Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.
Posgrado en Ciencias Biológicas
Actividad antifúngica de extractos de macroalgas
marinas de la costa de Yucatán
Tesis que presenta
MAURICIO GÓMEZ HERNÁNDEZ
En opción al título de
MAESTRO EN CIENCIAS
(Ciencias Biológicas: Opción Biotecnología)
Mérida, Yucatán, México
2018
DECLARACIÓN DE PROPIEDAD
Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos
Experimentales, los Resultados y Discusión de este documento proviene de las
actividades de experimentación realizadas durante el período que se me asignó
para desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro
de Investigación Científica de Yucatán, A.C., y que a razón de lo anterior y en
contraprestación de los servicios educativos o de apoyo que me fueron
brindados, dicha información, en términos de la Ley Federal del Derecho de
Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, le pertenece patrimonialmente a dicho
Centro de Investigación. Por otra parte, en virtud de lo ya manifestado,
reconozco que de igual manera los productos intelectuales o desarrollos
tecnológicos que deriven o pudieran derivar de lo correspondiente a dicha
información, le pertenecen patrimonialmente al Centro de Investigación
Científica de Yucatán, A.C., y en el mismo tenor, reconozco que si derivaren de
este trabajo productos intelectuales o desarrollos tecnológicos, en lo especial,
estos se regirán en todo caso por lo dispuesto por la Ley Federal del Derecho
de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, en el tenor de lo expuesto en la
presente Declaración.
Firma: ________________________________
Biól. Mar. Mauricio Gómez Hernández
Este trabajo se llevó a cabo en la Unidad de Biotecnología del Centro de Investigación
Científica de Yucatán, y forma parte del proyecto titulado “Actividad antifúngica de
extractos de macroalgas marinas de la costa de Yucatán”, bajo la dirección de la Dra.
Cecilia Mónica Rodríguez García.
AGRADECIMIENTOS
A CONACYT, por la beca otorgada # 612342.
Al CICY, por las instalaciones y el apoyo brindado para realizar este trabajo.
A la Dra. Cecilia Mónica Rodríguez García, por su asesoría académica, sabios consejos,
paciencia y dedicación en la revisión de mis documentos y trabajo en el laboratorio, que me
permitieron desarrollarme profesionalmente.
A la M.C. Leticia Peraza Echeverría, por su asesoría académica, sabios consejos, paciencia y
dedicación en mi capacitación en el trabajo de laboratorio y revisión de mis documentos.
Al M.C. Luis W. Torres Tapia, por su apoyo técnico en diversos experimentos relacionados
con la extracción orgánica y la cromatografía líquida de alta resolución.
A la Biól. Silvia Hernández Aguilar, por su apoyo en el herbario.
A la Dra. Ileana Ortegón Aznar, por la identificación de las especies de macroalgas marinas.
A los compañeros de laboratorio, por sus consejos y buenos deseos.
Al comité tutorial conformado por la Dra. Cecilia Mónica Rodríguez García, Dr. Sergio Rubén
Peraza Sánchez, Dr. Ignacio Rodrigo Islas Flores, Dra. Elizabeth Ortiz Vázquez y Dra.
Alejandra Prieto Davó, por sus asesorías, correcciones, consejos y conocimientos que me
permitieron crecer de manera profesional y personal.
DEDICATORIA
A Dios por cuidarme, protegerme y enseñarme el camino.
A mi esposa Guadalupe Dayre Catzim Uc, por sus consejos, dedicación, amor y sobre todo por acompañarme en este viaje que es la vida.
A mis hijas Yoshy y Cami que, a pesar del poco tiempo que estuvieron, muy pronto volverán.
A mi abuela María Cristina Hernández Vásquez, por ser mi primera maestra, por sus cuidados y cariño.
Y a mi madre Fe Gómez Hernández, por su motivación y fuerza.
Índice
i
ÍNDICE
Índice …………………………………………………………………………………...……………………. i
Listado de abreviaturas …………………………….……………..……………………………………… v
Índice de figuras ………………….……………………………………………………………………….. vi
Índice de cuadros ………………….……………………………………………………………………… viii
Resumen
Abstract
INTRODUCCIÓN …………………………………………………………………………………………. 1
CAPÍTULO I
ANTECEDENTES
1.1. La importancia de la agricultura en México ……………………………………………..………. 3
1.1.1. Principales productos agrícolas ………………………………………………………………… 4
1.1.2. Derrama económica de la agricultura …………………………………………………………… 5
1.2. Riesgos que afectan a la agricultura en México ………………………………………………….
. 6
1.2.1. Riesgos abióticos y costos económicos ……………………………………………………….. 6
1.2.2. Riesgos bióticos y costos económicos …………………………………………………………. 6
1.3. Hongos fitopatógenos ……………………………………………………………………………… 7
1.4. Pseudocercospora fijiensis Morelet ………………………………………………………………. 8
1.4.1. Ciclo de vida ……………………………………………………………………………………….. 8
1.4.2. Patogenia …………………………………………………………………………………………. 9
1.4.3. Control …………………………………………………………………………………………….. 10
1.4.4. Daños económicos ……………………………………………………………………………….. 10
1.5. Fusarium oxysporum Schlechtendal ………………………………………………………………. 11
1.5.1. Ciclo de vida ……………………………………………………………………………………….. 11
1.5.2. Patogenia …………………………………………………………………………………………. 12
1.5.3. Control …………………………………………………………………………………………….. 12
1.5.4. Daños económicos ……………………………………………………………………………….. 13
1.6. Colletotrichum gloeosporioides (Penz) Penz. y Sacc. ………………………………………….. 13
1.6.1. Ciclo de vida ……………………………………………………………………………………….. 13
1.6.2. Patogenia …………………………………………………………………………………………. 14
1.6.3. Control …………………………………………………………………………………………….. 14
1.6.4. Daños económicos ……………………………………………………………………………….. 15
1.7. Los fungicidas sintéticos ……………………………………………………………………………. 15
1.7.1. Fungicidas de contacto y sistémicos …………………………………………………………… 16
1.7.2. Afectaciones causadas por la aplicación de fungicidas ……………………………………… 16
1.7.3. Alternativas a los fungicidas sintéticos …………………………………………………………. 17
1.8. Las macroalgas marinas ……………………………………………………………………………. 18
Índice
ii
1.8.1. Distribución ……………………………………………………………………………………….. 19
1.8.2. Aprovechamiento de macroalgas marinas ……………………………………………………... 20
1.8.3. Metabolitos de macroalgas marinas …………………………………………………………….. 21
1.8.4. Actividad antifúngica de macroalgas marinas …………………………………………………. 21
1.8.5. Estudios de macroalgas marinas contra fitopatógenos ……………………………………… 21
1.8.6 Macroalgas marinas en Yucatán y su potencial aprovechamiento …………………………... 23
1.8.7. Los arribazones de macroalgas marinas ……………………………………………………….. 24
1.8.8. Estudios sobre arribazones ……………………………………………………………………… 24
JUSTIFICACIÓN …………………………………………………………………………………………. 27
HIPÓTESIS ………………………………………………………………………………………………. 28
OBJETIVO GENERAL …………………………………………………………………………………. 29
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ……………………………………………………………………………. 29
ESTRATEGIA DE INVESTIGACIÓN …………………………………………………………………... 30
CAPÍTULO II
ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DE EXTRACTOS CRUDOS ACUOSOS, FRACCIONES ORGÁNICAS
Y PARTE PROTEICA DE LAS MACROALGAS MARINAS
2.1. MATERIALES Y MÉTODOS ……………………………………………………………………… 32
2.1.1. Material algal …………………………………………………………………………………….. 32
2.1.2. Preparación e identificación de macroalgas …………………………………………………… 32
2.1.3. Preparación de las muestras para la obtención de extractos crudos acuosos (ECA’s) ……. 33
2.1.4. Métodos de elaboración de ECA’s ……………………………………………………………… 34
2.1.5. Bioensayo de actividad antifúngica de los ECA’s …………………………………………….. 35
2.1.6. Extracción orgánica y fraccionamiento de las macroalgas marinas con actividad antifúngica 36
2.1.7. Bioensayo de actividad antifúngica de las fracciones orgánicas ……………………………. 36
2.1.8. Extracción de proteína de los ECA’s de las macroalgas mediante ultrafiltración …………. 37
2.1.9. Cuantificación mediante el método de Bradford de la proteína de los ECA’s con actividad
antifúngica ………………………………………………………………………………………………..
37
2.1.10. Análisis de los ECA’s con actividad antifúngica mediante cromatografía líquida de alta
resolución (CLAR) y cromatografía en capa delgada (CCD) ……………………………………….
38
2.1.11. Determinación de la actividad antifúngica de los ECA’s utilizando el método de Alamar
Blue ………………………………………………………………………………………………………..
39
2.1.12. Análisis de toxicidad de los ECA’s en camarones de salmuera (Artemia salina) ………... 40
2.13. RESULTADOS …………………………………………………………………………………….. 41
2.14. Material algal ……………………………………………………………………………………… 41
2.15. Elección del método de elaboración de ECA’s ………………………………………………… 44
2.16. Bioensayo de actividad antifúngica del ECA de Halymenia floresii …………………………. 45
2.17. Análisis de toxicidad del ECA de H. floresii ……………………………………………………... 47
Índice
iii
2.17.1. Análisis de toxicidad del ECA de H. floresii en camarones de salmuera (Artemia salina) ... 48
2.17.2. Análisis de toxicidad en lombriz de tierra (Eisenia foetida) …………………………………... 48
2.18. Análisis del ECA de H. floresii mediante cromatografía en capa delgada (CCD) …………. 48
2.19. Análisis del ECA de H. floresii mediante cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) …. 49
2.20. Determinación de la actividad antifúngica del ECA de H. floresii mediante el método de
Alamar Blue ………………………………………………………………………………………………
52
2.21. Extracción de fracciones orgánicas de H. floresii y bioensayo de actividad antifúngica..…... 54
2.22. Bioensayo de actividad antifúngica de la parte proteíca del ECA de H. floresii ……………. 55
2.23. Perfil proteico de H. floresii ………………………………………………………………………. 58
2.24. DISCUSIÓN ………………………………………………………………………………………... 60
CAPÍTULO III
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
3.1. CONCLUSIONES …………………………………………………………………………………. 66
3.2. PERSPECTIVAS Y RECOMENDACIONES ……………………………………………………… 67
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS …………………………………………………………………….. 68
ANEXOS ………………………………………………………………………………………………….. 85
Índice
iv
Listado de abreviaturas
v
Listado de abreviaturas
AB Alamar Blue
CCD Cromatografía de capa delgada
CLAR Cromatografía líquida de alta resolución
ECA Extracto crudo acuoso
mAU Miliunidades de absorbancia
µL Microlitros
µm Micrómetros
nm Nanómetros
p/v Peso/volumen
PDA Papa dextrosa agar
PDB Caldo de papa dextrosa
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio
ton Toneladas
Índice de figuras
vi
ÍNDICE DE FIGURAS CAPÍTULO I
Figura 1.1. Promedio anual de superficie sembrada y cosechada en México en el año 2015
(SIAP, 2017) …………………………………………………………………………………………………
4
Figura 1.2. Producción agrícola en México en el año 2015 (SIAP, 2017) ……………….................... 5
Figura 1.3. Principales productos agrícolas mexicanos y su valor económico en el año 2015
(SIAP, 2017) ………………………………………………………………………………………..............
5
Figura 1.4. Ciclo de vida de Pseudocercospora fijiensis en plantas de banano (Manzo-Sánchez et
al.,2005) ………………………………………………………………………………….…..
9
Figura 1.5. Estadios de la Sigatoka negra en hojas de banano.1), pizca; 2) y 3), estrías; 4), 5) y 6),
manchas (Fouré, 1997) …………………………….………………………........................................
10
Figura 1.6. Ciclo de vida de Fusarium oxysporum (Grimaldo, 2016) ………………………………. 12
Figura 1.7. Ciclo de vida de Colletotrichum gloeosporioides y Giberella cingulata (Agrios, 2002). 14
Figura 1.8. Modo de acción de los fungicidas en las plantas: a) de contacto y b) sistémicos
(Pérez y Forbes, 2014) ……………………………………………………………………………………
16
Figura 1.9. Divisiones de las algas marinas: a) Rhodophyta, b) Ochrophyta, c) Chlorophyta ……. 19
Figura 1.10. Mapa de distribución de macroalgas marinas en el mundo (Kerswell, 2006)
…………………………………………………………………………………………………………………..
19
Figura 1.11. Arribazón de algas en la costa de Sisal, Yucatán (16 enero del 2017) ………………. 24
Figura 1.12. Proceso de secado de macroalgas marinas ……………………………………........... 33
Figura 1.13. Estrategia experimental de tres métodos de elaboración de ECA’s …………….…… 35
CAPÍTULO II
Figura 2.1. Espécimen de Halymenia floresii con las características representativas de la especie
………………………………………………………………………………………………………………….
41
Figura 2.2. Espécimen de Agardhiella subulata con las características representativas de la
especie ……………………………………………………………………………………………………….
42
Figura 2.3. Espécimen de Codium isthmocladum con las características representativas de la
especie ...............................................................................................................................................
42
Figura 2.4. Espécimen de Dictyota dichotoma con las características representativas de la especie
…………………………………………………………………………………………………………………..
43
Figura 2.5. Espécimen de Bryothamnion triquetrum con las características representativas de la
especie ……………………………………………………………………..............................................
43
Figura 2.6. Crecimiento del micelio de los hongos (C. gloeosporioides y F. oxysporum ) tratados
con el ECA de H. floresii a 30 días de inoculación ……………………………………………………..
45
Figura 2.7. Inhibición del crecimiento micelial de P. fijiensis ocasionado por el extracto acuoso de
Índice de figuras
vii
H. floresii ………………………………………………………………………………………….............. 46
Figura 2.8. Conidios de P. fijiensis sin crecimiento micelial ocasionado por el ECA de H. floresii
…………………………………………………………………………………………………........................
47
Figura 2.9. Cromatograma en capa delgada (CCD) del ECA (1), parte proteica (2) y no proteica (3)
de H. floresii con actividad antifúngica ……………………………………………...............................
49
Figura 2.10. Cromatogramas del extracto crudo acuoso de H. floresii a 214nm …………….......... 50
Figura 2.10. Continuación Cromatogramas del extracto crudo acuoso de H. floresii a 214nm …… 51
Figura 2.11. Curva de reducción de resazurina-resorufina ……………………………….................. 52
Figura 2.12. Reducción de resazurina-resorufina del ECA de H. floresii ……………………………. 53
Figura 2.13. Inhibición del ECA de H. floresii (27.27 mg/mL) sobre conidios de P. fijiensis ………. 53
Figura 2.14. Conidios germinados al inicio del experimento …………………………………............ 56
Figura 2.15. Conidios de P. fijiensis sin crecimiento micelial ocasionado por la parte proteica del
ECA de H. floresii ……………………………………………………………………………...................
56
Figura 2.16. Inhibición del crecimiento micelial de P. fijiensis ocasionado por la parte proteica del
ECA de H. floresii …………………………………………………………………………………………..
57
Figura 2.17. Conidios de P. fijiensis sin crecimiento micelial ocasionado por la parte proteica del
ECA de H. floresii ………………………………………………………………………………................
