I

IDENTIFICACIÓN DE MOLÉCULAS NATURALES CON POTENCIAL

ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA, CONTRA BACTERIAS GRAM POSITIVAS,

A TRAVÉS DEL ANÁLISIS IN SILICO DE PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS

DE DOS LIBRERÍAS DE COMPAÑÍAS FARMACEUTICAS

FRANK LEANDRO CORTEZ GOMEZ

UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

MAESTRÍA EN INVESTIGACIÓN EN ENFERMEDADES INFECCIOSAS BUCARAMANGA

2018

II

IDENTIFICACIÓN DE MOLÉCULAS NATURALES CON POTENCIAL

ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA, CONTRA BACTERIAS GRAM POSITIVAS,

A TRAVÉS DEL ANÁLISIS IN SILICO DE PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS

DE DOS LIBRERÍAS DE COMPAÑÍAS FARMACEUTICAS

FRANK LEANDRO CORTEZ GOMEZ

16861010

Trabajo de Grado presentado como parte de los requisitos para la

obtención del título de Magíster en Investigación en Enfermedades

Infecciosas.

NYDIA PAOLA RONDÓN VILLARREAL, MSc, PhD.

TUTOR

UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

MAESTRÍA EN INVESTIGACIÓN EN ENFERMEDADES INFECCIOSAS BUCARAMANGA

2018

III

IV

Dedicatoria A Laura Melissa Torrado mi inspiración y mi corazón, mi fuerza en estos 2 años

de maestria para seguir adelante en cada aspecto de mi vida

A Juan Camilo y Maria Fernanda mis hijos mis amores y mi motivo de dedicarme todos los días a sacar mis proyectos adelante y ser su ejemplo

V

AGRADECIMENTOS

A mi tutora la Dra. Paola Rondón, quien con mucho entusiasmo me animó durante la realización de este proyecto, y con mucha paciencia me enseñó un

lado desconocido del conocimiento de gran valor para mi vida profesional.

A la Dra. Liliana Torcoroma, nuestro mayor ejemplo A todo el personal docente de la maestría que durante dos años nos dieron lo

mejor de ellos para nuestra formación

A mis compañeros cada uno de ellos con su carisma, su amistad me dieron ánimo para seguir adelante con la maestría, y aún más me dieron cariño. 2

años de una experiencia sin igual

A Laura Melissa Torrado, por su amor, por impulsarme a seguir adelante, a ser mejor persona, mejor estudiante y un mejor profesional, a ella le debo todo en

estos 2 años, por eso le dedico mis triunfos. Por acercarme a Dios y darme su mano siempre

