UNIVERTIDAD AUT~NOMA METROPOLITANA

Iztapalapd

JC .B .S .

Rep ~ rte de Servicio S.

Uso de Emulsiones Inversas en Procesos de Biodesulfuración" J;I

B\OQulH IC R 'Lic. en Ingeniería Industrial

/Alumna: Gabriela Martínez Carrillo

Mat.: 92329521

Lugar de Realización: Instituto Mexicano del Petróleo, Departamento de Bioprocesos

/Asesor Interno:\-h Dpto. Biotecnología UAMI \

Asesor Externo: M. en C. Diego Zaragoza Contreras, Depto. Bioprocesos IMP

Mayo - Noviembre ' 98

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INFORME FINAL

Uso de Emulsiones Inversas en Procesos de Biodosulfuración

INTROWCCldN

El proceso clásico para la eliminacibn (19 azufre es un proceso catalitico, llamado Hidrodesulfuraci6n (HDS), el cual se lleva acabo en condiciones severas de temperatura y presibn, haciendo de este un proceso muy costoso y poco eficknte en destilados medios.

Los tioles, sulfidas y tiofenos, son fácilmente removidos por HDS. Sin embargo, los benzotiofenos y los dibenzotiofenos (DBT's) son considerablemente m h dificiles de remover por HDS.

Desde hace algunas décadas se ha iniciado en el extranjero la investigación de procesos biotecnológicos para la reduccibn de azufre en energbticos fbsiles, sin embargo en México la investigacibn en esta área se ha desarrollado débilmente en los últimos t n a años. Los resultados han mostrado que las experiencias en el extranjero pueden ser parcialmente útiles en el caso de México, sobre todo por la diferencia en el contenido de azufre en los hidrocarburos.

Resulta importante para la industria petrolera, y en general, para la mejora del ambiente, buscar alternativas biotecnológicas al proceso clásico de eliminacibn de azufre debido a que la normatividad nacional como internacional ha iniciado una planeaci6n para disminuir los limites en el contenido de azufre en hidrocarburos, hasta 50-1000 ppm dependiendo del combustible para el año 2000. Por otro lado se ha comprobado que la mayoría de las reservas de crudo en el mundo muestran un alto contenido de azufre. Por Io que resultan importantes las investigaciones y estudios que puedan ofrecer opciones para mejorar los procesos ya existentes.

Es por eso que nuevos procesos como los de Biodesulfuración tienen gran oporhinidad de sobresalir en el medio de refinacibn del crudo.

Tradicionalmente enzimas y células bacterianas han sido utilizadas en dispersiones homogéneas para converür sustancias en productos.

La meta de una desulfuracibn biccatalítica es desarrollar sistemas en los cuales las bacterias o sus enzimas catalicen reacciones muy específicas para eliminar el azufre de los compuestos organosulfurados. Esto es análogo a la tecndogía donde se usan catalizadores inorgánicos para facilitar la reaccibn de gas hidr6geno con fracciones de petr6leo para producir HIS y compuestos desulfurados.

Es entonces cuando se produce la necesidad de introducir conocimientos como los de la química coloidal para evaluar emulsiones inversas como posibles medios de atrapamiento de biocatalizadores, con el fin de disminuir los niveles de azufre en el diesel (fig. 1, Tipos de Micelas).

1

amphiphilic compouid

Figura 1. Tipos de Micelas

El tbmino emulsi6n se refiere a cualquier disprsi6n de un Ilquido en otro. Por supuesto los dos liquidos deben ser inmiscibles. El agua es uno de los componentes más comunes y el otro es usualmente un aceite o algún olro líquido lipofilico. AI agitar estos llquidos se fotma la suspensi6n pero ésta no es estable ya que al poco tiempo las gotas tienden a juntarse y los líquidos se separan en dos capas, por Io que es importante agregar a la mezcla un agente emulsificante o surfactante y lograr as1 su estabilidad (fig. 2, tipos de agregados micelares).

I

Figura 2. Tipos de Agregados Micelares

Los surfactantes son mol&ulas que poseen dos secciones, una parte hidrofílica (usualmente ihica), y una parte hidroióbica (cadena de hidrocarburos). Esta naturaleza dual provoca que estas mOl&UlaS sean absorbidas en la interfase de dos liquidos inmiscibles.

7

El bis-(2-etilexil) sulfosuccinato de sodio (también llamado dioctilsulfosuccinato de scdio, aerosol OT 6 AOT) es un tensoactivo ani6nico que en presencia de un hidrocarburo y agua fona micelas invertidas en cuyo centro se aloja el agua (fig. 3. Estructura química del AOT).

