V Diagnóstico y terapia epigenética

En la actualidad se están desarrollando técnicas de diagnóstico y agentes terapéuticos con actividad

a nivel epigenético. En este capítulo se hará una breve descripción de las herramientas de diagnóstico

para cáncer, seguido por la descripción de algunos compuestos activos trascendentes que actúan a nivel

de modificación de ADN e histonas junto con la descripción de sustancias de origen alimenticio que

muestran este tipo de actividad.

5.1 Diagnóstico basado en la epigenética

La información epigenética puede utilizarse en el diagnóstico de enfermedades complejas. En el

campo de la nutrición humana, se espera sean utilizados perfiles de expresión genética para describir

una condición patológica, incluso en etapas pre-clínicas [Müller & Kersten 2003]. El cáncer es la principal

enfermedad en la que se han intentado identificar patrones epigenéticos, tanto así que varios estudios

han demostrado que se pueden clasificar los tumores de acuerdo a sus perfiles de expresión como

herramienta para predecir su comportamiento y asimilación de fármacos antineoplásicos [Perez et al. 2004;

Jain 2004; Mantripragada et al. 2004; MacGregor & Squire 2002].

Sin embargo, el perfil de expresión genética está limitado por:

a) La disponibilidad de células que, para evitar los efectos epigenéticos del estrés, deben ser

obtenidas por técnicas no-invasivas,

b) la heterogeneidad genética de la población humana, y

c) los diferentes estilos de vida y hábitos alimenticios.

Cuando se tenga mayor conocimiento del transcriptoma humano, bajo diferentes condiciones y

etapas de desarrollo, esta herramienta tendrá mucho más valor diagnóstico.

Tipo de cáncer

Alteraciones epigenéticas asociadas

Colon

Hipermetilación de islas CpG (hMLH1, p16INK4a, p14ARF, RARb2, SFRP1, WRN), hipometilación genómica global, pérdida de impronta de

IGF2, mutaciones en enzimas modificadoras de histonas (EP300, HDAC2), disminución de histonas H4 monoacetiladas y trimetiladas.

Seno Hipermetilación de islas CpG (BRCA1, E-cadherina, TMS1 y receptor

de estrógeno), hipometilación genómica global

Pulmón Hipermetilación de islas CpG (p16INK4a, DAPK, RASSF1A),

hipometilación genómica global, deleciones genómicas de CBP y del factor remodelador de cromatina BRG1.

Glioma Hipermetilación de islas CpG (enzima reparadora de ADN MGMT,

EMP3 y THSBS1)

Leucemia Hipermetilación de islas CpG (p15INK4b, EXT1, ID4), traslocaciones de modificadores de histonas (CBP, MOZ, MORF, MLL1, MLL3 y NSD1)

Linfoma Hipermetilación de islas CpG (p16INK4a, p73, enzima reparadora de ADN

MGMT), disminución de histona H4 monoacetilada y trimetilada

Vejiga Hipermetilación de islas CpG (p16INK4a y TPEF/HPP1), hipometilación

genómica global.

Riñón Hipermetilación de islas CpG (VHL), pérdida de impronta de IGF2,

hipometilación genómica global.

Próstata Hipermetilación de islas CpG (GSTP1), amplificación genética de policomb histona metiltransferasa EZH2, patrones aberrantes de

modificación de histonas H3 y H4.

Esófago Hipermetilación de islas CpG (p16INK4b y p14ARF), amplificación de

histona desmetilasa JMJD2C/GASC1 Estómago Hipermetilación de islas CpG (hMLH1 y p14ARF)

Hígado Hipermetilación de islas CpG (SOCS1 y GSTP1), hipometilación

genómica global Ovario Hipermetilación de islas CpG (BRCA1)

Tabla 12. Alteraciones epigenéticas encontradas en diferentes tipos de tumores. Abreviaturas: BRCA1=gen susceptibilidad a seno 1; BRG1=gen relacionado a BRM/SWI2 1; CBP=elemento de respuesta a AMPc; DAPK=proteina cinasa asociada a muerte; EMP3=proteína de membrana epitelial 3; EP300=proteína de unión E1A de unión a p300; EXT1=exostosina 1; EZH2=promotor de homólogo de zezte de Drosphila 2; GSTP1=glutatión S-transferasa 1; HDAC2=histona desacetilasa 2; hMLH1=homólogo de MutL Escherichia coli; ID4=inhibidor de unión a ADN 4; IGF2=factor de crecimiento tipo insulina 2; JMJD2C/GASC1=proteína con dominio Jumonki 2C; MGMT=O6-metilguanina-ADN metiltransferasa; MLL1=leucemia de linaje mezclado 1; MLL3=leucemia de linaje mezclado 3; MORF=factor relacionado con la proteína dedo de zinc de leucemia monolítica; MOZ=dedo de zinc de leucemia monolítica; NSD1=proteína receptor nuclear con unión a dominio SET 1; RARb2=receptor de ácido retinóico b2; RASSF1A=proteína de la familia de asociación ras 1; SFRP1=proteína secretada relacionada a frizzled 1; SOCS1=supresor de señalamiento de citosinas 1; THBS1=trombospondina 1; TMS1=blanco de silenciación inducida por metilación 1; TPEF/HPP1=gen de poliposis hiperplásica 1; VHL=enfermedad de von Hippel-Landau; WRN=síndrome de Werner [Adaptada de Esteller 2008].

5.1.1 Cáncer

Las marcas epigenéticas asociadas con el desarrollo y la progresión del cáncer podrían utilizarse en

el área clínica (Tabla 12). Los marcadores de hipermetilación de ADN están siendo estudiados para

probar si podrían ser utilizados como métodos de diagnóstico, pronóstico y para la predicción de la

respuesta al tratamiento.

La hipermetilación de islas CpG podría ser un marcador de células cancerígenas en todos los tipos

de fluidos biológicos y especímenes de biopsia [Laird 2003; Esteller et al. 1999a] (Tabla 13). Este análisis tiene

aplicaciones diagnósticas potenciales para los individuos que sean portadores de mutaciones de alta

penetrancia en genes supresores de tumor. Por ejemplo, la identificación de la hipermetilación de ADN

en una biopsia de mama proveniente de una portadora de una mutación en BRCA1 puede ser útil

cuando el diagnóstico es incierto, ya que la hipermetilación de las islas CpG es un evento temprano en

el desarrollo de lesiones cancerígenas [Esteller et al. 2001b].

La aplicación de pruebas de hipermetilación de ADN como marcadores de tumoración en la práctica

clínica diaria requerirá, además de un criterio objetivo de selección de genes aplicables en diferentes

tipos de tumores, de técnicas rápidas, cuantitativas, precisas y costo-efectivas [Esteller 2008]. La

hipermetilación de un gen supresor de tumoración y los perfiles de hipermetilación de ADN pueden ser

indicadores de la prognosis del paciente oncológico. Por ejemplo, la hipermetilación de los genes

DAPK, p16INK4a y EMP3 se ha relacionado con resultados pulmonares, colorectales y cerebrales no

favorecedores respectivamente [Esteller 2007].

La hipermetilación de ciertos genes colabora con la predicción de la respuesta al tratamiento. Un

ejemplo es la metilación asociada con la silenciación de la proteína MGMT, reparadora de ADN, en

gliomas [Estelle et al. 1999b]. La MGMT revierte la adición de grupos alquilo a las bases guanina del ADN

[Esteller & Herman 2004]. Dos estudios han mostrado que la hipermetilación de MGMT es un factor de

predicción independiente sobre una respuesta favorable de los gliomas a carmustina (BCNU) [Esteller et al.

2000] o temozolomida [Hegi et al. 2005; Hau et al. 2007]. No obstante, la hipermetilación de MGMT en pacientes

con astrocitomas de bajo grado (una forma de glioma), y en otros tipos tumorales, constituye una señal

de prognosis no favorable debida probablemente a la acumulación de mutaciones en estos

tumores[Komine et al. 2003; Hanahan & Weinberg 2000].

El grado de metilación de otros genes reparadores de ADN también ha mostrado predecir la

respuesta a la quimioterapia. Algunos casos son la ciclofosfamida (con el gen MGMT) [Esteller et al. 2002],

cis-platino (con el gen hMLH1) [Strathdee et al. 1999], metotrexato (con el gen transporador de folato

reducido, RFC) [Ferreri et al. 2004] e irinotecan (con el gen WRN) [Agrelo et al. 2006] (Fig. 53).