VI

TABLA DE CONTENIDO

INTRODUCCIÓN 1

1 ASPECTOS FUNDAMENTALES DE DISEÑO DE ANTIBIÓTICOS

2

1.1. FARMACOLOGÍA GENERAL Y FARMACOLOGÍA DE LOS ANTIBIOTICOS

2

1.1.1 Farmacocinética y farmacodinamia 2

1.1.1.1 Paso a través de membranas celulares 3

1.1.1.2 Transporte pasivo a través de las membranas 4

1.1.1.3 Electrólitos e influencia del pH 5

1.1.1.4 Transporte por la membrana mediado por transportadores. 5

1.1.2 Diseño de medicamentos y absorción oral 6

1.1.3 Absorción oral de medicamentos más allá de las 5 reglas de Lipinski

7

1.1.4 Relación entre el blanco y las propiedades fisicoquímicas de los fármacos antibacterianos

8

1.1.5 Panorama actual del desarrollo de antibióticos, retos y nuevos desarrollos

10

1.1.6 Barrera de permeabilidad en Gram Negativos 11

1.1.7 Resistencia a múltiples antibióticos 13

1.1.8 Bacterias multidrogo resistentes 15

1.1.9 Diseño de medicamentos asistido por computador 16

1.1.10 Descriptores moleculares 19

1.1.11 El proceso del diseño de fármacos basado en la estructura 19

1.1.12 Moléculas naturales como potenciales medicamentos y antibióticos

23

1.1.13 Efecto sinérgico de antibióticos y extractos de plantas 26

2. OBJETIVOS 28

3. MATERIALES Y MÉTODOS 29

3.1. MATERIALES 29

3.1.1. Librería de compuestos 29

3.1.2. Librerías de código y software 29

VII

3.2. MÉTODOS 30

3.2.1 Creación de grupos de antibióticos 30

3.2.2. Cálculo de los descriptores moleculares de los compuestos de cada librería

30

3.2.3. Selección de los descriptores moleculares más utilizados en el diseño de antibióticos asistido por computador

35

3.2.4 Análisis de los datos 38

3.2.5 Creación de las reglas de diseño de antibióticos 38

3.2.6 Selección de las moléculas naturales 39

4. RESULTADOS 40

4.1 Principales descriptores moleculares en los grupos de antibióticos aprobados por la FDA

40

4.1.1. Clasificación por vía de administración 40

4.1.2 Clasificación por espectro 41

4.1.3. Clasificación por blanco 42

4.1.4. Clasificación por familias 44

4.2 Principales descriptores moleculares en las librerías de compuestos de las compañías Asinex e Interbioscreen

45

4.3. Reglas sugeridas para el diseño computacional de antibióticos 47

4.3.1 Reglas para antibióticos de administración endovenosa 47

4.3.2. Reglas para antibióticos de administración oral 47

4.3.3. Reglas para antibióticos que actúan sobre Riboproteínas 48

4.3.4. Reglas para antibióticos que actúan sobre proteinas individuales

48

4.3.5. Reglas para antibióticos que actúan sobre complejos de proteinas

48

4.3.6. Reglas para antibióticos que actúan contra bacterias gram positivas

49

4.3.7 Reglas para antibióticos que actúan contra bacterias gram negativas

49

4.3.8. Resumen de las reglas propuestas para el diseño de antibióticos

50

4.3.9. Lista de otros descriptores que pueden ser útiles para seleccionar moléculas con posible actividad contra bacterias gram positivas

50

VIII

4.4. Selección de moléculas naturales utilizando las reglas propuestas

55

4.4.1. Moléculas candidatas para antibióticos de administración endovenosa

55

4.4.2. Moléculas candidatas para ser antibióticos de administración oral

55

4.4.3 4.4.3. Moléculas candidatas para ser antibióticos que atacan riboproteínas 51

55

4.4.4 Moléculas candidatas para ser antibióticos que atacan proteínas individuales

55

4.4.5. Moléculas candidatas para ser antibióticos que atacan complejos de proteinas

55

4.4.6. Moléculas candidatas para ser antibióticos que atacan bacterias gram positivas

55

4.4.7. 4.4.7. Moléculas candidatas para ser antibióticos que atacan bacterias gram negativas

55

4.4.8. 4.4.8. Moléculas candidatas para ser antibióticos que atacan bacterias gram positivas y de administracion endovenosa

56

4.4.9. Lista sugerida de moléculas con actividad contra bacterias gram positivas

56

5. 5. DISCUSIÓN 60

5.1. Clasificación por vía de adminstración 61

5.2. Clasificación por espectro 64

5.3. Clasificación por blanco 65

5.4. Clasificación por familias de antibióticos 65

5.5. Aplicación de otros descriptores que pueden ser útiles para seleccionar moléculas con posible actividad contra bacterias gram positivas

66

6. CONCLUSIONES 68

7. REFERENCIAS 69

8. ANEXOS 76

A Scripts de código desarrollados y utilizados en el desarrollo del presente proyecto

76

A.1 Script para el cálculo de todos los descriptores moleculares utilizando Python 2.7

76

A.2. Script para el cálculo de los descriptores moleculares más comunes utilizando Python 2.7

82

IX

A.3. Scripts en R para analizar las distribuciones y las pruebas estadísticas de los descriptores moleculares por clasificación

83

A.3.1. Para la clasificación por administración 83

A.3.2. Para la clasificación por espectro 88

A.3.3. Para la clasificación por blanco 91

A.3.4. Para la clasificación por familias 95

A.4 Script de código en Python 2.7 para seleccionar las moléculas de acuerdo a las reglas diseñadas

101

A.5. Script de código en Python 2.7 para seleccionar moléculas, con multiples descriptores, con potencial actividad contra gram positivas

103

B. Lista de compuestos naturales en la librería Interbioscreen con su respectiva fórmula química.

109

C. Lista de moléculas seleccionadas como candidatas para administración endovenosa.

110

D. Lista de moléculas seleccionadas como candidatas para administración oral

110

E. Lista de moléculas seleccionadas como candidatas para ser antibióticos que atacan riboproteínas

110

F Lista de moléculas seleccionadas como candidatas para ser antibióticos que atacan proteínas individuales

110

G. Lista de moléculas seleccionadas como candidatas para ser antibióticos que atacan complejos de proteínas

110

H. Lista de moléculas seleccionadas como candidatas para ser antibióticos que atacan bacterias gram positivas

110

I. Lista de moléculas seleccionadas como candidatas para ser antibióticos que atacan bacterias gram negativas

110

J. Lista de moléculas seleccionadas, utilizando más descriptores, como candidatas para ser antibióticos que atacan bacterias gram positivas

111

X

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Interacción de absorción, distribución, fijación, metabolitos y excreción de los fármacos y su concentración en sitios de acción (farmacocinética y farmacodinamia)

3

Figura 2. Mecanismos del paso de moléculas a través de las membranas

4

Figura 3. Influencia del pH en la distribución de un ácido débil entre el plasma y el jugo gástrico separados por una barrera de lípidos

5

Figura 4 El proceso de diseño de drogas basado en la estructura

21

Figura 5. Diagramas de cajas y bigotes de los valores que mostraron los antibióticos de la FDA agrupados por vía de administración

41

Figura 6. Diagramas de cajas y bigotes de los valores que mostraron los antibióticos de la FDA agrupados por espectro

42

Figura 7. Diagramas de cajas y bigotes de los valores que mostraron los antibióticos de la FDA agrupados por blanco

43

Figura 8. Diagramas de cajas y bigotes de los valores que mostraron los antibióticos de la FDA agrupados por familia

44

Figura 9. Diagramas de cajas y bigotes de los valores que mostraron las librerías Asinex e Interbioscreen en los descriptores moleculares más utilizados

