VALORACIÓN DE LA PROLIFERACIÓN Y LA VIABILIDAD CELULAR …

VALORACIÓN DE LA PROLIFERACIÓN Y LA VIABILIDAD CELULAR EN CULTIVOS A LARGO TÉRMINO DE

ESPONJAS DE SUBMUCOSA INTESTINAL PORCINA Y ÁCIDO HIALURÓNICO

Autor Juliana Bernal Martínez

Estudiante Ingeniería Biomédica [email protected]

Asesor de proyecto Diana Marcela Tabima

[email protected]

Departamento de Ingeniería Biomédica Facultad de Ingeniería

Universidad de los Andes Bogotá, Colombia

Enero 23, 2015

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TABLA DE CONTENIDO

AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................ 3

RESUMEN ................................................................................................................................ 4

INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 6

OBJETIVOS DEL PROYECTO DE GRADO ...................................................................... 9

Objetivo General ..................................................................................................................... 9

Objetivos Específicos .............................................................................................................. 9

Acciones concretas para alcanzar los objetivos planteados .................................................. 10

RESUMEN DE TRABAJO PREVIO EN EL TEMA ......................................................... 11

METODOLOGÍA ................................................................................................................... 12

Preparación esponjas ............................................................................................................. 12

Cultivo celular ....................................................................................................................... 14

DISCUSIÓN Y RESULTADOS ............................................................................................ 18

Análisis de microscopía electrónica de barrido (SEM) ........................................................ 19

Área celular ........................................................................................................................... 24

Circularidad celular ............................................................................................................... 26

Análisis histológico ............................................................................................................... 29

Área efectiva ......................................................................................................................... 31

Conteo celular ....................................................................................................................... 36

Radio de viabilidad celular ................................................................................................... 38

Densidad celular .................................................................................................................... 44

Análisis del ensayo MTT ...................................................................................................... 47

CONCLUSIONES .................................................................................................................. 50

REFERENCIAS ...................................................................................................................... 51

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AGRADECIMIENTOS

Se agradece al Grupo de Ingeniería Biomédica y en especial a las personas trabajando en el

proyecto de esponjas del Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de los Andes.

A la Dra. Diana Marcela Tabima, por el apoyo, asesoramiento y acompañamiento a lo largo del

proyecto.

Al Laboratorio de Genética Humana y en especial a la estudiante doctoral Diana María Narváez

por la guía, las enseñanzas, el tiempo y la dedicación.

A mis compañeros Vivian Andrea Talero y Mateo Pineda por el tiempo, el apoyo y la compañía

en este trayecto.

A la Dra. Rocío del Pilar López por el acompañamiento, la ayuda y las enseñanzas.

Al Laboratorio de Microscopía y principalmente a Dery Esmeralda Corredor por el tiempo y el

apoyo a lo largo del proyecto.

De igual manera, se agradece al Laboratorio de Biofísica y al Laboratorio de Ingeniería Química

por autorizarnos para utilizar los equipos que permitieron llevar a cabo este proyecto.

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RESUMEN De acuerdo a la Organización Mundial de la Salud (OMS), 300,000 muertes al año se atribuyen a

heridas por quemaduras, mientras 6 millones de pacientes alrededor del mundo sufren de

quemaduras cada año. Adicionalmente más de 6 millones de individuos sufren úlceras crónicas

en la piel y sólo en los Estados Unidos de América, 3 millones de pacientes sufren heridas

crónicas (Pereira, Barrias, Granja, & Bartolo, 2013). Y estos son sólo datos que pueden ser

recolectados y contabilizados a partir de historias clínicas, de tal manera que las heridas

profundas tales como úlceras y quemaduras representan un problema esencial que se debe

resolver.

Una solución para las heridas profundas es el uso de apósitos, vendajes que proveen un ambiente

limpio, adecuadamente perfundido, es decir, que la circulación de la sangre en el circuito capilar

es normal y libre de necrosis, infección y material extraño (Vowden & Vowden, 2014). La

matriz extracelular (MEC) es una estructura que provee sostén temporal para las células y

los tejidos mientras éstos se reproducen, convirtiéndola en un biomaterial factible para el

uso como apósito (Murugan & Ramakrishna, 2007).

La MEC obtenida de la submucosa del intestino delgado, conocida más comúnmente por las

siglas SIS (por su nombre en inglés: Small Intestinal Submucosa), es un biomaterial

compuesto principalmente por colágeno tipo I y II, factores de crecimiento y proteoglicanos

(Kim M. S., 2007). Por sus componentes, la SIS ha demostrado ser de gran utilidad para el

procesamiento de matrices basadas en colágeno con características biológicas muy

favorables (Kim M. S., 2007) que la hace adecuada para cualquier tipo de regeneración

epitelial (Lua, Leea, Benta, Fishmanb, & Sabelmanc, 2007). Adicionalmente, el ácido

hialurónico (HA) al ser un glicosaminoglicano presente naturalmente en el organismo ha

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demostrado aumentar las propiedades hidrofílicas, regenerativas y de angiogénesis (Collins

& Birkinshawb, 2013). Estos dos materiales juntos presentan grandes expectativas para la

producción de apósitos regenerativos y hemostáticos para heridas profundas. Davidenko et

al demostraron que unas matrices fabricadas en combinación de estos dos compuestos puede

producir poros interconectados que asistan el crecimiento celular, rápida vascularización y

transporte de oxígeno. Igualmente, la presencia de HA en las mátrices de colágeno pueden

aumentar la capacidad de hinchamiento de las matrices y aumentar el tiempo de disolución.

Por esta razón, se buscó realizar mezclas de los dos compuestos con el fin de crear apósitos

regenerativos y hemostáticos que puedan ser utilizados en casos de heridas profundas.

Dichas formulaciones fueron evaluadas en un modelo in vitro a través de un cultivo celular

de fibroblastos a largo término por 28 días y caracterizado a partir de microscopía

electrónica de barrido (MEB), ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-

difeniltetrazol (MTT) y análisis histológico por tinción de hematoxilina y eosina (H&E). A

partir de esta caracterización biológica y el análisis de la misma, fue posible hallar

condiciones biológicas favorables para la proliferación celular en cuatro grupos

experimentales, con mayor y menor concentración de SIS y con presencia o ausencia de HA.

De esta forma, fue posible encontrar que la formulación con mayor contenido de SIS y en

ausencia de HA presentó mejores resultados en las caracterizaciones a 28 días del conteo

celular, el área celular, densidad celular, radio de viabilidad celular y densidad óptica

observada a partir del ensayo MTT como se muestra en el documento a continuación.

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INTRODUCCIÓN La ingeniería de tejidos es una disciplina relativamente nueva que aplica los conocimientos

ingenieriles en contextos médicos, clínicos y quirúrgicos. El fin último de esta disciplina es

obtener tejidos vivos que puedan reemplazar tejidos perdidos y/o funciones perdidas

(Eucomed, 2007). De esta forma, se han venido desarrollando matrices que sirven como un

andamiaje celular para un reemplazo exitoso de dichos tejidos.

En la Universidad de los Andes, el Departamento de Ingeniería Biomédica cuenta entre sus

líneas de investigación con una en Ingeniería de Tejidos-Biomateriales que ha venido

trabajando en el desarrollo de soluciones a problemas que involucran pérdidas de tejido y

pérdidas de la función de los mismos. Especialmente, se han desarrollado avances en el área

cardiovascular y de tejidos blandos con el fin de obtener dispositivos y alternativas viables

frente a este campo (Universidad de los Andes). Así, en el último año se han venido

desarrollando matrices regenerativas en tres dimensiones para la re-epitelización de heridas

abiertas.

Estudios previos realizados por el grupo de investigación del Departamento han demostrado

que la MEC obtenida de la submucosa del intestino delgado, conocida más comúnmente por

las siglas SIS (por su nombre en inglés: Small Intestinal Submucosa), es un biomaterial

compuesto principalmente por colágeno tipo I y II, factores de crecimiento y proteoglicanos

(Kim M. S., 2007). Por sus componentes, la SIS ha demostrado ser de gran utilidad para el

procesamiento de matrices basadas en colágeno entrecruzado con características biológicas

muy favorables (Kim M. S., 2007). Adicionalmente, el ácido hialurónico (HA) al ser un

glicosaminoglicano presente naturalmente en el organismo ha demostrado aumentar las

propiedades hidrofílicas, regenerativas y de angiogénesis (Collins & Birkinshawb, 2013).

