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INTERPRETACION DE DATOS DE ELISA Y ESTABLECIMIENTO DEL RANGO POSITIVO Y NEGATIVO EN EL DIAGNOSTICO DEL VIRUS TRISTEZA DE LOS ClTRlCOS (VTC) EN MUESTRAS COMPUESTAS. ISAURA~OBLEDO CASTRO ASESORES: DR. DANIEL TELlZ ORTIZ M. en C. MARTIN VALENCIA ACEVES
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INTERPRETACION DE DATOS DE ELISA Y ESTABLECIMIENTO
DEL RANGO POSITIVO Y NEGATIVO EN EL DIAGNOSTICO
DEL VIRUS TRISTEZA DE LOS ClTRlCOS (VTC) EN
MUESTRAS COMPUESTAS.
ISAURA~OBLEDO CASTRO
ASESORES:
DR. DANIEL TELlZ ORTIZ M. en C. MARTIN VALENCIA ACEVES
U ' 25813 ~
INTRODUCCION Y ANTECEDENTES
El desarrollo de las vías de comunicación y el aumento en la rapidez de los medios de transporte, ha conducido a la facilitación del comercio nacional e internacional de vegetales y sus productos, pero al mismo tiempo se han incrementado las oportunidades para la diseminación de plagas.
Por otra parte, debido al cambio de la Política Económica Nacional en el marco de la apertura comercial, estamos sometidos a una competencia intensa con sistemas productivos, que buscan eficiencia y apertura de nuevos mercados. Asimismo, se debe considerar que los recursos disponibles requieren la participación de los sectores interesados en la Industria, Universidades e Institutos de Investigación Agrícola, para asumir sus responsabilidades fitosanitarias, creando una interacción positiva que le dé independencia y autonomía en cada uno de los niveles operativos y que se integre bajo la normatividad y supervisión de las áreas competentes.
Ante esta necesaria apertura comercial, el riesgo de diseminación de plagas es mayor, tal es el caso del Virus Tristeza de los Cítricos (VTC); el cual se encuentra distribuido en casi todas las zonas citrícolas del mundo, por lo que existe un alto riesgo fitosanitario en el intercambio de material vegetal de cítricos.
Importancia de la citricultura.
La industria cítricola de México además de proporcionar fruta para consumo local y para exportación, representa un importante apoyo para la economía del país, proporcionando fuente de divisas y de empleo para una gran parte de la población mexicana. Para 1992, México contaba con una superficie total de más de 300 mil ha dedicadas al cultivo de los cítricos, las cuales proporcionan una producción anual promedio estimada en 3.5 millones de toneladas.
La naranja, toronja y mandarina se cultivan principalmente m los estados de Veracruz, San Luis Potosí, Tamaulipas y Nuevo León. Estas especies representan alrededor del 80% de la producción total de cítricos del país.
Otros estados con áreas en incremento en el cultivo de los cítricos, principalmente naranja, son: Sonora, Sinaloa, Jalisco, Quintana Roo, Yucatán, Tabasco, Oaxaca y Guerrero (Rocha-Peña Mario A. y Peña del Río Ma. de los Angeles 1992).
Características del Virus Tristeza de los Cítricos (VTC).
EL VTC pertenece al grupo de los Closterovirus, posee partículas en forma de filamentos flexibles que miden 11 X 2000 nanometros (nm), las partículas contienen un sólo cordón de ácido ribonucleico (ARN) como material genético. Presenta agregados de partículas, llamados inclusiones, que a menudo se encuentran en el parénquima o en la células adyacentes a los haces vasculares del floema, ya que dicho virus sólo se encuentra en estos tejidos
Transmisión.
Este virus se difunde naturalmente por insectos; el más importante de ellos es el áfido café Toxopfera citricidus, que es considerado como el vector más eficiente del VTC. El áfido probablemente es nativo de China y actualmente se encuentra distribuido en una gran cantidad de regiones citrícolas del mundo. Aunque es considerado como una especie tropical, el áfido existe en los lugares fríos del Japón, en el sur del desierto del Sahara, en la India, Ceylán, en las regiones áridas de Africa del sur, Australia, y Nueva Zelanda, así como en todos los países del oriente; donde es también, considerado como una plaga de consideración para el cultivo de los cítricos.
Otras especies asociadas a la transmisión del VTC son: Toxopfera auranfii, Aphis gOSSYPk A. spiracola, Myzus persicae.
Fawel y Wallace 1946, fueron los que por primera vez descubrieron su naturaleza viral al demostrar que era transmisible por injerto de corteza, con yemas o brotes y tejidos de hojas. Lo cual es utilizado para realizar ensayos experimentales. Desde 1957, Mc cleam, reporta que el VTC no se transmite por semilla.
Sintomatología.
La enfermedad llamada Tristeza de los cítricos, afecta prácticamente a todos los tipos de cítricos, pero principalmente al naranjo dulce, toronja, naranjo agrio y mandarina. Este virus produce efectos letales; al iniciarse la enfermedad, las hojas normalmente de color verde intenso se torna cloróticas, coriáceas, con la nervadura central prominente. La brotación se detiene, las raícillas de la periferia mueren y conforme avanza la muerte de raíces, la brotación se detiene, el follaje se ralea y la planta toma un aspecto triste, seguido de un decaimiento general, razón por la cual los autores brasileños la denominaron "Tristeza". En ese estado las plantas florecen muy intensamente, pero se forman muy pocas frutas, que no alcanzan su tamaño normal. En estados más avanzados las hojas caen, las ramas mueren y la parte aérea se va secando, sólo se produce alguna brotación en las ramitas primarias en el tronco, hasta que finalmente la planta se seca. Esto ocurre en un lapso de tres a cinco años; según la variedad o raza del virus, existen casos de marchitamiento y muerte casi instantánea, entonces la planta queda con sus hojas y frutos secos.
Por otra parte, se supone que la destrucción de las raíces del naranjo agrio se vincula con la acción de toxinas elaboradas por las hojas del naranjo dulce en presencia del virus, esas toxinas son letales para las raíces del naranjo agrio, esta enfermedad viral tiene gran difusión en el mundo entero y a través de los tiempos ha recibido distintos nombres, los mas importantes:
“Incompatibilidad” en Africa. “Podredumbre de las raicillas” en Argentina. “Podridao das raicelas” en Brasil. “Tristeza” en Brasil y Florida.
La tristeza es una de las enfermedades más destructivas de los cítricos, y es de distribución mundial; hasta ahora es considerada como una de las enfermedades de mayor importancia económica en el cultivo de los cítricos (Bar-Joseph and Lee,1989; Bar-Joseph et al, 1983,1989).
Distribución del VTC.
