UTILIZACIÓNDEL

NITRÓGENO INORGÁNICO

BIOQUÍMICA II

• Los compuestos que contienen nitrógeno son:- Aminoácidos y sus derivados

- Nucleótidos

- Polímeros ácido nucleicos

- Proteínas

• La existencia de 20 aminoácidos diferentes en las proteínas implica la existencia de 20 rutas de biosíntesis y 20 rutas de degradación.

• Todos los organismos pueden convertir el amoniaco (NH3) en compuestos de nitrógeno orgánicos, es decir sustancias que contienen enlace C-N, sin embargo, no todos los organismos pueden sintetizar amoniaco a partir del gas nitrógeno (N2) y el ión nitrato (NO3

-).

• La reducción del N2 a NO3- (fijación biológica del nitrógeno), la realizan

tan solo determinados microorganismos a veces en una relación simbiótica con las plantas. La reducción de NO3

- a NH3, es en cambio un proceso muy difundido entre las plantas y los microorganismos.

UTILIZACIÓN DEL NITRÓGENO INORGÁNICO

• En la biósfera se mantiene un equilibrio entre las formas inorgánicas totales y las formas orgánicas totales de nitrógeno. La conversión de nitrógeno inorgánico en orgánico, se inicia con la fijación del nitrógeno y la reducción del nitrato, y esto se contrarresta por el catabolismo (desnitrificación y desintegración) produciendo amoniaco y diversos productos finales orgánicos nitrogenados que pueden metabolizarse a su vez por diversas bacterias [género nitrosomonas oxidan el amoniaco para producir nitrito (NO2

-) y nitrobácter oxidan el nitrito a nitrato]. Estas oxidaciones producen energía.

• Las bacterias desnitrificantes, catabolizan el amoniaco para dar N2. Debido a la toxicidad del amoniaco hay un gran interés en utilizar estas bacterias y sus enzimas en la biorremediación, el uso de organismos vivos para purificar y destoxificar los residuos ambientales de la actividad humana (fabricación y residuos).

UTILIZACIÓN DEL NITRÓGENO INORGÁNICO

• A pesar de que el 80% de la atmósfera terrestre es nitrógeno, su reducción a amoniaco se produce en un número limitado de seres vivos: bacterias Klebsiella y Azotobacter, cianobacterias (algas verde-azuladas) y los nódulos simbióticos de leguminosas (alfalfa y habas) y árboles (aliso).

• La molécula de N2 con un enlace triple (N≡N) es difícil de reducir. Industrialmente la reducción se hace mediante el proceso se Haber utilizando temperatura y presión muy altas (fabricación de fertilizantes).

• La fijación del nitrógeno se da en condiciones anaerobias ya que las enzimas que intervienen en la fijación del nitrógeno son sensibles al oxígeno.

• En los nódulos de las raíces de las plantas infectadas con Rhizobium existe una proteína (leghemoglobina) que mantiene un medio anaerobio al fijar todo el O2 que llega al nódulo y presentándolo a las enzimas respiratorias al igual que la mioglobina en los animales.

FIJACIÓN DEL NITRÓGENO

• El mecanismo de fijación de nitrógeno es el mismo en todas las especies hasta la fecha.

• La estequiometría de la reacción global es la siguiente:

• El ATP se genera del catabolismo de los carbohidratos y los electrones proceden de transportadores de potencial bajo (ferredoxina y flavodoxina). El hidrógeno es un producto secundario de la reducción del nitrógeno.

• El sistema enzimático (complejo nitrogenasa) responsable de la reducción del N2 esta formado por 2 proteínas distintas: Componente I (nitrogenasa o proteína con molibdeno-hierro / cataliza la reducción del N2) y Componente II (nitrogenasa reductasa o proteína con hierro / transfiere los electrones desde la ferredoxina o la flavodoxina al componente I).

• Ambos componentes contienen grupos hierro-azufre, el componente I contiene el cofactor hierro-milibdeno (FeMo-co) al cual se une el N2 durante su reducción.

FIJACIÓN DEL NITRÓGENO

N2 + 8e- + 16ATP + 16H2O 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi + 8H+

• Las plantas, los hongos y las bacterias en su totalidad reducen el nitrato a amoniaco.

• La reducción del nitrato a nitrito (NO2-) es químicamente difícil y se

realiza gracias a la intervención de la nitrato reductasa (grande, compleja, de múltiples subunidades, con FAD, molibdeno y el citocromo 557 con el complejo Fe4S4). La reacción global de la nitrato reductasa es:

• Las plantas utilizan NADH y los hongos y las bacterias utilizan NADPH como donadores de electrones. Los electrones se transfieren al FAD unido a la enzima, luego al citocromo 557, luego al molibdeno y finalmente al sustrato. El molibdeno esta unido a un cofactor que contiene un anillo de pteridina (molibdopterina) que es muy distinto de la FeMo-co (nitrogenasa).

• La reducción del nitrito a amoniaco se da en 3 pasos:

UTILIZACIÓN DEL NITRATO

NO3- + NAD(P)H + H+ NO2

- + NAD(P)+ + H2O

NO2- NO- NH2OH NH3

BIOGÉNESIS DEL NITRÓGENO ORGÁNICO

• Todos los organismos comparten una ruta común de utilización del nitrógeno inorgánico en forma de amoniaco.

• El amoniaco a elevadas concentraciones es muy tóxico pero a concentraciones bajas se constituye en un metabolito (sustrato) sobre el cual actúan 5 enzimas y lo convierten en diversos compuestos orgánicos nitrogenados.

