visión moderna de la hemostasia: nuevo modelo de coagulación

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CURSO DE FORMACIÓN CONTINUADA A DISTANCIA 2011-2012 TALLER DEL LABORATORIO CLÍNICO Nº 2 VISIÓN MODERNA DE LA HEMOSTASIA: NUEVO MODELO DE COAGULACIÓN

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CURSO DE FORMACIÓN CONTINUADA A

DISTANCIA 2011-2012

TALLER DEL LABORATORIO CLÍNICO

Nº 2

VISIÓN MODERNA DE LA

HEMOSTASIA: NUEVO MODELO

DE COAGULACIÓN

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I.S.S.N.- 1988-7469

Título: Taller del Laboratorio Clínico

Editor: Asociación Española de Biopatología Médica

Maquetación: AEBM

Fecha de Distribución: diciembre de 2011

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Visión moderna de la hemostasia: nuevo

modelo de coagulación

Eva Menéndez Alonso.- Residente de Bioquímica Clínica, Shaila Rubio Arias.- Residente de Análisis Clínicos, Mª Teresa Sánchez

Calvin.- FEA de Análisis Clínicos. Hospital Universitario 12 de Octubre. Madrid.

1. INTRODUCCIÓN

La hemostasia permite que la sangre circule libremente por los vasos sanguíneos

y cuando existe una lesión, inicia una serie de mecanismos fisiológicos que conducen

a la formación del trombo hemostático, a reparar el daño y finalmente disolver el

coágulo representando el cese fisiológico de la hemorragia.

El sistema de coagulación junto a los mecanismos de retroalimentación asegura la

eficacia hemostática, mientras que el sistema fibrinolítico actúa como regulador del

sistema de la coagulación, eliminando la fibrina no necesaria para la hemostasia.

La hemostasia siempre depende del equilibrio entre ambos sistemas, este

equilibrio es perfecto en las personas sanas. Si hay un déficit de los factores de

coagulación o si el potencial fibrinolítico sobrepasa el de coagulación, se producirá

una hemorragia. Al contrario, si el potencial de coagulación sobrepasa al fibrinolítico

o se produce una disminución de los factores de inhibición de la coagulación se

producirá una trombosis.

Las superficies celulares, plaquetas, células endoteliales, fibroblastos y monocitos

principalmente, juegan un papel muy importante dentro de la coagulación sanguínea.

Desempeñan dos acciones básicas en la hemostasia. Por una parte proporcionan los

factores esenciales que normalmente no están presentes en el plasma y por otra

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proveen una superficie para el ensamblaje de los complejos enzima-cofactor y su

interacción con los sustratos para formar el coágulo de fibrina.

El sistema de la hemostasia se divide en dos mecanismos de respuesta

principales: la hemostasia primaria, donde se lleva a cabo fundamentalmente la

interacción entre el endotelio y la plaqueta; y la hemostasia secundaria o coagulación

donde participan los factores de coagulación que interaccionan sobre una superficie

catalítica para formar una red de fibrina y posteriormente formar el coágulo

sanguíneo (1).

2. HEMOSTASIA PRIMARIA

Tiene lugar a los pocos segundos de producirse una lesión vascular. La

interacción de las plaquetas y la pared vascular juegan un papel esencial para

detener la salida de la sangre en capilares, arteriolas pequeñas y vénulas.

Las plaquetas son participantes esenciales en el proceso de la hemostasia

primaria. Son pequeñas células discoides anucleadas, procedentes de la

fragmentación del megacariocito. A pesar de carecer de núcleo, estas células

contienen muchos componentes estructurales, metabólicos y de señalización propios

de las células nucleadas. Incluso debido a su participación en diversos procesos

fisiológicos y su accesibilidad, han servido como modelo de estudio en biología

molecular.

Las plaquetas, que normalmente circulan en forma inactiva, se adhieren a la

pared del vaso dañado, segregando el contenido de sus gránulos e interaccionando

con otras plaquetas, formando la base del tapón hemostático. Por otro lado, las

plaquetas participan en la activación del sistema de la coagulación proporcionando la

superficie sobre la cual se van a ensamblar los complejos que intervienen en esta

fase (2).

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La formación del tapón hemostático se produce por una serie de mecanismos:

Adhesión de la plaqueta al subendotelio vascular dañado (interviene el factor

Von Willebrand)

Agregación plaquetaria primaria al activarse el receptor glucoproteico IIb/IIIa

y permitir así la unión de las plaquetas

Liberación de compuestos intraplaquetarios que provocan agregación

secundaria de nuevas plaquetas al tapón hemostático

Consolidación y retracción del coágulo

Formación del tapón hemostático definitivo con la formación del polímero de

fibrina

Detención de la hemorragia (1)

3. COAGULACIÓN O HEMOSTASIA SECUNDARIA

En esta fase se produce la interacción entre sí de las proteínas plasmáticas o

factores de coagulación que se activan en una serie compleja de reacciones que

culminarán con la formación del coágulo de fibrina.

La fibrina formará una malla definitiva que reforzará al tapón hemostático inicial,

formándose un coágulo o trombo definitivo.

Intervienen en el proceso varias proteínas procoagulantes (factores de

coagulación) y proteínas anticoagulantes (las más importantes son antitrombina III,

proteína C y proteína S) que regulan y controlan el proceso de coagulación evitando

una coagulación generalizada.

Aunque la descripción del mecanismo de la coagulación se divide en diferentes

fases, todas ellas guardan relación entre si. Las plaquetas activadas van a acelerar

el proceso de la coagulación y a su vez los productos de la coagulación van a inducir

la activación de las plaquetas.