Para 1992, la FA0 reporta la presencia del VTC en Argentina, Brasil, Colombia, Perú, Uruguay, Venezuela, Estados Unidos, Islas Hawai, Jamaica, Filipinas, Formosa, China, Japón, India, Ceylán, La Cuenca del Mediterráneo (España, Italia, Israel, Egipto), Africa, Cuba. Para el caso de México y Centro América y algunos países del Mediterráneo, donde la enfermedad aun no se presenta, se encuentran amenazados, por la llegada de esta plaga, ya sea a través de material propagativo o su vector (Toxopfera cifricidus). Asimismo, el VTC presenta alrededor de 18 variantes, las cuales producen diferentes síntomas en sus hospederos, por lo que es considerada como una de las enfermedades vírales de mayor importancia económica en el cultivo de los cítricos (Bar-Joseh, M. and Lee, RF., 1989).
Métodos de Diagnóstico.
Para conocer si el VTC se encuentra presente en alguna planta, se pueden utilizar los métodos convencionales de diagnóstico, tales como; plantas diferenciales, injerto y microscopia electrónica. Sin embargo, dentro de estos métodos, destaca el diagnóstico serológico ELISA (Inmuno Absorbencia con Enzimas Conjugadas), que mediante el uso de un antígeno, que se depositan en una placa, se puede identificar la presencia del VTC.
El nivel de absorbancia se obtiene en nanómetros, que se genera al conjuntar el antígeno del virus con los anticuerpos de la planta y que se refleja por la presencia de una tonalidad de color amarillo o verde, lo cual permite determinar visualmente la presencia del virus. Sin embargo, no se tiene el grado de incidencia, este se obtiene al analizar estadísticamente los resultados.
La aplicación estadística que se da a los resultados de absorbancia, que se obtienen al conjuntar el antígeno y el anticuerpo, es la desviación estándar.
El grado en que los datos numéricos tienden a extenderse, alrededor de un valor medio, se le llama variación, tales como: el rango, la media y la desviación estándar.
Si se requiere una expresión más formal de la estimación y su variación, se puede obtener una estimación por intervalo, que es una estimación del parámetro por intervalo al azar, llamado intervalo de confianza.
Para mayor claridad, supongamos que el parámetro a estimar por intervalo de confianza es la media muestral; se conoce que la distribución muestral de la media es aproximadamente normal por el teorema del límite central y que dice:
a) El 68% de los casos están comprendidos entre X-S y X+S (es decir, el valor de la desviación estándar a ambos lados de la media).
b) El 95.45% de los casos están comprendidos entre X-2s Y X+2S.(es decir, el doble del valor de la desviación estándar a ambos lados de la media).
c) El 99.73% de los casos están comprendidos entre X-3s Y X+3S.(es decir el triple del valor de la desviación estándar a ambos lados de la media).
Como se indica:
La desviación estándar se define como la raíz cuadrada positiva de la varianza. Así la desviación estándar viene dada por la varianza de un conjunto de datos, que se define como el cuadrado de la desviación estándar (S).
El uso de histogramas, facilita visualizar los valores de la distribución de frecuencias en ELISA, es el dibujo de número de observaciones, es la representación por unidades de áreas sobre un eje, se elige un intervalo conveniente de unidades de absorbancia, se cuentan los puntos que caen dentro de cada intervalo y se gráfica la distribución de frecuencias de la población de cítricos
Aunque se considera, al método serológico ELISA de uso común, existen diferencias con respecto al análisis de los resultados estadísticamente. Bajo este esquema, se plantearon los siguientes objetivos:
U OBJETIVOS
1. Estandarizar un método estadístico para determinar el rango positivo- negativo (plantas sanas-enferma), en virus Tristeza de los cítricos VTC (muestras compuestas).
2. Estandarizar criterios en la determinación del rango positivo-negativo válidos en cualquier laboratorio en donde se realice el diagnóstico del virus tristeza de los cítricos (VTC), mediante la técnica ELISA (muestras compuestas).
I MATERIALES Y METODOS
Este trabajo se dividió en dos etapas:
1.- Muestre0 en campo:
Selección al azar de plantaciones de cítricos comerciales y viveros productores, en cuatro estados de la República Mexicana, como se indica en el CUADRO 1 y FIGURA 1.
CUADRO 1. LUGARES MUESTREADOS Y MUESTRA COLECTADA POR ESTADO
ESTADO LUGARES MUESTREADOS (DE- PLANTACIONES Y VIVEROS) COLECTADAS
NUEVO LEON
480 30 COLIMA 580 29 SONORA 400 20 TAMAU L I PAS 740 37
I I c.7 1 3 / I TAMAU L I PAS
I . . 20 400 29
480 30 COLIMA 580
1 I
TOTAL 2200 110
El método estadístico de muestre0 fue el de tipo “ W , con tamaño de una muestra compuesta de 3 brotes tiernos, de 5 árboles diferentes para una hectárea.
La toma de muestras fue de brotes tiernos, retirados del árbol mediante un corte con tijeras de podar, la cual se limpiaba con hipoclorito de sodio, después de cada corte.
Las muestras se identificaron con región, vivero, propietario y árbol, y fueron trasladadas en cajas refrigerantes, para mantenerlas frescas.
2.- Trabajo de laboratorio:
El trabajo de laboratorio se llevó a cabo en el Centro Nacional de Referencia de Diagnóstico Fitosanitario, área de virología, laboratorio de serología, de la Dirección General de Sanidad Vegetal.
Procesado de muestras:
Las muestras de cítricos se analizaron mediante la técnica serológica ELISA, para esto se requiere de la savia de los cítricos y cinco diferentes soluciones:
0 buffer de lavado, (buffer PBST). O buffer de extracción O buffer de solución del sustrato PNP O buffer de cubrimiento O buffer Reactivo [A]
Es importante durante el proceso respetar el tiempo, orden y cantidad de la aplicación de los diferentes tipos de soluciones (buffer); asi mismo, al realizar la lectura mediante el lector de (ELISA) calibrar a 405 nm, para tener un registro de una buena lectura.
Descripción de la técnica ELISA
La Técnica ELEA esta basada en la capacidad de los virus parásitos de vegetales de producir anticuerpos en animales de laboratorio y la especificidad de sus reacciones antígeno-anticuerpo, hacen que esta técnica sea prácticamente obligatoria, con el objeto de lograr la identificación de un determinado virus.
La técnica más utilizada en virología vegetal, es la reacción de precipitación. Esta se basa en el hecho de que los antígenos víricos vegetales son polivalentes, o sea que cada partícula puede combinarse con varias del anticuerpo según el tamaño de la partícula antígena. De este modo se forman estructuras reticuladas que crecen hasta hacerse visibles en forma de un precipitado.