57
Figura 2.18. Crecimiento micelial de P. fijiensis que indica ausencia de actividad antifúngica de la
parte no proteica del ECA de H. floresii …………………………………………………………………
58
Figura 2.19. Perfil proteico de los ECA’s de H. floresii ………………………………………………... 59
Índice de cuadros
viii
ÍNDICE DE CUADROS
CAPÍTULO
Cuadro 1.1. Fungicidas sintéticos, nombres comunes, grupo químico al que pertenecen y
mecanismo de acción …………………………………………………………………………………
15
Cuadro 1.2. Bioplaguicidas en el mercado …………………………………………………………. 18
Cuadro 1.3. Estudios sobre actividad antifúngica de macroalgas marinas …………………….. 22
CAPÍTULO II
Cuadro 2.4. Condiciones del gradiente de elución utilizado para obtención del perfil
cromatográfico del extracto crudo acuoso de H. floresii …………………………………………..
38
Cuadro 2.5. Biomasa colectada de algas marinas, peso húmedo colectado, peso seco y
porcentaje de peso seco ………………………………………………………………………………
44
Cuadro 2.6. Material obtenido de las fracciones orgánicas de H. floresii ………………………… 54
Cuadro 2.7. Rendimiento de las fracciones orgánicas de C. isthmocladum …………………….. 55
Resumen
RESUMEN
Los hongos fitopatógenos son responsables de pérdidas económicas enormes en la
agricultura debido a su gran diversidad y adaptabilidad. Para su control se utilizan
principalmente fungicidas sintéticos, pero ocasionan un impacto negativo en el
ambiente y la salud, por lo cual es necesario la búsqueda de nuevos compuestos y el
desarrollo de productos alternativos de control que tengan baja toxicidad y sean
efectivos. En este trabajo se evaluó la actividad antifúngica de extractos de
macroalgas marinas contra fitopatógenos como Pseudocercospora fijiensis,
Colletotrichum gloeosporioides y Fusarium oxysporum.
Dado su bajo costo, fácil acceso y abundancia, se identificaron y obtuvieron extractos
acuosos de las macroalgas marinas Halymenia floresii, Agardhiella subulata, Codium
isthmocladum, Dictyota dichotoma y Bryothamnion triquetrum colectadas de
arribazones de la zona costera de Dzilam de Bravo y Sisal, Yucatán. Únicamente el
ECA de H. floresii en concentraciones de 27.27 y 13.72 mg/mL presentó actividad
inhibitoria sobre el crecimiento del hongo P. fijiensis durante 30 días. Además, el ECA
de H. floresii no presentó actividad tóxica sobre Artemia salina y Eisenia foetida. El
análisis por cromatografía líquida de alta resolución del ECA de H. floresii presentó
tres picos mayoritarios en los tiempos de retención 1.633, 23.047 y 23.900 con un
máximo de absorbancia de 319, 270 y 265 mAU y un área bajo la curva de 10.06,
12.28 y 10.74%, respectivamente, y 20 picos minoritarios. Una prueba colorimétrica
usando el reactivo resazurina para determinar la viabilidad de P. fijiensis después del
tratamiento con el ECA de H. floresii mostró una reducción del 47.32% en la viabilidad
y una actividad inhibitoria de la germinación de los conidios de P. fijiensis del 58.64%
confirmando la actividad antifúngica del ECA de H. floresii. La evaluación de las
fracciones órganicas de H. floresii no mostraron actividad antifúngica; sin embargo, la
parte proteica del ECA de H. floresii fue activa contra P. fijiensis en concentraciones de
0.625, 1.25, 2.5 y 5 ng/µL a 30 días, indicando que el posible origen de la actividad
antifúngica del ECA de H. floresii sea de naturaleza proteica o peptídica.
ABSTRACT
Fungi are phytopathogens responsible for the economic losses in the agriculture.
Farmers use mainly synthetic fungicides for there control, but they cause a negative
impact on the environment and health. It is necessary to search for innovative
compounds and the development of alternative products with low toxicity and efficacy.
Aqueous extracts of marine macroalgae collected from the coastal zone of Dzilam de
Bravo and Sisal, Yucatán (Halymenia floresii, Agardhiella subulata, Codium
isthmocladum, Dictyota dichotoma, and Bryothamnion triquetrum) were obtained. Only
the aqueous crude extracts of H. floresii presented inhibitory activity on the growth of
the fungus P. fijiensis at 27.27 and 13.72 mg/mL during 30 days. The toxicity analysis
was carried out in Artemia salina and Eisenia foetida, where the ECA of H. floresii
showed no toxic activity at the evaluated settings. To know the richness of the
compounds present in the ECA of H. floresii, a high-resolution liquid chromatography
was performed, which showed three large peaks at the retention times of 1.633, 23.047
and 23.900 with a maximum absorbance of 319, 270 and 265 mAU and an area under
the curve of 10.06, 12.28, and 10.74%, respectively, and 20 minority peaks. A
colorimetric test was also carried out using the reagent Alamar Blue to determine the
viability of P. fijiensis fungi after treatment with the ECA of H. floresii, where a reduction
percentage of 47.32% and an inhibitory activity on the conidia of P. fijiensis of 58.64%
were obtained, confirming the antifungal activity of H. floresii. The activity of the general
fractions was also evaluated; however, the antifungal activity was not present. The
protein part of the ECA of H. floresii was active against P. fijiensis at 0.625, 1.25, 2.5
and 5.0 ng/μL at 30 days, indicating that the possible origin of the antifungal activity of
the ECA of H. floresii, could be either proteinic or peptidic.
Introducción
1
INTRODUCCIÓN
Los fertilizantes y plaguicidas en la agricultura han incrementado los rendimientos de
las cosechas y en cierta medida han contribuido al control de patógenos como
bacterias, virus, insectos y hongos (SAGARPA, 2015), los cuales causan cuantiosas
pérdidas económicas y biológicas (Agrios, 2005).
El uso excesivo de fertilizantes y plaguicidas sintéticos ocasiona efectos adversos
sobre el medio ambiente, e.g., contaminación del suelo, agua, aire y daños a la salud
dado que se han reportado casos de cáncer de piel en la población involucrada en el
proceso de cultivo de banano, tal es el caso de Ecuador (Arce, 2015 citado por Lizardo
y Montiel, 2016), además algunos hongos patógenos han desarrollado resistencia a
los fungicidas (revisado por Hahn, 2014).
Se han reportado compuestos alternativos a los fungicidas sintéticos como el yodo (I)
que ha permitido el control de las especies Rhizoctonia y Gaeumannomyces en arroz
a dosis de 0.75 L/ ha (8.4 g/L de yodo libre) (Rivas y Sael, 2017), nanopartículas de
cobre contra Cladosporium herbarum (Cu) (Alta y Pastrana, 2017), extractos acuosos,
orgánicos, polvos, aceites esenciales y metabolitos secundarios de plantas superiores
como eucalipto, neem (Alfonso, 2002 citado por Nava-Pérez et al., 2012), clavo,
orégano, epazote, albahaca, tomillo y yerbabuena (Montes y Carvajal, 1999 citado por
Montes et al., 2000), microorganismos como levaduras y bacterias (Riviera-Méndez et
al., 2016) o de origen marino como extractos proteicos de macroalgas como Hypnea
musciformis contra Colletotrichum lindemunthianum (Melo et al., 1997), metabolitos
secundarios como terpenos de Stypopodium zonale, Laurencia dendroidea, Pelvetia
canaliculata, Sargassum muticum, Ascophyllum nodosum y Fucus spiralis que afectan
al hongo fitopatógeno Colletotrichum lagenarium que provoca antracnosis en las
cucurbitáceas (Peres et al., 2012).
Diversos extractos de macroalgas han mostrado actividad inhibitoria contra Botrytis
cinerea (Selim et al., 2015; Jiménez et al., 2011), Verticillium spp, Rhizoctonia solani
(Barreto et al., 1997), Fusarium solani, F. oxysporum, Sclerotinia sclerotiorum (Kulik,
1995), Alternaria solani (Chanthini et al., 2012), Cladosporium cladosporioides, C.
sphaerospermum, (De Felício et al., 2010), Pestalotiopsis theae y Hypoxylon serepens
(Samanta, 2011).
Introducción
2
Se ha reportado actividad antifúngica en especies de macroalgas verdes como
Codium iyengarii contra Fusarium solani (Sultana et al., 2005) y en extractos orgánicos
de Ulva lactuca, Caulerpa sertularioides, Padina gymnospora y Sargassum liebmanni
contra Alternaria solani (Hernández et al., 2014). Por tal motivo las macroalgas
marinas son una fuente de compuestos con actividad antifúngica y su uso en la
agricultura es una alternativa a los fungicidas sintéticos.
Las macroalgas marinas de arribazones en la costa yucateca son recursos
abundantes y de fácil acceso, por lo cual son una fuente potencial de compuestos para
la investigación y desarrollo de productos biotecnológicos que permitan disminuir el
uso de plaguicidas sintéticos en la región. El presente estudio se enfoca en la
evaluación del potencial de actividad antifúngica de extractos de macroalgas marinas
de arribazones de la zona costera de Yucatán contra hongos fitopatógenos de cultivos
de importancia comercial.
Capítulo I
3
CAPÍTULO I
1.- ANTECEDENTES
1.1. La importancia de la agricultura en México
La agricultura se originó independientemente en al menos seis regiones tropicales y
subtropicales del planeta, entre los años 11,000 y 5,000 a.C. (Smith, 1998 citado por
Smith, 2005). Entre las cuales se encuentra Mesoamérica (actualmente Guatemala,
Belice, Honduras, El Salvador, Costa Rica, Nicaragua y el centro-sur de México).
Los valles de Tehuacán en Puebla y la cuenca del Balsas, en el centro de México se
consideran como lugares que dieron origen a la domesticación y cultivo de especies
vegetales como el maíz (Zea mays), frijol (Phaseolus vulgaris), chiles (Capsicum spp)
y tomates (Solanum lycopersicum) (Zizumbo-Villarreal, 2010). La agricultura se
convirtió en un componente fundamental para el sustento y desarrollo de las urbes
prehispánicas (De Tapia, 2000).
La agricultura en la época colonial se enfocó a satisfacer las necesidades de la
población minera, durante los siglos XVII y XVIII se convirtió en la principal actividad
económica, cultivándose especies como el tabaco, cacao, algodón y maíz (Domínguez
y Carrillo, 2010). En dicho período los españoles introdujeron nuevos cultivos como
arroz, lentejas, manzanas, melocotones y peras (Vargas, 2012 citado por Román et
al., 2013).
En México, aproximadamente 5.5 millones de personas se encuentran ocupadas en
actividades agrícolas, de las cuales el 56% son agricultores y el 44% son jornaleros o
peones, siendo los estados de Chiapas, Guerrero, Michoacán, Oaxaca, Puebla y
Veracruz los que tienen mayor población dedicada a las actividades agrícolas (INEGI,
2016). En México, la diversidad de cultivos ha posicionado al país en el doceavo lugar
en el mundo y el tercero en Latinoamérica, en cuanto a producción agroalimentaria
(SAGARPA, 2016).
Capítulo I
4
1.1.1. Principales productos agrícolas
En México se cultivan 22,148,245 hectáreas, con una producción aproximada de 250.1
millones de toneladas de productos agrícolas. México es el primer productor a nivel
mundial de aguacate (Persea americana) con cerca de 1,644,225.86 ton siendo
Michoacán el principal estado productor con cerca de 1,283,313.29 ton. México ocupa
también el segundo puesto a nivel mundial en cultivo de chile verde (Capsicum
annuum) con 2,782,340 ton, con Sinaloa a la cabeza de producción con 601,736 ton y
limón (Citrus × limón) con 2,326,068 ton siendo Veracruz productor de 42,885 ton. Con
respecto al maíz, base de la alimentación, México ocupa el séptimo lugar a nivel
mundial en producción con 24,694,046.25 toneladas (SIAP, 2017). En la Figura 1.1 se
indican las hectáreas (ha) sembradas y cosechadas por estado. En la Figura 1.2 se
observa la producción en toneladas de los principales productos agrícolas.
Figura 1.1. Promedio anual de superficie sembrada y cosechada en México en el
año 2015. Los estados de Chiapas, Jalisco, Michoacán, Tamaulipas, Oaxaca y
Veracruz encabezan la lista de mayor superficie sembrada y cosechada (SIAP,
2017).
Capítulo I
5
Figura 1.2. Producción agrícola en México en el año 2015 (SIAP, 2017).
1.1.2. Derrama económica de la agricultura
Las actividades agrícolas contribuyen con aproximadamente el 4% del producto
interno bruto (PIB) del país con un valor de 451,766 millones de pesos (INEGI, 2016).
El valor de las exportaciones agroalimentarias mexicanas alcanza 10,217 millones de
dólares, siendo Estados Unidos y Japón los principales mercados consumidores
(SAGARPA, 2015). El maíz representa una derrama económica de cerca de
$84,523,647, seguido por la caña de azúcar con $26,673,949 y el chile verde con
$22,585,487. En la Figura 1.3 se observan los principales productos agrícolas
producidos en México y el valor de la producción en pesos.
Figura 1.3. Principales productos agrícolas mexicanos y su valor económico en el
año 2015 (SIAP, 2017).
Capítulo I
6
1.2. Riesgos que afectan a la agricultura en México
En México existe el Programa de Agricultura Sostenible y Reconversión Productiva en
Zonas de Siniestralidad Recurrente (PIASRE) dedicado a fomentar, con un carácter
preventivo y en función de las condiciones agroecológicas, el desarrollo sustentable en
regiones y zonas frecuentemente afectadas por fenómenos adversos que inciden en
una disminución de la productividad. Este menciona que existen fenómenos
ambientales (abióticos) que afectan a la agricultura como son: las sequías, huracanes,
tormentas, granizadas y heladas, otros riesgos (bióticos) son los virus, bacterias,
insectos y hongos que pueden provocar pérdidas económicas muy importantes.
1.2.1. Riesgos abióticos y costos económicos
Las sequías son períodos de carencia de lluvias que abarcan zonas geográficas
extensas y pueden prevalecer por varios años (Wilhite y Vanyarkho, 2000). En el 2011
en Guanajuato y Puebla, estos fenómenos afectaron la producción de frijol (28.81%),
maíz (14.37%), trigo (9.5%), tomate verde (26.25%), papa (16.59%), chile verde
(14.47%) y tomate rojo (12.25%) (ASERCA, 2011). En el caso del frijol, se reportaron
pérdidas aproximadas de $281,998,400.
Los huracanes y tormentas se caracterizan por fuertes vientos y abundante
precipitación. El huracán “Ingrid” y la tormenta tropical “Manuel” en 2013 provocaron
daños en 534,000 ha con un valor aproximado de $75,000 millones de pesos,
afectando 215,000 ha, sólo en el estado de Guerrero (SAGARPA, 2013).
Las heladas son el descenso de temperatura a 0 °C ó menos durante un período de
tiempo mayor a 8 h. En el año 2011 en el estado de Sinaloa, provocaron daños en
436,216 ha de maíz, 29,789 ha de frijol y 38,207 ha de garbanzo con un valor
económico de cerca de $40,000 millones de pesos (SIAP, 2017).
La carencia de planes de manejo en la utilización de los recursos naturales y suelos
agrícolas es un factor de vulnerabilidad ante estos fenómenos (SAGARPA, 2012).
