USO DE ULTRASONIDO COMO TÉCNICA ALTERNATIVA EN LA ...

INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY CAMPUS ESTADO DE MÉXICO

USO DE ULTRASONIDO COMO TÉCNICA ALTERNATIVA EN LA DESINFECCIÓN DE VEGETALES

TESIS QUE PARA OPTAR EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS EN DESARROLLO SOSTENIBLE

PRESENTA

SARA CHAVESTE LEDESMA

Asesor: Co-asesor:

Dr. ILANGOVAN KUPPUSAMY AMMAL Dr. JESÚS ENRIQUE CHONG QUERO

Comité de tesis:

Dr. MARIO CARRANZA ALVARADO Dr. JESÚS ENRIQUE CHONG QUERO

Jurado:

Dr. LORENZO LEIJA SALAS Dr. ILANGOVAN KUPPUSAMY AMMAL Dr. JESÚS ENRIQUE CHONG QUERO

Presidente Secretario Vocal

Atizapán de Zaragoza, Estado de México., Abril de 2006.

DEDICATORIAS.

A Enrique, por su apoyo incondicional.

A Wei y Yin, por la fortaleza que me dieron.

RECONOCIMIENTOS.

Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey, Campus Estado de México, por el apoyo brindado para la realización de mis estudios de maestría, los cuales permiten orientar mis esfuerzos en favor del mejoramiento social y sustentable de México. Centro de Investigación en Calidad Ambiental (CICA) del Tecnológico de Monterrey, Campus Estado de México, por facilitar la realización del presente proyecto mediante el otorgamiento de recursos y el uso de sus instalaciones dentro del campus.

ABSTRACT The increased consumer desire to eat fresh fruits and vegetables also increases the consumer demand for new methods of food disinfection. Usually the final consumer uses heat or chemical bactericides, but new trends demands the need to reduce or eliminate this chemical products and, to use other technologies to disinfect fresh food, that have a reduce impact on nutritional content and overall food quality. This commercial challenge has opened up new opportunities for alternative technologies for inactivating microorganisms without relying on heat, which is not a new concept, but their development for use as disinfection treatments has received considerable attention only recently, in response to consumer demands for more fresh and natural food products. Alternative methods for thermal or chemical disinfection (non thermal technologies), of fruits and vegetables are gaining importance, due to they are capable to inactivate microorganisms at ambient temperatures and without chemical additives, thereby avoiding the deleterious effects on the flavor, color and nutrient value of foods. Ultrasound processing or sonication is one of the alternative non thermal technologies, that has shown promise in applications in food industry. The purpose of this study was to evaluate quantitatively, the degree to which microorganisms in the surface of fruit and vegetables could be inactivated through the administration of ultrasonic energy. Also, to compare the results with the germicidal efficacy obtained using commercial bactericides (Microdyn and CM) under the same conditions. Ultrasonic energy at a frequency of 1 MHz, was used to expose samples of either a fruit or a vegetable (Fragaria vesca; Lactuca sativa) at ambient temperature, with inoculated aqueous suspensions of bacteria (Escherichia coli or Salmonella spp.) in a cylindrical container with 70 mL of pure water. There were applied three time treatments: 10, 15, 20 minutes for each bacteria type, and for each fruit or vegetable. In all the experiments, the logarithmic reduction increases with the increased duration of exposure to ultrasonic waves. Only Microdyn and 20 minutes sonication gave acceptable log reductions for food, (over 5 Log), equivalent to 99.999 % of microbe reduction. Twenty minutes sonication is likely the best method to inactivate microbes that can be used by the final consumer, it has the log reduction required to be considered a disinfection process and seems to have no secondary effects on the organoleptic properties of evaluated fresh foods. The physical mechanism of inactivation appears to be cavitation. This work could be useful for improving sanitation and preservation treatments of foods, especially those which are sensitive to temperature. It also contributes to our knowledge of microbial inactivation mechanisms by ultrasonic treatments. Ultrasound is a sustainable technology for disinfection of fresh products, due to it minimize the use of water, and eliminate chemical substances.

RESUMEN El incrementado deseo de los consumidores por consumir frutas y vegetales frescos, ha causado la demanda de nuevos métodos de desinfección de alimentos. Usualmente, el consumidor final utiliza calor o bactericidas químicos, pero las nuevas tendencias exigen reducir o eliminar el uso de productos químicos y utilizar otros procesos, que tengan un impacto reducido en el contenido nutricional y la calidad total del alimento. Este reto ha abierto nuevas oportunidades para tecnologías alternativas de inactivación microbiana, lo cual no es un concepto nuevo, sin embargo, el desarrollo de las mismas para usarlas como tratamientos de desinfección, ha recibido hasta hace poco la atención requerida, como respuesta a las demandas del consumidor de productos más naturales y frescos. Las tecnologías no-térmicas de desinfección de frutas y vegetales están ganando importancia, debido a que son capaces de inactivar microorganismos a temperatura ambiente sin aditivos químicos, evitando así los efectos indeseables en el sabor, color y valor nutricional de los productos. La aplicación de ondas ultrasónicas, es una de estas tecnologías alternativas que ha mostrado ser prometedora en diversas aplicaciones en la industria alimenticia. El propósito de este estudio, fue evaluar cuantitativamente, el índice de inactivación microbiana en la superficie de frutas y vegetales, inducido por su exposición a ondas ultrasónicas de 1 MHz, durante tres diferentes tiempos de aplicación. Comparar los resultados obtenidos, con la inactivación microbiana obtenida usando bactericidas comerciales (Microdyn y CM) bajo las mismas condiciones. Se utilizaron ondas ultrasónicas a una frecuencia de 1MHz, para radiar muestras ya sea de fruta o vegetal (Fragaria vesca; Lactuca sativa) a temperatura ambiente, con inóculos de suspensiones bacterianas (Escherichia coli o Salmonella spp) dentro de un vaso de precipitados con 70 mL de agua pura. Se aplicaron 3 tratamientos de 10, 15 y 10 minutos para cada tipo de bacteria y para cada fruta o vegetal utilizado. En todos los experimentos la reducción logarítmica se incrementa a medida que se incrementa el tiempo de exposición a las ondas ultrasónicas. Sólo el Microdyn y la aplicación de ultrasonido por 20 minutos dieron reducciones logarítmicas aceptables para alimentos (arriba de 5 Log), equivalente a una reducción de la población microbiana en un 99.999%. La radiación ultrasónica de 20 minutos muestra ser el mejor método de inactivación microbiana que puede ser utilizado por el consumidor final, logra la reducción logarítmica requerida para ser considerado un proceso de desinfección adecuado y parece no tener efectos en las propiedades organolépticas de los productos frescos utilizados. El mecanismo físico de inactivación parece ser la cavitación. Este trabajo puede ser útil para mejorar los procesos de desinfección y conservación de alimentos, especialmente de aquellos que son sensibles a la temperatura. También contribuye a ampliar el conocimiento de los efectos bactericidas del ultrasonido como tecnología sustentable en la desinfección de productos frescos.

CONTENIDO. Abstract. 4

Resumen. 5 Contenido. 6 Lista de figuras. 9 Lista de tablas. 11

1. Introducción. 12

2. Objetivos. 17

2.1 Objetivo general 17 2.2 Objetivos específicos 17

3. Antecedentes. 18

3.1 Enfermedades asociadas al consumo de alimentos 18 3.1.1 Toxoinfecciones alimentarias 18

3.2 Microorganismos que causan toxoinfecciones alimentarias. 19 3.2.1 Características generales de Escherichia coli y de Salmonella spp. 19

3.2.1.1 Características de Escherichia coli 19 3.2.1.2 Características de Salmonella spp. 21

3.2.2 Enfermedades Causadas por Escherichia coli y Salmonella spp. 22

3.2.2.1 Enfermedades causadas por E. coli 22 3.2.2.2

Enfermedades causadas por Salmonella spp. 23

3.3 Factores que influyen en la contaminación de los Productos Hortofrutícolas 24

3.4 Tecnologías de Desinfección de Productos Hortofrutícolas 25

3.4.1 Tecnologías Tradicionales de Desinfección de Productos Hortofrutícolas 26

3.4.1.1 Tratamientos Térmicos 26 3.4.1.2 Tratamientos Químicos 26

3.4.1.2.1 Dióxido de Cloro 28 3.4.1.2.2 Plata Coloidal 29

3.4.2 Tecnologías Alternativas de Desinfección de Productos Hortofrutícolas 30

3.4.2.1 Luz Blanca Pulsante de Alta Intensidad 30 3.4.2.2 Campo Eléctrico Pulsado 30 3.4.2.3 Radiofrecuencia 31 3.4.2.4 Atmósferas Modificadas 31 3.4.2.5 Luz Ultravioleta 31

3.5 Ultrasonido 33 3.5.1 Definición 33 3.5.2 Principios Físicos Básicos 33 3.5.3 Mecanismo de Inactivación Microbiana 33

3.5.3.1 Fenómeno de Cavitación 35 3.5.4 Otras Aplicaciones de la Tecnología Ultrasónica 36 3.5.5 Factores Críticos en la Aplicación de la

Tecnología Ultrasónica 36 3.5.6 Expectativas de las Tecnologías Alternativas 37 3.5.7 Efecto Sinérgico del Ultrasonido en Combinación

con otros Tratamientos en la Industria Alimentaria 37 4. Materiales y Métodos. 38

4.1 Bacterias y Condiciones de Crecimiento 38 4.2 Productos Hortofrutícolas Seleccionados 40

4.2.1 Lechuga 40 4.2.2 Fresa 41

4.3 Preparación del Inóculo 42 4.3.1 Conteo Bacteriano 43

4.4 Inoculación de Productos 43 4.5 Tratamientos de Desinfección Analizados 44

4.5.1 Tratamiento con Microdyn 44 4.5.2 Tratamiento con Bactericida CM (Comercial Mexicana) 45 4.5.3 Tratamiento con Ultrasonido 45 4.5.4 Evaluación de la Eficacia de los Tratamientos con

Bactericidas Comerciales 47

4.5.5 Expresión de los Resultados 48 4.6 Determinación de las Variaciones de pH y Temperatura 49

5. Discusión de Resultados. 51

5.1 Tratamientos de Desinfección Evaluados 51 5.1.1 Muestras de Fresa (Fragaria vesca) 51

5.1.1.1 Inóculo de Escherichia coli 52 5.1.1.2 Inóculo de Salmonella spp. 53

5.1.2 Muestras de Lechuga (Lactuca sativa) 54 5.1.2.1 Inóculo de Escherichia coli 54 5.1.2.2 Inóculo de Salmonella spp. 55

5.2 Variaciones de pH 61 5.2.1 Control 61 5.2.2 Lechuga con Inóculo de Escherichia coli 62 5.2.3 Lechuga con Inóculo de Salmonella spp. 63 5.2.4 Fresa con Inóculo de Escherichia coli. 64 5.2.5 Fresa con Inóculo de Salmonella spp. 65

5.3 Variaciones de Temperatura 66 5.3.1 Control 66 5.3.2 Lechuga con Inóculo de Escherichia coli. 67 5.3.3 Lechuga con Inóculo de Salmonella spp. 69 5.3.4 Fresa con Inóculo de Escherichia coli. 70 5.3.5 Fresa con Inóculo de Salmonella spp. 71

6. Conclusiones. 73

7. Referencias y Bibliografía. 75

LISTA DE FIGURAS Figura # 3.1 Fotografía de una colonia de Escherichia coli tomada con

microscopio electrónico.

20 Figura # 3.2 Imagen de Salmonella enteritidis. 21 Figura # 3.3 Fenómeno de cavitación inducido por ondas ultrasónicas

asociadas a la expansión e implosión de burbujas.

34 Figura # 3.4 Fenómeno de Cavitación inducido en un líquido. 35 Figura # 4.1 Siembra de Escherichia coli. 38 Figura # 4.2 Fotografía de tortuga utilizada para la extracción de la cepa

de Salmonella spp.

39 Figura # 4.3 Fotografía de lechuga utilizada en los experimentos. 40 Figura # 4.4 Fotografía de fresas utilizadas en los experimentos. 41 Figura # 4.5 Toma de colonias para la preparación del inóculo bacteriano. 43 Figura # 4.6 Equipo amplificador de ondas ultrasónicas, cabezal de 5 cm

de diámetro sumergido en vaso de precipitado de 100 mL con5 mL de líquido

46 Figura # 4.7 Acercamiento del transductor de ondas ultrasónicas. 46 Figura # 4.8 Gráfico de la muerte o destrucción bacteriana. 49 Figura # 4.9 Medidor de pH y temperatura utilizado en los experimentos. 49 Figura # 5.1 Índices de reducción Log resultante de los tratamientos de

desinfección aplicados a muestras de Fresa con inóculo de E.

coli.

52 Figura # 5.2 Reducción Log resultante de los tratamientos de desinfección

aplicados a muestras de Fresa con inóculo de Salmonella


aplicados a muestras de Lechuga con inóculo de E. coli


aplicados a muestras de Lechuga con inóculo de Salmonella

sp.

56 Figura # 5.5 Cuadro comparativo de la Reducción logarítmica resultante

entre los diferentes tratamientos de desinfección aplicados a muestras de lechuga y fresa con su inóculo respectivo.

57 Figura # 5.6 Variación del pH del agua corriente estéril con los diferentes

tratamientos de desinfección aplicados.

61 Figura # 5.7 Variación del valor de pH de agua estéril con muestra de

lechuga e inóculo de E. coli.

62 Figura # 5.8 Variación del pH de agua esterilizada con muestra de

lechuga e inóculo de Salmonella spp.

63 Figura # 5.9 Variación del valor de pH de agua estéril con muestra de

fresa con inóculo de E. coli.

64 Figura # 5.10 Variación del valor de pH de agua esterilizada con muestra

de fresa e inóculo de Salmonella spp.

65 Figura # 5.11 Variación de Temperatura del agua esterilizada con la

aplicación de diferentes tratamientos de desinfección.

66

Figura # 5.12 Variaciones de temperatura del agua esterilizada,

conteniendo 3 gramos lechuga e inóculo de E. coli., con los diferentes tratamientos de desinfección aplicados.

67

Figura # 5.13 Variaciones de temperatura del agua esterilizada, conteniendo 3 gramos lechuga e inóculo de Salmonella spp, con los diferentes tratamientos de desinfección aplicados.

69 Figura # 5.14 Variaciones de temperatura del agua esterilizada,

conteniendo 3 gramos fresa e inóculo de E. coli., con los diferentes tratamientos de desinfección aplicados.

70

Figura # 5.15 Variaciones de temperatura del agua esterilizada, conteniendo 3 gramos fresa e inóculo de Salmonella spp, con los diferentes tratamientos de desinfección aplicados.

71

LISTA DE TABLAS. Tabla # 3.1 Clases de E. coli patógenas, pertenecientes al grupo EEC y

síntomas que causan.

20 Tabla # 3.2 Clasificación en grupos de Salmonella sp. 21 Tabla # 3.3 Fuentes de microorganismos patógenos en productos

hortofrutícolas frescos y condiciones que influyen en su sobrevivencia y crecimiento.

24 Tabla # 3.4 Agentes químicos utilizados para disminuir la carga

microbiana en productos hortofrutícolas frescos.

27 Tabla # 3.4a Agentes químicos más utilizados por el consumidor final para

disminuir la carga microbiana en productos hortofrutícolas frescos que se analizarán a detalle en este proyecto de investigación.

28 Tabla # 4.1 Valor Nutricional de la lechuga por porción de 100 gramos. 41 Tabla # 4.2 Valor Nutricional de la fresa por porción de 100 gramos 42 Tabla # 4.3 Matriz de Tratamientos Aplicados a los Productos

Seleccionados. 44

Tabla # 4.4 Equivalencia en Reducción log a el porcentaje de reducción microbiana en alimentos.

47

Tabla # 4.5 Condiciones y variables bajo las cuales se hicieron las mediciones de pH y Temperatura.

50

Tabla # 5.1 Índices de Reducción logarítmica de los tratamientos aplicados sobre muestras de fresa, con inóculo de Escherichia coli.

52

Tabla # 5.2 Índices de Reducción logarítmica de los tratamientos aplicados sobre muestras de fresa, con inóculo de Salmonella sp.

53

Tabla # 5.3 Índices de Reducción logarítmica de los tratamientos aplicados sobre muestras de lechuga, con inóculo de Escherichia coli.

54

Tabla # 5.4 Índices de Reducción logarítmica de los tratamientos aplicados sobre muestras de fresa, con inóculo de Escherichia coli.