El antisuero se obtiene preferentemente de conejos y ratones o caballos, según el volumen que se necesite. La inyección del antígeno se efectúa según los casos, por vía endovenosa, intramuscular o intraperitoneal. Este antígeno es conveniente que sea minuciosamente purificado, porque de emplearse el jugo vegetal como se extrae, se corre el riesgo de incorporar una considerable cantidad de proteínas vegetales, como resto de células, cloroplastos etc. Por otra parte, con el virus purificado y por lo tanto más concentrado se requiere de una inyección con una cantidad menor. La purificación parcial del antígeno puede ser efectuada por diferentes medios.
Diagrama de flujo, para la Técnica Serológica ELISA (APENDICE 1)
1.
2.
3.
4.-
5.-
Adición del primer anticuerpo- policlonal. La placa de poliestireno (Fase sólida) se cubre con el antisuero, se prepara en unadisolución de I : 10,000 del antisuero (cabra anti VTC) en solución amortiguadora (buffer) de cobertura de carbonatos a pH = 6.9
Incubar 4 hrs. a temperatura de 37OC, o durante toda la noche a 4OC
Lavar la placa *
Preparación y adición de muestras a las placas. Extraer la muestra (macerar) en buffer de extracción en una relación de (1 :20) peso/vol, a pH= 7.4 agregar 200 ul en cada pozo del extracto vegetal.
Incubar 16 hrs. a temperatura de 37OC
Lavar la placa *
Adición de anticuerpo secundario monoclonal, ratón anti VTC en buffer reactivo [A] en 1 : 1 O 0 0 agregar 200 ul a cada pozo.
Incubar 2 hrs. en cámara húmeda a temperara de 37°C.
Lavar la placa *
Adición del conjugado( antisuero-enzima). Adición de enzima conjugada anti ratón IgG, diluir el conjugado del antisuero y la enzima fosfatasa alcalina en el buffer reactivo [A], agregar 200 ul en cada pozo.
Incubar 1 hr. a temperatura de 37OC.
Lavar la placa *
Adición del sustrato. Sustrato preparar el PNP (p-nitrofenil fosfato) en solución para disolver el DTA (dietanolamina), en 1 mg/ml.
30-60 minutos en medio obscuro a temperatura de 37OC.
Evaluación visual (coloración amarilla)
Lectura fotométrica (405 nm por el lector de ELISA)
Los valores de la placa registrada por el lector ELISA a 405 nm, es debido a que se obtiene una coloración amarilla en las muestras positivas, al efectuarse la reacción de la fosfatasa alcalina con el sustrato.
* Proceso de lavado de placas:
Este proceso consiste en agregar buffer de lavado (PBS-T) a la placa, esperar apróximadamente 5 segundos y voltear la caja mediante un movimiento brusco sobre un papael secante, teniendo cuidado de que al levantar la placa esta no escurra líquido. Esta acción se recomienda que se repita otras dos veces más, siendo en total tres lavados entre cada fase de aplicación de los diferentes reactivos, de acuerdo al esquema señalado.
La evaluación se realizó en 148 muestras compuestas, provenientes del estado de Nuevo León, 80 de Tamaulipas, 116 de Sonora y 96 de Colima. Lo cual da un total de 440 muestras compuestas.
En relación a la placa en base para llevar a cabo la técnica ELISA, se pueden analizar 45 muestras, ya sea simples o compuestas con una repetición y sus tres testigos (buffer, testigos positivo y negativo). En este estudio en cada pozo de la placa de ELISA se colocaron muestras compuestas de 5 árboles diferentes. De esta forma se analizaron 2250 muestras en total, bajo este esquema:
PARA UNA PLACA PARA 50 PLACAS 45 No. de pozos por placa 45 No, de pozos por placa
En cada pozo se analizan 5 muestras Placas de ELISA de cítricos
testigos total + testigos 225 Muestras compuestas analizadas en total + 2250 Muestras compuestas analizadas en
Estandarización del método de (ELISA).
Mediante fórmulas estadísticas y gráficas, los datos reportados por el lector de ELISA calibrado a 405 nm., se obtuvo el criterio de evaluación, con respecto a muestras positivas (Plantas enfermas) 0 muestras negativas (plantas sanas) en cítricos en la detección del VTC.
ESQUEMA DE UNA PLACA ELISA
1 12 11 10 9 8 7 6 3 4 5 2 A 6 5 4 3 2 1 6 5 3 4 2 1 ..
l B I I I I I I I I I I a ~
7 1 81 91 101 111 121 71 81 91 101 11 I 12 I
lado izquierdo muetras (a) lado derecho muestras (b) t""""""""""""""""""""""""""" + t"""""""""""""""""""""" +
El lado izquierdo corresponde a las muestra compuestas del tipo "a" (pozo 1- 45), más testigos (buffer, planta con W C y planta sana).
El lado derecho corresponde a las muestras compuestas del tipo "b"(repetición de los pozos 1- 45 ), más testigos (buffer, planta con VTC y planta sana).
RESULTADOS DEL ANALISIS SEROLOGIC0 ELSA A PLANTAS DE ClTRlCOS CONTRA EL VIRUS TRISTEZA DE LOS ClTRlCOS EN MUESTRAS COMPUESTAS DEL
ESTADO DE: NUEVO LEON
LOCALIDAD
4LLENDE., N.L
ZADEREYTA. 1.L.
RANCHO
ESTEBAN GARCIA
RAMON CAVAZOS
ROGELIO SALAZAR
EL CERRITO
SAN MIGUELITO
LA HACIENDITA A
CADEREYTA AGUIRRE
SAN PEDRO
EJIDO DE LA HACIENDITA B
a l a2 b l b2
a l a2 b l b2
a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2
No. DE MUESTRA
1 2 3 4
5 6 7 8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36
RESULTADO DE ANALISIS
PLANTA SANA: 0.0255 nm. PLANTA C M C : 0.1332 nm.
0.0018 0.0014 0.0018 0.0005
0.001 5 0.0033 0.0006 0.0008
0.0007 0.0000 0.0001 0.0007 0.0006 O. 0003 0.0008 0.0004 0.0010 0.0007 0.0002 0.0007 0.0007 0.0001 O. 0007 0.001 o 0.0009 0.0001 0.0029 0.0024 0.0002 0.0006 0.0013 0.0007 0.0016 0.0000 0.0006 0.0003
ANAL ESTADI
X = MEDIA
-
0.001 37
0.001 55
0.00037
0.00052
0.00065
O. 00062
0.00157
0.0007
O. 00062
;Is S=DESV.
EST.
r tco
0.00061
0.00122
0.00037
0.00022
0.00033
0.00037
0.00129
0.00045
0.00069
LOCALIDAD
MONTE MORELOS
RANCHO
TEODORO RDZ.