1.2.2. Riesgos bióticos y costos económicos
De la gran cantidad de factores bióticos que afectan a los cultivos se mencionan a
continuación algunos ejemplos:
a) El virus del enanismo amarillo de la cebolla (OYDV) y el virus del puerro de veta
Capítulo I
7
amarilla (LYSV) se han detectado mediante la técnica de ELISA en ajo (Allium
sativum), pueden causar disminuciones de la calidad del cultivo (Pérez, 2013;
Pérez-Moreno et al., 2008).
b) La mosca blanca (Bemisia sp) en tomates ha provocado pérdidas de 125 millones
de dólares (Norman et al., 1997 citado por Cano-Rios, et al., 2001).
c) La bacteria Candidatus liberibacter causante de la enfermedad del dragón amarillo
(huanglongbing, HLB) ha provocado daños de $ 6,965 millones en la citricultura
mexicana (Salcedo et al., 2011).
d) Especies de hongos fitopatógenos del género Fusarium ocasionan en cultivos de
fresas, pérdidas superiores al 50% (Castro y Dávalos, 1990 citado por Dávalos et
al., 2011), así como del género Colletotrichum que produce la enfermedad llamada
antracnosis que tiene una incidencia de hasta el 100% en mangos (Arauz et al.,
1994 citado por Arauz, 2000).
1.3. Hongos
Los hongos son organismos eucariontes, heterótrofos, uni o pluricelulares, productores
de esporas y tienen paredes celulares de quitina, de los cuales se han descrito
712,000 especies (Schmit y Muller, 2007). Algunos grupos son: basidiomycota,
zygomycota, chytridiomycota, glomeromycota y ascomycotas.
Se han reportado aproximadamente 23,000 especies fitopatógenas que provocan
afectaciones en raíces, flores, hojas o el sistema vascular (Persley et al., 2010). Los
hongos fitopatógenos se encuentran ampliamente distribuidos en los ecosistemas, e.g.
cuerpos de agua, suelo, aire y zonas desérticas (Gastón, 2007).
Algunos géneros de hongos fitopatógenos son: Diplodia, Alternaria, Mycosphaerella,
Botrytis, Monilinia, Penicillium, Colletotrichum, Phomopsis, Fusarium, Rhizoctonia,
Rhizopus, Gibberella y Mucor (Rivera, 2008). Los hongos producen enfermedades
como el tizón temprano causado por Alternaria solani, pudrición de la raíz por
Fusarium oxysporum, pudrición del tallo por Gibberella moniliformis, antracnosis por
Colletotrichum spp y Sigatoka negra por Pseudocercospora fijiensis. Debido a su
diversidad, la dificultad de control y a los daños económicos y biológicos que
Capítulo I
8
producen, los hongos se consideran entre los microorganismos fitopatógenos más
importantes (Agrios, 2005).
1. 4. Pseudocercospora fijiensis Morelet
Pseudocercospora fijiensis es un hongo ascomiceto perteneciente al orden
Dothideales, familia Dothideaceae que ataca el plátano (Musa sp) provoca la
enfermedad llamada Sigatoka negra caracterizada por la aparición de necrosis,
reducción del área foliar y disminución del rendimiento de la fruta (Stover, 1980). La
Sigatoka negra es la enfermedad foliar más importante de los cultivos de banano en el
mundo (Noar y Daub, 2016), su elevado éxito en la colonización se debe a su alta
frecuencia de reproducción sexual-asexual y a su exitosa producción por esporas
sexuales (ascosporas) (Mouliom Pefoura et al., 1996 citado por Romero, 2003) y
esporas asexuales (conidios) (Sánchez et al., 2001).
1.4.1. Ciclo de vida
El ciclo de vida de P. fijiensis inicia sobre las hojas de banano, a temperatura de 26-
28 °C y humedad de 90 a 100%. Las esporas se dispersan a través del viento, lluvia o
rocío (Marín et al., 2003), una vez en su hospedero germinan y sus tubos germinativos
penetran a través de los estomas, posteriormente se desarrollan en el espacio
intercelular de las hojas (Churchill, 2011, Merchán, 2000,). El hongo establece una
relación biotrófica al penetrar los estomas durante 3 a 4 semanas (Hoss et al., 2000),
hasta que el hospedero presenta los primeros síntomas necróticos de la enfermedad,
las ascosporas se desprenden en los estadios 5 y 6 de la enfermedad, mientras tanto
los conidios se desprenden en los estadios 2 al 6 y son transportados por el viento o el
agua hasta hojas sanas y el ciclo se repite (Gauhl et al., 2000 citado por Churchill,
2011). En la Figura 1.4 se observan las principales etapas del ciclo de vida de P.
fijiensis.
Capítulo I
9
Figura 1.4. Ciclo de vida de P. fijiensis en plantas de banano (Manzo-Sánchez et
al., 2005).
1.4.2. Patogenia
La enfermedad Sigatoka negra se manifiesta solamente en las hojas de banano,
afecta la actividad fotosintética, crecimiento y productividad de la planta. Los signos de
la enfermedad inician con manchas cloróticas pequeñas que se convierten en rayas
marrones hasta formar manchas negras necróticas (Bennett y Arneson, 2003). Los
signos de la enfermedad se desarrollan en seis estados (Fouré, 1997). En el primero
se observan pequeñas decoloraciones de color café rojizo en el envés de la hoja (< 1
mm de longitud). En el segundo se observa un crecimiento en las decoloraciones en
sentido longitudinal (2 a 3 mm). En el tercero las decoloraciones crecen tornándose
oscuras (2 a 3 cm). En el cuarto se forman manchas elípticas de color café y negro. En
el quinto, la mancha elíptica es completamente negra, rodeada por un halo amarillo y
en el sexto, la mancha presenta un halo amarillo con un hundimiento en su zona
central desarrollándose hasta provocar la muerte de las hojas. En la Figura 1.5 se
observan los seis estados de la enfermedad.
Capítulo I
10
Figura 1.5. Estadios de la Sigatoka negra en hojas de banano.1), pizca; 2) y 3), estrias;
4), 5) y 6), manchas (Fouré, 1997).
1.4.3. Control
El hongo P. fijiensis se controla principalmente con fungicidas sintéticos como benomyl
y carbendazim, también se realizan prácticas agrícolas como el deshoje, dehije,
densidad de plantación, drenaje, control de malezas y fertilización (Orozco-Santos,
1998 citado por Hidalgo et al., 2016). Debido a la aparición de cepas resistentes, el
control se ha vuelto más complejo y costoso (Patiño et al., 2007). Se reportan métodos
alternativos para controlar a la enfermedad, como son: biocontrol mediante bacterias,
control cultural mediante poda temprana de hojas y nutrición mineral balanceada
(Guzmán, 2012).
1.4.4. Daños económicos
El control químico de la Sigatoka negra en México se realiza mediante tres tipos de
programas: el intensivo, semi-intensivo y rústico. El programa intensivo conlleva
aplicaciones de fungicidas como el mancozeb de 35 veces por año, el semi- intensivo
de 15 veces por año y el rústico no utiliza fungicidas (Orozco-Santos et al., 2001 citado
por Aguilar-Barragán et al., 2014). En plantaciones sin control químico P. fijiensis
puede ocasionar pérdidas en la producción de hasta el 100% (David et al., 2011).
Capítulo I
11
1.5. Fusarium oxysporum Schlechtendal
Fusarium oxysporum es un hongo ascomiceto perteneciente al orden Hypocreales
familia Nectriaceae (Snyder y Hansen, 1940). F. oxysporum comprende una amplia
variedad de formas especiales patogénicas y no patogénicas que tienen una
distribución cosmopolita (agua, tierra y aíre). Las formas especiales fitopatogénicas
pueden atacar a una amplia variedad de cultivos provocando marchitamiento vascular,
de raíces y la muerte de la planta. F. oxysporum produce tres tipos de esporas
asexuales macronidias, micronidias y clamidosporas.
1.5.1. Ciclo de vida
Los ciclos de vida son similares en las diversas formas especiales de F. oxysporum. El
hongo se desarrolla en temperaturas de 25 - 28 °C, a pH de 7.5 a 8.5 y en oscuridad
continua (De Granada et al., 2001). Las clamidosporas del hongo se pueden encontrar
en desechos de bananos, estas germinan al estar en contacto con la planta hospedera
para posteriormente penetrar por las raíces terciarias hasta alcanzar el rizoma y
pseudotallo, invadiendo el xilema (Batlle y Pérez, 2009). Al entrar al xilema el hongo se
reproduce hasta tapar los haces vasculares evitando el movimiento de agua y
nutrientes, posteriormente el hongo crece fuera del sistema vascular y sus tres tipos
de esporas son expulsadas al ambiente y pueden permanecer en el suelo y en tejido
muerto (en dormancia) hasta germinar e infectar una nueva planta y repetir el ciclo
(Davis, 2005 citado por Urías, 2015). En la Figura 1.6 se describe el ciclo de vida de F.
oxysporum.
Capítulo I
12
Figura 1.6. Ciclo de vida de F. oxysporum (Grimaldo, 2016).
https://es.slideshare.net/GrimaldoPecerosMatute/hongos-de-importancia-agricola.
Publicado Julio 2016.
1.5.2. Patogenia
Formas especiales como F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici provocan la
enfermedad llamada “fusariosis” o marchitamiento vascular. F. oxysporum f. sp.
cubense provoca la enfermedad llamada “mal de Panamá” en bananos (Batlle y Pérez,
2009). Sus signos son un amarillamiento en las hojas basales hasta la marchitez y una
necrosis vascular del tallo y las raíces (Apodaca-Sánchez et al., 2002). Estos últimos
son ocasionados por la obstrucción de los haces vasculares debido al crecimiento
micelial (Abawi y Pastor-Corrales, 1990 citado por Martinez, et al., 2004). F.
oxysporum también provoca enanismo y la disminución de brotes. El rasgo
representativo de la enfermedad es la presencia de un color blanquecino, amarillento
marrón y descomposición en los tejidos sin afectar la médula de la planta (Baker, 1980
citado por De Granada, 2001).
1.5.3. Control
Se basa en la aplicación preventiva de fungicidas sintéticos, en el uso de suelos libres
del patógeno, en la rotación de cultivo, en la quema de plantas infectadas, en el uso de
cultivares resistentes al hongo y en la solarización (Ancurio, 2010). El control mediante
Capítulo I
13
fungicidas consiste en el uso de benomyl, captan, bromuconazol, procloraz,
thiabendazol, carbendazim y metiltiofanato (Amini y Sidovich, 2010).
1.5.4. Daños económicos
Este patógeno provoca pérdidas superiores al 50% en cultivos de tomate (Ramiréz,
1989 citado por Apodaca-Sánchez et al., 2004). F. oxysporum f. sp. cubense ha
provocado pérdidas en banano de hasta 75 millones de dólares (Perez- Vicente et al.,
2004 citado por OIRSA, 2009). En México se han reportado daños en 40,000 ha de
banano (Orozco et al., 2009 citado por Lara-Fiallos, 2009).
1.6. Colletotrichum gloeosporioides (Penz) Penz. y Sacc.
Es un hongo ascomiceto del orden Glomerellales de la familia Glomerellaceae, de
distribución cosmopolita predominante en regiones tropicales (Paul et al., 1997 citado
por Ali et al., 2010). Produce la enfermedad llamada antracnosis en papaya y otros
cultivos tropicales y subtropicales (Santamaría 2011). Colletotrichum gloeosporioides
se reproduce mediante conidios cilíndricos con extremos redondeados.
1.6.1. Ciclo de vida
Colletotrichum gloeosporioides presenta dos fases una sexual y otra asexual (Abang et
al., 2003). El ciclo inicia cuando los conidios llegan a la superficie de una planta
hospedera, posteriormente desarrollan el apresorio que es un estructura plana que
permite la adhesión y posterior entrada. Los conidios germinan y forman el tubo
germinal que penetra la cutícula colonizando la pared celular (Gomes et al., 2011), el
hongo puede penetrar tanto por lo estomas como por heridas, desarrollándose en
cualquier tejido de la planta. Es un hongo hemibiotrófico que infecta de dos formas a
su hospedero, de manera biotrófica intracelular (asintomática inicial) y necrotrófica
subcuticular (destructiva, disolviendo la matriz péptica de las células) (Agrios, 2002).
En condiciones favorables el hongo se desarrolla de manera rápida en la planta, no
obstante en condiciones adversas puede permanecer en forma quiescente y en
latencia sobre tejido muerto. El ciclo se completa al diseminarse los conidios mediante
la lluvia, riego o foresis (transportado por otros organismo) (Agrios, 2005). C.
gloeosporioides es considerado como hemibiótrofo (Barhoom y Sharon, 2007). En la
Figura 1.7 se describe el ciclo de vida de C. gloeosporioides.
Capítulo I
14
Figura 1.7. Ciclo de vida de Colletrotrichum gloeosporioides y Giberella cingulata
(Agrios, 2002).
1.6.2. Patogenia
Colletorichum gloeosporioides provoca una mancha hundida y pequeña de color
negro, ocasionando la pudrición del fruto (Agrios, 2005). En el aguacate produce
manchas redondas transparentes que evolucionan a un color café oscuro, este signo
cuando aparece en frutos en desarrollo se denomina como “viruela”, también producen
lesiones irregulares y hundidas de color negro, cuando aparecen en frutos maduros se
denomina como “clavo” (Campos A., J. 1987 citado por Zamora et al., 2001). El hongo
presenta esporulación de color rosado y en las hojas el hongo produce manchas color
café con halos cloróticos, en las flores se observan manchas oscuras y en los tallos
manchas circulares purpúreas y necrosadas (Morales y Ángel, 2007 citado por
Rodríguez-López et al., 2009).
1.6.3. Control
Para el control de C. gloeosporioides se usan fungicidas sintéticos como benomyl,
maneb, captafol (Agrios, 2005), siembra de cultivares resistentes y buenas prácticas
de cultivo. En la etapa de postcosecha se han usado métodos como la aplicación de
ácido salicílico en el mango (Zainuri et al., 2001), quitosano en papaya (Hernández et
al., 2001), aire caliente (Coates et al., 1993) y luz ultravioleta (Stevens et al., 1997).
Capítulo I
15
1.6.4. Daños económicos
La antracnosis inducida por C. gloesporiodes causa daños económicos considerables
debido a la pérdida de sabor, rápida madurez y disminución en la calidad de la fruta
(Tian et al., 2010), por ejemplo en mango puede ocasionar pérdidas de hasta el 100%
en la fase de comercialización (Michereff, 2013).
1.7. Los fungicidas sintéticos
Los fungicidas controlan muchas enfermedades de los cultivos y permiten mantener
los rendimientos y el tiempo de vida de las plantas. Los fungicidas son compuestos en
su mayoría de naturaleza sintética (Brent y Hollomon, 1998), en el Cuadro 1.1.se
mencionan algunos ejemplos.
Cuadro 1.1. Fungicidas sintéticos, nombres comunes, grupo químico al que pertenecen y
mecanismo de acción.
Nombre común Grupo químico Mecanismo de acción
Captan, folpet Ftalimida Multi-sitio
Mancozeb, maneb Ditiocarbamatos Multi-sitio
Metil-tiofanato Tiofanatos Afecta la división celular
benalaxil, metalaxil Acilalaninas Afecta la síntesis de ácidos
nucleicos
Azoxistrobin Metoxiacrylatos Inhibe la respiración celular
Iprodiona Dicarboximidas Afecta la síntesis de lípidos y
membranas
Los fungicidas actúan inhibiendo el metabolismo energético, pueden alterar la
membrana celular de los hongo, bloquear la biosíntesis de sustancias importantes, la
división celular y algunos presentan modos de acción múltiples (Melgarejo y Portilla,
2011). Pueden tener efectos en la pared celular, citoplasma, mitocondrias, ribosomas
o el núcleo de los hongos. Los fungicidas se clasifican en dos categorías: sistémicos y
de contacto.
