Vibriocholerae : factores de virulencia y subtipificación ......Vibriocholerae: factores de...

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  • Vibrio cholerae: factores de virulencia y

    subtipificación molecular

    Taller “El papel de laboratorio en la prevención y control del cólera”

    INCIENSA, 8 de noviembre de 2013

    subtipificación molecular

    Dr. Francisco Duarte Martínez

    Centro Nacional de Referencia de Bacteriología, INCIENSA

    Centro de Excelencia Regional WHO-Global Foodborne Infections Network para

    Centroamérica, México y Caribe de Habla Hispana

  • Generalidades acerca del V.cholerae O1:

    marcadores genéticos importantesmarcadores genéticos importantes

  • Ruby et al., 2004

  • Regiones por resaltar – El Tor

  • CT está codificada en el operón ctxAB, el cual reside en el genoma del fago ctxφ

    ctxφ se encuentra en todos los aislamientos epidémicos pero raramente en

    Factores de virulencia

    Toxina Colérica: Toxina tipo AB

    Une al GM1 del epitelio intestinal

    Una vez internalizada SubA de CT se escinde proteolíticamente

    CT-A1 ADP ribosila Prot Gs � producción constitutiva de AMPc

    Perdida masiva de electrolitos hacia el lumen intestinal

    Maston et al., 2007

    ctxφ se encuentra en todos los aislamientos epidémicos pero raramente en

    aislamientos no–O1, no-O139

    ctxφ puede integrarse al cromosoma para formar un profago estable o puede

    replicarse como plásmido en ausencia de secuencias de integración específicas

    En cepas de V. cholerae O1 biotipo Clásico existe un profago en ambos cromosomas

    En cepas de V. cholerae O1 biotipo EL Tor ctxφ se encuentra como una sola copia o

    en múltiples copias en “tandem” en el CI

    Fidelma et al., 2000; Safa et al. 2009

  • Mecanismo de acción de la toxina colérica

    http://techno.msu.ac.th/fn/ecenter/pathogens/images/anim-cholera.gif

  • EI TCP (Toxin Coregulated Pilus) es un pili tipo IV, requerido para

    colonización intestinal

    Produce la agregación de células de V. cholerae

    Induce la formación de microcolonias en el intestino

    Receptor para el fago ctxφ

    La pilina del TCP está codificada en el gen tcpA, el cual presenta

    Factores de virulencia

    La pilina del TCP está codificada en el gen tcpA, el cual presenta

    hipervariabilidad. Lo que le permite a la bacteria escapar del

    reconocimiento por el sistema inmune del hospedador

    Posee además otros factores de virulencia como hemolisinas,

    citotoxinas (RTX), toxina termoestable (ST)

    Maston et al., 2007

  • Modelo acerca de

    la aparición de una

    Dale et al., 2004

    la aparición de una

    cepa patógena

  • Aparición de cepas toxigénicas de V. cholerae

    Faruque et al., 1998

  • VPI: Isla de patogenicidad de Vibrio

    Karaolis et al., 1998

  • VPI: Isla de patogenicidad de Vibrio

    VPI puede circularizarse y podría transferirse

    horizontalmente entre cepas V. cholerae O1.

    Rajanna et al., 2003

    VPI y otros fragmentos cromosomales pueden

    transferirse entre cepas de V. cholerae O1

    utilizando el fago CP-T1

    O’Shea et al. 2002

    tcpA: pilina

    acf A-D: factores de colonización

    vpiT e int: recombinasa

  • Serogrupos O1 y O139

    Bik et al, 1995

  • Serogrupos O1 y O139

    Faruque et al, 2003

    El serogrupo O139 resulta de una deleción de 22-kb en la región wbe (rfb) de O1, la cual es

    reemplazada por una región de 35-kb wbf (wbfA -wbfX) la cual codifica para el antígeno O139

  • Fenotipos y genotipos de V.cholerae 01

    Safa et al., 2009

  • Estructura del locus del CTXφ

    Safa et al., 2009

  • CTXφ y RS1 en las cepas de Haití

    Hasan et al., 2011

  • V.cholerae O1: características genotípicas de los

    biotipos y de sus variantes

    Son et al., 2011

  • Diversidad genética de las cepas de

    V.cholerae O1 en Haití

  • Hasan et al., 2012

  • Hasan et al., 2012

  • Hasan et al., 2012

  • Transmisión global de V.cholerae O1

    en la 7ª pandemiaen la 7ª pandemia

  • Mutreja et al., 2011

  • Mutreja et al., 2011

  • Marcadores genéticos a monitorearMarcadores genéticos a monitorear

  • Identificación de genero y especie:

    Detección específica para Vibrio cholerae de una región del operón rRNA. Corresponde a

    regiones espaciadoras intergénicas (IRSs) localizadas entre 16S y 23S del rDNA (Chun et al, 1999).

    Caracterización de Vibrio cholerae

    INEI-ANLIS., 2007

  • Se amplifica un fragmento del gen ctxA que codifica para la subunidad A de la toxina.

    INEI-ANLIS., 2007

    Determinación de factores de virulencia:

    Ruby et al., 2004

  • Genes codificantes para Toxina termoestable ST y toxina formadora de poros RTX.

    Gen tcpA que codifica para la pilina del TCP específica del Biotipo El Tor.

    Sin embargo esta proteína es polimórfica.

    El gen regulador tcpI está sometido a menor presión de selección que el gen estructural

    tcpA, por lo que tiene una variabilidad mucho menor. La detección de este gen es de especial

    utilidad como indicador de la presencia de TCP en cepas que tienen variantes del gen tcpA

    diferentes al alelo “EL Tor”.

    Determinación de factores de virulencia:

    diferentes al alelo “EL Tor”.

    INEI-ANLIS., 2007

  • 564 bp

    ctxA, tcpA, RS16S-23S

    451 bp

    300 bp

    Fuente: Centro Nacional de Referencia de Bacteriología, INCIENSA

  • Subtipificación molecular de V.cholerae

  • Cultivo Cultivo microbianomicrobiano

    AgarosaAgarosa

    Subtipificación por PFGESubtipificación por PFGE

    Electroforesis Electroforesis de campo pulsadode campo pulsado

    LisisLisis

    LavadosLavados

    RestricciónRestricción

    microbianomicrobianoBloques de agarosaBloques de agarosa

  • Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]

    PFGE-SfiI

    100

    9590

    PFGE-SfiI

    VETA361

    VETA385

    SOS18

    Upala

    Los Chiles

    Alajuela

    Water

    Cheese

    Stool

    Environment

    Food

    Human Ecuador

    1996-07-19

    1996-07-25

    1992-01-05

    O1

    O1

    O1

    El Tor

    El Tor

    El Tor

    Ogawa

    Ogawa

    Ogawa

    ctx +

    ctx +

    ctx +

    CNRB-INCIENSA, 2011.

    Gonzalez et al, 2009

    PulseNet CDC - INDRE, sept 2013

  • Muchas gracias