Aerosol OT

Figura 3. Estnictura química del AOT

En Io que se refiere al estudio de bicatalizadores el Rhodococcus rhodochrous es el microorganismo que en los últimos años ha sido mhs estudiado, éste microorganismo proviene de la cepa IGTSB, la cual es una bacteria gram positiva, aerobia, con número de patente 5,132,219, y fue aislada de suelos y ambientes marinos de Kuwait. Este microorganismo tiene la habilidad de usar DBT como fuente de azufre, sin destruir los enlaces carbonocarbono, por lo que es posible emplearlo como catalizador en procesos de Biodesulfuraci6n.

OWETWO GENERAL:

El objetivo general del proyecto al que pertenece este trabajo es desarrollar un proceso de bicdesulfuraci6n de alto rendimiento.

OBJETIVOS PARTICULARES:

Conocer la actividad desulfuradora del microorganismo Rhodococcus rhodwhrous y su manejo. Mantener en condiciones 6ptimas de desulfuraci6n al microorganismo Rhodococcu~ rhodochrous. Evaluar el uso de emulsiones inversas en una proporcibn 70130, aguadiesel como sistemas de inmovilización.

METODOLOG~A

La primera parte del proyecto es la correspondiente al aspecto microbiolbgico y su metodología se muestra en la figura 4. Metodo Microbiol6gico

* =.

PARTE MlCROBlOLOGlCA

biomass de Rr üeterminación de la Dureza

4

-7- ~ ~~- I

1

úicubación a 30°C I

~mmt1ac16n

Figura 4. MBtodo Microbiológico

A

La segunda parte es la correspondiente a la evaluación de emulsiones inversas, y su metodología se muestra a continuación: ESTABILIDAD DE EMULSION VARIANDO CONCENTRACION DE AOT en sistemas Diesel / Fase acuosa en una proporción 70130 y AOT como surfactante, SIN biomara Primero se debe filtrar el diesel para asegurar que las observaciones no se vean interferidas por partículas suspendidas provenientes del diesel de proceso. 1. Se filtra el diesel 2. Se vacla en viales de cristal con tapa de teflón 7mL de diesel en c/u 3. Se disuelve el AOT en el diesel con agitación constante hasta uniformidad (1 a 2 min.) 4. Se agrega fase acuosa (Medio Basal Salino ó Solución Fisiol6ggica) 5. Se agita con vortex tomando tiempo Imin 6. Se deja en reposo, tomando tiempo hasta la separación de fases. 7. Se registra el tiempo en el que se separan las fases. Este procedimiento se ilustra en la figura 5. Metodologia de las Pruebas de Emulsibn.

PRUEBAS DE ESTABILIDAD DE EMUL5IdN

3

f=3

6i I E 100 rpm, I l m i n I

Figura 5. Metodologia de las Pruebas de Emulsión

z

ESTABILIDAD DE EMULSION VARIANW CONCENTRAClON DE AOT en sistemas Diesel / Fase acuosa en una proporci6n 70130 y AOT como surfactante, CON blomrsa Esta prueba se realiza de la misma manera que la anterior solo que la fase acuosa, Sol. salina y Medio de cultivo tienen el 1 % de biomasa concentrada, (peso seco de O.O061g/mL y 0.0104 glmL respectivamente). VIABILIDAD EN EMULSIONES VARIANDO LA CONCENTRAClON DE AOT con sistemas Desel I Fase acuosa + biomasa en una proporción 70130 y AOT como surfactante, 1. Se prepara y esteriliza soluci6n fisiológica (0.85%) 2. Se prepara y esteriliza Medio Basal Salino 3. Se lavan y esterilizan matraces bafleados 4. Se filtra el diesel y se vacían 7 mL en c/u de los matraces 5. Se disuelve el AOT en el diesel 6. Del concentrado de biomasa se toma la cantidad necesaria para inocular la Sol. Fisiológica y el

Medio basal salino al 1% 7. Se mide la densidad óptica de c/u 8. Se agregan 3 mL de sol. fisiológica + biomasa 6 medio basal + biomasa a cada uno de los

matraces 9. Se llevan a agitaci6n constante por 72h 10. Se dejan reposar por Ih 11, Se separan las fases en embudos de separación 12. Se centrifuga fase acuosa 13. Se siembra en caja petri y se incuba hasta observar crecimiento Nota: Es importante resaltar que en ésta etapa se debe de cuidar la esterilidad de todos los materiales así como del brea de trabajo. Este procedimienio se ilustra en la figura 6. Metodología de Viabilidad en Emulsiones

MABILIDAD EN Eh4UL51ONES

h

.

ACTMDADES REALWDAS

1. Evaluación Microbiolbgica. 2. EstabilizacMn y purificación de la cepa Rhodocmw rhodcchrous IGTSB. 3. Evaluación del sistema Diesel I Fase acuosa 70130 con y sin biomasa.

