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ÓRGANO DE DIFUSIÓN DE LASOCIEDAD ARGENTINA DE HEMATOLOGÍA

HEMATOLOGIAARGENTINA

Presidente: Jorge Milone Vice-Presidente: Moira Lluesma GoñalonsSecretaria: María Gabriela Flores Tesorero: Luis Palmer

Carlos PonzinibbioDirector

Gustavo Kusminsky, Buenos AiresSecretario de Redacción

Comité de Redacción

Jorge Arbelbide, Buenos Aires Regina Kohan, Buenos AiresJosé Ceresetto, Buenos Aires Marta Martinuzzo, Buenos AiresGustavo Chiappe, Buenos Aires Arturo Musso, Buenos AiresDorotea Fantl, Buenos Aires Carlos Ponzinibbio, Buenos Aires

CONSEJO CIENTÍFICO ASESOR

Mario Aggio, Bahía BlancaLuis Aversa, Buenos AiresAlfredo Basso, Buenos AiresRaimundo F. Bezares, Bs. As.Eduardo Bullorsky, Bs. As.Pedro Bustelo, Bs. As.Luis Carreras Vescio, FranciaFernando Cavagnaro, Bs. As.

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Emilio Lanari, CorrientesValentín Labanca, MendozaGraciela Lucero, Bs. As.Mónica Matus, Santa FeJorge Milone, Bs. As.Arturo Musso, Bs. As.Elsa Nucifora, Bs. As.Emilio Palazzo, Córdoba

Santiago Pavlovsky, Bs. As.Raúl Pérez Bianco, Bs. As.Lorenzo Pérez Polo, MendozaMarco Pizzolato, Bs. As.Julio C. Sánchez Avalos Bs. As.Norma Tartas, Bs. As.Miguel Tezanos Pinto, Bs. As.

VOLUMEN 14 Nº 1 ● ENERO-MARZO ● 2010

Edición: Sociedad Argentina de Hematología: Julián Alvarez 146 - C1414 DRD - TEL/FAX: 4855-2452e-mail: sah@sah.org.ar

Hematología se distribuye cuatrimestralmente en forma gratuita a los miembros de la Sociedad Argentina de HematologíaRegistro de la Propiedad Intelectual Nº 155751

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Esta revista está indizada en la Base de Datos LILACS, BIREME, BRASIL

ISSN: 0329-0379

HEMATOLOGIA ● Volumen 1 - Nº 1, 19962

VOLUMEN 14 Nº 1 ● ENERO-MARZO DE 2010

CONTENIDO

HEMATOLOGIAARGENTINA

IMÁGENES EN HEMATOLOGÍAAlteraciones morfológicas plaquetarias en microscopía electrónica. Luego de buceos simulados encámara hiperbáricaE. Paoletti, C. Espinosa, R Laguens, G. Mauvecin, Diana García, M.E. Paoletti, C.W. García .............................

EDITORIALHomenaje al MaestroComité Editor .............................................................................................................................................................

ARTÍCULOS ORIGINALESResultados del tratamiento de leucemias linfoblásticas agudas recaídas en pediatría. Experiencia enuna instituciónMyriam R. Guitter, Elizabeth M. Alfaro, Jorge Rossi, Marta Gallego, Cristina Alonso, María S. Felice ..............

Señales de sobrevida inducidas por el complejo IL-6/IL-6sR en el linaje megacariocítico. Influencia dela mutación JAK2-V617FCarlos D. Chazarreta, Nora P. Goette, Paola R. Lev, Juan P. Salim, Felisa C. Molinas, Rosana F. Marta ..............

INFORMACIÓN GENERAL ....................................................................................................................

REGLAMENTO DE PUBLICACIONES ...................................................................................................

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Edición realizada por Estudio Sigma S.R.L. - J. E. Uriburu 1252 - 8º F - Buenos Aires - Tel.: 4824-9431 / 4821-2702E-mail: estsigma@gmail.com - www.estudiosigma.com.ar

Impreso en el mes de Marzo de 2010

IMAGEN

HEMATOLOGIA, Vol. 14 Nº 1: 1Enero-Marzo, 2010

Alteraciones morfológicas plaquetariasen microscopía electrónica. Luego de buceos

simulados en cámara hiperbárica

E. Paoletti***, C. Espinosa****, R Laguens**, G. Mauvecin****,Diana García*, M.E. Paoletti*, C.W. García

*Clínica 25 de mayo, **Fundación Favaloro,***Universidad FASTA,****Escuela de Buceo ARA.

Mar del Plata

Fecha de recepción: 8/10/09Fecha de aprobación: 15/11/09

Evaluamos desde 1982 la funciónplaquetaria en grupos de alumnos de laEscuela de Buceo de la Armada Argen-tina luego de buceos simulados en cáma-ra hiperbárica y con tiempos de inmer-sión y emersión normales y observamosun aumento de la agregación plaquetaria.

Comprobamos In Vivo, por micros-copía electrónica cambios en la morfolo-gía plaquetaria con desaparición de mi-crovellosidades y adopción de formacóncavo-convexa, que les confiere aspec-to falciforme y pérdida de granulacionesα y densas. La degranulación podría seratribuida a activación plaquetaria, por laaparición de microburbujas del gas iner-te (N2) de la mezcla respiratoria en lasangre, que fue previamente disuelto enlos tejidos.

Se obtuvo PRP centrifugando 30 mi-nutos a 1000 g. El sedimento puesto en2.5% glutaraldehido en 0.1 M bufferfosfato, pH 7.2, post-fijado en tetraóxidode osmio 1% e incluido en resina epoxy.Se obtuvieron cortes ultra finos, colorea-dos con nitrato de plomo y estudiado enmicroscopio electrónico de transmisión.

Esa activación de la función plaque-taria en buceos con descompresionescontroladas podría ser el factor desen-cadenante de la formación de micro-trombos que, de alguna manera, afectanciertas zonas de la microcirculación pro-vocando entre otras cosas la osteone-crosis disbárica.

1. Undersea Biomed Res 1987 Jan; 14 (1): 45-58

Fig. 1. Plaquetas normales, previas a inmersión simulada.

Fig. 2. Plaquetas post inmersión

EDITORIAL

HEMATOLOGIA, Vol. 14 Nº 1: 3Enero-Marzo, 2010

Homenaje Al Maestro

Es bueno que los testimonios permanezcan asentados en pluma y pa-pel para generaciones futuras.

Es bueno que quienes comienzan a recorrer el camino de la especiali-dad que amamos, sepan que ha habido personas que lo han hecho en pro-longada trayectoria y lo siguen haciendo con entusiasmo y dedicación.

Es bueno que se reconozca públicamente a esas personas, aquellas quesin proponerse la alabanza propia como meta u objetivo particular, reci-ban el justo homenaje de la confraternidad profesional.

Es por ello que desde estas páginas deseamos resaltar el otorgamien-to de la distinción por parte de la Academia Nacional de Medicina «Pre-mio Hipócrates» a nuestro colega, el Profesor Julio César Sánchez Avaloscomo público reconocimiento a su trayectoria en la Hematología.

Nada más justo.Sánchez Avalos, como habitualmente le llamamos, supo abrazar con una

pasión singular su carrera profesional y ha sobresalido en ella desde sumismo inicio. Y no porque haya buscado que errantes haces de luz se po-sen sobre su figura, sino, por el contrario, porque ha sido y es -en sí mis-mo- una fuente de luz, un faro permanente que ha sabido conducir a buenpuerto a un gran número de hematólogos. Su inteligencia y clarividenciapara percibir lo esencial de la especialidad, su conocimiento adquirido conel estudio constante, su capacidad de observación y gran sensibilidad siem-pre han estado a disposición de quien lo quisiera tomar. Su generosidadsin límites, su trato llano y amable y su experiencia lo han ido modelandocomo el verdadero maestro de varias generaciones de hematólogos.

Su compromiso con la Sociedad Argentina de Hematología nació jun-to a ella y ha sabido mantenerse con una fidelidad infatigable, completa-mente despojada de desencuentros personales o animadversiones. Su an-helo por formar orgánicamente a los jóvenes hematólogos lo llevó junto aentusiastas colegas a fundar el Curso para la formación de Hematólogos,curso de más de 30 años de continuidad y hoy, Carrera universitaria, cunaque arrulló a una buena parte de los que hoy integramos esta Sociedad.

Justamente, la amable presentación hecha por el Académico Miguel deTezanos Pinto, enfatizó la prolongada y fecunda trayectoria del Dr. SánchezAvalos fruto de su sensible personalidad, amor por la medicina e infati-gable capacidad de trabajo. Muchos pacientes han sabido beneficiarse desus talentos, pero también muchos colegas lo han hecho, y que bueno!

Al tiempo de pronunciar sus palabras de agradecimiento, el Dr.Sánchez Avalos intentó destacar que si algún mérito le cabía, debía ser enbuena medida por el apoyo perseverante de sus colaboradores y el soste-nido impulso de la comunidad hematológica. Como de costumbre, con sucaracterística humildad quiso que ésta fuera una distinción para todos loshematólogos.

Su ejemplo honra y distingue a la Sociedad Argentina de Hematología. La perseverancia, la construcción constante y el sucesivo aporte que

cada uno añade para el bien común, construyen los peldaños de la escale-ra por la que sube y progresa una Institución.

Que quede escrito.

Comité Editor

ARTÍCULOSORIGINALES

HEMATOLOGIA, Vol. 14 Nº 1: 11-17Enero-Marzo, 2010

Señales de sobrevida inducidas por el complejoIL-6/IL-6sR en el linaje megacariocítico.

Influencia de la mutación JAK2-V617F

Carlos D. Chazarreta, Nora P. Goette, Paola R. Lev, Juan P. Salim,Felisa C. Molinas, Rosana F. Marta

Hematología Investigación, UE IDIM-CONICET, Instituto Lanari, UBA.Combatientes de Malvinas 3150 C.A.B.A. CP 1427. Tel 011-4523-8947

Correspondencia a: Dra. Rosana F. Marta. rfmarta2005@gmail.com

Fecha de recepción: 10/10/09Fecha de aprobación: 30/10/09

RESUMENLa IL-6 actúa a través del receptor de membrana y del

soluble (IL-6sR) que confiere sensibilidad a células sinreceptor de membrana. Previamente reportamos aumen-to de IL-6sR en trombocitemia esencial (TE), una neo-plasia mieloproliferativa (NM). En este trabajo se evaluóla acción del complejo IL-6/IL-6sR (COMP) comparadocon la IL-6 en su capacidad de protección de la apoptosisde progenitores CD34+ normales y de NM y de activa-ción de JAK/STAT en plaquetas normales y de NM. Seevaluó expresión de fosfatidilserina por marcación conanexina V y de caspasa 3 activada en células CD34+ desangre periférica de NM y de cordón umbilical como con-trol, y activación de JAK2 y STAT3 por western-blot conanticuerpos contra las proteínas fosforiladas y sin fosfo-rilar. En conjunto, los progenitores CD34+ de pacientesy controles tuvieron menos apoptosis con COMP que conIL-6 (activación de caspasa 3 p=0.001, 7 normales, 4 pa-cientes; expresión de anexina V p=0.029, 6 normales, 5 pa-cientes; Rangos señalados Wilcoxon) La activación deJAK2 y STAT3 en plaquetas se evaluó calculando la re-lación (Rel) de intensidad de la banda de la proteínafosforilada respecto del total estimulada por COMP (RelCOMP) y por TPO (RelTPO), obteniéndose el cociente(Rel COMP/TPO). Los pacientes JAK2V617F + tuvieronaumento de Rel COMP/TPO del STAT3, 2.03 (0.45-3.03)(mediana y rango) (n=4), respecto de controles 0.63 (0.014-0.8) (n=5) y pacientes no mutados, 0.75 (0.005-1.12) (n=5)(ANOVA p=0.018). La activación de JAK2 siguió una ten-dencia similar a STAT3 aunque no alcanzó diferenciassignificativas.