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3.1 FACTORES DE COAGULACIÓN

Los factores plasmáticos de la coagulación son proteínas procoagulantes (su

nomenclatura es internacional). Se denominan utilizando números romanos,

asignados en el orden en el que fueron descubiertos (no existe factor VI).

A algunos factores plasmáticos no se les ha asignado un número romano, como

son la precalicreína, calicreína, y el quininógeno de alto peso molecular (CAPM). Los

fosfolípidos plaquetarios no están incluidos en esta clasificación.

Todas las proteínas y componentes celulares involucrados en el proceso de

coagulación circulan en plasma de forma inactiva en condiciones fisiológicas

normales. Durante el proceso de la coagulación serán activados y entonces se

representan con el sufijo “a” después del número romano. Se pueden englobar en

dos grandes grupos:

Factores dependientes de vitamina K

La síntesis de los factores de la coagulación se realiza, principalmente, en el

hígado y en el endotelio vascular. Requieren vitamina K para su correcta

funcionalidad, aquí se incluyen los factores II, VII, IX y X, así como las dos

principales proteínas reguladoras de la coagulación proteína C y proteína S. Todos

ellos contienen de 10 a 12 residuos de glutamina, que son carboxilados a ácido

carboxiglutámico por una carboxilasa que precisa como cofactor a la vitamina K.

Este paso es importante para la unión del ión calcio y necesarios para la

interacción de estas proteínas con las membranas plaquetarias (fosfolípidos

plaquetarios).

Los factores no carboxilados se conocen como P.I.V.K.A. (Protein Induced by

Vitamin K Absence) que no son funcionales y poseen actividad anticoagulantes

por un mecanismo competitivo sobre los factores carboxilados.

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Cofactores

Se dividen en dos grupos:

Procofactores plasmáticos: incluyen a los factores V, VIII y quininógeno. El FV

circula en plasma como una proteína monomérica y el FVIII circula junto con

el factor de von Willebrand (FvW) que al activarse, se disociarán por

proteólisis.

Procofactores celulares: incluyen al factor tisular (FT) y la trombomodulina

(TM). El FT es el único factor que no se encuentra normalmente en la

circulación sanguínea, es una proteína específica presente sobre la membrana

plasmática de células como monocitos o células endoteliales. El FT se activa

únicamente al entrar en contacto con el FVII, momento en el que se inicia la

coagulación plasmática. La TM se expresa sobre las células del endotelio

vascular, participa como anticoagulante activando a la proteína C (1)

4. FIBRINOLISIS

El sistema fibrinolítico consiste en la conversión de una proenzima, el

plasminógeno, en su forma activa, la plasmina, la cual es capaz de degradar la

fibrina y, así, eliminar el coágulo previamente formado. La transformación del

plasminógeno en plasmina se produce mediante la acción proteolítica de dos

enzimas: activador tisular del plasminógeno (tPA) y activador del plasminógeno tipo

urocinasa (uPA).

La plasmina degrada la fibrina del coágulo y la transforma en productos de

degradación del fibrinógeno (PDF) que contienen residuos de lisina y arginina en

posición carboxiterminal. Estos residuos constituyen los sitios de unión para el tPA y

el plasminógeno, y son por tanto responsables de amplificar enormemente la

cascada de la fibrinolisis. A esta tendencia profibrinolítica se opone una actividad

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antifibrinolítica, de tal modo que sólo un adecuado equilibrio entre ambas fuerzas

dará lugar a un correcto funcionamiento del sistema fibrinolítico.

La inhibición de la fibrinolisis se produce a diferentes niveles. Por una parte, están

los inhibidores de los activadores del plasminógeno: el principal inhibidor de la

fibrinolisis in vivo es el inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 o PAI-1, que

se sintetiza en el endotelio vascular y también en el hígado. Otros inhibidores son el

PAI-2, fundamentalmente de origen placentario y el PAI-3, con una menor actividad

antifibrinolítica.

Se ha descrito también otro mecanismo que regula negativamente la activación

del plasminógeno, se trata de la vía del inhibidor de la fibrinolisis activable por

trombina (TAFI). Los residuos de los aminoácidos básicos exhibidos en la superficie

de la fibrina parcialmente degradada sirven de anclaje al plasminógeno y al tPA.

Cuando el plasminógeno y el tPA coinciden en la superficie del coágulo de fibrina, se

produce la conversión del plasminógeno a plasmina. A este nivel el TAFI, una vez

activado por la trombina (TAFIa), es capaz de eliminar los residuos de lisina y

arginina de la superficie de la fibrina, impidiendo la formación de plasmina y, por lo

tanto, limitando la cascada de la fibrinolisis.

A otro nivel se puede regular la actividad proteolítica de la plasmina por la acción

de la α2-antiplasmina, su principal inhibidor fisiológico, y, en menor medida, por la

α2-macroglobulina y el TAFIa.

Éstos son, básicamente, los factores implicados en la fibrinolisis, de tal modo que

una correcta hemostasia depende del balance de fuerzas entre todas estas

tendencias opuestas. Hay que resaltar que se trata de un equilibrio dinámico y

adaptable a diferentes situaciones tanto fisiológicas como patológicas. (3)

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5. MODELOS DE COAGULACIÓN

Distintos modelos de la coagulación in vivo se han descrito desde finales del siglo

XIX. Las primeras descripciones estuvieron relacionadas con individuos que

desarrollaban trombosis, se demostró que la formación del coágulo de fibrina se

genera a partir de su precursor el fibrinógeno mediante una conversión enzimática

mediada por la enzima trombina que a su vez provenía de la protrombina.

En los siguientes años se realizaron múltiples investigaciones hasta conocer el

factor responsable del inicio del proceso de coagulación.