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Una de las fuentes de SIS es el intestino delgado de cerdo, éste posee cuatro capas que de

afuera hacia adentro se denominan serosa, capas musculares, submucosa y mucosa (Cook

Biotech, Inc., 2014). La submucosa es la capa que se extrae debido a que provee la

resistencia mecánica y el soporte al intestino delgado a través de una compleja organización

de fibras de colágeno, proteínas y factores de crecimiento (Cook Biotech, Inc., 2014).

Por otro lado, el ácido hialurónico (HA por sus siglas en inglés: Hyalorunic Acid) es un

glicosaminoglicano que se encuentra principalmente en la MEC de tejidos del mesodermo,

el líquido sinovial de las articulaciones y el humor vítreo del ojo (Montalvo, 2010).

Comercialmente, el HA se encuentra en forma de hialuronato de sodio, es decir, en forma de

sal de sodio por lo cual se encuentra cargado negativamente y consecuentemente tiene

propiedades hidrofílicas, algunas veces es llamado “la esponja molecular” (Battaner, 2012).

De esta forma, dadas las anteriores características de la SIS y el HA, en la Universidad de

los Andes se ha llegado a la producción de unas matrices 3D, que se creen pueden ser útiles

para la re-epitelización de heridas abiertas, estas matrices cuentan con características de

esponja debido a que forman un material poroso con alta capacidad de absorción.

Junto con el Laboratorio de Genética Humana de la Universidad de los Andes, tras la

producción de esponjas con concentración variante de SIS y HA, se ha estudiado el efecto

de la variación de los parámetros de manufactura (tales como el tamaño de poro de la SIS, el

tiempo y la temperatura de congelación del gel, la presión y la temperatura de liofilización

del gel, la concentración del ácido hialurónico y su forma de presentación líquida

primordialmente) en las propiedades biológicas de las esponjas. Para realizar dicho estudio

la estudiante de Ingeniería Biomédica, Angie Nathaly Sabogal, desarrolló un modelo in vitro

que consistió en el diseño de un cultivo celular a corto término evaluado en los días 1, 3 y 6.

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Este modelo permitió evaluar la adhesión celular en las esponjas utilizando fibroblastos, las

células propias de los tejidos conjuntivos fibrosos, su función principal es de síntesis y

soporte de la matriz extracelular del tejido, por lo cual su adhesión y proliferación en las

matrices de SIS y HA puede brindar información valiosa para el proyecto al demostrar su

capacidad de funcionamiento como matriz de soporte tisular. De esta forma, se ha utilizado

la línea celular Vero, células aisladas de riñón de mono (Sheets, 2000).

De forma complementaria, se encuentran en proceso pruebas in vivo en un modelo murino

por una duración de 28 días con el fin de comprobar a través de un modelo animal la

viabilidad de implantación de dichas esponjas. Los resultados en el modelo que fue

completado fueron satisfactorios demostrando una completa remodelación del tejido.

Complementando esta investigación, este proyecto se centra en el estudio de la viabilidad de

la proliferación celular en un modelo in vitro a largo término. Un proceso de cicatrización

normal depende fundamentalmente de la profundidad y el sitio de la herida, pero puede

llegar a tener un periodo de cicatrización mayor a 28 días. La recolección de muestras en los

días 1, 3, 6, 14, 21 y 28 permite realizar un control estratégico del crecimiento poblacional y

del cambio en la viabilidad para el término establecido. Suministrando de esta forma

información suficiente para comparar adecuadamente con el modelo in vivo que es llevado

igualmente a 28 días. Para esto, se realizaron caracterizaciones biológicas a partir de

microscopía electrónica de barrido (MEB), ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-

ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) y análisis histológico por tinción de hematoxilina y eosina

(H&E). El análisis por MEB permite calcular el área celular y la circularidad celular como

métodos de análisis de la adhesión y el crecimiento celular para su posterior migración,

proliferación y finalmente maduración (Pereira, Barrias, Granja, & Bartolo, 2013); el ensayo

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MTT permite hallar curvas de densidad óptica respecto a los días transcurridos como

parámetro de examen de la viabilidad celular; y el análisis histológico posibilita el conteo

celular con los radios de viabilidad celular a partir de la diferenciación de células en estado

normal y células en estado alterado, como se explica más adelante en este documento,

realizar mediciones de área efectiva para la adhesión celular y hallar la densidad celular a

partir de una razón del número total de células y el área efectiva.

OBJETIVOS DEL PROYECTO DE GRADO A continuación se presenta el objetivo general y los objetivos específicos planteados a lo largo

de esta investigación.

Objetivo General Evaluar la viabilidad y la capacidad de proliferación celular de la línea celular Vero en los

apósitos regenerativos de SIS y HA para la re-epitelización de heridas abiertas.

Adicionalmente, comparar los resultados de esta investigación con los modelos in vitro

realizados previamente.

Objetivos Específicos 1. Preparar la materia prima (SIS y HA) para producir las esponjas.

2. Diseñar un cultivo celular a largo término y evaluar la viabilidad y la capacidad de

proliferación del mismo.

3. Analizar y comparar los resultados obtenidos a través de las pruebas in vitro realizadas a

partir de células fibroblastos de la línea celular Vero con los resultados obtenidos

previamente en las pruebas in vitro de los cultivos con la misma línea celular.

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Acciones concretas para alcanzar los objetivos planteados Con el fin de lograr los objetivos planteados en el numeral anterior, la metodología que se

propone es la siguiente:

Fase I-Producción de las esponjas: 1. Extracción de la SIS.

2. Descelularización de la SIS.

3. Producción de láminas como control y pulverización de la SIS.

4. Liofilización del HA para acceder a él en estado sólido pulverizado.

5. Producción del gel de SIS y HA.

6. Liofilización y producción de las esponjas.

7. Corte y esterilización de las esponjas.

Fase II-Diseño y caracterización del cultivo celular: 1. Diseño del cultivo celular para una para la extracción estratégica de las muestras.

2. Implantación celular de la línea Vero en las esponjas y los controles.

3. Desarrollo de curvas de densidad óptica a partir del ensayo MTT (Bromuro de 3-

(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol) el cual a partir de la reducción de este

compuesto a formazán produce un compuesto coloreado identificable por la

medición de la absorbancia.

4. Fijación a partir de glutaraldehído y observación de las células adheridas a las

esponjas a través de microscopía electrónica de barrido (MEB) después de realizar

un secado de punto crítico y una metalización como parte de la preparación de las

muestras.

5. Fijación y tinción de las células adheridas en las esponjas a partir de análisis

histológicos con la tinción de hematoxilina y eosina (H&E).

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Fase III-Comparación: 1. Análisis de imágenes y datos obtenidos a partir de la fase anterior y comparación con

las pruebas in vitro realizadas a través del proyecto de grado de Angie Nathaly

Sabogal, estudiante de Ingeniería Biomédica de la Universidad de los Andes en el

semestre 2014-1 y de la prueba in vivo.

RESUMEN DE TRABAJO PREVIO EN EL TEMA A través de un proyecto financiado por la Fundación Cardioinfantil, a lo largo del último

año en el Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de los Andes se han

venido desarrollando matrices 3D regenerativas para el uso en regeneración laminar de

tejidos como apósitos para el control, re-epitelización y regeneración de tejido en heridas

abiertas. Hasta el momento en cuanto a la caracterización de la adhesión celular en las

matrices 3D en un modelo in vitro, Angie Nathaly Sabogal estudiante de Ingeniería

Biomédica de la Universidad de los Andes, en colaboración con el Laboratorio de Genética

Humana de la Universidad de los Andes, diseñó un modelo in vitro basado en un cultivo

celular de la línea Vero en matrices 3D, con concentración aleatoria de SIS y HA (S0.5, S1,

S0.5HA, S1HA) los cuales contienen concentraciones de 0.5% m/v de SIS, 1.0% m/v de

SIS, 0.5% m/v de SIS y 15% m/v de HA y 1.0% m/v de SIS y 15% m/v de HA

respectivamente. Este estudio se realizó con el fin de cuantificar la adhesión, proliferación y

migración celular. En cuanto a la caracterización in vivo, las estudiantes de Ingeniería

Biomédica Angie Nathaly Sabogal y Vivian Andrea Talero han estado diseñando e

implementando un modelo murino en el cual han sido implantadas esponjas de las mismas

formulaciones. Hasta el momento sólo se ha llevado a cabo un sujeto, sin embargo, en éste

ya fue posible observar con esponjas de S0.5 y S1 una remodelación completa del tejido y

una absorción total de la esponja.