Los resultados sugieren que el COMP es más efecti-vo que la IL-6 en la protección de la apoptosis de los pro-genitores CD34+. Esto junto al hallazgo de aumento deIL-6sR en TE, sugerirían que un mayor nivel de IL-6sR

favorece la sobrevida de los progenitores megacariocí-ticos en NM. La protección ocurriría a través de JAK2 ySTAT3 siendo más eficiente en pacientes JAK2V617F+.

Palabras clave: Receptor de interleuquina 6, Plaquetas,JAK2-V617F, Progenitores hematopoyéticos, Apoptosis.

INTRODUCCIÓN

La trombopoyetina (TPO) es la principal citoquinaestimulante de la megacariopoyesis. Sin embargo, sehan descrito algunos otros factores “TPO indepen-dientes” capaces de inducir el desarrollo megacario-cítico, entre ellos la interleuquina 6 (IL-6)1.

La IL-6 actúa a través de su receptor específico(IL-6Rα) en la membrana de las células blanco quese asocia con una glicoproteína llamada gp130, en-cargada de la transducción de la señal intracelular.La activación y homodimerización de la gp130 indu-ce fosforilación de Janus quinasas (JAKs), favorecien-do la activación de signal transducers and activators oftranscription (STATs). Esta ruta de señalización es ac-tivada también por TPO y por otras citoquinas queutilizan la gp130 para la transducción de la señalintracelular. Existe además una forma soluble delreceptor (IL-6sR) que al unirse a la IL-6 es capaz dedesencadenar la transducción de la señal en célulasque no poseen IL-6Rα, como las células endoteliales,y ampliar así el espectro celular sobre el que la IL-6ejerce su acción. Este mecanismo se denomina trans-señalización2. El IL-6sR se une a su ligando con afi-

HEMATOLOGIA ● Volumen 14 - Nº 1, 201012

nidad similar al IL-6Rα, actuando de maneraagonista y siendo capaz de prolongar la vida mediade la IL-6. El mecanismo de trans-señalización a tra-vés del IL6-sR se encuentra implicado en numerosaspatologías en donde actúa facilitando la acciónantiapoptótica de la IL-6. La activación de las seña-les intracelulares inducida por IL-6 es de importan-cia en la producción de progenitores hematopoyéticosinmaduros y comprometidos con el linaje mega-cariocítico3.

Las neoplasias mioloproliferativas crónicas (NM)son un grupo de enfermedades que se caracterizanpor un aumento de la proliferación de alguno de loslinajes mieloides. Así, la policitemia vera (PV) seidentifica por una exacerbación de la serie eritroide,la trombocitemia esencial (TE) por un aumento de laserie megacariocítica y la mielofibrosis primaria (MP)por fibrosis medular y desarrollo mieloide extrame-dular4. En los últimos años, el descubrimiento de lamutación V617F en la tirosinquinasa JAK2, con dife-rentes frecuencias en cada una de estas tres entida-des, ha puesto en evidencia que son patologías condiferencias fenotípicas pero que comparten ciertascaracterísticas genéticas. Los factores que determinanel desarrollo de cada uno de estos tres desórdenes noestán totalmente dilucidados. La mutación V617F enel dominio autoinhibitorio de la quinasa, induce unaumento de la actividad de la misma, provocandoactivación constitutiva en líneas celulares5 y creci-miento independiente de citoquinas in vitro6.

En un trabajo previo7 describimos el aumentoplasmático del IL-6sR en pacientes con TE. Dada la ca-racterística agonista del IL-6sR y la amplia participaciónde su ligando en la megacariocitopoyesis, en el presen-te trabajo se evaluó la actividad del complejo IL-6/IL-6sR (COMP) y de la IL-6 por sí sola en la protección dela apoptosis de células progenitoras CD34+ normalesy de pacientes con NM, así como la activación de lasrutas de señalización JAK/STAT en plaquetas norma-les y de pacientes con NM portadores de la mutaciónJAK2V617F y negativos para la misma (JAK2WT).

MATERIALES Y MÉTODOS

Pacientes y controles

Los pacientes se diagnosticaron de acuerdo a loscriterios del PVSG, utilizándose únicamente muestrasde pacientes libres de tratamiento. Se estudiaron 15pacientes, 12 con TE, 2 con PV y uno con MP. Losprogenitores hematopoyéticos CD34+ normales seobtuvieron de sangre de cordón umbilical humano departos a término de embarazadas sin antecedentes deenfermedad hematológica. La recolección de estasmuestras se realizó en el Hospital Materno Infantil

de San Isidro. Las muestras de plaquetas normalesse obtuvieron de individuos sanos que no habíaningerido medicación alguna en los últimos 8 días.

Este proyecto cuenta con la aprobación del comi-té de ética del Instituto de Investigaciones MédicasA. Lanari, y del Hospital Materno Infantil de San Isi-dro. Tanto pacientes como controles normales firma-ron el consentimiento informado correspondiente.

Muestras biológicas

Progenitores hematopoyéticos CD34 positivos: losprogenitores hematopoyéticos CD34+ normales seobtuvieron recogiendo la sangre de cordón umbilicalen tubos estériles conteniendo buffer anticoagulanteBAC (PBS, 1mM EDTA, 50 U/ml heparina). Los pro-genitores CD34+ de pacientes con NM se obtuvierona partir de sangre periférica utilizando el mismoanticoagulante.

Plaquetas: las plaquetas de pacientes y controlesnormales se obtuvieron de sangre periférica anticoa-gulada con BAC suplementado con inhibidores de laactivación plaquetaria y se aislaron por método con-vencional. El plasma rico en plaquetas fue filtradopor filtros desleucocitantes (Purecell PL, Pall Biome-dical Products, East Hills, NY, USA) para descartarla presencia de glóbulos blancos.

Purificación de progenitores CD34+

Los progenitores se purificaron por método inmu-nomagnético de selección positiva miniMACS utili-zando un anticuerpo directo anti-CD34 unido a es-feras metálicas (Myltenyi Biotec GMBH Alemania).

Estudios de apoptosis en células progenitoras CD34+

Activación de caspasa 3 por citometría de flujo:Para este ensayo se hizo proliferar a las célulasCD34+ cultivándolas por un periodo de 48 hs en me-dio IMDM suplementado con suero fetal bovino 2%,BSA 1.5%, transferrina saturada de hierro 200 µg/ml,Stem Cell Factor 25 ng/ml, lípidos sonicados, en pre-sencia de penicilina y estreptomicina. Después de laproliferación las células fueron lavadas con PBS/BSA/EDTA y cultivadas durante 12 hs en medio con-dicionado IMDM, deprivado de nutrientes, comobase para inducir apoptosis, o bien el mismo mediocon el agregado de 100 ng/ml de IL-6 o 100 ng/mlde IL-6 + 200 ng/ml de IL-6sR (citoquinas provenien-tes de R&D Systems, Minneapolis, USA). Después deeste periodo se realizó la marcación de las célulasprogenitoras con CD34 FITC y CD45 PerCP por 30min. a temperatura ambiente para la selección de lapoblación. Luego las células marcadas fueron lava-

13SEÑALES DE SOBREVIDA INDUCIDAS POR EL COMPLEJO IL-6/IL-6SR EN EL LINAJE MEGACARIOCÍTICO

das y se procedió a la fijación y permeabilizaciónutilizando un kit comercial (PharMingen TM), para laposterior marcación intracitoplasmatica de caspasa 3activada con un anticuerpo monoclonal unido a PE(Becton Dickinson, San José, CA, USA). Los resultadosse expresaron como porcentaje de marcación de caspasa3 activada en las células expuestas a los distintos trata-mientos (IL-6 sola o complejo IL-6 + IL-6sR) respecto ala marcación obtenida en las células cultivadas enIMDM sin el agregado de citoquinas, que fue conside-rada como el 100% de activación de caspasa 3.

Expresión de fosfatidilserina: las células CD34+purificadas se cultivaron en medio deprivado denutrientes como metodología para inducir apoptosis.Los cultivos se realizaron durante 16 hs a 37 °C enmedio IMDM sólo y con el agregado de 100 ng/mlde IL-6 o 100 ng/ml de IL-6 + 200 ng/ml de IL-6sR.La concentración celular sembrada fue de 50000 cé-lulas/well/ml. Pasado el tiempo de incubación lascélulas fueron cosechadas, lavadas e incubadas conAnexina V unida al fluorocromo FITC e ioduro depropidio. La Anexina V se une a la fosfatidilserina quese expone en la cara externa de la membrana plas-mática cuando la célula entra en apoptosis, mientrasque el ioduro de propidio penetra en las células en lasque la integridad de su membrana ha sido alterada,como es el caso de las células necróticas y apoptóticastardías. Para este estudio se utilizó un kit comercial(Becton-Dickinson) según las recomendaciones del fa-bricante. Los resultados se expresaron como porcen-taje de células apoptóticas totales (apoptosis tempra-na representada por eventos anexina V positivos,ioduro de propidio negativos, más apop-tosis tardía,representada por eventos anexina V positivos, iodurode propidio positivos).

Estudio de fosforilación de proteínas plaquetarias

Para el estudio de fosforilación de proteínas, lasplaquetas filtradas se ajustaron a 1.106/ul. Se estimu-laron 200 ul de esta suspensión plaquetaria con a) 100ng/ml IL-6, b) 100 ng/ml IL-6 + 200 ng/ml IL-6sR,c) 100 ng/ml TPO. Las muestras se incubaron 10minutos a 37° C, se lisaron con buffer de lisis M-Per(Pierce Biotechnology, Rockford, USA) y se agrega-ron inhibidores de proteasas y fosfatasas. Las mues-tras fueron centrifugadas a 4 °C 10 min a 14000 rpm.Las proteínas plaquetarias se separaron medianteelectroforesis en gel de poliacrilamida y se realizaronwestern-blots utilizando anticuerpos específicos con-tra las proteínas JAK2 y STAT3 fosforiladas y sinfosforilar (Cell Signalling, Beverly, MA y Santa CruzBiotechnology).

Para evaluar el grado de activación de JAK2 ySTAT3 en plaquetas, se calculó la relación (Rel) divi-

diendo la intensidad de la banda correspondiente alJAK2 o STAT3 fosforilados por la del JAK2 o STAT3total, tanto en la muestra estimulada con el comple-jo (RelCOMP) como en la estimulada por TPO(RelTPO) y luego se obtuvo el cociente entre ambasrelaciones con el fin de relativizar el grado de fosfo-rilación del complejo respecto a TPO (RelCOM/TPO).

Estadística

Los resultados se expresaron como mediana yrango. Para la comparación de la expresión decaspasa 3 activada y anexina V con los distintos tra-tamientos se utilizó el test de rangos señalados deWilcoxon que compara muestras apareadas. Paraanalizar si la protección frente a la apoptosis era dis-tinta entre pacientes y controles se utilizó el test desuma de rangos de Wilcoxon. La comparación delgrado de activación de JAK2 y STAT3 entre pacien-tes JAK2V617F, JAK2WT y controles normales se rea-lizó mediante el análisis de varianza.

RESULTADOS

Evaluación de la apoptosis de progenitores CD34+

Activación de caspasa 3

En conjunto, los progenitores hematopoyéticos depacientes y controles mostraron una menor activaciónde caspasa 3 al ser estimulados con el COMP, media-na 82.9%, rango 47.7-103.8%, respecto a la IL-6,100.0% (76.1-142.0) (p=0.001; 7 normales, 4 pacientes).Al compararse los resultados entre pacientes y con-troles, se observó que no había diferencias en el gra-do de protección del COMP respecto de la IL-6 entreambos grupos. En la Fig. 1A se muestran los resulta-dos en el grupo de pacientes y controles normales porseparado. En la Fig. 1B se muestra un ejemplo repre-sentativo de la activación de caspasa 3 obtenida enpresencia del COMP y de IL-6.