55

Tabla # 5.5 Comparación de ventajas y desventajas de diversos tratamientos de desinfección existentes con el ultrasonido de 1 MHz aplicado por 20 minutos, evaluadas en escala de 1 a 3

59

1 INTRODUCCIÓN. A futuro, uno de los problemas que habrán de enfrentarse será el consumo de alimentos inocuos1 microbiológicamente hablando. Es prioritario para poder alcanzar un desarrollo social y económico sustentable, el cuidar los recursos naturales con los que contamos, principalmente el agua. Con el crecimiento de la población, y la actividad industrial, se generan mayor cantidad de residuos contaminantes que terminan por contaminar los recursos hídricos disponibles, imprescindibles para el cultivo de productos hortofrutícolas. La introducción de nuevas técnicas de desinfección de vegetales que no involucren el uso de sustancias químicas que constituyan contaminantes en sí mismas, es un factor básico a tomar en cuenta para cuidar este recurso y para proteger la salud de los consumidores. El estilo de vida de la población en cuanto al consumo de alimentos, está cambiando en diversas partes del mundo. La mayoría de los consumidores, son cada vez más conscientes de su salud, por lo que la demanda de alimentos se ha movido a otros grupos alimenticios. Uno de los rubros en donde se ha manifestado una demanda creciente en los últimos años es en el de los productos hortofrutícolas frescos; debido a que se consideran sanos, nutritivos y de fácil preparación para su consumo. (Murano et al., 2002; Siller J., 2003). Los productos hortofrutícolas suelen ser tratados utilizando desde ácidos orgánicos hasta agentes químicos diversos, con la finalidad de reducir o eliminar su carga bacteriana e incrementar su vida de anaquel. (USFDA 2001ª). Sin embargo, en los últimos diez años, ha habido un incremento en la frecuencia de brotes de enfermedades asociadas a alimentos, atribuidas al consumo de frutas y vegetales crudos. Están involucrados diversos productos enteros, en corte, y jugos no pasteurizados. (Murano et al., 2002). Y aunque las causas son variadas, el hecho es que estos productos representan vehículos potenciales de infección (Francis et al., 1999) y que han sido implicados en un gran número de incidentes de intoxicaciones alimenticias. (Nguyen & Carlin, 1994; Beuchat L., 1998).

1 inocuo: inofensivo, no nocivo. (Moliner, 2001)

Dentro del mercado de productos hortofrutícolas frescos, se han desarrollado presentaciones de productos frescos precortados listos para su consumo, cuyas ventas se han incrementado exponencialmente desde que comenzaron a venderse bajo esa presentación. La demanda por su conveniencia hace que se manejen como productos con valor agregado y se prevé que este mercado seguirá en expansión en el futuro cercano. (USFDA, 2001). Aún así, y a pesar de tener un costo incrementado, este tipo de productos no tienen una inocuidad garantizada, y representan también vehículos potenciales de intoxicación. (USFDA 2001b). La presencia permanente en los mercados mundiales de productos de mala calidad y contaminados, así como el consiguiente aumento en el rechazo de dichos productos, se traduce en graves daños para el desarrollo económico de los países. La contaminación con bacterias patógenas afecta la inocuidad de frutas y hortalizas frescas, lo que constituye un problema para la salud humana, desencadenando brotes diarreicos e implicaciones clínicas de mayor importancia para quienes consumen estos productos, (Siller J., 2003; Bier J et al., 2001). Entre los factores que pueden contribuir a la presencia de microorganismos patógenos en productos hortofrutícolas, están:

• El riego con aguas contaminadas y la presencia de residuos fecales en los cultivos.

En estudios realizados respecto de la evaluación del riesgo para la salud por el uso de aguas residuales, en agricultura se demostró que la contaminación fecal proviene principalmente del agua utilizada para riego de los productos y además, que existe una relación directa entre el número de coliformes fecales y la presencia de Salmonella tanto en aguas residuales como en productos hortofrutícolas. (Altekruse S., et al, 1995) • Falta de una infraestructura sanitaria, de una higiene adecuada entre los

trabajadores y ausencia de buenas prácticas de manejo y cuidado de los alimentos.

Los productores en el campo, o plantas de empacado no siempre están controlados por grandes corporaciones que tienen los recursos para aplicar efectivamente procedimientos de desinfección de los productos agrícolas, como pueden ser los lavados químicos o tratamientos físicos. Existen grupos que aportan producción suficiente para abastecer las necesidades alimenticias de algunas poblaciones, que no tienen el mismo nivel de recursos y no llevan a cabo prácticas para controlar o retirar patógenos de esos productos. Es común, que en las centrales de abastecimiento hacia los consumidores finales, las condiciones sanitarias de recepción, almacenamiento, distribución y las deficiencias en la higiene de los trabajadores, son factores que influyen sobre el

riesgo de contaminación por patógenos humanos y que pueden afectar al consumidor final. (Seymour et al, 2002; Murano et al., 2002, USFDA, 2001).

Los principales patógenos que suelen encontrarse en frutas y vegetales frescos son: Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Shigella, Listeria monocytogenes, Salmonella spp,

E. coli O157O157:H7, Cryptosporidium parvum, virus de Hepatitis A, los cuales causan tan sólo en los Estados Unidos hasta doce millones de casos de infecciones, provocando pérdidas económicas anuales que oscilan entre 6.5 y 34.9 miles de millones de dólares. (Francis G., et al, 1999). De todos los organismos patógenos, Salmonella spp. es la bacteria más comúnmente reportada de enfermedades originadas por alimentos, originando cientos de casos de salmonelosis resultado del consumo de frutas y vegetales contaminados en Estados Unidos de Norteamérica, (Murano et al., 2002) y también en México. (Gutiérrez L., et al, 2000). La incidencia de enfermedades infecciosas como la salmonelosis, y los brotes diarreicos están aumentando en los países industrializados. Los estudios de la Organización Mundial de la Salud (OMS) indican que en esos países, entre l5 y 10 por ciento de la población se ve afectada anualmente por patologías asociadas al consumo productos hortofrutícolas crudos. (Siller J., 2003). Según la OMS (1998), la frecuencia de los casos de enfermedades causadas por alimentos contaminados podría ser entre 300 y 350 veces mayor de lo que los informes reportan. Esta mayor incidencia está vinculada directamente a los problemas sanitarios más importantes que amenazan a la población mundial y tiene un impacto comercial considerable, ya que la globalización y la intensificación de los intercambios de productos hortofrutícolas son responsables en cierta medida de la propagación de enfermedades y del aumento de brotes infecciosos. De los casi 1,500 millones de casos de diarrea que ocurren anualmente en el mundo, la OMS estima que el 70 por ciento son el resultado directo de la contaminación química o biológica que presentan algunos de los alimentos que se comercializan. (Siller J., 2003). Después de la cosecha y durante la distribución de los productos hortofrutícolas, se puede disminuir su carga bacteriana, más no eliminarla por completo, debido a la relación existente entre patógenos humanos y la flora nativa del vegetal; ya que se ha sugerido que el reducir/controlar las poblaciones de microorganismos nativos mediante el lavado, desinfección o almacenamiento en atmósferas controladas facilita las condiciones de crecimiento para los microorganismos patógenos en la superficie de los vegetales. La reducción de las poblaciones de superficie, reduce la competencia por espacio y nutrientes, dando así oportunidad de crecimiento a patógenos contaminantes. (Brackett 1992). Una proliferación de microorganismos establecidos después de la cosecha puede comprometer la integridad de la cáscara y alterar el pH del producto, facilitando así la supervivencia y crecimiento de patógenos humanos. (Conway W., et al, 2000) Además, existen productos como ciertas moras que no pueden someterse a procesos de lavado debido a su delicada textura y problemas asociados con proliferación de levaduras. (USFDA, 2001).

El problema de la contaminación de los productos hortofrutícolas, con microorganismo patógenos, no puede ser eliminado por completo en ninguna de las etapas desde la producción hasta su distribución al consumidor final, esto es porque aún cuando el método utilizado de desinfección en alguna etapa sea muy eficaz, no se puede garantizar que habrá una recontaminación en alguna etapa posterior de su manejo hasta el consumidor. Por lo tanto, la única acción confiable, es el lavado o desinfección realizados por el consumidor final. En respuesta a las preocupaciones actuales de salud pública respecto a la inocuidad microbiológica de productos agrícolas frescos enteros o en corte, los científicos han investigado la efectividad de numerosos métodos físicos, químicos y biológicos para reducir la carga microbiana de vegetales que puedan ser utilizados por el consumidor final y que no comprometan la calidad sensorial del producto. Existe una gran variedad de métodos usados para reducir o inactivar poblaciones de microorganismos en vegetales. Cada método tiene distintas ventajas y desventajas dependiendo del tipo de producto, protocolo de mitigación, y algunas otras variables. La eficacia del método utilizado para reducir las poblaciones microbianas, depende del tipo de tratamiento, tipo y fisiología de los organismos blanco, características de la superficie de los productos (grietas, hendiduras, tendencia hidrofóbica, textura), tiempo de exposición y concentración del limpiador o desinfectante, pH y temperatura. Debe aclararse que el nivel de concentración de los desinfectantes o el tiempo de aplicación de otros métodos útiles, puede estar limitado por el impacto sensorial inaceptable que producen en los productos hortofrutícolas. (USFDA, 2000). Actualmente las tecnologías de limpieza existentes no pueden garantizar la seguridad microbiológica de los productos hortofrutícola, sin comprometer su calidad. (Seymour, 2002). Es así que se requieren nuevos métodos para inactivar poblaciones bacterianas en productos frescos, que puedan ser utilizados por el consumidor final, independientemente del tipo de productos frescos que se adquiera. Es así que en la búsqueda de tecnologías alternativas a los métodos químicos existentes, surge la investigación de métodos físicos de desinfección como: radiación ultravioleta, ósmosis inversa, campo eléctrico, luz pulsada, campos magnéticos oscilantes, calentamiento-enfriamiento, radiación de iones y ultrasonido. (Taeymans 2000). Todos estos métodos están en el foco de investigaciones conducidas a reducir o eliminar microorganismos patógenos en alimentos y hay muy pocos trabajos publicados directamente relacionados al impacto de estas tecnologías en la seguridad de los productos vegetales. (Taeymans, 2000).

En el presente trabajo, en el intento de hacer aportaciones para encontrar un método que sea eficiente en la desinfección de productos hortofrutícolas y que pueda ser utilizado por el consumidor final, se han estudiado los efectos del ultrasonido con frecuencia de 1 MHz y potencia de 3.4 W sobre muestras de lechuga Lattuca sativa y fresa Fragaria vesca inoculadas con células de Salmonella spp y Escherichia coli.

2 OBJETIVOS. 2.1 OBJETIVO GENERAL. Comparar los niveles de inactivación de microorganismos patógenos entre tratamientos con bactericidas comerciales y el uso de ultrasonido de 1MHz como tecnología alternativa, aplicados a lechuga (Lactuca sativa) y fresa (Fragaria vesca). 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.

� Evaluar el efecto del tiempo de irradiación ultrasónica, sobre la inactivación

bacteriana. � Determinar cuantitativamente la capacidad desinfectante del ultrasonido bajo tres

diferentes tiempos de aplicación. � Comparar los resultados de inactivación microbiana obtenidos con la aplicación del

ultrasonido, contra los resultados obtenidos con dos bactericidas comerciales. � Determinar los cambios en dos parámetros fisicoquímicos del agua, (Temperatura y

pH) inducidos por los tres diferentes tipos de tratamientos de desinfección comparados.

• Establecer antecedentes de investigación con el ultrasonido de 1 MHz, como

tecnología alternativa para la desinfección de vegetales.

3 ANTECEDENTES. 3.1 ENFERMEDADES ASOCIADAS AL CONSUMO DE ALIMENTOS Las múltiples enfermedades que se pueden producir por el consumo de alimentos, constituyen uno de los principales problemas de salud pública en la mayoría de los países. La OMS, define las enfermedades asociadas al consumo de alimentos como "aquellas que, a la luz de los conocimientos actuales, pueden ser atribuidas a un alimento específico, a una sustancia que se le ha incorporado al alimento, o a la presencia de microorganismos en los mismos”.

3.1.1 TOXOINFECCIONES ALIMENTARIAS

Un trastorno ocasionado por ingestión de alimentos contaminados se conoce como infección alimentaria cuando la enfermedad que es causada en el humano, se debe única y exclusivamente a la presencia de microorganismos patógenos en los alimentos, como es el caso de la salmonelosis. Se utiliza el término intoxicación alimentaria, cuando se ocasiona en el humano una enfermedad asociada a la presencia de toxinas microbianas en los alimentos consumidos, como es el caso del botulismo. Al conjunto de estas enfermedades se le conoce como Toxoinfecciones alimentarias (TIA). Los microorganismos causantes de trastornos alimentarios son, mayoritariamente, de origen exógeno, es decir, proceden de contaminaciones ocurridas durante la obtención, distribución o el procesado de los alimentos. (USFDA, 1999). Cuando los microorganismos están presentes de forma intrínseca en el alimento, se dice que se trata de una contaminación endógena, si los microorganismos llegaron al alimento por agentes externos, se trata de contaminación exógena. (Madigan M. et al., 2004).

Entre las enfermedades causadas por la ingesta de alimentos y producidas por microorganismos, tienen especial relevancia por su incidencia, un grupo cuyas características más representativas son: un corto periodo de incubación, síndrome gastrointestinal (diarrea, vómitos, dolor abdominal, fiebre) y en algunos casos aparente recuperación en unos días. De estas, destacan la salmonelosis, colibacilosis, estafilococia y botulismo. (USFDA, 2003). En la mayoría de las TIA, para que se produzca enfermedad, los microorganismos deben encontrarse en concentraciones (ufc/g ó mL) altas, es decir, superar una dosis infectiva mínima (DI), aunque, en el caso de algunas bacterias, bastan unas pocas células para provocar la enfermedad, por lo que no debemos minimizar el riesgo que supone toda contaminación, debido a que algunas pueden verse agravadas particularmente en niños, ancianos y pacientes con otra enfermedad previamente adquirida. (Beuchat L., 1996). La agudeza de la enfermedad que puedan producir depende además de otros factores como: el agente causal, la dosis ingerida del microorganismo, la susceptibilidad del individuo hacia determinado microorganismo, y el vehículo de ingesta. (USFDA, 2003). 3.2 MICROORGANISMOS QUE CAUSAN TOXOINFECCIONES ALIMENTARIAS Una gran cantidad de microorganismos pueden provocar enfermedades relacionadas directamente con la ingesta de alimentos. De todos ellos, las bacterias ocupan el primer lugar tanto en diversidad como en frecuencia. Así, a diferencia de los virus, protozoos y helmintos, que encuentran en los alimentos las condiciones idóneas para su multiplicación, las bacterias y los mohos utilizan estos como substrato y medio de vida. (Beuchat L., 1996). Las bacterias que presentan mayor incidencia en las toxoinfecciones alimentarias en México así como en Estados Unidos, son Escherichia coli y Salmonella spp (Gutiérrez L et al, 2000; Murano et al., 2002; Blanco et al., 1993); razón por la cual en esta investigación, los experimentos se han enfocado al estudio de estas bacterias. 3.2.1 CARACTERÍSTICAS GENERALES DE Escherichia coli Y Salmonella spp. 3.2.1.1 Características de Escherichia coli

Escherichia coli es la cabeza de la familia Enterobacteriaceae, grupo numeroso de bacterias entéricas, anaerobias, gram negativas. Un determinado número de géneros dentro de la familia son patógenas2 para el humano, y otras son colonizadores normales del tracto gastrointestinal de animales y humanos. Sobreviven fácilmente entre 15 y 45 °C (mesófilas) y pH de 4.5 a 9, son termosensibles y su DI va de 106 a 1010 bacterias para establecer colonización en el intestino, una dosis mayor puede inducir diarrea en 24 horas. (USFDA, 1999).

2 patógeno(a): Capaz de provocar alguna enfermedad en el ser humano o en los animales. (Madigan M., 2004)

Sin embargo, algunas subespecies de E. coli se asocian con enfermedades como meningitis neonatal, infecciones urinarias y gastroenteritis, la cual es de especial interés en este estudio, debido a que está asociada al consumo de alimentos contaminados. (Valle M, 2001). Entre las especies patógenas de E. coli, existen cinco clases de ésta, que pueden causar gastroenteritis y son caracterizadas dentro de un grupo conocido como EEC (E. coli enterovirulentas). (Tabla 3.1).

Tabla # 3.1. Clases de E. coli patógenas, pertenecientes al grupo EEC y síntomas que causan. (Blanco J., et al, 1993).

Nombre Efectos provocados Enteroinvasivas (EIEC) Invaden y traspasan los intestinos, produciendo

diarrea severa.