PEDRO VAQUERO
ELENA GOMEZ
ANGELINA WELSH
EMILIO LEON
JUAN CARDENAS
HDTA. LA CARLOTA
VIVERO MANUEL MARROQUIN
VIVERO JOSE LUIS DE LEON
VIVERO MANUEL MATA
ANALISIS MUESTRA - RESULTADO No. DE
MUESTRA DE ANALISIS PLANTA SANA: 0.0255 nm PLANTA C M C 0.1332 nm.
a l
0.0016 39 b l 0.0028 38 a2 0.0028 37
0.0030 47 b l 0.0016 46 a2 0.0025 45 a l 0.001 9 44 b2 0.0024 43 b l 0.0030 42 a2 0.0017 41 a l 0.0016 40 b2
b2
0.0032 50 a2 0.0033 49 a l 0.0028 48
0.0031 55 b l 0.0036 54 a2 0.0021 53 a l 0.0001 52 b2 0.0012 51 b l
b2 0.0006 57 a l 0.0033 56
0.0008 b l 58 1 0.0006 b2
0.0033 61 a l 0.0013 60
a2 b l
O. 0024 62
0.0280 76 b2 0.0280 75 b l 0.0260 74 a2 0.0260 73 a l 0.0020 72 b2 0.0027 71 b l 0.0032 70 a2 0.0028 69 a l 0.0009 68 b2 0.0009 67 b l 0.0019 66 a2 0.001 9 65 a l 0.0009 64 b2 0.0012 63
ESTADI: X =
MEDIA
0.0022
-
0.00225
0.00247
0.00195
0.00302
0.00082
0.00195
0.0014
0.00267
0027
tic0 S=DESV. EST.
0.00069
0.00058
0.00061
0.00156
0.00065
0.00033
0.001 10
0.00057
O. 00049
0.001 15
LOCALIDAD
3ENERAL TERAN
HUERTO SOLEDAD DE LA MATA
LA PURlSlMA C
a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 84
LA PURlSlMA a l 85 D 86
b2 88 JESUS a l 89 MARIA 90
b2 92 OSWALDO a l 93
VILLANUEVA I b l I 95 a2 94
b2 96 HECTOR E. a l 97 GARCIA 98
b2 1 O 0 DOLORES E. a l 1 o1 PEÑA
~.
I E: 1 103 102
b2 104 QUINTANILL a l 105 A DOLORES a2 106 R b l 107
b2 108
RESULTADO DE ANALISIS
'CANTA SANA: 0.0255 nm. 'CANTA WVTC: 0.1 332 nm.
0.001 5 0.0020 0.0021 0.001 3 0.0001 0.0006 0.0003 0.0005 0.0003 0.0003 0.0001 O. 0004 0.0012 0.0005 0.001 3 0.0008 0.001 5 0.0005 0.0012 0.0019 0.001 1 0.0021 0.0012 0.0015 0.0012 0.001 1 0.0024 0.0014 0.0008 0.0005 0.0015 0.0005
ANALISIS ESTADI
M ED IA
0.00172
x=
0.00037
0.00027
0.00095
0.00127
0.00147
0.00152
0.00082
rlco S=DESV.
EST.
0.00038
0.00022
0.00012
0.00036
0.00059
O. 00045
0.00059
0.00047
LOCALIDAD
LINARES MONTERREY N.L.
RANCHO
LA CONCHA
LAS VEGAS
LA PARRITA
LA CHAPEÑA
LA PERLA
SAN JUAN DE DIOS Y LA CORONA
LA AMISTAD
LA CONTRA
LA GARZA
LA CATARINA
MUESTRA
a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b2 b3 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2
No. DE RESULTADO MUESTRA DE ANALISIS
PLANTA SANA: 0.0255 nm PLANTA CIVTC 0.1332 nm.
1 o9 110 111 112 113 114 115
0.0436 O. 0440 O. 0466 0.0433 0.0439 0.0426 0.0438
116 0.0433 117 0.0263 118 0.0271 119 0.0289 120 0.0294 121 0.0426 122 O. 0426 123 O. 042 1 124 0.0425 125 O. 042 1 126 0.0425 127 0.0430 128 0.0420 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139
0.0015 0.0016 0.0245 0.0006 0.0016 0.0020 0.0009 0.0005 0.0003 0.0007 0.0017
140 0.0003 141 0.0012 142 0.0004 143 I 0.0012 144 0.0003 145 0.001 8
0.0014 0.0018
148 0.0005
ESTADI! X =
MEDIA
-
0.04437
O. 0434
0.02792
0.04245
0.0424
0.00705
0.00125
0.00075
0.00077
0.00137
r tco S=DESV.
EST.
0.00151
0.00059
0.00146
0.00023
0.00045
0.01 164
0.00067
0.00066
0.00049
0.00061
RESULTADOS DEL ANALISIS SEROLOGIC0 ELSA A PLANTAS DE ClTRlCOS CONTRA EL VIRUS TRISTEZA DE LOS ClTRlCOS EN MUESTRAS COMPUESTAS DEL
ESTADO DE: TAMAULIPAS
RANCHO
HUERTO SAN CARLOS I
HUERTO SAN CARLOS II
HUERTO EL PRINCIPIO Y LA MAGNOLIA
EJIDO PLAN DE AYALA ClRlLO CASTILLO
EJIDO CRUZ MARGARITA GARCIA
HUERTO EX- HACIENDA EL CARACOL. J. SALAZAR PROP. MARIO ALANIS
HUERTA EX- HACIENSDA EL CARACOL M. ALANIS HUERTO SIN REGISTRO EX- HACIENDA EL CARACOL HUERTO LA PROVIDENCIA
a2 7 b l 6
20 b2 19 b l 18 a2 17 a l 16 b2 15 b l 14 a2 13 a l 12 b2 11 b l 10 a2 9 a l 8 b2
a l
24 b2 23 b l 22 a2 21
a l
28 b2 27 b l 26 a2 25
a l
a l 32 b2 31 b l 30 a2 29
40 b2 39 b l 38 a2 37 a l 36 b2 35 b l 34 a2 33 -
RESULTADO DE ANALISIS
PLANTA SANA: 0.0255 nm. PLANTA CIWC. 0.1332 nm.
0.01 10 0.0091 0.01 02 0.01 04 0.0096 0.0096 0.0095 0.0095 0.0085 0.0098 0.0102 0.0103 0.0099 0.0099 0.0093 0.0093 0.0090 0.0098 0.0101 0.0091 0.0099 0.0091 0.0098 0.0091 0.0095 0.0095 0.0105 0.0105 0.0106 0.0094 0.0106 0.0095 0.0096 0.0096 0.0094 0.0096 0.0098 0.0098 0.0140 0.0140
r ANALISIS ESTADISTICO
- X =
MEDIA
0.01 O 1 7
0.00955
0.0097
0.0096
0.0095
O. 00947
0.01
0.01 002
0.00955
0.01 19
S=DESV. EST.