Expresión de Anexina V

De forma similar a lo observado para caspasa 3activada, la expresión de anexina V fue menor en lasmuestras estimuladas con COMP, 40.3% (12.9-83.7),que en aquellas estimuladas con IL-6 sola, 51.4%(22.4-77.3), p=0.029; (6 normales y 5 pacientes). Tam-poco se observaron diferencias en la respuesta de lospacientes respeto a los controles normales. En la Fig.2A se muestran los resultados de los pacientes y con-troles y en el Fig. 2B un ejemplo de la distribuciónde los eventos anexina V positivos por citometría deflujo.

HEMATOLOGIA ● Volumen 14 - Nº 1, 201014

De los 8 pacientes estudiados para apoptosis deprogenitores, solo uno fue portador de la mutaciónJAK2V617F. Esto imposibilitó la realización del análi-sis comparativo entre pacientes con y sin la mutación.

Activación de JAK2 y STAT3 en plaquetas

La activación de la ruta de señalización JAK2 ySTAT3 se estudió en muestras de plaquetas evaluan-do las bandas de las proteínas fosforiladas en ausen-cia de citoquinas y en presencia de a) IL-6, b) Com-plejo IL-6/IL-6sR, c) TPO, citoquina estimulante dela vía JAK2/STAT3. Tanto las plaquetas enfrentadascon vehículo carente de citoquina como aquellas in-cubadas en presencia de IL-6 no presentaron activa-ción de JAK2 ni STAT3, demostrando la incapacidadde la IL-6 por sí sola de transducir la señal enplaquetas. En cambio, la estimulación con TPO yCOMP dió lugar a la aparición de bandas de proteí-na fosforilada tanto para JAK2 como para STAT3.

La fosforilación de JAK2 inducida por TPO fuesemejante en los pacientes portadores de la mutación,0.39 (0.20-0.80), en los pacientes no mutados, 0.59 (0.05-1.86), y en los controles normales, 0.38 (0.01-0.75), Fig.3A. En cambio, se observó mayor activación de JAK2inducida por COMP en los pacientes JAK2V617F, 0.33(0.008-2.25) respecto de los no mutados, 0.007 (0.005-0.014) y los normales, 0.038 (0.004-0.07) aunque ladiferencia no fue estadística-mente significativa, Fig. 3B.

Cuando se analizó el nivel de fosforilación deSTAT3 se observaron las siguientes tendencias: alinducir la activación con TPO los pacientes con lamutación presentaron menor grado de fosforilación,0.72 (0.009-2.10), que los no mutados, 1.08 (0.35-7.79)y que los controles normales, 11.52 (0.18-21.80), Fig.

3C. Por el contrario, la fosforilación inducida por elCOMP fue mayor en pacientes JAK2V617F, 1.34 (0.69-4.61), que en los JAK2WT, 0.39 (0.005-2.80) y que lossujetos normales, 0.27 (0.11-1.84), Fig. 3D.

Al relativizar la activación inducida por el COMPrespecto a la TPO observamos mayor Rel COMP/TPO para STAT3 en los pacientes JAK2V617F, 2.03(0.45-3.03) (n=4), que en los pacientes negativos parala mutación, 0.75 (0.005-1.12) (n=5) y en los contro-les normales 0.63 (0.014-0.8) (n=5) (p=0.018), demos-trando en el grupo mutado un aumento del nivel defosforilación de STAT3 inducida por el COMP. Losniveles de fosforilación de JAK2 siguieron la mismatendencia: pacientes JAK2V617F 1.16 (0.02-2.81), pa-cientes JAK2WT 0.01 (0.01-0.14), normales 0.22 (0.1-0.34), Fig. 3E. En la figura 3F se muestra un ejemplorepresentativo de la activación de STAT3 en un pa-ciente JAK2V617F y en uno JAK2WT.

DISCUSIÓN

Los resultados del presente trabajo indican que elcomplejo IL-6/IL-6sR es más efectivo que la IL-6 porsí sola en la protección de la apoptosis de los proge-nitores hematopoyéticos tanto normales como depacientes con NM. Esta diferencia podría basarse enel hecho de que la IL-6 requiere del receptor especí-fico de membrana IL-6Rα, que, en los progenitoresCD34+ de las muestras estudiadas en este trabajo,tuvo una expresión baja, no superando el 12% (da-tos no mostrados). En cambio, la expresión ubicua dela gp130 encargada de transducir la señal intrace-lular, posibilita la respuesta frente al complejo IL6/IL6sR. Las rutas de señalización involucradas en esteefecto serían JAK/STAT y PI3K/AKT.

Fig. 1.– Caspasa 3 activada en progenitores hematopoyéticos CD34+. (A) Porcentaje de activación de caspasa 3 inducido por IL6 o complejo IL6/IL6sR (COMP) en pacientes (P) y controles normales (N) tomando como 100% de inducción de muerte la expresión de caspasa 3 activada en lascélulas cultivadas sin citoquinas. (B) Histograma representativo de la expresión de caspasa 3 activada en una muestra tratada con IL6 (histogramade la derecha) y COMP (histograma de la izquierda).

15SEÑALES DE SOBREVIDA INDUCIDAS POR EL COMPLEJO IL-6/IL-6SR EN EL LINAJE MEGACARIOCÍTICO

El aumento del IL-6sR plasmático que describi-mos previamente en pacientes con TE (7) nos indujoa estudiar su repercusión en las vías de señalizaciónde IL-6. Debido a la dificultad en la obtención de lacantidad suficiente de progenitores CD34+ necesariospara realizar los estudios de activación de JAK/STATutilizando esta metodología, se buscó otro tipo celu-lar que perteneciera a la estirpe afectada y que fuerade fácil obtención. Las plaquetas presentan la venta-ja de poder obtenerse fácilmente, en cantidad sufi-ciente y podrían tomarse como reflejo de la trans-ducción de la señal corriente abajo de la IL-6 en ellinaje megacariocítico.

La fosforilación de STAT3 inducida por el comple-jo IL-6/IL-6sR fue mayor en las plaquetas de los pa-cientes JAK2V617F que en los no mutados y en loscontroles sanos, demostrando un aumento de la ca-

pacidad de activación de esta vía por el complejo.Contrariamente, la TPO indujo menor activación deSTAT3 en los pacientes positivos para la mutación.Moliterno y colaboradores han demostrado que lospacientes con TE JAK2V617F+ tienen menor expre-sión del receptor Mpl en plaquetas que aquellos ne-gativos para la misma, existiendo una correlacióninversa entre la carga alélica de JAK2V617F y la ex-presión del receptor Mpl en NM8. Esto podría suge-rir que el aumento relativo de la fosforilación deSTAT3 inducida por el COMP respecto de TPO enpacientes con la mutación de JAK2 se deba tambiéna una menor actividad de TPO por la disminución desu receptor Mpl. La evaluación de los niveles de Mplplaquetario en todos los pacientes incluidos en elestudio está en curso para aclarar este punto. En con-junto, estos resultados sugieren que la señalización

Fig. 2.– (A) Porcentaje de expresión de anexina V (apoptosis temprana y tardía) inducido por IL6 o complejo IL6/IL6sR (COMP) en pacientes (P) ycontroles normales (N). (B) Marcación para anexina V en el eje X y la incorporación de ioduro de propidio en el eje Y. Los eventos comprendidos enel cuadrante inferior derecho son AV+IP-, y representan las células en apoptosis temprana. Los eventos en el cuadrante superior derecho AV+IP+corresponden a las células en apoptosis tardía.

HEMATOLOGIA ● Volumen 14 - Nº 1, 201016

Fig. 3.– Fosforilación de JAK2 y STAT3 en plaquetas. (A-D) Mediana y rango de la relación de intensidad de las bandas fosforilada y total para cadaproteína (JAK2 y STAT3) inducida por TPO y COMP en los pacientes portadores de la mutación JAK2V617F, no mutados (JAK2WT) y controlesnormales (NORM). (E) Mediana y rango de la relación de fosforilación inducida por COMP respecto a TPO ( Rel COMP/TPO) para el STAT3 y elJAK2 en los distintos grupos. (*) diferencia estadística entre el grupo JAK2V617F y los grupos JAK2WT y controles, p=0.018. (F) Western blotrepresentativo de la fosforilación de STAT3 en una muestra incubada con medio carente de citoquinas (línea 1), IL6 (línea 2), complejo IL6/IL6sR(línea 3), TPO (línea 4), receptor soluble de IL6 solo (IL6sR, línea 6). En la línea 5 se muestra un control positivo de fosforilación.

17SEÑALES DE SOBREVIDA INDUCIDAS POR EL COMPLEJO IL-6/IL-6SR EN EL LINAJE MEGACARIOCÍTICO

por JAK2/STAT3 en plaquetas de pacientes portado-res de la mutación de JAK2 estaría más estimuladapor el complejo IL-6/IL-6sR que por trombopoyetina.

Majka y colaboradores9 describieron que la TPO yla IL-6 protegen de la apoptosis a los progenitoresCD34+. En este trabajo demostramos que la presenciade IL-6sR junto a la IL-6 es más efectiva que la IL-6sola en su capacidad antiapoptótica. Si el patrón defosforilación que observamos en plaquetas fuera reflejode lo que ocurre en los progenitores, los pacientesportadores de la mutación JAK2V617F podrían tenerun aumento de STAT3 fosforilado mediado por el com-plejo IL-6/IL-6sR, lo que contribuiría, al menos enparte, a la disminución de la apoptosis que caracteri-za al clon hematopoyético en estos pacientes.

Majka demuestra, además, la capacidad de IL-6 deinducir activación de STAT1, 3 y 5 en progenitoresCD34+ y megacarioblastos pero no en plaquetas. Delmismo modo, nosotros tampoco obtuvimos fosforila-ción de JAK2 ni STAT3 inducida por IL-6 sola en nin-guna de las muestras estudiadas. Este resultado con-cuerda con la ausencia de receptor de IL-6 (IL-6α) enla membrana plaquetaria descrita por nuestro grupocon anterioridad10. En cambio, el agregado de concen-traciones equimolares de IL-6sR produjo una activa-ción de JAK2 y STAT3 en las muestras de controlesnormales y pacientes, revelando que la transducciónde la señal inducida por IL-6 en plaquetas ocurreexclusivamente a través del complejo IL-6/IL-6sR. Eneste contexto, el aumento de IL-6sR en TE cobra ma-yor importancia fisiopatológica, ya que podría aumen-tar la señalización intraplaquetaria mediada por IL-6,potenciando así la activación plaquetaria inducida porotros agonistas.

En conclusión, el complejo IL-6/IL-6sR es más efec-tivo que la IL-6 en la protección frente a estímulosapoptóticos, por lo que el aumento del nivel de IL-6sRen trombocitemia esencial favorecería la sobrevida delos progenitores hematopoyéticos CD34+ que danorigen a los megacariocitos, contribuyendo al cuadrocaracterístico de la enfermedad. Por otra parte, estimu-laría señales de activación intraplaquetaria con mayoreficiencia en pacientes JAK2V617F.

ABSTRACTIL-6 acts through its membrane bound and soluble (IL-

6sR) receptors. The latter confers IL-6 sensitivity to cellsthat lack the anchored receptor. Previously, we havereported IL-6sR increase in essential thrombocythemia (ET),a myeloproliferative neoplasm (MN). In the present work,we evaluated the effect of IL-6/IL-6sR complex (COMP)compared to that of IL-6, regarding its ability to protectCD34+ progenitors form apoptosis and to activate JAK/STAT in platelets, from both, MN patient and normalsamples. Altogether, progenitors from patients and controlsunderwent less apoptosis in the presence of COMP thanwith IL-6 (activated caspase 3 p=0.001; anexin V expression

p=0.029). JAK2 and STAT3 activation was evaluated bywestern-blot comparing the phosphorylated and the totalprotein induced by COMP (RelCOMP) and thrombopoietin(RelTPO) and calculating the ratio (R COMP/TPO).Patients harbouring JAK2-V617F had increased STAT3 RCOMP/TPO, 2.03 (0.45-3.03) (median, range) than controls,0.63 (0.014-0.8) and patients without the mutation, 0.75(0.005-1.12) ANOVA p=0.018. JAK2 activation showed thesame pattern but did not reach statistical significance.