OBJETWOS Y METAS ALCANZADOS

I. Conocimiento de los cuidados y precauciones al manejar Rhodococcus rhodochrous IGTSB 2. Integración de resultados para la evaluación de un sistema Diesel /Agua en una proporción

~ 70130. -

RESULTADOS Y CONCWSIONES

Se trabajó con el microorganismo Rhodococcus rhodochrous IGTS8 durante casi 4 meses seguidos para c o n m r su ciclo de vida, así como las condiciones para su crecimiento, durante estos meses se tuvieron algunos problemas ocasionados por contaminaciones cruzadas dentro del laboratorio, sin embargo pudimos damos cuenta de los cuidados que se deben de tener para mantener a dicho microorganismo ya que presenta cambios morfológicos durante su crecimiento, al inicio de su crecimiento se obseiva como coco, posteriorniente pasa a bacilo corto para posteriorniente comenzar a fcfmar pseudo hifas y finalmente romper nuevamente en coco. Trabajos anteriores, demuestran que la fase en la que el microorganismo se encuentra mtis activo es cuando está en bacilo corto.

Una vez seguros de que la cepa se encontraba en condiciones óptimas se realizaron las pruebas con emulsiones Dieselbase acuosa (70/30)

7

Para pder graficar estos resultados se pasaron los datos a minutos y se hizo un promedio.

E - 5 5 f 4

C 1 F O

0.002 0.W3 0.004 0.005 Canüdd del sumstnt. AOT (0)

GMtm 1. EstaMlidad de ErnuMn, sd. Salina, sin Mornasa

Erbbilidad de Ernubbn 70R@D¡o~V901. Salina CON BDMASA

O 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 I - ~ * * ~ C l 8 l $ . A O T l g J

R

O ow1 o002 ow3 ow o005 UnU.ddi AOTb)

GMm 2. Estabüdad de Ernulsi6n, Med. basal, sin bbmasa

I . . . . . ---... 5 I ' - "w

53 E 2 81 . . . <

. . . . , . I O

O 0.m 0.002 0.003 0.004 Cmad.ddauibobniAOi(pl

Gr(LRC0 3. EslabYidad de Emuisbn, Sd. salina, a n bbmasa GMm 4. EstabHidad de Emuisibn, Med. Basal, con bkimasa Los resultados de las pruebas de estabilidad sin biomasa para sistemas 70130 Diesel1 Fase

acuosa nos demostraron que al utilizar medio de cultivo basal salino el tiempo que tardaron las fases en separarse van6 ligeramente con respecto a los resultados obtenidos con SOluci6n fisioltgica, esto es debido al contenido de sales del medio basal ya que éstas interfieren en la funcibn del surfactante disminuyendo as¡ el tiempo de estabilidad de la emulsibn. (gráficos 1 y 2)

AI comparar los resultados de estabilidad con y sin biomasa podemos damos cuenta que la presencia del microorganismo en el sistema mantiene la estabilidad casi constante aun al aumentar ta cantidad de surfactante, de esto podemos damos cuenta en las gráficas correspondientes. (gráficas 3 y4)

En general podemos decir que cuando se aumenta la cantidad de AOT en el sistema la estabilidad aumenta también, sin embargo, debido a la naturaleza de nuestro proceso es necesario que después de estar en contacto el tiempo suficiente para lograr la desulfuracibn ambas fases (acuosa y orgánica), se debe lograr una separación rápida y total. Y en las pruebas que contenían AOT después de varias horas de reposo la emulsi6n no se rompia totalmente, pues en la fase orgánica podían observarse residuos de la fase acuosa y viceversa. Pero en las pruebas blanco, es decir sin AOT esto era sensiblemente menor, la separacibn podria decirse fue total.

Tabla 5. Datos obtenidos de la prueba de Viabilidad: -

Concentración AOT Muestra , Blanco 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005

Diesel /Sol. J X x X X X Salina

DiesellMedio J X X X X X - Basal x no hubo crecimiento J s i hubo crecimiento

Los resultados obtenidos de la prueba de viabilidad heron negativos para ensayos con AOT y positivos para los blanco (sin AOT), como puede observarse en la tabla 5.

A éstos últimos se les realizó tincibn gram para asegurar que las colonias que crecieron correspondieran a Rhodococcus rhodochmuslR~ y no a algún tipo de contaminacibn; en dicha tinci6n se observaron bacilos gram positivos grandes y un poco alargados muy homogéneo, aunque no muy parecido a la cepa original de B, por Io tanto se realiz6 prueba de actividad en matraces bafleados con DBT.

Los resultados de la prueba de actividad del microorganismo sobreviviente a la prueba de viabilidad, fueron positivos pues al hacer una evaluacibn cualitativa del contenido de DBT en los matraces prueba se observ6 una considerable disminuci6n de &te compuesto, caracteristica de la cepa original, por Io que podemos decir que el microorganismo mcdific6 su fisiología debido a las condiciones a las que fue sometido, ya que como se mencionb anteriormente ésta cepa es muy delicada y cualquier mcdificaci6n en el medio que Io rodea provcca cambios en su comportamiento.