5.2 Tratamiento epigenético

5.2.1 Inhibidores de la metilación de ADN

Estos fármacos impiden la metilación del ADN al inhibir a las DNMTs para reactivar genes

aberrantemente silenciados (Fig. 54). Sin embargo, la mayoría de los inhibidores de DNMT conocidos

en la actualidad no son específicos para cada tipo de estas enzimas [Burgers et al. 2002].

La inhibición de la metilación de ADN puede ser especialmente útil para tratar casos de cáncer en

donde uno de los cambios epigenéticos base es la hipermetilación anormal de regiones promotoras de

genes involucrados el mantenimiento y regulación del ciclo celular (Fig. 55) [Scarano et al. 2005; Esteller 2007].

Además, los inhibidores de DNMT también están siendo probados en la reactivación del gen de

hemoglobina fetal para así incrementar la producción de hemoglobina F y corregir la anemia derivada

de enfermedades como talasemia y anemia falciforme [Egger et al. 2004; Santini et al. 2001].

Los inhibidores de DNMT pueden ser subdivididos en tres grupos según sus estructuras químicas:

inhibidores nucleósido-análogos, inhibidores no-nucleósido análogos y oligonucleótidos antisentido.

5.2.1.1 Nucleósidos análogos

Los análogos de nucleósidos consisten en derivados de deoxicitidina con una modificación en la

quinta posición del anillo pirimidina (Figs. 56 y 57). Estos compuestos inhiben la metilación del ADN

de forma irreversible, lo que induce un efecto dual: reactivan genes silenciados en dosis pequeñas y

producen citotoxicidad en dosis más altas [Lu et al. 2006].

Tipo de tumor Gen Muestra Metilación (%)

Próstata GSTP1 [Goessl et al. 2000] Suero/plasma 72 Orina 36 Eyaculación 50

Carcinoma microcítico de pulmón

APC [Usadel et al. 2002] Suero/plasma 47

CDKN2A [Kersting et al. 2000] Esputo/lavado bronquial, BAL

50

p16, DAPK, MGMT, GSTP1 [Esteller et al. 1999a]

Suero/plasma 73

Seno p16INK4a [Silva et al. 1999] Suero/plasma 23 Ciclina D2, RARb, gen twist [Evron et al. 2001]

Lavado ductal 85

Vejiga p14ARF [Domínguez et al. 2002] Plasma 40 Cáncer colorectal

p16 [Zou et al. 2002] Plasma/suero 38

Esófago APC-adenocarcinoma [Kawakami et al. 2000]

Suero/plasma 27

APC-SCC [Kawakami et al. 2000] Suero/plasma 12 Hígado p15 [Wong et al. 2000] Suero/plasma 81

Cabeza y cuello p16, DAPK, GSTP1, MGMT [Sanchez-Cespedes et al. 2000]

Suero/plasma 42

Tabla 13. Detección de cáncer con fluidos corporales utilizando la metilación de ADN como marcador.

Abreviaturas: GSTP1=glutatión-S-transferasa-fosfato 1; APC=poliposis coli adenomatosa; CDKN2A/p16=cinasa ciclina-dependiente 2ª; DAPK1=proteína cinasa asociada con muerte 1; MGMT=O-6 metilguanina-ADN metiltransferasa [Adaptado de Das & Singal 2004].

Figura 53. Epigenética en el manejo terapéutico del cáncer.

Las técnicas de metilación de ADN permiten una detección sensible y cuantitativa de los genes supresores de tumoración hipermetilados en varios tipos de fluidos biológicos y biopsias. El establecimiento del perfil de metilación de ADN y modificación de histonas del espécimen tumoral puede ser una herramienta valiosa para obtener una prognosis y predecir la respuesta del paciente a los tratamientos [Adaptado de Esteller 2008].

Figura 54. Inhibición de la ADN metiltransferasa (DNMT) al atrapar o bloquear la

enzima. Izquierda: Los análogos de nucleósidos (p.e. azacitidina) pueden incorporarse al ADN durante la fase de replicación y después ser reconocidos por las enzimas DNMT. Posteriormente, forma un intermediario estable con el grupo sulfhidrilo de un residuo cisteína en la región catalítica de la DNMT. Derecha: Moléculas no-nucleósidas (p.e. RG108) puede bloquear el bolsillo catalítico sin la formación de intermediarios covalentes [Adaptado de Lyko & Brown 2005].

Figura 55. Blancos de la terapia epigenética a nivel de metilación de ADN.

La desmetilación resulta en una reactivación de varios genes, generando una variedad de efectos. Por ejemplo, la desmetilación de la región promotora del gen MLH1 induce la reactivación del gen y una quimiosensibilidad incrementada. De manera similar, la desmetilación de E-cadherina, MYOD, antígenos tumorales, DAPK1 y p16 resulta a la adhesión celular y diferenciación, incrementa inmunogenicidad, induce apoptosis e inhibe el crecimiento celular descontrolado, respectivamente [Adaptado de Yoo et al. 2004].

Cuando la célula se expone a la actividad de los análogos de nucleósidos, estos compuestos se

fosforilan por cinasas, se convierten en nucleótidos y se incorporan al ADN. Normalmente, cuando

DNMT actúa sobre citosinas de ADN recién sintetizado, se forma un complejo intermediario donde se

incorpora un grupo metilo (obtenido a partir de SAM) en la posición C5, y posteriormente la enzima se

libera del complejo [Jeltsch 2002]. La presencia de una modificación en esta posición provoca que la enzima

quede atrapada en un aducto de ADN-proteína, previniendo la futura metilación de las cadenas hijas de

ADN al acabar con la reserva de DNMT [Zhou et al. 2002]. Los análogos de nucleósidos tienen un efecto

irreversible sobre el DNMT de las células proliferativas [Lu et al. 2006].

Los primeros análogos de nucleósidos, los análogos originales, fueron sintetizados durante la

segunda mitad del siglo XX, 5-azacitidina (5-aza-CR) y 5-aza-2’-deoxicitidina (5-aza-CdR,

decitabina), y se han estudiado extensivamente demostrando inducir la diferenciación celular e inhibir

la metilación de ADN con dosis micromolares [Jones & Taylor 1980].

La azacitidina es el primer agente hipometilante de ADN aprobado por la FDA para el tratamiento

de síndromes mielodisplásicos (MDS) [Kaminskas et al. 2005; Marcucci et al. 2005]. La azacitidina es rápidamente

absorbida después de una inyección subcutánea, alcanzando su concentración plasmática máxima en

los primeros 30 minutos posteriores a su administración. Una dosis simple de azacitidina de 75 mg/m2

generalmente es bien tolerada, independientemente si se administra por vía subcutánea o intravenosa.

Aunque las dosis altas han mostrado ser tóxicas, la decitabina a dosis bajas mostró ser efectiva como

tratamiento de patologías mieloides como leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoblástica

aguda (ALL), síndrome mielodisplásico (MDS) y leucemia mieloide crónica (CML) [Lu et al. 2006]. Se

obtuvo una tasa de respuesta general del 49% y una tasa de respuesta completa de 20% en pacientes

con MDS de la tercera edad [Wijermans et al. 2000]. Otro estudio mostró que el tratamiento con decitabina es

mejor que el tratamiento paliativo del estado general salud, funcionamiento físico, fatiga y disnea en

pacientes con MDS de la tercera edad. La dosis recomendada de decitabina para estudios futuros sobre

el tratamiento de MSD es de 15 mg/m2/d por 10 días [Issa et al. 2004], mientras que en pacientes con

tumores sólidos se ha utilizado 2 mg/kg/d en infusión contínua por 168 horas [Lu et al. 2006].

Sin embargo, los análogos originales tienen la desventaja de ser inestables en solución acuosa y ser

susceptibles a la desactivación por la citidina desaminasa [Ptak & Petronis 2008; Lu et al. 2006]. Afortunadamente,

la zebularina ha mostrado superar estos obstáculos.

La zebularina es un análogo nucleósido que contiene un anillo 2-(1H)-pirimidona y que fue

originalmente sintetizado como un inhibidor de la citidina desaminasa [Ballestar & Wolffe 2001; Amir & Zoghbi 2000;

Issa 2002]. Además de funcionar como un potente inhibidor de la metilación de ADN, la zebularina tiene

varias propiedades terapéuticas deseables al ser muy estable y tener características fisicoquímicas que

permiten su administración por vía oral. Por su baja toxicidad, la zebularina puede dosificarse de

manera continua a concentraciones pequeñas [Cheng et al. 2004a].