46

XI

LISTA DE TABLAS

Tabla 1 Proteínas de membrana externa y relación con la permeabilidad

13

Tabla 2. Clasificación de microorganismos considerados como amenaza de acuerdo al CDC

15

Tabla 3. Compuestos naturales con potencial actividad antibacteriana 24

Tabla 4. Resumen de los descriptores moleculares más utilizados en el diseño de medicamentos

35

Tabla 5. Valores p de las pruebas de Kruskal-Wallis y Wilcoxon con los grupos de la clasificación por vía de administración

40

Tabla 6. Valores p de las pruebas de Kruskal-Wallis y Wilcoxon con los grupos de la clasificación por espectro

41

Tabla 7. Valores p de las pruebas de Kruskal-Wallis y Wilcoxon con los grupos de la clasificación por blanco

43

Tabla 8. Valores p de las pruebas de Kruskal-Wallis y Wilcoxon con los grupos de la clasificación por familia

45

Tabla 9 Resumen de las reglas propuestas en este trabajo para el diseño de antibioticos

50

Tabla 10 Selección de moléculas naturales utilizando las reglas propuestas

51

Tabla 11. Descriptores moleculares con valor estadísticamente significativo para establecer reglas de escogencia de moléculas candidatas

51

XII

LISTA DE ABREVIATURAS

Å: Angström ADN: Ácido Desoxirribonucleico ADMET: Absorción, distribución, metabolismo, excreción y toxicidad ARN: Ácido ribonucleico CDC: Centro para Control de Enfermedades Infecciosas (USA) Da: Daltons GLUT: Proteína transportadora de glucosa sensible a la insulina PBP: Proteínas de unión a betalactámicos QSAR: Relación cuantitativa estructura-actividad (en inglés, Quantitative Structure-Activity Relationship) LogP: Logaritmo de P LPS: Lípido polisacárido MIC: Concentración Mínima Inhibitoria Naccr: Número de aceptores de hidrógeno Ndonr: Número de donadores de hidrógeno Nrot: Número de enlaces rotables SGLT: Co-transportadores sodio-glucosa RMN: Resonancia Magnética Nuclear SARM: Staphylococcus aureus resistente a la meticilina VIH: Virus de Inmunodeficiencia Humana OMS: Organización Mundial de la Salud Weight: Peso Molecular

XIII

RESUMEN

Título: IDENTIFICACIÓN DE MOLÉCULAS NATURALES CON POTENCIAL

ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA, CONTRA BACTERIAS GRAM POSITIVAS,

A TRAVÉS DEL ANÁLISIS IN SILICO DE PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS

DE DOS LIBRERÍAS DE COMPAÑÍAS FARMACEUTICAS

Autor: Frank Leandro Cortés Gómez.

Palabras Clave: Antibióticos, antibacterianos, Propiedades fisicoquímicas, Descriptores moleculares, Diseño computacional. Descripción: La resistencia a los antibióticos es una amenaza a la salud humana, con reportes crecientes de múltiples bacterias multidrogo resistentes y pocos avances en investigación desde hace más de 20 años (Kelley et al., 2011). En la búsqueda de una solución, las moléculas de origen natural pueden ser una buena alternativa para la aparición de nuevos antibióticos (Taylor, 2013). Además, el diseño racional de medicamentos permite el análisis in silico de moléculas mediante herramientas computacionales, y esto puede aumentar las probabilidades de identificar compuestos de origen natural biológicamente efectivos contra bacterias.

Entre estas herramientas in silico, se encuentran las técnicas QSAR que analizan la relación entre estructura y actividad biológica, en modelos para predecir la actividad de una molécula (Cox et al., 2013, Soukup et al., 2016). Por otra parte, el uso de herramientas computacionales como QSAR, también permite calcular las propiedades fisicoquímicas, electrofísicas, posibles interacciones, sitios de unión, fármaco-elegibilidad y toxicidad, mediante el uso de modelos matemáticos y herramientas estadísticas que permiten el análisis de una gran cantidad de datos (Shin et al., 2017; McPhillie et al., 2015; Cherkasov et al., 2014). Por lo anterior, en este trabajo de grado se utilizaron herramientas computacionales para establecer reglas de diseño (a falta de reglas claras oara este fin) para moléculas con actividad antibacteriana contra bacterias gram-positivas y fármaco elegibles, que posteriormente fueron utilizadas para seleccionar moléculas naturales de la librería de la compañía Interbioscreen con potencial actividad antibacteriana (https://www.ibscreen.com/natural-compounds). El uso de estas herramientas computacionales permitió reducir significativamente el espacio de posibles moléculas a analizar en futuras pruebas experimentales, pasando de un conjunto de 66.107 posibles moléculas a tan sólo una lista de 257 moléculas candidatas.

https://www.ibscreen.com/natural-compoundshttps://www.ibscreen.com/natural-compoundshttps://www.ibscreen.com/natural-compounds