0.00079
0.00005
0.00082
0.00034
0.00053
0.00043
0.00057
O. 00066
0.0001
0.00242
iUERTO SANTA ZECILIA
iUERTO rAMOQUlCHE
iUERTO 2OVADONGA
iUERTO LOS iUMUS
'ROP. MARIANO SANCHEZ L.
iUERTO CAPORAL ZD. SANTOS
iUERTO LOS qARANJOS
iUERT0 RANCHO ZHAPULTEPEC
iUERT0 SANTA 3ARBARA iUEHUETLAN
'ROP JESUS AARQUEZ V. iUICHIHUAYAN
a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2
41 0.0099 42 o. O099 43 O. 0088 44 0.0088 45 0.001 5 46 0.0009 47 0.0004 48 0.0001 49 0.0012 50 o. 0002 51 0.0006 52 0.0006 53 O. 0450 54 0.0441 55 0.0251 56 0.0281 57 O. 0443 58 0.0441 59 0.0271 60 0.0267 61 0.0178 62 0.0178 63 0.0208 64 0.0208 65 0.0128 66 0.0128 67 0.0185 68 0.0185 69 0.0198 70 0.01 98 71 0.01 92 72 0.0192 73 0.01 90 74 0.0190 75 0.0200 76 0.0200 77 0.0122
0.0000 0.0181
80 0.0000
- X =
MEDIA
0.00935
0.00072
0.00065
0.03557
0.03555
0.0193
0.01565
~ ~~ ~~
0.0195
0.0195
0.00757
S=DESV. EST.
0.00063
0.00061
0.00041
0.01 044
0.00998
0.001 73
0.00329
0.00034
0.00057
0.00907
RESULTADOS DEL ANALISIS SEROLOGIC0 ELSA A PLANTAS DE ClTRlCOS CONTRA EL VIRUS TRISTEZA DE LOS ClTRlCOS EN MUESTRAS COMPUESTAS DEL
ESTADO DE: SONORA
RANCHO
HUERTO EMILIANO ZAPATA
HUERTO LA LAURITA
HUERTO EL PARDO
HUERTO EL CAMPO N U EVO
HUERTO SAN ANTONIO
HUERTO SOCIEDAD DE PRODUCCION RURAL STA. AMELIA
HUERTO ARMlDA
HUERTO LA GRANJA
HUERTO EL AGUILA
HUERTO EL LOCO RAMOS
MUESTRA
a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2
No. DE MUESTRA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
0.0247 0.0236 0.02472 0.0258 0.0248 0.0256 0.0244 0.02565 0.0257 0.0269 0.0274 0.0256 0.0258 I 0.0280 0.0253 0.0256 0.02497 O. 0249 0.0241 O. 0260 O. 0443 0.03945 0.0441 0.0434 0.0271 0.0257 0.02652 0.0259 0.0274 0.0245 0.0254 0.02457 0.0243
ANALISIS ESTADISTICO RESULTADO DE ANALISIS X =
- 'LANTA SANA: 0.0267 nm 'LANTA CIVTC 0.1 194 nm. MEDIA
"
0.0241 0.0255 0.0235 0.02497 0.0256 0.0253 0.0256 0.0252 0.02515 0.0254 0.0244 0.0259 0.0250 0.0256 0.0261 0.0254
S=DESV. EST.
0.00089
0.001 02
0.001 18
0.00065
0.00897
0.00085
0.00057
0.00099
0.00052
0.00049
RURAL RODOLFO a2 SANTIAGO b l
b2 VICENTE a l GUERRERO a2
b l b2
EL OLVIDO a l a2 b l b2
SALSIPUEDES a l a2 b l b2
MARIBEL a l a2 b l b2
LA ESMERALDA a l a2 b l b2
SAN JOAQliN a l
I b l a2
b2 TEPIC a l
1 b l a2
b2 CHAMIZAL a l
I b l a2
b2 CRISTOBAL C a l
b2
42 I 0.0046 0.0089
43 44 45 * 46 0.0014 47 0.01 96 48 0.01 96 49 o. 0002 50 0.0002 51 0.0003 52 0.0012 53 0.0010 54 0.0006 55 0.0006 56 0.0008 57 0.0276 58 0.0254 59 0.0264 60 0.0255 61 0.0017 62 0.001 8 63 0.0007 64 0.0023 65 0.0253 66 0.0253 67 0.0255 68 0.0273 69 0.0143 70 I 0.0142
0.0143 71 72 0.0142 73 0.0018 74 I 0.0004
0.0009 75 76 0.0008 77 O. 0266
O. 0266 0,0233 0.0233
- X =
MEDIA
0.00675
0.0105
0.00047
0.00075
0.02622
0.00162
0.02585
0.01425
0.00097
0.02495
S=DESV. EST.
0.00248
0.01050
0.00048
0.00019
0.00102
0.00067
0.00097
0.00005
0.00059
0.00190
a2 b l b2
SANTA RITA a l a2 b l b2
SAN JOSE a l a2 b l b2
:L TEPEYAC a l a2 b l b2
-1UERTA SPR a l -1ERMOSILLO a2 SONORA b l
b2 SAN SEBASTIÁN a l
a2 b l b2
S.P.R. MEXICO a l a2 b l b2
-1ERCULES a l a2 b l b2
SAHUARIPA I a l a2 b l b2
82 0.0233 0.0198 83 0.0163 84 0.0163 85 0.0251 86 0.0251 0.02545 87 0.0258 88 0.0258 89 0.0008 90 0.0008 0.01422 91 0.0286 92 0.0267 93 94 95 96
0.0273 0.0250 0.0260 0.0252
0.02587
97 0.0262 98 0.0256 0.02587 99 0.0263 1 O 0 0.0254 1 o1 0.0252 102 O. 0244 0.026 103 0.0258 104 0.0286 105 0.0260 106 0.0234 0.02487 107 0.0248 108 0.0253 1 o9 0.0250
111 1 0.0265 I lo 0.0258
112 0.0261 113 0.0255 114 0.0257 0.02535 115 0.0250 116 0.0252
S=DESV. EST.
0.00404
O. 00040
0.01552
0.001 04
O. 00044
0.001 82
0.00109
0.00063
0.00031
RESULTADOS DEL ANALISIS SEROLOGIC0 ELISA A PLANTAS DE ClTRlCOS CONTRA EL VIRUS TRISTEZA DE LOS ClTRlCOS EN MUESTRAS COMPUESTAS DEL
ESTADO DE : COLIMA
RANCHO MUESTRA
CHORIZO a l a2 b l b2
EL JARAL a l a2 b l b2
PROPIEDAD a l SERGIO VERDUSCO a2
b l b2
LAS PRIMAVERAS a l a2 b l b2
SAN a l BUENAVENTURA a2
b l b2
SANTA RITA a l a2 b l
RANCHO SANTANDER
RANCHO EL POLLITO
HUERTO VALLE VIEJO
HUERTO RANCHO LOS CERRITOS
a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2 a l a2 b l b2
1
No. DE DE ANALlSIS MUESTRA RESULTADO
PLANTA SANA: 0.0264 nm. PLANTA CNTC. 0.1056 nm.