La zebularina ha mostrado tener una mayor preferencia por células tumorales que por fibroblastos

normales [Cheng et al. 2004b]. Esta sustancia se incorpora al ADN de manera lineal a través del tiempo:

cuando se compararon varias líneas celulares tumorales y normales, se observó que las células

cancerígenas incorporaban el fármaco más rápidamente que las normales [Cheng et al. 2004b]. Entre los genes

que activa la zebularina se encuentra un grupo de antígenos relacionados con cáncer [Cheng et al. 2004b] y

otros relacionados con la apoptosis [Pompeia et al. 2004], lo que sugiere que este fármaco puede tener una

acción antitumoral en conjunto con inmunoterapia. En un estudio se trataron células cancerígenas

inicialmente con 5-aza-CdR y posteriormente se expusieron a zebularina. El resultado fue que la re-

metilación fue inhibida y la expresión genética se mantuvo, lo que sugiere que con un tratamiento

combinado se obtiene la mejor respuesta inhibidora de la metilación [Cheng et al. 2004a].

No obstante, la zebularina tiene algunas desventajas y aún es necesario realizar estudios que ayuden

a comprender los efectos clínicos completos de esta sustancia. Por ejemplo, se requieren

concentraciones más altas de zebularina para obtener un grado similar de desmetilación que el inducido

por 5-aza-CdR. Se piensa que, siendo la zebularina un inhibidor de citidina desaminasa, gran parte del

fármaco administrado podría ser secuestrado por la enzima y así disminuiría la concentración efectiva

del fármaco. Otra explicación es que la inhibición de citidina desaminasa por la zebularina incrementa

la concentración celular de citidina y deoxicitidina, resultando en la inhibición competitiva de

deoxicitidina [Yoo et al. 2004].

5.2.1.2 Análogos no-nucleósidos

Los análogos no-nucleósidos son moléculas pequeñas con la capacidad de unirse al sitio activo de

las DNMTs o prevenir la expresión de las enzimas sin incorporarse al ADN. Estas sustancias no tienen

una actividad tan potente como los análogos nucleósidos, pero pueden ser más útiles en la práctica

clínica porque pueden inhibir la metilación del ADN sin una acción tan directa sobre el ADN [Lu et al.

2006].

La procaína es un fármaco anestésico que causa hipometilación del ADN global en líneas celulares

de seno MCF-7. En este estudio, las células MCF-7 fueron tratadas con varias concentraciones de

procaína (0.005-0.5 mM) por 72 horas y se determinó una reducción de hasta el 40% en el contenido de

citosinas metiladas después del estudio. La procaína también ha mostrado inducir la desmetilación de

islas CpG densamente hipermetiladas, como las encontradas en la región promotora del gen RARβ2, lo

que reestablece la expresión de los genes relacionados a éstas [Villar-Garea et al. 2003].

La procainamida (agente antiarrítmico) y la hidralazina (fármaco antihipertensivo), ambos derivados

del ácido 4-aminobenzóico, han demostrado inducir una desmetilación de células T en varios sistemas

experimentales [Lu et al. 2005]. La procaiamida inhibe competitivamente la actividad DNMT.

Concentraciones micromolares de procainamida inhiben DNMT1 en condiciones in vitro, pero no a la

DNMT3a o DNMT3b2. Además, la procaniamida reduce la afinidad de DNMT1 a sus dos sustratos

(ADN hemimetilado y SAM) [Lee et al. 2005]. Por otro lado, la hidralazina no inhibe la activad DNMT, sino

que desestabiliza la vía de señalamiento ERK y así disminuye la expresión de DNMT1 y DNMT3a [Deng

et al. 2003]. La toxicidad reportada por estas sustancias es leve, con signos como náusea, mareo, fatiga,

cefalea y palpitaciones [Zambranoet al. 2005b]. La hidralazina es el único análogo no-nucleósido cuya

investigación ha sobrepasado la fase clínica I, mostrando que puede reactivar genes supresores de

tumoración en pacientes con cáncer cervical no-tratado sin afectar el grado de metilación global [Zambrano

et al. 2005a].

El descubrimiento de la mayoría de los inhibidores de DNMT ha sido fortuito. La falta de

estructuras tridimensionales de los DNMT en organismos eucariotas ha detenido el diseño racional de

inhibidores para esta enzima. Sin embargo, se ha establecido un modelo de homología tridimensional

del sitio catalítico de la enzima DNMT1 humana [Siedlecki et al. 2003]. Esto ayudó a identificar a RG108, una

molécula pequeña inhibidora de la DNMT humana que funciona bloqueando el sitio activo de la

enzima. Aunque RG108 ha demostrado una actividad desmetiladora dependiente de la concentración

con una toxicidad ligera [Brueckner et al. 2005], no se han realizado pruebas clínicas para indagar su uso en

humanos [Ptak & Petronis 2008].

5.2.1.3 Oligonucleótidos antisentido

Los oligonucleótidos antisentido son secuencias cortas de ácidos nucleicos complementarias a

secuencias específicas de un ARNm determinado (secuencia sentido) (Fig. 58). La formación de un

complejo sentido-antisentido bloquea la traducción del mensaje genético, impidiendo que se traduzca

en una proteína.

La molécula MG98 inhibe la traducción del ARNm DNMT1, sin afectar a DNMT3a o DNMT3b, al

dirigirse a su porción 3’. Se reportó una respuesta partcial a MG98 en un paciente con carcinoma renal

en una prueba clínica fase I [Stewart et al. 2003]; sin embargo, en la fase II se obtuvieron resultados menos

exitosos [Brueckner et al. 2005]. La evaluación farmacológica de MG98 indica que su efecto no es dosis-

dependiente [Davis et al. 2003a]. Se considera que una dosis de 80 mg/m2/d es segura y tolerable cuando se

administra por 2 horas por infusión intravenosa dos veces por semana por tres-cuatro semanas. Sin

embargo, aún se requieren más estudios para poder determinar las características de este inhibidor, ya

que también ha demostrado no siempre ser efectivo como estrategia antitumoral [Saikawa et al. 2004].

5.2.1.4 Compuestos alimenticios que afectan el grado de metilación del ADN

Se han sugerido tres mecanismos diferentes para explicar el posible impacto de ciertos componentes

alimenticios sobre el grado de metilación de ADN:

1) Influir en la disponibilidad de grupos metilo para la formación y mantenimiento de SAM.

2) Alterar el uso de los grupos metilo por cambios en la actividad metiltransferasa.

3) Inducir cambios en la actividad ADN desmetilasa.

Además, los patrones mismos de metilación de ADN podrían influenciar en la respuesta a

componentes alimenticios, lo que podría explicar las diferencias en respuesta entre células normales y

neoplásicas.

Existe evidencia que muestra que la metilación de ADN está influida por el alcohol, betaína, cumestrol,

fibra, genisteína, selenio, vitamina A (retinol), vitamina B6 (piridoxina, priridoxal, piridoxamina),

vitamina B12 (cobalamina), vitamina C, arsénico, colina, eculo, folato, metionina, polifenoles y zinc

[Davis & Uthus 2004; Ross 2003; Poirier 1986; Jacob et al. 1998; Cooney 1993].

Figura 56. Estructura química de la citidina y de nucleósidos análogos con

actividad terapéutica en investigación.

Figura 57. Inhibidores de la ADN metiltransferasa (DNMT) y los mecanismos inhibidores.

Los inhibidores nucleósidos (5-azacitidina, 5-azadeoxicitidina y zebularina) sufren un metabolismo extenso en la célula antes de ser incorporados en el ADN, Después de su incorporación, funcionan como sustratos suicidas de las enzimas DNMT. Se ha propuesto que los inhibidores no nucleósidos (procaína, EGCG y RG108) inhiben la actividad DNMT al simular ser secuencias blanco (procaína) o al bloquear el sitio activo de la enzima (EGCG y RG108) [Adaptado de Lyko & Brown 2005].

Figura 58. Mecanismos de acción de oligonucleótidos antisentido en genes blanco.

Se han determinado varios mecanismos para los fármacos antisentido (mostrado en color verde): Inhibición de la transcripción (a), inhibición del ajuste e inhibición de maduración de ARN para prevenir la formación de 5’-cap y la poliadenilación (b) y la inhibición de la transcripción ribosomal (c). Los agentes antisentido que se hibridizaron con el ARN blanco mostraron ser sustratos de las enzimas RNasa H (mostradas en rojo; b,d) que rompen el ARN para formar híbridos ADN-ARN o ARN-ARN y disminuir las concentraciones de ARNm del gen blanco [Adaptado de Gleave & Monia 2005].