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METODOLOGÍA

Preparación esponjas A continuación se muestran explicados a profundidad los pasos que fueron llevados a cabo en la

fase I, correspondiente a la extracción de la SIS y la producción de las esponjas.

a. Extracción de la SIS Se adquiere un intestino delgado de cerdo fresco y se procede a lavarlo completamente con

agua, se realizan 4 lavados con agua o los necesarios hasta que el agua salga

completamente clara. Posteriormente se procede a eliminar los segmentos que contienen

acumulaciones de grasa (denominados parches) y a cortarlo en segmentos para congelarlo

en bloques. Se descongelan los bloques cada vez que se va a realizar la extracción de la SIS

y se procede a abrir las secciones de intestino, cortando por la mitad los tubos y retirando

mecánicamente primero la serosa (capa superior del intestino), incluyendo la capa

muscular, y luego la mucosa (capa inferior del intestino). La capa que queda en la mitad se

conoce como SIS (submucosa intestinal porcina).

b. Descelularización de la SIS Con la SIS previamente retirada del intestino se procede a realizar 3 lavados con agua cada

uno por 20 minutos con el fin de eliminar fragmentos no deseados y suciedad remanente y

se pasa a la cámara de flujo laminar en donde se realizan 4 lavados por 15 minutos, el

primero en una solución de NaClO (Hipoclorito de sodio) con H2O2 (Peróxido de

hidrógeno), el segundo con PBS (Phosphate Buffer Solution) y los dos lavados remanentes

con agua esterilizada.

c. Producción de polvo de SIS Para la producción de un gel de SIS es necesario obtenerla en polvo con el fin de producir

una mezcla homogénea. De esta forma, se procede a realizar unas láminas de SIS de 7x4cm

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a partir de aproximadamente 30 capas de la materia prima. Dado a que se quiere mantener

como control en 2D una lámina del material, se realizan dos láminas adicionales con el fin

de obtener dos réplicas de este control, de aproximadamente 5mm que corresponde al

grosor de las esponjas. Posteriormente, éstas son pulverizadas a partir de un motortool

Kalley K-SH800. Tras la obtención del polvo se procede a calcular el tamaño de poro con

ayuda del mastersizer, se halla un tamaño de poro promedio para el 50% de las muestras

entre 67.9 µm y 84.8 µm.

d. Producción de polvo de HA Como se explica en el numeral anterior, para la producción de un gel que sea

posteriormente liofilizado se deben obtener los compuestos en estado sólido pulverizado.

Sin embargo, la materia prima del HA se obtiene en forma de hialuronato de sodio en

estado líquido. Por tanto, es necesario liofilizar este gel de hialuronato de sodio de venta

comercial; esto se realiza en condiciones de presión 0.045 mBar y temperatura de -130°C

durante 24 horas.

e. Fabricación del gel Con el fin de producir las esponjas, es necesario producir inicialmente un gel en el cual se

disuelven los componentes. Esto se realiza en un gel al 3% de ácido acético y al 0.1% de

pepsina con las siguientes cantidades de SIS y HA.

Tabla 1. Cantidades utilizadas en cada una de las formulaciones utilizadas.

Grupo Formulación g HA g SIS

I S0.5 0 0.05

II S1.0 0 0.1

III S0.5HA15 0.0075 0.0425

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IV S1.0HA15 0.015 0.085

Con el fin de obtener eficientemente una mezcla de todos los componentes, se agitan en un

agitador orbital durante 48h.

f. Producción de las esponjas Con la obtención del gel, se procede a eliminar el sobrenadante, ubicar el gel en moldes

circulares con sección transversal constante de 3cm de diámetro y realizar el proceso de

liofilizaciòn en dos condiciones diferentes: dos réplicas en el Laboratorio de Biofísica a

condiciones de presión 0.045 mBar y temperatura de -130°C y una réplica en el

Laboratorio de Ingeniería Química a condiciones de presión 0.140 mBar y temperatura en

cámara de 2°C y temperatura en el colector de -85°C. Tras la primera liofilización, se

someten las muestras a entrecruzamiento con glutaraldehído al 0.002% en PBS con el fin

de obtener mejores propiedades mecánicas y se repite el proceso de liofilización. Por

último, se procede a realizar un corte mecánico de las esponjas a partir de un perforador de

5 mm de diámetro.

g. Esterilización de las esponjas Para evitar la presencia de microorganismos no deseados en las esponjas, se someten a

esterilización con óxido de etileno durante 48h en la Fundación Cardio Infantil de Bogotá,

Colombia.

Cultivo celular Para la ejecución de la Fase II correspondiente al diseño y caracterización del cultivo celular se

siguieron los siguientes pasos específicos:

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a. Siembra celular Debido a la disponibilidad inmediata, se toman las células de la línea Vero en el pase No.

31 realizado en el Laboratorio de Genética Humana de la Universidad de los Andes, las

cuales se proceden a sembrar 100𝜇𝐿 de suspensión celular en concentración de 1x106

células/mL en cada una de las esponjas (Ding, Zhou, He, & Tan, 2008). La implantación

celular se hace siguiendo el siguiente protocolo: Se toman dos cajas correspondientes al

pase mencionado anteriormente, se toma 1 mL que se tiñe con azul de triptán y se pasa por

la cámara de Neubauer con el fin de realizar conteo celular; tras realizar el conteo, se

implantan en cada uno de los pozos sobre las esponjas que han sido previamente

posicionadas en los pozos, se implantan 70µL de la suspensión celular de la línea Vero y se

inserta la microplaca en el agitador orbital dentro de la incubadora durante 1 hora y tras

esto se vierten 100µL de DMEM (10% SBF, 1% estreptomicina y L-Glutamina). Tras la

implantación en las esponjas, se realiza cambio de medio cada 5 días tras observar la

necesidad de las esponjas, los cambios de medio se realizan con DMEM (5% SBF, 1%

estreptomicina, 80 µg/mL gentamicina y L-Glutamina).

b. Caracterización Durante el proceso de recolección de muestras se realizaron lavados con buffer de fosfato

salino (PBS) y posteriormente, cada muestra recolectada fue divida en tres partes,

dividiendo primero la muestra por la mitad y una de estas mitades en otros dos segmentos.

Cada segmento de estos últimos fue llevado a un protocolo de fijación distinto: 1. Basado

en cloroformo al 3% y 2. Basado en glutaraldehído al 2,5%. El otro segmento

correspondiente a la mitad de la muestra se vuelve a incubar en la microplaca con el medio

de cultivo y 10 𝜇𝐿 del compuesto MTT como se explica a profundidad a continuación:

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• Microscopía electrónica de barrido (MEB): Tras la extracción de las muestras en los

días 1, 3, 6, 14, 21 y 28 del cultivo celular, se colocan en el protocolo de fijación 2.

correspondiente a glutaraldehído al 2.5% por al menos 24 horas. Posteriormente, se

deshidratan con ayuda de etanol en concentraciones que varían entre 60% v/v y 100%

v/v en intervalos de 5 minutos aumentando el 10% en cada uno de los cambios y

finalmente se deja en etanol al 100% por al menos 7 minutos. Finalmente, se llevan las

muestras al Laboratorio de Microscopía de la Universidad de los Andes donde se

realiza preparación por secado de punto crítico y preparación por metalización de las

muestras. A partir de las fotografías obtenidas por MEB es posible observar la

superficie de las matrices, identificando su estructura general y las agrupaciones

celulares presentes. De esta forma, se calcula el área celular y la circularidad celular a

partir de las fotografías en formato binario y la herramienta computacional ImageJ.

Estos últimos atributos permiten identificar a través del tiempo la adhesión celular a

las matrices por la elongación y el crecimiento de las células en las mismas (Arenas &

Zurbarán, 2002).

• Análisis histológico por tinción de hematoxilina y eosina (H&E): Las muestras fijadas

a partir del protocolo de fijación 1. basado en cloroformo al 3% son llevadas al

Departamento de Patología de la Fundación Santafé de Bogotá que con la asesoría de

la Doctora Rocío del Pilar López son analizadas histológicamente a partir de tinción

con hematoxilina y eosina que permite la observación de núcleos celulares, citoplasma

y estructuras generales de las matrices. A partir de los cortes histológicos obtenidos es

posible realizar conteo celular en el microscopio óptico en un aumento de 40x para 10

campos de cada lámina, el conteo se realiza por cuatro lectores ciegos en simultáneo.

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Se realiza conteo de células totales, células en estado normal y células en estado

alterado, identificando estas últimas como aquellas que posean rupturas en el

citoplasma o tinción muy oscura que no permita la identificación del núcleo (Arenas &

Zurbarán, 2002). De esta manera, a partir de este análisis se realiza conteo celular,

radio de viabilidad celular (razón entre células en estado normal y células en estado

alterado) y análisis de la estructura calculando el área efectiva para la adhesión y

proliferación celular en las esponjas, que igualmente permite el cálculo de la densidad

celular (razón entre el área efectiva para siembra y adhesión celular y el número total

de células).