These results suggest that COMP is more effective thanIL-6 in protecting hematopoietic progenitors fromapoptosis. These findings together with the increased IL-6sR levels previously found in ET, suggest that high IL-6sRlevels could favour megakaryocytic progenitors survival inMN. This protection would occur through JAK2/STAT3,being more efficient in patients carrying the JAK2-V617Fmutation.

Key words: Interleukin 6 receptor, Platelets, JAK2-V617F, Hematopoietic progenitors, Apoptosis.

Agradecimientos: Los autores de este trabajo agradecenal Servicio de Obstetricia y Quirófano de Obstetricia delHospital Materno Infantil de San Isidro y especialmente aSara Labat por la recolección de las muestras de sangre decordón umbilical. Este trabajo ha sido realizado con lossubsidios PIP 2004 número 5711 de CONICET, PICT 2002número 11229 y PICT 2005 número 32075 de la AgenciaNacional de Promoción Científica y Tecnológica.

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HEMATOLOGIA ● Volumen 14 - Nº 1, 20104

ARTÍCULOSORIGINALES

HEMATOLOGIA, Vol. 14 Nº 1: 4-10Enero-Marzo, 2010

Resultados del tratamiento de leucemiaslinfoblásticas agudas recaídas en pediatría.

Experiencia en una institución

Myriam R. Guitter1, Elizabeth M. Alfaro1, Jorge Rossi2,Marta Gallego3, Cristina Alonso1 y María S. Felice1

1Servicio de Hematología y Oncología2Servicio de Inmunología y Reumatología

3Servicio de GenéticaHospital Nacional de Pediatría “Juan P. Garrahan”

Combate de los Pozos 1881, Buenos Aires, ArgentinaTel/Fax 54-11-43084300 / 43085325, CPa1245Correo electrónico: myriamguitter@yahoo.com

Trabajo premiado en categoría investigación clínica en elXIX Congreso Argentino de Hematología

Fecha de recepción: 10/10/09Fecha de aprobación: 30/10/09

INTRODUCCIÓN

Las enfermedades malignas son la 1ra causa demuerte asociada a enfermedades en los pacientespediátricos en la Ciudad de Buenos Aires1. Lasleucemias agudas constituyen un tercio de lasmismas, siendo la neoplasia más frecuente en lapoblación de pacientes menores de 15 años. El 75%de las leucemias agudas son Leucemias Linfo-blásticas Agudas (LLA); actualmente el 80% de losniños con esta patología (en nuestro medio aproxi-madamente el 70%3) logra curarse con quimioterapiaconvencional, con mínimas secuelas2. El tratamientode elección para las LLA pediátricas es la quimio-terapia, cuya intensidad se determina teniendo encuenta el riesgo de que los pacientes no respondanal tratamiento, o respondan y luego la enfermedadrecaiga. Si bien aproximadamente el 97% de las LLAde diagnóstico inicial alcanza la Remisión Completa(RC) luego de la fase de inducción del tratamiento,entre 25-30% de las mismas presenta una reapariciónde la enfermedad. Por lo tanto, la principal causa defracaso del tratamiento quimioterápico sigue siendoen nuestros días la recaída de la enfermedad, y delos niños que recaen no más del 30% podrá curarsecon un 2do tratamiento. Tanto por su frecuencia,relacionada con la incidencia general de las LLA enpediatría, como por su respuesta al tratamiento ypronóstico, las recaídas de LLA constituyen unaentidad diferente a las LLA de novo4.

En el presente trabajo reportamos los resultadosdel tratamiento de 172 pacientes evaluables ingre-sados al Hospital Nacional de Pediatría “Juan P.Garrahan” (HPG) que fueron tratados de acuerdo alProtocolo LLA-REC 97, basado en la estrategia detratamiento del grupo BFM. Los objetivos principalesfueron evaluar los resultados de dicho tratamiento deacuerdo a la respuesta al mismo, las característicasde los pacientes, la duración de la 1ra RC, el inmuno-fenotipo de la LLA y el sitio de la recaída5, 6.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se realizó un análisis retrospectivo de los resul-tados del Protocolo LLA–REC 97. Se revisaron lashistorias clínicas y las bases de datos correspondien-tes de 245 pacientes con recaída de LLA diagnosti-cados y tratados en el HPG, desde Setiembre de 1994hasta Agosto de 2009. Para el presente análisis nofueron evaluables 73 (29%) pacientes debido a: haberrecibido diferentes tratamientos quimioterápicos (n:36), administración de cuidados paliativos por tratar-se de recaídas sin opciones terapéuticas (n: 26) y a nocontar con datos suficientes para su evaluación (n:11). El diagnóstico de recaída se confirmó a través decitomorfología de sangre periférica, médula ósea(PAMO), LCR (PL) y, en los casos correspondientesa infiltración testicular u otro sitio extramedular, através de material obtenido por punción con aguja

5RESULTADOS DEL TRATAMIENTO DE LEUCEMIAS LINFOBLÁSTICAS AGUDAS RECAÍDAS EN PEDIATRÍA

fina o biopsia del sitio comprometido. Se realizaronademás estudios citoquímicos, de citometría de flu-jo para determinar el inmunofenotipo de los blastosy estudios cito-genéticos/moleculares.

Los pacientes fueron estratificados en grupos deriesgo de acuerdo al momento de la presentación dela recaída, su localización y el inmunofenotipo de laLLA inicial, definiéndose 3 grupos de riesgo basadosen la estrategia de los protocolos de tratamiento delgrupo BFM (Tabla 1).

El tratamiento quimioterápico (Grafico 1 y Tabla2) incluía una prefase con prednisona como mono-droga y un bloque de quimioterapia de alta inten-sidad (como inducción de la RC), seguido por 5bloques de intensidad similar, seguidos de radiote-rapia de SNC preventiva (1200 cGy en todos lospacientes), terapéutica (2500 cGy en los pacientes conrecaídas de SNC) y/o testicular terapéutica (2500-3000 cGy en todos los pacientes con recaídas testi-culares). Luego los pacientes recibían una fase demantenimiento rotacional semanal con 4 pares dedrogas quimioterápicas, hasta cumplir 2 años detratamiento desde el momento del diagnóstico de larecaída. Todos los pacientes recibieron 1 dosis detriple quimioterapia intratecal (TIT) al diagnóstico, y1 dosis con cada uno de los bloques de quimio-terapia (total 6 dosis). En caso de tratarse de recaídasque comprometían el SNC, se administraban dosissemanales de TIT hasta observarse al menos 2determinaciones citológicas del LCR con menos de 5células por ml, libres de blastos.

Los pacientes con recaídas de alto riesgo (gruposREC2 y REC3) con donante idéntico familiar re-cibían transplante de células precursoras hema-topoyéticas (TCPH) como consolidación del trata-miento.

La RC se determinaba por la ausencia de mani-festaciones clínicas de la enfermedad, y de blastosen sangre periférica, en LCR y en MO luego del blo-que R1, al momento de la recuperación hemopo-yética.

Análisis estadístico

La respuesta a la fase de inducción se evaluó con-siderando las siguientes tasas: pacientes quealcanzaron la RC, pacientes que fallecieron durantedicha fase, y pacientes que no respondieron a laquimioterapia.

En el grupo de pacientes que alcanzaron la RC seanalizaron los eventos que presentaron (conside-rándose eventos a las 2das recaídas de la enfermedad),las muertes en RC y las 2das enfermedades malignas.

Los cálculos de las probabilidades de SobrevidaLibre de Eventos (pSLE) y de Sobrevida Libre deLeucemia (pSLL) según sitio y duración de la 1ra RCse realizaron a través del análisis de Kaplan-Meier7

y se calculó el Error Estándar (EE) por el método dePeto8. Las curvas de sobrevida se compararon através del test de log-rank9. La significación esta-dística se calculó usando chi-cuadrado o test deFisher para las variables nominales, y test de Studento test de Wilcoxon para las variables numéricas. Lasignificación estadística será expresada como valoresde p e intervalos de confianza del 95% (CI 95%).

RESULTADOS

Las características clínicas y de laboratorio de lospacientes evaluables al momento de presentar una 1ra

recaída de su LLA se observan en la Tabla 3.La respuesta a la fase de inducción fue: RC en 134

pacientes (78%), muerte durante la fase de inducciónen 20 pacientes (12%) y respuesta parcial/nula en 18pacientes (10%). De los 134 pacientes que alcanzaronla RC, 69 (52%) presentaron una 2da recaída de suLLA, con una duración media de la 2da RC de 18,8(rango: 0,7-88,8) m, 10 (7%) fallecieron en RC y 1paciente presentó una 2da enfermedad maligna (PNETen SNC). Las 2das recaídas fueron en MO en 50pacientes, extra-MO 14 (6 en SNC, 5 en testículo, 1en ojo, 1 en mama y 1 en intestino) y MO combinada(MOc) en 5 casos.

TABLA 1.– Estratificación en grupos de riesgo

Inmunofenotipo NO “T” “T”Localización Extra-MO MO y MOc Extra-MO MO y MOc

Tiempo

Muy tempranas(hasta 18 m de la RC) REC 2 REC 3 REC 3 REC 3

Tempranas(18-30 m de la RC) REC 1 REC 2 REC 2 REC 3

Tardías(30-48 m de la RC) REC 1 REC 2 REC 1 REC 2

Muy tardías(+48 m de la RC) REC 1 REC 1 REC 1 REC 2

HEMATOLOGIA ● Volumen 14 - Nº 1, 20106

Con una media de seguimiento de 49 (rango: 4-155) m, continúan en RC 54 pacientes, encontrándose37 de ellos actualmente fuera de tratamiento.

Recibieron un TCPH 26 pacientes: 1 de ellos fueun TCPH idéntico no relacionado; y los restantes 25,familiares idénticos. De estos 26 pacientes, 12presentaron 2das recaídas de su LLA a los 10,1 (r 0-37,9) m de la 2da RC, 9 de ellas en MO. Una de ellaspresentó cambio significativo interlinaje al momentode la recaída posterior al TCPH, de LLA precursor B

(Bcp) a LMA. Además en 3 casos la 2da recaída fueextra-MO (testículo, intestino y ojo), y 3 pacientesfallecieron en RC debido a complicaciones re-lacionadas con el TCPH.