XIV

ABSTRACT

Title: IDENTIFICATION OF NATURAL MOLECULES WITH POTENTIAL ANTIBACTERIAL ACTIVITY, AGAINST GRAM POSITIVE BACTERIA, THROUGH THE IN SILICONE ANALYSIS OF PHYSICOCHEMICAL PROPERTIES OF TWO BOOKSTORES OF PHARMACEUTICAL COMPANIES Author: Frank Leandro Cortés Gómez. Keywords: Antibiotics, antibacterials, physicochemical properties, molecular descriptors, computational design. Description: Antibiotic resistance is a threat to human health, with increasing reports of multiple resistant multidrug bacteria and few advances in research for more than 20 years (Kelley et al., 2011). In the search for a solution, molecules of natural origin can be a good alternative for the appearance of new antibiotics (Taylor, 2013). In addition, rational drug design allows the in silico analysis of molecules by computational tools, and this can increase the chances of identifying biologically effective compounds of natural origin against bacteria. Among these in silico tools, there are QSAR techniques that analyze the relationship between structure and biological activity, in models to predict the activity of a molecule (Cox et al., 2013, Soukup et al., 2016). On the other hand, the use of computational tools such as QSAR, also allows to calculate physicochemical kind, electrophysical properties, possible interactions, binding sites, drug-eligibility and toxicity, through the use of mathematical models and statistical tools that allow the analysis of a large amount of data (Shin et al., 2017; McPhillie et al., 2015; Cherkasov et al., 2014). Therefore, in this degree work, computational tools were used to establish design rules (in the absence of clear rules for this purpose) for molecules with antibacterial activity against gram-positive and drug-eligible bacteria, which were subsequently used to select natural molecules from the bookshop of the Interbioscreen company with potential antibacterial activity (https://www.ibscreen.com/natural-compounds). The use of these computational tools allowed to significantly reduce the space of possible molecules to be analyzed in future experimental tests, going from a set of 66,107 possible molecules to just a list of 257 candidate molecules.

Introducción

1

INTRODUCCIÓN

La resistencia a los antibióticos es uno de los problemas de salud pública más importantes de la época actual, en especial en los países en vía de desarrollo en donde factores económicos, biológicos y culturales incrementan la magnitud de este problema (Amábile-Cuevas, 2010). Sin la aparición de nuevos antibióticos la medicina moderna se verá altamente afectada en el área de cirugías y procedimientos avanzados, entre otros, debido al alto riesgo de adquirir una bacteria intrahospitalaria multidrogo resistente que no pueda ser controlada con la medicina actual ( House, W. 2015).; Projan & Bradford, 2007).

En el año 2015, la Organización Mundial de la Salud (OMS) publicó el plan de acción global en la resistencia antimicrobiana (World Health Organization, 2015) y en este expone cinco objetivos estratégicos, entre los cuales se encuentra el aumentar el entendimiento y la toma de conciencia de esta problemática, fortalecer la investigación y la vigilancia médica, reducir el número de infecciones, optimizar el uso de los agentes antimicrobianos y asegurar una inversión sostenible que permita hacer frente a esta gran amenaza. En el plan mencionado, se propone que la investigación básica en las enfermedades infecciosas debe ser una prioridad y se hace un llamado para que los países miembro realicen investigaciones colaborativas en la búsqueda de nuevas medicinas, herramientas de diagnóstico y vacunas.

La problemática es incluso mucho mayor si se considera, que las grandes industrias farmacéuticas no han estado muy interesadas e involucradas en el desarrollo de nuevos antibióticos, básicamente por motivos económicos (Bettiol, et all. 2015) (Ventola, 2015). En este sentido, el costo de producir un nuevo antibiótico es de alrededor US $2.6 billones y el tiempo requerido para su desarrollo y posterior aprobación es mayor a 10 años (Coates, et all 2011). Adicionalmente, la corta duración del tratamiento y las restricciones de uso para los nuevos antibióticos, hacen que la tasa de recuperación de la inversión sea bastante baja (Poupard, 2005; Projan, 2003; Williams & Bax, 2009). Por esto, la gran mayoría de estas compañías se ha dedicado al descubrimiento de medicamentos para enfermedades crónicas y de alto costo, que representan un ingreso mayor y una tasa de utilización de los nuevos medicamentos bastante superior a la tasa de utilización de un nuevo antibiótico en el mercado (Projan, 2003; Poupard, 2005).

Por otra parte, el descubrimiento de nuevos antibióticos ha sido casi que nulo en las últimas décadas (Shore C.K., Coukell A. 2016). El ceftaroline es uno de los últimos antibióticos descubiertos, que se encuentra disponible en el mercado para el tratamiento de la bacteriemia causada por Staphylococcus aureus, bacteria gram positiva de un amplio espectro de infecciones tanto a nivel comunitario como hospitalario y con altas tasas de mortalidad (Zhanel et al., 2009). Sin embargo, ya se tienen noticias de bacterias que han generado resistencia a este nuevo antibiótico. En este sentido, se requiere de nuevos

Introducción

2

agentes terapéuticos con mecanismos de acción novedosos, que permitan la disminución en la prevalencia de infecciones, que puedan ser altamente efectivos y tengan una baja o nula toxicidad.