En el año 1904 Morawitz describió por primera vez un esquema de la coagulación

sanguínea. Afirmó que los tejidos vasculares liberaban una tromboplastina tisular tras

la lesión vascular, necesaria para el inicio del proceso de coagulación y propuso

cuatro componentes esenciales para la coagulación: protrombina, fibrinógeno, calcio

y tromboplastina. Descubrió también la presencia de antitrombinas en la circulación

que modulan la trombocinasa, mejor conocida como factor tisular (FT). En el

trascurso de los años se fueron descubriendo los factores de la coagulación.

Ya en los años 60 dos grupos de investigación por separado, propusieron un

modelo de coagulación que incorporaba una complejas reacciones, donde la

activación secuencial de los factores de coagulación, daban como resultado la

generación de una enzima llamada trombina. En este modelo las vías de coagulación

se dividieron en dos sistemas: sistema extrínseco y sistema intrínseco. Le dieron una

mayor importancia a la vía intrínseca como iniciadora de la coagulación a través del

factor XII. Ambas vías convergían en una vía común y eran capaces de activar al

factor X, el cual uniéndose con el cofactor V activado, generaban la trombina.

Este modelo denominado Cascada de

Coagulación, es razonablemente bueno

y de gran utilidad en el laboratorio, para

explicar la activación in vitro de la

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coagulación a través del tiempo de

protrombina (TP) y tiempo de

tromboplastina parcial activado (TTPa)

que corresponden a las vías extrínsecas

e intrínsecas respectivamente.

Sin embargo en base a los descubrimientos de los últimos años este modelo es

inadecuado para explicar las vías fisiológicas de la hemostasis in vivo al no considerar

la interacción del sistema con las células que participan en la coagulación.

Es evidente que la hemostasia no es posible sin la participación de las plaquetas, y

por otra parte el FT es una proteína que está presente en la membrana de diversas

células esenciales en la coagulación. Además diferentes células expresan proteínas

procoagulantes, anticoagulantes y receptores para diversos componentes de la

hemostasia, lo que ha supuesto un paradigma para explicar las reacciones que

tienen lugar durante el proceso hemostático. (4)

El modelo clásico de la cascada de la coagulación es por tanto inconsistente con

el comportamiento clínico de la disfunción de la hemostasia. Se comprobó que

ambas vías no operan de forma independiente y que los déficit de factores de la vía

intrínseca que prolongan el TTPA no conllevan el mismo riesgo hemorrágico:

Figura 1. Cascada de la coagulación

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deficiencias de factor XII no cursan con hemorragia y las de XI puede cursar con

hemorragia leve, mientras que las deficiencias de factores VIII y IX (hemofilia A y B

respectivamente) conllevan hemorragias graves. Otra observación clave fue el hecho

de que el complejo FT/VII no sólo activa el factor X, sino también el factor IX (4).

Varios grupos han explicado procesos fundamentales que rompen la estructura

del modelo clásico de la coagulación:

- La interacción FT/VIIa activa no solamente al factor X sino también al IX,

llegándose a la conclusión de que la vía extrínseca sería la de mayor relevancia

fisiopatológica in vivo.

- El evento disparador de la hemostasia in vivo es la formación del complejo

FT/FVIIa.

- La trombina activa directamente al factor XI en una superficie cargada.

De todo ello se ha concluido que es poco probable que el modelo tradicional

funcione en condiciones fisiológicas, por lo que Hoffman y otros investigadores han

propuesto una alternativa denominada Modelo Celular de la Coagulación (5).

6. MODELO CELULAR DE LA COAGULACIÓN

El modelo celular de la coagulación se explica en 3 diferentes etapas.

6.1. INICIACIÓN

El FT es el principal iniciador de la coagulación in vivo que actúa como receptor

para el factor VII. Se expresa en numerosos tipos de células y está presente en

monocitos circulantes y células endoteliales en respuesta a procesos inflamatorios.

Las células están localizadas fuera del endotelio, lo que previene la iniciación de la

coagulación cuando el flujo es normal y el endotelio está intacto. Es necesario que se

produzca una lesión que rompa la barrera que separa al FT y al factor VII.

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Cuando se produce una lesión en la pared vascular, las células subendoteliales

que contienen FT entran en contacto con el plasma y se inicia el proceso de

generación de trombina al unirse al factor VII creando el complejo FT/VIIa. Éste

complejo a su vez activa más VII, y también actúa sobre el factor IX y X.

El factor Xa se combina en la superficie celular con el Va para producir pequeñas

cantidades de trombina, que jugarán un papel importante en la activación de las

plaquetas y del factor VIII en la siguiente fase (4).

6.2. AMPLIFICACIÓN

En esta fase la célula fundamental es la plaqueta. Éstas se adhieren a la matriz

subendotelial, siendo activadas en lugares donde se ha expuesto el FT. Las pequeñas

cantidades de trombina generadas en la fase anterior junto con el calcio sanguíneo y

los fosfolípidos plaquetarios, amplifican la señal procoagulante inicial activando a los

factores V, VIII y XI que se ensamblan en la superficie plaquetar para promover

posteriores reacciones en la siguiente fase.

Esta fase se acaba cuando el factor Va y el VIIIa se unen a la membrana celular

de una plaqueta activada para poder formar dos complejos que iniciarán la fase

siguiente (6).

6.3. PROPAGACIÓN

Los complejos iniciadores de la propagación son la tenasa (VIIIa/IXa, Ca2+ y

fosfolípidos) y el complejo protrombinasa (Va/Xa, Ca2+ y fosfolípidos). El complejo

tenasa cataliza la conversión del factor Xa, mientras que el complejo protrombinasa

cataliza, a nivel de la superficie plaquetar, la conversión de protrombina en grandes

cantidades de trombina, lo que se conoce como “explosión de trombina” necesaria

para la formación de un coágulo estable de fibrina.