• Ensayo de bromuro de 3-(4-5-dimetiltiazol-2-il)-2-5-difeniltetrazolio (MTT): El

último segmento de la esponja se incuba durante 1 hora en 10 µL de MTT.

Inicialmente se lleva la microplaca a agitación en el agitador orbital durante 10

minutos dentro de la incubadora a 37°C y finalmente se posiciona por 50 minutos en la

incubadora a 37°C con 5% CO2. Finalmente, cuando se extrae, se observa que las

muestras en los platos de control hayan obtenido una tinción de color morado que

indica que los cristales producidos por el MTT se han formando satisfactoriamente, en

este momento se elimina el MTT que dejará de actuar y se ingresan 100 𝜇𝐿 de di-metil

sulfóxido que disolverá los cristales formados y permitirá la cuantificación a partir de

absorbancia. Se ingresa nuevamente la microplaca durante 10 min a la incubadora con

el agitador orbital y finalmente se procede a medir la absorbancia de la muestra,

mientras mayor índice de absorbancia se pueda observar, mayor viabilidad celular se

podrá calcular en la muestra (Zhang, Le Pennec, Steffen, Muller, & Zhang, 2004).

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DISCUSIÓN Y RESULTADOS Antes de mostrar los datos obtenidos a partir de esta investigación se considera importante

explicar las condiciones en las que se realizó el modelo in vitro a corto término realizado

previamente para la posterior comparación con el mismo. Las condiciones en las que se realizó el

modelo previo variaron significativamente respecto a las condiciones en las que se realizó este

modelo y pueden explicar las diferencias que se encontraron en las dos investigaciones.

Inicialmente, es importante destacar que los estudios se realizaron con un tiempo de diferencia

de 6 meses y debido a la disponibilidad de compuestos en el momento se utilizó EDC como

entrecruzante, mientras que a lo largo de este proyecto se utilizó glutaraldehído con este fin. De

igual forma, se observó que la densidad celular para el modelo anterior había sido muy baja (100

𝜇𝐿 de una suspensión de 1x105 células/mL) en comparación con modelos in vitro en esponjas,

como el propuesto por Ding et al. En este estudio las esponjas de colágeno y quitosano se

siembran estáticamente con 100 𝜇𝐿 de una suspensión celular entre 1.21x106 células/mL y

6.37x107 células/mL. Igualmente, la observación de la variación en los resultados de Ding et al.

tras realizar comparaciones de un proceso de siembra estático y un proceso de siembra por

perfusión, los autores encontraron resultados más favorables en el segundo caso en cuanto a

conteo celular, distribución y morfología celular y cobertura de poros para mayor crecimiento

celular. Por estas razones, en este estudio se procedió a realizar un proceso de siembra fluída a

partir de agitación orbital en incubación durante los 60 minutos siguientes a la siembra.

Finalmente, en el modelo anterior no se tuvieron controles de referencia y por esto en este

modelo se tuvieron dos controles correspondientes a los platos de la microplaca y las láminas en

dos dimensiones, los platos se emplearon en las comparaciones del ensayo MTT y las láminas en

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la observación en el microscopio electrónico de barrido, el área celular, la circularidad celular, el

análisis histológico, el conteo celular, los radios de viabilidad celular y el ensayo MTT.

Teniendo esto en cuenta, a continuación se encuentran los resultados encontrados con su análisis

correspondiente.

Análisis de microscopía electrónica de barrido (SEM) En las figuras 1 y 2 se muestran las imágenes de las esponjas previo a la implantación celular. La

Figura 1 muestra las imágenes de las esponjas que fueron liofilizadas el Laboratorio de Biofísica

a condiciones de presión 0.045 mBar y temperatura de -130°C. La Figura 2 muestra las

fotografías de las esponjas que fueron liofilizadas en el Laboratorio de Ingeniería Química a

condiciones de presión 0.140 mBar y temperatura en cámara de 2°C y temperatura en el colector

de -85°C. Es posible observar que las estructuras presentan una estructura porosa pero más

calificable como una estructura en escamas muy similar a la obtenida en el modelo in vitro

anterior.

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Figura 1. Imágenes de microscopía electrónica de barrido de las esponjas liofilizadas en el Laboratorio de Biofísica previas a la implantación celular (Condiciones de liofilización: 0.045 mBar y -130°C) A) S0.5, B) S1, C) S0.5HA, D) S1HA.

Figura 2. Imágenes de microscopía electrónica de barrido de las esponjas liofilizadas en el Laboratorio de Biofísica previas a la implantación celular (Condiciones de liofilización: 0.140 mBar y -85°C) E) S0.5, F) S1, G) S0.5HA, H) S1HA.

A) B)

C) D)

G H

F E

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Con el fin de analizar estadísticamente estas muestras y observar si se presentaban diferencias

significativas entre grupos y entre el método de liofilización, se calculó tres veces el porcentaje

de porosidad superficial para cada réplica a través de la herramienta ImageJ. Este proceso se

realizó obteniendo la imagen binaria (a través de Process- Binary- Make binary) de cada una de

estas fotografías y se graficó el histograma de la imagen (Analyze-Histogram) a partir del cual

fue posible obtener los datos del número total de píxeles y el número de píxeles coloreados. El

análisis estadístico posterior a la recolección de los datos se realizó a través de la herramienta

Prism6 de GraphPad con un Two-way ANOVA y con un intervalo de confianza del 95% entre las

muestras estudiadas, los datos se observan en la figura 3.

Figura 3. Porcentaje de porosidad superficial de los diferentes grupos experimentales liofilizados a dos condiciones diferentes.

El ANOVA permitió comparar los métodos de liofilización y se encontró una variación

significativa en el factor columna correspondiente al método de liofilización con un valor p

22

correspondiente de 0.0173. De esta forma, se corrieron pruebas de comparación múltiple de

Tukey y se encontraron las siguientes diferencias significativas (Tabla 2).

Tabla 2. Resultados obtenidos del análisis estadístico realizado sobre el porcentaje de porosidad entre las diferentes formulaciones para cada método de liofilización (Ns: No diferencias significativas).

Grupos con diferencias significativas Método de Tukey S1 Biofísica vs. S0.5HA Biofísica S0.5HA Biofísica vs. S0.5HA Química S0.5HA Biofísica vs. S1HA Química

De esta forma fue posible observar que el grupo S0.5HA sí presenta diferencias significativas

para los dos métodos de liofilización. Para este grupo, se observan diferencias significativas para

su método de liofilización y con otros grupos experimentales. Dado a que no fue posible

encontrar diferencias significativas entre los métodos de liofilización en otros grupos estas

diferencias del grupo S0.5HA pueden ser causa de un error experimental en el procesamiento de

muestras. Para el análisis de los datos de este estudio se toman todas las formulaciones

liofilizadas en las dos condiciones para el análisis de este documento; sin embargo, se tienen en

cuenta las diferencias significativas encontradas en el grupo experimental S0.5 para sugerencias

futuras y para variaciones en los resultados encontradas dentro de este grupo. De esta manera, se

asume igualdad entre los dos métodos de liofilización y se manejan las diferentes muestras de

cada uno de los grupos experimentales como réplicas sin diferenciar el método de liofilización al

cual fueron sometidas. Sin embargo, se considera que se deben realizar mayores estudios en

cuanto a las diferencias que son observables en la forma y distribución de los poros de las

esponjas en las dos diferentes condiciones de liofilización.

Adicionalmente, se presentan algunas muestras fotográficas de las imágenes obtenidas de la

superficie de las esponjas a partir de microscopía electrónica de barrido. Las figura 4-9 muestran

las fotografías de cortes histológicos correspondientes al día 1, 3, 6, 14, 21 y 28 de cultivo

23

respectivamente. A partir del análisis realizado a estas imágenes y sus réplicas, se calculó tanto

el área celular como la circularidad celular en las muestras.

Figura 4. Fotografías de microscopía electrónica de barrido de las formulaciones de esponja: A) S0.5, B) S1, C) S0.5HA, D) S1HA y E)Láminas, de muestras recolectadas de cultivo celular transcurrido 1 día de la implantación celular.

Figura 5. Fotografías de microscopía electrónica de barrido de las formulaciones de esponja: A) S0.5, B) S1, C) S0.5HA, D) S1HA y E)Láminas, de muestras recolectadas de cultivo celular transcurridos 3 días de la implantación celular.