Por lo anterior, es de gran importancia que se promueva la investigación y la inversión de recursos, en la búsqueda de nuevas moléculas que puedan tener actividad antibacteriana contra estas bacterias multidrogo resistentes. Es por esto que múltiples organizaciones incluyendo la Sociedad de América de Enfermedades Infecciosas IDSA por sus siglas en inglés (Infectious Diseases Society of America), han propuesto la iniciativa 10 x 20 con el propósito de desarrollar 10 nuevos antibióticos para el año 2020. Estas organizaciones están incentivando a las industrias farmacéuticas, científicos, políticos y sociedad en general en la búsqueda de nuevas soluciones a la problemática de la resistencia antimicrobiana (Infectious Diseases Society of America, 2010).

En este sentido, este trabajo de grado busca dar apoyo en la búsqueda de soluciones a la falta de moléculas de antibióticos y propone el uso de herramientas in silico que permitan identificar moléculas de origen natural con potencial actividad antibacteriana.

1. ASPECTOS FUNDAMENTALES DE DISEÑO DE ANTIBIÓTICOS

1.1 FARMACOLOGÍA GENERAL Y FARMACOLOGÍA DE LOS ANTIBIÓTICOS

1.1.1 Farmacocinética y farmacodinamia

La farmacocinética se enfoca en el estudio de la absorción, distribución y metabolismo de un fármaco desde el momento que ingresa al cuerpo hasta el momento en el cual es eliminado, mientras que la farmacodinamia se dedica al estudio de los mecanismos de acción de los fármacos y la acción sobre un receptor específico. La Figura 1 muestra la interacción de absorción, distribución, fijación, metabolitos y excreción de los fármacos y su concentración en sitios de acción.

Por otra parte, es importante resaltar algunos aspectos teóricos de estas áreas que pueden ser de gran utilidad al momento de diseñar fármacos a través de técnicas computacionales.

Cada molécula posee unas características físicas y químicas que le permiten atravesar las membranas celulares. Las características de un fármaco que permiten pronosticar su desplazamiento y disponibilidad en los sitios de acción son su tamaño y forma molecular, grado de ionización, solubilidad relativa en lípidos de sus variantes ionizada y no ionizada y su enlace con las proteínas séricas y tisulares (hísticas).

Introducción

3

Figura 1. Interacción de absorción, distribución, fijación, metabolitos y excreción de los fármacos y su concentración en sitios de acción (farmacocinética y farmacodinamia) (Goodman y Gilman 2014).

1.1.1.1 Paso a través de membranas celulares

Las membranas plasmáticas son la barrera más importante para el paso de moleculas. Frecuentemente, el paso a través de las membranas incluye una o varias de estas, desde un epitelio como el intestinal, a las capas de la piel y la unión a proteínas de las membranas celulares y lípidos.

Las membranas plasmáticas se forman por una doble capa de lípidos anfipáticos, y cadenas de carbohidratos hidrófobos hacia el interior y cabezas hidrófilas al exterior. Las moléculas de lípidos pueden organizarse con colesterol formando esfingolipidos y dando propiedades a la membrana como fluidez, flexibilidad, impermeabilidad, aislamiento y resistencia eléctrica sobre todo a moléculas fuertemente polares.

Dentro de la capa lipídica están las proteínas que cumplen como receptores, bombas, canales de iones, transportadores que transducen vías de señalización eléctrica y química y constituyen blancos selectivos para la acción de medicamentos.

Introducción

4

Figura 2. Mecanismos del paso de moléculas a traves de las membranas (Goodman y Gilman 2014).

Existen varios tipos de trasporte a través de las membranas celulares de las moléculas: via paracelular, por difusión (por gradiente), difusión facilitada, transportadores de fármacos (Figura 2). (Goodman y Gilman 2014).

El paso de medicamentos a través de transporte paracelular es menor así como el que es arrastrado por difusión pasiva a través del paso con el agua, y el paso de las moléculas se ve limitado por la unión a las proteínas del plasma. (Goodman y Gilman 2014).

El paso paracelular es importante y está relacionado con la capacidad del flujo sanguíneo a los tejidos y es el determinante de la eliminación renal a través de la filtración glomerular. En algunos tejidos existen excepciones como en el sistema nervioso central (SNC) por las uniones estrechas que posee y que limita el paso de moléculas.

1.1.1.2. Transporte pasivo a través de las membranas

Los fármacos pueden atravesar por medio de transporte facilitado y mediante transporte pasivo por medio de difusión a lo largo de un gradiente de concentración que depende de la solubilidad de la molécula en la membrana bilipídica.

El transporte pasivo depende de la concentración del fármaco, el coeficiente de reparto entre lípidos y agua. Entre mayor el coeficiente mayor será la concentración del fármaco en la membrana y menor el transporte pasivo.

Así como la superficie molecular en contacto con la membrana (PSA) a mayor superficie de contacto por área menor será el paso a través de la membrana.

Introducción

5

Para aquellos compuestos que son electrolitos dependen del estado de ionización y el pH de la membrana a ambos lados.

1.1.1.3. Electrólitos e influencia del pH

En el paso de las membranas, los fármacos son ácidos o bases débiles en forma ionizada o no ionizada. Las moléculas no ionizadas suelen ser liposolubles y se difunden a través de la membrana celular y las ionizadas pueden penetrar por la membrana lipídica, por su escasa liposolubilidad.