Enterohemorrágicas (EHEC) A este grupo pertenece E. coli O157:H7 causante de

la diarrea sangrante, con alto índice de mortalidad a

nivel mundial.

Enterotoxigénica (ETEC) Produce una toxina que ataca la mucosa intestinal y

es la causa más común de la “diarrea del viajero”.

Entero patogénica (EPEC) Causa diarrea principalmente entre los recién

nacidos.

Enteroagregativa (EAggEC) Puede causar diarrea aguda y crónica por largos

períodos en niños.

La presencia regular de E. coli en el intestino y heces de animales, ha llevado a rastrear estas bacterias en el medio, como indicadores de contaminación fecal en agua y alimentos, esto es, donde hay E. coli presente puede haber contaminación fecal con parásitos intestinales de humanos. (Kenneth T., 2002).

Fig. 3.1 Fotografía de una colonia de Escherichia coli tomada con microscopio electrónico.

(Fuente: www.commtechlab.msu.edu)

3.2.1.2 Características de Salmonella spp. Las salmonellas son bacilos gramnegativos de la familia Enterobacteriaceae. Se conocen más de 2460 serotipos, muchos de ellos patógenos para el ser humano. Son bacterias invasoras, enterotoxigénicas y están ampliamente diseminadas en todo el mundo. Se encuentran principalmente en el intestino de personas y animales infectados. Su temperatura ideal de sobrevivencia va de 5 a 45 °C (mesófilas) y en un rango de pH de 4.5 a 9. Son termosensibles, y su DI va de: 101 - 105 ufg/g ó mL. (USFDA, 1999). Los microorganismos de este género se distribuyen en seis grupos (Tabla 3.2)

Tabla # 3.2. Clasificación en grupos de Salmonella spp. (Gutiérrez L, et al, 2000).

Grupo Clases Grupo A S. paratyphi Al

Grupo B S. typhimurium y S bredeney

Grupo C1 S. choleraesuis, S.montevideo y S. oranienburg

Grupo C2 S. newport

Grupo D S. typhi, S. enteritidis, S. dublin, S. fallinarum

Grupo E S. butanan S. anatum y S. give

La Salmonella serotipo typhi es la causante de la fiebre tifoidea, los demás serotipos considerados no tifoídicos, ocasionan el estado de portador asintomático, gastroenteritis, bacteriemia e infecciones focales como meningitis. En el año 2000, los serotipos aislados con mayor frecuencia en Estados Unidos fueron Salmonella typhimurium, S enteritidis y S

newport. (USFDA, 2001b). En México, los serotipos de Salmonella sp. identificados con mayor frecuencia en los servicios de salud fueron: S. typhimurium (20.4%) y S. enteritidis

(18.3%). (Gutiérrez L., et al., 2000).

Fig. 3.2 Imagen de Salmonella enteritidis.

(Fuente: www.nature.com)

3.2.2 ENFERMEDADES CAUSADAS POR Escherichia coli Y Salmonella spp. Al incrementarse el consumo de frutas y vegetales crudos, se ha incrementado el índice de enfermedades relacionadas con el consumo de productos hortofrutícolas frescos. El riesgo de contaminación ha aumentado no sólo la baja calidad sanitaria del agua utilizada para riego, si no que además, debido a que actualmente se ofrecen productos frescos todo el año, los consumidores está comprando productos importados de países que no utilizan ningún tipo de tratamiento para remover microorganismos patógenos. Los brotes de enfermedades causadas por alimentos, asociadas a productos frescos y reportadas en los Centros para el Control de Enfermedades (CDC) de Estados Unidos se han incrementado en los últimos años (CDC, 1999). Este incremento además de estar asociado con diversas fuentes de contaminación, también se relaciona directamente con el aumento significativo en el consumo per cápita de frutas y hortalizas que se que ha dado en Estados Unidos desde principios de los setentas y en México a partir de los años noventas. Tan sólo en Estados Unidos, el consumo per cápita de 1982 a 1997, pasó de 91.6 a 121 kg, un incremento del 32%.(Nguyen-the E., et al, 2000). Así mismo, el aumento en las importaciones y exportaciones de este tipo de productos a todo el mundo, facilita la diseminación de organismos patógenos y con esto la incidencia de brotes infecciosos. Por ejemplo para 1991, existían un promedio de 345 productos vegetales diferentes para escoger en un supermercado típico cuando en 1987 era de 173. (USFDA, 2001b). Hay una gran variación en el número de microorganismos en los vegetales provenientes de campos de cultivo. Todas las plantas poseen una microflora residente que subsiste normalmente en el agua de condensación de las mismas. Las poblaciones de microorganismos en vegetales, varían ampliamente y a menudo dependen del tipo de vegetal y de condiciones ambientales. En vegetales que están en contacto con el suelo los recuentos totales pueden ser tan altos como 107 ufc por gramo. (FDA, 1998). 3.2.2.1 Enfermedades causadas por E. coli La principal enfermedad producida por la bacteria Escherichia. coli, es la gastroenteritis, el síndrome clínico incluye diarrea acuosa, calambres abdominales, febrículas, náusea y malestar. La enfermedad puede ser aguda o crónica y se presenta entre el primer y octavo día del ingreso de la bacteria al organismo. Los niños menores de 5 años y los adultos mayores, son los grupos más vulnerables. Durante la fase de infección, se excretan gran cantidad de células enterotoxigénicas en las heces lo que hace más fácil su diseminación. (USFDA, 2003). Esta bacteria, al ser un habitante regular y normal del intestino se usa desde hace más de un siglo como el mejor indicador de contaminación de los alimentos con materia fecal; y puede indicar la presencia de bacterias perjudiciales o patógenas para el hombre que tienen hábitat en común, como por ejemplo la Salmonella.

El serotipo E. coli O157:H7 causa colitis hemorrágica la cual puede derivar en una falla aguda del riñón o en Síndrome Urémico Hemolítico (SUH) en el 5 % de los infectados. Del 3 al 5% de los infectados mueren. Los que consiguen recuperarse padecen fallas renales, complicaciones neurológicas y otras secuelas durante largos periodos de tiempo. (FAO, 2003). 3.2.2.2 Enfermedades causadas por Salmonella spp.

La bacteria Salmonella spp., es uno de los principales agentes etiológicos involucrados en intoxicaciones alimentarias a nivel mundial; puede causar infecciones sistémicas como Fiebre Tifoidea y Paratifoidea o Salmonelosis, enfermedades zoonóticas.3 La más común de ellas, es la salmonelosis, adquirida por la ingestión de alimentos o bebidas contaminadas, se manifiesta como una enterocolitis aguda, y se caracteriza por presentar síndromes febriles asociados a manifestaciones gastrointestinales o sistémicas, con frecuencia severas. El cuadro se localiza básicamente en el íleo terminal y en el intestino grueso. La enfermedad se manifiesta a través de diferentes fases. En la primera fase, la infección se limita a la mucosa intestinal, y en la siguiente, la bacteria invade el tejido linfático local. Este primer paso es seguido por una fase de bacterimia, durante la cual la mayoría de las bacterias son fagocitadas por macrófagos del hígado y del bazo. La ingestión de Salmonella por los macrófagos no elimina la infección, al contrario, inicia una fase de crecimiento bacteriano intracelular, el cual, después de varios días, provoca la liberación de gran cantidad de Salmonella al torrente sanguíneo. Las manifestaciones clínicas más frecuentes son vómitos, diarrea, dolores abdominales, fiebre elevada, y dolor a la palpación en el vientre. (Gutiérrez L., 2000). La salmonelosis es una enfermedad aguda de distribución mundial. Afecta a todos los grupos de edad, con mayor incidencia en los extremos de la vida, menores de 5 y mayores de 60 años. Esta bacteria causa infecciones en el ser humano en forma endémica o en brotes epidémicos de intoxicación alimentaria que abarcan, en ocasiones, amplias zonas geográficas debido a las extensas cadenas de distribución comercial de los alimentos existentes hoy en día. El periodo de incubación es de 6 a 48 hrs. En el caso de la fiebre tifoidea, el periodo de incubación es de 3 a 60 días. (USFDA, 1999). Se considera una infección de importancia en salud pública debido al impacto socioeconómico que ocasiona tanto en los países en desarrollo, así como en los países desarrollados. (Francis G., et al, 1999). Además si no se recibe tratamiento puede ser causante del síndrome de Reiter, el cual se manifiesta por dolor en las articulaciones, irritación en los ojos, dolor al orinar y puede durar meses o años, desencadenándose una artritis crónica. (CDC, 1999)

3 zoonótica: Transmisible de los animales al ser humano.(Moliner M., 2001)

Desde la década de los ochentas, la incidencia de salmonelosis de origen alimentario ha aumentado considerablemente en México. Este incremento es resultado de una combinación de factores como la calidad del agua utilizada para riego, el manejo, almacenamiento, distribución y preparación de los alimentos principalmente. (Gutiérrez L et al., 2000). 3.3 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA CONTAMINACIÓN DE LOS PRODUCTOS HORTOFRUTÍCOLAS. Los factores que influyen en la contaminación de los productos hortofrutícolas con bacterias patógenas se detallan en la tabla # 3.3.

Tabla #3.3 Fuentes de microorganismos patógenos en productos hortofrutícolas frescos y condiciones que influyen en su sobrevivencia y crecimiento.

(Murano et al, 2002; USFDA, 2001).

Antes de la Cosecha: Características de la tierra

Calidad del Agua de Irrigación

Uso de residuos orgánicos sin procesar en composta adecuada

Aire (polvo)

Animales salvajes o domésticos en el área

Manipulación humana

Calidad del agua utilizada para otro uso diferente al riego

(por ejemplo, pesticidas, tratamientos foliares, crecimiento hormonal)

Después de la cosecha Manipulación humana (trabajadores y consumidores)

Equipo de cosecha

Contenedores de transporte

Animales domésticos en el área

Aire (polvo)

Calidad del agua de lavado

Procesos de separación, empacado, corte y otros

Higiene de los vehículos de transporte

Almacenamiento inadecuado (temperatura, ambiente físico)

Embalaje inadecuado (incluye las nuevas tecnologías de embalaje)

Contaminación cruzada (por otros alimentos, utensilios o

áreas de preparación contaminadas)

Manejo inadecuado después de su compra

3.4 TECNOLOGÍAS DE DESINFECCIÓN4 DE PRODUCTOS HORTOFRUTÍCOLAS

Es importante destacar, que el presente trabajo está dirigido a estudiar los tratamientos de desinfección que pueden ser aplicados por el consumidor final. Esto es básicamente porque está demostrado que aunque los tratamientos de desinfección aplicados en las plantas de empacado o centros de distribución sean los adecuados, no hay forma de garantizar que los productos no se contaminen durante el almacenamiento, venta y distribución hasta el consumidor final. Debido a lo anterior, que se busca ofrecer otras alternativas de desinfección que sean seguras y prácticas para el consumidor. En el presente, los consumidores están buscando incluir en su dieta mayor cantidad de frutas y hortalizas crudas, debido a sus expectativas de comer de forma más nutritiva y baja en calorías. Incluso recientemente vemos como la forma de venta de estos productos está cambiando, ahora se ofrecen pelados, precortados, y en algunos casos pre-lavados y desinfectados. Aún así, la mayoría tienen que ser lavados y desinfectados antes de su consumo. Con el fin de facilitar el proceso de una manera eficaz, se han desarrollado nuevas tecnologías cuyos propósitos son: 1) Satisfacer los nuevos atributos de calidad demandados por los consumidores y 2) Asegurar la inocuidad5 microbiológica de los productos. En la búsqueda de ofrecer al consumidor, productos seguros en lo que a la presencia de microorganismos patógenos se refiere, se han desarrollado y se utilizan actualmente, gran variedad de técnicas físicas y químicas que buscan disminuir la carga bacteriana de los productos a niveles aceptables ó desinfectarlos completamente. Cuando se busca desarrollar un protocolo para la desinfección de hortalizas, quizás el factor más crítico es determinar la dosis que debe ser usada. Una dosis baja podría no ser efectiva, mientras que una muy alta podría reducir considerablemente el número de microorganismos pero podría producir decoloración y acelerar la descomposición del producto.

4 Desinfección: Conjunto de operaciones destinadas a eliminar o reducir sustancialmente el número de microorganismos de significancia en salud pública, así como otros microorganismos indeseables. (Bracket R., 1992)

5 inocuo: que no causa daño.( Moliner M., 2000) que no afecta la seguridad para el consumidor (Bracket R., 1992)

3.4.1 TECNOLOGÍAS TRADICIONALES DE DESINFECCIÓN DE PRODUCTOS HORTOFRUTÍCOLAS.

3.4.1.1 Tratamientos Térmicos Los tratamientos térmicos eliminan microorganismos vegetativos y algunas esporas, su efectividad depende de la temperatura y el tiempo de tratamiento. Desafortunadamente, la magnitud del tratamiento, es proporcional a la pérdida de nutrientes, al desarrollo de sabores indeseables y al deterioro de propiedades funcionales de los productos. (Piyasena P., 2003). Con este tipo de tratamientos se pierde la posibilidad de consumir los productos frescos y aprovechar todas sus propiedades nutricionales. 3.4.1.2 Tratamientos Químicos Los agentes químicos utilizados para desinfectar los productos vegetales frescos, abarcan desde la aplicación de ácidos orgánicos hasta el tratamiento con agentes derivados del cloro, el yodo ó la plata. (Barach J., 2004). Tienen la desventaja de tener efectos secundarios asociados, como el desarrollo de sabores o colores indeseables, pérdida de las propiedades organolépticas, en algunos casos la formación de compuestos químicos tóxicos para el organismo, o estar limitados a determinadas cantidades debido a que su uso continuo es riesgoso para la salud. Además, la mayoría no puede utilizarse en productos delicados como las frutillas y las moras, debido al daño que ocasionarían en su textura y apariencia. Existen estudios que reportan la supervivencia de ciertos microorganismos y esporas a los tratamientos con desinfectantes químicos aplicados, lo que ha sugerido que los medios químicos no son 100% seguros. (Scherba et al., 1991). A continuación se detallan las ventajas y desventajas de los más utilizados comercialmente. (Tabla 3.4). Para este proyecto de investigación se tomaron dos de los desinfectantes comerciales más comúnmente utilizados por el consumidor en México, para analizarlos a detalle y comparar su efectividad con la del ultrasonido. (Tabla # 3.4ª)

Tabla # 3.4 Agentes químicos utilizados por el consumidor final para disminuir la carga microbiana en productos hortofrutícolas frescos.

Agente

Químico

Ventajas Limitaciones Comentarios

sobre su uso

Resultados de

investigaciones

Hipoclorito Largo historial de

uso.

Fácil de obtener.

Económico.

Forma cloraminas6

Corrosivo

Sensible a la

temperatura, luz,

aire, metales y

materiales

orgánicos

Usado en el rango

de 50 a 200 ppm7

con un tiempo de

contacto de hasta

20 min. Útil en

agua y alimentos.

Debe enjuagarse

con agua limpia.

Concentraciones muy

altas no eliminan

patógenos de los

productos. En

concentraciones comunes

producen una reducción

máxima de 2 log8.

Ácidos

Orgánicos

(Ácidos

láctico, acético

y cítrico)

Económicos

dependiendo del

tipo de ácido y uso.

Útiles sólo en

rangos de pH

bajos. Su

efectividad

depende del tipo de

ácido y cepa del

microorganismo.

Cambios de

calidad en términos

de pérdida de

firmeza y sabor.

Se utiliza

principalmente

para acidificar el

medio y preservar

los productos por

más tiempo

Jugo de limón, y

vinagre pueden

ser útiles para uso

doméstico.

Efectivos para controlar

las poblaciones nativas y

patógenas como

Salmonella, Listeria o

Yersinia en grandes

cantidades de productos.

El ácido acético en

concentraciones arriba de

200 ppm es muy efectivo.

Ozono Efectivo a bajas

concentraciones, y

requiere cortos

periodos de

contacto.

Amplio espectro.

Buena capacidad de

penetración.

Se descompone en

productos no

tóxicos.

Puede dañar

textura, apariencia,

sabor y color del

producto.

Corrosivo.

Inestable y muy

reactivo.

Posibles efectos

tóxicos para

humanos durante el

tratamiento.

Se usa más para el

tratamiento de

agua.

Efectivo contra gran

variedad de patógenos

reportados en frutas y

vegetales.

Tiene una reducción log

para Salmonella y E. coli

de 3 a 4 log.

Se requiere más

investigación sobre sus

efectos secundarios.

6 Cloraminas: Subproducto adverso formado por el cloro en presencia de materia orgánica. Cancerígenas. 7 ppm: partes por millón. 8 log: índice logarítmico. En alimentos para que una desinfección sea confiable debe ser por arriba de un índice de 4 log de reducción de población microbiana.