La pSLE (EE) fue de 25 (3)%, y la pSLL (EE) de33 (4)% para el grupo total de recaídas. La pSLE delas LLA recaídas de inmunofenotipo Bcp fue de 28%,y las LLA recaídas de inmunofenotipo T de 6%(p:0,0025); para las LLA recaídas en MO+MOc lapSLE fue de 21% y para las LLA con recaídas extra-

TABLA 2.– Tratamiento

Drogas Dosis Días administración

PrefasePrednisona (VO) 100 mg/m2 1 al 10TITa adecuada por edad 1

Bloque R1Dexametasona (EV) 20 mg/m2 1 al 56-Mercaptopurina (VO) 100 mg/m2 1 al 5Vincristina (EV) 1.5 mg/m2 1 y 6Metotrexato (EV infusión 24hs)b 1 g/m2 1Citarabina (EV infusión 3hs) 2 g/m2 c/12hs 5L-Asparaginasa (IM) 25.000 UI/m2 6TITa adecuada por edad

Bloque R2Dexametasona (EV) 20 mg/m2 1 al 56-Mercaptopurina (VO) 100 mg/m2 1 al 5Vincristina (EV) 1.5 mg/m2 1Metotrexato (EV infusión 24hs)b 1 g/m2 1Ifosfamida (EV infusión 1h)c 400 mg/m2 c/12hs 1 al 5L-Asparaginasa (IM) 25.000 UI 6Daunoblastina (EV infusión 24hs) 50 mg/m2 5TITa adecuada por edad

Bloque R3Dexametasona (EV) 20 mg/m2 1 al 5Citarabina (EV infusión 3hs) 2 g/m2 c/12hs 1 y 2Etopósido (EV infusión 1 h) 150 mg/m2 3 al 5L-Asparaginasa (IM) 25.000 UI/m2 6TITa adecuada por edad

Mantenimiento rotacionald

Ciclofosfamida (EV infusión 1h) 300 mg/m2/día x 1 semana 1Etopósido (EV infusión 1h) 300 mg/m2/día x 1 semana 36-Mercaptopurina (VO) 45 mg/m2/día x 7 semana 2Metotrexato (VO) 1 g/m2 45 mg/m2/día x 1 semana 2Citarabina (EV infusión 1h) 300 mg/m2/día x 1 semana 3Tenipósido (EV infusión 1h) 150 mg/m2/día x 1 semana 3Vincristina (EV) 1.5 mg/m2/día x 1 semana 4Dexametasona (VO) 6 mg/m2/día x 7 semana 4

aTIT: terapia intratecalbRescates con leucovorina, 15 mg/m2 a las horas 48 y 54 del inicio dela infusión de MTXcMesna 300 mg/m2 en las horas 0, 4 y 8 de la infusión de IfosfamidadMantenimiento Rotacional, se repiten los 4 pares de drogasrotándose por semana, todos los meses hasta cumplir 2 años detratamiento desde la fecha del diagnóstico de la recaída

7RESULTADOS DEL TRATAMIENTO DE LEUCEMIAS LINFOBLÁSTICAS AGUDAS RECAÍDAS EN PEDIATRÍA

MO de 40% (p:0,0061). La pSLE de las recaídastesticulares aisladas fue de 80%, y para las otras LLArecaídas extra-MO no testiculares fue de 12%(p:0,0004). La pSLE de las LLA recaídas a <18m dela 1ra RC fue de 5%, entre 18-36 m de 25% y >36 mde 41% (p:0,0001) (Gráfico 2).

DISCUSIÓN

Las recaídas de LLA constituyen aproximada-mente un 25% de las LLA de diagnóstico inicial; esteporcentaje indica que son tan frecuentes como lamayoría de los tumores sólidos y las LeucemiasMieloblásticas Agudas (LMA) en la población pe-

Gráfico 1.– Esquema de tratamiento del Protocolo LLA–REC 97

TABLA 3.– Características de los pacientes evaluables

Características Pacientes (n=172)

SexoMasculino 118Femenino 54

Edad media al diagnóstico 9,8 r (1,8-20,8) años

InmunofenotipoPrecursor B 153 (89%)T 19 (11%)

Duración 1ra RC<18 m 41 (24%)18-36 m 79 (46%)>36 m 52 (30%)

Sitio de RECMO 106 (61%)MOc 27 (17%)Extra-MO 39 (22%)

- Testículo 12- SNC 19- Otras localizaciones 8

diátrica. Debido a su incidencia y a que presentanuna respuesta al tratamiento muy diferente a las LLAen su 1er diagnóstico, las recaídas de las LLA debenser consideradas como entidades absolutamentediferentes. La reaparición de la enfermedad leucé-mica continúa siendo el principal obstáculo paralograr la curación de las LLA a pesar de la inten-sificación de los esquemas de tratamiento4.

Los factores pronósticos más importantes quedefinen las probabilidades de mantener una 2da RCson: 1- la duración de la 1ra RC, 2- el inmunofenotipoy 3- el sitio de recaída6. En cuanto a la duración dela 1ra RC, no todas las publicaciones definen de igualmanera una duración de RC que corresponda a unacategoría de pronóstico intermedio, pero la mayoríade los reportes coinciden en incluir como recaídasmuy tempranas y tempranas a aquéllas que ocurrendentro de los primeros 18 meses desde el diagnósticoy, generalmente, durante los 2 primeros años detratamiento (ya sea durante el tratamiento o luego de6 meses de finalizado el mismo)4. Hay acuerdo en laliteratura sobre las escasas posibilidades de curaciónde estas recaídas, que no superan el 15% de pSLL.Por otro lado, en la mayoría de los reportes las re-caídas que se presentan entre los 30 y 36 meses desdeel diagnóstico presentan pSLL que, si bien es superiora la de las recaídas más tempranas, no alcanza el50%4, 5. Sin embargo, en las recaídas con una duraciónde la 1ra RC mayor de 36 meses, se han reportadopSLE a los 5 años >50%6, 10, 11, 12, 13, 14. Los resultadosobservados en nuestro análisis coinciden con laliteratura, ya que la pSLE para los niños que reca-yeron antes de los 18 meses fue de 5% vs 41% paralos que recayeron dentro de los 36 meses deldiagnóstico15. En un estudio realizado por Chessellset al.15, el 74% de los pacientes recayó dentro de los3 primeros años del diagnóstico; resultados simila-res se observaron en nuestra población de pacientes,

HEMATOLOGIA ● Volumen 14 - Nº 1, 20108

Gráfico 2.– Curvas de sobrevida

ya que un 70% recayó dentro de ese período detiempo.

En cuanto al inmunofenotipo, se encuentraclaramente definido que las recaídas de las LLA deinmunofenotipo T tienen un pronóstico más pobreque las recaídas de LLA Bcp11, 16. En nuestro análisisla pSLL de las LLA-T fue significativamente menorque la de las LLA recaídas Bcp.

Con respecto a la localización de la recaída,diversos estudios han demostrado que las recaídasextramedulares aisladas, principalmente lastesticulares, presentaban mejor pronóstico que lasrecaídas en MO aisladas6, 16. También se ha sugerido

que las recaídas medulares combinadas tenían mejorpronóstico que las medulares aisladas17. En nuestraserie las recaídas medulares aisladas tuvieron unpronóstico similar a las combinadas, mientras quepara las recaídas extramedulares observamos unapSLE significativamente superior a las recaídas en lascuales había compromiso de la MO, ya sea en formaaislada o combinada (40% vs 21%, respectivamente).Cuando analizamos por separado las recaídastesticulares del resto de las recaídas extramedularesaisladas con otras localizaciones diferentes a latesticular, encontramos que la pSLE de las recaídastesticulares fue significativamente superior (80% vs

9RESULTADOS DEL TRATAMIENTO DE LEUCEMIAS LINFOBLÁSTICAS AGUDAS RECAÍDAS EN PEDIATRÍA

12%), al igual que lo descripto en la literatura. Pro-bablemente, la pobre pSLE obtenida para las recaídasMOc y en extramedulares no testiculares (en nuestroestudio la mayoría en SNC) pueda explicarse por elmomento de recaída y/o por la persistencia deEnfermedad Mínima Residual (EMR), aún en recaí-das aparentemente extramedulares puras18, 19. Lamedición de EMR realizada por técnicas moleculareso inmunológicas durante el tratamiento de la enfer-medad ha demostrado tener significado pronóstico,pero la mayoría de estos estudios se ha realizado enpacientes con LLA de reciente diagnóstico20.

Con respecto a la elección del mejor tratamientopara estos pacientes, ha habido controversias acercade quiénes se beneficiarían del TCPH. En la 1ra com-paración sistemática del Bone Marrow TransplantRegistry se sugirió que el TCPH es superior a laquimioterapia en las recaídas a menos de 18 mesesdesde el diagnóstico21, al igual que para el estudioAlemán22 y que para la serie reportada por el grupoItaliano23. En nuestra población de pacientes no esposible hacer una comparación de la utilización depoliquimioterapia vs. transplante, ya que al tratarsede una randomización biológica solamente el 15% delos pacientes contó con donante relacionado his-toidéntico. Otra opción terapéutica sería el TCPH condonante no relacionado, pero el tiempo para la ob-tención de un donante apropiado es muy prolongado–además de costoso– en nuestro medio, y en generallos pacientes presentan nuevas recaídas antes deacceder a este tipo de tratamiento.

Finalmente, si consideramos que los resultadosglobales de pSLL de las recaídas en general, y dealgunos grupos en particular, deben ser mejorados,actualmente es necesario no sólo el desarrollo denuevas herramientas terapéuticas para este grupo depacientes, sino también la incorporación de métodosde estudio de seguimiento de la EMR en LLA re-caídas con la finalidad de redefinir los grupos deriesgo de esta patología (por Citometría de Flujo oPCR). Esta estratificación de acuerdo a la deter-minación de EMR y de estudios farmacogenéticoshará necesaria a su vez la aplicación de nuevosagentes quimioterápicos (Clofarabina, Nelarabina,Forodesina, etc.)24, 25, 26 y terapias target, que permi-tirán la realización de tratamientos de mayor inten-sidad y/o individualizados.

En lo referente a la consolidación de los trata-mientos con TCPH, debido a las escasas posibi-lidades de contar con un donante familiar idéntico ya la demora para la obtención de un donante norelacionado, es necesario el desarrollo y la evaluaciónde nuevas estrategias TCPH, como son el TCPHhaploidéntico27, 28, 29 y diversas estrategias de terapiacelular, actualmente en estudio.

CONCLUSIONES

En nuestro trabajo podemos concluir que el in-munofenotipo, la duración de la 1ra RC y el sitio dela recaída influyeron significativamente la pSLE,datos que se encuentran en concordancia con loreportado en la literatura. Los mejores resultadosfueron los de las recaídas testiculares.

El TCPH es una opción para un pequeño grupode pacientes, por lo cual actualmente es necesario eldesarrollo de nuevas terapéuticas que permitanmejorar la pSLE de estos pacientes.

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ARTÍCULOSORIGINALES

HEMATOLOGIA, Vol. 14 Nº 1: 11-17Enero-Marzo, 2010

Señales de sobrevida inducidas por el complejoIL-6/IL-6sR en el linaje megacariocítico.

Influencia de la mutación JAK2-V617F

Carlos D. Chazarreta, Nora P. Goette, Paola R. Lev, Juan P. Salim,Felisa C. Molinas, Rosana F. Marta

Hematología Investigación, UE IDIM-CONICET, Instituto Lanari, UBA.Combatientes de Malvinas 3150 C.A.B.A. CP 1427. Tel 011-4523-8947

Correspondencia a: Dra. Rosana F. Marta. rfmarta2005@gmail.com

Fecha de recepción: 10/10/09Fecha de aprobación: 30/10/09

RESUMENLa IL-6 actúa a través del receptor de membrana y del

soluble (IL-6sR) que confiere sensibilidad a células sinreceptor de membrana. Previamente reportamos aumen-to de IL-6sR en trombocitemia esencial (TE), una neo-plasia mieloproliferativa (NM). En este trabajo se evaluóla acción del complejo IL-6/IL-6sR (COMP) comparadocon la IL-6 en su capacidad de protección de la apoptosisde progenitores CD34+ normales y de NM y de activa-ción de JAK/STAT en plaquetas normales y de NM. Seevaluó expresión de fosfatidilserina por marcación conanexina V y de caspasa 3 activada en células CD34+ desangre periférica de NM y de cordón umbilical como con-trol, y activación de JAK2 y STAT3 por western-blot conanticuerpos contra las proteínas fosforiladas y sin fosfo-rilar. En conjunto, los progenitores CD34+ de pacientesy controles tuvieron menos apoptosis con COMP que conIL-6 (activación de caspasa 3 p=0.001, 7 normales, 4 pa-cientes; expresión de anexina V p=0.029, 6 normales, 5 pa-cientes; Rangos señalados Wilcoxon) La activación deJAK2 y STAT3 en plaquetas se evaluó calculando la re-lación (Rel) de intensidad de la banda de la proteínafosforilada respecto del total estimulada por COMP (RelCOMP) y por TPO (RelTPO), obteniéndose el cociente(Rel COMP/TPO). Los pacientes JAK2V617F + tuvieronaumento de Rel COMP/TPO del STAT3, 2.03 (0.45-3.03)(mediana y rango) (n=4), respecto de controles 0.63 (0.014-0.8) (n=5) y pacientes no mutados, 0.75 (0.005-1.12) (n=5)(ANOVA p=0.018). La activación de JAK2 siguió una ten-dencia similar a STAT3 aunque no alcanzó diferenciassignificativas.

