Modelo cobayo Prueba de potencia de Vacunas virales Bovinas

Dra Viviana Parreño Instituto de Virología

CICV y A INTA Castelar Investigador Adjunto CONICET

vparreno@cnia.inta.gov.ar

PROSAIA Grupo ad hoc VACUNAS VIRALES:

En 1 año de trabajo se cerraron 3 guías:

Nº1 POTENCIA Y EFICACIA PARA VACUNAS DE BoHV-1 (IBR) (Octubre 2011)

POTENCY AND EFFICACY for bovine vaccines containing bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) causal agent of the Infectious Bovine Rhinotracheitis (IBR)

(Documento de trabajo del CAMEVET TRAMITE I)

Se contestaron las inquietudes de representante de USA

-Donna Gatewood, Section Leader, Virology, USDA/APHIS/VS/CVB PEL

-David Siev, Statistics Stetion Leader, USDA

PROSAIA Grupo ad hoc VACUNAS VIRALES:

1-CVB allows in vitro potency tests using a parallel line assay and a validated reference vaccine.

2-Original data set to obtain the SPLIT POINTS values for vaccine classification

3-Guinea pig receives two doses of vaccine, 21 days apart. Why the 2 vaccination schedules?

4- Note that the cutoffs proposed by the authors are intended to discriminate only between differences of at least one common logarithm (i.e. tenfold).

5- Report other parameter for the guinea pig model

ELISA: Predictivity, precision and accuracy 100% (all vaccines)

VN: Predictivity 75%, precision 90% (very satisfactory vaccines) - Accuracy 82%

IBR 23

IBR-DVB 44

IBR-DVB-PI3 53

IBR-DVB-PI3-BRSV 23

IBR-PI3 2

IBR-DVB-RVB 1

RVB 7

RVB-CVB 3

DVB-RVB 2

TOTAL 158

VALENCIA NÚMERO DE SERIES

PRODUCCIÓN de Vacunas Virales

No Vesiculares 2009 1

3 200

17

12

13

25

1616

53

Agropharma

Biogenesis Bagó

CDV

Tecnovax

Invesbio

ISG

Inmunovet

Rosenbusch

Fuerte Sancti Spiritu

OVER Lab Sta Elena

Zoovac

Richmond

Series presentadas

(total 158)

Cantidad de dosis

(Total 32.410.445)

Síndrome respiratorio

SDVE, Balcarce. 1995-2002

Dyctiocaulus

4%

Virus

53%

Intererminado

10%

Otros

32%

A pyogenes

3%

Otra bact

5%

M haemolytica

5%

P multocida

10%

H somnus

10%

n=96

Bacterias

Virus

BRSV

18%

PI3

15%

IBR

22%Otros

virus

5%

Otros

agentes

40%

Modelo cobayo Prueba de potencia de Vacunas virales Bovinas IBR

Vacunas evaluadas por SENASA-INTA:

Periodo: 2008 to 2011

Laboratorios productores: 11

Vacunas: 81 (59 acuosas y 22 oleosas)

Prueba de Potencia en cobayos

1. Codificación de las muestras de vacunas (planilla de codificación/

planilla de vacunación y sangrado/ planilla diaria)

2. Bioterio de inoculados- SENASA- Protocolo INTA

3. Los sueros obtenidos se fraccionan en cuatro paquetes

4. ELISA y VN se realizan en INTA

5. Una vez obtenidos los resultados, se realiza la

Decodificación de las muestras

IMPORTANTE

Los laboratorios involucrados en la prueba están invitados a presenciarla.

Una vez realizada la decodificación, los laboratorios pueden retirar una contramuestra de

sus sueros.

Dra. Virginia Barros DILAB-SENASA

Técnica

Criterio de Clasificación

POTENCIA

No

safistactoria

Satisfactoria

Muy

satisfactoria

ELISA < 1.93 1.93 a 3.02 > 3.02

VN < 1.31 1.31 a 2.05 > 2.05

Criterio de clasificación del Título de Ac estimado para

IBR a partir del Modelo Cobayo INTA

Cortes 2010

VACUNAS DE REFERENCIA

IBR oleosa y acuosa

CONTROLES

DE CALIDAD

VACUNA ACUOSA VACUNA OLEOSA

Fecha elaboración

vencimiento

Jun/08 – jun/10

24 meses

Jul/08 – jul/10

24 meses

Titulo viral BoHV-1

Infeccioso,

pre-inactivación

3.16 x 10 ^7 /dosis

3.16 x 10 ^7 /dosis

Esterilidad/inactivación

(formol residual)

Negativo/ inactivado

0.18%

Negativo/ inactivado

0.17%

pH 7.4 7.5

Adyuvante Al(OH)3 Oleoso/Agua en aceite

vis 37 cp 0.01 uSi/cm

Volumen de dosis

(Total de dosis )

5 ml

(1500 dosis)

3 ml

(2500 dosis)

RESULTADOS

73% (52/81) VACUNAS APROBADAS 25 VACUNAS RECHAZADAS

Vacunas evaluadas por SENASA-INTA:

Período: 2008 to 2011

Laboratorios productores: 11

Vacunas: 81 (59 acuosas y 22 oleosas)

CV: 14% CV: 20%

2008 2009 2010 2011

2008 2009 2010 2011

ELISA VN

RESULTADOS

IBR VACUNA de Referencia ACUOSA. Control chart

(Bioterio: SENASA post-4 años de elaboración)

MEDIA

-2sd

-3sd

+2sd

+3sd

ELISA cortes: 1,93-3,02 VN cortes: 1,31-205

El modelo COBAYO INTA representa

◦ una herramienta útil para controlar la inmunogenicidad de vacunas contra IBR del mercado.