Tabla # 3.4a Agentes químicos más utilizados por el consumidor final para disminuir la carga microbiana en productos hortofrutícolas frescos que se analizarán a detalle en este proyecto de

investigación. Agente

Químico

Ventajas Limitaciones Comentarios

sobre su uso

Resultados de

investigaciones

Dióxido de

Cloro

Menor reactividad,

menor formación de

subproductos y

mejor actividad

desinfectante a pH

neutro que el

hipoclorito

Poca Estabilidad.

No se permite su

uso en productos

en corte.

Hasta 5 ppm se

permite en frutas y

vegetales enteros

y 1 ppm máximo

en papas peladas.

Poco efectivo en la

destrucción de Listeria

monocytogenes, E. coli,

Salmonella y

Criptosporidium

reportándose reducciones

Log muy bajas. (1-2.5)

Plata Coloidal Útil contra todas las

especies de hongos,

bacterias,

protozoarios,

parásitos y ciertos

virus.

Su consumo en

grandes cantidades

durante largos

períodos de tiempo

puede llegar a

destruir la flora

bacteriana en el

intestino.

El pH de la plata

coloidal debe de

ser de 6.5 y el

rango de

seguridad de su

concentración

debe de ser de 3 a

5 ppm.

Se ha detectado que un

consumo muy prolongado

puede causar con el

tiempo una deficiencia de

selenio en el organismo

inducida por la plata.

3.4.1.2.1 Dióxido de Cloro El dióxido de cloro ( ClO2 ) es una forma de cloro a la que se le han encontrado nuevas aplicaciones como agente desinfectante ya que tiene la ventaja de no formar trihalometanos. Actualmente ya se comercializan diversos desinfectantes a base de ClO2 par ser utilizados por el consumidor final. La ionización de la molécula de ClO2 y formación de ión Cl- (vía HCl) en presencia de agua, se acelera en presencia de bacterias o compuestos orgánicos que contienen compuestos parecidos a los azúcares, lo que facilita el proceso de desinfección. Es efectivo en soluciones con altos valores de pH, pero es más efectivo en soluciones con un rango de valores de pH bajos. La concentración máxima permitida de ClO2 es de 2 ppm para frutas y vegetales con cáscara y solo 1ppm para productos sin cáscara o en corte. Después del tratamiento deben enjuagarse de forma abundante o sumergirse en agua hirviendo para eliminar los residuos de cloro, que pueden ser tóxicos para el organismo. La susceptibilidad al tratamiento depende de la cepa microbiana presente en el producto y las condiciones ambientales. La desinfección a base de cloro es un método que ha sido ampliamente usado en la descontaminación de agua y vegetales, sin embargo se han encontrado microorganismos resistentes al cloro tales como Aeromonas y Cryptosporidium.

Tiene además la desventaja de que en presencia de materia orgánica, hay formación de cloraminas las cuales causan sabores y olores indeseables (el olor de las albercas se atribuye a las cloraminas), y las que se ha demostrado son cancerígenas. Así, su capacidad de desinfección se ve limitada. Ejemplos de microbicidas a base de ClO2 que se comercializan en México son: Microbicida CM (Comercial Mexicana); Microbicida Great Value. Otros productos a base de cloro, como las soluciones de hipoclorito no se recomiendan para ser utilizadas en frutas y vegetales frescos pues son muy corrosivas, son estables sólo en rangos de valores de pH por arriba de 8, y tienen un alto índice de formación de cloraminas. (NACMF, 1999). 3.4.1.2.2 Plata Coloidal La plata fue usada como un germicida efectivo desde el año de 1900 Se ha comprobado que la plata coloidal es útil contra todas las especies de hongos, bacterias, protozoarios, parásitos y ciertos virus. Consiste en plata pura metálica en estado coloidal, esto es partículas ultra finas dentro del rango de 0.005 a 0.015 micrones de diámetro suspendidas en un medio acuoso. En un verdadero coloide, estas partículas no pueden verse a simple vista y permanecen suspendidas ya que están eléctricamente cargadas. El tamaño de las partículas determina la calidad germicida de la plata. La presencia de plata coloidal cerca de un virus, hongo, bacteria o cualquier otro microorganismo, incapacita a su enzima metabolizadora de oxígeno, en aproximadamente 5 minutos, el microorganismo se sofoca, muere y luego es eliminado del cuerpo por los sistemas inmunológico y linfático. La plata coloidal no daña enzimas celulares o tisulares, ya que son radicalmente diferentes de las enzimas de microbianas. Presenta la desventaja de que pueden sobrecargarse los sistemas corporales de eliminación, y almacenarse de forma excesiva en nuestro cuerpo. Su consumo en grandes cantidades durante largos períodos de tiempo puede llegar a destruir la flora bacteriana en el intestino. Bajo ciertas circunstancias, una persona puede se más susceptible a intoxicación con plata, por ejemplo si se tienen bajos niveles de vitamina E y/o Selenio. El selenio se enlaza a los metales pesados como la plata y se elimina junto con ellos. También en individuos cuyo metabolismo es lento o están ingiriendo medicamentos que disminuyen el metabolismo basal, quienes pueden sufrir argiria9.

9 Argiria: Intoxicación con Plata.

3.4.2 TECNOLOGÍAS ALTERNATIVAS DE DESINFECCIÓN DE PRODUCTOS HORTOFRUTÍCOLAS. Más allá de los métodos físicos y químicos tradicionales de desinfección, se está trabajando en la investigación y desarrollo de nuevas tecnologías con alta eficacia desinfectante y que presenten mínimo o nulo efecto sobre las propiedades sensoriales de los productos, además de ser seguros para el consumidor. Las tecnologías alternativas para inactivar microorganismos buscan en general eliminar el uso de elevadas temperaturas o agentes químicos y evitar así los efectos adversos producidos por estos, en las propiedades organolépticas y en valor nutricional de los alimentos. (Barbosa-Canovas, 2002) Estas tecnologías no son conceptos que se han desarrollado recientemente, como lo demuestran los estudios realizados por Hite en 1899 o Jacobs y Thornley en 1954; pero la adaptación para utilizarlas como tratamientos de desinfección de alimentos ha recibido gran atención últimamente, en respuesta a las demandas del consumidor de productos alimenticios más frescos y naturales (Ross et al, 2003). A continuación se detallan algunas de estas tecnologías que están bajo investigación para su aplicación en alimentos. 3.4.2.1 Luz blanca pulsante de alta intensidad. La luz blanca pulsante es un método de inactivación bacteriana que involucra el uso de pulsos intensos y cortos de luz blanca de amplio espectro. El espectro del tratamiento abarca hasta longitudes de onda en el rango del UV cerca de la región infrarroja. El material tratado es expuesto a por lo menos 1 pulso (1 a 20 flashes por segundo (s)) que tiene una densidad de energía en el rango de 0.01 a 50 J/cm2 en la superficie, en un rango de duración de 1µs a 0.1 s En la mayoría de los casos, se requiere aplicar un número bajo de flashes en una fracción de segundo para lograr altos niveles de inactivación microbiana. Niveles más altos de energía pueden llegar a inactivar esporas. El mecanismo de inactivación es fotoquímico a través de un calentamiento rápido en la superficie, sin cocinado real del producto. Es deficiente en la penetración de superficies opacas e irregulares. (USFDA, 2000). 3.4.2.2 Campo eléctrico pulsado. El tratamiento de campo eléctrico pulsado de alta intensidad (CEP), se realiza con la aplicación de pulsos de alto voltaje (20 a 80 kV/cm) a alimentos colocados entre dos electrodos por lapsos menores de 1 segundo. Sin embargo, los pulsos con intensidad de campo de 10 a 20 kV/cm son capaces de romper membranas celulares de microorganismos, creando una distribución no uniforme de la carga eléctrica a lo largo de la membrana celular, lo que lleva a la inactivación microbiana en los alimentos. Esta tecnología se considera superior a los tratamientos tradicionales debido a que los cambios en las propiedades sensoriales o físicas de los alimentos son mínimos o nulos. Algunos estudios sugieren que el CEP preserva las propiedades nutricionales, sin embargo, aún siguen bajo estudio sus efectos

sobre las características químicas y nutricionales de los alimentos. (Barbosa-Canovas G., 2002; USFDA, 2000). 3.4.2.3 Radiofrecuencia. La radiofrecuencia se refiere al uso de ondas electromagnéticas con frecuencias de 13.56, 27.12 y 40.68 MHz, para generar calor en un material. Las frecuencias Usadas en Estados Unidos con fines de calentamiento son: 13.56 MHz ± 6.68 kHz; 27.12 MHz ± 160.00 kHz; 40.68 MHz ± 20.00 kHz. El alimento se coloca en un campo eléctrico que consiste en pulsos de ondas de alta frecuencia. Esto genera calor mediante una rápida inversión de la polaridad de las moléculas, logrando que el proceso sea muy similar a una pasteurización. Tiene especial aplicación en la destrucción de patógenos en jugos de frutas frescas. (USFDA, 2000). 3.4.2.4 Atmósferas Modificadas. Esta técnica involucra ya sea modificar o controlar activa o pasivamente la atmósfera que rodea al producto dentro de un empaque elaborado de varios tipos y/o combinaciones de películas. Una atmósfera modificada puede definirse como una creada alterando la composición normal del aire, para proveer de una atmósfera óptima para incrementar la vida de anaquel y calidad del producto. El almacenamiento en atmósferas controladas es una tecnología ampliamente utilizada para productos hortofrutícolas frescos. En Norte América una de sus primeras aplicaciones para productos frescos en corte fue utilizada por McDonalds para distribuir la lechuga en empaques predeterminados La utilización de gases inertes, reactivos o vacío le permite tener aplicaciones diversas en el control de microorganismos así como mantener el color y la frescura del producto. (Barach J et al., 2004; Berrang M. et al., 1989). 3.4.2.5 Luz Ultravioleta. El tratamiento con luz ultravioleta involucra el uso de radiación de la región ultravioleta del espectro electromagnético para propósitos de desinfección. La longitud de onda para de la región ultravioleta va en el rango de 100 a 400nm. La región ultravioleta se divide en: UVA (315-400nm) responsable de los cambio de coloración de la piel humana. UVB (280-315nm) puede causar quemaduras en la piel y eventualmente causa cáncer de piel. UVC (200-280nm) llamado el rango germicida debido a su efectividad para inactivar bacterias y virus.

UV de vacío (100-200nm) puede ser absorbido por casi todas las sustancias y puede ser sólo transmitida en el vacío. Las propiedades germicidas de la radiación UV se deben principalmente, a que puede inducir mutaciones en las moléculas de ADN. Para lograr la inactivación microbiana la radiación de luz UV debe ser de al menos 400 J/m2 en toda la superficie del producto. Tiene como desventajas: su pobre profundidad de penetración10, por lo que en la mayoría de los casos en la industria alimentaria su uso se limita a la desinfección de áreas de trabajo; y el hecho de que cataliza cambios oxidativos que resultan en rancidez y decoloración de los productos. (USFDA, 2000; Munkacsi F., et al., 1976). En general cualquiera que sea la tecnología de desinfección utilizada, se sabe que su eficacia varía en diferentes frutas y vegetales, dependiendo de sus características de superficie, temperatura y tipo de patógeno que se desee eliminar.

10 Profundidad de Penetración: La distancia que las ondas electromagnéticas de una cierta frecuencia viajan en un material antes de perder el 63% de su energía. (US-FDA, 2000)

3.5 Ultrasonido. 3.5.1 DEFINICIÓN. Ultrasonido es el término usado para describir una onda de vibración de una frecuencia superior a la frecuencia límite superior del oído humano (ondas ultrasónicas), incluyen todas las frecuencias por arriba de los 20 KHz. (Butz et al., 2002, Hughes et al., 1962). 3.5.2 PRINCIPIOS FÍSICOS BÁSICOS. Es necesario entender lo que es el sonido antes de intentar comprender que es el ultrasonido. Sonido es nuestra experiencia de la propagación de una onda de presión a través de un medio físico elástico, que usualmente es aire, pero también puede ser un líquido. Las ondas de presión son generadas por algún tipo de perturbación mecánica. Así, el sonido es transferencia de energía; la energía mecánica es convertida en una onda que irradia energía lejos de la perturbación mecánica. Las vibraciones mecánicas se convierten en ondas de presión vibrantes, transfiriendo energía al medio y a los objetos que contacta la onda. (USFDA, 2000; Dunn F., 1976). Sin embargo, el oído humano es limitado. El oído humano no puede escuchar arriba de 20,000 vibraciones por segundo o 20 kHz. La frecuencia de vibración del ultrasonido es muy rápida, es decir muy alta, nosotros no podemos oírla. Aunque existen mamíferos que sí pueden hacerlo como los murciélagos y las ballenas que utilizan la eco-localización y escuchan frecuencias incluso por arriba de los 100kHz. Esto es el ultrasonido, vibraciones demasiado rápidas para que podamos escucharlas. (Coupland J., 2004). A mayor frecuencia se tiene una menor longitud de onda, lo que les permite reflejarse de los objetos de mejor manera y dar más información acerca de esos objetos. Frecuencias extremadamente altas son difíciles de generar y medir. En los trabajos científicos sólo han logrado transmitir hasta 10 GHz de frecuencia. (Coupland J., 2004). Generalmente las frecuencias altas son utilizadas para imágenes médicas tales como la observación del feto en el vientre materno. Las frecuencias de 1 MHz y menores, tienen mayor longitud de onda y mayor amplitud para una energía dada, por lo que producen mayor desorganización (destrucción) del medio; esta mayor desorganización lleva a incrementar el movimiento y en un líquido conduce al fenómeno de cavitación que se explicará con mayor detalle posteriormente. (Scanlon M., 2004; Hughes D., 1962). 3.5.3 MECANISMO DE INACTIVACIÓN MICROBIANA. La investigación del ultrasonido como un método potencial de inactivación microbiana comenzó a principio de los años sesentas, después de que se descubrió que el sonar usado en los submarinos mataba los peces. (Earnshaw et al., 1995). El mecanismo de inactivación microbiana se debe principalmente al adelgazamiento de la membrana celular, calor localizado y producción de radicales libres como OH, HO2 y O. (Butz et al., 2002; Fellows,

2000; Furuta et al., 2003). La inactivación microbiana con ultrasonido fue reportada por primera vez, por Sala et al en 1995 (Álvarez, 2003). A través de los años se ha avanzado considerablemente en vislumbrar cuales son los mecanismos responsables de la interacción del ultrasonido con las biomoléculas en medios acuosos. Los efectos producidos por el ultrasonido contribuyen al rompimiento físicos de las estructuras microbianas así como a la descomposición de químicos tóxicos (Furuta et al, 2003) Sonicar es el proceso de generar un campo ultrasónico en un medio líquido, con lo que se crean ondas longitudinales, y por tanto, regiones alternadas de compresión y expansión. Las ondas ultrasónicas inducen la formación de burbujas, las cuales al estar sometidas a regiones alternadas de compresión y expansión, crecen, se contraen y eventualmente implotan. Con la implosión, se producen inmensas cantidades de calor y presión durante lapsos muy cortos de tiempo. A este fenómeno se le conoce como cavitación.

Fig. 3.3 Fenómeno de cavitación inducido por ondas ultrasónicas asociadas a la expansión e

implosión de burbujas.

Los cambios de presión resultantes de las implosiones ocurridas durante la cavitación, son la principal causa del efecto bactericida del ultrasonido, que resulta en lisis celular. (Sala et al., 1995). Se propone que shocks micromecánicos son creados al formarse y romperse burbujas microscópicas inducidas por presiones fluctuantes bajo el proceso de ultrasonido. Estos shocks rompen los componentes estructurales y funcionales hasta el punto de lisis celular.