Capítulo I
16
1.7.1. Fungicidas de contacto y sistémicos
Los fungicidas de contacto tienen una función preventiva, matan al hongo antes de
que el micelio se desarrolle e invada los tejidos de la planta (Yuste y Gostincar, 1999
citado por García et al., 2003), estos se aplican sobre la superficie y no entran a los
tejidos, son propensos a ser lavados por la lluvia o riego por lo cual tienen un efecto de
corta duración (Pérez y Forbes, 2014). Fungicidas de este tipo son el oxicloruro de
cobre, mancozeb, maneb.
Los fungicidas sistémicos tienen un función curativa, matan al hongo aún cuando el
micelio se ha desarrollado e invadido los tejidos de la planta (Yuste y Gostincar, 1999
por García et al., 2003), se absorben a través de las hojas o raíces y se movilizan a
todos los tejidos de la planta permitiendo una efecto de larga duración (Pérez y
Forbes, 2014). Fungicidas de este tipo son el benalaxyl, metalaxyl, fosetyl-al. En la
Figura 1.8 se observa el modo de acción de los fungicidas de contacto y sistémicos.
Figura 1.8. Modo de acción de los fungicidas en las plantas: a) de contacto y b)
sistémicos (Pérez y Forbes, 2014).
1.7.2. Afectaciones causadas por la aplicación de fungicidas
En México la Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios
(COFEPRIS), en su “Catálogo de plaguicidas 2016” reporta 611 formulaciones de
origen sintético y natural. Algunos fungicidas se encuentran prohibidos en Europa y
Estados Unidos debido a los daños que provocan, pero están permitidos en México,
como por ejemplo: captofol, dicloran, quintozeno, maneb, mancozeb tridemorf, captan,
a) b)
Capítulo I
17
mientras que otros se encuentran prohibidos como la aldrina y el nitrofenol (Instituto
Nacional de Ecología INE, 2016).
La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y Agricultura (FAO por
sus siglas en inglés) menciona que en México se usaron 42,223 ton de fungicidas
(FAOSTAT, 2016), aunque estos datos pueden estar subestimados, ya que se
desconocen los datos reales de producción y comercialización de las empresas. El uso
excesivo de los fungicidas, provoca graves problemas metabólicos, inducción de
resistencia en cepas patogénicas (Brent y Hollomon, 1995), biomagnificación y
bioconcentración en las especies (Reyes, 2011 citado por García y Rodríguez, 2012).
La aparición de la resistencia depende del grupo químico del fungicida aplicado, su
frecuencia y dosis, de la biología del patógeno y de las prácticas agrícolas (Brent y
Hollomon, 1995). La resistencia es un factor limitante en el control de enfermedades y
causa pérdidas económicas a productores y al público (Hollomon, 2015).
Las estrategias de manejo de cepas resistentes son: la rotación de fungicidas,
combinación de fungicidas, limitar la cantidad y los tiempos de los tratamientos,
respetar las recomendaciones del proveedor y la combinación con métodos no
químicos (Brent y Hollomon, 1995).
Se han reportado efectos negativos en la salud humana, como por ejemplo, el
aumento en la probabilidad de contraer la enfermedad de Parkinson en hasta un 75%,
después de exposiciones prolongadas al fungicida (Costello et al., 2009) y dermatitis
aguda en humanos causada por el captan (Vilaplana y Romaguera, 1993). El impacto
de estos fungicidas es de gran transcendencia social, biológica y económica, por lo
que es necesario la búsqueda y desarrollo de productos alternativos de baja toxicidad
y efectivos, para disminuir o sustituir el uso de estos fungicidas.
1.7.3. Alternativas a los fungicidas sintéticos
Se han reportado compuestos como el timol, linalol, eugenol, mentol, 2
metilcinamaldehído y cafeína obtenidos de plantas como tomillo, albahaca, canela,
clavo y yerbabuena que han tenido actividad antifúngica contra fitopatógenos de los
géneros Alternaria, Aspergillus, Cercospora, Colletotrichum, Fusarium, Oidium,
Penicillium y Stemphylium (Hernández et al., 1996 citado por Montes et al., 2000).
Como biocontrol se han utilizado bacterias (Bacillus subtilis) y levaduras (Rhodotorula
minuta) contra C. gloeosporioides que afecta cultivos de mango (Fasio et al., 2005) ó
Capítulo I
18
de Trichoderma contra F. oxysporum f. sp. ciceri que produce la marchitez del
garbanzo (Ibarra et al., 2006). Existen en el mercado productos alternativos
(bioplaguicidas) para el control de microorganismos patógenos (Cuadro 1.2).
Cuadro 1.2. Bioplaguicidas en el mercado.
Nombre
comercial
Tipo de
plaguicida
Compuesto Fuente
Bacter F®
Bactericida,
fungicida
Aceites esenciales de orégano
mexicano y extracto de ricino
Bionutra,
2016
Bio Gober ®
Fungicida,
insecticida
Planta gobernadora (Larrea
tridentata) y aceite de ricino (Ricinus
communis)
Idem
Natucontrol® Fungicida Esporas de Trichoderma harzianum
Biokrone
2015
Baktillis® Fungicida Subtilina y Bacitricina Idem
FungifreeAB
® Fungicida Bacteria Bacillus subtilis sp 83
Agro&Biotecn
ia, 2016
Otras de las alternativas a los fungicidas sintéticos son los productos de origen marino
como Biorend Cobre®, elaborado a partir de quitina extraída de centollas (Lithodes
santolla) y sulfato de cobre pentahidratado (Bioagro, 2011) y Alguicidium® elaborado a
partir de algas marinas (Corporación Selva de Oro, 2016) aunque las fichas técnicas
de dichos productos no especifican contra que hongos fitopatógenos son activos. Las
algas marinas pueden ser una alternativa para el control de fitopatógenos al producir
compuestos con actividad antiviral, antifúngica y antibacterial.
1.8. Las macroalgas marinas
Las macroalgas marinas son organismos multicelulares fotosintéticos, simples,
carentes de estructuras como flores, sistema vascular y raíces. Estos organismos son
importantes para la vida marina ya que proveen alimento, protección y son formadores
de sustrato (Mateo et al., 2013). Se clasifican en tres grupos basados en su
pigmentación: algas ocres (phylum Ochrophyta), algas rojas (phylum Rhodophyta) y
algas verdes (phylum Chlorophyta) (Silberfeld et al., 2014; Guiry, 2012). En la Figura
1.9 se muestran especies representativas de las divisiones de macroalgas marinas.
Capítulo I
19
Figura 1.9. Divisiones de las algas marinas: a) Rhodophyta, b) Ochrophyta, c)
Chlorophyta.
1.8.1. Distribución
Las macroalgas abarcan cerca del 2% del suelo marino (vida bentónica), se
distribuyen dependiendo de la temperatura y luz. Presentan una mayor diversidad en
aguas tropicales y zonas someras (Karleskint et al., 2010). Estudios biogeográficos
indican que las regiones con mayor diversidad algal son las costas de Japón, sur de
Australia y Europa occidental, y las de menor densidad las regiones polares, el sur del
Pacífico y occidente de África (Santelices y Marquet, 1998 citado por Kerswell, 2006).
Como explicación a la diversidad de algas, se propone una correlacion positiva directa
entre las variables ambientales (luz y nutrientes) y el número de taxones encontrados
(Kerswell, 2006). En la Figura 1.10 se observa la riqueza de géneros de macroalgas
marinas en el mundo.
Figura 1.10. Mapa de distribución de macroalgas marinas en el mundo (Kerswell,
2006).
a) b) c)
Capítulo I
20
1.8.2. Aprovechamiento de macroalgas marinas
Las macroalgas marinas son utilizadas para la elaboración de alimento para aves,
composta, abonos foliares, extracción de ficocoloides, alimentación humana,
producción de fármacos y cosméticos (revisado por Barsanti y Gualtieri, 2006). Desde
la antiguedad diversas especies de macroalgas marinas han sido utilizadas como
fertilizantes en países como Japón, China, Reino Unido, Islandia, Francia, Finlandia,
Dinamarca y Chile (Meier 1942), debido a su riqueza en macro y microelementos,
entre las principales macroalgas aprovechadas para este fin se encuentran
Ascophyllum nodosum, Ecklonia maxima, Fucus vesiculosus, Laminaria sp y
Sargassum sp.
Desde hace aproximadamente tres décadas las macroalgas marinas han sido
utilizadas en la cosmética principalmente en Francia debido a sus propiedades
gelificantes o espesantes, como protectores solares, cicatrizantes, antiinflamatorios de
la piel, agentes revitalizadores de la piel, lociones suavizantes y nutritivas, tonificantes,
antiedad y antioxidantes, los principales géneros usados para este fin son Fucus,
Laminaria y Ascophyllum.
Como alimento las macroalgas marinas han sido utilizadas ampliamente en Japón y
China, debido a sus cualidades nutritivas, su riqueza en minerales, vitaminas,
proteínas, antioxidantes y fibras, los principales géneros aprovechados para este fin
son Laminaria, Undaria, Porphyra, Eucheuma/Kappaphycus y Gracilaria.
(Bourgougnon et al., 2011).
Otros usos de las macroalgas marinas son para obtener sustancias ficocoloides como
carrageninas, alginatos y agares usados en la medicina, alimentación y ciencia, siendo
los principales productores Estados Unidos, Chile, España, Filipinas y Francia, los
géneros aprovechados son Macrocystis, Eucheuma, Ascophyllum, Gelidium, Hypnea,
Chondrus, Gigartina y Kappaphycus (Mchugh, 2002).
Capítulo I
21
1.8.3. Metabolitos de algas marinas
En la base de datos MarinLit de la Real Sociedad de Química se han reportado más
de 24,000 compuestos extraídos de especies marinas de los cuales 3,200 (13%)
corresponden a compuestos extraídos de especies de macroalgas marinas. El phylum
Rhodophyta cuenta con más del 7% de compuestos aislados (revisado por Blunt y
Munro, 2013) del cual la familia Rhodomelaceae representa el 57% (Maschek y Baker
2009). Se han reportado del phylum Ochrophyta 1,200 compuestos, siendo el género
Dictyota el mejor representado y del phylum Chlorophyta solamente 270 compuestos
(Blunt et al., 2013). Los isoprenos (terpenoides, carotenoides y esteroides) seguido por
los shikimatos y policétidos, son los principales compuestos aislados de las
macroalgas marinas (Leal et al., 2013).
Se han reportado metabolitos con actividades biológicas como por ejemplo:
polisácaridos sulfatados de Ulva pertusa, Laminaria japonica, Enteromorpha linza y
Bryopsis plumose con propiedades antioxidantes (Zhang et al., 2010),
metoxibifurcarenona de Cystoseira tamariscifolia con propiedades antibacteriales
(revisado por Faulkner, 2002) y florotaninos de algas cafés con propiedades
antifúngicas (revisado por Lopes et al., 2015). Estos organismos poseen un potencial
biotecnológico para su uso en el combate de fitopatógenos en la agricultura orgánica
(libre de pesticidas sintéticos) (Ambika y Sujatha, 2015).
1.8.4. Actividad antifúngica de macroalgas marinas
Extractos etanólicos de la especie Hypnea musciformis han presentado actividad
contra patogénos como Trichophytum rubrum (pie de atleta), T. tonsurans (tiña de la
cabeza), T. mentagrophytes (tiña), Microsporum canis (tiña capites), M. gypseum
(lesiones en anillo) y la levadura Candida albicans (Guedes et al., 2012). El florotatino
dieckol extraído de Ecklonia cava muestra una actividad fungicida contra el hongo T.
rubrum (Lee et al., 2010).
1.8.5. Estudios de macroalgas marinas contra fitopatógenos
Se ha reportado que material seco molido de Codium iyengarii presentó actividad
antifúngica a un porcentaje de 0.5% (p/p) contra Fusarium solani que infecta raíces de
la okra (Sultana et al., 2005).
Estudios que evalúan extractos de macroalgas marinas contra hongos fitopatógenos
se describen en el Cuadro 1.3.
Capítulo I
22
Cuadro 1.3. Estudios sobre actividad antifúngica de macroalgas marinas.
Especie Tipo de extracto o compuestos
aislados Fitopatógeno Referencia
Dictyopteris zonarioides Zonarol e isozonarol Rhizoctonia solani y Sclerotinia sclerotiorum Fenical et al. (1973)
Algas marinas Extractos orgánicos Botrytis cinerea y Erysiphe polygoni Kulik (1995)
Hypnea musciformis Extracto proteico Colletotrichum lindemunthianum Melo et al. (1997)
Stypopodium zonale, Laurencia
dendroidea, Pelvetia canaliculata,
Fucus spiralis
Neofitadieno, cartilagineol, obtusol,
elatol; etil hexadecanoato, 1,1-bis(4-
hidroxifienil) etano , isooctil ftalato,
ácido ftalico y bis (2-etilhexil) adipato
Colletotrichum lagenarium y Aspergillus
flavus Peres et al. (2012)
Ulva lactuca, Caulerpa sertularioides,
Padina gymnospora y Sargassum
liebmanni
Extractos orgánicos Alternaria solani Hernández et al.
(2014)
S. myricocystum y Gracillaria edulis Extractos acuosos y etanólicos Colletotrichum falcatum Ambika y Sujatha
(2015)
S. polycystum y S. terranimun Extractos acuosos, etanólicos,
metanólicos y cloroformo
Aspergillus niger, Rhizoctonia solani, Mucor
racemosus, Rhizopus stolonifer
Kausalya y Narasimba
(2015)
S. vulgare, Cystoseira barbata, D.
membranácea, Dictyota dichotoma y
Colpomenia sinuosa
Extractos ciclohexánicos
Alternaria alternata, Cladosporium
cladosporioides, F. oxysporum, Epicoccum
nigrum, A. niger, A. ochraceus, A. flavus y
Penicillium citrinum
El Shafay et al. (2016)
Capítulo I
23
1.8.6. Macroalgas marinas en Yucatán y su potencial aprovechamiento
En México se han reportado aproximadamente 2,745 especies de macroalgas
(Pedroche y Sentíes, 2003), de la cuales 500 especies se encuentran distribuidas en la
península de Yucatán e incluyen los estados de Campeche y Quintana Roo (Huerta-
Múzquiz y Espinosa, 2000) y en la costa del estado de Yucatán en Sisal y Dzilam de
Bravo se han identificado un total de 64 especies (Ortegón y Aguilar, 2014), en la zona
entre Uaymitún y Chuburná se han reportado 46 especies, siendo la familia
Rhodomelaceae la mejor representada. Las características físicas de la plataforma
yucateca como su amplia extensión de hasta 160 km, poca profundidad, altos niveles
de radiación solar y un sustrato idonéo para la fijación y crecimiento de macroalgas
marinas han propiciado que la península yucateca sea una zona geográfica rica en
estas especies (Robledo-Ramírez, 1996).
Diversos estudios han reportado una biomasa colectable de hasta el 3.2 Kg/m2 de
algas rojas (Robledo y Freile, 1998), lo cual permite su posible uso para extracción de
ficocoloides, agares y carragenatos. Existen reportes sobre la viabilidad en Yucatán
para soportar el desarrollo de cultivos de algas como Kappaphycus alvarezi (Muñoz et
al., 2004). También se ha evaluado la composición química y de minerales de
especies como Gracilaria cornea, Eucheuma isiforme, Caulerpa racemosa, Codium
isthmocladum, Padina gymnospora y Sargassum filipendula para su potencial
consumo humano o alternativas como alimento animal e incluso fertilizantes (Robledo
y Pelegrín, 1997).