5.2.1.4.1 Ciclo del monocarbono: vitaminas B6, B12, folato, metionina y colina

El folato es uno de los protagonistas del metabolismo del monocarbono (Fig. 59). En condiciones

normales de este ciclo, una unidad de carbono proveniente de la serina o glicina se transfiere a

tetrahidrofolato (THF) para formar 5,10-metil-tetrahidrofolato [Scott & Weir et al. 1998] y la vitamina B6 es un

cofactor necesario para la actividad enzimática de esta conversión, la hidroxi-metiltransferasa [Ross 2003].

El 5,10-metil-tetrahidrofolato se puede utilizar para la síntesis de timidina, la cual es precursor de

oxidación del formil-tetrahidrofolato para la síntesis de purinas; y puede ser reducido para formar 5-

metil-tetrahidrofolato, utilizado para metilar homocisteína y así formar metionina [Ross 2003]. La enzima

metionina-sintasa se encarga de mediar la formación de metionina a partir de homocisteína.

Posteriormente, la metionina se convierte a S-adenosil-metionina (SAM) por una transferencia ATP-

dependiente de adenosina a metionina en la vía metionina-adenosiltransferasa [Ross 2003]. La SAM es el

donador de grupos metilo en más de 80 reacciones de metilación, incluyendo las que transforman

ARN, ADN y proteínas [Choi & Mason 2002].

Cuando el folato es limitado, las concentraciones plasmáticas de homocisteína aumentan. Aunque la

enzima betaína-homocisteína metiltransferasa puede compensar parcialmente la síntesis de metionina

por una actividad deficiente de metionina sintasa, se sabe que la deficiencia de folato es suficiente para

disminuir la reserva de SAM [Miller et al. 1994]. Esto lleva a un aumento en la concentración celular de S-

adenosil-homocisteína (SAH) porque el equilibrio de la interconversión SAH-homocisteína favorece la

presencia de SAH. Por lo tanto, cuando el metabolismo de homocisteína se inhiba (como en casos de

deficiencia de folato), la concentración celular de SAH incrementará. Mayor cantidad de SAH implica

la inhibición de la actividad metiltransferasa y de las reacciones de metilación del ADN [Cabo et al. 1995].

Esta inhibición está asociada con consumo insuficiente de folato y con una mayor susceptibilidad a

desarrollar cáncer. Además, se ha encontrado una actividad DNMT reducida en condiciones de

depleción de folato gracias a un mecanismo aún desconocido [Davis & Uthus 2003].

Interesantemente, las sustancias alimenticias que alteran el grado de metilación global pueden

causar, simultáneamente, efectos opuestos en la metilación gen-específica. Por ejemplo, la deficiencia

de folato causa una hipermetilación de ADN mientras, al mismo tiempo, ocurre una hipermetilación en

la secuencia reguladora 5’ del gen H-cadherina y su consecuente represión [Jhaveri et al. 2001].

Varios estudios epidemiológicos y clínicos han sugerido que la ingesta de folato y su concentración

sanguínea de folato están inversamente relacionados con el cáncer colorectal [Kim 2004; Harnack et al. 2002;

Vecchia et al. 2002; Konings et al. 2002; Fuchs et al. 2002]. Sin embargo, estudios en animales han mostrado que la dosis

y el periodo de ingesta de folato son puntos críticos para una profilaxis efectiva y segura:

concentraciones excepcionalmente altas de folato y su administración detección de un foco neoplásico

microscópico favorecen, más que suprimen, la carcinogénesis [Kim 2004].

Además, se ha encontrado hipometilación del ADN en linfocitos humanos con bajo consumo de

folato que puede ser revertida con suplementación de este compuesto [Trasler et al. 2003]. En contraste, otro

estudio sobre tejido intestinal normal y neoplásico reportó que la deficiencia de folato no tuvo impacto

alguno en el grado de metilación de ADN global ni en los genes E-cadherina y p53 [Fang & Xiao 2003]. Por

lo tanto, el efecto de la suplementación de donadores de metilo parece depender del tipo celular, de la

etapa de transformación y del gen.

En un modelo de carcinoma hepatocelular de rata, una dieta deficiente en colina indujo una

hipometilación de islas CpG de los genes c-myc, p53, c-fos y c-Ha-ras, por lo que también se reportó

su sobreexpresión [Tsujiuchi et al. 1999; Bhave et al. 1988; Zapisek et al. 1992; Sohn et al. 2003].

En el desarrollo postnatal y durante la edad adulta, los patrones establecidos de metilación de ADN

y modificaciones de histonas deben mantenerse a través de múltiples divisiones mitóticas; por lo tanto,

el consumo insuficiente de metionina (u otros donadores de metilo) puede alterar los patrones normales

de marcas epigenéticas [Waterland 2006].

Figura 59. Metabolismo del monocarbono y las vías metabólicas relacionadas. Se indican el ciclo del folato (izquierda superior), el ciclo metionina-homocisteína (centro superior), la vía de transulfuración y su conexión con la síntesis de cistationina/glutatión (centro medio e inferior); la vía de regeneración betaína-homocisteína (derecha superior) y la conexión colina-betaína junto con la síntesis e interconversión de fosfolípidos (derecha media e inferior). El desequilibrio en el metabolismo del monocarbono puede causar patrones alterados de metilación de ADN, y por lo tanto cambios fenotípicos. Abreviaturas: 10f-THF=10-formil-tetrahidrofolato; 5,10-CHH-THF=5,10-metenil-tetrahidrofolato; 5-10-CH2-THF=5,10-metilen-tetrahidrofolato; 5mTHF=5-metil-tetrahidrofolato; AICAR=amino-amidazol-carboxamida ribotido; AICART=amino-imidazol-carboxamida ribotido transformilasa; B2=vitamina B2; B12=vitamina B12 (+1 y +2 es el estado de oxidación de cobalto); B6=vitamina B6; BHMT=betaína-homocisteína metiltransferasa; CBS=cistation-beta-sintasa; CDP=citidina difosfato; Chol ox=colina oxidasa; CK=colina cinasa; CPT=1,2-diacil-glicerol-colina fosfotransferasa; CT= CTP-fosfocolina citidiltransferasa; Cys=cisteína; Cys-Gly=cisteína-glicina; decSAM=S-adenosil-metionina descarboxilada; DHF=Dihidrofolato; DHFR=Dihidrofolato reductasa; DMGlicina=dimetil-glicina; dTMP=timidita monofosfato; dUMP=2’-deoxiuridina monofosfato; FAD(H2)=flavin adenina dinucleótido oxidado (reducido); Fin y Fout=velocidad en la cual 5mTHF entra y sale de la célula; FTD=10-formil-tetrahidrofolato deshidrogenada; FTS=10-formil-tetrahidrofolato sintasa; GAR=glicinamida ribotido; Glu=glutamina; Glu-Cys=glutamil-cisteína; Gly=glicina; GSH=glutatión reducido; CSSG=glutatión oxidado; MAT=metionina-adenosiltransferasa; MTR=metionina sintasa; MTCH=5,10-metilen-tetrahidrofolato ciclohidrolasa; MTD=5,10-metilen-tetrahidrofolato deshidrogenasa; MTF=metiltransferasas; MTHFR= 5,10-metilen-tetrahidrofolato reductasa; MTRR=metionina sintasa reductasa; NE=interconversión no-enzimática de THF y 5,10-CH2-THF; PC=fosforibosil glicinamida transformilasa; PS=fosfatidil-serina; PSD=fosfatidil-serina descarboxilasa; PSS1 y 2=fosfatidil-serina sintasa; ROOH=peróxido; SAH=S-adenosil-homocisteína; SAHH=S-adenosil-homocisteína hidrolasa [Adaptado de Muskiet & Kemperman 2006].

Figura 60. Efecto de la suplementación materna en el fenotipo y epigenotipo de crías

Avy/a. (a) Suplementación materna en ratones hembra durante el embrazo (derecha) y el control (izquierda). (b) Distribución de coloración de pelo de las crías. (c) Metilación del ADN y expresión den gen agouti. El grado de metilación del ADN se asocia con represión transcripcional, y por lo tanto con la inhibición de la producción de feomelanina (pigmento amarillo). El tamaño de las flechas es directamente proporcional a la expresión ectópica y durante el desarrollo del gen. Los círculos blancos indican sitios CpG (relacionados con la modulación transcripcional) no metilados, mientras que los círculos negros representan a los que están metilados [Adaptado de Waterland & Jirtle 2003].