Se sabe que el ultrasonido interactúa con varios agentes físicos y químicos de manera sinérgica, aunque los mecanismos de esta sinergia, aún no están claramente definidos. (Petin V., et al, 1999). La aplicación de ondas ultrasónicas que generan cavitación en suspensiones que contienen microorganismos y enzimas frecuentemente logra resultados letales. Muchos autores reportan que este fenómeno es responsable de la dispersión de colonias de microorganismos, de la modificación de su actividad celular, rompimiento de la pared celular y una incrementada sensibilidad al calor. (DeGennaro L et al 1999). 3.5.3.1 Fenómeno de Cavitación. La cavitación se refiere a actividad ultrasónica inducida que ocurre en un líquido o material sólido de consistencia casi líquida que consiste en la formación de cavidades o burbujas, que contienen gas o vapor. (Scherba et al, 1991). Estas burbujas tienen una mayor área de superficie durante el ciclo de expansión, lo cual incrementa la difusión del gas, causando que la burbuja se expanda. Se alcanza un punto en el cual la energía ultrasónica no es suficiente para retener la fase de vapor en la burbuja ocurriendo una rápida condensación. Las moléculas condensadas implotan violentamente, creando ondas de choque. Estas ondas de choque provocan regiones de muy alta presión y temperatura alcanzado hasta los 50,000 KPa y los 5500 ºC. (Piyasena P., 2003). La cavitación puede afectar un sistema biológico en virtud de un incremento localizado de stress mecánico, temperatura, y/o producción de radicales libres (como OH- y O-), todo esto iniciado mediante un mecanismo no-térmico. (Esche R. 1962; Scherba et al, 1991). Para lograr el efecto de cavitación, la frecuencia de ultrasonido utilizada, deber estar por debajo de los 2.5MHz, ya que no ocurre cavitación por encima de ese nivel. (Alliger, 1975).

Fig. 3.4. Fenómeno de Cavitación inducido en un líquido.

Fuente: www.sonolintec.com

La cavitación puede entenderse en términos de dos categorías generales: cavitación transiente y cavitación estable. La cavitación transiente connota una actividad relativamente violenta en el cual ocurren rápidos incrementos de presión y temperatura en pequeños puntos del medio durante lapsos muy cortos de tiempo (del orden de microsegundos) causados por estallidos (colapso de

burbujas) en regiones altamente localizadas dentro del medio sonicado. El colapso de tales cavidades causa ondas de choque hidrodinámicas intensas, estableciéndose pulsos de presión intensos, los cuales pueden desbaratar el material en la vecindad de la cavidad, siendo destructivos para los microorganismos. (Scherba et al., 1991). Estos estallidos pueden estar acompañados por la generación de especies químicas altamente reactivas. En contraste, la cavitación estable es una forma mucho menos violenta, y se asocia con cuerpos gaseosos vibrantes. La naturaleza de esta forma de cavitación consiste en un cuerpo gaseoso que permanece espacialmente estabilizado dentro de- pero no necesariamente debido a- el campo ultrasónico, y debido a este campo de ultrasonido, oscila o pulsa. Cuando tales oscilaciones volumétricas se vuelven estables, el medio líquido inmediato adyacente a la burbuja de gas fluye o corre (micro-flujo). Se ha demostrado que este microflujo produce stress suficiente para destruir membranas celulares. (Scherba et al., 1991; Alliger H., 1975). Se piensa que ambas propiedades biofísicas de la cavitación son el principal mecanismo que influye en la actividad bactericida del ultrasonido. (Williams A., 1983; Dunn F. et al, 1976). 3.5.4 OTRAS APLICACIONES DE LA TECNOLOGÍA ULTRASÓNICA. La tecnología ultrasónica tiene un amplio rango de aplicaciones actuales y a futuro en la industria de alimentos. Desde la clasificación de la carne hasta la esterilización, y en años recientes se ha incursionado en la caracterización ultrasónica de alimentos y bebidas en la que por medio del ultrasonido se obtiene información sobre las propiedades fisicoquímicas de los alimentos. (Pakrash M., et al, 2003; McClements D., 1997; McClements D., 1995). Se han llevado a cabo estudios de investigación con radiación ultrasónica, para realizar evaluaciones no destructivas de la calidad interna y defectos latentes de frutas y vegetales enteros. (Mason T., 1996). Algunos otros están dirigidos a monitorear los procesos de producción de alimentos debido a su acelerada difusión. (Pakrash M., et al, 2003). Otras aplicaciones incluyen análisis de la textura, viscosidad y concentración para muchos alimentos sólidos y líquidos, determinación de la composición de huevos, carnes, frutas, vegetales y lácteos entre otros. También puede mejorar procesos tales como la limpieza de superficies, decantado, secado y filtración, inactivación de microorganismos y enzimas, ruptura celular, de-gasificación de líquidos, transferencia de calor y procesos de extracción. (Señorans F., 2003; Zenker M. et al., 2003). Generalmente los equipos de ultrasonido de aplicación en alimentos, usan frecuencias de entre 20 kHz y 10 MHz. (Piyasena P., 2003). 3.5.5. FACTORES CRÍTICOS EN LA APLICACIÓN DE LA TECNOLOGÍA ULTRASÓNICA. Se asumen como factores críticos del proceso aquellos que son determinantes para un tratamiento exitoso. Estos son: la amplitud de las ondas ultrasónicas, la potencia, el tiempo de exposición/contacto con los microorganismos y/o el vegetal, el tipo de microorganismo, el

volumen, las características de superficie, y la composición del producto a ser procesado el pH y la temperatura del tratamiento. La temperatura del agua utilizada para el tratamiento es muy importante, ya que esta de be ser mayor a la temperatura del producto hortofrutícola bajo tratamiento, ya que con esto se minimiza la introducción de los microorganismos al tejido. (CDC, 1999) Cuando el ultrasonido se usa en combinación con otros procesos, entonces los factores de proceso críticos de esos métodos deben tomarse en cuenta, para evaluar la posiblidad de que interfieran con el tratamiento ultrasónico. (DeGennaro, 1999). 3.5.6 EXPECTATIVAS DE LAS TECNOLOGÍAS ALTERNATIVAS. La eficacia de inactivación microbiana varía en cada una de las técnicas descritas. Algunas de ellas requieren tratamientos de alta intensidad, lo que puede ocasionar efectos adversos en las propiedades funcionales o sensoriales de los productos hortofrutícolas. (Sala et al 1995) Algunas otras fueron diseñadas para su aplicación durante la manufactura de alimentos a gran escala, por lo que demandan demasiada energía o tienen altos costos para ser utilizadas de manera práctica en menor escala. (Raso et al 2003; Señorans F., 2003). Aún cuando estas tecnologías alternativas están bajo investigación, existen muy pocas publicaciones relacionadas directamente con el impacto de estas en la desinfección de productos hortofrutícolas frescos enteros o en corte. (USFDA, 2000). Entre las técnicas más prometedoras en el área de desinfección de alimentos están el Campo Eléctrico Pulsado y la Radiación Ultrasónica. (Ross et al 2003). En este proyecto de investigación se realizaron pruebas para determinar la eficacia de la inactivación microbiana de la Radiación Ultrasónica con el fin de establecer antecedentes en protocolos de desinfección aplicables a vegetales. Se escogió esta técnica debido a que no utiliza calor y al requerir menor cantidad de energía y no utilizar agentes químicos, es un proceso sustentable. 3.5.7 EFECTO SINÉRGICO DEL ULTRASONIDO EN COMBINACIÓN CON

OTROS TRATAMIENTOS. El ultrasonido puede ser usado en combinación con otros procesos de preservación básicamente para resaltar la inactivación microbiana en alimentos. Tales aplicaciones requieren de mayor exploración; por ejemplo estudios de validación, o análisis de los efectos sinergísticos. (Scouten A., 2002). Combinado con el calor, éste puede acelerar el índice de esterilización de los alimentos. Las ventajas del ultrasonido sobre la pasteurización o esterilización incluyen: la minimización de pérdida de sabor, especialmente en jugos de frutas; mayor homogeneidad, y significativos ahorros de energía. La combinación de ultrasonido y calor a temperaturas moderadas puede optimizar la inactivación microbiana. Esto puede ser particularmente útil para pasteurización de ciertas bebidas donde son deseables temperaturas reducidas. El ultrasonido tiene aplicaciones potenciales en emulsiones, especialmente cuando las cualidades reológicas pueden ser mejoradas con tratamientos a base de ultrasonido. (Zenker M., 2003).

4. MATERIALES Y METODOS. 4.1 BACTERIAS Y CONDICIONES DE CRECIMIENTO. Las bacterias utilizadas fueron: Escherichia coli (Cepa obtenida de cultivo liofilizado, E. coli AT922 de QUANTI-CULTPLUS(TM)) y Salmonella spp. (aislada en el laboratorio de Tratamiento de Aguas del ITESM CEM, a partir de excremento de tortuga). La cepa de Escherichia coli fue rehidratada según especificaciones del liofilizado y almacenada en de agua-glicerol en proporción 1:1. Se tomó con asa estéril un inóculo de la cepa y se colocó en un tubo de ensaye con 10 mL de Caldo BRILA de Bioxón, el cual fue incubado a 36.5 ± 1 ºC por 48 horas. De este cultivo inicial se realizaron tres resiembras posteriores, para lograr un crecimiento estable de la bacteria. Posteriormente se tomó 1 ml de diferentes tubos de ensaye conteniendo el cultivo y se sembraron en diferentes cajas petri con 10 mL de Agar Bilis Verde Brillante las cuales fueron incubadas a a 36 ± 1 ºC por 24 horas, y almacenadas a 4 ±1 ºC hasta su utilización en los experimentos.

Fig. 4.1. Siembra de Escherichia coli. (original en colores)

El Agar Bilis Verde Brillante (ABVB) utilizado fue de Bioxón, código 214500; éste es un medio de enriquecimiento selectivo de E. coli. Las colonias típicas de E. coli, son verdes con brillo metálico a la luz reflejada. La cepa de Escherichia coli utilizada en esta investigación fue adquirida de Eleco S.A. Remer S.R.L. Oxoid Products con el código C 7050-L. Este código es equivalente a la cepa de E. coli ATCC- 25922, la cual es comúnmente utilizada en varios estudios con alimentos como microorganismo subrogado a E coli O157:H7 la cual es la cepa causante de diarreas sangrantes por intoxicación con alimentos. Para obtener la cepa de Salmonella spp., se utilizó una tortuga casera conocida como Tortuga de Orejas Rojas o Californiana (Trachemys scripta elegans). Se tomó con ayuda de hisopos estériles muestras del excremento de la tortuga. Las muestras tomadas fueron sembradas en “Agar Salmonella y Shigella” (ASS) de Bioxón código 214400. Este agar es un medio selectivo para aislamiento de Salmonella excepto S. typhi., e incubadas a 36.5 ±1 ºC por 24 horas. Las colonias típicas de Salmonella fueron tomadas y resembradas en agar 5 veces con la intención de lograr un cultivo puro; el cual se almacenó a 4 ºC ±1 ºC hasta su caracterización. Se confirmo la caracterización de la colonia como Salmonella sp., en el Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional.

Fig. 4.2. Fotografía de tortuga utilizada para la extracción de la cepa de Salmonella spp.

4.2 PRODUCTOS HORTOFRUTÍCOLAS SELECCIONADOS. Para el presente proyecto de investigación, se seleccionaron un fruta y una hortaliza. La fruta seleccionada fue fresa (Fragaria vesca) y la hortaliza seleccionada fue: lechuga (Lactuca

sativa variedad longifolia). Ambos productos se seleccionaron en base a dos criterios: 1) El alto índice de consumo en México sin un lavado o desinfección previos. 2) La gran reticencia existente en hacia su consumo debido a la frecuente presencia de microorganismos patógenos en los mismos. Ambos productos fueron adquiridos en un supermercado local un día previo a la elaboración de los experimentos y se mantuvieron a temperatura de refrigeración hasta que fueron utilizados. 4.2.1 LECHUGA.

.

Fig. 4.3. Imagen de hojas de lechuga utilizadas

La lechuga es una hortaliza cuyo consumo es muy recomendable, debido a que es una adecuada fuente de vitaminas A y C; las cuales, entre otras funciones, tienen la de ser antioxidantes, previniendo el envejecimiento prematuro. El valor nutricional de la lechuga se muestra en la tabla 4.1. Este vegetal, tiene una porción comestible muy baja, esto es, contiene un 96% de humedad, lo que proporciona un medio fácilmente viable para el crecimiento de microorganismos.

Tabla # 4.1 Valor Nutricional de la Lechuga por porción de

100gramos. (infoagro.com)

Carbohidratos (g) 20.1 Proteínas (g) 8.4 Grasas (g) 1.3 Calcio (g) 0.4 Fósforo (mg) 138.9 Vitamina C (mg) 125.7 Hierro (mg) 7.5 Niacina (mg) 1.3 Riboflavina (mg) 0.6 Tiamina (mg) 0.3 Vitamina A (UI) 1155 Calorías (cal) 18

4.2.2 FRESA.

Fig.4.4 Imagen de Fresas utilizadas.

Las fresas son varias especies de plantas rastreras del género Fragaria. Las variedades cultivadas comercialmente son por lo general híbridos, especialmente Fragaria x ananassa que ha reemplazado casi universalmente a la especie silvestre Fragaria vesca, por el superior tamaño de sus frutos. Las fresas son útiles en la eliminación del ácido úrico por lo que se considera que protegen contra la gota, además del cáncer, artritis y anemia. Son una excelente fuente de Vitamina C, beta-carotenos y vitamina E, por lo que cuentan con un alto poder antioxidante, muy benéfico para el organismo. El valor nutricional de la fresa se muestra en la tabla 4.3.

Tabla # 4.2.Valor Nutricional de la Fresa por porción de

100gramos. (infoagro.com)

Proteínas (g) 1 Hierro (mg) 0.90

Fibra (g) 3.2 Carbohidratos (g) 7.4 Vitamina A (UI) 100

Vitamina B1 (mcg) 30 Vitamina B5 (mg) 0.28 Vitamina C (mg) 72.8

Vitamina B2 (mcg) 30 Potasio (mg) 147 Fósforo (mg) 22 Calcio (mg) 22

Calorías (cal) 39.4

4.3 Preparación del Inóculo. Para ambos tipos de bacterias se utilizó el mismo procedimiento. A partir de 5 colonias bien aisladas y de morfología similar en el medio de aislamiento, se preparó una suspensión en 5 mL de caldo bilis verde brillante, tocando la parte superior de cada colonia, utilizando un asa de cultivo. El tubo de cultivo se incubó a 36 ±1 º C, hasta que alcanzó turbidez, (3 horas). Se prepararon de cada tubo de cultivo una serie de diluciones en 10 tubos para realizar los experimentos de ambas bacterias, se colocaron en tubos de ensaye 9 mL de agua destilada y 1 mL de suspensión de cultivos de cada una de las cepas seleccionadas. Los tubos fueron almacenados a 4 ºC ±1 ºC hasta que fueron utilizados en los experimentos. La metodología de muestreo, conteo bacteriano y análisis microbiológico esta basada en los estándares reportados en FDA-CFSAN BAM, 2003; HPB, 1993 y apoyada en protocolos previos de investigación como Andrews W. et al., 2001; Nguyen-the C et al., 1994.

Fig. 4.5. Toma de colonias para la preparación del inóculo bacteriano.

4.3.1 CONTEO BACTERIANO. Para ambas bacterias utilizadas en los experimentos, se prepararon diluciones seriales con solución salina normal estéril, desde 101 a 107 hasta lograr un conteo de colonias de entre 15 y 50 colonias en cada caja petri sembrada, para asegurar cuentas exactas de colonias. Se obtuvo para la dilución 107 un conteo promedio de 43 ufc para Salmonella sp. y 32 unidades formadoras de colonias (ufc) para E.coli. (FDA-CFSAN BAM, 2003; HPB, 1993) Después de la aplicación de cada uno de los tratamientos, el número de células bacterianas sobrevivientes a cada uno de estos, se determinó haciendo un conteo de ufc después de depositar 1 mL de la dilución necesaria en cada tratamiento en cajas petri con el agar correspondiente para cada tipo de bacteria utilizada e incubarlas en una incubadora convencional modelo 6M por 24 horas (HPB, 1993; Maturin L., et al., 2001) Todos los experimentos se realizaron por triplicado y analizados estadísticamente (Desviación estándar, ANOVA). 4.4 Inoculación de Productos. Los productos, lechuga romana (Lactuca sativa) y fresas (fragaria vesca), se adquirieron en supermercados locales. Ambos productos fueron cortados a mano usando técnicas asépticas. La cantidad utilizada de los productos seleccionados, (muestra inicial) fue previamente lavada con una solución de hipoclorito preparada como sigue: 2 gotas de hipoclorito comercial concentrado al 5% en 1 litro de agua corriente estéril. Posteriormente esta muestra se sometió a 10 enjuagues con agua corriente estéril para eliminar los residuos de hipoclorito. Todo el proceso anterior fue realizado con la finalidad de minimizar la carga microbiana presente en la muestra y que esta no interfiriera con los experimentos. La muestra inicial previamente lavada se cubrió con papel aluminio y se mantuvo a temperatura ambiente hasta la realización de los experimentos, tiempo que no excedió las 2 horas. En ambos casos el peso de muestra utilizado fue de 3 gramos.