En cuanto al aprovechamiento y comercialización de productos elaborados con
macroalgas marinas el estado de Yucatán, un claro ejemplo es el de mujeres de la
comunidad de Sinanché que produjeron shampoos, jabones y cosméticos a la partir de
las algas Sargassum sp y Halymenia floresii, ésta iniciativa fue promovida por
integrantes del Programa Integral de Desarrollo Rural, Componente de Extensión e
Innovación Productiva (CEIP), del Gobierno de Yucatán en colaboración con la
Universidad Autónoma de Yucatán (Alpuche et al., 2016). Actualmente existe una
empresa dedicada a la producción de fertilizantes foliares elaborados a partir de
macroalgas marinas de arribazón del género Sargassum sp llamada Salgax
Biotecnología Marina Aplicada S. de R.L. de C.V. (com. pers.).
Capítulo I
24
1.8.7. Los arribazones de macroalgas marinas
La llegada masiva de macroalgas a las playas se conoce como arribazón (beach-cast
o wrack en inglés); pueden ser mono o poliespecíficos dependiendo de la composición
ficoflorística, la zona geográfica y la estacionalidad. Estos fenómenos ocurren en el
Caribe Mexicano durante todo el año, siendo más recurrentes en los meses de
noviembre a abril. La frecuencia de los arribazones se ha relacionado a las corrientes
marinas, ciclones, frentes fríos y tamaño de las especies (Dreckmann y Sentíes,
2003). En la Figura 1.11 se observa un arribazón de algas marinas en la costa de
Sisal, Yucatán.
Figura 1.11. Arribazón de algas en la costa de Sisal, Yucatán (16 enero del
2017).
1.8.8. Estudios sobre arribazones
Estudios de caracterización florística y aprovechamiento de los arribazones se han
realizado en Alaska donde se evaluaron los riesgos asociados a los diferentes
mercados donde se comercializan productos obtenidos de macroalgas marinas, sus
canales de distribución, promoción y precios para otorgar oportunidades de trabajo a
residentes de la isla de St. Lawrence (Roberts y Stekoll, 1993). En Argentina se ha
evaluado en la comunidad de Bahía Nueva al noreste de la provincia de Chubut, el
aprovechamiento de macroalgas marinas para su compostaje donde se concluyó que
los arribazones son adecuados para su uso como composta siendo la especie Undaria
pinnatifida la más idónea para este fin debido a su composición química (Eyras y Sar,
2003; Becherucci y Benavides, 2016).
Capítulo I
25
En Estonia se ha investigado los patrones de acumulación, ficoflora asociada y
factores ambientales que afectan a la macroalga Furcellaria lumbricalis en la bahía de
Kassari donde encontraron que existe una pérdida aproximada de la biomasa de la
población del 3% debido a los arribazones y que estos están relacionados a
condiciones meteorológicas e hidrológicas como la velocidad del viento, inclinación de
la costa y las fuerza de las olas (Kersen y Martin, 2007). En Suecia se evaluó el valor
no comercial de la recolección de macroalgas marinas de arribazones en la
municipalidad de Trelleborg, enfocándose en un programa ambiental para su
aprovechamiento como biocombustible o biofertilizante teniendo una aceptación
positiva por los habitantes (Risén et al., 2017).
En México los estudios son muy limitados (Dreckmann y Senties, 2013), en Yucatán
se reporta la caracterización de macroalgas marinas bénticas y de arribazón en la
zona de Dzilam de Bravo, entre las especies más abundantes se encuentran S.
filipendula, Sporochnus pedunculatus, Padina sp, H. floresii, H. elongata, Meristotheca
gelidium, G. cervicornis, Caulerpa racemosa, C. prolifera y C. paspaloide (Rosado et
al., 2011).
Los arribazones de algas son fenómenos recurrentes que afectan a la población
costera, debido al mal aspecto y olor que despiden al descomponerse. El gobierno
federal en su programa de empleo temporal que ofrece trabajo a cerca de 4,600
personas, incluyó el retiro y el manejo de los recursos algales en los estados de
Yucatán y Quintana Roo, en este último se publicó el documento “Lineamiento técnico
para el bloqueo y retiro del sargazo en la zona marina” (SEMARNAT, 2015).
En el 2018 los arribazones se han vuelto una problemática para la zona costera de
Quintana Roo con más de 106 mil metros cúbicos de macroalgas marinas retiradas de
40 km de playas en la temporada junio-agosto, según informó a medios periodísticos
el Sr. Alfredo Arellano Guillermo titular de la Secretaria de Ecología y Medio Ambiente
(SEMA). Se han intentado diferentes métodos para resolver el problema de los
arribazones en Quintana Roo, desde bandas transportadoras, embarcaciones que
colectan dentro del mar hasta barreras y aspiradoras, sin embargo la problemática no
se resuelve, ya que estos esfuerzos están enfocados a retirar la macroalgas de la
costa y no al aprovechamiento de la misma.
Capítulo I
26
Una industria que use estos recursos para la elaboración de productos biotecnológicos
innovadores, disminuiría los efectos de los arribazones y sería además una fuente de
empleos. Por lo anterior este trabajo evalúa la actividad antifúngica potencial de
extractos de macroalgas marinas de arribazón de la zona costera de Yucatán contra
fitopatógenos de importancia comercial como: Pseudocercospora fijiensis,
Colletotrichum gloeosporioides y Fusarium oxysporum.
Capítulo I
27
JUSTIFICACIÓN
Los fungicidas sintéticos causan daños al ambiente, a la salud, además algunas cepas
han desarrollado resistencia a dichos fungicidas. La búsqueda y evaluación de
compuestos y extractos naturales efectivos y menos tóxicos contra hongos
fitopatógenos abre la posibilidad de desarrollar productos biotecnológicos que
promuevan una agricultura ecoamigable, reduciendo los efectos negativos de los
fungicidas sintéticos. Las macroalgas marinas procedentes de arribazones de la zona
costera de Yucatán tienen el potencial de ser una fuente de compuestos antifúngicos,
antibacteriales, antivirales y antioxidantes, adémas son abundantes, baratas y de fácil
acceso. Asimismo al utilizarlas se disminuirá su impacto negativo en las zonas
turísticas. En este trabajo se evaluó el potencial antifúngico de extractos de cinco
macroalgas marinas de arribazón.
Capítulo I
28
HIPÓTESIS
Los extractos de macroalgas marinas de la zona costera de Yucatán presentan
actividad antifúngica contra hongos fitopatógenos como Pseudocercospora fijiensis,
Colletotrichum gloeosporioides y Fusarium oxysporum.
Capítulo I
29
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Evaluar la actividad antifúngica de extractos de macroalgas marinas de la zona costera
de Yucatán contra fitopatógenos de cultivos agrícolas de importancia comercial.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Recolectar e identificar especímenes de macroalgas marinas representativos de
los phyla Rhodophyta, Ochrophyta y Chlorophyta de la zona costera de Yucatán.
Evaluar la actividad antifúngica in vitro de extractos crudos acuosos, fracciones
orgánicas y proteicas contra tres hongos fitopatógenos: Pseudocercospora
fijiensis, Colletotrichum gloeosporioides y Fusarium oxysporum.
Obtener el perfil proteico del ECA con actividad antifúngica.
Obtener el perfil cromatográfico mediante CLAR de los extractos con actividad
antifúngica.
Validar cuantitativamente la actividad inhibitoria de los ECA’s utilizando el método
de Alamar Blue.
Analizar la toxicidad de los ECA´s con actividad antifúngica en camarones de
salmuera (Artemia salina).
Capítulo I
30
ESTRATEGIA DE INVESTIGACIÓN
Capítulo I
31
ESTRATEGIA DE INVESTIGACIÓN
Capítulo II
32
CAPÍTULO II
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DE EXTRACTOS
CRUDOS ACUOSOS, FRACCIONES ORGÁNICAS Y PROTEÍNA DE
MACROALGAS MARINAS DE YUCATÁN
2.1. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1.1. Material algal
Se colectaron especies de macroalgas marinas de arribazones en las localidades de
Sisal (21°09′56.1″N 90°02´49.8″O) y Dzilam de Bravo (21°23′25.2″N 88°54′31.5″O)
durante la temporada 2016-2017 (octubre-enero). La colecta se realizó en la zona
intermareal y de manera manual, los especímenes se lavaron en el sitio con agua de
mar para retirar epibiontes, arena y objetos extraños, posteriormente se depositaron
en bolsas de plástico para su transporte. Se seleccionaron cinco especies
considerando los siguientes criterios:
1) Que tuvieran una biomasa abundante (> 1 Kg).
2) Que el rendimiento peso húmedo/peso seco fuera mayor al 4%.
3) Y que fueran representativas de los tres phyla de macroalgas marinas.
La preparación y el análisis se realizaron en el laboratorio de biotecnología de plátano
de la Unidad de Biotecnología del Centro de Investigación Científica de Yucatán, CICY
A.C.
Cuatro ejemplares de cada especie se preservaron en formaldehído al 5% para su
prensado.
Se realizó una segunda colecta (noviembre 2016) de la macroalga marina cuyo
extracto crudo acuoso presentó actividad antifúngica con la finalidad de evaluar si el
extracto de dicha colecta también era activo.
2.1.2. Preparación e identificación de macroalgas
Los especímenes se prensaron siguiendo las especificaciones de Florez et al., (2010),
se lavaron con agua de la llave para retirar el excedente de formaldehído, se
depositaron sobre cartulinas para herbario (Bristol 110 Kg libre de ácido de un tamaño
de 40 cm × 28 cm), se prensaron y se depositaron en un horno a 45 °C por una
semana (Figura 2.1). Posteriormente se depositaron dos ejemplares de cada especie
en los herbarios "U Najil Tikin Xiw” del Centro de Investigación Científica de Yucatán y
en el “Alfredo Barrera Marín” de la Universidad Autónoma de Yucatán.
Capítulo II
33
Para la identificación morfológica de los ejemplares se consultó la base de datos de
Algaebase (Guiry and Guiry, 2013) y las guías de Littler y Littller (2000) y Wynne
(2011), además se realizaron cortes manuales histológicos transversales de los talos
de las macroalgas con una navaja de bisturí # 11 (Salavarría et al., 2015) y se tiñeron
con azul de lactofenol por 10 min (fenol: 0.1 g, ácido láctico: 8 mL, agua destilada: 10
mL, glicerina: 20 mL y azul de anilina: 0.5 g) para observar estructuras internas
mediante un estereomicroscopio binocular Stemi DV4, Zeiss®. La Dra. Ileana Ortegón
Aznar, profesora asociada de la Universidad Autónoma de Yucatán y especialista en
macroalgas marinas, confirmó la identificación de las especies.
2.1.3. Preparación de las muestras para la obtención de extractos crudos
acuosos (ECA’s)
La macroalgas marinas se lavaron con agua de la llave y posteriormente agua
destilada, siguiendo el método de Ambika y Sujatha (2015) con modificaciones se
secaron a la sombra sobre papel a 27 °C (+/– 3 °C) de 3 a 7 días, posteriormente en
horno a 37 °C por 24 h. Al finalizar el secado se molieron en una licuadora (Waring®
Comercial, USA Modelo WF2211212), hasta obtener un polvo fino y se guardaron en
bolsas ziploc, en oscuridad, a 27 °C +/– 3 °C hasta su uso (Figura 1.12).
Figura 1.12. Proceso de secado de macroalgas marinas.
Capítulo II
34
2.1.4. Métodos de elaboración de ECA’s
Se compararon tres métodos de elaboración de ECA’s para elegir el más práctico (fácil
y rápido). Se utilizó una muestra de arribazón del grupo Rhodophyta recolectada el día
6 de enero del 2015.
En la Figura 1.13 se describe la estrategia experimental utilizada para la extracción
acuosa y enseguida se describe a detalle cada procedimiento.
1) El primer método fue el de Díaz et al. (2015) con modificaciones; brevemente, se
realizó una maceración de 5 g de material seco en 50 mL de agua destilada estéril,
dejando en agitación constante a 27 °C +/- 3 °C durante 24 h, posteriormente se
centrifugó a 5,854 × g a 4ºC por 30 min, se transfirió el sobrenadante a tubos
Eppendorf, se centrifugó a 18,213 × g por 30 min. Se filtró mediante membranas
Durapore® de 0.65 µm, 0.45 µm para retirar partículas suspendidas en el extracto, el
paso final se modificó pues el sobrenadante no se liofilizó, si no que se esterilizó por
filtración utilizando una membrana de 0.22 µm y se conservó a 4 ºC hasta su uso.
2) El segundo método fue el de Ruiz-Ruiz et al. (2016) con modificaciones; consistió
en mezclar 5 g de material seco con 50 mL de agua destilada estéril y licuar a mínima
potencia por 1 min. El sobrenadante de la muestra se distribuyó en tubos Falcon y se
centrifugó a 5,854 × g por 30 min, se volvió a recuperar y se transfirió a tubos
eppendorf de 2 mL para centrifugarse nuevamente a 18,213 × g por 30 min y al
finalizar el sobrenadante se filtró por medio de membranas Durapore® de 0.65 µm,
0.45 µm, se esterilizó por filtración a 0.22 µm y se conservó a 4 ºC hasta su uso.
3) El tercer método fue el de Kuda e Ikemori (2009) con modificaciones, consistió en
licuar 5 g de material seco con 50 mL de agua destilada estéril, por un minuto a
máxima potencia. La mezcla se calentó por 30 min a 50 °C, se mantuvo en agitación
constante y se centrifugó a 5,854 × g por 30 min, el sobrenadante se transfirió a tubos
eppendorf y se centrifugó a 18,213 × g por 30 min, se filtró el sobrenadante por medio
de membranas Durapore® de 0.65 µm, 0.45 µm, se esterilizó por filtración a 0.22 µm y
se conservó a 4 °C hasta su uso.
Capítulo II
35
Figura 1.13. Estrategia experimental de tres métodos de elaboración de ECA’s.
2.1.5. Bioensayo de actividad antifúngica de los ECA’s
Se siguió el método de Ruiz-Ruiz et al. (2016) debido a que permite evaluar
tanto la actividad fungistática como fungicida de un extracto determinado, además de
su simplicidad, bajo costo y rapidez. Se prepararon tratamientos con un volumen de
112.5 µL de extracto crudo acuoso a concentraciones de 27.27 (C4), 13.635(C3),
6.817(C2) y 3.408 mg/mL (C1) y 12.5 µL de suspensión conidial a una concentración
de 150 conidios ó esporas/µL; como control negativo se utilizaron 12.5 µL de agua
destilada estéril y 12.5 µL de suspensión conidial, como control positivo se utilizaron
111 µL de agua destilada estéril y 1.5 µL del fungicida nitrato de miconazol y 12.5 µL
suspensión conidial, las muestras se incubaron por 72 h en oscuridad a 27 °C +/– 3
°C.
Para evaluar la actividad antifúngica de los extractos acuosos de manera cualitativa,
se transfirieron 25 µL de cada muestra donde se observó ausencia del crecimiento
micelial del hongo y se depositaron por duplicado en cajas Petri con PDA, se dejaron
incubar en periodos de luz/oscuridad de 12 h por 30 días, se evaluó la presencia o
Capítulo II
36
ausencia del crecimiento micelial a los 5, 15 y 30 días. En las muestras en las que se
observó inhibición micelial del hongo en la cajas Petri se documentó con
microfotografías mediante microscopio óptico marca AXIOPLAN I ®, Zeiis.