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La trombina generada, activará al factor XIII o factor estabilizador de fibrina y a

un inhibidor fibrinolítico (TAFI) necesarios para la formación de un coágulo de fibrina

resistente a la lisis (4).

La trombina es la enzima principal de la coagulación, la velocidad y el pico

máximo de producción de trombina son factores muy importantes para que todas

sus funciones se lleven a cabo.

Las principales funciones de la trombina son: activación de las plaquetas, del

cofactor V y VIII, del factor XI y XIII, activación de la vía del inhibidor de la

fibrinolisis por trombina (TAFI), es la enzima responsable de la transformación del

fibrinógeno a fibrina, interviene en la unión al receptor PAR-4 en la superficie de las

plaquetas y participa en los procesos de inflamación y cicatrización de heridas (7).

Figura 2. Nuevo Modelo celular de la hemostasia (3)

En resumen, según el modelo celular de la hemostasia, la coagulación fisiológica

depende del contacto del FT subendotelial en el lugar de la lesión con el factor VIIa y

del ensamblaje de las reacciones de coagulación a nivel de superficie celular

plaquetar, lo que favorece la formación de trombina a nivel local y la generación de

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un coágulo estable de fibrina. Este modelo contempla una vía única y la focalización

del proceso en las superficies celulares (4).

7. CONTROL DE LA COAGULACIÓN

Existen varios mecanismos que regulan la coagulación para prevenir un exceso de

formación de trombina y la posible oclusión del flujo sanguíneo. Existe una expresión

de antitrombina III y del inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) que inhiben al

factor Xa que no está unido a las células que liberan TF o las plaquetas activadas.

Por otra parte la trombina se autorregula al unirse a la trombomodulina y así activar

a la proteína C que va a impedir la generación de nuevas moléculas de trombina al

escindir irreversiblemente el factor Va y el VIIIa. Esta proteína requiere de un

cofactor la proteína S que va a actuar aumentando su afinidad por la membrana

celular unas 10 veces. La proteína C inhibirá al factor Va en un endotelio no dañado,

pero no lo bloqueará si se encuentra sobre una plaqueta activada. El complejo

proteína C-proteína S también inactiva a un importante inhibidor de la fibrinolisis, el

inhibidor del activador del plasminógeno. La fibrinolisis es esencial para disolver el

coágulo formado por los mecanismos hemostáticos (6).

8. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO (8)

8.1. CONDICIONES PREANALÍTICAS

Para la determinación del estudio hemostático lo primero que necesitamos es una

correcta obtención de la muestra. Son necesarios tubos con citrato sódico como

anticoagulante. Estos tubos contienen una concentración de citrato sódico de 130

mM, que con la sangre se quedará en una concentración final de 13mM, para ello se

deben extraer 9 partes de sangre y una de citrato sódico. Para la hematológica

básica se debe utilizar un tubo con ácido etilen diamino tetracético (EDTA) como

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anticoagulante.

8.2. EXPLORACIÓN DE LA HEMOSTASIA PRIMARIA

Tiempo de sangría: es el periodo de tiempo desde que se realiza una pequeña

incisión en la piel y el momento en que finaliza el sangrado. Es la única prueba que

permite medir in vivo la reacción plaqueta-endotelio y demuestra la capacidad

hemostática de las plaquetas. Se usa la técnica de Ivy que consiste en practicar una

incisión en la cara anterior de antebrazo mediante una hoja especial de 1 cm de

longitud y 1 mm de profundidad.

El tiempo de hemorragia normal es entre 3 minutos y 30 segundos, y 8 minutos y

30 segundos. Las causas de prolongación del tiempo de sangría son las alteraciones

en la pared vascular, trombocitopenias, defectos en la agregación o adhesión

plaquetar.

Función plaquetaria: para su evaluación estudiaremos el PFA-100, agregometría y el

estudio de las glucoproteínas de membrana.

Para evaluar el PFA-100 (9) se utiliza sangre total citratada. No es tan específica

como el Ivy pero es más rápida y menos dolorosa para el paciente además de evitar

los posibles errores producidos por problemas cutáneos del paciente.

Se realiza una simulación in vitro del tiempo de hemorragia. Reproduce un flujo

constante de sangre que atraviesa una membrana porosa de colágeno y epinefrina o

colágeno y ADP. El paso por la membrana produce la activación de las plaquetas y su

agregación. El aparato registra el tiempo de obturación del flujo. El tiempo de

obturación está aumentado en pacientes con trombocitopenia, enfermedad de Von

Willebrand y en pacientes que toman medicación que altera la función plaquetar.

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Otro estudio es la agregometría que se realiza cuando el tiempo de oclusión en

PFA-100 esta alterado. Utiliza el método turbidimétrico de Born, que consiste en

medir la trasmitancia del plasma del paciente cuando se produce la agregación

plaquetar. Obtenemos el porcentaje de agregación plaquetaria frente a un panel de

agentes agregantes: ADP, colágeno, ristocetina, adrenalina, ácido araquidónico,

trombina, endoperóxidos cíclicos y un ionóforo de calcio. La respuesta de las

plaquetas a los diferentes agentes agregantes se divide en cuatro fases sucesivas: el

cambio de forma, la agregación, la movilización y la liberación del contenido de los

gránulos. Por ello, podemos estudiar donde se produce el fallo en el funcionamiento

plaquetario.