Para llevar a cabo la inoculación de los productos, se tomó la muestra inicial, y se colocaron 3 gramos de lechuga o fresa (submuestras)según fue el caso en cada uno de los vasos de precipitado de 100 mL estériles destinados para los experimentos. Cada una de las submuestras fue inoculada con niveles conocidos de bacterias (1ml de inóculo de Salmonella conteniendo aproximadamente 72 x107 ufc/mL, y 1mL de inóculo de E. coli conteniendo aproximadamente 42 x 107 ufc/mL). Los frascos se cubrieron con papel aluminio y se agitaron suavemente para lograr una mejor distribución del inóculo. Con la intención de dar un tiempo suficiente a las bacterias para ambientarse, los vasos de precipitado tapados, se almacenaron a temperatura ambiente por 2 horas y posteriormente se mantuvieron en refrigeración a 4ºC ± 1ºC hasta ser sometidas a tratamiento. Los métodos de conteo bacteriano se basaron en la tecnología dada por Maturin L., 2001. 4.5 Tratamientos de Desinfección Analizados. En este proyecto de investigación se aplicaron tres tratamientos desinfectantes diferentes, en el caso del ultrasonido, con bajo tres diferentes tiempos de irradiación. (Tabla 4.4). Todos los tratamientos se hicieron en presencia de dos bacterias previamente seleccionadas, (Escherichia coli y Salmonella spp.) cada una por separado.

Tabla 4.3 Matriz de Tratamientos Aplicados a los Productos Seleccionados. Tratamiento / Alimento Fresa Lechuga Microdyn √ √ Bactericida CM √ √ Ultrasonido 10 minutos √ √ Ultrasonido 15 minutos √ √ Ultrasonido 20 minutos √ √ 4.5.1 Tratamiento con Microdyn El bactericida marca Microdyn utilizado, está elaborado a base de plata coloidal. Para las pruebas con el bactericida comercial Microdyn, se utilizaron vasos de precipitado de 100 mL previamente esterilizados, donde se colocaron 3 g de muestra de cada uno de los vegetales utilizados, y con su respectivo inóculo. A cada vaso se le adicionaron 75 mL de una solución previamente preparada del producto como se indica en las instrucciones: 8 gotas por litro de agua (se utilizó agua de la llave previamente esterilizada). El vaso se agitó suavemente y se dejó reposar el tiempo indicado en la etiqueta (10 min.). Transcurrido el tiempo, se tomaron muestras de 1 mL de solución de y se colocó en 9 mL de agua corriente esterilizada, dentro de un tubo de ensayo, esto con la finalidad de realizar diluciones para lograr un conteo adecuado de bacterias. Se realizaron en total cinco diluciones y se sembró un mL de cada dilución en agar Bilis Verde Brillante para E. coli y en Agar Salmonella y Shigella para Salmonella. Las cajas con agar, se incubaron a 36.5 ± 1 ºC por 24 horas y se realizó el conteo de colonias respectivo.

4.5.2 Tratamiento con Bactericida CM (Comercial Mexicana). El bactericida marca CM está elaborado a base de Dióxido de Cloro ClO2. Para las pruebas con bactericida CM, a cada vaso con la muestra de vegetal o fruta se le adicionaron 75 mL de una solución del bactericida preparado como se indica en la etiqueta: 5 gotas por litro de agua ( se usó agua corriente esterilizada) y se dejó reposar por el tiempo indicado (20 min.). Transcurrido el tiempo se tomaron muestras de 1 mL por triplicado de cada vaso y se colocaron en un tubo de ensaye con 9 mL de agua destilada. Se realizaron cinco diluciones y se sembró 1 mL de cada dilución en Agar Bilis Verde Brillante para E. coli y en Agar Salmonella y Shigella para Salmonella. Las cajas se incubaron a 36.5 ± 1 ºC por 24 horas y se realizó el conteo de colonias respectivo. 4.5.3 Tratamiento con Ultrasonido. Para el tratamiento con Ultrasonido, se utilizó un amplificador de ondas ultrasónicas de modo pulsante, con 1 MHz de frecuencia, intensidad de 2.3 W/cm2 y potencia de 4.1 W; el cual tiene un consumo de energía de 160 mA o 17.6 W a su máxima potencia. (Fig. 4.6) Cuenta con un cabezal de 5cm de diámetro de acero inoxidable que recubre la piezocerámica que emite las vibraciones ultrasónicas. (Fig. 4.7) Este equipo fue diseñado, construido y calibrado por el Instituto de Cibernética, Matemáticas y Física de la La Habana, Cuba en colaboración con el Departamento de Ingeniería Eléctrica y Electrónica del Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey Campus Estado de México (ITESM-CEM). Para realizar las pruebas de radiación ultrasónica, se le adicionó a cada vaso de precipitado de 100 mL con muestra del vegetal, 75 mL de agua corriente esterilizada, esto con el fin de proporcionar un medio líquido para la transmisión de las ondas ultrasónicas. En los tres tipos de tratamiento con ultrasonido aplicados, la única variación fue el tiempo de irradiación. Transcurrido el tiempo de tratamiento, se tomaron muestras de 1 mL por triplicado de cada vaso bajo experimentación, se sembraron en agar Bilis Verde Brillante para E. coli y en Agar Salmonella y Shigella para Salmonella. Las cajas se incubaron a 36.5 ± 1 ºC por 24 horas y se realizó el respectivo conteo de colonias. Los datos recolectados se analizaron posteriormente.

Fig. 4.6. Equipo amplificador de ondas ultrasónicas, cabezal de 5 cm de diámetro sumergido en vaso de precipitado de 100 mL conteniendo 75 mL de solución.

Fig. 4.7. Acercamiento del transductor de ondas ultrasónicas.

4.5.4 EVALUACIÓN DE LA EFICACIA DEL TRATAMIENTO DESINFECTANTE. Para la evaluación de la eficiencia del tratamiento de desinfección aplicado, se realizó lo siguiente: � Se llevó a cabo una prueba en blanco. (Muestra sometida tratamiento desinfectante sin

adición de inóculo microbiano)

� Se dejó un testigo positivo. (Muestra sin tratamiento) De cada uno de los vasos sometidos a tratamiento y del blanco y el testigo positivo, se tomaron muestras que se sembraron en agar Bilis Verde Brillante cuando se utilizó inóculo de Escherichia coli; y se sembraron en agar Salmonella y Shigella, cuando se utilizó inóculo de Salmonella spp. en los experimentos. Todos los experimentos se realizaron por triplicado, así como los análisis microbiológicos correspondientes. Los resultados se reportan para cada tratamiento como Índice Logarítmico de Destrucción Microbiana o Reducción Log11. En alimentos este concepto se utiliza para comparar con máximo escudriño la eficiencia de los métodos de desinfección, debido a que es determinante la presencia o no de tan sólo unas células bacterianas para garantizar un alimento inocuo, debido al rápido crecimiento de las colonias. Este concepto de reducción log o logarítmica, tiene su equivalencia al porcentaje de inactivación microbiana. Tabla 4.5.

Tabla 4.4 Equivalencia en Reducción Log a el porcentaje de reducción microbiana en alimentos. (Hoover D.; 2000; USFDA, 2001ª).

Número de veces de Reducción Microbiana

% de Reduccion Microbiana

Índice Log

10 90 % 1 log 100 (102) 99 % 2 log 1000 (103) 99.9 % 3 log

10,000 (104) 99.99 % 4 log 100,000 (105) 99.999 % 5 log 1 millón (106) 99.9999 % 6 log

Un logaritmo es una “potencia de diez”. Cada log de reducción es una reducción del 90%. Por definición, la desinfección es un proceso, físico o químico, con una reducción de 5-log, (99.999% eliminación) de microorganismos—específicamente virus, bacterias y hongos, no menor. 11 Log: El término “Log” es abreviatura de logaritmo.

La definición estática de esterilización es un proceso de uno en 108 probabilidad de que un organismo sobreviva el proceso, por ejemplo, un sobreviviente permitido de una cuenta inicial de 100,000,000—una reducción de 8-log.(Hoover D.,2000, USFDA, 2001a) 4.5.5 EXPRESIÓN DE RESULTADOS. Para la cuantificación de la concentración de las bacterias recuperadas al final del proceso, se utiliza generalmente el logaritmo de reducción en base diez, de acuerdo con las siguientes fórmulas: Log 10 reducción = Log 10 CP - Log 10 CF

Donde: Log 10 CP = Concentración del control positivo al final del tratamiento sin tratamiento desinfectante Log 10 CF = Concentración final de microorganismos después del tratamiento desinfectante

Para que un proceso de desinfección se considere adecuado, este debe permitir una reducción de un 99.999 % de los microorganismos que existían al comienzo del proceso, esto es una reducción de 5 Log. Para que un bactericida comercial se considere eficaz, debe tener una reducción de 4 log, esto es 99.99% de reducción microbiana, aunque lo ideal es que tenga una reducción de 5 log, esto es 99.999% de reducción microbiana. La muerte de una población bacteriana, del mismo modo que el crecimiento de la misma, es por lo general exponencial o logarítmica, es decir, la población se reduce en una fracción constante a un intervalo de tiempo constante. Este proceso se representa en la figura 4.8.

Fig. 4.8 Gráfico de la muerte o destrucción bacteriana. (Hoover K., 2002)

Por lo tanto, dado que la destrucción de la población es logarítmica, es teóricamente imposible eliminar a todos los microorganismos de una población por más que se incremente la extensión de tiempo usada en el tratamiento. 4.6 Determinación de las variaciones de pH y Temperatura. Con la finalidad de tener un análisis más detallado de las variaciones de pH y temperatura inducidas por el ultrasonido, se llevaron a cabo barridos con mediciones de la variación minuto a minuto de cada una de estas variables baja las condiciones mostradas en la tabla 4.2. Todas las mediciones se hicieron utilizando agua corriente esterilizada, y con un equipo portátil modelo WTW ph 330, mostrado en la figura 4.9.

Fig. 4.9 Medidor de pH y Temperatura utilizado en los experimentos

En la tabla 4.5 se muestra un esquema de los criterios utilizados para hacer la mediciones de pH y temperatura en los experimentos.

Tabla 4.5 Condiciones y variables bajo las cuales se hicieron las mediciones de pH y Temperatura.

Condiciones Lechuga Fresa E. coli Salmonella Sin Inóculo, y sin Tratamiento

*

*

Con Inóculo y sin Tratamiento de desinfección.

** **

** **

** **

** **

Con Inóculo y Tratamiento con Microdyn.

** **

** **

**

** **

Con Inóculo y Tratamiento con Bactericida CM.

** **

** **

**

** **

Con Inóculo y Tratamiento con Ultrasonido barrido de 0 a 20 minutos.

** **

** **

**

** **

Los resultados obtenidos fueron comparados entre sí posteriormente.

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. En el presente estudio, se investigó el potencial del ultrasonido para inactivar bacterias inoculadas en la superficie de muestras de frutas y vegetales. 5.1 Tratamientos de Desinfección Evaluados. 5.1.1. Muestras de Fresa (Fragaria vesca). En el caso de la fresa, se tomaron frutos visiblemente frescos y sin daño. Los frutos se sometieron a corte con cuidado extremo, para causar un daño mínimo sobre los fragmentos de muestra. Después de cada uno de los tratamientos de desinfección aplicados, se hicieron observaciones para evaluar los daños físicos visibles que se pudieran haber causado a las muestras por los tratamientos aplicados. Las muestras tratadas con dióxido de cloro (bactericida CM), presentaron daños visibles en la superficie de los fragmentos de fruta, estos daños se manifestaron mediante cambios en la coloración y pérdida de firmeza. Con la aplicación del tratamiento con ultrasonido, así como el tratamiento con microdyn, no se manifestaron cambios físicos visibles en la superficie de las muestras sometidas a estudio. Mediante estas observaciones, se pone de manifiesto que el tratamiento con ultrasonido para desinfección de estas frutas, podría se aplicado por el consumidor final, sin temor a que los productos sufran cambios adversos en su apariencia. Para la primera serie de experimentos, se utilizó un inóculo de Escherichia coli y en una segunda serie de experimentos se utilizó un inóculo de Salmonella sp. De esta forma se pudieron evaluar los resultados utilizando dos diferentes bacterias patógenas de importancia en salud pública.

5.1.1.1 Inóculo de Escherichia coli. Los resultados obtenidos con la aplicación de cada uno de los tratamientos para desinfección sobre muestras de fresa y utilizando un inóculo de Escherichia coli, se muestran en la tabla 5.1. Tabla 5.1 Índices de Inactivación Bacteriana de los tratamientos aplicados sobre muestras de

fresa con inóculo de Escherichia coli. Resultados expresados en Log10 ufc/mL Tratamiento Microdyn CM US 10 min. US 15 min. US 20 min. Reducción Log

5.22 0.19 3.15 4.15 5.68

Las reducciones logarítmicas más altas obtenidas fueron las del microbicida marca Microdyn y la aplicación de ultrasonido por un lapso de 20 minutos (5.22 Log y 5.68 Log respectivamente). Ambos tratamientos están por arriba del porcentaje mínimo de inactivación bacteriana requerido, para considerar un proceso como adecuado según la norma establecida.

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

Microbicida Microdyn

(Plata coloidal)

Microbicida CM (CIO2) Ultrasonido (10 min) Ultrasonido (15 min) Ultrasonido (20 min)

Re

du

cció

n L

og

(ufc

Ml-

1)

Fig. 5.1. Índices de reducción Log resultante de los tratamientos de desinfección aplicados a muestras de Fresa con inóculo de E. coli.

Como lo muestran los resultados obtenidos en este experimento, el efecto bactericida del bactericida Microdyn y la aplicación de ultrasonido durante 20 minutos, es muy similar, y si tomamos en cuenta, que el ultrasonido no requiere la adición de agentes químicos que debido a la acumulación puedan ser tóxicos al organismo, es claro el tratamiento con ultrasonido para desinfección es superior.

5.1.1.2 Inóculo de Salmonella. Los resultados obtenidos con la aplicación de los tratamientos para desinfección seleccionados, sobre muestras de fresa y utilizando un inóculo de Salmonella sp., se muestran en la tabla 5.2.

Tabla 5.2 Índices Índices de Inactivación Bacteriana de los tratamientos aplicados sobre muestras de fresa, con inóculo de Salmonella sp . Resultados expresados en Log10 ufc/mL.

Tratamiento Microdyn CM US 10 min. US 15 min. US 20 min. Reducción Log

5.14 0.30 2.20 4.26 5.86

Las reducciones logarítmicas más altas obtenidas fueron las del microbicida marca Microdyn y la aplicación de ultrasonido por un lapso de 20 minutos (5.14 Log y 5.86 Log respectivamente).

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00


(Plata coloidal)


Red

ucció

n L

og

(ufc

Ml-

1)

Fig. 5.2. Reducción Log resultante de los tratamientos de desinfección aplicados a

muestras de Fresa con inóculo de Salmonella.

Cuando se utilizó un inóculo de Salmonella sp, los resultados obtenidos anteriormente con Escherichia coli se confirman, al tener la máxima inactivación bacteriana con el tratamiento con ultrasonido por un lapso de 20 minutos.

5.1.2 Muestras de Lechuga (Lactuca sativa) En el caso de la lechuga, se tomaron las hojas externas del vegetal las cuales estaban visiblemente frescas y sin daño o rastros de oxidación en sus bordes. Las hojas fueron sometidas a corte con técnicas asépticas y tratando de causar un mínimo daño sobre los fragmentos de muestra. Después de cada uno de los tratamientos de desinfección aplicados, se hicieron observaciones para evaluar los daños físicos visibles que se pudieran haber causado a las muestras por los tratamientos aplicados. Las muestras tratadas con dióxido de cloro (bactericida CM), presentaron una textura babosa en su superficie, sin embargo no se apreciaron daños visibles en la superficie o bordes del vegetal. La aplicación del tratamiento con ultrasonido, no causo cambio alguno en la textura ni en la apariencia física del vegetal. La aplicación del tratamiento con microdyn, parece no haber causado cambios en la apariencia física de las muestras, y la textura es muy similar a las muestras sin tratamiento. Mediante estas observaciones, se pone de manifiesto que el tratamiento con ultrasonido para desinfección de lechuga, podría se aplicado por el consumidor final o en restaurantes, sin temor a que los productos sufran cambios adversos en su apariencia. Para la primera serie de experimentos, se utilizó un inóculo de Escherichia coli y en una segunda serie de experimentos se utilizó un inóculo de Salmonella sp. De esta forma se pudieron evaluar los resultados utilizando dos diferentes bacterias patógenas de importancia en salud pública. 5.1.2.1 Inóculo de Escherichia coli. Los resultados obtenidos con la aplicación de cada uno de los tratamientos para desinfección sobre muestras de lechuga y utilizando un inóculo de Escherichia coli, se muestran en la tabla 5.3. Tabla 5.3 Índices de Inactivación Bacteriana de los tratamientos aplicados sobre muestras de

lechuga con inóculo de Escherichia coli. Resultados expresados en Log10 ufc/mL Tratamiento Microdyn CM US 10 min. US 15 min. US 20 min. Reducción Log

5.01 0.81 1.80 2.93 5.67

Las reducciones logarítmicas más altas obtenidas fueron las del microbicida marca Microdyn y la aplicación de ultrasonido por un lapso de 20 minutos (5.01 Log y 5.67 Log respectivamente). Además de que el tratamiento con ultrasonido es superior en el índice de desinfección, este no utiliza agentes químicos y reduce el consumo de agua en el lavado, lo que lo hace un tratamiento plenamente sustentable.