La distribución transmembrana de un electrólito débil suele depender de su pKa y del gradiente de pH entre uno y otro lado de la membrana. El pKa es el pH en el cual la mitad del fármaco (electrólitos débiles) se halla en su forma ionizada. La mucosa gástrica es permeable al fármaco en su estado no ionizado de la sustancia acida y se calcula por medio de la ecuación de Henderson-Hasselbalch:

log [forma ionizada] /[forma no ionizada]= pKa – pH

En el estado estable un fármaco ácido se acumulará en el lado más “alcalino” de la membrana, y un fármaco alcalino, en el lado más ácido, suceso llamado retención de iones.

El transporte de moléculas es por medio de un evento físico y no requiere de un sistema de transporte.

Figura 3. Influencia del pH en la distribución de un ácido débil entre el plasma y el jugo gástrico separados por una barrera de lípidos (Goodman y Gilman 2014).

1.1.1.4 Transporte por la membrana mediado por transportadores.

Es el mecanismo predominante en la eliminación de casi todos los fármacos. El transporte activo depende de energía contra un gradiente, capacidad de saturación, selectividad e inhibición competitiva por compuestos transportados conjuntamente. Se usa para desplazar una molécula en contra de su gradiente electroquímico favorecido por la energía almacenada en la molécula de ATP.

Introducción

6

De este mecanismo existen múltiples ejemplos, transportadores de Ca dependiente de Na K ATPasa, transportadores de glucosa acoplados al Na SGLT1 y SGLT2 que desplazan glucosa a través de la membrana del epitelio digestivo y los túbulos renales combinando el transporte de glucosa con el flujo descendente de Na. (Goodman y Gilman 2014).

En la difusión facilitada de un transportador no existe aporte de energía, y depende del gradiente electroquímico como el caso del transporte de glucosa al músculo determinado por la proteína transportadora de glucosa sensible a la insulina (glucose transporter, GLUT4).

Estos mecanismos son selectivos de las moléculas y facilitan su transporte que por medio de difusión pasiva sería lento.

Existen también factores limitantes como la glicoproteína P del enterocito que limita la absorción oral de los compuestos, exporta fármacos hacia el aparato digestivo, así como de otros tejidos y epitelios y se encarga de la expulsión de moléculas y productos de desecho. (Goodman y Gilman 2014).

1.1.2 Diseño de medicamentos y absorción oral

El diseño de medicamentos para su uso oral se basa desde los años 90 en las reglas establecidas por Lipinski y que determinan de manera general, propiedades físico químicas comunes que influencian la biodisponibilidad de cualquier medicamento administrado por vía oral. Estas reglas predicen una absorción de al menos el 20% de la molécula (no son 5 si no 4 en múltiplos de 5) (Lipinski, et all 2001).

Reglas para el diseño de medicamentos orales

1. No más de cinco donadores de enlaces por puentes de hidrógeno (átomos de nitrógeno u oxígeno con al menos un átomo de hidrógeno).

2. No contener más de diez aceptores de enlaces por puentes de hidrógeno (átomos de nitrógeno, oxígeno o flúor). Menos de 10 enlaces rotables y menos de 140 Angstroms de superficie de área polar tienen alta probabilidad de tener buena disponibilidad en ratas (Veber, et all, 2002).

3. Debe poseer un peso molecular inferior a 500 Da. El punto de corte de 500 daltons separa aquellos que tienen adecuada biodisponibilidad de aquellos que tienen biodisponibilidad aceptable, además en relación con el aumento de los enlaces rotables, la superficie de área polar y el conteo de enlaces de hidrógeno. (Veber, et all., 2002)

4. Debe poseer un coeficiente de reparto octanol-agua (log P) inferior a 5

Después de esta publicación ha sido de interés validar los resultados que influencian la absorción de medicamentos. Se encontró por ejemplo, que la aumentada flexibilidad molecular mediada por la cantidad de enlaces rotables, la baja superficie de área polar determinada por la suma de átomos de nitrógeno y oxígeno, y el conteo total de uniones de hidrógeno (aceptores y donadores) son importantes predictores de biodisponibilidad oral independiente

Introducción

7

del peso molecular. La superficie de área polar reducida se correlaciona mejor con el incremento en la permeabilidad de lo que lo hace la lipofìlia (log P), y el incremento en los enlaces rotables tiene un efecto negativo en la rata de permeación (Veber, et all., 2002).

La permeación de las membranas es un requisito para la biodisponibilidad oral, en ausencia del transporte activo y es dependiente de las 5 reglas de Lipinski. Se asocia con mayor biodisponibilidad oral cuando hay menor peso molecular, menos enlaces rotables, menor conteo de donadores de hidrógeno y superficie de área polar.

Así mismo existen limitantes de la biodisponibilidad gastrointestinal:

1. Transporte de membrana basal dependiente de energía. 2. Enzimas de primer paso hepático, citocromos, glicosilación, sulfatación,

glucoronización etc. Estos procesos son específicos de la estructura a diferencia del paso por la membrana intestinal.

3. A mayor rigidez molecular, hay mayor cantidad de enlaces rotables y mayor peso molecular.

En estudios de disponibilidad en ratas cuando el 65 % de las moléculas analizadas tienen menos de 7 enlaces alcanzan más del 20% de biodisponibilidad oral, y cuando tienen más de 10 enlaces el 75% tienen menos del 20% de biodisponibilidad oral.