A) B) C) D) E)

A) B) C) D) E)

A) B) C) D) E)

A) B) C) D) E)

A) B) C) D) E)

24


Área celular A partir de las imágenes obtenidas de la microscopía electrónica de barrido fue posible realizar

un análisis de imágenes con la herramienta computacional ImageJ. Dado a que se les realizaron

fotografías directamente a las células, se tomó cada una de las imágenes y se seleccionó la célula

en la misma. Posteriormente, se realizó una escala de la imagen con ayuda de la escala presente

en cada una de las gráficas y el número de píxeles de la misma y se utilizó la opción Analyze-

Measure y se obtuvieron los datos para el área (figura 10) y la circularidad de las células (figura

11).

Figura 10. Área celular promedio [um2] de cada grupo experimental en los días 1, 3, 6, 14, 21 y 28 transcurridos tras la implantación celular para las formulaciones: S0.5, S1, S0.5HA, S1HA y láminas como grupo control.

A) B) C) D) E)

25

Al realizar el análisis de las imágenes se pudo observar de manera general que para todos los

grupos experimentales el área celular aumenta a medida del tiempo. El aumento del tamaño

celular a lo largo del tiempo permite confirmar un crecimiento celular a medida que las células se

adaptan favorablemente al medio. Se puede observar una tendencia al incremento en el tamaño

celular que sugiere un aumento en el tamaño celular y la cantidad de componentes intracelulares

que poseen para así poder duplicar su material genético y luego dividirse (Vidales & Mugica,

2009).

Con el fin de observar inicialmente si la tendencia a la alza que se observa es significativa en los

grupos se realiza un ANOVA two-way inicial para comparar la media de cada grupo entre días

(Tabla 3).

Tabla 3. Resultados obtenidos del análisis estadístico realizado sobre el área celular entre los diferentes días para cada una de las formulaciones (Ns: No diferencias significativas).

Prueba estadística Grupos con diferencias significativas Método de Tukey

S0.5 Día 1 vs. Día 28 S1 Día 1 vs. Día 21

Día 1 vs. Día 28 Día 3 vs. Día 21 Día 3 vs. Día 28 Día 6 vs. Día 28 Día 14 vs. Día 28 Día 21 vs. Día 28

S0.5HA Día 1 vs. Día 28 S1HA Ns

Láminas Ns

A partir de éste análisis, se puede observar que a pesar de que hay una tendencia de crecimiento

en todos los grupos, únicamente se observan diferencias significativas para todos los días en el

aumento del tamaño celular para la formulación S1, sin embargo los grupos S0.5 y S0.5HA

demuestran una diferencia significativa entre el día 1 y el día 28 de cultivo lo cual sugiere un

crecimiento significativo para estas muestras.

26

Como seguimiento de este análisis, se realiza un segundo ANOVA two-way en el cual se

comparan las muestras en el transcurso de los días como se muestra en la tabla 4 a continuación.

Tabla 4. Resultados obtenidos del análisis estadístico realizado sobre el área celular entre las diferentes formulaciones para cada día de recolección de muestras (Ns: No diferencias significativas).


Muestras 1 día Ns Muestras 3 días Ns Muestras 6 días Ns Muestras 14 días Ns Muestras 21 días S1 vs. S1HA

S1 vs. Láminas Muestras 28 días S0.5 vs. S1

S1 vs. S0.5HA S1 vs. S1HA S1 vs. Láminas

Al observar los resultados de la comparación de medias de Tukey es posible observar que para

los primeros días del cultivo no es posible observar diferencias significativas entre grupos pero

para los días finales del cultivo el grupo S1 empieza a tener diferencias con todos los otros

grupos experimentales al demostrar un mejor comportamiento biológico frente a los otros

grupos.

Circularidad celular Con el mismo análisis que fue realizado previamente para el hallazgo del área celular fue posible

calcular la circularidad celular. Esto se consideró importante para el análisis de los hallazgos de

este proyecto debido a que a pesar de que la morfología de los fibroblastos puede verse

ligeramente afectada dependiendo del material de la superficie a donde se va a adherir; en

general los fibroblastos son células que se adhieren mucho a la superficie alongándose a lo largo

de la misma perdiendo de esta manera la morfología celular que poseen cuando se encuentran en

solución (Sidney & Kohn, 2009).

27

Figura 11. Circularidad celular en cada uno de los grupos experimentales para cada periodo de tiempo. Formulaciones S0.5, S1, S0.5HA, S1HA y Láminas control en los días 1, 3, 6, 14. 21 y 28 de cultivo.

A partir de la figura 11 es posible observar que a medida que transcurre el tiempo en general para

todos los grupos experimentales existe una tendencia de disminución de la circularidad lo cuál

indica que las células sí se están expandiendo a través de la superficie aumentando su tamaño

celular como se muestra anteriormente y por tanto disminuyendo su esfericidad.

Inicialmente, se realizó un ANOVA two-way dentro de los grupos con el fin de identificar

cambios significativos a lo largo del tiempo dentro de cada uno de los grupos experimentales,

como se muestra en la tabla 5.

Tabla 5. Resultados obtenidos del análisis estadístico realizado sobre la circularidad celular dentro de las diferentes formulaciones para cada día de recolección de muestras (Ns: No diferencias significativas).


S0.5 Día 1 vs. Día 28 Día 3 vs. Día 28 Día 6 vs. Día 28 Día 21 vs. Día 28

S1 Día 1 vs. Día 14 Día 1 vs. Día 21 Día 1 vs. Día 28 Día 3 vs. Día 21

28

Con este análisis (tabla 5), es posible observar que la tendencia al descenso en la circularidad

celular es significativo para todos los grupos experimentales lo cual comprueba su pérdida de

esfericidad y adhesión a las matrices. Con esto claro, se realiza un segundo ANOVA two-way

para observar diferencias entre muestras.

Tabla 6. Resultados obtenidos del análisis estadístico realizado sobre la circularidad celular entre las diferentes formulaciones para cada día de recolección de muestras (Ns: No diferencias significativas).

Con una comparación entre días (tabla 6) fue posible observar que sólo se aprecian diferencias

significativas entre días para el día 28 entre S0.5 y S1HA que sugiere que las células en el grupo

S0.5 transcurridos 28 días de cultivo difieren significativamente a las del grupo S1HA.

Día 3 vs. Día 28 Día 6 vs. Día 21 Día 6 vs. Día 28

S0.5HA Día 1 vs. Día 21 Día 1 vs. Día 28 Día 3 vs. Día 21 Día 3 vs. Día 28 Día 6 vs. Día 28 Día 14 vs. Día 28

S1HA Día 1 vs. Día 28 Día 6 vs. Día 28 Día 14 vs. Día 28

Láminas Día 1 vs. Día 28 Día 3 vs. Día 28 Día 6 vs. Día 28 Día 14 vs. Día 28


Muestras 1 día Ns Muestras 3 días Ns Muestras 6 días Ns Muestras 14 días Ns Muestras 21 días Ns Muestras 28 días S0.5 vs. S1HA

29

Análisis histológico A continuación se presentan algunas fotografías, obtenidas a partir del microscopio óptico del

análisis histológico realizado. A partir de imágenes como las que se muestran a continuación fue

realizado el conteo celular. Las Figura 12-17 muestran las fotografías de cortes histológicos

correspondientes al día 1, 3, 6, 14, 21 y 28 de cultivo respectivamente.

Figura 12. Fotografías de cortes histológicos (tinción Hematoxilina-Eosina) de las formulaciones de esponja: A) S0.5, B) S1, C) S0.5HA, D) S1HA y E)Láminas, de muestras recolectadas de cultivo celular transcurrido 1 día de la siembra celular. (Aumento 40X, barra=26 𝝁𝒎)

Figura 13. Fotografías de cortes histológicos (tinción Hematoxilina-Eosina) de las formulaciones de esponja: A) S0.5, B) S1, C) S0.5HA, D) S1HA y E)Láminas, de muestras recolectadas de cultivo celular transcurridos 3 días de la siembra celular. (Aumento 40X, barra=26 𝝁𝒎)



A) B) C) D) E)

B) C) D) E) A)

B) C) D) E) A)

B) C) D) E) A)

30



En las fotografías de las muestras histológicas es posible observar las estructuras de las esponjas

en tonos rosados y azules, las variaciones en los colores se deben primordialmente a su

composición debido a que la hematoxilina se encarga de teñir las sustancias de carácter básico,

es decir, que presentan cargas positivas como los grupos de fosfato de los ácidos nucleicos, los

grupos sulfatos de los glicosaminoglicanos y los grupos carboxilo de las proteínas; mientras que

la eosina se encarga de teñir los compuestos ácidos, es decir, compuestos con cargas negativas

como los grupos amino de las proteínas (Universidad Kennedy, 2011). Así, las estructuras

compuestas por SIS se observan en tonos rosados, mientras que las estructuras compuestas

adicionalmente por ácido hialurónico se observan en tonos rosados y azules. Las células fue

posible identificarlas debido al tono azul fuerte de sus núcleos.

