además, las
mutaciones en el sitio de amplificación de los SSRs podrían generar
alelos nulos pero esto no explicaría el grado de DS detectado para todos
los marcadores analizados.
29
7. CONCLUSIONES
● De los 30 marcadores SSR estudiados, sólo 21 resultaron
informativos para el análisis de segregación en la población F2
● El 85,4 % de los marcadores SSR analizados presentaron
distorsión de las frecuencias alélicas y genotípicas, lo que sugiere la
influencia de selección gamética y cigótica simultáneamente. Mientras
que los marcadores HA806, HA911, HA1938, HA3349, ORS229 y
ORS899 solo mostraron distorsión de las frecuencias alélicas, esto
sugiere la influencia de selección gamética únicamente.
● La población de mapeo F2 proveniente del cruzamiento entre
R285♂ y R023♀ no cumplió con la premisa de segregación 1:2:1 para
marcadores co-dominantes según la Priemera Ley de Mendel.
30
8. PERSPECTIVAS FUTURAS
En base a los resultados obtenidos en el presente trabajo para la
población F2 segregante analizada, se propone abordar dos estrategias.
Por un lado, la caracterización molecular de nuevos parentales
contrastantes para el carácter en estudio con el objeto de determinar el
cruzamiento más adecuado para la construcción de poblaciones F2
segregantes que permitan acceder a un mapa de ligamiento robusto. Por
otro lado, sería pertinente evaluar otros tipos de poblaciones de mapeo
genético como las líneas endocriadas recombinantes (RIL: Recombinant
Inbred Lines), poblaciones derivadas de retrocruzamientos (BC: Back-
Cross) o las provenientes de cruzamientos recíprocos. Asimismo, también
sería viable el estudio del carácter a través de otras metodologías de
abordaje como el mapeo por asociación, el análisis de mutaciones para
genes concretos relacionados al carácter (TILLING: Targeting Induced
Local Lesions in Genomes) o el uso de chips de ADN (microarrays).
31
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10. ANEXO
Protocolo 1: CUANTIFICACIÓN DE ADN POR FLUOROMETRÍA
a) Preparar la solución de trabajo como se detalla más abajo.
b) Agregar 2 mL de solución en la cubeta de cuantificación,
colocarla en el fluorómetro y ajustar a cero. Repetir este paso
cada vez que se lee una muestra nueva.
c) Remover la cubeta y agregar 2 µL de muestra. Mezclar por
inversión varias veces y colocar en el aparato nuevamente.
Registrar la lectura del equipo y repetir los pasos b y c. Hacer
por lo menos dos lecturas de cada muestra.
d) Descartar la solución de trabajo y enjuagar la cubeta con ddH2O
después de cada lectura.
Soluciones utilizadas:
- Solución de trabajo a utilizar para 20 muestras:
ddH2O 36 mL
Buffer TNE (10X) 4 mL
Hoechst #33528 (1 mg/mL) 4 µL
- Solución Buffer TNE (pH 7,2) para un volumen final de 1 L:
NaCl (1,5 M) 175 g
Tris base (0,5 M) 121 g
EDTA (0,001 M) 0,74 g
Enrazar 1L con ddH2O.
46
Protocolo 2: TINCIÓN CON NITRATO DE PLATA Y
PRETRATAMIENTO CON ÁCIDO NÍTRICO (modificado de Creste et al.
2001)
a) 1º Fijación: 10 min en agitación con solución fijadora.
b) 1º Lavado: 1 min en agitación con agua destilada.
c) Pre-tratamiento: 3 min en agitación con ácido nítrico.
d) 2º Lavado: 1 min en agitación con agua destilada.
e) Tinción: 15 min en agitación con nitrato de plata.
f) 3º Lavado rápido: 10 s en agua destilada.
g) 1º Revelado: con hidróxido de sodio en agitación durante 10 s.
h) 2º Revelado: con carbonato de sodio, en agitación hasta que
aparezcan las bandas.
i) 2º Fijación: 5 min en agitación con solución fijadora.
j) 4º Lavado: 5 min en agitación con agua destilada.
Soluciones utilizadas:
- 1º Solución fijadora:
Etanol absoluto 100 mL
Ácido acético 10 mL
Enrazar 1 L con ddH2O.
- Solución de pretratamiento:
Ácido nítrico 15 mL
Enrazar 1 L con ddH2O.
- Solución de tinción:
Nitrato de plata 2 g
Enrazar 1 L con ddH2O.
- Solución de revelado:
Hidróxido de sodio 15 g / Carbonato de sodio 30 g
Formaldehído 540 µL
Enrazar 1 L con ddH2O.
- 2º Solución fijadora:
Ácido acético 50 mL
Enrazar 1 L con ddH2O.
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