1.1.3. Absorción oral de medicamentos más allá de las 5 reglas de Lipinski

Las 5 reglas de Lipinski son una serie de normas aplicadas al descubrimiento de medicamentos para priorizar aquellos compuestos con mayor probabilidad de absorción oral. Sin embargo, muchos de los fármacos actualmente en uso incluyendo antibióticos, se encuentran más allá de estas reglas y propiedades como la unión de hidrógeno intramolecular, macrocilación, dosificación y formulaciones se pueden usar para mejorar la biodisponibilidad. Se prefiere la ruta de administración oral de medicamentos por la mayor aceptabilidad por los pacientes, porque garantiza la permeabilidad de las células expuestas a nivel intestinal con un área de superficie expuesta grande y mayor confiabilidad de la exposición (Doak, et all 2014).

Se debe tener en cuenta los factores que determinan la absorción oral de los medicamentos, como son:

1. Disolución de la presentación. 2. Estabilización en el tracto gastrointestinal.

El pH estomacal es de 1 a 2 en ayunas y de 3 a 7 posterior a la alimentación, mientras que el pH intestinal es de 4 en ayunas y de 6 a 6,6 post alimentación.

3. Absorción: La mayoría de los medicamentos se absorben en la primera sección del intestino duodenal por las 3 vías descritas en la sección de farmacocinética y farmacodinamia.

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• Paracelular entre los enterocitos: Se absorben principalmente moléculas hidrofílicas con peso molecular menor de 350 Daltons y baja lipofìlia log D 7,4 pasando entre los enterocitos. Aquellas altamente lipofilicas pueden no disolverse o no separarse de la membrana y limitar su absorción (Doak, et all, 2014).

• Transcelular por difusión pasiva entre los enterocitos: el más común para los fármacos.

• Transporte activo a través de proteínas: algunas moléculas análogas de péptidos, aminoácidos, lípidos y azúcares.

4. Metabolismo de primer paso a nivel hepático: La biodisponibilidad oral es una fracción de la que se absorbe el metabolismo de primer paso en el hígado y dependerá de la administración, siendo mayor la de la vía oral. Sufre distintos procesos de biotransformación, desaturación, difusión, resolución, desolvaltación que requiere de baja polaridad y que dependerán de las propiedades de la molécula como el tamaño, polaridad, lipofìlia, dinámica conformacional (Doak, et all. 2014).

La mayoría de los antibacterianos actúan a través de dianas proteícas bacterianas, que tienen propiedades fisicoquímicas dentro del rango clásico para medicamentos orales dirigidos contra proteínas humanas, mientras que los que actúan contra riboproteínas bacterianas caen más allá del límite superior de los 5 de Lipinski y son más polares (Mugumbate y Overington G., 2015)

1.1.4 Relación entre el blanco y las propiedades físico químicas de los fármacos antibacterianos

Los fármacos antibacterianos ocupan una región diferenciada del espacio físico químico en comparación con los demás fármacos dirigidos al ser humano. Los antibacterianos tienen mayor peso molecular, menor log P y mayor superficie de área polar. La lipofìlia es una propiedad físico química distinta entre los medicamentos usados en humanos y los antibióticos con una menor lipofìlia para los antibióticos humanos en general (Leeson, y Davis. 2004).

Se ha encontrado que los antibacterianos que forman complejos con riboproteínas caen fuera del espacio que ocupan los fármacos humanos, mientras que aquellos que forman complejos con proteínas de membrana cumplen las reglas de los 5 de Lipinski (Lipinski, et all 2001) (Mugumbate, G., 2015).

A finales de los años 90 se establecieron reglas que definirían la investigación de fármacos orales, los 5 de Lipinski, (Lipinski, et all 2001).. Investigaciones posteriores establecieron la importancia de la superficie de área polar y el log P como determinantes de la absorción, ambos pueden por si solos predecir una absorción alta o baja 90 o 30% con un 95% de confianza, con un rango de PSA menor de 131,6 Å y log P de 5,88 (Veber, et all., 2002).

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Se encontró que si una molécula tenía menos de 10 enlaces giratorios, un PSA menor o igual a 140 Å y menos de 12 donantes o aceptores de hidrógeno, tenían mejor biodisponibilidad en modelos en ratas (Veber, et all., 2002).

Esto no solo está limitado a la masa general de bacterias si no que existen características que pueden ser distintas para gram positivos y gram negativos y que pueden usarse para el campo de investigación y el tratamiento de las enfermedades infecciosas. Para bacterias gram positivas se ha descrito un peso molecular medio de 813 Da y para gram negativos, son moléculas más pequeñas con un peso molecular medio de 414 Da, lo que está determinado por la necesidad del paso por bombas de membrana (Mugumbate y Overington G., 2015)

La hipótesis que plantean estos resultados es, si las distintas propiedades fisicoquímicas se relacionan con sus propiedades naturales y el tipo de diana molecular y son responsables de la eficacia del tratamiento. Diferentes sitios de unión de acuerdo a las familias de antibióticos y las dianas moleculares correspondientes determinarán características fisicoquímicas distintas, (proteínas individuales, familias de proteínas, complejos de proteínas, Riboproteinas) (Mugumbate, G., 2015):

• Dirigidos a riboproteínas son más pequeños y lipofílicos.