De esta manera, a partir de la observación de los núcleos celulares, fue posible afirmar que existe

viabilidad biológica tanto en las matrices 3D como en el control en 2D debido a que fue posible

hallar presencia celular en cada una de las formulaciones evaluadas en todo el periodo de

recolección de muestras, es decir, para todas las formulaciones en todos los días evaluados se

D) E) C) B) A)

D) E) C) B) A) D)

31

encontró presencia celular. Asimismo, fue posible encontrar agrupaciones celulares a lo largo del

tiempo lo cual sugiere proliferación celular en las mismas como se observa en la Figura 16-A).

Sin embargo, el número de células totales no es considerable para la magnitud de células que

fueron implantadas en cada uno de las matrices (1x106 células). Esto implica una evidente

pérdida de la población celular en el área evaluada, la cual puede ser ocasionada porque las

condiciones in vitro iniciales pueden estar afectando las dinámicas de distribución celular, que

pueden deberse a un proceso de siembra celular que no fue completamente homogéneo, así como

la función de las mitocondrias y la estructura celular generando el desencadenamiento de

procesos de apoptosis o necrosis (Tarazona, Olivera, & Lenis, 2010).

Área efectiva Con el fin de realizar una evaluación de la estructura de las matrices, se realizó un procesamiento

de imágenes de las fotografías del análisis histológico para cada una de las formulaciones sin

incluir las láminas debido a su falta de poros. Este análisis de imágenes se realizó a través de la

herramienta MATLAB_R2014a. Anterior a este proyecto, Angie Nathaly Sabogal y Vivian

Andrea Talero, pertenecientes al grupo de investigación de esponjas en la Universidad de los

Andes, desarrollaron un código que permite a grandes rasgos: La binarización de la imagen y el

cálculo promedio del área efectiva correspondiente a la esponja. Las funciones de programación

implícitas para el análisis de imágenes son im2bw y bwarea.

Los resultados encontrados para las muestras recolectadas transcurrido 1 día del cultivo celular

fueron los siguientes:

32

Figura 18. Área efectiva de cada uno de los grupos experimentales transcurrido 1 día de cultivo.

Los resultados encontrados para las muestras recolectadas transcurridos 3 días del inicio del

cultivo celular fueron los siguientes:

Figura 19. Área efectiva de cada uno de los grupos experimentales transcurridos 3 días de cultivo.

33







Los resultados encontrados para las muestras recolectadas transcurridos 21 días del inicio cultivo

celular fueron los siguientes:

34


Por último, los resultados encontrados para las muestras recolectadas transcurridos 28 días desde

el inicio del cultivo celular fueron los siguientes:


A partir de las gráficas del análisis mostradas anteriormente en las Figuras 18 hasta la Figura 23,

fue posible observar en términos generales que los grupos experimentales S1 y S1HA mostraron

mejor desempeño en cuanto al área efectiva. Sin embargo, con el fin de culminar el análisis de

los datos obtenidos del área efectiva para cada una de las muestras en cada uno de los días y de

35

evaluar las diferencias observadas con estos dos grupos mencionados anteriormente, se realizó

una comparación estadística ANOVA 2way con un intervalo de confianza del 95% para las áreas

encontradas con el fin de evidenciar diferencias significativas entre las formulaciones para cada

periodo. Al encontrarlas, se procedió a realizar una prueba Tukey para identificar los grupos que

presentaban diferencias estadísticamente significativas. Los resultados obtenidos fueron los

siguientes:

Tabla 7. Resultados obtenidos del análisis estadístico realizado sobre el área calculada entre las diferentes formulaciones para cada periodo (Ns: No diferencias significativas).


Muestras 1 día S0.5 vs. S1HA S0.5HA vs. S1HA

Muestras 3 días S1 vs. S0.5HA Muestras 6 días Ns

Muestras 14 días Ns Muestras 21 días Ns Muestras 28 días Ns

A partir de la información obtenida sobre el área efectiva (tabla 7), reportada previamente, es

posible asegurar con una confianza del 95% que existen diferencias significativas del área

efectiva promedio únicamente en los días 1 y 3 del cultivo y únicamente entre S0.5 y S1HA y

S0.5HA y S1HA para el primer caso y S1 y S0.5HA en el segundo caso. Esto comprueba que los

grupos S1HA y S1 presentan cambios con los grupos experimentales con concentraciones de SIS

de 0.5% m/v en algunos casos aunque no en todos de ellos. Asimismo, se evidenció que las

diferencias encontradas entre las formulaciones no son consistentes para los seis días en los que

se realizó extracción de las muestras por esto se considera que es necesario realizar más pruebas

con el fin de identificar las similitudes o diferencias con respecto al área efectiva presente en las

diferentes formulaciones y entre las muestras del mismo grupo. Igualmente, como se puede

observar en la gráfica con todos los días examinados y los grupos estudiados, se observa una

36

irregularidad en el área efectiva para el día número 14 del cultivo debido a que en todos los

grupos demuestra una disminución notable y entre las muestras del día 14 no se observan

diferencias significativas. Esta disminución puede ser debido a una pérdida significativa de masa

en este día, sin embargo no se puede afirmar debido a que no se realizaron pruebas de pérdida de

masa a lo largo de este proyecto.

Conteo celular A partir de las muestras histológicas se realizó conteo celular con el fin de analizar el

comportamiento a través de los días de los diferentes grupos experimentales. Este conteo se

realizó con ayuda del microscopio de luz en las muestras histológicas tratadas como fue descrito

previamente, teñidas con hematoxilina y eosina. Los resultados obtenidos para el número total de

células se muestran a continuación (figura 24).

Figura 24. Número de células encontradas a partir del conteo celular realizadas en placas histológicas de cada uno de los grupos experimentales (S0.5, S1, S0.5HA, S1HA) transcurridos 1, 3, 6, 14, 21 y 28 días de la implantación celular.

37

Se realizó inicialmente un ANOVA two-way dentro de los grupos para observar si los cambios y

las tendencias que se observan son significativos (Tabla 8).

Tabla 8. Resultados obtenidos del análisis estadístico realizado sobre el conteo celular entre las diferentes formulaciones (Ns: No diferencias significativas).


S0.5 Día 1 vs. Día 3 Día 1 vs. Día 14 Día 1 vs. Día 28

S1 Día 1 vs. Día 21 Día 1 vs. Día 28 Día 3 vs. Día 21 Día 3 vs. Día 28 Día 6 vs. Día 28 Día 14 vs. Día 28

S0.5HA Día 1 vs. Día 14 Día 1 vs. Día 21 Día 1 vs. Día 28

S1HA Día 1 vs. Día 14 Día 1 vs. Día 21 Día 6 vs. Día 14 Día 6 vs. Día 21

Láminas Ns Posteriormente, se realizó un análisis estadístico con el fin de encontrar las diferencias de los

grupos experimentales en los días de recolección de muestras. Esto se realizó a través de un

análisis ANOVA 2way, que permite realizar comparaciones entre los grupos experimentales y

entre los días de recolección de muestras, con un nivel de significancia del 95% y se corrieron

pruebas de comparación de Tukey como se muestran a continuación en la Tabla 9.

Tabla 9. Resultados obtenidos del análisis estadístico realizado sobre el conteo celular entre días para las diferentes formulaciones (Ns: No diferencias significativas).


Muestras 1 día S0.5 vs. S1 S0.5 vs. Láminas S1 vs. S0.5HA S1 vs. S1HA S0.5HA vs. Láminas

Muestras 3 días Ns Muestras 6 días S1 vs. S1HA

Muestras 14 días Ns

38

Muestras 21 días S1 vs. S0.5HA S1 vs. S1HA

Muestras 28 días S0.5 vs. S1 S1 vs. S0.5HA S1 vs. S1HA S1 vs. Láminas

Como se puede observar en la Tabla 9; en los días 3 y 6 de recolección de muestras no se

observan diferencias significativas. Sin embargo, para los días 1, 6, 21 y 28 es posible observar

diferencias significativas en las cuales está concurrentemente involucrado el grupo experimental

S1 y al observar la tabla 8, la tendencia a incrementar que se puede observar en S1 se confirma

con diferencias significativas a lo largo de los días para este grupo. Se observan diferencias

significativas para los otros grupos menos para el control laminar, sin embargo no se puede

osbervar una tendencia establecida.