• A pH fisiológico la especie dominante es el ion amonio (+NH4) , pero la especie reactiva es el amoniaco (NH3).

• Todos los organismos asimilan amoniaco a través de reacciones que conducen al glutamato, la glutamina, la asparagina y el carbamoil fosfato. El carbamoil fosfato se utiliza solo para biosintetizar arginina, úrea y nucleótidos de pirimidina. La mayor parte del nitrógeno procedente del amoniaco sirve para biosintetizar aminoácidos y otros compuestos nitrogenados a partir de los aminoácidos glutamato (nitrógeno amino) y glutamina (nitrógeno amida).

UTILIZACIÓN DEL AMONIACO

GLUTAMATO DESHIDROGENASA: Aminación reductora del α-cetoglutarato

• La glutamato deshidrogenasa [NAD(P)H] cataliza la aminación reductora del α-cetoglutarato (reacción reversible) para formar glutamato (amino) :

• La mayor parte de las bacterias y muchas plantas contienen una forma de la enzima específica para el NADPH. La enzima de los animales utiliza NAD+ como principal cofactor, pero también puede emplear NADP+.

UTILIZACIÓN DEL AMONIACO

GLUTAMATO DESHIDROGENASA: Aminación reductora del α-cetoglutarato

• En los animales la glutamato deshidrogenasa se encuentra en las mitocondrias por lo que participa en la generación de energía. Esta enzima se controla alostéricamente, la síntesis de α-cetoglutarato se inhibe por el ATP o el GTP y se estimula por el ADP o el GDP.

• Las levaduras y los hongos contiene ambos tipos de glutamato deshidrogenasa.

• La glutamato sintasa (comparable con la glutamato deshidrogenasa) biosintetiza fundamentalmente glutamato:

UTILIZACIÓN DEL AMONIACO

α-cetoglutarato + glutamina + NADPH + H+ 2 glutamato + NADP+

GLUTAMINA SINTETASA: Generación de nitrógeno amida biológicamente activo

• El glutamato puede aceptar un segundo grupo amoniaco para formar glutamina (amida), esta reacción es catalizada por la glutamina sintetasa (se requiere Mn2+ ).

• Esta enzima se denomina sintetasa porque la reacción acopla la formación del enlace con la energía liberada por la hidrólisis del ATP.

• La reacción de la glutamina sintetasa utiliza un intermediario (acil fosfato).

• El nitrógeno amida (glutamina) se utiliza en la biosíntesis de varios aminoácidos (glutamato, triptófano e histidina), los nucleótidos de purina y pirimidina, y los aminoazúcares.

UTILIZACIÓN DEL AMONIACO

Glutamato + NH3 + ATP glutamina + ADP + Pi

GLUTAMINA SINTETASA: Generación de nitrógeno amida biológicamente activo

• La actividad de la glutamina sintetasa se controla por 2 mecanismos diferentes pero acoplados:

1. Regulación alostérica mediante una retroinhibición acumulativa.- Esta regulación involucra la acción de 8 retroinhibidores específicos (productos finales del metabolismo de la glutamina: triptofano, histidina, glucosamina-6-fosfato, carbamoil fosfato, CTP y AMP, o bien indicadores de algún otro tipo del estado general del metabolismo de los aminoácidos: alanina y glicina.

2. Modulación covalente de la enzima mediante una cascada reguladora.- La glutamina sintetasa se regula por adenilación, la adenilación inactiva el lugar catalítico adyacente. Un residuo de tirosina específico de la enzima reacciona con el ATP para formar un éster entre el grupo hidroxilo fenólico y el fosfato del AMP resultante. Este residuo se encuentra muy cerca del lugar catalítico.

UTILIZACIÓN DEL AMONIACO

ASPARAGINA SINTETASA: Reacción Semejante a la Amidación

• La asparagina sintetasa tiene amplia distribución pero su contribución a la asimilación del amoniaco es mucho menor. Esta enzima utiliza amoniaco o glutamina para catalizar la conversión de aspartato en asparagina.

• La asparagina sintetasa rompe el ATP para dar AMP y PPi, mientras que la glutamina sintasa da ADP y Pi. La glutamina sintetasa tiene como sustrato preferido a la glutamina.

UTILIZACIÓN DEL AMONIACO

Aspartato + NH3 (Gln)+ ATP Asparagina+ AMP + PPi + (Glu)

CARBAMOIL FOSFATO SINTETASA: Generación de un Intermediario para la Síntesis de Arginina y Pirimidina

• La ruta de asimilación del amoniaco, forma en primer lugar, carbamoil fosfato siendo la responsable la carbamoil fosfato sintetasa.

• Tanto el amoniaco como la glutamina pueden ser los donadores de nitrógeno.

• La enzima bacteriana puede catalizar ambas reacciones siendo la glutamina el sustrato preferido.

• Las células eucariotas contiene 2 formas de la enzima: La forma I (mitocondrias) tiene como sustrato preferido al amoniaco y se utiliza en la biosíntesis de arginina y el ciclo de la úrea. La forma II (citosol) tiene preferencia por la glutamina y participa en la biosíntesis de nucleótidos de pirimidina.

UTILIZACIÓN DEL AMONIACO

NH3 + HCO3- + 2 ATP carbamoil fosfato + 2 ADP + Pi

Glutamina + HCO3- + 2 ATP + H2O carbamoil fosfato + 2 ADP + Pi + glutamato