El último estudio para la determinación de la función plaquetar es la

determinación de las glucoproteínas de membrana que se puede estudiar por dos

técnicas diferentes:

1- Técnica electroforética en gel de policrilamida donde se detecta y caracteriza la

glucoproteína. Esta técnica no permite detectar las propiedades antigénicas de las

proteínas ni su interacción con otras proteínas.

2- Técnica inmunológica: citometría de flujo, permite medir diferentes subgrupos

dentro de la población plaquetaria estudiada, es capaz de detectar cambios

conformacionales en las glucoproteínas (ejemplo: complejo IIb-IIIa) y diferenciar las

plaquetas activadas de las que están en reposo.

Exploración de la cinética plaquetaria: se realiza un marcaje a las plaquetas con un

radionúclido y se mide la radioactividad ligada a las plaquetas circulantes. Nos

permite cuantificar la supervivencia plaquetar, la tasa de renovación plaquetaria y los

lugares de destrucción periférica en el paciente (habitualmente el bazo).

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Exploración de la adhesividad: se realiza la técnica de Baumgartner que estudia la

interacción entre las plaquetas y el subendotelio en condiciones de flujo definidas.

Reproduce la circulación sanguínea y permite emular los parámetros reológicos de

flujo y coeficiente de cizallamiento. Nos permite observar trastornos hemorrágicos

congénitos (por defectos en la unión del Factor von Willebrand al subendotelio y al

GPIb).

Nuevos métodos de estudio de la función celular global de las plaquetas:

transcriptómica y proteómica(10). Se sabe que las plaquetas poseen varios mRNA.

Existen principalmente dos técnicas transcriptómicas para el estudio de los

transcriptos, que son los microarrays y la SAGE (análisis seriado de expresión génica)

(11). Las técnicas proteómicas nos proporcionaran conocimientos del contenido

proteico plaquetar y de su importancia en las alteraciones de la función plaquetar o

su respuesta a fármacos antitrombóticos.

8.3. PRUEBAS DE ESTUDIO DE DIÁTESIS HEMORRÁGICA

Tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa): el plasma citratado en presencia

de tromboplastina parcial o cefalina y cloruro cálcico se coagula a una velocidad

dependiente de la concentración de todos los factores (excepto VII y XIII). Se inicia

la reacción añadiendo al plasma una sustancia cargada negativamente (sílice, caolín

o ácido elágico). Esta prueba presenta un error sistemático cuando no se cumple la

proporción 9:1 de sangre: citrato y nos da un valor de TTPa alargado. La relación

(TTPa / TTPa control) > 1,5 se correlaciona con déficit de factores y el riesgo de

hemorragia. Podemos detectar hemofilias tipo A y B e inhibidores de la coagulación

(anticoagulante lúpico). Se usa para el control del tratamiento con heparina.

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Tiempo de protrombina o de Quick (TP): el plasma citratado en presencia de

tromboplastina y cloruro cálcico se coagula a una velocidad dependiente de la

actividad de protrombina, de los factores V, VII, X y el fibrinógeno. Evalúa la vía

extrínseca. Se usa para el control del tratamiento crónico con cumarínicos. Detecta

anomalías de factores y se correlaciona el riesgo de hemorragia junto con TTPa.

Los resultados se expresan en la unidad: índice normalizado internacional (INR)

es la razón del tiempo de coagulación del paciente respecto al control elevado a un

valor llamado ISI (índice de sensibilidad internacional) que es propio de cada

tromboplastina.

Tiempo de trombina (TT): tiempo que tarda en coagular un plasma citratado al

añadir una baja concentración de trombina. Valora la capacidad de polimerizar del

fibrinógeno. Se prolonga en niveles muy bajos de fibrinógeno o niveles altos de

productos de degradación del fibrinógeno o de la fibrina.

Tiempo de reptilasa: tiempo que tarda en coagular un plasma citratado al que se

añade reptilasa (reptilasa es una enzima proteolítica extraída del veneno de la

serpiente Bothrops atrox que actúa como el fibrinógeno). Se alarga en hepatopatías,

disfibrinogenemias e hipofibrinogenemia. Es insensible a la heparina (se usa esta

técnica cuando queremos comprobar si un plasma contiene heparina).

Concentración de fibrinógeno: se usa el método Von Clauss (12) que utiliza plasma

citratado diluido en el que se añade un exceso de trombina. Mide el tiempo de

transformación del fibrinógeno a fibrina. Siendo la concentración de fibrinógeno

proporcional al tiempo medido por el analizador, extrapolándose el resultado del

paciente a la correspondiente curva de calibración realizada en el ensayo.

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Dosificación de la actividad de los factores:

Factores II, V, VII y X: Dependiendo de qué factor quieras medir se usa plasma

citratado con exceso de los otros factores y se inicia la coagulación con

tromboplastina y calcio. El tiempo de coagulación es proporcional a la concentración

del factor.

Factores VIII, IX, XI y XII: igual que el anterior pero se inicia la coagulación con

cefalina y calcio.

Factor XIII: se debe activar el factor XIII con trombina y valorar la actividad

trasglutaminasa sobre un sustrato o con un sustrato cromogénico.

Factor von Willebrand (FvW): puede realizarse por medio de una determinación por

aglutinación donde se añade ristocetina para inducir o mimetizar el cambio que se

produce en el factor von Willebrand cuando se ha unido al colágeno. Se induce la

agregación plaquetaria. Se determina por técnicas de ELISA, electroinmunoensayo.

Determinación de dímero D: el dímero D es un producto de degradación de la fibrina.

Su exceso nos indica estados de hiperactivación de la coagulación como coagulación

intravascular diseminada (CID). También nos orienta a posible tromboembolismo e

hiperfibrinolisis. Se detecta por métodos cuantitativos (ELISA o técnicas

turbidimétricas) o semicuantitativos (aglutinación por partículas de látex o

inmunofiltración).