1
0.0289 11 0.0277 10 0.0296 9 0.0.249 8 0.0259 7 0.0258 6 0.0254 5 O. 0264 4 0.0255 3 0.0269 2 0.0260
12 0.001 1 13 0.0273
l4 I 0.0001 0.0008
15 16
0.0003 17 0.0005
l8 I 0.0017 0.0014
19 20
0.0005 21 0.0016
22 I 0.0003 0.0006
23 24
0.0004 25 0.0008
26 0.0010 27 0.0014
0.001 8 35 0.0014 34 0.0009 33 0.0001 32 0.0003 31 0.0001 30 0.0004 29 0.0000 28
36 0.0120 37 0.001 5
0.0120 0.001 8
40 0.001 8
ANALISIS ESTADISTICO
x = MEDIA
0.0262
0.0255
0.02837
0.00062
0.0125
0.00055
0.0007
0.00022
0.0014
0.0069
S=DESV. EST.
0.00059
0.00045
0.001 06
0.00042
O. 00064
0.00020
0.00062
0.0001 5
0.00037
0.00588
HUERTO LA ROSAL a l 41 a2 42 b l 43 b2 44
HUERTA EL PILAR a l 45 a2 46 b l 47 b2 48
HUERTA LA a l 49 PAROTITA a2 50
b l 51 b2 52
RANCHO LOS a l 53 MANOLOS a2 54
b l 55 b2 56
PAPA ALEJO Ill a l 57 a2 58 b l 59 b2 60
LIC. LEONARD0 a l 61 JARAMILLO a2 62
b l 63 b2 64
RANCHO LAS a l 65 CIRUELOS Ill a2 66
b l 67 b2 68
HUERTA SANTA a l 69 GERTRUDIZ IV a2 70
b l 71 b2 72
TECOMAN M.R. LUIS a l 73 a2 74 b l 75 b2 76
EL VERANO a l 77 HUERTA a2 78 MICHELENA b l 79
b2 80
RESULTADO DE ANALISIS
>LANTA SANA 0.0264 nm. 'LANTA CIVTC. 0.1 056 nm
O. 0007 O. 0003 0.0012 0.0012 0.0006 0.0013 O. 0007 0.001 5 0.0014 0.0001 0.0002 0.001 3 0.0000 0.0005 0.0003 0.0008 0.0007 0.0004 0.001 1 0.0007 0.0008 0.0012 0.0008 0.0012 0.0010 0.001 7 0.0009 0.0030 0.001 1 0.0002 0.0005 0.0003 0.0245 0.0302 0.0440 0.0437 0.0438 O. 0440 O. 044 1 0.0443
- X =
MEDIA
0.00085
0.00102
0.00075
O. 0004
0.00072
0.001
0.0165
0.00052
0.0347
0.04405
S=DESV. EST.
0.00043
0.00044
0.00069
0.00033
0.00028
0.00023
0.00096
0.00040
0.00890
0.00020
t
a2 b l b2
KM. 2 CAMINO A a l CHENCHOPA a2
b l b2
RANCHO VILLA a l FLORIDA a2
b l b2
RANCHO SAN a l LORENZO a2
b l
82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95
ANALISIS ESTADISTICO RESULTADO DE ANALlSIS
- X = I S=DESV.
PLANTA SANA 0.0264 nm. PLANTA CIVTC: 0.1056 nm. I MEDIA I EST.
0.0015 0.0016 0.0023 O. 0006
0.0015 0.00069
0.0014 0.0008 0.0012 0.0004
0.00009 0.00044
0.01 89 0.01 89 0.01 83 0.01 83
0.0186 0.00034
O. 0446 0.0257 0.0258 0.0252
0.03032 0.00952
I ANALISIS ESTADISTICO POR ESTADO
I I I
TAMAULIPAS 80 0.0132075 0.0096338 0.040991
SONORA 116 0.0204818 0.0103829 0.051630
COLIMA 96 0.0095697 0.0139929 0.051 548
I 440 I I 0.01 33942 I 0.052592
ANALISIS ESTADISTICO DE TESTIGOS NEGATIVOS
BUFFER - X+3S DE VALORES NEGATIVOS =0.06639
PLANTASANA - X+3S DE VALORES NEGATIVOS= 0.05259
ANALISIS SEROLOGICO(VTC) A CITRICOS DE MUESTRAS COMPUESTAS DEL ESTADO N.L.
A B S O R
- - ____
TESTIGO + 133.2
B 120 A i
I a
x d
VALOR ESTANDAR = 52.5 _ " " " " - - - - - - - - -
e
I 40 I- r c a 20
RANGO NEGATIVO I 1 1 2 5 . 5 TESTIGO ( - )
n I I I I I C
O h
- NUEVO LEON
TESTIG-(25 .5) VAL. ESTAND(52.5) TEST+(133.2)
ESC 1:lOOO
A B S O R B A N C
I A ( 4 O 5
m ) d e
I a
X
d e
I
n
-
O S
r a n C
O S
h
ANALISIS SEROLOGICO(VTC) A ClTRlCOS DE MUESTRAS COMPUESTAS DEL EDO. TAMAULIPAS
140
120
1 O 0 t
_____ TESTOGO + 1 3 3 . 2
I RANGO POSITIVO
.......................