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00


(Plata coloidal)


Red

uc

ció

n L

og

(ufc

Ml-

1)

Fig. 5.3. Reducción Log resultante de los tratamientos de desinfección aplicados a muestras

de Lechuga con inóculo de E. coli.

5.1.2.2 Inóculo de Salmonella sp. Los resultados obtenidos con la aplicación de cada uno de los tratamientos para desinfección sobre muestras de lechuga y utilizando un inóculo de Salmonella sp., se muestran en la tabla 5.4. Tabla 5.4 Índices de Inactivación Bacteriana de los tratamientos aplicados sobre muestras de

lechuga con inóculo de Salmonella. Resultados expresados en Log10 ufc/mL Tratamiento Microdyn CM US 10 min. US 15 min. US 20 min. Reducción Log

5.00 0.25 2.15 2.97 5.77

Las reducciones logarítmicas más altas obtenidas fueron las del microbicida marca Microdyn y la aplicación de ultrasonido por un lapso de 20 minutos (5.00 Log y 5.77 Log respectivamente). Una vez más se confirma la superioridad del ultrasonido en la inactivación bacteriana.

Fig. 5.4. Reducción Log resultante de los tratamientos de desinfección aplicados a muestras

de Lechuga con inóculo de Salmonella sp.

En la Figura 5.6 se muestra un gráfico que resume los tres tratamientos aplicados, en cada uno de los productos hortofrutícolas manejados y con cada uno de los inóculos utilizados. En la aplicación de tratamientos con ultrasonido, se observa un incremento en el efecto bactericida a medida que aumenta el tiempo de irradiación ultrasónica. La eficiencia de desinfección de la aplicación de ultrasonido por 10 minutos es baja, del orden de 99.9%, lo cual en el caso de alimentos no es adecuado. La eficiencia de desinfección de la irradiación ultrasónica por 15 minutos es de 99.99% lo que parecería ser suficiente, sin embargo, en alimentos, debido a el riesgo que conlleva para los consumidores la rápida proliferación de los microorganismos, no es así; el resultado no alcanza para considerarlo un proceso de desinfección adecuado por definición; sin embargo entra en un rango de aceptable.

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00


(Plata coloidal)


Re

du

cc

ión

Lo

g(u

fc M

l-1

)

asonido (15 min) Ultrasonido (20 min)

Lechuga & Salmonella

ntre los diferentes tratamientos de su inóculo respectivo.

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00


(Plata coloidal)

Microbicida CM (CIO2) Ultrasonido (10 min) Ultr

Reducció

n L

og(u

fc M

l-1)

Fresa & E. Coli Lechuga & E. Coli Fresa & Salmonella

Fig. 5.5. Cuadro comparativo de la Reducción logarítmica resultante edesinfección aplicados a muestras de lechuga y fresa con

Se observa que el tratamiento con ultrasonido por un periodo de 20 minutos es el tratamiento que logra mayor inactivación bacteriana. Comparando estos resultados con los obtenidos con el bactericida Microdyn, no existe diferencia significativa, ya que los dos logran entre 5 y 6 Log de reducción, y en todos los casos se tiene un porcentaje de inactivación bacteriana del 99.999%, con variaciones en el índice de las diezmilésimas, pero el porcentaje mínimo requerido para ser un tratamiento adecuado de desinfección, ambos tratamientos lo cumplen adecuadamente. La diferencia entre estos dos tratamientos estriba en un punto muy importante. El uso de agentes químicos que pueden dañar el medio ambiente, o la salud de quien los consume. El microdyn es un bactericida elaborado a partir de plata coloidal, cuando su uso es muy frecuente o en individuos con ciertas deficiencias, puede causar argiria (intoxicación con plata). El tratamiento con ultrasonido por 20 minutos no utiliza agentes químicos por lo que lo hace superior en este aspecto. La eficiencia de desinfección lograda por la irradiación ultrasónica durante 20 minutos es de 99.999%. Esto es, el resultado logra que se pueda considerar este tratamiento como un proceso de desinfección eficiente y aceptable en alimentos, ya logra sobrepasar el índice mínimo necesario para un proceso de desinfección. El bactericida marca Comercial Mexicana constituido de dióxido de cloro ClO2, presenta un índice de reducción logarítmica demasiado bajo, no alcanzando ni siquiera una desinfección del 90%. El dióxido de cloro, tiene la desventaja de mermar su efectividad en valores bajos de pH, lo que ha sido manifestado por los fabricantes del producto químico. Tal vez los valores de pH tan bajos en las muestras de fresa (entre 3 y 3.9), y ligeramente bajos en las muestras de lechuga (entre 5.7 y 6.13), afectaron su efectividad. Esta merma, no ocurre con el tratamiento con ultrasonido a 1 MHz por 20 minutos, el cual, ha mostrado tener efectividad en un rango de pH amplio que va de 3 a 8, dentro del cual se encuentran la mayoría de los vegetales que se consumen por el humano.(Bridges M., et al, 1999).

Se sugiere la elaboración en otros proyectos de pruebas sensoriales y fisicoquímicas de los productos tratados con cada uno de estos tratamientos; esto con la finalidad de determinar si el índice de calidad del producto hortofrutícola se ve afectado. Este índice de calidad, está dado por factores como apariencia (color, tamaño, forma ausencia de defectos) firmeza, sabor (sólidos solubles, acidez titulable y compuestos aromáticos) y valor nutricional (contenido vitamínico). Se considera que para tener un sabor aceptable el producto debe contener un mínimo de 7% de sólidos solubles y un máximo de 0.8% de acidez titulable. (PTRIC, 2005).

Cada técnica de desinfección tiene sus ventajas dependiendo el área de aplicación, y en algunos casos aplicaciones específicas en productos especiales. En la tabla5.5, se muestran algunas de estas ventajas y desventajas de cada uno de los tratamientos seleccionados en este estudio, así como las de otros tratamientos existentes en el mercado.

Tabla # 5.5 Comparación de ventajas y desventajas de diversos tratamientos de desinfección existentes con el ultrasonido de 1 MHz aplicado por 20 minutos, evaluadas en escala de 1 a 3

(3 es el máximo puntaje favorable)

Método de Desinfección

Ambientalmente

amigable

Formación de subproductos

tóxicos

Efectividad Inversión Costos de operación

Daño sensorial

Sonicado 20 minutos a 1

MHz

3 3 3 2 2 3

Microdyn 1 1 3 2 2 3

Bactericida CM

1 1 1 3 2 2

Ozonificación 1 1 2 2 1 3

Radiación luz UV

2 2 1 2 2 1

Los experimentos realizados en este proyecto de investigación se han hecho con inóculos de bacterianos de Salmonella spp., y Escherichia coli., debido a que son bacterias ampliamente conocidas como patógenos asociados a alimentos. Son bacterias implicada en numerosos brotes que han ocurrido en las últimas décadas, algunos de ellos mortales, involucrando alimentos como huevos, pollo, frutas y vegetales.(Piyasena P., et al, 2003) Escherichia coli y Salmonella spp., son bacterias que cuando son encontradas en alimentos son tomadas como un indicio de contaminación fecal. Suelen encontrarse en vegetales que fueron regados con aguas residuales, o que debido a las malas prácticas de manufactura, se contaminaron durante el proceso de llegada al consumidor. Basándose en que el ultrasonido mediante el fenómeno de cavitación genera una energía mecánica que tiene una acción desincrustante, se puede asegurar que las bacterias inoculadas en los experimentos no permanecen adheridas al vegetal, y son susceptibles de ser destruidas. El consumo de vegetales contaminados con estos microorganismos conlleva graves riesgos a la salud humana ya que estas son responsables de enfermedades gastrointestinales que afectan principalmente a niños y adultos mayores. En el caso de vegetales, son muy escasos los trabajos de investigación realizados que reporten resultados sobre los efectos de inactivación bacteriana con ultrasonido y no se encontraron trabajos reportados en la frecuencia de 1MHz, bajo las condiciones experimentales reportadas aquí.

Las patentes que existen de sistemas ultrasónicos de inactivación bacteriana, sostienen que el uso únicamente de ultrasonido en el procesado de alimentos puede ser un todo un reto. La efectividad de un tratamiento con ultrasonido depende del tipo de bacteria que se va a tratar y la geometría de superficie del alimento. (Sala et al, 1995)

5.2 Variaciones de pH 5.2.1 Control. Se hizo un análisis de la variación del pH en los tratamientos de desinfección aplicados, a manera de poder evaluar los efectos de cada uno únicamente sobre el agua corriente esterilizada. Se cree que la presencia de muestras vegetales, así como la de inóculos bacterianos pueden influir en la variaciones finales de pH obtenidas durante los tratamientos. Los cambios de pH observados en los diferentes experimentos realizados muestran y confirman lo observado en estudios anteriores, la generación de radicales libres del agua a través de un proceso de oxidación que es de naturaleza reversible.

7

7.2

7.4

7.6

7.8

8

8.2

8.4

8.6

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Tiempo (min)

pH

Control Microdyn Microbicida CM Ultrasonido

Fig. 5.6. Variación del pH del agua corriente estéril con los diferentes tratamientos de desinfección aplicados.

En la gráfica se observan las variaciones de pH que tiene el agua esterilizada con el simple hecho de ser sometida a uno de los tratamientos de desinfección seleccionados. Esto se hizo con la finalidad de determinar como afecta al pH el tratamiento aplicado de manera aislada, sin la presencia de muestras vegetales o inóculos bacterianos.

El tratamiento con ultrasonido es el que causa una menor variación del pH de las muestras con 0.115 unidades, con respecto al control esto es, al agua sin tratamiento. De esta forma, podemos inferir, que el tratamiento con ultrasonido no afectará la textura de los vegetales tratados con ondas ultrasónicas. En el otro extremo el tratamiento con microdyn es el que induce una mayor variación del pH con 1.21 unidades. Esta disminución del pH puede afectar la textura de algunos productos delicados como las fresas, moras, etc. El tratamiento con bactericida CM sólo presenta una ligera variación del pH, sin embargo no ha mostrado ser muy eficaz en la desinfección, por lo que no se considera competitivo con el ultrasonido.

5.2.2 Lechuga con inóculo de Escherichia coli.

8.1

8.2

8.3

8.4

8.5

8.6

8.7

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Tiempo (min)

pH

Control Microdyn Cl Ultrasonido

Fig. 5.7. Variación del valor de pH de agua estéril con muestra de lechuga e inóculo de E.

coli, sometidas a diferentes tratamientos.

En esta gráfica, se observan las variaciones de pH que se presentaron en el agua corriente esterilizada al colocarse la muestra de lechuga y el inóculo bacteriano, y ser sometidas a diferentes tratamientos de desinfección. Esto se llevó a cabo con la finalidad de observar como la presencia de alimento y bacterias, modifican los valores de pH durante los tiempos de tratamiento manejados. En todos los experimentos, al adicionar la muestra de lechuga y el inóculo bacteriano al agua, su pH se incrementó solo ligeramente en 0.25 unidades de pH. En el tratamiento con ultrasonido, la ligera disminución del pH que se manifestó en el agua estéril ahora se incrementa al principio de forma vertiginosa, pero pasados los primeros dos minutos de tratamiento, el pH sigue disminuyendo de manera más pausada. Sin embargo la

variación neta de pH es únicamente de 0.355 unidades versus la variación de casi 0.115 unidades de pH cuando se hizo el tratamiento sin muestra de vegetal o inóculo. La variación del pH en el tratamiento con microdyn, ahora se ve disminuida siendo sólo de 0.27 unidades, cuando que con el tratamiento sin presencia de muestra vegetal fue de 1.21 unidades de pH. Esto nos indica que la plata coloidal reacciona con la materia orgánica presente, evitando así que la plata reaccione con las moléculas de agua disponible y aumente la liberación de iones hidrógeno. La variación del pH para el tratamiento con bactericida CM fue de 0.475 unidades de pH, y cuando no hubo presencia de vegetal e inóculo fue de 0.5 unidades de pH por lo que permaneció casi constante.

5.2.3 Lechuga con inóculo de Salmonella sp.

8.1

8.15

8.2

8.25

8.3

8.35

8.4

8.45

8.5

8.55

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Tiempo (min)

pH

Control Microdyn Cl Ultrasonido Fig. 5.8 Variación del pH de agua esterilizada con muestra de lechuga, e inóculo de

Salmonella sp.

Al cambiar el inóculo en las muestras, la variación del pH no se vio significativamente afectada en ninguno de los tres tratamientos aplicados. En el caso del inóculo de Salmonella

sp., y el tratamiento con microdyn, la variación fue de 0.315 unidades, casi igual que en el caso de E. coli, con el tratamiento de CM fue de 0.5 unidades y con el tratamiento de ultrasonido fue de 0.33 unidades. Estas variaciones se mantuvieron casi constantes, por lo que se deduce el tipo de bacteria utilizada no afecta los resultados.

5.2.4 Fresa con inóculo de Escherichia coli.

3.5

4

4.5

5

5.5

6

6.5

7

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Tiempo (min)

pH

Control Microdyn Cl Ultrasonido Fig. 5.9. Variación del valor de pH de agua estéril con muestra de fresa con inóculo de E. coli.

En esta gráfica, se observan las variaciones de pH que se presentaron en el agua corriente esterilizada al colocarse la muestra de fresa así como el inóculo bacteriano correspondiente, y ser sometidas a diferentes tratamientos de desinfección. En todos los experimentos, al adicionar la muestra de fresa y el inóculo bacteriano al agua, su pH se incrementó ligeramente en 0.245 unidades de pH. Esto llama la atención, debido a que el pH de la fresa es mucho más bajo que el de la lechuga, sin embargo la transcurrir el tiempo, las diferencias se vieron más acentuadas En el tratamiento con ultrasonido, la ligera y constante disminución del pH que se manifestó en el agua estéril, ahora se modifica con el siguiente comportamiento: disminuye ligeramente durante el primer minuto de tratamiento y luego se incrementa y supera ligeramente el valor inicial, para después inicial un descenso hasta llegar a un valor de pH de 3.925; el valor final alcanzado no va más allá del pH normal de la fresa. La variación neta de pH es muy grande, de 4.69 unidades versus la variación de casi 0.115 unidades de pH cuando se hizo el tratamiento sin muestra de vegetal o inóculo. La variación del pH en el tratamiento con microdyn, también disminuye aún más, con respecto al tratamiento sin presencia de muestra de la fruta. En esta ocasión es de 2.46 unidades de pH, mientras que con el tratamiento sin presencia de muestra vegetal fue de 1.21 unidades de pH. El valor de pH intrínseco de la fresa si afectó la variación neta de pH durante los tratamientos.

La variación del pH para el tratamiento con el microbicida CM fue de 2.78 unidades de pH, y cuando no hubo presencia del fruto ni inóculo fue de 0.5 unidades de pH por lo que nuevamente se infiere que el pH intrínseco de la fresa afecto la variación neta de pH. 5.2.5 Fresa con inóculo de Salmonella sp.

3.5

4

4.5

5

5.5

6

6.5

7

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Tiempo (min)

pH

Control Microdyn Cl Ultrasonido Fig 5.10. Variación del valor de pH de agua estérilizada con muestra de fresa e inóculo de

Salmonella sp. Al cambiar el inóculo en las muestras de fresa, la variación del pH sólo se vio significativamente afectada en el tratamiento con microdyn, donde esta última fue casi duplicada; en el tratamiento con ultrasonido y con el microbicida CM la diferencia se mantuvo constante. Cuando se utilizó el inóculo de Salmonella sp., y el tratamiento con microdyn, la variación neta de pH, fue de 4.14 unidades, mientras que con el inóculo de E. coli fue de 2.46 unidades. Con el tratamiento con ultrasonido la variación neta de pH fue de 4.69 unidades que en el caso de E. coli fue la misma, 4.69 unidades de pH. En el tratamiento con microbicida CM, la variación neta de pH fue de 2.78 unidades, igual que con el inóculo de E. coli, de 2.78 unidades La variación manifestada en el tratamiento con microdyn no es probable que se deba al tipo de bacteria utilizada, es posible que la muestra de fruta utilizada haya tenido una mayor acidez, y esto ocasionó una variación al final del experimento.