Los resultados sugieren que el COMP es más efecti-vo que la IL-6 en la protección de la apoptosis de los pro-genitores CD34+. Esto junto al hallazgo de aumento deIL-6sR en TE, sugerirían que un mayor nivel de IL-6sR

favorece la sobrevida de los progenitores megacariocí-ticos en NM. La protección ocurriría a través de JAK2 ySTAT3 siendo más eficiente en pacientes JAK2V617F+.

Palabras clave: Receptor de interleuquina 6, Plaquetas,JAK2-V617F, Progenitores hematopoyéticos, Apoptosis.

INTRODUCCIÓN

La trombopoyetina (TPO) es la principal citoquinaestimulante de la megacariopoyesis. Sin embargo, sehan descrito algunos otros factores “TPO indepen-dientes” capaces de inducir el desarrollo megacario-cítico, entre ellos la interleuquina 6 (IL-6)1.

La IL-6 actúa a través de su receptor específico(IL-6Rα) en la membrana de las células blanco quese asocia con una glicoproteína llamada gp130, en-cargada de la transducción de la señal intracelular.La activación y homodimerización de la gp130 indu-ce fosforilación de Janus quinasas (JAKs), favorecien-do la activación de signal transducers and activators oftranscription (STATs). Esta ruta de señalización es ac-tivada también por TPO y por otras citoquinas queutilizan la gp130 para la transducción de la señalintracelular. Existe además una forma soluble delreceptor (IL-6sR) que al unirse a la IL-6 es capaz dedesencadenar la transducción de la señal en célulasque no poseen IL-6Rα, como las células endoteliales,y ampliar así el espectro celular sobre el que la IL-6ejerce su acción. Este mecanismo se denomina trans-señalización2. El IL-6sR se une a su ligando con afi-

HEMATOLOGIA ● Volumen 14 - Nº 1, 201012

nidad similar al IL-6Rα, actuando de maneraagonista y siendo capaz de prolongar la vida mediade la IL-6. El mecanismo de trans-señalización a tra-vés del IL6-sR se encuentra implicado en numerosaspatologías en donde actúa facilitando la acciónantiapoptótica de la IL-6. La activación de las seña-les intracelulares inducida por IL-6 es de importan-cia en la producción de progenitores hematopoyéticosinmaduros y comprometidos con el linaje mega-cariocítico3.

Las neoplasias mioloproliferativas crónicas (NM)son un grupo de enfermedades que se caracterizanpor un aumento de la proliferación de alguno de loslinajes mieloides. Así, la policitemia vera (PV) seidentifica por una exacerbación de la serie eritroide,la trombocitemia esencial (TE) por un aumento de laserie megacariocítica y la mielofibrosis primaria (MP)por fibrosis medular y desarrollo mieloide extrame-dular4. En los últimos años, el descubrimiento de lamutación V617F en la tirosinquinasa JAK2, con dife-rentes frecuencias en cada una de estas tres entida-des, ha puesto en evidencia que son patologías condiferencias fenotípicas pero que comparten ciertascaracterísticas genéticas. Los factores que determinanel desarrollo de cada uno de estos tres desórdenes noestán totalmente dilucidados. La mutación V617F enel dominio autoinhibitorio de la quinasa, induce unaumento de la actividad de la misma, provocandoactivación constitutiva en líneas celulares5 y creci-miento independiente de citoquinas in vitro6.

En un trabajo previo7 describimos el aumentoplasmático del IL-6sR en pacientes con TE. Dada la ca-racterística agonista del IL-6sR y la amplia participaciónde su ligando en la megacariocitopoyesis, en el presen-te trabajo se evaluó la actividad del complejo IL-6/IL-6sR (COMP) y de la IL-6 por sí sola en la protección dela apoptosis de células progenitoras CD34+ normalesy de pacientes con NM, así como la activación de lasrutas de señalización JAK/STAT en plaquetas norma-les y de pacientes con NM portadores de la mutaciónJAK2V617F y negativos para la misma (JAK2WT).

MATERIALES Y MÉTODOS

Pacientes y controles

Los pacientes se diagnosticaron de acuerdo a loscriterios del PVSG, utilizándose únicamente muestrasde pacientes libres de tratamiento. Se estudiaron 15pacientes, 12 con TE, 2 con PV y uno con MP. Losprogenitores hematopoyéticos CD34+ normales seobtuvieron de sangre de cordón umbilical humano departos a término de embarazadas sin antecedentes deenfermedad hematológica. La recolección de estasmuestras se realizó en el Hospital Materno Infantil

de San Isidro. Las muestras de plaquetas normalesse obtuvieron de individuos sanos que no habíaningerido medicación alguna en los últimos 8 días.

Este proyecto cuenta con la aprobación del comi-té de ética del Instituto de Investigaciones MédicasA. Lanari, y del Hospital Materno Infantil de San Isi-dro. Tanto pacientes como controles normales firma-ron el consentimiento informado correspondiente.

Muestras biológicas

Progenitores hematopoyéticos CD34 positivos: losprogenitores hematopoyéticos CD34+ normales seobtuvieron recogiendo la sangre de cordón umbilicalen tubos estériles conteniendo buffer anticoagulanteBAC (PBS, 1mM EDTA, 50 U/ml heparina). Los pro-genitores CD34+ de pacientes con NM se obtuvierona partir de sangre periférica utilizando el mismoanticoagulante.

Plaquetas: las plaquetas de pacientes y controlesnormales se obtuvieron de sangre periférica anticoa-gulada con BAC suplementado con inhibidores de laactivación plaquetaria y se aislaron por método con-vencional. El plasma rico en plaquetas fue filtradopor filtros desleucocitantes (Purecell PL, Pall Biome-dical Products, East Hills, NY, USA) para descartarla presencia de glóbulos blancos.

Purificación de progenitores CD34+

Los progenitores se purificaron por método inmu-nomagnético de selección positiva miniMACS utili-zando un anticuerpo directo anti-CD34 unido a es-feras metálicas (Myltenyi Biotec GMBH Alemania).

Estudios de apoptosis en células progenitoras CD34+

Activación de caspasa 3 por citometría de flujo:Para este ensayo se hizo proliferar a las célulasCD34+ cultivándolas por un periodo de 48 hs en me-dio IMDM suplementado con suero fetal bovino 2%,BSA 1.5%, transferrina saturada de hierro 200 µg/ml,Stem Cell Factor 25 ng/ml, lípidos sonicados, en pre-sencia de penicilina y estreptomicina. Después de laproliferación las células fueron lavadas con PBS/BSA/EDTA y cultivadas durante 12 hs en medio con-dicionado IMDM, deprivado de nutrientes, comobase para inducir apoptosis, o bien el mismo mediocon el agregado de 100 ng/ml de IL-6 o 100 ng/mlde IL-6 + 200 ng/ml de IL-6sR (citoquinas provenien-tes de R&D Systems, Minneapolis, USA). Después deeste periodo se realizó la marcación de las célulasprogenitoras con CD34 FITC y CD45 PerCP por 30min. a temperatura ambiente para la selección de lapoblación. Luego las células marcadas fueron lava-

13SEÑALES DE SOBREVIDA INDUCIDAS POR EL COMPLEJO IL-6/IL-6SR EN EL LINAJE MEGACARIOCÍTICO

das y se procedió a la fijación y permeabilizaciónutilizando un kit comercial (PharMingen TM), para laposterior marcación intracitoplasmatica de caspasa 3activada con un anticuerpo monoclonal unido a PE(Becton Dickinson, San José, CA, USA). Los resultadosse expresaron como porcentaje de marcación de caspasa3 activada en las células expuestas a los distintos trata-mientos (IL-6 sola o complejo IL-6 + IL-6sR) respecto ala marcación obtenida en las células cultivadas enIMDM sin el agregado de citoquinas, que fue conside-rada como el 100% de activación de caspasa 3.

Expresión de fosfatidilserina: las células CD34+purificadas se cultivaron en medio deprivado denutrientes como metodología para inducir apoptosis.Los cultivos se realizaron durante 16 hs a 37 °C enmedio IMDM sólo y con el agregado de 100 ng/mlde IL-6 o 100 ng/ml de IL-6 + 200 ng/ml de IL-6sR.La concentración celular sembrada fue de 50000 cé-lulas/well/ml. Pasado el tiempo de incubación lascélulas fueron cosechadas, lavadas e incubadas conAnexina V unida al fluorocromo FITC e ioduro depropidio. La Anexina V se une a la fosfatidilserina quese expone en la cara externa de la membrana plas-mática cuando la célula entra en apoptosis, mientrasque el ioduro de propidio penetra en las células en lasque la integridad de su membrana ha sido alterada,como es el caso de las células necróticas y apoptóticastardías. Para este estudio se utilizó un kit comercial(Becton-Dickinson) según las recomendaciones del fa-bricante. Los resultados se expresaron como porcen-taje de células apoptóticas totales (apoptosis tempra-na representada por eventos anexina V positivos,ioduro de propidio negativos, más apop-tosis tardía,representada por eventos anexina V positivos, iodurode propidio positivos).

Estudio de fosforilación de proteínas plaquetarias

Para el estudio de fosforilación de proteínas, lasplaquetas filtradas se ajustaron a 1.106/ul. Se estimu-laron 200 ul de esta suspensión plaquetaria con a) 100ng/ml IL-6, b) 100 ng/ml IL-6 + 200 ng/ml IL-6sR,c) 100 ng/ml TPO. Las muestras se incubaron 10minutos a 37° C, se lisaron con buffer de lisis M-Per(Pierce Biotechnology, Rockford, USA) y se agrega-ron inhibidores de proteasas y fosfatasas. Las mues-tras fueron centrifugadas a 4 °C 10 min a 14000 rpm.Las proteínas plaquetarias se separaron medianteelectroforesis en gel de poliacrilamida y se realizaronwestern-blots utilizando anticuerpos específicos con-tra las proteínas JAK2 y STAT3 fosforiladas y sinfosforilar (Cell Signalling, Beverly, MA y Santa CruzBiotechnology).

Para evaluar el grado de activación de JAK2 ySTAT3 en plaquetas, se calculó la relación (Rel) divi-

diendo la intensidad de la banda correspondiente alJAK2 o STAT3 fosforilados por la del JAK2 o STAT3total, tanto en la muestra estimulada con el comple-jo (RelCOMP) como en la estimulada por TPO(RelTPO) y luego se obtuvo el cociente entre ambasrelaciones con el fin de relativizar el grado de fosfo-rilación del complejo respecto a TPO (RelCOM/TPO).

Estadística

Los resultados se expresaron como mediana yrango. Para la comparación de la expresión decaspasa 3 activada y anexina V con los distintos tra-tamientos se utilizó el test de rangos señalados deWilcoxon que compara muestras apareadas. Paraanalizar si la protección frente a la apoptosis era dis-tinta entre pacientes y controles se utilizó el test desuma de rangos de Wilcoxon. La comparación delgrado de activación de JAK2 y STAT3 entre pacien-tes JAK2V617F, JAK2WT y controles normales se rea-lizó mediante el análisis de varianza.

RESULTADOS

Evaluación de la apoptosis de progenitores CD34+

Activación de caspasa 3

En conjunto, los progenitores hematopoyéticos depacientes y controles mostraron una menor activaciónde caspasa 3 al ser estimulados con el COMP, media-na 82.9%, rango 47.7-103.8%, respecto a la IL-6,100.0% (76.1-142.0) (p=0.001; 7 normales, 4 pacientes).Al compararse los resultados entre pacientes y con-troles, se observó que no había diferencias en el gra-do de protección del COMP respecto de la IL-6 entreambos grupos. En la Fig. 1A se muestran los resulta-dos en el grupo de pacientes y controles normales porseparado. En la Fig. 1B se muestra un ejemplo repre-sentativo de la activación de caspasa 3 obtenida enpresencia del COMP y de IL-6.