2.1.6. Extracción orgánica y fraccionamiento de las macroalgas marinas con
actividad antifúngica
A las algas cuyos extractos crudos acuosos presentaron actividad antifúngica, se les
realizó una extracción orgánica, siguiendo el método de Lenis et al. (2007) con
modificaciones; el material algal seco y molido (25 g - 50 g) se mezcló con etanol:
agua (9:1) y se expuso a ultrasonido (60 Hz por 60 min mediante un baño sonicador
Cole-Parmer Modelo 08895-16, Illinois, USA). El sobrenadante se recuperó mediante
filtración (se repitió la extracción dos veces con el material sobrante) y se concentró en
un rotovapor IKA® RV10 a 40 °C hasta secado total, se pesó para determinar su
rendimiento. El extracto crudo se resuspendió en una mezcla metanol:agua (1:3), se
fraccionó con hexano (1 × 80 mL, 2 × 40 mL), diclorometano (1 × 80 mL, 2 × 40 mL) y
acetato de etilo (1 × 80 mL,2 × 40 mL); cada fracción se concentró en un rotavapor
IKA® RV10 a 40 °C. Las muestras resultantes se pesaron para determinar su
rendimiento. Se etiquetaron y guardaron a 4 °C hasta su uso.
2.1.7. Bioensayo de actividad antifúngica de las fracciones orgánicas
Para los bioensayos de actividad antifúngica, se siguió el método de Vargas, (2014)
con modificaciones, se realizaron dos experimentos independientes usando medio de
cultivo PDB y H20 estéril, para lo cual se pesaron 5 mg de cada fracción y se
resuspendieron en 100 µL de dimetil sulfóxido (DMSO) quedando la disolución madre
a 50 µg/µL, se tomaron 40 µL y se realizaron seis diluciones con PDB o H20 estéril a
las concentraciones de 2000 µg/mL, 1000 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL y
62.5 µg/mL, se tomaron 112.5 µL de cada concentración y se agregaron 12.5 µL de
suspensión conidial a una concentración de 150 conidios ó esporas/µl, como control
negativo se utilizó 112.5 µL de PDB o H20 estéril y 12.5 µL de suspensión conidial,
como control positivo se utilizó 111 µL de PDB o H20 estéril más 1.5 µL de nitrato de
miconazol y 12.5 µL de suspensión conidial, las muestras se incubaron por 72 h en
oscuridad a 27 °C +/– 3 °C.
Para evaluar cualitativamente a la actividad antifúngica de los extractos acuosos, se
transfirieron 25 µL de cada muestra donde se observó ausencia del crecimiento
Capítulo II
37
micelial del hongo y se depositaron por duplicado en cajas Petri con PDA, se dejaron
incubar en periodos de luz/oscuridad de 12 h por 30 días, se evaluó la presencia o
ausencia del crecimiento micelial a los 5, 15 y 30 días. En las muestras en las que se
observó inhibición micelial se documentó con microfotografías mediante microscopio
óptico marca AXIOPLAN I ®, Zeiss®.
2.1.8. Extracción de proteína de los ECA’s de las macroalgas mediante
ultrafiltración
La técnica de ultrafiltración se eligió debido a su rapidez, simplicidad, capacidad de
procesamiento, capacidad de desalinización y obtención de compuestos de naturaleza
proteica sensibles y de bajo peso molecular (Chabeaud et al., 2009; Denis et al.,
2009). Se usaron membranas de 3 kDa (Amicon® MWCO 0.5mL Ultra, Germany) para
filtrar 1.5 mL del extracto crudo acuoso con actividad inhibitoria a una concentracion de
27.27 mg/mL, centrifugando a 14000 × g por 20 min, hasta alcanzar un volumen
retenido de 200 µL, la muestra retenida conteniendo a las proteínas mayores de 3 kDa
se recuperó mediante centrifugación a 1000 x g por 2 minutos. Las muestras retenidas
(parte proteica) se resuspendieron en un volumen de 1.3 mL de agua estéril y se
esterilizaron mediante membranas de nitrocelulosa (Millipore®) de 0.22 µm, se
etiquetaron y guardaron a 4 °C hasta su uso. La muestra filtrada (parte no proteica) se
esterilizó siguiendo el procedimeinto antes mencionado. Se realizó un bioensayo de
actividad antifúngica de la parte proteica y de la no proteica siguiendo el método
descrito en el apartado 2.1.5.
2.1.9 Cuantificación mediante el método de Bradford de la proteína de los ECA’s
con actividad antifúngica
Para cuantificar las muestras proteícas se siguió el protocolo de Kruger (1994) basado
en el método colorimétrico de Bradford. Se obtuvo el perfil proteico de las muestras
mediante un gel de acrilamida SDS-PAGE siguiendo el método de Laemmli (1970) con
modificaciones. Se tomaron 20 µL de la muestra retenida, de la filtrada y del ECA de la
especie con actividad antifúngica y se mezclaron con 6 µL de tampón de carga
(dodecilsulfato sódico al 4%). Se depositaron 20 µL de cada muestra en un gel
discontinuo de poliacrilamida, el primero llamado de apilamiento de proteínas y
formado de 4% de acrilamida y el segundo llamado gel separador de 15% de
acrilamida. La electroforesis se realizó a 90 volts por 90 min y se como referencia del
peso molecular de las proteínas se utilizó el paquete comercial “prestained sds page-
Capítulo II
38
standards broad range” con proteínas en el rango de entre 6.9-210 kDa. Después de la
electroforesis el gel se tiñó con nitrato de plata y se observaron las bandas de
proteína.
2.1.10 Análisis de los ECA’s con actividad antifúngica mediante cromatografía
líquida de alta resolución (CLAR) y cromatografía en capa delgada (CCD)
La cromatografia líquida de alta resolución (CLAR) es una técnica instrumental de alta
sensibilidad, cuantitativa y cualitativa que permite la separación de una amplia gama
de compuestos mediante el uso de una columna (fase estacionaria) y una fase móvil,
acoplada a detectores que ayudan a determinar la naturaleza del compuesto. Para la
obtención del perfil cromatográfico del extracto crudo acuoso de las especies con
actividad antifúngica se utilizó un equipo de cromatografía líquida de alta resolución
Agilent Technologies 1290 Infinity y una columna cromatográfica Grace® Altima C18 µ
250 mm × 4.6mm, usando un método de gradiente de elución que se muestra en el
Cuadro 2.4.
Cuadro 2.4 Condiciones del gradiente de elución utilizado para obtención del perfil
cromatográfico del extracto crudo acuoso de H. floresii.
H2O (%) MeOH (%) Acetonitrilo
(%)
Tiempo
(min)
Flujo
(mL/min)
Temperatura
(°C)
90 10 0 8 1.5
24
50 50 0 5 1
0 70 30 15 0.5
50 0 50 7 1
Para el análisis mediante cromatografía en capa delgada del extracto crudo acuoso,
de la parte proteica y parte no proteica del ECA de las especies con actividad
antifúngica se utilizaron placas TLC gel de sílice 60 F254 y TLC gel de sílice 60 RP-18
F254s, empleando un sistema de disolventes metanol:acetato de etilo (1:1) y
H2O:metanol (7:3), respectivamente, revelando con ácido fosfomolíbdico.
Capítulo II
39
2.1.11 Determinación de la actividad antifúngica de los ECA’s utilizando el
método de Alamar Blue
El análisis de la actividad antifúngica de los ECA’s mediante Alamar Blue (AB) se basa
en la reducción de la resazurina (azul) a resarufina (rojo) por oxido-reductasas
localizadas en las mitocondrias de las células, el cambio de color es directamente
proporcional al número de células que se encuentren viables (Zhang et al. 2004). En
este trabajo se calculó el porcentaje de viabilidad mediante la fórmula de porcentaje de
reducción del AB, que se describe a continuación:
% = (O2 × A1) – (O1 × A2) / (R1 × N2) – (R2 × N1) × 100
Donde:
O1 = Coeficiente de extinción molar oxidado del Alamar Blue a 570 nm
O2 = Coeficiente de extinción molar oxidado del Alamar Blue a 600 nm
R1 = Coeficiente de extinción molar reducido del Alamar Blue a 570 nm
R2 = Coeficiente de extinción molar reducido del Alamar Blue a 600 nm
A1 = Absorbancia de prueba a 570 nm
A2 = Absorbancia de prueba a 600 nm
N1 = Absorbancia de control a 570 nm
N2 = Absorbancia de control a 600 nm
Coeficientes de extinción molar de Alamar Blue
Oxidado Reducido
570 nm 155677 80586
600 nm 14652 117216
Se preparó una curva estándar con una concentración de conidios de 40,000, 20,000 y
10,000 conidios/mL con PDB (pH 7.2) y Alamar Blue. Las muestras se prepararon
siguiendo la metodología del punto 2.1.5 con la modificación de que al finalizar la
incubación de 27 °C +/– 3 °C por 3 días, se centrifugaron a 18,213 × g por 30 min, se
desechó el sobrenadante y se recuperaron las pastillas, adicionando 500 µL de PDB y
50 µL de Alamar Blue. Para el control positivo se utilizó un volumen determinado de
PDB, Alamar Blue y suspensión conidial. Se incubaron las muestras en oscuridad y se
evaluó la reducción del AB mediante absorbancia a 570 y 600 nm a las 0, 24, 48 y 72
Capítulo II
40
h mediante un espectrofotómetro. Los análisis se realizaron por triplicado. Se calculó
el porcentaje de reducción y las gráficas de actividad antifúngica.
2.1.12 Análisis de toxicidad de los ECA’s en camarones de salmuera (Artemia
salina)
Se determinó la toxicidad de los extractos activos, siguiendo el método de Meyer et al.
(1982) con modificaciones, se usó en un recipiente rectangular de plástico con
divisiones de luz y oscuridad, con una disolución de agua marina (200 mL agua
destilada ésteril + 5 g de sal marina), la cual se mantuvo en aireación mediante una
bomba de pecera durante 2 h.
Se agregaron 45 mg de quistes de camarones para su eclosión, a las 24 h se tomaron
15 nauplios y se depositaron en viales con 4.5 mL de disolución de eclosión y 0.5 mL
del extracto a evaluar, se usaron concentración finales de 1350, 675, 337.5 y 168.75
µg/mL, como control negativo 0.5 mL de la solución de eclosión y como positivo 6µL
de nitrato de miconazol (20 mg/mL), se dejaron incubar por 24 h. Durante todo el
experimento se usó como fuente de luz artificial un foco de luz blanca (127 V, 23 W,60
Hz marca Brith Ligth®) a 27 °C+/– 3 °C.
Se determinó el porcentaje de letalidad y la CL50 mediante la función PROBIT usando
el programa XLSTAT, considerando una mortalidad natural del 11%.
Capítulo II
41
2.13. RESULTADOS
2.14. Material algal
Se identificaron cinco especies de macroalgas marinas colectadas de la zona costera
de Dzilam de Bravo y Sisal, Yucatán. Las especies identificadas fueron:
Halymenia floresii (Clemente) C.Agardh 1817. Phylum: Rhodophyta, familia
Halymeniaceae. Se caracteriza por un talo aplanado y gelatinoso, con ramificaciones
de 0.7 mm a 3 mm de ancho, el alga presenta una coloración rojiza, rosácea a
anaranjada (Figura 2.1a), los cortes histológicos mostraron un cortéx papiloso y firme
con un médula filamentosa anticlinal (Figura 2.1b).
Figura 2.1. Espécimen de H. floresii con las características representativas de la
especie. a) vista macroscópica, b) corte transversal del talo observado bajo un
microscopio estereoscopio a 32x. Se observa el cortéx y la médula teñidos con azul de
lactofenol.
Agardhiella subulata (C.Agardh) Kraft y M.J.Wynne 1979. Phylum: Rhodophyta familia:
Solieriaceae. Se caracteriza por un talo erecto, tubular de superficie lisa, de 15 a 45
cm con ramificaciones opuestas, el alga presenta una coloración rojiza-anaranjada-
café (Figura 2.2a), los cortes histológicos mostraron un córtex pseudoparenquimatoso
y médula filamentosa (Figura 2.2b).
a) b)
32x 5 cm
Capítulo II
42
Figura 2.2. Espécimen de A. subulata con las características representativas de la
especie. a) vista macroscópica, b) corte transversal del talo observado bajo un
microscopio estereoscopio a 32x. Se observa el cortéx y la médula teñidos con azul
de lactofenol.
Codium isthmocladum Vickers 1905. Phylum Chlorophyta, Familia Codiaceae. Se
caracteriza por un talo ramificado dicotómico, rugoso y suculento con un tamaño de 5
a 15 cm de largo y ramas corticadas, el alga presenta una coloración verde oscuro
(Figura 2.3a), el corte histológico mostró utrículos cilíndricos colocados radialmente
(Figura 2.3b).
Figura 2.3. Espécimen de C. isthmocladum con las características representativas
de la especie. a) vista macroscópica, b) corte transversal del talo observado bajo un
microscopio estereoscopio a 32x. Se observa utrículos y la médula teñidos con azul
a) b)
a) b)
32x
32x
3 cm
2 cm
Capítulo II
43
de lactofenol.
Dictyota dichotoma (Hudson) J.V.Lamouroux 1809. Phylum: Ochrophyta, familia
Dictyotaceae. Se caracteriza por talos dicotómicos, planos y firmes de hasta 14 cm de
altura, con ramas corticadas, el alga presenta una coloración café claro–amarillenta-
verdosa (Figura 2.4a), el corte histológico mostró un córtex simple con células
rectangulares y médula sencilla (Figura 2.4b).
Figura 2.4. Espécimen de D. dichotoma con las características representativas de la
especie. a) vista macroscópica, b) corte transversal del talo observado bajo un
microscopio estereoscopio a 32x. Se observa corteza y la médula teñidos con azul de
lactofenol.
Bryothamnion triquetrum (S.G.Gmelin) M.Howe 1915. Phylum Rhodophyta, familia
Rhodomelaceae. Se caracteriza por un talo erecto, con ramificaciones cortas tipo
espina, el alga presenta una coloración roja a café oscura (Figura 2.5a), el corte
histológico mostró un córtex con células corticales rectangulares muy pigmentadas, y
una médula con células globosas pericentrales (Figura 2.5b).
a) b)
a) b)
25x
25x
1 cm
2 cm
Capítulo II
44
Figura 2.5. Espécimen de Bryothamnion triquetrum con las características
representativas de la especie. a) vista macroscópica, b) corte transversal del talo
observado bajo un microscopio estereoscopio a 32x. Se observa cortex y la médula
teñidos con azul de lactofenol.
Se ingresaron a cada herbario dos ejemplares de las especies H. floresii, A. subulata,
C. isthmocladum, D. dichotoma y solo una de la especie B. triquetrum.
La especie H. floresii presentó una biomasa fresca colectada de 4,232 g siendo la más
representativa en la comunidad de Sisal, lo cual representa 4.3% de peso seco, la
especie A. subulata presentó el mayor porcentaje de peso seco (7.1%) y las especies
C. isthmocladum y D. dichotoma de 4.6 y 4.3%, respectivamente (Cuadro 2.5).
Cuadro 2.5 Biomasa colectada de algas marinas, peso húmedo colectado, peso seco y
porcentaje de peso seco.
Especie Peso húmedo colectado (g)
Peso seco (g)
Peso seco en % Lugar de colecta
H. floresii 4,232 185 4.3 Sisal
A. subulata 2,021 145 7.1 Sisal
C.
isthmocladum
1,410 66 4.6 Sisal
D. dichotoma 440 19 4.3 Dzilam de
Bravo
B. triquetrum 2,299 151 6.5 Sisal
2.15. Elección del método de elaboración de ECA´s
Se eligió el método de Ruiz-Ruiz et al. (2016) para realizar la extración porque se
obtuvo un mayor volumen de ECA y es un método práctico.