I
1 i k""""""""
80
60 t VALOR ESTANDAR = 5 2.5 1
40 1 /
20
O
TESTIGO ( - > 25.5
O 5 10 15 20 25 30
NO. DE RANCHOS
-t" TAMAULIPAS
TESTIG-(25.5) VAL. ESTAND(52.5) TEST+(133.2)
ESC 1:lOOO
A B S O R B A N C I A ( 4 O 5
m ) d e
I a
X
d e
I
n
-
O S
r a n C
O S
h
140
120
1 O 0
80
60
40
20
0-
ANALISIS SEROLOGICO(VTC) A ClTRlCOS DE MUESTRAS COMPUESTAS DEL EDO. SONORA
TESTIGO + 119.4
RANGO POSITIVO
1. I
I I i i
RANGO NEGATIVO 3t A
I I ! + + I I I
O 5 10 15 20 25 30 35
NO. DE RANCHOS
SONORA
ANALISIS SEROLOGICO(VTC) A CITRICOS DE MUESTRAS COMPUESTAS DEL EDO. COLIMA
A B S O R B A N C
I A ( 4 O 5
m 1 d e
I a
X
d e
I
n
c
O S
r a n C h O S
120
1 O 0
80
60
40
20
O
TESTIGO + 105.6 , I
O 5 10 15 20 25 30
NO. DE RANCHOS
-6"- COLIMA
T E S T - ( 2 6 . 4 ) V A L O R S T A N D ( 5 2 . 5 ) T E S T + ( l O 5 . 6 )
A B S O R B A N C I A ( 4 O 5 n m 1 d e
I a
X
d e
I
-
O S
r a n C h O S
140
120
1 O 0
80
60
40
20
O
ANALISIS SEROLOGICO(VTC) A ClTRlCOS DE MUESTRAS COMPUESTAS DE LOS ESTADOS
RANGO POSITIVO
VALOR ESTANDAR = 52. 5
I
I
_"" " _ """""""
- TESTIGOS POSITIVOS 133.2
119.4
i 105.6
~ i I i
1 i I I
Í
133 - 2
O 10 20 30 40 50
NO. DE RANCHOS
d- NUEVO LEON "- TAMAULIPAS
i- SONORA ++ COLIMA
F R
140
E C . U E N C I
A
N O
D E
M U E S T R A S
120
1 O 0
80
60
40
20
O
INTERVALO DE ABSORB.(VTC) EN MUESTRAS COMPUESTAS DE ClTRlCOS DEL EDO. N.L.
~ RANGO NEGATIVO RANGO POSITIVO I I "'* , * 4
I + I j
n I
7 v
1 2 O
O 20 40 60 80 100 120
ABSORBANCIA(405nm)
-*- NUEVO LEON
TEST+(133.2)VALOR STANDAR(52.5) T E S T - ( 2 5 . 5 )
ESC 1:lOOO
140 F R
INTERVALO DE ABSORB.(VTC) EN MUESTRAS COMPUESTAS DE ClTRlCOS DEL EDO. SONORA
RANGO NEGATIVO RANGO POSITIVO
N c 100 ; I A
N 80
O ~
D 60 -1 E
M U E S T R A S
40 I
20 -i -f
O , I +
r"
u3 hl
n I I--
I 1
I I
L I
O 20 40 60 80 100 12.0 ABSORBANCIA(405nm)
* SONORA
TEST- (26.7) VALOR STANDAR(52.5) TEST+(119.4)
ESC 1:lOOO
F R E C U E N C I A
N O
D E
M U E S T R A S
INTERVALO DE ABSORB.(VTC) EN MUESTRAS COMPUESTAS DE ClTRlCOS DEL EDO. TAMAUL.
140
120
1 O 0
80
60
40
20
O
t
O
RANGO NEGATIVO RANGO POSITIVO ,
I
20 4 0
I
I
i
60 80 100 120
TEST-(25.5)VALOR STANDAR(52.5) TEST+(133.2)
ABSORBANCIA(405nm)
+ TAMAULIPAS
ESC 1:lOOO
2 2 5 8 1 3
INTERVALO DE ABSORB.EN ClTRICOS(VTC) EN MUESTRAS COMPUESTAS DEL EDO.COLIMA
E N C I 80 1 A I
1 I
N O 60 -~
D E
M U E
T R A
40 -
S 20
O 20 40 60 80 100 120 ABSORBANCIA(405nm)
---E+ COLIMA
ESC 1:lOOO
INTERVALO DE ABSORB.(VTC) EN MUESTRAS COMPUESTAS DE ClTRlCOS DE LOS ESTADOS
E N
I A
!
c 100- ,
4
20 40 60 80 100
ABSORBANCIA(405nm)
"c NUEVO LEON -t- TAMAULIPAS
-++ SONORA COLIMA
TEST-(26.4)VALOR STANDAR(52.5) TEST+(105.6) TEST+(119.4) TEST+(133.2) TEST- (26 .7 )
"
ESC 1:lOOO
U DISCUSION
La evaluación de las muestras colectadas para el diagnóstico del virus VTC, se efectúa en el lector de ELSA calibrado a 405 nm, el valor de absorbancia reportado en cada pozo y testigos fueron formando la base de datos para realizar los cálculos estadísticos para obtener un número, el cual sería el estándar para determinar el rango positivo-negativo para plantas de cítricos enfermas (presencia del VTC) o plantas sanas (ausencia del VTC).
Para el análisis estadístico, se revisaron varias fórmulas como son:
2 x 3; x + 2 s x + 3 s
-
-
Sin embargo, en base a la literatura revisada se tomó la decisión de aplicar el teorema de Chebychev ( X + 3s), ya que se requiere una expresión más formal de la estimación y precisión, con lo cual se puede obtener una estimación del parámetro por intervalo al azar, llamado intervalo de confianza.
Es decir, supongamos que el parámetro a estimar por intervalo de confianza, sabiendo que la distribución muestra1 de X es aproximadamente normal por el teorema del límite central I que aproximadamente es el 99.73 % de los valores de la media, más tres veces la desviación estándar, esto es: x +3S del total de las plantas sanas de los estados de Nuevo León, Tamaulipas, Sonora y Colima, nos da un total de 440 muestras compuestas en total. Estas muestras presentaron valores en un rango de O a 0.0466 nm de absobancia, las cuales se encuentra por abajo del testigo positivo. Las variaciones de las muestras analizadas se puede observar mejor en las gráficas, donde está variación se debe a:
1. Madurez de la planta (contenido de virus). 2. Variante del virus (En México es una variante débil, no es tan agresivo). 3. Tamaño de muestra (cantidad de savia para analizar). 4. Condiciones ambientales ( campo/ laboratorio). 5. Calidad del material serológico (sustancias químicas y equipo). 6. Procesamiento (recursos humanos). 7. Manejo cultural del cultivo (fertilización, riego, fecha de siembra, variedad de la planta).
Las muestras analizadas nos dieron valores negativos, por lo tanto el virus VTC esta ausente, esto con base a el valor tomado como estándar, que es de 0.05259 nm. Por debajo de este valor se consideran los resultados de las muestras como negativas y por arriba se consideran positivas.
Las muestras se analizaron serologícamente con la técnica de inmunosorbencia con enzimas conjugadas ELISA; como lo indica Agdia para la detección de la tristeza de los cítricos VTC, utilizando anticuerpos policlonales goat anti-CiTV (antisuero policlonal de cabra anti VTC), para la detección del VTC. Así como, el anticuerpo monoclonal mouse anti-CiTV (antisuero monoclonal ratón anti VTC), para evaluar las muestras analizadas.
Actualmente, la técnica es de gran utilidad en éI diagnóstico de enfermedades vírales, como es el caso de la enfermedad de la tristeza de los cítricos VTC.