α2-antiplasmina: es el principal inhibidor de la plasmina (13). Es una glucoproteína.

Se incuba el plasma citratado con exceso de plasmina. Luego se añade un sustrato

cromogénico que mide la cantidad de plasmina residual, está será inversamente

proporcional a la capacidad antiplasmínica del plasma, debida prácticamente en su

totalidad a la α2-antiplasmina.

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8.4. DETECCIÓN DE INHIBIDORES

El alargamiento de las pruebas básicas de coagulación o la detección de niveles

bajos de un factor no siempre son debidas a un déficit o defecto, sino que puede ser

consecuencia de la presencia de un inhibidor.

Detección de anticoagulante lúpico (AL): son autoanticuerpos dirigidos contra

complejos proteína-fosfolípidos que impiden la correcta unión de los factores de

coagulación a las superficies fosfolipídicas. Se asocian a una tendencia trombótica.

Resultados: se produce alargamiento de la TTPa, o el tiempo de protrombina.

Para diagnosticar un paciente con AL deben cumplirse los siguientes criterios:

prolongación de al menos una prueba de coagulación que necesite fosfolípidos,

confirmación de que la alteración se debe a un inhibidor y no a un defecto de

factores, evidencia de que la actividad inhibitoria depende de los fosfolípidos y

evidencia de que el inhibidor no va dirigido contra factores de coagulación.

Se determina por dos test: Test de Exner, mide el tiempo de coagulación de un

plasma mezclado en diferentes proporciones con un plasma control, con caolín y

cloruro cálcico. Es sensible a heparina y a los inhibidores específicos contra factores

de coagulación. Al ser positivo descartaremos los inhibidores específicos contra

factores de coagulación, y el Test de Russell, se coagula un plasma con veneno de la

serpiente de Russell, que activa el factor X en presencia de pequeñas cantidades de

fosfolípidos. También es sensible a la heparina.

Detección de anticuerpos antifosfolípidos: son anticuerpos contra los fosfolípidos

(14). Los pacientes presentan episodios trombóticos, abortos recurrentes o

trombocitopenia. Se determinan con técnicas ELISA utilizando como antígeno la

cardiolipina o la fosfatidilserina.

Page 21: visión moderna de la hemostasia: nuevo modelo de coagulación

602

Detección de inhibidores contra los factores de la coagulación: se detectan

inhibidores contra los factores de la vía intrínseca, los más frecuentes son

anticuerpos IgG anti-FcVIII. Se utiliza el test descrito por Ewing y Kasper, en el que

se valora el TTPa de una mezcla del plasma normal y del paciente, incubados juntos

durante dos horas a temperatura ambiente de 37ºC. En presencia de un inhibidor, el

TTPa posterior a la incubación es prolongado en comparación con los controles sin

inhibidor.

8.5. PRUEBAS PARA VALORAR LA TENDENCIA TROMBÓTICA

Cuando a un paciente se le relaciona con una patología trombótica se debe hacer

un estudio básico de trombofilia, es decir, antitrombina, proteína C, proteína S,

resistencia a la proteína C activada, anticoagulante lúpico, factor VIII, homocisteína,

anticuerpos antifosfolípidos, la mutación factor V Leiden y la mutación G20210A del

gen de la protrombina.

Antitrombina: principal inhibidor fisiológico de las serínproteasas. Su cuantificación

funcionalmente se basa en la inhibición de la antitrombina por trombina o factor Xa.

Se incuba el plasma citratado problema con un exceso de trombina o de factor Xa en

presencia de heparina que acelera la inhibición. A continuación se añade un sustrato

cromogénico, con el que se valora la enzima residual, que es inversamente

proporcional a la cantidad de antitrombina presente en el plasma.

Si en la cuantificación funcional se obtiene niveles bajos de antitrombina se hace

la determinación antigénica. Se realiza por métodos de inmunodifusión radial,

electroinmunoensayo o ELISA. Si es un defecto de síntesis (los niveles detectados

por la cuantificación funcional y la determinación antigénica son los mismos) y si es

una proteína disfuncional (son mayores los niveles obtenidos por la determinación

Page 22: visión moderna de la hemostasia: nuevo modelo de coagulación

603

antigénica que por la cuantificación funcional).

Proteína C: es una glucoproteína vitamina K dependiente con acción anticoagulante.

Se puede hacer su determinación funcional midiendo la proteína C activada sobre un

sustrato. Se puede utilizar el complejo trombina-trombomodulina o veneno de

serpiente para activar a la proteína C. La detección se realiza añadiendo un sustrato

cromogénico o su sustrato natural (factor Va y VIIIa). El primero es un método

colorimétrico y el segundo una técnica coagulativa en la que se valora el

alargamiento del tiempo de coagulación por la proteína C activa.

Proteína S: es un cofactor no enzimático para la actividad de la proteína C activada

sobre los factores Va y VIIIa. En el plasma va unida en un 60% a C4b binding

protein (C4bBP) (15). El C4bBP es una glicoproteína de alto peso molecular del

complemento, formada por 7 subunidades α idénticas y una subunidad β. Las

subunidades α se unen a C4b y la unidad β se une a la proteína S (PS). Para evaluar

su concentración hay que conocer la concentración total, la libre y su funcionalidad.