Con el método de Ruiz-Ruiz et al. (2016) se obtuvieron cinco ECA´s de cada especie y
se evaluó la actividad antifúngica contra los hongos fitopatógenos: P. fijiensis, F.
oxysporum y C. gloeosporioides.
Capítulo II
45
2.16. Bioensayo de actividad antifúngica del ECA de H. floresii
El extracto acuoso de de la primera colecta de H. floresii presentó actividad
fungiestática al inhibir temporalmente (tres días) el crecimiento del micelio de F.
oxysporum y C. gloeosporioides a las concentraciones 27.27 mg/mL (C4), 13.72
mg/mL (C3), 6.89 mg/mL (C2) y 3.44 mg/mL (C1) respectivamente (Figura 2.6 a, b). El
extracto de H. floresii presentó actividad inhibitoria del crecimiento del hongo P.
fijiensis a las concentraciones de 27.27 mg/mL (C4) y 13.72 mg/mL (C3) durante 30
días (Figura 2.7 y 2.8).
El extracto acuoso de C. isthmocladum presentó actividad fungistática (temporalmente
durante tres días) contra el hongo C. gloeosporioides. Los extractos acuosos de A.
subulata, D. dichotoma y B. triquetrum no presentaron actividad contra los hongos
evaluados.
Figura 2.6. Crecimiento del micelio de los hongos tratados con el ECA de H. floresii a
30 días de inoculación. a) C. gloeosporioides y b) F. oxysporum. Control (–), control
(+) y tratamientos a las concentraciones C4, C3, C2 y C1.
a) b)
Capítulo II
46
Figura 2.7. Inhibición del crecimiento micelial de P. fijiensis ocasionado por el
extracto crudo acuoso de H. floresii. Control negativo (C–), control positivo (C+).
Concentraciones activas: 13.72 mg/mL (C3) y 27.27 mg/mL. Evaluación a 30
días de inoculación.
Bajo microscopio se observó germinación de los conidios de P. fijiensis a las
concentraciones de 3.44 mg/mL (C1) y 6.89 mg/mL (C2) y conidios sin germinar a las
concentraciones de 13.72 mg/mL (C3) y 27.27 mg/mL (C4) (Figura 2.8).
Capítulo II
47
Figura 2.8. Conidios de P. fijiensis sin crecimiento micelial ocasionado por el ECA de
H. floresii. Control negativo (C–), control positivo (C+). Concentraciones activas: 13.72
mg/mL (C3) y 27.27 mg/mL (C4). C = conidio, M = micelio. Evaluación a 30 días de
inoculación.
Una segunda colecta fue realizada en el mes de noviembre del 2016 de la especie H.
floresii para comprobar la presencia de actividad antifúngica. El ECA no presentó
actividad contra los hongos P. fijiensis, F. oxysporum y C. gloroeosporoides.
2.17. Análisis de toxicidad del ECA de H. floresii
Debido a la búsqueda de extractos menos tóxicos que los fungicidas sintéticos es
necesario verificar si los extractos de origen algal con actividad inhibitoria presentan
toxicidad contra fauna benéfica, para esto se realizan estudios de toxicidad en
organismos modelo como Artemia salina o Eisenia foetida. Por lo cual en este estudio
se determinó la toxicidad del extracto de H. floresii de la primera colecta en las
especies modelo Artemia salina y Eisenia foetida.
100x 100x 100x
M
M
C
C
C
M
Capítulo II
48
2.17.1 Análisis de toxicidad del ECA de H. floresii sobre camarones de salmuera
(Artemia salina)
El ECA de H. floresii no presentó actividad tóxica contra Artemia salina a las
concentraciones evaluadas (1350, 675, 337.5 y 168.75 µg/mL). En el experimento se
observó una muerte natural del 11% de los organismos.
2.17.2 Análisis de toxicidad en lombriz de tierra (Eisenia foetida)
El ECA de H. floresii no presentó actividad tóxica contra Eisenia foetida a las
concentraciones evaluadas (27.27, 13.72, 6.89 y 3.44 mg/mL). En el experimento no
se observó muerte natural de los organismos.
2.18. Análisis del ECA de H. floresii mediante cromatografía en capa delgada
CCD
Se realizó una cromatografía en capa delgada (CCD) en placas de TLC gel de sílice
60 RP-18 F254s, donde se observaron bandas continuas con una relación frontal (Rf) de
0.25 a 0.8 en el extracto crudo acuoso de H. floresii (1). En la parte proteica del ECA
(2), se observaron bandas con una Rf de 0.8 y no se observaron bandas en la parte no
proteica (3) (Figura 2.9a). Al realizar la cromatografía en capa delgada (CCD) en
placas de TLC gel de sílice 60 F254 se observaron dos bandas con una Rf de 0.625 y
0.125, en el extracto crudo acuoso de H. floresii (1) en la parte proteica del ECA (2) no
se observaron bandas y en la parte no proteica (3) se observó una banda con una Rf
de 0.625 (Figura 2.9b).
Capítulo II
49
Figura 2.9. Cromatograma en capa delgada CCD del ECA (1), parte proteica (2)
y no proteica (3) de H. floresii con actividad antifúngica. a) TLC gel de sílice 60
RP-18 F254s y b) TLC gel de sílice 60 F254 revelado con ácido fosfomolíbdico.
2.19. Análisis del ECA de H. floresii mediante cromatografía líquida de alta
resolución (CLAR)
Para obtener un perfil de los componentes presentes en el ECA de H.floresii que
presentó actividad antifúngica contra P.fijiensis, se realizó una cromatografía líquida de
alta resolución (CLAR), donde se encontró que la longitud de onda de mayor
sensibilidad para la detección fue de 214 nm. El tiempo de corrida fue de 35 min y en
total se obtuvieron 23 picos, quince de esos picos se observaron en la primera parte
de la corrida de 0 a 10 min con un ancho de banda menor a 0.3 min y ocho picos en la
segunda parte de la corrida del minuto 14 al 35, los cuales presentaron una
sobreposición en la base de los picos. El cromatograma presentó tres picos
mayoritarios en los tiempos de retención 1.633, 23.047 y 23.900 con un máximo de
absorbancia a 319, 270 y 265 mAU y un porcentaje bajo la curva de 10.06, 12,28 y
10.74% respectivamente (Figura 2.10).
a) b)
Capítulo II
50
Figura 2.10. Cromatogramas del ECA de H. floresii a 214nm, a) Cromatograma con un tiempo de corrida de 35 min donde se observa la
presencia de tres picos mayoritarios con un tiempo de retención de 1.633, 23.047 y 23.900.
a)
Capítulo II
51
Figura 2.10 (continuación). Cromatogramas del ECA de H. floresii a 214nm, b) Ampliación del cromatograma del minuto 1 al 14 donde se
observa la presencia de un pico mayoritario con un tiempo de retención de 1.633 y 14 picos minoritarios c) Ampliación del cromatograma del
minuto14 al 35 donde se observa la presencia de dos picos mayoritarios con tiempos de retención de 23.047 y 23.900, respectivamente y
seis minoritarios.
b) c)
Capítulo II
52
2.20. Determinación de la actividad antifúngica del ECA de H. floresii mediante el
método de Alamar Blue
Se realizó un experimento a diferentes concentraciones de conidios y tiempos de
incubación con el objetivo de obtener una curva de reducción y así determinar las
condiciones óptimas para el experimento de viabilidad celular de los conidios de P.
fijiensis expuestos al ECA de H. floresii (Figura 2.11).
Figura 2.11. Curva de reducción de resazurina-resorufina. Concentraciones de
conidios de P. fijiensis a 40000, 20000 y 10000, tiempos de incubación 0, 24, 36 y 48
h.
Se eligió la concentración de 10,000 conidios y el tiempo de incubación de 36 h para
determinar el porcentaje de reducción e inhibición del ECA de H. floresii, dando como
resultados un porcentaje de reducción del 63.29% para el control positivo y de 47.32%
para el extracto de H. floresii (Figura 2.12). La actividad inhibitoria del ECA de H.
floresii sobre los conidios de P. fijiensis fue de 58.64% (Figura 2.13).
Capítulo II
53
Figura 3.12.- Reducción de resazurina-resorufina del ECA de H. floresii. Control
positivo (+) PDB.
Figura 3.13 Inhibición del ECA de H. floresii (27.27mg/mL) sobre conidios de P.
fijiensis. Control positivo (+) PDB.
Capítulo II
54
2.21. Extracción de fracciones orgánicas de H. floresii y bioensayo de actividad
antifúngica
La cantidad de material obtenido de las fracciones orgánicas de la especie H. floresii
se muestran en el Cuadro 2.6. La fracción acuosa y diclorometánica presentaron los
mayores rendimientos con 5208 mg y 155.9 mg respectivamente.
Cuadro 2.6 Material obtenido de las fracciones orgánicas de H. floresii.
Fracción
orgánica
Peso total
(mg)
Rendimiento
(%) respecto a
extracto crudo
Rendimiento
(%) respecto
material
usado (50g)
Etanol:agua
(Extracto crudo) 7097 100 14.1
Hexano 98 1.3 0.19
Diclorometano 155.9 2.2 0.31
Acetato de etilo 126.5 1.7 0.25
Acuosa 5208 73.37 10.41
La cantidad de material obtenido de las fracciones orgánicas de la especie C.
isthmocladum se observan en el Cuadro 2.7. La fracción hexánica presentó el más alto
rendimiento con 231 mg.
Capítulo II
55
Cuadro 2.7 Rendimiento de las fracciones orgánicas de C. isthmocladum
Fracción
orgánica
Peso total
(mg )
Rendimiento (%)
respecto a
extracto crudo
Rendimiento
(%) respecto
material
usado (30g)
Etanol:agua
(Extracto crudo) 6222 100 20.74
Hexano 231 3.71 0.77
Diclorometano 143.8 2.31 0.48
Acetato de etilo 65.8 1.05 0.22
Acuoso 1,935 31.1 6.4
Ninguna fracción orgánica presentó actividad inhibitoria o fungistática contra los
hongos evaluados.
2.22. Bioensayo de actividad antifúngica de la parte proteica del ECA de H.
floresii
La parte proteica del ECA de H. floresii fue activa contra el hongo P. fijiensis. Se
observó ausencia de crecimiento micelial a las concentraciones evaluadas [0.625
ng/µL (C1), 1.25 ng/µL (C2), 2.5 ng/µL (C3) y 5 ng/µL (C4)]. Se tomaron fotografías de
los conidios al inicio del experimento (Figura 2.14) y al finalizar la incubación de tres
días (Figura 2.15), al transferirse a cajas Petri con medio PDA se observó inhibición de
la germinación de los hongos (Figura 2.16) y a los 30 días de inoculación del hongo
(Figura 2.17). La parte no proteica no fue activa contra P. fijiensis (Figura 2.18).
Capítulo II
56
Figura 2.14. Conidios germinados al inicio del experimento.
Figura 2.15. Conidios de P. fijiensis sin crecimiento micelial ocasionado por la parte
proteica del ECA de H. floresii. Control negativo (C–), control positivo (C+).
Concentraciones activas: 0.625 ng/µL (C1), 1.25 ng/µL (C2), 2.5 ng/µL (C3) y 5
ng/µL (C4). (C4). C = conidio, M = micelio. Evaluación a 72h de incubación.
M
C C
C
C
C
Capítulo II
57
Figura 2.16 Inhibición del crecimiento micelial de P. fijiensis ocasionado por
la parte proteica del ECA de H. floresii. Control negativo (C–), Control
positivo (C+). Concentraciones activas: 0.625 ng/µL (C1), 1.25 ng/µL (C2),
2.5 ng/µL (C3) y 5 ng/µL (C4). Evaluación a 30 días de incubación.
Figura 2.17 Conidios de P. fijiensis sin crecimiento micelial ocasionado por la
parte proteica del ECA de H. floresii. Control negativo (C–), control positivo
(C+). Concentraciones activas: 0.625 ng/µL (C1), 1.25 ng/µL (C2), 2.5 ng/µL
(C3) y 5 ng/µL (C4). (C4). C = conidio, M = micelio. Evaluación a 30 días de
incubación.
C C
C C C
M
Capítulo II
58
Figura 2.18. Crecimiento micelial de P. fijiensis que indica ausencia de
actividad antifúngica de la parte no proteica del ECA de H. floresii. Control
negativo (C–), control positivo (C+). Evaluación a 30 días de incubación.
2.23 Perfil proteico de H. floresii
Se observaron diferencias en los perfiles proteicos de los ECA´s de H. floresii, esto es,
la intensidad de las bandas fue mayor en las muestras de la primera colecta la cual
presentó actividad antifúngica (Figura 3.19).
Capítulo II
59
Figura 2.19. Perfil proteico de los ECA’s de H. floresii. a) Muestra colectada en octubre
2016 de H. floresii con actividad antifúngica (HF1). b) Muestra colectada en noviembre
2016 de H. floresii sin actividad antifúngica (HF2). ECA, parte proteica (Pro) y no
proteica (NPro) del ECA H. floresii. (+) Activo, (–) inactivo. M = SDS-PAGE Standards,
Bio-Rad® (6.9 - 210 kDa).
+ + -
a) b)
20µL de carga
Capítulo II
60
2.24. DISCUSIÓN
Los arribazones en el Caribe Mexicano se originan debido al desprendimiento de los
talos o filoides de las macroalgas ocasionado por las lluvias y corrientes superficiales
durante la temporada ciclónica (mayo-octubre), los restos son arrojados a las costas al
final de la temporada (Castillo-Arenas y Dreckmann, 1995 citado por Dreckmann y
Santíes, 2013). Las macroalgas marinas de la península de Yucatán son abundantes
en su hábitat en la época de lluvias, debido a las escorrentías y a la surgencia de
aguas profundas que aportan nutrientes al ecosistema, (Mateo-Cid et al., 2013;
Ortegón et al., 2001), lo que provoca que la biomasa de macroalgas marinas en los
arribazones sea abundante. La ficoflora del litoral yucateco tiene características
tropicales, con una mayor abundancia de especies del phylum Rhodophyta (Mateo-Cid
et al., 2013).
En este trabajo se obtuvo una mayor abundancia de especies del phylum Rhodophyta
lo cual concuerda con las características de la ficoflora de la región. Los arribazones
en la zona costera de Yucatán son más frecuentes en los meses de octubre-febrero
comparado con el Caribe Mexicano. Especies como H. floresii, D. dichotoma A.
subulata, B. triquetrum y C. isthmocladum que se observaron en la la temporada 2016-
2017 (octubre-enero), concuerdan con las características tropicales del litoral yucateco
y son consideradas especies comunes en los arribazones.
Especies como H. floresii y B. triquetrum han sido reportadas como constituyentes de
arribazones en Yucatán y con alta presencia en la zona de Sisal (Rosado et al., 2011;
Ortegón y Aguilar, 2014) en este trabajo fueron componentes principales de los
arribazones.
En este estudio se reporta que el extracto crudo acuoso de H. floresii presentó
actividad fungicida contra conidios de P. fijiensis a las concentraciones 27.57 y 13.72
mg/mL, siendo estas concentraciones más bajas que las reportadas para extractos
acuosos de Sargassum polycystum y Sargassum tenerrimum, quienes fueron activos
contra Aspergillus niger a 100 mg/mL y 500 mg/mL, respectivamente (Kausalya y
Narasimba, 2015).
Las concentraciones en las cuales los extractos crudos acuosos de macroalgas
marinas presentan alguna actividad antifúngica en general es alta, cabe mencionar
que puede depender de la especie evaluada, método de extracción o el bioensayo
utilizado, adémas las características fisicoquímicas del agua que permiten la disolución
Capítulo II
61
de una amplia variedad de compuestos hidrofílicos como por ejemplo proteínas,
azúcares, taninos, saponinas y sustancias glicosiladas, entre otras, hacen difícil definir
el principio activo del extracto. Aunque en general los componentes mayoritarios
reflejan las características biofísicas y biológicas de los extractos evaluados (Bakkali et
al., 2008).