De esta forma, estos datos sugieren condiciones favorables para la proliferación celular en el

grupo experimental con una formulación correspondiente a una concentración de SIS de 1.0%

m/v.

Radio de viabilidad celular Con el fin de identificar la viabilidad biológica entre las células y las muestras, de cada uno de

los grupos experimentales en cada uno de los días de recolección se calculó el radio de viabilidad

celular. Éste se calculó a partir de la razón entre las células en estado normal y las células en

estado alterado identificadas en el conteo celular.

Los resultados se muestran a continuación (Figura 25).

39

Figura 25. Radio de viabilidad celular para las formulaciones: S0.5, S1, S0.5HA, S1HA y las láminas control para los días de recolección 1, 3, 6, 14, 21, 28.

Dado a que no se observa un patrón consolidado de comportamiento para ninguna formulación,

se procede a realizar un análisis independiente por días del comportamiento de las formulaciones

(figuras 26-31).

Figura 26. Radio de viabilidad celular encontrado a partir del conteo celular en las placas histológica, para las muestras recolectadas tras 1 día de la implantación celular para las formulaciones de esponja: S0.5, S1, S0.5HA y S1HA.

40

Para un periodo de cultivo de un día se obtienen resultados favorables únicamente para los

grupos experimentales S1 y S0.5HA. Esto implica una mayor cantidad de células en estado

normal que células en estado alterado para estos dos grupos; se sugiere que deben existir mejores

condiciones biológicas en estas dos formulaciones para la adhesión celular; en los cultivos

previos realizados para 1, 3 y 6 días se pudo observar en el caso del primer día de cultivo que

sólo el grupo experimental S0.5HA presentaba viabilidad celular favorable lo que sugiere que las

muestras de S1 realizadas durante este proyecto poseen mejores condiciones a las muestras del

mismo grupo utilizadas en el modelo in vitro anterior a éste.

Figura 27. Radio de viabilidad celular encontrado a partir del conteo celular en las placas histológica, para las muestras recolectadas tras 3 días de la implantación celular para las formulaciones de esponja: S0.5, S1, S0.5HA y S1HA.

Transcurridos 3 días desde la implantación celular para este modelo in vitro se encontró que los

grupos S0.5, S1 y S1HA poseen una viabilidad favorable. Contrario a lo ocurrido transcurrido un

día de la implantación, S0.5HA no muestra viabilidad favorable por lo cual se puede considerar

que las condiciones se empiezan a deteriorar. En el caso del modelo anterior, fue posible

observar que para estos días de cultivo sólo el grupo experimental muestra una viabilidad

favorable con un valor mayor al que se muestra en este modelo.

41


Se encontró para un periodo de recolección de muestras de 6 días viabilidad celular favorable

para las muestras S0.5 y S1. En el modelo anterior para un mismo periodo de tiempo se encontró

viabilidad celular en los grupos S0.5, S0.5HA y S1HA. Estos resultados siguen demostrando lo

que fue sugerido anteriormente de la muestra S1, la producción de ese grupo experimental puede

haber variado las condiciones biológicas del mismo de un modelo a otro.


42

Transcurridos 14 días del cultivo celular fue posible observar viabilidad celular favorable para

cada uno de los grupos experimentales que fueron evaluados. Se pueden observar líneas de

desviación estándar un poquito superiores en el caso del grupo experimental S1.


En el caso de 21 días desde la implantación celular, se observa viabilidad celular en todos los

grupos evaluados a excepción del grupo experimental S0.5HA obteniendo valores un poco

superiores en el caso del grupo experimental S1.

43


Transcurridos 28 días de la implantación celular en el modelo es posible observar nuevamente

viabilidad celular favorable para todos los grupos experimentales. Es importante considerar que

para facilidad del estudio no se realizó contabilización celular en todos los cortes histológicos

que se obtuvieron en la Fundación Santa Fe de Bogotá dado a que se encontró número total de

células similar en cada una de estas capas. Sin embargo, el radio de viabilidad celular sí se puede

ver afectado y considerando que se realizó conteo fundamentalmente en las capas superiores de

las muestras, estas se pueden ver afectadas por el roce superficial en el posterior tratamiento para

la realización de las pruebas. Esta puede ser la causa para que en el día 21 se vea una viabilidad

celular no favorable para el grupo experimental S0.5HA.

De esta forma, al analizar los resultados es posible afirmar que las muestras con una formulación

de SIS 1.0% m/v, para los seis periodos de recolección de muestras se encuentran en condiciones

favorables. Posiblemente, esto se encuentra directamente relacionado al crecimiento exponencial

que demuestra este grupo experimental en el conteo de células totales.

Se realiza inicialmente un ANOVA two-way dentro de los grupos para observar las diferencias

significativas a lo largo del tiempo para los mismos (tabla 10).

44

Tabla 10. Resultados obtenidos del análisis estadístico realizado sobre el radio de viabilidad celular entre grupos para los diferentes días de recolección (Ns: No diferencias significativas).


S0.5 Ns S1 Ns S0.5HA Día 1 vs. Día 14

Día 3 vs. Día 14 Día 6 vs. Día 14 Día 14 vs. Día 21 Día 14 vs. Día 28

S1HA Ns Láminas Ns

Con este análisis dentro de los grupos fue posible observar que la única diferencia significativa

que existe es en el grupo S0.5HA la muestra del día 14 con las muestra de los otros días.

Se realiza un segundo ANOVA two-way entre los diferentes días para observar cambio entre

días para cada formulación (tabla 11).

Tabla 11. Resultados obtenidos del análisis estadístico realizado sobre el radio de viabilidad celular entre días para las diferentes formulaciones (Ns: No diferencias significativas).


Muestras 1 día Ns Muestras 3 días Ns Muestras 6 días S1 vs. S0.5HA

S1 vs. S1HA S1 vs. Láminas

Muestras 14 días S0.5 vs. S1 S0.5 vs. S0.5HA

Muestras 21 días Ns Muestras 28 días Ns

A partir de estos datos (tabla 11) es posible observar que se encuentran diferencias significativas

para los días 6 y 14. Las diferencias significativas para este día comprenden las muestras S1 para

el día 6 y S0.5 para el día 14 respecto a otras muestras.

Densidad celular A partir de los datos previos obtenidos a partir del análisis de área efectiva y número de células

totales en cada una de las muestras se halló una relación con el fin de identificar el número de

45

células presentes en el área efectiva de cultivo en cada uno de los días de recolección de

muestras. Los resultados se muestran a continuación (Figura 32).

Figura 32. Densidad celular encontrada para las muestras recolectadas en los días 1, 3, 6, 14, 21 y 28 tras la implantación celular en el modelo in vitro para las formulaciones de esponja: S0.5, S1, S0.5HA y S1HA.

Inicialmente, se realizó un ANOVA two-way para identificar las diferencias significativas dentro

de los grupos para afirmar las tendencias (tabla 12).

Tabla 12. Resultados obtenidos del análisis estadístico realizado sobre la densidad celular entre los diferentes días para cada formulación (Ns: No diferencias significativas).


S0.5 Día 1 vs. Día 3 Día 1 vs. Día 28

S1 Día 1 vs. Día 28 S0.5HA Día 1 vs. Día 6

Día 1 vs. Día 14 Día 1 vs. Día 21 Día 1 vs. Día 28 Día 3 vs. Día 28

S1HA Ns

46

Finalmente, se realizó un análisis estadístico ANOVA two-way con el fin de encontrar las

diferencias significativas entre grupos en los diferentes días de recolección y al encontrarlas se

corrieron pruebas de comparación de medias de Tukey con lo que se obtuvieron las diferencias

que se encuentran en la Tabla 13.

Tabla 13. Resultados obtenidos del análisis estadístico realizado sobre la densidad celular entre las diferentes formulaciones para cada periodo (Ns: No diferencias significativas).


Muestras 1 día S0.5 vs. S1 S1 vs. S1HA S1 vs. S0.5HA S0.5HA vs. S1HA

Muestras 3 días S1 vs. S0.5HA Muestras 6 días Ns Muestras 14 días Ns Muestras 21 días Ns Muestras 28 días S0.5 vs. S1

S1 vs. S0.5HA Estas diferencias significativas resultan muy similares a las encontradas previamente al realizar

el análisis estadístico de los datos obtenidos al realizar el conteo celular. El grupo experimental

S1 no posee valores muy altos y por esto difiere bastante con los resultados de los otros grupos

en cada uno de los días de recolección de muestras; sin embargo a partir de la Figura 32 es

posible observar que S1 es el único grupo que a través del tiempo aumenta su densidad celular

mientras los otros grupo experimentales disminuyen o realizan patrones no definidos, su cambio

de tendencia es significativo entre el día 1 y el día 28. En S0.5HA también se presenta un patrón

establecido en disminución que se confirma con los resultados de la tabla 12.