La determinación de proteína S libre se realiza eliminando los complejos C4bBP-PS

mediante precipitación con polietilenglicol. Luego se mide con una técnica ELISA. La

determinación proteína S total se realiza por técnicas ELISA o de

electroinmunoensayo. Por último, para la determinación funcional se mide el

alargamiento del TTPa o de protrombina en el que el plasma citratado del enfermo

se ha diluido en plasma deficiente en proteína S y al que se añade factor V y

proteína C activada. El alargamiento del tiempo de coagulación es proporcional a la

concentración de proteína S.

Hay tres tipos de defectos: Tipo I (niveles bajos de PS total, libre y funcional),

tipo II (niveles normales de PS total y libre y disminución de la PS funcional) este

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604

tipo es poco frecuente y posteriormente se ha comprobado que muchos de los

pacientes de este grupo realmente tenían el factor V Leiden mutado, y el tipo III

(niveles normales de PS total, bajos de PS libre y funcional).

Mutación factor V Leiden: cuando existe una mutación en el nucleótido 1691G>A en

el gen del factor V, se produce un cambio de una arginina por una glutamina. Lo que

da lugar a una mayor resistencia a la degradación del factor V por la proteína C

activada, lo que está asociado a trombofilia. Se analiza el ADN mediante

amplificación por PCR del fragmento genómico que contiene el nucleótido y se hace

una digestión con una enzima de restricción.

Mutación 20210G>A del gen de la protrombina: La mutación se da en el fragmento

genómico del gen de la protrombina. Se produce un cambio en la zona 3’ (no

codificante), en el nucleótido 20210G>A. Se detecta por amplificación de la zona y

posterior digestión con una enzima de restricción. La presencia de la mutación se

asocia a niveles más elevados de factor II, y a un incremento del riesgo trombótico.

Mutación Jak2: JAK2 (16) es una proteína con función tirosinquinasa implicada en la

traducción de señal de los receptores de múltiples citoquinas. Se ha descrito una

mutación en dominio pseudotirosinkinasa de esta proteína que confiere un estatus de

activación permanente a esta proteína, lo que ocurre es que no puede ser inhibida

por sus inhibidores. Esta mutación se sitúa en el aminoácido 617 y se produce un

cambio de valina por fenilanina. La presencia de esta mutación se ha descrito en la

trombocitosis esencial con una sensibilidad del 65% y una especificidad del 100%.

Se analiza por High Resolution Melting (HRM), este método se basa en un análisis de

PCR a tiempo real para identificar las variaciones en las secuencias de ácidos

nucleicos, utilizando las curvas de la temperatura de melting (disociación del ADN).

Page 24: visión moderna de la hemostasia: nuevo modelo de coagulación

605

9. TRASTORNOS DE LA HEMOSTASIA

El diagnóstico de la hemostasia exige la realización de una historia clínica, una

exploración física y un estudio complementario de laboratorio.

9.1. TRASTORNOS DE LA HEMOSTASIA PRIMARIA (17)

Trombocitopenia: se define como valores de plaquetas totales inferiores a

150000/µl. Por debajo de 50000/µl se dan hemorragias espontáneas y por debajo de

10000/µl pueden resultar mortales. La trombocitopenia es resultado de uno o varios

de los siguientes procesos: disminución de su producción por la médula ósea,

secuestro, por lo general en un bazo crecido, o mayor destrucción de las plaquetas.

En primer lugar hay que descartar la posible presencia de una

"Pseudotrombocitopenia", sobre todo en pacientes sin una causa manifiesta de

trombocitopenia. Es un error in vitro causado por la aglutinación de las plaquetas

mediada por los anticuerpos anti-EDTA. Se debe comprobar el resultado y observar

si se ha producido un coágulo en la muestra por incorrecta homogeneización del

anticoagulante con la sangre recién obtenida. Descartar la existencia de agregados

plaquetarios con la observación de un frotis de sangre periférica al microscopio

óptico. Y por último diagnosticar la psedotrombopenia con la realización del

recuento plaquetario en sangre recogida en un tubo con citrato de sodio.

Los síntomas de los pacientes con trombocitopenia son pequeños sangrados de

vénulas pequeñas o capilares en lugar de vasos grandes. La piel de estas personas

muestra muchas manchas purpúreas pequeñas, de las que deriva el nombre de

púrpura trombocitopénica. La púrpura trombocitopénica es un trastorno adquirido

que desencadena la destrucción de plaquetas mediada por factores inmunitarios y

también se produce la inhibición de la liberación de plaquetas a partir del

Page 25: visión moderna de la hemostasia: nuevo modelo de coagulación

606

megacariocito.

Trombocitopenia hereditaria, puede darse de forma aislada o como parte de otro

síndrome. Es una enfermedad hereditaria autosómica dominante, autosómica

recesiva o ligada a X. En la actualidad se sabe que muchas formas de

trombocitopenia autosómica dominante están relacionadas con mutaciones en el gen

de la cadena pesada de miosina no muscular MYH9.

Trombocitosis: casi siempre se debe a una deficiencia de hierro, inflamación,

cáncer o infección (trombosis reactiva), o un proceso mieloproliferativo subyacente

(trombocitemia idiopática o policitemia verdadera)

Trombopatías: dentro del grupo de trombopatías vamos a comentar la enfermedad

de Von Willebrand, enfermedad de Bernard-Soulier y la enfermedad de Glanzman.

Enfermedad de Von Willebrand: es el trastorno hemorrágico hereditario más

frecuente (18). El factor de von Willebrand desempeña dos funciones: como

principal molécula de adhesión que fija la plaqueta al subendotelio expuesto y como

proteína fijadora para el factor VIII, lo cual trae consigo una prolongación importante

de la vida media del factor VIII en la circulación sanguínea. La enfermedad de von

Willebrand se ha clasificado en tres tipos principales (1, 2 y 3) y cuatro subtipos del

tipo 2 (2A, 2B, 2M y 2N).