Expresión de Anexina V

De forma similar a lo observado para caspasa 3activada, la expresión de anexina V fue menor en lasmuestras estimuladas con COMP, 40.3% (12.9-83.7),que en aquellas estimuladas con IL-6 sola, 51.4%(22.4-77.3), p=0.029; (6 normales y 5 pacientes). Tam-poco se observaron diferencias en la respuesta de lospacientes respeto a los controles normales. En la Fig.2A se muestran los resultados de los pacientes y con-troles y en el Fig. 2B un ejemplo de la distribuciónde los eventos anexina V positivos por citometría deflujo.

HEMATOLOGIA ● Volumen 14 - Nº 1, 201014

De los 8 pacientes estudiados para apoptosis deprogenitores, solo uno fue portador de la mutaciónJAK2V617F. Esto imposibilitó la realización del análi-sis comparativo entre pacientes con y sin la mutación.

Activación de JAK2 y STAT3 en plaquetas

La activación de la ruta de señalización JAK2 ySTAT3 se estudió en muestras de plaquetas evaluan-do las bandas de las proteínas fosforiladas en ausen-cia de citoquinas y en presencia de a) IL-6, b) Com-plejo IL-6/IL-6sR, c) TPO, citoquina estimulante dela vía JAK2/STAT3. Tanto las plaquetas enfrentadascon vehículo carente de citoquina como aquellas in-cubadas en presencia de IL-6 no presentaron activa-ción de JAK2 ni STAT3, demostrando la incapacidadde la IL-6 por sí sola de transducir la señal enplaquetas. En cambio, la estimulación con TPO yCOMP dió lugar a la aparición de bandas de proteí-na fosforilada tanto para JAK2 como para STAT3.

La fosforilación de JAK2 inducida por TPO fuesemejante en los pacientes portadores de la mutación,0.39 (0.20-0.80), en los pacientes no mutados, 0.59 (0.05-1.86), y en los controles normales, 0.38 (0.01-0.75), Fig.3A. En cambio, se observó mayor activación de JAK2inducida por COMP en los pacientes JAK2V617F, 0.33(0.008-2.25) respecto de los no mutados, 0.007 (0.005-0.014) y los normales, 0.038 (0.004-0.07) aunque ladiferencia no fue estadística-mente significativa, Fig. 3B.

Cuando se analizó el nivel de fosforilación deSTAT3 se observaron las siguientes tendencias: alinducir la activación con TPO los pacientes con lamutación presentaron menor grado de fosforilación,0.72 (0.009-2.10), que los no mutados, 1.08 (0.35-7.79)y que los controles normales, 11.52 (0.18-21.80), Fig.

3C. Por el contrario, la fosforilación inducida por elCOMP fue mayor en pacientes JAK2V617F, 1.34 (0.69-4.61), que en los JAK2WT, 0.39 (0.005-2.80) y que lossujetos normales, 0.27 (0.11-1.84), Fig. 3D.

Al relativizar la activación inducida por el COMPrespecto a la TPO observamos mayor Rel COMP/TPO para STAT3 en los pacientes JAK2V617F, 2.03(0.45-3.03) (n=4), que en los pacientes negativos parala mutación, 0.75 (0.005-1.12) (n=5) y en los contro-les normales 0.63 (0.014-0.8) (n=5) (p=0.018), demos-trando en el grupo mutado un aumento del nivel defosforilación de STAT3 inducida por el COMP. Losniveles de fosforilación de JAK2 siguieron la mismatendencia: pacientes JAK2V617F 1.16 (0.02-2.81), pa-cientes JAK2WT 0.01 (0.01-0.14), normales 0.22 (0.1-0.34), Fig. 3E. En la figura 3F se muestra un ejemplorepresentativo de la activación de STAT3 en un pa-ciente JAK2V617F y en uno JAK2WT.

DISCUSIÓN

Los resultados del presente trabajo indican que elcomplejo IL-6/IL-6sR es más efectivo que la IL-6 porsí sola en la protección de la apoptosis de los proge-nitores hematopoyéticos tanto normales como depacientes con NM. Esta diferencia podría basarse enel hecho de que la IL-6 requiere del receptor especí-fico de membrana IL-6Rα, que, en los progenitoresCD34+ de las muestras estudiadas en este trabajo,tuvo una expresión baja, no superando el 12% (da-tos no mostrados). En cambio, la expresión ubicua dela gp130 encargada de transducir la señal intrace-lular, posibilita la respuesta frente al complejo IL6/IL6sR. Las rutas de señalización involucradas en esteefecto serían JAK/STAT y PI3K/AKT.

Fig. 1.– Caspasa 3 activada en progenitores hematopoyéticos CD34+. (A) Porcentaje de activación de caspasa 3 inducido por IL6 o complejo IL6/IL6sR (COMP) en pacientes (P) y controles normales (N) tomando como 100% de inducción de muerte la expresión de caspasa 3 activada en lascélulas cultivadas sin citoquinas. (B) Histograma representativo de la expresión de caspasa 3 activada en una muestra tratada con IL6 (histogramade la derecha) y COMP (histograma de la izquierda).

15SEÑALES DE SOBREVIDA INDUCIDAS POR EL COMPLEJO IL-6/IL-6SR EN EL LINAJE MEGACARIOCÍTICO

El aumento del IL-6sR plasmático que describi-mos previamente en pacientes con TE (7) nos indujoa estudiar su repercusión en las vías de señalizaciónde IL-6. Debido a la dificultad en la obtención de lacantidad suficiente de progenitores CD34+ necesariospara realizar los estudios de activación de JAK/STATutilizando esta metodología, se buscó otro tipo celu-lar que perteneciera a la estirpe afectada y que fuerade fácil obtención. Las plaquetas presentan la venta-ja de poder obtenerse fácilmente, en cantidad sufi-ciente y podrían tomarse como reflejo de la trans-ducción de la señal corriente abajo de la IL-6 en ellinaje megacariocítico.

La fosforilación de STAT3 inducida por el comple-jo IL-6/IL-6sR fue mayor en las plaquetas de los pa-cientes JAK2V617F que en los no mutados y en loscontroles sanos, demostrando un aumento de la ca-

pacidad de activación de esta vía por el complejo.Contrariamente, la TPO indujo menor activación deSTAT3 en los pacientes positivos para la mutación.Moliterno y colaboradores han demostrado que lospacientes con TE JAK2V617F+ tienen menor expre-sión del receptor Mpl en plaquetas que aquellos ne-gativos para la misma, existiendo una correlacióninversa entre la carga alélica de JAK2V617F y la ex-presión del receptor Mpl en NM8. Esto podría suge-rir que el aumento relativo de la fosforilación deSTAT3 inducida por el COMP respecto de TPO enpacientes con la mutación de JAK2 se deba tambiéna una menor actividad de TPO por la disminución desu receptor Mpl. La evaluación de los niveles de Mplplaquetario en todos los pacientes incluidos en elestudio está en curso para aclarar este punto. En con-junto, estos resultados sugieren que la señalización

Fig. 2.– (A) Porcentaje de expresión de anexina V (apoptosis temprana y tardía) inducido por IL6 o complejo IL6/IL6sR (COMP) en pacientes (P) ycontroles normales (N). (B) Marcación para anexina V en el eje X y la incorporación de ioduro de propidio en el eje Y. Los eventos comprendidos enel cuadrante inferior derecho son AV+IP-, y representan las células en apoptosis temprana. Los eventos en el cuadrante superior derecho AV+IP+corresponden a las células en apoptosis tardía.

HEMATOLOGIA ● Volumen 14 - Nº 1, 201016

Fig. 3.– Fosforilación de JAK2 y STAT3 en plaquetas. (A-D) Mediana y rango de la relación de intensidad de las bandas fosforilada y total para cadaproteína (JAK2 y STAT3) inducida por TPO y COMP en los pacientes portadores de la mutación JAK2V617F, no mutados (JAK2WT) y controlesnormales (NORM). (E) Mediana y rango de la relación de fosforilación inducida por COMP respecto a TPO ( Rel COMP/TPO) para el STAT3 y elJAK2 en los distintos grupos. (*) diferencia estadística entre el grupo JAK2V617F y los grupos JAK2WT y controles, p=0.018. (F) Western blotrepresentativo de la fosforilación de STAT3 en una muestra incubada con medio carente de citoquinas (línea 1), IL6 (línea 2), complejo IL6/IL6sR(línea 3), TPO (línea 4), receptor soluble de IL6 solo (IL6sR, línea 6). En la línea 5 se muestra un control positivo de fosforilación.

17SEÑALES DE SOBREVIDA INDUCIDAS POR EL COMPLEJO IL-6/IL-6SR EN EL LINAJE MEGACARIOCÍTICO

por JAK2/STAT3 en plaquetas de pacientes portado-res de la mutación de JAK2 estaría más estimuladapor el complejo IL-6/IL-6sR que por trombopoyetina.

Majka y colaboradores9 describieron que la TPO yla IL-6 protegen de la apoptosis a los progenitoresCD34+. En este trabajo demostramos que la presenciade IL-6sR junto a la IL-6 es más efectiva que la IL-6sola en su capacidad antiapoptótica. Si el patrón defosforilación que observamos en plaquetas fuera reflejode lo que ocurre en los progenitores, los pacientesportadores de la mutación JAK2V617F podrían tenerun aumento de STAT3 fosforilado mediado por el com-plejo IL-6/IL-6sR, lo que contribuiría, al menos enparte, a la disminución de la apoptosis que caracteri-za al clon hematopoyético en estos pacientes.

Majka demuestra, además, la capacidad de IL-6 deinducir activación de STAT1, 3 y 5 en progenitoresCD34+ y megacarioblastos pero no en plaquetas. Delmismo modo, nosotros tampoco obtuvimos fosforila-ción de JAK2 ni STAT3 inducida por IL-6 sola en nin-guna de las muestras estudiadas. Este resultado con-cuerda con la ausencia de receptor de IL-6 (IL-6α) enla membrana plaquetaria descrita por nuestro grupocon anterioridad10. En cambio, el agregado de concen-traciones equimolares de IL-6sR produjo una activa-ción de JAK2 y STAT3 en las muestras de controlesnormales y pacientes, revelando que la transducciónde la señal inducida por IL-6 en plaquetas ocurreexclusivamente a través del complejo IL-6/IL-6sR. Eneste contexto, el aumento de IL-6sR en TE cobra ma-yor importancia fisiopatológica, ya que podría aumen-tar la señalización intraplaquetaria mediada por IL-6,potenciando así la activación plaquetaria inducida porotros agonistas.

En conclusión, el complejo IL-6/IL-6sR es más efec-tivo que la IL-6 en la protección frente a estímulosapoptóticos, por lo que el aumento del nivel de IL-6sRen trombocitemia esencial favorecería la sobrevida delos progenitores hematopoyéticos CD34+ que danorigen a los megacariocitos, contribuyendo al cuadrocaracterístico de la enfermedad. Por otra parte, estimu-laría señales de activación intraplaquetaria con mayoreficiencia en pacientes JAK2V617F.

ABSTRACTIL-6 acts through its membrane bound and soluble (IL-

6sR) receptors. The latter confers IL-6 sensitivity to cellsthat lack the anchored receptor. Previously, we havereported IL-6sR increase in essential thrombocythemia (ET),a myeloproliferative neoplasm (MN). In the present work,we evaluated the effect of IL-6/IL-6sR complex (COMP)compared to that of IL-6, regarding its ability to protectCD34+ progenitors form apoptosis and to activate JAK/STAT in platelets, from both, MN patient and normalsamples. Altogether, progenitors from patients and controlsunderwent less apoptosis in the presence of COMP thanwith IL-6 (activated caspase 3 p=0.001; anexin V expression

p=0.029). JAK2 and STAT3 activation was evaluated bywestern-blot comparing the phosphorylated and the totalprotein induced by COMP (RelCOMP) and thrombopoietin(RelTPO) and calculating the ratio (R COMP/TPO).Patients harbouring JAK2-V617F had increased STAT3 RCOMP/TPO, 2.03 (0.45-3.03) (median, range) than controls,0.63 (0.014-0.8) and patients without the mutation, 0.75(0.005-1.12) ANOVA p=0.018. JAK2 activation showed thesame pattern but did not reach statistical significance.