Ahora bien, debido a que en México se considera como una de las pocas áreas del mundo donde aún no existe el VTC (Virus Tristeza de los cítricos), es necesario analizar las muestras de viveros y plantaciones comerciales de cítricos, de las principales zonas productoras; con la finalidad de detectar cualquier indicio de presencia de este patógeno, que pudiera poner en riesgo la citricultura mexicana. En base a lo anterior, en ocasiones se requiere analizar un gran número de muestras en poco tiempo, considerando muestras compuestas o simples, de acuerdo con las evidencias de presencia o ausencia del VTC.
En relación al tamaño de muestra compuesta, que se manejó en este ensayo, se conformó de cinco muestras diferentes, cada una compuesta de tres brotes tiernos para una hectárea, en estas muestras es importante identificar la región, vivero, propietario y árbol. En caso de que se obtengan resultados positivos, se recomienda procesar muestras simples, obteniéndose una mayor precisión del diagnóstico, ya que por trabajar con muestras compuestas no podemos determinar cuantos árboles están afectados por éI VTC.
Con la técnica ELISA para VTC podemos confirmar la presencia 0 ausencia del virus tristeza de los cítricos, ya que como se ha mencionado esta técnica presenta las siguientes ventajas:
0 Precisa 0 Sensible 0 Usa cantidades mínimas de antisuero 0 La reacción es rápida.
VENTAJAS DE PROCESAR MUESTRAS COMPUESTAS DE CITRICOS:
1. Se puede detectar la presencia del virus VTC en un muestreo grande. 2. En un período corto de tiempo pueden ser analizadas muchas muestras. 3. Utilizando mínimas cantidades de sustancias químicas podemos analizar un mayor
4. En cuanto al costo, resulta económico para un muestreo grande. número de muestras.
DESVENTAJAS DE PROCESAR MUESTRAS COMPUESTAS EN CITRICOS:
1. Si el resultado de una muestra compuesta sale positiva; es decir, está presente el VTC, no se tiene la certeza de que 1,2,3,4 6 los 5 árboles sean positivos.
2. En el análisis de muestras compuestas, no es posible cuantificar la concentración del virus por árbol (la intensidad de coloración es directamente proporcional a la concentración del virus).
3. Si el resultado es positivo, esto implicaría analizar muestras simples, requiriendo de mayor tiempo y dinero.
1 CONCLUSION I
1. La implantación de medidas, que requiere de un análisis confiable estadísticamente, se puede expresar como la media más tres veces la desviación estándar ( x + 3s); lo que nos permite determinar el rango apropiado positivo-negativo en éI diagnóstico del virus tristeza de los cítricos mediante la técnica ELISA.
2. Con base al uso de la técnica ELISA para diagnosticar y determinar la presencia o ausencia del VTC en zona citricolas, se pudo determinar que en este muestre0 los valores obtenidos se encuentran en un rango de O - 0.0466 nm, estos son valores negativos, lo cual nos indica la ausencia del VTC.
3. Mediante el uso de la técnica ELISA, se evaluaron muestras compuestas de cítricos, lo que permitió determinar que para 1993 no se encontró presente el virus tristeza de los cítricos en las zonas muestreadas de los estados de Nuevo León, Tamaulipas, Sonora y Colima.
* 2 2 5 8 1 3
RECOMENDACIONES I 1. Establecimiento de los valores del rango positivo y negativo a usar
2. Analizar suficientes plantas para familiarizarse con el rango de valores involucrados de muestras positivas y negativas.
3. Incluir controles negativos conocidos en cada ensayo para asegurar la representación del rango negativo previamente establecido. Asimismo, considerar un testigo positivo (con presencia de VTC), con el mismo fin.
4. Incluir un control sano (positivo) confiable en cada placa.
5. Considerar un mínimo de dos repeticiones de las muestras.
APENDICE 1
REACTIVOS PARA LAS SOLUCIONES (BUFFER)
Buffer de lavado (buffer PBST).
REACTIVOS
Cloruro de sodio Fosfato dibásico de sodio (hidratado) Fosfato monobásico de potasio Cloruro de potasio Tween-20 (surfactante) En 1000 ml de agua destilada disolver. Ajustar el pH = 7.4 Temperatura = 4 "C (almacenar)
FORMULAS CANTIDAD
NaCl 8.0 g Na, HPO .12H20 2.99
KC I 0.29 KHz PO, 0.29
0.5ml
Buffer de extracción
Disolver en 1000 ml de buffer de lavado (PBST).
REACTIVOS FORMULAS CANTIDAD
Sulfito de sodio(anhidro) Polyvinylpyrrolidona Azida de sodio Polvo de albúmina de pollo Tween 20 (surfactante) Ajustar a pH = 7.4 Temperatura = 4 "C (almacenar)
Na, SO, 1.3g
NaN, 0.2g 2.09
(PVP) PM=24-40,000 20.09
0.5ml
Buffer de solución del sustrato PNP(P-nitrofenil fosfato).
REACTIVOS FORMULAS CANTIDAD
Diethanolamina (DTA) (HOCH, CH,) NH 97.0 ml Agua destilada NaN, 800.0 ml Azida de sodio 0.29 Ajustar el volumen final a 1000 ml con agua destilada Ajustar a pH = 9.8 Temperatura = 4 "C. (almacenar).
Buffer de cubrimiento
En 1000 ml de agua destilada disolver.
REACTIVOS
Carbonato de sodio Bicarbonato de sodio Azida de sodio Ajustar a pH = 9.6 Temperatura = 4°C (almacenar).
Buffer Reactivo [A]
En 1000 ml de (PBST) agregar:
REACTIVOS
Suero de albúmina de bovino (BSA) Polyvinilpyrrolidona Azida de sodio Temperatura = 4°C (almacenar)
FORMULAS
Na, CO, Na HCO, Na N,
CANTI DAD
1 .59g 2.939 0.29
FORMULAS CANTIDAD
2.09 (PVP) PM = 24 - 40,000 20. og
NaN, 0.29
APENDICE 2
ESQUEMA FOTOGRAFICO DEL EQUIPO Y MATERIAL PARA DESARROLLAR LA TECNICA SEROLOGICA ELISA.
LABORATORIO DIAGNOSTICO DE VIRUS, DE LA DlRECClON GENERAL DE SANIDAD VEGETAL. SAGAR.
LECTOR ELISA
SUSTANCIAS Y REACTIVOS
HOMOGENiZADOR DE MUESTRAS (MACERADOR)
REFRlGERAClON DE MUESTRAS PARA CONSERVAClON Y PROCESAMIENTO POSTERIOR
r l BlBLlOGRAFlA
Agrios, N. G. 1991. Fitopatología. 5ta. reimpresión. Ed. Limusa. pp. 648-651
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