5.3. Variaciones de Temperatura. 5.3.1 Control Se realizaron varios experimentos para poder evaluar los efectos de cada uno de los tratamientos de desinfección seleccionados en la temperatura del medio. De esta forma establecer una comparación entre tratamientos debido a que un incremento alto de la misma puede dañar las enzimas y tejidos de los productos hortofrutícolas tratados. Primero se evaluaron los efectos en la temperatura de agua correinte esterilizada únicamente. Más adelante se observan los cambios en la temperatura en presencia de muestras vegetales e inóculos bacterianos. Variación de la Temperatura en los diferentes tratamientos aplicados únicamente a agua corriente esterilizada.

19

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0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Tiempo (min)

Tem

pe

ratu

ra (

°C)

Control Microdyn Microbicida CM Ultrasonido

Fig. 5.11. Variación de Temperatura del agua esterilizada con la aplicación de los diferentes tratamientos de desinfección seleccionados en este estudio.

En la gráfica se observan las variaciones de temperatura que se presentan en agua esterilizada con el simple hecho de ser sometida a uno de los tratamientos de desinfección seleccionados. Aquí se puede observar como cada tratamiento en si mismo afecta la temperatura del medio donde se aplica.

El tratamiento con ultrasonido es el que causa una mayor variación de la temperatura, la temperatura del medio se ve incrementada en 9.75 ºC con respecto al control. La temperatura final del medio fue de 29.4 ºC, la cual no es elevada con respecto a la temperatura ambiente, es por eso que la apariencia física final de los vegetales al ser tratados con ultrasonido, se conserva intacta. En el tratamiento con microdyn, se observó un incremento de temperatura despreciable de 0.25 grados centígrados, el cual muy probablemente está dado por el aumento de la temperatura ambiente al transcurrir los experimentos. Al no haber un cambio de temperatura, no hay daño posible a las muestras de vegetales tratadas, y su calidad se corserva. El tratamiento con bactericida CM presenta un incremento de temperatura ligeramente mayor que el de microdyn, de 1.2 grados centígrados, no es probable que este incremento de temperatura sea el responsable de la degradación de la superficie de las muestras vegetales por que más bien se atribuye a cambios químicos. 5.3.2 Lechuga con inóculo de Escherichia coli.

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Tiempo (min)

Tem

pera

tura

(°C

)

Control Microdyn Cl Ultrasonido Fig. 5.12. Variaciones de temperatura del agua esterilizada, conteniendo 3 gramos lechuga e inóculo de E. coli., con los diferentes tratamientos de desinfección aplicados. En esta gráfica, se observan las variaciones de temperatura, que se presentaron en los recipientes conteniendo agua corriente esterilizada y colocárseles la muestra de lechuga y el inóculo bacteriano, después de sometidas a los diferentes tratamientos de desinfección seleccionados.

Esto se llevó a cabo con la finalidad de observar como la presencia de muestras vegetales y bacterias, modifican las variaciones de temperatura que se tienen en los diferentes tratamientos, durante los tiempos de aplicación manejados. En todos los experimentos, al adicionar la muestra de lechuga y el inóculo bacteriano al agua, la temperatura se vio incrementada entre 0.2 y 0.45 ºC. Este se dio probablemente debió a que la temperatura del inóculo era ligeramente mayor que la temperatura del agua en el vaso de precipitados. En el tratamiento con ultrasonido, el incremento de temperatura que hubo, fue mayor que el que se dio en el agua esterilizada sola; fue de 13.65 ºC; con respecto al control, llegando a una temperatura final de 34.25 ºC; pero el control se incrementó en 2.65 ºC debido al incremento de temperatura del medio ambiente. La temperatura en el tratamiento con microdyn, se incrementó sólo en 3.21 ºC, cuando que con el tratamiento sin presencia de muestra vegetal fue de 0.25 ºC. Si consideramos que el control incrementó su temperatura 2.65 ºC, podemos decir que el microdyn no induce un cambio significativo de temperatura. La variación de temperatura para el tratamiento con bactericida CM fue de 1.21 ºC, y cuando no hubo presencia de vegetal e inóculo fue la misma; incluso su temperatura no aumentó como la del control, si no que se mantuvo constante.

5.3.3 Lechuga con inóculo de Salmonella

19

21

23

25

27

29

31

33

35

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Tiempo (min)

Tem

pera

tura

(°C

)

Control Microdyn Cl Ultrasonido Fig. 5.13 Variaciones de temperatura del agua esterilizada, conteniendo 3 gramos lechuga e inóculo de Salmonella sp., con los diferentes tratamientos de desinfección aplicados. Al cambiar el inóculo en las muestras, el incremento en la temperatura de las diferentes muestras de experimentación, no se vio significativamente afectado en ninguno de los tres tratamientos aplicados. En el caso del inóculo de Salmonella sp., y el tratamiento con microdyn, el incremento fue de 3.05 ºC que es prácticamente el mismo que se dio con el inóculo de E. coli de 3.1 ºC. Con el tratamiento con el microbicida CM el incremento de temperatura fue de 2.8 ºC similar al incremento de 1.95 ºC que se dio con el inóculo de E. coli. Estos incrementos de temperatura están dados por el incremento en la temperatura ambiente y no por el tratamiento en sí; así mismo se deduce que tipo de bacteria utilizada no tiene influencia sobre las variaciones de temperatura que ocurren durante el tratamiento aplicado.

5.3.4 Fresa con inóculo de Escherichia coli.

19

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0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Tiempo (min)

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(°C

)

Control Microdyn Cl Ultrasonido Fig. 5.14. Variaciones de temperatura del agua esterilizada, conteniendo 3 gramos fresa e inóculo de E. coli., con los diferentes tratamientos de desinfección aplicados. En esta gráfica, se observan las variaciones de temperatura, que se presentaron en los recipientes conteniendo agua corriente esterilizada y colocárseles la muestra de fresa y el inóculo bacteriano, después de sometidas a los diferentes tratamientos de desinfección seleccionados. Esto se llevó a cabo con la finalidad de observar como la presencia de muestras vegetales y bacterias, modifican las variaciones de temperatura que se tienen en los diferentes tratamientos, durante los tiempos de aplicación manejados. En todos los experimentos, al adicionar la muestra de fresa y el inóculo bacteriano al agua, la temperatura se vio incrementada entre 0.2 y 0.55 ºC. Este se dio probablemente debió a que la temperatura del inóculo era ligeramente mayor que la temperatura del agua en el vaso de precipitados. En el tratamiento con ultrasonido, el incremento de temperatura que hubo, fue mayor que el que se dio en el agua esterilizada sola; fue de 13.05 ºC; con respecto al control, llegando a una temperatura final de 33.55 ºC; pero el control se incrementó en 1.5 ºC muy probablemente, debido al incremento de temperatura del medio ambiente. Los incrementos de temperatura que se dieron en los tratamientos con ultrasonido aplicados en ambos tipos de muestras vegetales y para ambos inóculos bacterianos son muy similares, esto es, podemos decir que un incremento neto de temperatura de aproximadamente 13 grados centígrados es lo más probable que ocurra durante todos los tratamientos con ultrasonido, aplicados por un periodo de 20 minutos.

Este incremento de temperatura no afecta la superficie o textura del producto vegetal, si la temperatura inicial del tratamiento es lo suficientemente baja; lo cual no es algo muy complicado de tener, pues la temperatura común del agua del grifo no suele superar los 20 grados centígrados, y normalmente es de 15 grados centígrados. La temperatura en el tratamiento con microdyn, se incrementó sólo en 0.8 ºC, muy similar a cuando se aplicó el tratamiento sin presencia de muestra vegetal que fue de 0.25 ºC. Si consideramos que el control incrementó su temperatura 1.5 ºC, podemos decir que el microdyn no induce un cambio significativo de temperatura. La variación de temperatura para el tratamiento con bactericida CM fue de 1.05 ºC, y cuando no hubo presencia de vegetal e inóculo fue de 1.25 ºC muy similar misma; incluso su temperatura no aumentó como la del control, si no que se mantuvo constante. 5.3.5 Fresa con inóculo de Salmonella.

19

21

23

25

27

29

31

33

35

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Tiempo (min)

Tem

pera

tura

(°C

)

Control Microdyn Cl Ultrasonido Fig. 5.15. Variaciones de temperatura del agua esterilizada, conteniendo 3 gramos fresa e inóculo de Salmonella sp., con los diferentes tratamientos de desinfección aplicados. Al cambiar el inóculo en las muestras, el incremento en la temperatura de las diferentes muestras de experimentación, no se vio significativamente afectado en ninguno de los tres tratamientos aplicados.

El incremento de temperatura dado por el tratamiento con ultrasonido fue de 14.2 ºC, un incremento muy similar al obtenidos con todos los demás tratamientos con ultrasonido aplicados. El cambio de inóculo no influyó en la variación de temperatura dada por el tratamiento. En el caso del inóculo de Salmonella sp., y el tratamiento con microdyn, el incremento fue de 0.55 ºC que es menor a que se dio con el inóculo de E. coli de 3.1 ºC. Esta variación está dada probablemente por lo la variación de la temperatura ambiente cuando se llevaron a cabo los experimentos. Con el tratamiento con el microbicida CM el incremento de temperatura fue de 1.25 ºC similar al incremento de 1.05 ºC que se dio con el inóculo de E. coli. Estos incrementos de temperatura están dados por el incremento en la temperatura ambiente y no por el tratamiento en sí; ya que el control también sufrió un incremento de temperatura de 1.5 ºC, así mismo se deduce que tipo de bacteria utilizada no tiene influencia sobre las variaciones de temperatura que ocurren durante el tratamiento aplicado. En el tratamiento con ultrasonido de 1 MHz por 20 minutos hay una variación de temperatura de hasta casi 14 grados centígrados, sin embargo, los efectos térmicos inducidos por el ultrasonido pueden descartarse de ser responsables de alterar los microorganismos presentes. Se ha demostrado que tiene mayor efecto en la resistencia del microorganismo, la reducción del pH causada por el fenómeno de cavitación. (Ross et al., 2003) Estudios teóricos y experimentales han claramente demostrado que el mecanismo térmico en el ultrasonido es insignificante en cuanto a que pueda producir un incremento letal de la temperatura en sistemas biológicos cuando se trabaja a frecuencias bajas de ultrasonido como la empleada en este estudio, y el tiempo de exposición no influye debido a los mecanismos de eliminación de calor intrínsecos. Las tecnologías no térmicas como el ultrasonido, fueron diseñadas para eliminar el uso de elevadas temperaturas y prevenir así efectos adversos en el sabor, apariencia o valor nutricional. El incrementar la inocuidad de los productos no solo es necesario para el consumidor final, también es muy importante para los productores y distribuidores. Así, también puede aplicarse el ultrasonido en combinación con otros tratamientos o como complemento a los tratamientos tradicionales que utilizan calor, con la finalidad de producir alimentos más seguros y comercialmente estériles. Así, se concluye que se requieren de mas estudios cuantitativos para definir exactamente las condiciones de exposición adecuadas para asegura una eficacia germicidas así como especificar si hay organismos específicos que son susceptibles a este tratamiento.

6. CONCLUSIONES Las diferentes aplicaciones de la tecnología ultrasónica en la industria de alimentos cada día se expanden más, por lo que se vislumbra que tendrá una fuerte presencia en el futuro de esta industria. Actualmente el uso de ultrasonido en procesos de inactivación bacteriana, está en fase de prueba, y ha mostrado en los estudios realizados, que puede ser muy prometedor. Este estudio, confirma que sí es posible aplicar el ultrasonido de 1 MHz de frecuencia y 4.1 W de potencia, como tecnología alternativa sustentable para desinfección de fresa y lechuga. El ultrasonido de frecuencia de 1 MHz aplicado, es capaz de generar cavitación y puede ser aplicado para la destrucción de microorganismos patógenos. Los cambios en el pH y temperatura del medio, obtenidos como consecuencia de la radiación ultrasónica en los diferentes tiempos de aplicación manejados, confirman que se generó el fenómeno de cavitación, siendo este la causa de la destrucción de los microorganismos. En los tratamientos donde se utilizaron ondas ultrasónicas ocurrió un incremento de temperatura, que se debe principalmente a los cambios de presión ocurridos en el sistema por el crecimiento e implosión de las microburbujas generadas en la cavitación. Sin embargo, este incremento de temperatura no es suficiente para lograr un índice de destrucción microbiana tan elevado, por lo que se concluye que la elevación de temperatura no es el mecanismo mediante el cual tiene lugar la inactivación bacteriana. La eficacia bactericida del tratamiento con ultrasonido de 1 MHz, mostró que es posible trabajar adecuadamente, en un rango de valores de pH entre 3 y 9. Además en este estudio, los resultados obtenidos muestran que el tratamiento con ultrasonido de 1 MHz durante veinte minutos para desinfección de vegetales, es claramente superior al tratamiento con dióxido de cloro y ligeramente superior al tratamiento con Microdyn; además de presentar mayores ventajas para una aplicación sustentable. La tecnología ultrasónica descrita en este proyecto, permite el consumo de vegetales más frescos, y más nutritivos, sin embargo aun está en su etapa de investigación; por lo que su efectividad en la inactivación de otro tipo de microorganismos patógenos debe confirmarse mediante la realización de estudios posteriores, así como establecer, si ocurre inactivación enzimática que pudiera llegar a dañar los productos. El tiempo de contacto requerido para el tratamiento con ultrasonido de 1 MHz, es mayor que para los otros dos tratamientos comparados en este estudio, sin embargo es aceptable si se considera que no existe riesgo para la salud. Los experimentos con ultrasonido en alimentos reales y no sólo en suspensiones acuosas de microorganismos, no son mediciones triviales debido a que los vegetales tienden a ser altamente absorbentes y con una geometría de superficie complicada.

Entre las aplicaciones exitosas actuales del ultrasonido en la industria de alimentos están: la medición del grosor de capas de chocolate, de grasa, ó cartílago en carne; detección de contaminantes tales como piezas de metal, vidrio o madera en alimentos; medición de los índices de flujo en tuberías, determinación de la composición de alimentos y medición de tamaño de partículas. En el área de preservación de alimentos, se requieren hacer más análisis y pruebas detalladas, antes de que éste pueda ser usado como un método alternativo, ya sea a mayor o menor escala. Entre las principales necesidades de investigación están la determinación del efecto del ultrasonido en la inactivación microbiana cuando se aplica de manera aislada y no en combinación con otras tecnologías, como se hace en la mayoría de los casos; evaluación de la influencia de las propiedades de los alimentos tales como viscosidad y tamaño de partículas Se requieren de estudios más detallados sobre la cavitación transiente y estable para poder comprender como el fenómeno de cavitación puede ser responsable de la inactivación de suspensiones acuosas de bacterias. Estos experimentos preliminares sugieren que el ultrasonido de baja frecuencia, tiene cierta eficacia en la inactivación de algunos agentes que pueden residir en los vegetales para consumo humano. Debido a que la cavitación transiente puede ocurrir en el nivel de intensidad trabajado, se cree que la cavitación transiente es el principal mecanismo físico responsable de la inactivación de los microorganismos. La cavitación estable es un mecanismo que requiere niveles de intensidad muy superiores para lograr tales efectos. El análisis cuantitativo indica que existe un cierto grado de efecto germicida inducido por el ultrasonido contra ciertos patógenos que podrían encontrase en los vegetales. Sin embargo, no se tienen respuestas absolutas y definitivas en estos estudios preliminares. Por lo tanto, se requieren estudios cuantitativos adicionales para definir de manera más completa y exacta las condiciones de exposición bajo las cuales aseguran por completo la eficacia germicida así como otros organismos específicos que pueden ser susceptibles a inactivación con ultrasonido. La implementación de elevados estándares en el agua de riego que se utiliza como parte de un programa de inocuidad alimentaria, puede disminuir los riesgos de salud publica. Esta agua de riego puede incluso ser tratada con ultrasonido. La aplicación de ondas ultrasónicas de 1 MHz de frecuencia por un periodo de tiempo de 20 minutos, es una tecnología no térmica alternativa que es sustentable y puede ser aplicada para la destrucción de microorganismos patógenos no solo en agua, sino también en vegetales, ya que ha demostrado resultados satisfactorios al cumplir con los estándares mínimos requeridos para considerarse un proceso de desinfección aceptable en alimentos.

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