◦ Permite estudiar la estabilidad de la potencia entre lotes de vacunas y

de una misma vacuna en el tiempo.

Es un método de control más económico, más reproducible e insume menor tiempo que la prueba en bovinos. Evita el problema de contar con bovinos seronegativos en países endémicos como Argentina.

Es una prueba basada en métodos serológicos, que cumple con el

principio de las 3R (refinamiento, reducción y remplazo) de bienestar animal y que puede formar parte del principio de “consistencia” de GMP.

CONCLUSIONES

Grupo ad hoc VACUNAS VIRALES:

proyecto de resolución SENASA

“Regulación para las vacunas virales inactivadas no vesiculares para bovinos” .

Se realizó comentario a la consulta pública

N° 2: POTENCIA Y EFICACIA PARA VACUNAS DE PI-3. (Septiembre 2012)

(A presentar en reunion anual CAMEVET, San Pablo, Brasil - 3 al 5 de Octubre, 2012

N° 3: INOCUIDAD (Septiembre 2012)

PARAINFLUENZA 3 ROTAVIRUS

Dra Viviana Parreño

Sección de Virus Éntericos (Lab VD) Instituto de Virologa

CICV y A INTA Castelar vparreno@cnia.inta.gov.ar

Tel 4481 3006

Desarrollo y Validación Estadística

de un Modelo Cobayo para el control

de vacunas de Parainfluenza 3

Vacuna PI-3: Control de Calidad

Inmunogenicidad POTENCIA

Desempeño a campo Ensayo de Eficacia

? ?

Validación estadística de un modelo animal de laboratorio para evaluar vacunas de PI-3

◦ Estudio de la respuesta de anticuerpos frente a la vacunación en

el modelo cobayo y bovinos

◦ Análisis Estadístico en cada especie para definir categorías de calidad inmunogénica (POTENCIA) de las vacunas.

◦ Estudio de concordancia entre el modelo y la especie de destino:

Capacidad del Modelo cobayo de predecir la potencia de las vacunas de PI-3 en bovinos

1

2

3

4

0 30 60 90

A 1x108

B 5x107

C 1x107

D 1x106

E 1x105

Placebo/testigo

Ensayos Dosis Respuesta: Capacidad Discriminatoria

Vacunas Oleosas con concentraciones crecientes de PI-3

n=10 cobayos/vacuna

PI-3 IHA

a

b

a

b

c

Cobayos

Bovinos

Tiempo (días post vacunación)

PI-3: la prueba en cobayo

discriminó

significativamente entre

vacunas oleosas formuladas

con títulos de Ag de 10^5;

10^6 y títulos de 10^7 o

mayores a los 30 dpv

c

Titu

lo d

e A

c I

HA

an

ti P

I-3

Tiempo (días post vacunación)

21

1

2

3

4

0 30 60

A 1x108

B 5x107

C 1x107

D 1x106

E 1x105

Se observó una relación directamente proporcional entre la

Respuesta de Ac y la concentración de Ag en ambas especies

El patrón de respuesta fue similar en ambas especies animales

Cinética de la respuesta de Ac

Magnitud de la respuesta de Ac

CONCLUSIONES

El modelo cobayo arrojó resultados mas homogéneos

y presentó mayor capacidad discriminante que los bovinos

Ensayos Dosis Respuesta: Capacidad Discriminatoria

Vacunas Oleosas con concentraciones crecientes de PI-3

4,00 5,00 6,00 7,00 8,000,00

1,25

2,50

3,75

5,00

4,00 5,00 6,00 7,00 8,000,00

1,25

2,50

3,75

5,00

BOVINOS (60 dpv) COBAYOS (30 dpv)

Modelo lineal polinómico de 2º grado

R2 86%; p< 0,0001

Titulo de Ac IHA predicho:

-13,69 + 4,22 Ag PI-3 – 0,258 Ag PI-32

Modelo lineal polinómico de 2º grado

R2 82%; p< 0,0001

Titulo de Ac IHA predicho:

-3,139 + 1,71 Ag PI-3 – 0,1122 Ag PI-32

Tit

ulo

de

Ac

IHA

an

ti-P

I-3

(lo

g 1

0)

Estimacion de puntos de corte para clasificar vacunas de PI-3

Curva de regresión ajustada e intervalos de confianza y de predicción

Cada punto representa un promedio de 5 animales vacunados con vacuna de dosis creciente de PI-3