En los primeros días es posible observar una alta densidad celular S0.5HA y S0.5 especialmente

comparado con los otros grupos a pesar de que en el conteo celular demuestran un bajo número.

Estos resultados pueden ser analizados como la presencia de estrés celular que puede ser

consecuencia de factores estructurales como la presencia de grandes vacíos arquitectónicos por

47

discontinuidad o dimensiones fuera de rangos cercanos a las 0.1-220 mm (Tarazona, Olivera, &

Lenis, 2010).

Análisis del ensayo MTT

Figura 33. Gráfica de absorbancia a través de los días transcurridos del cultivo celular. Se muestran los cuatro grupos experimentales más los dos grupos control.

En la Figura 33 se puede observar la gráfica de la densidad óptica calculada por el equipo

correspondiente al ensayo MTT que se realizó en los días 1, 3, 6, 14, 21 y 28 al igual que se

realizaron las tinciones histológicas y las observaciones en el microscopio electrónico de barrido.

A partir de la anterior gráfica, es posible observar que en general los grupos S0.5, S0.5HA y

S1HA presentan valores estables en todos los días del cultivo. Sin embargo, el grupo S1 presenta

valores mayores desde el día 3 de cultivo y ascienden hasta el día 14 mientras los días 21 y 28

disminuyen aunque manteniéndose por encima de los otros grupos experimentales. En el caso de

las láminas se observa un comportamiento estable en los primeros días y asciende de manera

espontánea a un valor elevado en el día 21 y vuelve a caer en el día 28 a un valor más bajo, esto

puede ser producto de una contaminación bacteriana para estos dos días dado a las diferencias

con los días anteriores. En cuanto a los platos de cultivo es posible observar un comportamiento

48

similar al del grupo experimental S1 pues realiza un pico el día 14 el cual vuelve a bajar en los

días siguientes.

Este ensayo permite realizar varias sugerencias en cuanto al comportamiento de las esponjas.

Inicialmente, es posible observar que las esponjas previas a la implantación celular poseen un

nivel de marcación de densidad óptica, esto sucede debido a que el ensayo MTT es capaz de

medir los requerimientos nutricionales de cada una de estas esponjas (Zhang, Le Pennec, Steffen,

Muller, & Zhang, 2004). Se pudo observar que evidentemente por la mayor concentración de

SIS, las mezclas correspondientes a 1.0% m/v de SIS tanto con HA como sin él, poseen valores

más elevados, al igual que el HA por su cuenta también aumenta la densidad óptica pues las

muestras de S0.5HA tienen una densidad óptica mayor que las muestras de S0.5 así como las

muestras S1HA poseen valores superiores a las muestras de S1.

Igualmente, el comportamiento de las muestras sugiere pérdida de masa como ha sido sugerido

en pruebas anteriores pues en el conteo celular se observa que en los últimos días hay mayor

número de células, como sucede en el grupo experimental S1, sin embargo no hay aumento para

estos días en la densidad óptica. Esto puede estar ocurriendo debido a que hay mayor pérdida de

masa, que disminuye la densidad óptica, que aquella que está aumentando debido a la

proliferación celular. Esto sucede especialmente en el día 14 y se puede observar igualmente en

el caso de los platos como control, es posible que los platos alcancen su nivel de saturación, pues

las células alcanzan su límite de propagación y ya que no tienen para dónde seguirse

reproduciendo mueren como consecuencia.

Tabla 14. Resultados obtenidos del análisis estadístico realizado sobre la absorbancia del ensayo MTT entre las diferentes formulaciones para cada periodo (Ns: No diferencias significativas).


Muestras 0 días S0.5 vs. S1HA S1HA vs. Platos

Muestras 1 día S0.5 vs. S1HA

49

Muestras 3 días S0.5 vs. S1 S1 vs. S0.5HA S1 vs. S1HA S1 vs. Láminas S1 vs. Platos



Muestras 21 días S0.5 vs. S1 S0.5 vs. Láminas S0.5 vs. Platos S1 vs. S0.5HA S1 vs. S1HA S1 vs. Platos S0.5HA vs. Láminas S1HA vs. Láminas Láminas vs. Platos

Muestras 28 días S0.5 vs. S1 S0.5 vs. Láminas S1 vs. S0.5HA S1 vs. S1HA S1 vs. Platos S0.5HA vs. Láminas S1HA vs. Láminas Láminas vs. Platos

Al observar los resultados de la comparación de medias (tabla 14) es posible decir que para los

primeros días las muestras S1HA muestran características más favorables frente a los otros

grupos para la adhesión celular. Sin embargo, desde los 6 días transcurridos del cultivo el grupo

experimental S1 empieza a mostrar ventajas frente a todos los otros grupos experimentales. En

los últimos días las láminas también presentan diferencias significativas frente a los otros grupos,

que sugieren un comportamiento biológico más favorable, esto puede ser causado debido a que

en estos últimos días al retirarlas del medio de cultivo fue posible observar que estas estaban

50

hinchadas pero mantenían mayor consistencia frente a las esponjas debido a su falta de poros que

con la pérdida de masa resultan en pérdida de la consistencia y de la resistencia.

De esta forma, se puede decir que la formulación de SIS 1.0% m/v presenta características

biológicas más favorables para la adhesión, proliferación y migración celular pues satisfacen las

necesidades nutricionales de las células.

CONCLUSIONES Todos los grupos experimentales estudiados presentaron condiciones biológicas favorables que

favorecieron la adhesión y la proliferación celular garantizando la viabilidad celular. Sin

embargo, a pesar de que todas las formulaciones presentan condiciones biológicas favorables,

fue posible observar que presentan diferentes estructuras y que la superficie de las esponjas no

presenta una estructura porosa. Se recomienda a futuro utilizar concentraciones del entrecruzante

que en este caso fue glutaraldehído más altas que permitan comparar los resultados en búsqueda

de un tamaño de poro entre 0.1 y 0.22 mm (Yang, et al., 2002) y una resistencia mecánica mayor

que evite la pérdida de masa en un periodo menor a 28 días.

Se evidenció a partir de los resultados que sería de gran utilidad realizar mayor cantida cortes en

las muestras que fueron observadas en el MEB con el fin de obtener mayor cantidad numérica

para análisis de imágenes y poder observar lo que está ocurriendo en capas inferiores pues en

algunas muestras se podía dificultar el encuentro de células añadiendo que el MEB no es el

equipo más adecuado para realizar esta visualización debido a que las estructuras presentan

morfología de escamas que en algunos casos dificultan la diferenciación de las estructuras de la

esponja con los fibroblastos en estado maduro adheridos a la superficie.

En todas las pruebas que se realizaron se observaron consistentemente resultados más favorables

para las esponjas con formulación de SIS en concentración 1.0% m/v. En cuanto al conteo

51

celular se observó un crecimiento constante en relación al tiempo transcurrido y los radios de

viabilidad celular se encontraron por encima de los otros grupos experimentales. Igualmente en

el ensayo de la densidad celular fue posible observar que este grupo crecía exponencialmente

mientras los otros se comportaban de maneras no estables.

A partir del ensayo MTT también se observó mejor comportamiento biológico para la muestra

S1. Sin embargo, al igual que cuando se calculó el área efectiva, se propone realizar pruebas de

pérdida de masa para este cultivo pues se cree que después de los 14 días es posible que la tasa a

la que se está perdiendo masa es mayor a la tasa a la que está ocurriendo la proliferación celular.

No fue posible realizar conclusiones sobre el efecto del HA en las formulaciones, ya que no se

encontraron diferencias significativas contundentes en los resultados obtenidos para las

formulaciones que contenían HA en comparación con las que no lo contenían.

En conclusión, las esponjas de MEC de SIS y HA presentan características biológicas favorables

(Arenas & Zurbarán, 2002; Badylak, Freytes, & Gilbert, 2009; Kim M. S., 2007) que pueden

promover la regeneración de tejidos dado a que demuestran promover la adhesión y la

proliferación celular debido a la presencia de factores biológicamente activos, características que

las hacen posibles candidatas para el uso como apósitos regenerativos en heridas abiertas.

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