Otro estudio utilizó ratones amarillos agouti (Avy) machos y hembras con genotipo no-agouti (a/a)

que fueron suplementadas con promotores del metabolismo de donadores de metilo (S-adenosil-

metionina, SAM): ácido fólico, vitamina B12, colina y betaína [Wolff et al. 1998; Waterland & Jirtle 2003] (Fig. 60).

La suplementación inició dos semanas antes del cruzamiento con los ratones macho y se mantuvo

durante el periodo de embarazo y lactancia. Las crías de las madres suplementadas mostraron pelo

predominantemente negro, mientras que los ratones de madres no-suplementadas lo presentaron

amarillo. La suplementación indujo una hipermetilación en la región IAP (partícula intacisternal A), río

arriba del locus agouti responsable de la coloración amarilla, que provocó un cambio en la distribución

de coloración de cabello en las crías [Waterland & Jirtle 2003]. La hipermetilación silencíó al gen agouti,

permitiendo que los ratones que recibieron suplementación de donadores de metilo tuvieran coloración

negra. Este estudio es una clara demostración de cómo las condiciones nutricionales pueden influenciar

la organización epigenética de los genes y tener efectos a largo plazo sobre la expresión genética y el

fenotipo. Los resultados de los ratones suplementados son similares a los observados en los que se les

administró genisteína, un fitoestrógeno encontrado en soya [Waterland & Jirtle 2003]. Este cambio fenotípico

coincide con una menor susceptibilidad a obesidad, diabetes y cáncer [Cooney 1993; Cooney et al. 2002].

Por lo tanto, la exposición in utero a factores alimenticios no solamente pueden influenciar al

desarrollo embrionario, sino que podrían tener un impacto en la salud a largo plazo.

5.2.1.4.2 Alcohol

Se ha demostrado que el consumo de alcohol altera el metabolismo de folato e incrementa la

susceptibilidad a desarrollar cáncer de la cavidad oral y faringe [Menvielle et al. 2004; Visappa et al. 2004], esófago

[dal Maso et al. 2002], hígado [Munaka et al. 2003] y seno [Ergul et al. 2003; Freudenheim et al. 2004]. Cuando se consume de

forma excesiva, el alcohol está relacionado con la alteración de la metilación de ADN de colonocitos

en ratas y humanos [van Engeland et al. 2003; Choi et al. 1999]. Además, la exposición crónica a alcohol afecta la

concentración de ARNm de las enzimas DNMT en espermatozoides, alterando así la impronta

genómica paterna e induciendo un posible desarrollo fetal anormal [Bielawski et al. 2002].

Existe una correlación importante entre la concentración plasmática de homocisteína y la de alcohol

en sangre en pacientes alcohólicos no-abstinentes; mientras que la concentración de homocisteína va

disminuyendo progresivamente durante periodos de abstinencia [Bleich et al. 2000a, 2004, 2005]. El retículo

endoplásmico resiente mucho la toxicidad de homocisteína y una de las señales de estrés es la

expresión de HERP. En un estudio se observó un incremento significativo de la metilación de la

secuencia promotora del gen HERP (proteína del retículo endoplásmico inducida por homocisteína) en

pacientes alcohólicos, asociada significativamente con la expresión de ARNm de HERP y

concentración elevada de homocisteína característica de estos sujetos [Bleich et al. 2006]. Los niveles

aumentados de homocisteína pueden provocar atrofia cerebral [Bleich et al. 2003], convulsiones [Bayerlein et al.

2005; Bleich et al. 2000b] y alteraciones cognitivas durante el periodo de abstinencia [Wilhelm et al. 2006].

Entonces, algunos de los efectos adversos del consumo de alcohol podrían estar relacionados con

alteraciones en la metilación de ADN.

5.2.1.4.3 Vitamina A (retinoides)

Un estudio mostró que el exceso de ácido retinóico (Fig. 61) reduce la utilización de grupos metilo

provenientes de SAM en hígado hepático, lo que se traduce en una hipometilación global [Rowling et al.

2002]. Sin embargo, se han encontrado sitios de hipermetilación en regiones específicas en las mismas

condiciones de desproporción en la exposición de ácido retinóico [Singh et al. 2003].

5.2.1.4.4 Vitamina C (L-ascorbato)

La deficiencia de vitamina C (Fig. 62) está asociada con hipermetilación en células de pulmón

[Halliwell 2001].

5.2.1.4.5 Fitoestrógenos: genisteína, cumestrol y ecuol

Se cree que los fitoestrógenos (Fig. 63) provenientes de la soya tienen poderes preventivos contra

ciertos cánceres, de próstata y mama, al mantener un patrón de metilación seguro para estos tejidos

[Beiby et al. 2004]. El consumo de genisteína se correlaciona positivamente con cambios en la metilación de

islas CpG de próstata de ratón en genes específicos [Day et al. 2002]. Adicionalmente, se ha encontrado que

la exposición fetal a los fitoestrógenos cumestrol y ecuol inducen una hipermetilación en el oncogen c-

Ha-ras de cáncer pancreático [Lyn-Cook et al. 1995].

5.2.1.4.6 Polifenoles: epigalocatequina-3-galato

El polifenol más abundante del té verde es el (-)-epigalocatequina-3-galato (EGCG). EGCG puede

inhibir la actividad DNMT y así induce la desmetilación de dinucleótidos CpG y la reactivación de los

genes silenciados por metilación (Fig. 64). Este polifenol inhibe competitivamente la actividad DNMT

al unirse a la enzima, evitando así la carcinogénesis en varios modelos animales diferentes [Fang et al. 2003].

1.2.1.4.7 Minerales

Arsénico.El consumo de arsénico en rangos anormales, deficiencia o exceso, ha mostrado causar

hipometilación global en hígado de rata [Uthus 1994]. Además, el arsénico induce la hipometilación en la

porción 5’ de la región reguladora de Ha-ras en animales [Okoji et al. 2002]. Otro estudio sobre células Caco-

2 tratadas con 1 mMde arsenito mostró una hipermetilación global, pero se obtuvo un grado de

metilación en el gen p53 (supresor de tumoración) que cuando se probaron con 2 mM de arsenito

al. 2000].

Cadmio. Estudios en cultivos celulares de hígado de rata han mostrado que el cadmio es un inhibidor

activo de DNMT,sin embargo, cuando se está expuesto de manera crónica a este elemento, se observa

una actividad DNMT aumentada [Takiguchi et al. 2003]

demostró que el cadmio y el zinc inhiben la actividad DNMT, ya sea en ratas con dietas estándar o

deficientes en donadores de metilo, posiblemente por la unión de estos metales a la cisteína del centro

catalítico de la enzima [Poirier & Vlasova 2002]

Zinc.Al igual que el exceso de ácido retinóico, la deficiencia de zinc induce una hipometilación global

por la reducción en la utilización de grupos metilo de SAM en tejido hepático

Selenio.La deficiencia de selenio disminuyó el grado de metilación del ADN en células Caco

especial en la región promotora de p53, al igual que los resultados obtenidos a partir de células de

colon e hígado de rata [Davis et al. 2000]

condiciones deficientes de folato, tienen niveles significativamente inferiores de actividad DNMT en

hígado y colon.

Figura 61. Ácido retinóico. común en fuentes alimenticias

Figura 62

metilación en el gen p53 (supresor de tumoración) que cuando se probaron con 2 mM de arsenito

Estudios en cultivos celulares de hígado de rata han mostrado que el cadmio es un inhibidor

activo de DNMT,sin embargo, cuando se está expuesto de manera crónica a este elemento, se observa

[Takiguchi et al. 2003]. Un análisis realizado a partir de extractos nucleares

demostró que el cadmio y el zinc inhiben la actividad DNMT, ya sea en ratas con dietas estándar o

deficientes en donadores de metilo, posiblemente por la unión de estos metales a la cisteína del centro

[Poirier & Vlasova 2002].

Al igual que el exceso de ácido retinóico, la deficiencia de zinc induce una hipometilación global

por la reducción en la utilización de grupos metilo de SAM en tejido hepático [Wallwork & Duerre 1985]

La deficiencia de selenio disminuyó el grado de metilación del ADN en células Caco

especial en la región promotora de p53, al igual que los resultados obtenidos a partir de células de

[Davis et al. 2000]. Además las ratas con deficiencia de selenio, al igual que en

condiciones deficientes de folato, tienen niveles significativamente inferiores de actividad DNMT en

Ácido retinóico. Esta forma retinoide es la más

común en fuentes alimenticias.