El tipo 1 es el más frecuente. Los pacientes presentan, sobre todo, hemorragias en

mucosas, equimosis excesiva y epistaxis. A menudo, la enfermedad de von

Willebrand leve tipo 1 se manifiesta inicialmente durante las extracciones dentales o

con la amigdalectomía. Muchos factores influyen tanto en las concentraciones de

FvW como en los síntomas de hemorragia, se sabe que influyen el grupo sanguíneo

del paciente, su estado hormonal tiroideo, la raza, el estrés y el ejercicio.

Page 26: visión moderna de la hemostasia: nuevo modelo de coagulación

607

Los pacientes con enfermedad de von Willebrand tipo 2 tienen defectos

funcionales en el FvW.

La enfermedad de von Willebrand adquirida es un raro trastorno que se observa

en pacientes con gammapatías monoclonales, mieloma múltiple y macroglobulinemia

de Waldenström. Se sospecha en pacientes con síntomas recientes de hemorragia

grave en mucosas, sobre todo en individuos de edad avanzada.

Enfermedad de Bernard-Soulier: Enfermedad con herencia autosómica recesiva que

se manifiesta por hemorragias desde la infancia. Existe un déficit del receptor

plaquetario GpIb-IX-V.

Enfermedad de Glanzman: Enfermedad hereditaria autosómica recesiva,

caracterizada por un déficit del receptor de plaquetas GpIIb-IIIa.

9.2. TRASTORNOS DE LA COAGULACIÓN

Trombosis venosa: Es el resultado de la formación de un coágulo obstructivo en

las venas. Ocurre principalmente en las venas profundas de la pierna, desde donde

algunas fracciones del coágulo a menudo embolizan hacia los pulmones. Los

síntomas de trombosis venosa no son específicos y requiere estudios por imágen. El

tratamiento con anticoagulantes debe ser rápido y adecuado. Los factores de riesgo

para la trombosis, están relacionados con la inmovilización o con la

hipercoagulabilidad.

Trombofilia hereditaria: Estos pacientes tienen una “tendencia genéticamente

determinada al tromboembolismo venoso”. Su primer episodio de trombosis suele

aparecer alrededor de los 25-30 años. No son recomendables los anticonceptivos

orales que contienen estrógenos y se considerará la profilaxis anticoagulante

después del parto en mujeres con trombofilia hereditaria.

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608

Hemofilias: La hemofilia es una enfermedad hemorrágica recesiva ligada a

cromosoma X producida por mutaciones en el gen F8 (hemofilia A o hemofilia clásica

-> déficit factor VIII) o el gen F9 (hemofilia B -> déficit factor IX). Afecta a 1:10.000

varones, las mujeres son portadoras de la enfermedad. Clínicamente la hemofilia A y

la hemofilia B son indistinguibles. El fenotipo de la enfermedad se correlaciona con la

actividad residual del factor VIII o el IX y se clasifica como grave (<1%), moderada

(1 a 5%) o leve (6 a 30%). En las formas grave y moderada, la enfermedad se

caracteriza por episodios hemorrágicos en articulaciones, partes blandas y músculos

después de un traumatismo menor o incluso en forma espontánea. Los pacientes con

enfermedad leve experimentan hemorragias poco frecuentes que por lo general son

consecutivas a traumatismos. Entre aquellos con actividad residual de factor VIII o

IX de más de 25% del valor normal, la enfermedad se descubre únicamente por la

hemorragia que se presenta posterior a un traumatismo importante o durante las

pruebas de laboratorio que por lo general se realizan antes de una intervención

quirúrgica.

Las pruebas globales de la coagulación muestran sólo una prolongación aislada

del análisis de TTPa. Los pacientes con hemofilia tienen tiempos de sangrado y

recuentos plaquetarios normales. El diagnóstico se establece después de la

determinación específica de la actividad coagulante de factor VIII o factor IX.

Coagulación intravascular diseminada (CID): es un síndrome caracterizado por

la formación incontrolada de fibrina intravascular en respuesta a la exposición de la

sangre a concentraciones patológicas de fosfolípidos de los tejidos que da lugar a un

consumo de factores de coagulación y plaquetas con una hiperfibrinólisis secundaria.

Se produce un depósito de fibrina en zonas de microcirculación que ocluyen los

Page 28: visión moderna de la hemostasia: nuevo modelo de coagulación

609

vasos en la microcirculación y puede derivar a un fallo multiorgánico. Las causas más

frecuentes son la sepsis bacteriana, trastornos malignos como tumores sólidos,

leucemia promielocítica aguda y causas obstétricas.

La púrpura fulminante es una forma grave de coagulación intravascular

diseminada debida a trombosis de zonas extensas de la piel.

Los análisis de laboratorio deben incluir pruebas de coagulación (TTPa, TP y TT),

marcadores de productos de la degradación de la fibrina (dímero D), recuentos

plaquetarios y eritrocíticos y análisis del frotis sanguíneo al microscopio óptico, con la

observación de esquistocitos (fragmentos de eritrocitos).

Déficit de vitamina K: el déficit de la vitamina K se ha relacionado con las

deficiencias combinadas de todas las proteínas dependientes de vitamina K, incluidas

las proteínas procoagulantes protrombina, VII, IX y X, y los anticoagulantes proteína

C y proteína S (19). La vitamina K es una vitamina liposoluble y es el cofactor para

la carboxilación del carbono gamma de los residuos de ácido glutámico en los

factores dependientes de vitamina K. El déficit de vitamina K en un paciente produce

episodios hemorrágicos leves a graves.

Page 29: visión moderna de la hemostasia: nuevo modelo de coagulación

610

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