ESPECIE

Criterio de Clasificación VACUNAS

Concentración de Ag de PI-3/dosis

No

satisfactoria Menor de 10

6

Satisfactorias

[106- 10 7 )

Muy

satisfactorias 10 7 o mayor

COBAYO

< 1.5 1.5 a 2.4 > 2.4

BOVINO

< 2.8 2.8 a 3.1 > 3.1

Criterio de clasificación de vacunas para PI-3

Expresado como el log de las unidades inhibitorias de la hemoaglutinacion

(UIHA) anti-PI-3

Concordancia entre

El Modelo Cobayo y los Bovinos

Evaluar la capacidad de los modelos bovino y cobayo de

categorizar correctamente las vacunas Gold standard (de

formulación conocida)

Evaluar la concordancia de resultados de títulos de Ac. de

bovinos y cobayos en vacunas comerciales.

Concordancia el modelo cobayo y la especie de destino

para clasificar vacunas de Referencia (gold std) contra PI-3

Cobayo

Bovino

No satif.

(X<2.80)

satisfactoria

(X≥2.80)

No satisfactoria

(x<1.50) 19 0

Satisfactoria

(X≥1.50) 2 18

n 39 Weighted Kappa

0,898

Standard error

0,07

95% CI 0,760 to 1,000

17 vacunas dosis rta oleosas

6 vacunas experimentales de concentración conocida

(5 acuosas y 1 oleosa)

16 controles negativos (placebos y testigos)

Concordancia

casi perfecta

71 vacunas

39 GOLD STD + 32 COMERCIALES

Concordancia el modelo cobayo y la especie de destino

para clasificar vacunas COMERCIALES contra PI-3

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00

PI3IHAC30

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

PI3

IHA

B60

B

OV

INO

cobayo

Bovino (X≥2.8)

Cobayo (x≥1.5)

No satisfactoria

Satisfactoria

No satisfactoria

33 0 33 (46,5%)

Satisfactoria 8 30 38 (53,5%)

41 (57,7%)

30 (42,3%)

71

Concordancia

MUY BUENA

Concordance correlation coefficient weighted Kappa

0,7771

95% Confidence interval 0,6681 to 0,8534

Pearson ρ (precision) 0,7971

Bias correction factor Cb (accuracy)

0,9748

32 vacunas comerciales

12 vacunas no satisfactorias bov-cob

(3 no poseen PI-3 en su formulación)

12 vacunas satisfactorias bov-cob

6 discordantes: cob + bov -

ACUOSA OLEOSA

GOLD STD COMERCIAL

Tipo de Vacuna

1,00

1,75

2,50

3,25

4,00

Titu

lo d

e A

c IH

A a

nti-P

I3

ACUOSA OLEOSA

1,5

2,4

ACUOSA OLEOSA

GOLD STD COMERCIAL

Tipo de Vacuna

1,00

2,00

3,00

4,00

Titu

lo d

e A

c a

nti-P

I-3

ACUOSA OLEOSA

2,8

El modelo COBAYO INTA representa

◦ una herramienta útil para controlar la inmunogenicidad de vacunas contra PI-3 y predecir su potencia en la especie de destino.

Es un método de control más económico, más reproducible e insume menor

tiempo que la prueba en bovinos. Evita el problema de contar con bovinos seronegativos en países endémicos como

Argentina.

Evita el problema de utilizar bovinos con anticuerpos calostrales que interfieren el desarrollo de la respuesta inmune humoral

Es una prueba basada en métodos serológicos, que cumple con el principio de las

3R (refinamiento, reducción y remplazo) de bienestar animal y que puede formar parte del principio de “consistencia” de GMP.

CONCLUSIONES

Grupo ad hoc VACUNAS VIRALES:

Próximo tema a trabajar con el grupo ad hoc VACUNAS VIRALES: POTENCIA Y EFICACIA PARA ROTAVIRUS.

Daniela Rodriguez

Nancy Suarez Perez

Lic Laura Marangunich

Ing Maria Virgina Lopez

EQUIPO ESTADÍSTICO

Maria Marta Vena y equipo

AGRADECIMIENTOS

Virginia Barros

Hugo Murcia

Valeria Gonzalez

Thomas

Ricardo D’Aloia

Eduardo Maradei

ELISA IBR

Anti bovine IgG(H+L)

Peroxidase labeled Anti guinea pig IgG(H+L)

Peroxidase labeled

POD

ABTS/H202

KITS DIAGNOSTICOS

IBR VACUNA de Referencia OLEOSA. Control chart

(Bioterio: SENASA post-4 años de elaboración)

0,5 2 3,5 12 14 17 21 23 25 28 29 33 48 50 52

2008 2009 2010 2011

MEDIA

-2sd

-3sd

+2sd

+3sd

CV: 14%

0,5 2 3,5 12 14 17 21 23 25 28 29 33 48 50 52

2008 2009 2010 2011

CV: 17%

RESULTADOS

ELISA cortes: 1,93-3,02 VN cortes: 1,31-205