Figura 62. Vitamina C (L-ascorbato).

metilación en el gen p53 (supresor de tumoración) que cuando se probaron con 2 mM de arsenito [Davis et

Estudios en cultivos celulares de hígado de rata han mostrado que el cadmio es un inhibidor

activo de DNMT,sin embargo, cuando se está expuesto de manera crónica a este elemento, se observa

is realizado a partir de extractos nucleares

demostró que el cadmio y el zinc inhiben la actividad DNMT, ya sea en ratas con dietas estándar o

deficientes en donadores de metilo, posiblemente por la unión de estos metales a la cisteína del centro

Al igual que el exceso de ácido retinóico, la deficiencia de zinc induce una hipometilación global

[Wallwork & Duerre 1985].

La deficiencia de selenio disminuyó el grado de metilación del ADN en células Caco-2, en

especial en la región promotora de p53, al igual que los resultados obtenidos a partir de células de

deficiencia de selenio, al igual que en

condiciones deficientes de folato, tienen niveles significativamente inferiores de actividad DNMT en

Esta forma retinoide es la más

Figura 63. Ecuol, genisteína

Figura 64.Modelado molecular de la interacción entre EGCG y DNMT.(a) Orientación de la unión de EGCG en DNMT1. La proteína está represencoloreada de acuerdo a sus estructuras secundarias (hélice, hebra y bucle). Los residuos de contacto de EGCG y el ligando están coloreados de acuerdo al átomo que representan: carbono (gris), oxígeno (rojo), azufre (amarillo). (b) Red dy DNMT1. La distancia señalada en los enlaces (líneas punteadas) se encuentra en Å [Adaptado de Fang et al. 2003].

Ecuol, genisteína y cumestrol (de izquierda a derecha).

.Modelado molecular de la interacción entre EGCG y DNMT.

(a) Orientación de la unión de EGCG en DNMT1. La proteína está representada con listones y coloreada de acuerdo a sus estructuras secundarias (hélice, hebra y bucle). Los residuos de contacto de EGCG y el ligando están coloreados de acuerdo al átomo que representan: carbono (gris), oxígeno (rojo), azufre (amarillo). (b) Red de puentes de hidrógeno entre EGCG y DNMT1. La distancia señalada en los enlaces (líneas punteadas) se encuentra en Å

(de izquierda a derecha).

.Modelado molecular de la interacción entre EGCG y DNMT. tada con listones y

coloreada de acuerdo a sus estructuras secundarias (hélice, hebra y bucle). Los residuos de contacto de EGCG y el ligando están coloreados de acuerdo al átomo que representan:

e puentes de hidrógeno entre EGCG y DNMT1. La distancia señalada en los enlaces (líneas punteadas) se encuentra en Å

5.2.2 Inhibidores de la histona desacetilasa (HDACI)

El grupo de los inhibidores de la histona desacetilasa (HDACI) comprende una clase grande y

diversa de compuestos (Tabla 14). Cada compuesto de este grupo tiene un grupo funcional diferente

con actividad inhibidora de la HDAC, lo que favorece la restauración de la función genética o la

acetilación de factores de transcripción relacionados con supresores de tumoración.

Aunque los mecanismos de acción de los HDACI no son totalmente claros, estas sustancias activas

han mostrado inducir selectivamente apoptosis en células tumorales [Dokmanovic & Marks 2005], aumentar la

producción de especies reactivas de oxígeno [Ruefli et al. 2001], la vía mitocondrial (intrínseca) [Rosato et al. 2003],

la vía del receptor de muerte (extrínseca) [Nebbioso et al. 2005], activación de proteínas solo-BH3 (familia

Bcl-2) [Tan et al. 2006], o causando paro del ciclo celular generalmente en G1/S [Chen et al. 2002]. Un valor

agregado en su actividad es que las células normales, sin alteraciones en su ciclo celular, son resistentes

a la muerte inducida por las HDACI, mientras que una gran variedad de células transformadas son

sensibles a estos compuestos [Dokmanovic et al. 2007]. Estudios con micromatrices de ADN mostraron que

entre el 7-10% de los genes, de diferentes líneas celulares, muestran una expresión alterada cuando

están expuestas a HDACI [Mitsiades et al. 2004; Lee et al. 2006; Gray et al. 2004; Peart et al. 2005].

Las sirtuínas (HDACs clase III) no muestran similitudes en su secuencia con otras clases de HDAC

[Blander & Guarente 2004] y el ión zinc, característico de otras familias de HDACs, no se encuentra en estas

enzimas por lo que no son inhibidas por compuestos que interactúen con éste.

Existen cuatro grupos principales de HDACI: ácidos grasos de cadena corta, ácidos hidroxámicos,

benzamidas y tetrapéptidos cíclicos. Además, varios fármacos han mostrado actividad HDACI de

manera análoga a los tetrapéptidos cíclicos.

Tabla 14. Lista parcial de inhibidores de HDACI. GA= paro de crecimiento; TD=diferenciación terminal; A=apoptosis; AI=muerte celular por activación de la vía intrínseca apoptótica; AE=muerte celular por activación de la vía extrínseca apoptótica; MF= falla mitótica; AU=muerte celular autofágica; S=senescencia; PP=polidiploidia; ROS-CD=muerte celular facilitada por especies reactivas de oxígeno; N/A=no disponible; CBHA= ácido bis-(m-carboxicinamil) hidroxámico; CTCL=linfoma cutáneo de células T [Adaptada de Dokmanovic et al. 2007].

5.2.2.1 Ácidos grasos de cadena corta (SCFAs)

Los SCFAs ya se utilizan para tratar una variedad de enfermedades. El valproato es un SCFA que

normalmente es utilizado como un estabilizante del estado de ánimo, para tratar el desorden bipolar y

como anticonvulsivante en otras enfermedades como epilepsia. Este fármaco también actúa

epigenéticamente al inducir la expresión genética por la inhibición de HDACs y su habilidad de

provocar la desmetilación del ADN [Multinovic et al. 2007]. Además, desde que se descubrieron sus

propiedades epigenéticas, el valproato se administra en combinación con otros fármacos como parte de

la terapia oncológica en algunos pacientes. Este agente antiepiléptico ha demostrado aumentar la

actividad tumoricida de gemtuzumab ozogamicina en líneas celulares de AML [Cate et al. 2007]. Estudios

preclínicos fase I y II apoyan el uso de valproato con decitabina para el tratamiento de leucemia

avanzada [Garcia-Manero et al. 2006]. Además, los estudios fase II han mostrado que la combinación de

valproato con ácido retinóico es útil para el tratamiento del síndrome mielodisplásico y AML

reincidente [Kuendgen et al. 2005].

La tributirina, un análogo del butirato de sodio, se sintetizó recientemente y ha mostrado activad

inhibidora de la proliferación, además de que induce la diferenciación y apoptosis en células de

leucemia in vitro [Yin et al. 2005].

Sin embargo, los SCFAs tienen dosis efectivas en el rango milimolar por lo que, en general, son

inhibidores débiles de HDACs. También muestran efectos pleiotrópicos sobre otras enzimas y tienen

una biodisponibilidad y especificidad baja [Yoo & Jones 2006]. Se espera que cuando los mecanismos de

acción sean más claros, se crearán nuevos SCFAs que sean más útiles, ya sea como monoterapia o

parte de una politerapia, en una variedad de leucemias y condiciones patológicas.

5.2.2.2 Ácidos hidroxámicos

Los hidroxamatos son agentes terapéuticos prometedores, ya que tienen una actividad farmacológica

HDACI potente en concentraciones micromolares o menores.

La tricostatina A (TSA), un antibiótico derivado de Streptomyces hydroscopicus, es el HDACI más

potente conocido hasta el momento. TSA inhibe HDACs de clase I y II, pero generalmente la familia

Sir2 (HDAC clase III) no responde a esta molécula. Los efectos anticancerígenos de TSA se le

atribuyeron inicialmente a su actividad inductora de la proliferación celular [Yoshida et al. 1990] y a su

habilidad de detener el ciclo celular con concentraciones pequeñas. Sin embargo, posteriormente se

descubrió su actividad HDACI.