En el presente trabajo se observó actividad antifúngica en el extracto crudo acuoso y
ausencia de ésta en las fracciones orgánicas de H. floresii. Contrariamente se ha
reportado que el extracto etanólico de Sargassum polycystum ha presentado actividad
antifúngica contra Aspergillus niger y Rhizophus stolonifer a 100 mg/mL (Ambika y
Sujatha, 2015; Kausalya y Narasimba, 2015). La variación depende de la mayor
riqueza de compuestos extraídos por el disolvente utilizado, ya que compuestos
lipofílicos, glicolípidos, terpenoides fenólicos y otros, tienden a ser más solubles en
disolventes órganicos como el etanol y metanol que en agua (Dressman y Reppas,
2000; Ghanem et al., 1992) e incluso tiene un mayor potencial de presentar
propiedades antibacterianas y antifúngicas (El-Baky et al., 2008).
La cromatografía líquida de alta resolución es una técnica que permite la separación y
análisis de compuestos presentes en una muestra mediante el uso de un equipo
especializado. En el presente trabajo se reporta un perfil cromatográfico mediante
CLAR y CCD del extracto crudo acuoso de H. floresii, en el cual se observan picos y
bandas que posiblemente correspondan a pigmentos como clorofilas o carotenoides
ya que estos son solubles en disolventes orgánicos de media y alta polaridad, son
fáciles de extraer y su intensa absorción permite su detección a concentraciones muy
bajas (Garrido y Zapata, 1999). Para identificar los componentes de manera más
precisa en una muestra acuosa como es el caso del extracto de H.floresii es posible
realizar un análisis utilizando un equipo de cromatografía liquida de alta resolución con
un detector de arreglo de diodos y posteriormente un análisis de ionización en
electrospray en tándem con espectrometría de masas (HPLC-PDA-(–)ESI-MS/MS por
su siglas en inglés) (Tang et al., 2011).
Mediante el método colorimétrico Alamar Blue (AB) se verificó que el extracto de H.
floresii provocó la muerte de las conidios de P. fijiensis en un 58.64%, esto indica que
el extracto es fungicida sobre P. fijiensis confirmando los resultados en los bioensayos.
Este método ha sido utilizado exitosamente para determinar la viabilidad de hongos
filamentosos como Aspergillus spp., Fusarium spp. y Scedosporium spp. (Carrillo et
Capítulo II
62
al., 2006). También se han evaluado los efectos de ciertos fungicidas sobre el hongo
C. gloeosporioides donde los porcentajes relativos de inhibición son dependientes de
la concentración y tipo de compuesto (Rampersad y Teelucksingh, 2012). El método
de Alamar Blue es confiable para cuantificar la viabilidad de los conidios de P. fijiensis
expuestos al ECA de H. floresii.
En el presente trabajo, se observó una variación en la actividad antifúngica de los
extractos acuosos de H. floresii en muestras de dos colectas, lo que indica que
probablemente se deba a las condiciones ambientales como temperatura del agua,
salinidad, radiación solar, fenología de la especie o variación biogeográfica, ya que al
ser obtenida de arribazones se desconoce la procedencia de la especie, así como su
edad. Se han reportado variaciones en la composición de ácidos grasos en H. floresii
obtenida de las costas de Yucatán (Godínez et al., 2012). Asimismo, la actividad
antifúngica de extractos acuosos de Gracillaria chilensis (alga roja), contra
fitopatógenos como Phytophthora cinnamomi causante de la enfermedad llamada
“tinta del castaño” mostró dependencia de la dosis y temporada (Jiménez et al., 2011).
En otras especies de macroalgas, la actividad biológica de Laminaria sp, Codium sp,
Chondrus crispus y Ascophyllum nodosum contra Staphylococcus aureus fue
dependiente de la época del año (Hornsey y Hide, 1976).
También se ha observado que en algunas especies (e.g.Gracilaria blodgettii) se
producen variaciones en la cantidad de determinados metabolitos, en periodos cortos
(González et al., 2003); existe evidencia de que las algas marinas presentan variación
en concentración de determinados compuestos y que se relaciona con las zonas
biogeográficas en las que habitan (Steinberg, 1989). Al igual, compuestos
estructurales como el agar-agar obtenido del género Gracilaria son afectados en su
cantidad, calidad y fuerza por la condiciones ambientales (Marinho-Soriano y Bourret,
2003).
Los estudios antes mencionados podrían explicar que las muestras evaluadas de los
ECA’s de H. floresii presentaran variación en su actividad, esto es, que sólo el extracto
de la primera colecta tuviera actividad antifúngica aunque la diferencia de la fecha de
colectas fue de un mes.
Algunos autores mencionan que los elementos activos de algunas especies de
macroalgas marinas se producen o acumulan durante la época de lluvias mostrando
un aumento de la efectividad de diversos extractos (Jiménez et al., 2011). Incluso
Capítulo II
63
estos autores mencionan variaciones de compuestos relacionados a la edad de las
estructuras de las macroalgas, observando que en tejidos viejos se presentan mayor
concentraciones de metabolitos de defensa que propician que sean menos
susceptibles a ser consumidos por herbívoros (Cronin y Hay, 1996).
En este estudio se reporta por primera vez la inocuidad (CL50 > 27,750 µg/mL) del
extracto acuoso de H. floresii en Eisenia foetida, lombriz de tierra. Se han realizado
estudios sobre los efectos de extractos acuosos de macroalgas marinas en especies
de lombrices como Eudrilus eugeniae, que también resultaron ser inocuos (Karthick et
al., 2013). Al igual, el extracto acuoso de H. floresii mostró una concentración letal
media de CL50 > 27,750 µg/mL en Artemia salina, lo que confirma la inocuidad del ECA
de esta especie. La toxicidad de extractos orgánicos de H. floresii contra Artemia salina
ha sido reportada previamente con una CL50 > 1000 µg/mL (Freile-Pelegrín, 2008). En
resumen, el ECA de H. floresii fue inocuo contra A. salina y E. foetida, siendo un factor
a favor para su potencial uso agrícola e incluso como alimento o para la elaboración
de cósmeticos.
Diversos estudios se han realizado con H. floresii para evaluar actividad
anticoagulante (Gurgel-Rodrigues et al., 2011), aglutinante de eritrocitos (Chiles y Bird,
1989), antibacterial sobre Staphyloccocus aureus y Bacillus subtilis y actividad
antioxidante de extractos diclometano:metanol (Zubia et al., 2007). Se han reportado
metabolitos de naturaleza monoterpenica como por ejemplo, el terpeno loliólido que se
ha encontrado con una concentración media de 0.14 mg/g-1 (Percot et al., 2008).
Se han obtenido compuestos como el halymeniaol que presentó actividad inhibitoria
contra la malaria (Plasmodium falciparum cepa 3D7 resistente a la cloroquina)
(Meesala et al., 2017). También se ha evaluado su uso en la alimentación de moluscos
como Strombus pugilis (Sánchez et al., 2016), su cultivo para obtención de
carragenina (Robledo y Freile-Pelegrín, 2011) y la caracterización de ésta (Freile-
Pelegrín et al., 2011); la composición estacional de ácidos grasos (Godínez-Ortega et
al., 2012) y se ha reportado que la ingesta de polisacáridos sulfatados presentes en
esta especie favorece la movilidad gastrointestinal en ratas (Graça et al., 2011).
En cuanto a propiedad intelectual, se ha patentado una formulación líquida de proteína
y lambda carragenina para su uso como bebida (Sewall et al., 2011), la dosificación
sólida y liberación controlada de compuestos farmacéuticos, veterinarios y
nutracéuticos (e.g. analgésicos, antihistaminícos, antiepilépticos, antiinflamatorio,
Capítulo II
64
antibióticos, sedativos) usando lambda carragenina de Halymeniales (Sewall et al.,
2013) y su uso como bioabsorbente (Paul et al., 2014).
En este trabajo se hace hincapié en el posible uso agrobiotecnólogico del extracto
crudo acuoso de H. floresii debido a su potencial actividad antifúngica, a su
abundancia en la región y a su fácil acceso, cabe mencionar que es necesario evaluar
otras actividades biólogicas (e.g. antibacteriana, antiprotozoaria, antiviral y
antifúngica).
La concentración minima con actividad antifúngica in vitro del extracto crudo acuoso
de H. floresii contra P. fijiensis fue de 13.72 mg/mL. Es difícil comparar el extracto
evaluado con los biofungicidas comerciales ya que presentan principios activos
diferentes, asi como presentar actividades biológicas a diferentes concentraciones. En
el mercado existen varios biofungicidas como Fungi Free® elaborado con la bacteria
Bacillus subtilis con una dosis recomendada a la concentracion de 2mg/mL,
Natucontrol® elaborado con el hongo Trichoderma harzianum con una dosis
recomendada a la concentracion de 25mg/mL, Biogober® elaborado con extractos de
Ricinus communis y Larrea tridentata con una dosis recomendada de 1 a 1.5 L/Ha y/o
3 a 8 mL/L y Timorex gold® elaborado con la planta Melaleuca alternifolia con una
dosis recomendada contra P. fijiensis de 1.5 L/Ha aplicado de manera foliar. Cabe
mencionar que no hay productos antifúngicos agrícolas en el mercado elaborados a
partir de compuestos extraídos de macroalgas marinas, siendo un nicho de
oportunidad a desarrollar.
La actividad antifúngica de macroalgas marinas contra patógenos de cultivos agrícolas
se ha reportado desde el siglo XX, atribuyéndosela a metabolitos secundarios,
acuosos y proteicos. Existen pocos estudios que evalúan la actividad antifúngica de
compuestos proteicos provenientes de macroalgas marinas, aunque puede ser una
oportunidad de estudio ya que las macroalgas marinas en general son ricas en
proteínas con porcentajes en peso seco de 25 a 35% (Khanzada et al., 2007).
Se observó actividad fungicida en el ECA y la parte proteica del ECA contra conidios
de P. fijiensis, lo que indicaría que el origen del compuesto o compuestos activos
pudiera ser de origen proteico. Se han reportado extractos de macroalgas marinas con
actividad antifúngica que puede tener origen orgánico (El Shafay et al., 2016) o
proteico (Melo et al., 1997). Sin embargo, aún faltan evidencias que pudieran indicar
cuál es el origen del principio activo del ECA de H. floressi contra P. fijiensis, así como
Capítulo II
65
descartar la presencia de metabolitos residuales en la parte proteica del ECA de H.
floresii. Independientemente de esto, es importante mencionar que existen reportes de
actividad antifúngica de la parte proteica de otra macroalga roja, Hypnea musciformis,
contra Colletotrichum lindemunthianum atribuyéndose tal actividad a las aglutininas
(Melo et al., 1997), debido a que su mecanismo de acción antifúngica es probable que
sea similar a las aglutininas de trigo, esto es, que inhiban la síntesis de quitina
(Mirelman et al., 1975).
Las diferencias observadas en los perfiles proteicos de las muestras de las colectas de
H. floresii, pueden deberse a factores mencionados anteriormente como ambientales,
edad de los organismos y procedencia biogeográfica.
Reportes sugieren que complejos proteínas-polisacáridos como los proteoglicanos o
lectinas, pueden tener actividades biológicas (antivirales, anticoagulante, antifúngica) y
es posible que el origen de la actividad inhibitoria observada en H. floresii contra
conidios de P. fijiensis sea originada por alguno de estos compuestos, cabe mencionar
que para confirmar dicha aseveración es necesario realizar diversos estudios como
aislamientos de compuestos de naturaleza proteica mediante cromatográfia de
exclusión molecular o extracción de polisacáridos sulfatados con un alto porcentaje de
proteínas y evaluar individualmente la actividad antifúngica. Al igual, es recomendable
estudiar con más detalle las características fisicoquímicas del ECA de H. floresii
colectada de los arribazones y descartar que la actividad antifúngica observada contra
P. fijiensis sea ocasionada por contaminantes como metales pesados o pesticidas.
Para identificar el compuesto responsable de la actividad antifúngica de la parte
proteica del extracto crudo acuoso de H. floresii se podría utilizar una técnica como la
cromatografia líquida de exclusión molecular por ser de alta resolución y fácil
cuantificación (revisado por Benítez et al., 2008).
Las macroalgas marinas de arribazones son una fuente de compuestos prometedores,
de fácil acceso y abundantes. Fungicidas naturales desarrollados a partir de
macroalgas marinas, de baja toxicidad y eficientes, serían una alternativa a los
fungicidas sintéticos.
Capítulo III
66
CAPÍTULO IV
3. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
3.1. CONCLUSIONES
El ECA de Halymenia floresii colectada de un arribazón en el mes de octubre
del 2016 presentó actividad antifúngica in vitro contra P. fijiensis a las
concentraciones 27.27 mg/mL y 13.72 mg/mL.
El origen de la actividad antifúngica de H. floresii es de naturaleza proteica.
En la búsqueda de extractos de baja toxicidad y con actividad antifúngica, el
ECA de H. floresii es inocuo para Artemia salina y Eisenia foetida.
Las macroalgas marinas de arribazones son una alternativa sustentable, barata
y de fácil acceso para la investigación y el desarrollo de productos
biotecnológicos.
Capítulo III
67
3.2. PERSPECTIVAS Y RECOMENDACIONES
Para confirmar la actividad antifúngica del ECA y parte proteica del ECA de H.
floresii que se observó en este trabajo se recomienda colectar organismos de
arribazones de diferentes temporadas.
Para determinar si la especie es candidata a una explotación sustentable, se
recomienda evaluar la biomasa presente de H. floresii en los arribazones.
Se recomienda comparar la presencia o ausencia de la actividad inhibitoria en
los ECA’s de organismos de H. floresii colectados in situ durante varias
temporadas del año, determinando edad y condiciones ambientales donde se
desarrollan.
Profundizar en la identificación de los componentes proteicos de H. floresii para
detectar el principio activo (proteína o complejo proteína-polisacárido).
Los polisacáridos sulfatados presentan actividades biológicas interesantes, por
lo cual se recomienda extraerlos de H. floresii, cuantificar su porcentaje de
proteínas y evaluar su posible actividad antifúngica.
La actividad antifúngica observada en este estudio fue evaluada sólo contra
tres hongos fitopatógenos, por lo cual se recomienda evaluar la actividad
contra otros hongos fitopatógenos que afectan cultivos de importancia
comercial.
Para un mayor conocimiento sobre las características de los ECA’s y proteínas
de H. floresii y su potencial aprovechamiento se recomienda evaluar otras
actividades biológicas de H. floresii, como antibacteriana, antiviral y
antioxidante.
Las macroalgas de arribazón presentan actividades biológicas prometedoras,
por lo cual tienen potencial de ser aprovechadas para fines biotecnológicos.
El uso de las macroalgas de arribazones para fines biotecnológicos permitiría
disminuir los problemas causados por estos fenómenos a la población que vive
del turismo, además de desarrollar productos ecoamigables y con bajo impacto
ambiental.
Capítulo III
68
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Capítulo III
85
4.4 ANEXOS
Anexo 1. Tabla de conversión de Fuerza (g) a Revoluciones por minuto (rpm)
(Tech tip#40 Thermo scientific Convert between times gravity (×g)
and centrifuge rotor speed (RPM)
Fuente: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/TR0040-
Centrifuge-speed.pdf .
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