O

Es importante mencionar que se trabajb con sistemas 70130 Diesell Fase acuosa por ser una proporcibn intermedia dentro del rango necesario para m a r micelas inversas, siendo &e un primer estudio dentro del laboratorio en el que se Ilevb a cabo el trabajo.

RECOMENDACIONES

Debido a que el principal objetivo del proyecto es la desulfuraci6n, es recomendable repetir este mismo trabajo:

Evaluando la actividad del microorganismo antes y durante su adicibn al sistema, para comparar y caracterizar su comportamiento. Modificando la concentracibn del inoculo. Variando velocidades y tiempo de agitacibn.

Además es importante lograr que el AOT se disuelva completamente en el diesel antes de incorporar la fase acuosa ya que esto optimiza la emulsibn. Por otra parte, es sumamente importante cuidar al 100% la pureza de la cepa, evitar que el microorganismo sea manejado por vanas personas a la vez y mantener siempre su actividad desulfuradora.

BIBLIOGRAF~A

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1596-1600,1996.

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RESUMEN

Alumna: Gabnela Martlnez Carrillo, matrícula 93329521, Licenciatura en Ingenieria Bioqulmica Industrial. Titulo: USO DE EMULSIONES INVERSAS EN PROCESOS DE BlODESULFURAClbN Registro del Servicio Social l.B.1.014.98, fecha de entrega: 2711 1198 Asesor Interno: Dr. Sergio Huerta Ochoa, Departamento de Biotecnologia, UAM-I Asesor Extevo: M. en C. Diego Zaragoza Contreras, Investigador del Departamento de Biopmsos del IMP.

Los objetivos de &te trabajo fueron concm el manejo y cuidados del la cepa Rhodococcus rhodochrous, mantenerlo en condiciones adecuadas de acüvidad y pureza, además de evaluar el uso de emulsiones inversas m o altematia de atrapamiento de biccatalizadores en procesos de biodesulfuración. El microorganismo Riiadococcus rhodochrous es una bacteria gram positiva, aerobia que tiene cambios morío!&¡cos de acuerdo a la edad del cultivo, se presenta en una primera fase como cocos pequeños, posteriormente pasa a bacilos cortos y en este momento es cuando su actividad desulfuradora es mayor, cuando el cultivo ya es un poco viejo se comienzan a observar pseudohifas y finalmente vuelve a romper en coco. La evaluación de las emulsbnes se llevó a cabo en sktemas Diesel 1 fase a c u ~ (70/30), utilizando como fase acuosa Medio basal Salino y sol. Fisiobgica, además de AOT como surfactante. Los resultados indican que al utilizar medio basal como fase acuosa el tiempo de estabilidad fue menor al obtenido con sol. fisiol6gica cuando no se le inccfpor6 biomasa y en ambos CBSOS al aumentar la concentración de AOT, la estabilidad también aumentó. Cuando se adicionó biomasa el sistema al aumentar la concentración de surfactante, el incremento en la estabilidad no fue tan grande como en el caso anterior. En cuanto a las pruebas de viabilidad del microorganismo, después de 72h en agitación a 300 C en emulsión Diesellfase acuosa 70130, solo se obtuvo crecimiento en las pNebas blanco (sin surfactante) para m$dio basal salino y para sol. fisiobgica, el microorganismo, sufnó modificaciones en su motídogía, pero no en su actividad desulfuradora. En conclusión, las sales que contiene el medio basal salino interfieren en la acción del surfactante, y bajo estas condiciones el microorganismo se ve afactado en su comportamiento y morfología además de que no permanece viable cuando se le adiciona AOT bajo las condiciones manejadas.

1 1

1 , . I .

ClU ibbh d llrrnpo

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD SECRETARíA ACADÉMICA

A QUIEN CORRESPONDA: :

de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesoró el siguiente Servicio Social:

TITULO "USO DE EMULSIONES INVERSAS EN PROCESOS DE

ALUMNO MARTíNEZ CARRILLO GABRIELA MATRkULA 93329521 LICENCIATURA INGENIERíA BlOQUíMiCA INDUSTRIAL PERIODO MAYO 25,1998 a FEBRERO 15, 1999

Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan, en la Ciudad de México, Distrito Federal a veinte de septiembre de mil novecientos noventa y nueve.

A T E N T A M E N TE, "CASA ABIERTA AL TIENlPO"

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BIODESULFURACI~N"

I * SECRETARIO ACADÉMICO

UNIDAD IZTAPALAPA Av Michaacdn y la Pudsima. Col. Vicenbna. D F. 09340 Tel. (5) 723 63 51, Fax (5)612 MI 83 kmsil: akbMxanurn u9m.m

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