TSA puede sensibilizar las células tumorales a la radiación [Biade et al. 2001] y se ha demostrado

recientemente que induce una desmetilación, tanto gen-específica como global, en líneas celulares de

cáncer humano de vejiga y seno [Ou et al. 2007]. En estudios preclínicos, TSA mostró efectos

antiproliferativos, dependientes a la concentración, en líneas celulares de estroma endometrial. Este

efecto, combinado con su potencial para reparar irregularidades genéticas vía remodelación de

cromatina, sugiere que TSA es un agente prometedor para el tratamiento de la endometriosis [Wu & Guo

2006]. Sin embargo, debido a que la síntesis de TSA es costosa y altamente ineficiente (20 pasos, con un

2% de rendimiento), la búsqueda de HDACI alternativos está tomando importancia [Furumai et al. 2001; Kim et

al. 1999].

El ácido suberoilanilido hidroxámico (SAHA) es un derivado de la hexa-metilen- bisacetamida

(HMBA), un ácido capaz de inducir un paro en el crecimiento de células transformadas y muerte

celular [Richon et al. 1996] (Fig. 65). SAHA es más potente que su precursor pero es menos tóxico. Su

actividad inhibidora se basa en su unión con el ión zinc del sitio catalítico de HDAC [Finnin et al. 1999], pero

también se ha propuesto que esta sustancia induce la muerte celular a través de la lisis de Bid, una

proteína Bcl-2 solo-BH3 [Ruefli et al. 2001].

SAHA a demostrado actividad anticancerígena en estudios de fase I sobre tumores hematológicos

refractarios y sólidos [Marks & Breslow 2007]. Recientemente, un estudio fase II sobre linfoma cutáneo

refractario de células T (CTCL) mostró que SAHA puede inducir una respuesta parcial, al aliviar el

prurito asociado a esta enfermedad [Duvic et al. 2007], tanto así, que en el año 2006 la FDA aprobó el uso de

SAHA (Vorinostat, Zolinza) para el tratamiento de lesiones dérmicas persistentes derivadas de CTCL.

Se ha propuesto que SAHA podría actuar también como una proteína acetilasa y así interferir con la

función de proteínas chaperonas al alterar las tubulina desacetilasas, como la HDAC6 [Grant et al. 2007].

Otros ácidos hidroxámicos que están siendo investigados para su uso clínico potencial son LAQ824

y PDX-101. El primer compuesto muestra una buena actividad antitumoral en casos de melanoma

maligno humano cuando se combina con el ácido 13-cis-retinóico [Kato et al. 2007]. LAQ824 causa

hiperacetilación, induce apoptosis y acaba de iniciar su fase clínica [Remiszewski et al. 2003]. Por otro lado,

PDX-101 es un sulfonato que inhibe la acción HDAC a concentraciones nanomolares y está siendo

probado también en fase clínica I [Ptak & Petronis 2008].

5.2.2.3 Benzamidas

Dos de estos compuestos derivados del ácido benzoico están en fase clínica. Se piensa que CI-994

(N-acetildinalina) es un inhibidor de la desacetilación de histonas y un inductor del paro en el ciclo

celular [Loprevite et al. 2005]. CI-994 puede ser administrado vía oral y, en combinación con otros

tratamientos como paclitaxel y carboplatino, ha mostrado actividad antitumoral en varios estudios fase

I [Pauer et al. 2004; Prakash et al. 2001]. Sin embargo, un estudio fase II reciente reveló que la administración de

CI-994 en combinación con gemcitabina no es más ventajosa que la gemcitabina sola en el tratamiento

de carcinoma pancreático avanzado. No obstante, los resultados alentadores obtenidos en la fase clínica

I sustentaron que este agente se continuará investigando en fase II con diferentes tipos tumorales.

Otra benzamida, la MS-275, inhibe la actividad HDAC al unirse al ión zinc de su dominio catalítico

[Ptak & Petronis 2008] y ha mostrado propiedades radiosensibilizadoras en células de carcinoma de próstata

humano y líneas celulares de glioma [Camphausen et al. 2004]. Durante las pruebas de fase I, MS-275

administrado por vía oral mostró actividad HDACI efectiva en pacientes con leucemia mieloide

avanzada [Gojo et al. 2006]. Además, esta sustancia es bien tolerada por pacientes con tumores refractarios

sólidos o linfomas [Ryan et al. 2005]. MS-275 es capaz de activar el receptor RARβ2, el cual tiene efectos

antitumorales en casos de próstata y carcinomas renales [Wang et al. 2005].En la actualidad, este agente

también está siendo estudiado en pruebas de fase clínica II.

5.2.2.4 Tetrapéptidos cíclicos

Los tetrapéptidos cíclicos contienen un grupo α-epoxicetona que les permite desactivar el sitio

catalítico de HDAC por medio de una alquilación. La fracción epoxicetona puede ser sustituida por

otros grupos funcionales similares que también son capaces de interactuar con el grupo catalítico:

retrohidroxamato, sulfhidrilo; y los grupos pentafluoroetil- y trifluoro-metil-cetona [Ptak & Petronis 2008]. La

actividad HDACI de estas cetonas electrofílicas depende del grado de hidratación de la cetona, el

agente quelante del ión zinc [Jose et al. 2004].

El depsipéptido es el miembro más conocido de este grupo y ya completó los estudios clínicos de

fase I, donde mostró actividad antitumoral en pacientes con neoplasmas refractarios [Sandor et al. 2002],

linfoma cutáneo y periférico de células T [Piekarz et al. 2001], leucemia linfocítica crónica y leucemia

mieloide aguda. Además, se observó que es bien tolerado por los niños con tumores sólidos recurrentes

o refractarios [Fouladi et al. 2006]. En la fase clínica II, fue inefectivo en casos de cáncer renal metastático

[Stadler et al. 2006], pero aún continuan las pruebas para el tratamiento de linfoma de células T [Piekarz et al. 2001].

Las trapoxinas A y B, derivadas del hongo Helicoma ambiens, son ciclotetrapéptidos hidrofóbicos

que causan inhibición irrevesible de HDAC [Ptak & Petronis 2008] a concentraciones pequeñas (<10nM) [Kijima

et al. 1993].

5.2.2.5 Compuestos alimenticios con acción HDACI

Los compuestos inhibidores de la histona desacetilasa provenientes de fuentes alimenticias han

mostrado, hasta el momento, una actividad más sutil en la regulación epigenética a comparación de los

agentes farmacológicos previamente mencionados [Dashwood et al. 2006] (Fig. 66). Según estudios de

modelado por computadora, los componentes alimenticios con actividad HDACI deben tener ciertas

características estructurales: (1) un grupo funcional que interactúe con el átomo de zinc del centro

catalítico de HDAC, (2) una estructura ¨brazo conector¨ que entre en el boltillo de la enzima; y (3) un

grupo ¨casquete¨ que se asiente fuera del sitio activo [Myzak et al. 2006] (Fig. 67).

5.2.2.5.1 Butirato

El butirato tiene un espaciador corto de tres carbonos adjunto a un grupo carboxílico que

probablemente, al entrar en el bolsillo de la enzima, forma un complejo bidentado con el átomo de zinc.

Con este compuesto, la actividad HDAC se inhibe a concentraciones milimolares in vitro fáciles de

obtener a partir del tracto gastrointestinal, donde el butirato es el principal combustible oxidativo de los

colonocitos [Cummings JH et al. 1987; Bach-Knudsen et al. 2003].

5.2.2.5.2 S-alil-mercapto-cisteína

El disulfuro de alilo (DADS), uno de los compuestos más estudiados en el ajo, es biotransformado

para convertirse en S-alil-mercapto-cisteína [Guyonnet et al. 2004], el cual también cuenta con una porción

espaciadora y un ácido carboxílico terminal. En un estudio donde se administraron 200 mM de DADS

sobre células tumorales de colon, Caco-2 y HT-29, se inhibió la actividad HDAC de forma significativa

y así se aumento el grado de acetilación de las histonas H3 y H4[Duesne et al. 2004].

Figura 65. Mecanismo de acción del vorinostat (ácido suberoilanilido hidroxámico, SAHA) como inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC).

El vorinostat inhibe la actividad HDAC por uhidroxámico del vorinostat se une al átomo de zinc (rosa), permitiendo que el resto de la molécula se pose sobre el resto de la proteína proteína tipo[Adaptado deRichon et al. 2006].