These results suggest that COMP is more effective thanIL-6 in protecting hematopoietic progenitors fromapoptosis. These findings together with the increased IL-6sR levels previously found in ET, suggest that high IL-6sRlevels could favour megakaryocytic progenitors survival inMN. This protection would occur through JAK2/STAT3,being more efficient in patients carrying the JAK2-V617Fmutation.

Key words: Interleukin 6 receptor, Platelets, JAK2-V617F, Hematopoietic progenitors, Apoptosis.

Agradecimientos: Los autores de este trabajo agradecenal Servicio de Obstetricia y Quirófano de Obstetricia delHospital Materno Infantil de San Isidro y especialmente aSara Labat por la recolección de las muestras de sangre decordón umbilical. Este trabajo ha sido realizado con lossubsidios PIP 2004 número 5711 de CONICET, PICT 2002número 11229 y PICT 2005 número 32075 de la AgenciaNacional de Promoción Científica y Tecnológica.

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10. Marta R, Goette N, Chazarreta CD, Pirola C, Molinas FC. Nor-mal platelets possess soluble interleukin 6 receptor. Cytokine2005; 29: 13-17.

INFORMACIÓNGENERAL

HEMATOLOGIA, Vol. 14 Nº 1: 18Enero-Marzo, 2010

Por la trascendencia para la comunidad hematológica y prenda para laSociedad, cabe en nuestra Revista señalar la presentación del libro” Las neoplasiaslinfoides” bajo la dirección de las Dras. Norma Tartas y Marta Zerga y el Dr.Julio C. Sánchez Avalos recientemente editado y en distribución entre los colegas.Fruto de un esfuerzo mancomunado intenso, es una clara muestra de la capacidadintelectual de nuestra comunidad que nos alegra, satisface e impulsa a emprenderotras obras.

Se trascribe entonces el discurso pronunciado por la Dra. Norma Tartas entan jubilosa ocasión.

Presentación del Manual de Oncohematología:LAS NEOPLASIAS LINFOIDES

Sede de la SAH, 5 de Noviembre de 2009

Estamos aquí para presentar el manual “Las Neoplasias Linfoides”,el que tiene como destinatarios a los médicos hematólogos en formación.

La historia de la gestación de este manual empieza hace muchos años,cuando yo era becaria de hematología de la UBA y trabajaba en complejossolubles de monómeros de fibrina en el Instituto de InvestigacionesMédicas. El entonces director, Profesor Alfredo Lanari, al cruzarse conmigofortuitamente en un patio de la institución, me dijo que yo tenía queescribir una revisión sobre linfomas. En ese momento adopté un recursotípico de médica residente, dije: ¡Si Doctor! y me preparé para desaparecersistemáticamente de su vista. No tenía ni la mas remota idea de cómocumplir semejante orden. Ha pasado mucho tiempo y como dijo el poeta“en la ciudad del devenir los caminos son circulares”; hoy, con la ayudade muchos, el mandato de Alfredo Lanari. Finalmente se cumplió.

Es difícil que muchos hematólogos estén unánimemente de acuerdoen algo, pero eso ocurrió y así dedicamos el manual al profesor Etcheverry.Miguel Angel Etcheverry dedicó una buena parte de su vida profesionala la enseñanza de la Hematología y se constituyó en un modelo a seguirpara los docentes en la materia. Con este manual también trataremos dehonrar su memoria, difundiéndolo en todas las Sociedades de Hematologíadel interior del país y de la América de habla hispana.

“Las neoplasias linfoides“ se editó gracias a la buena voluntad demuchos, sus autores y mis compañeros de dirección editorial los DoctoresMarta Zerga y Julio Sánchez Ávalos, quienes con su espíritu críticofavorecieron el intercambio creativo y esto fue fundamental para lograrnuestro objetivo. También lo fue, el soporte financiero y técnico delLaboratorio Bio Sidus, personalizado en Alfredo Mari y Osvaldo Nuñez,sus gerentes, las licenciadas Analía Nuñez y Graciela Sánchez del equipode diseño de Sidus. Todos ellos permitieron que el primer manualrioplatense de neoplasias linfoides fuese editado por un laboratorioargentino que nos enorgullece y de esta manera completar otro caminocircular.

La SAH nos dio el auspicio y un mensaje cálido de su presidente DardoRiveros fue oportuno y muy valorado. Antes de darle la palabra al Dr.Riveros.pido un fuerte aplauso para todos por este logro tan anhelado.

Gracias.

Dra. Norma Tartas

HEMATOLOGIA ● Volumen 14 - Nº 1, 201020

REGLAMENTO DEPUBLICACIONES

La Revista Hematología es el órgano oficial de difusión de la Socie-dad Argentina de Hematología (SAH). En ella se publicarán trabajos re-lacionados con la especialidad, siempre que se ajusten a los requerimien-tos científicos y técnicos establecidos por el Comité Editor quien tendrála facultad de aceptar o rechazar los trabajos enviados para la publica-ción. Se admitirá la publicación de trabajos de autores de habla no his-pana en idioma inglés.

Esta revista está constituida sobre la base de diversas secciones a de-sarrollar:

1) Editorial2) Artículos originales3) Actualizaciones y/o revisiones4) Artículos especiales (compuestos por Comunicaciones breves, Ate-

neos Anatomoclínicos, Resolución de problemas clínicos, Reportede casos)

5) Imágenes en Hematología6) Correo de lectores7) Información General (Comentarios de libros, revistas o material in-

formativo, congresos, jornadas, información sobre las actividadesde interés científico de la Sociedad).

Las Editoriales serán solicitadas únicamente por el Comité Editor. Tendrán título y texto con característi-cas de monografía, en lo posible con una extensión no mayor de 2 páginas, con un máximo de 5 citas biblio-gráficas, figurando al final el nombre del autor, su dirección, código postal, TEL/FAX.

Los Artículos originales deberán ser presentados por triplicado, impresos en papel tamaño A4, con fuentestamaño 10, 70 caracteres por renglón, 25 líneas por página, numeradas en forma correlativa, incluyendo ta-blas y bibliografía. Deben ser originales e inéditos en el país. Se podrán publicar en este ítem aquellos traba-jos que fueron presentados en reuniones de la SAH, así como también en Reuniones Nacionales o Interna-cionales.

La evaluación del contenido científico será efectuada por dos o más árbitros seleccionados, quienes reci-birán el trabajo, conservándose su anonimato.

Los trabajos se desarrollarán según el siguiente ordenamiento: a) Título; b) Resúmenes (en hoja aparte);c) Introducción; d) Material y métodos; e) Resultados; f) Discusión; g) Bibliografía.

Título: Deberá ser consignado con mayúsculas y sin abreviaturas, será breve y preciso. En renglón apar-te se detallará la nómina de autores, separados por comas, comenzando por el primer nombre, iniciales delos segundos nombres y apellido completo. A continuación el nombre de la institución u hospital donde serealizó el trabajo, la dirección, TEL/FAX y el código postal del autor a quien dirigir la correspondencia.

Resumen: Cada trabajo deberá presentar un resumen en castellano y otro en inglés (incluyendo título endicho idioma) los cuales proporcionarán por sí mismos una idea concisa de cada uno de los puntos antesmencionados; y no deben ser más extensos de 200 palabras cada uno. Deberán consignarse 3 a 5 palabrasclave en inglés y en castellano al pie del resumen utilizando términos del Medical Subjects Headings delIndex Medicus.

Introducción: Explicará los fundamentos y objetivos del trabajoMaterial y métodos: Detallará las características del material, la metodología empleada y el método esta-

dístico utilizado.Resultados: Deberán estar expresados con claridad.Discusión: Analiza los resultados y los hechos que tengan relación directa con los mismos, las relaciones

entre éstos y el objetivo inicialmente propuesto y su confrontación con los conocimientos establecidos pre-viamente.

Bibliografía: Sólo se incluirán las referencias que hayan sido consignadas en el artículo, ordenadas numérica-mente en forma correlativa. Se hará figurar inicialmente la nómina de autores separados por comas, comenzandopor el apellido, seguido por las iniciales de los nombres. Cuando el número de autores sea mayor de 6, se harámención sólo a los primeros 3 seguidos de la sigla “y col.”; a continuación se consignará el título del trabajo se-guido del nombre de la revista en forma abreviada, según lo establezca por el «Index Medicus»; año de publi-cación, punto y coma, número de Volumen dos puntos, página inicial, guión, página final.

HEMATOLOGIA, Vol. 14 Nº 1: 20-21Enero-Marzo, 2010

REGLAMENTO DE PUBLICACIONES 21

Ejemplo: Kaldor JM, Day EN, Clarke EA y col. Leukemia following Hodgkin’s disease. N Engl J Med1990; 322: 7-13.

Cuando se trate de libros se harán figurar el nombre del autor/es, título del capítulo, título del libro,editor/es, año de aparición, páginas separadas por guión, agregando el número de edición si no fuera laprimera edición, editorial, y ciudad.

Ejemplo: Hughes TP and Goldman JM. Chronic myeloid leukemia. Hematology: Basic Principles andPractice. R. Hoffman, EI Benz, SJ Shatill, B Furie y EJ Cohen 1991, p 854-869. ChurchillLivingstone, Edinburgh

Las ilustraciones correspondientes al trabajo como las radiografías, dibujos, registros, etc., deberán presentar-se en forma de fotos en blanco y negro, con adecuado contraste, en tamaño de 9 x 12 cm o mayor, numeradas enforma correlativa al dorso, en caracteres arábigos. En hoja aparte se consignarán las leyendas o epígrafes corres-pondientes. Al dorso de cada fotografía deberá agregarse el nombre del primer autor y título del trabajo.

Las tablas deberán presentarse en hojas individuales, confeccionadas en forma clara, numeradas en ca-racteres romanos y con un título. No se aceptarán tablas que ocupen un espacio mayor que el de una páginade la Revista.

Las abreviaturas y símbolos deberán estar especificados en el texto o al pie de las tablas.Las Actualizaciones y/o revisiones serán solicitadas por el Comité Editor. El título, autores, lugar donde se

realizó, así como las tablas e ilustraciones guardarán las mismas formas que en los artículos originales.La sección de Artículos especiales estará compuesta por Ateneos Anatomoclínicos, Reporte de casos, Re-

solución de problemas clínicos y las Comunicaciones breves. Las comunicaciones de casos no deberán exce-der de 3 páginas, con un máximo de 3 ilustraciones y de 4 autores. No deberán exceder de 8 citas. En el casode los ateneos anatomoclínicos se procederá de la misma forma que en los artículos originales.

Las Comunicaciones breves no deberán exceder 3 páginas de tamaño oficio mecanografiadas a doble es-pacio, incluyendo en las mismas texto, figuras, tablas y bibliografía. Se desarrollarán de la misma forma queen los artículos originales. Hasta doce citas bibliográficas.

Imágenes en Hematología: estará constituido por material fotográfico en colores de excelente calidad des-tinado a exponer claramente temas de diversa índole, con especial objetivo docente. Ocuparán 1 página y sedesarrollarán según el orden siguiente: Título, texto conciso, imagen, nombre del autor/es. Podrá agregarse1 cita bibliográfica haciendo constar sólo el nombre de la revista y su identificación.

En el Correo de lectores se publicarán opiniones sobre situaciones clínicas y experiencias que puedan rela-cionarse o no con los artículos publicados en la Revista, con sentido crítico, objetivo y/o educativo, aceptándo-se derecho a réplica en caso de opinar sobre algún trabajo publicado. Su extensión máxima será de 2 páginasde tamaño oficio mecanografiadas a doble espacio, aceptándose hasta 4 citas bibliográficas.

El Comité Editor acusará recibo de los artículos presentados, informando acerca de la aceptación, modi-ficación o devolución dentro de los 90 días de la recepción.

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