Figura 66. Inhibidores de la histona desacetilasa (

(arriba) Interacción hipotética del butirato con HDAC, formando un complejo bidentado con el átomo de zinc ubicado en el sitio activo; (en medio) Preestructura de S-alil-mercaptoterminal. (abajo) Precursor y estructura de SFNsitio activo de un homólogo de HDAC [Adaptado de Myzak et al. 2006 y Dashwoet al. 2006].

Figura 65. Mecanismo de acción del vorinostat (ácido suberoilanilido hidroxámico,

SAHA) como inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC).

El vorinostat inhibe la actividad HDAC por unión al bolsillo catalítico de la enzima. El ácido hidroxámico del vorinostat se une al átomo de zinc (rosa), permitiendo que el resto de la molécula se pose sobre el resto de la proteína proteína tipo-histona desacetilasa (HDLP)

Inhibidores de la histona desacetilasa (HDACI) conocidos

provenientes de la dieta. (arriba) Interacción hipotética del butirato con HDAC, formando un complejo bidentado con el átomo de zinc ubicado en el sitio activo; (en medio) Pre

mercapto-cisteína, mostrando el ¨conector¨ y la el grupo carboxilo terminal. (abajo) Precursor y estructura de SFN-cisteína en su forma modelada en el sitio activo de un homólogo de HDAC [Adaptado de Myzak et al. 2006 y Dashwo

Figura 65. Mecanismo de acción del vorinostat (ácido suberoilanilido hidroxámico,

nión al bolsillo catalítico de la enzima. El ácido hidroxámico del vorinostat se une al átomo de zinc (rosa), permitiendo que el resto de la

histona desacetilasa (HDLP)

conocidos

(arriba) Interacción hipotética del butirato con HDAC, formando un complejo bidentado con el átomo de zinc ubicado en el sitio activo; (en medio) Precursor y

cisteína, mostrando el ¨conector¨ y la el grupo carboxilo cisteína en su forma modelada en el

sitio activo de un homólogo de HDAC [Adaptado de Myzak et al. 2006 y Dashwood

5.2.2.5.3 Sulforafano-cisteína (SFN-cisteína)

El compuesto sulforafano-cisteína es un metabolito obtenido a partir del sulforafano (SFN)

encontrado en vegetales crucíferos como el brócoli, coliflor, col de Brucelas, nabo, entre otros [Myzak et al.

2004]. Hasta el momento, la SFN-cisteína es el mejor HDACI proveniente de la alimentación.

Específicamente, el grupo α-amino de la SFN-cisteína participa en puentes de hidrógeno con

residuos de histidina del bolsillo enzimático y, al mismo tiempo, su grupo carboxílico forma un

complejo con el átomo de zinc del sitio activo de la HDAC de forma reversible. En un estudio in vitro,

la SFN-cisteína inhibió significativamente la actividad de HDAC en un sistema no-celular cuando se

probó con concentraciones de 3-15 mM, contrastando con el SFN original que no mostró efecto alguno

sobre la actividad HDAC a menos que fuera incubado con células para permitir su biotransformación

[Myzak et al. 2004]. Aún no se conocen las concentraciones exactas que alcanzan los SFNs, y sus metabolitos

activos, en los diferentes tejidos humanos. Sin embargo, en un estudio con cuatro voluntarios humanos

que consumieron brotes de brócoli se alcanzaron concentraciones plasmáticas máximas de ~2 mM [Ye et

al. 2002].

Se ha determinado que las células que están expuestas a SFNs de manera constante y que modulan

su actividad HDAC en un ~20-25%. La consecuencia aparente es que hay genes cuya represión se está

desapareciendo, como si se tratara de un ataque tóxico a la célula. Por lo tanto, los genes que median el

parto celular y la apoptosis, como p21 y BAX, pueden activarse más rápidamente para que la célula

responda con mayor velocidad [Hede 2006].

5.2.2.5.4 Alcohol

Un estudio publicado recientemente encontró que el efecto ansiolítico inducido por el consumo

agudo de alcohol está asociado con una disminución en actividad HDAC y un incremento en el grado

de acetilación de las histonas H3 y H4, en la concentración de CBP, y el neuropéptido Y en la amígala

cerebral de ratas [Pandey et al. 2008]. También se encontró que la ansiedad derivada del síndrome de

abstinencia está asociada con efectos totalmente contrarios al consumo agudo del alcohol en la

amígdala: actividad aumentada de HDAC; disminución de la acetilación de histonas H3 y H4; y menor

expresión de CBP y neuropéptido Y. La administración de TSA compensó la actividad incrementada

de HDAC y los compuestos relacionados y disminuyó la ansiedad del síndrome de abstinencia en ratas

[Pandey et al. 2008], por lo que probablemente el uso de los HDACI pueden ser un apoyo terapéutico que

apoye la recuperación del alcoholismo.

5.2.2.5.5 Dihidrocumarina

La dihidrocumarina es un compuesto encontrado de manera natural en el clavo dulce (Melilotus

officinalis) que es utilizado por la industria alimenticia y farmacéutica como agente saborizante.

Recientemente se descubrió que la dihidrocumarina puede inhibir a las sirtuínas de levadura y humana,

Sir2p y SIRT1 respectivamente, junto con su actividad desacetilasa [Olaharski et al. 2005].

5.2.2.5.6 Restricción calórica y SIRT1 (HDAC clase III)

La proteína HIC1 (hipermetilado en cáncer 1) forma un complejo con SIRT1, una desacetilasa que

previamente ha sido vinculada con la longevidad en organismos como moscas y levaduras. Cuando

HIC1 está desactivada en células tumorales, la expresión de SIRT1 se incrementa, desacetilando e

inactivando el gen p53. Esta represión hace que la célula afectada no sufra apoptosis y sobreviva. Las

concentraciones moderadamente altas de SIRT1, como los observados en animales con dieta

restringida en calorías, parecen tener una mejor resistencia y supervivencia al estrés. Sin embargo, la

silenciación de HIC1 es un signo de cáncer en etapa pre-invasiva. Es probable que, con la disrupción

parcial de p53, estas células hayan aprendido a sobrevivir gracias al incremento de SIRT1 [Hede 2006].

Por lo tanto, los estudios sugieren que SIRT1 puede ser un gen de longevidad, pero el costo por el

aumento en su expresión parece ser la oncogénesis. Si esta suposición es correcta, entonces estas

enzimas podrían ser un objetivo más de acción terapéutica para varios tipos de cáncer.

5.2.3 Limitaciones de las sustancias epigenéticas activas

5.2.3.1 Especificidad general limitada

Los inhibidores de la metilación de ADN se utilizan cuando una hipermetilación específica es parte

del cuadro patológico, como en el caso del cáncer. Sin embargo, una desmetilación global puede

potencialmente activar oncogenes [Eden et al. 2003] y puede agravarse la situación. De manera similar, los

HDACI tienen efectos pleiotrópicos en varias isoformas de HDACs otras proteínas diferentes a las

histonas. Como consecuencia de su inespecificidad, su efecto varía según el tipo celular, de tal forma

que pueden ser más que sólo inhibidores de HDAC [Bolden et al. 2006]. Para optimizar la eficiencia de los

fármacos epigenéticos, sus mecanismos y blancos deben ser definidos.

5.2.3.2 Duración del efecto terapéutico

Aunque la mayoría de los fármacos epigenéticos son efectivos con dosis pequeñas y tienen perfiles

de toxicidad relativamente bajos, sus efectos son temporales y los patrones epigenéticos aberrantes

generalmente regresan una vez que termina el tratamiento.

5.2.3.3 Frecuencia de utilización

Actualmente se están utilizando varios tratamientos epigenéticos junto con otras terapias,

principalmente con el fin de sensibilizar tumores a agentes citotóxicos o radiación [Conley et al. 2006]. Sin

embargo, muy pocos se utilizan como primera línea de tratamiento posiblemente porque aún tienen

poco éxito a comparación de los medicamentos establecidos. No obstante, parece que estos fármacos

tienen un gran potencial preventivo cuando existen epimutaciones que incrementan el riesgo de

desarrollar una enfermedad en personas que aún no muestran signos de la enfermedad [Laird 2003]. Antes

de maximizar su poder diagnóstico, se requiere comprender el epigenoma para identificar

biomarcadores clave.

Figura 67. Actividad HDACI de sulforafano e isotiocianatos estructuralmente relacionados.

Las células de colon HCT116 se incubaron con las moléculas de prueba, y después de 48 horas se analizaron los lisados celulares en una prueba de actividad HDAC in vitro [Adaptado de Myzak et al. 2006].