• Dirigidos a lipoproteínas son más grandes, con alta polaridad y no siguen las reglas de Lipinski.

El peso molecular de los antibióticos: 80% de los que tienen unión a riboproteínas tienen un peso molecular >500 Da, ej. Quinupristina > 1000 Da. (Este tipo de antibióticos se caracterizan por su presentación que es de administración endovenosa), 80% de los que tienen unión a proteínas bacterianas tienen peso molecular menor de 500 Da, 93% de los antibióticos que tienen acción contra proteínas humanas tienen < 500 Da, esto debido a que en su mayoría son de administración oral. Esto contrasta con los datos obtenidos de los antibióticos, por ejemplo pirazinamida 123 Da, quinupristina 1040 Da, tetraciclinas 400 a 500 Da, aquellos de mayor tamaño molecular como aminoglucósidos tienen exclusivamente administracion parenteral (Mugumbate y Overington G., 2015)

La lipofilicidad y polaridad de los antibióticos: Son compuestos grandes y polares con baja lipofìlia; antibióticos como los aminoglucósidos tienen muy baja lipofìlia. Ej. Neomicina peso 614 Da, logP -8,96, amikacina 585 Da, log P -8,43, paromomicina 615 Da, log P -8,67.

Los bolsillos de unión a riboproteínas son estructuras grandes >10 Å, son ambientes ricos en nucleótidos altamente polares debido a la presencia de grupos fosfato en el ARN y mayor cantidad de N y O polares. Las tetraciclinas forman un sistema de anillos fusionados con grupos altamente polares formando una red densa de enlaces de hidrógeno con ion magnesio y residuos de nucleótidos que se unen al sitio primario del ribosoma 30s. Para una unión fuerte y efectiva a sus objetivos las moléculas pequeñas diseñadas deben

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coincidir con la arquitectura de los sitios de unión de sus respectivos objetivos, moléculas hidrofóbicas se unen a sitios de unión hidrofóbicos por fuerzas de dispersión. Las moléculas grandes y polares formarán enlaces de hidrógeno e interacciones iónicas y puentes de sal (Mugumbate y Overington G., 2015)

1.1.5. Panorama actual del desarrollo de antibióticos, retos y nuevos desarrollos

Ha existido una disminución considerable en el desarrollo de nuevos antibióticos, y en las pasadas décadas la aprobación de nuevas moléculas ha contrastado, con el aumento de las cepas resistentes a múltiples antibióticos. Las causas para esto han sido varias, es menos atractivo económicamente tratar una infección bacteriana con los costos de investigación, producción con esquemas de tratamiento cortos, a tratar enfermedades crónicas o incluso virales como el VIH, en las que el paciente toma la medicación por largos periodos de tiempo, haciéndolo económicamente más rentable. Hasta el momento el gobierno federal de los Estados Unidos, el Instituto Nacional de Salud de los estados Unidos y la FDA han promovido la investigación y han establecido reglas en la conducción de estudios en busca de nuevas moléculas para su aprobación, además de recomendaciones por parte de la FDA, el Centro para Control de Enfermedades Infecciosas CDC y la Sociedad de Enfermedades Infecciosas de América en cuanto al tratamiento de las enfermedades infecciosas, con el fin de evitar el sub-diagnóstico, así como el uso inadecuado de esquemas de tratamiento antibiótico que contribuyen a mayor resistencia bacteriana (Nambiar, S. 2014).

La investigación enfrenta varios problemas por la alta tasa de resistencia bacteriana, fracaso en la creación de nuevos antibióticos y el fracaso en un enfoque genómico, que no tiene en cuenta la expresión proteínica en los organismos. Así como problemas en el tratamiento de las enfermedades infecciosas por coinfección, la duración de los tratamientos en aquellas enfermedades como el HIV que requieren de terapias prolongadas o permanentes y retrasos en el tratamiento, como el caso de la infección por tuberculosis que requiere del tratamiento con múltiples drogas por periodos prolongados (Mugumbate y Overington G., 2015) 1.1.6. Barrera de permeabilidad en Gram Negativos Existen múltiples problemas para encontrar nuevas moléculas de antibióticos contra bacterias gram negativas resistentes a múltiples fármacos, lo que significa un desafío. Durante las últimas décadas y con la aparición de resistencia, se han hecho estudios sobre lo factores que influencian la resistencia, y se ha encontrado la barrera de permeabilidad como el principal obstáculo. Actualmente se intenta comprender la estructura molecular de la membrana externa de los gram negativos, y las propiedades físicas y químicas de los compuestos y su permeación a través de las membranas, para evitar la

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fuerte corriente de eflujo. Existe aún un vacío del conocimiento muy amplio sobre las reglas de permeación y la manera de superarlos. Principales dificultades: 1. La permeabilidad a las drogas por la conformación de la membrana de las bacterias gram negativas, estas bacterias se consideran inherentemente resistentes a los antibióticos y generan infecciones con alta mortalidad. 2. Para las bacterias gram negativas respecto a gram positivas tiene menor tasa de éxito en encontrarse nuevas moléculas por la conformación de la doble bicapa de lípidos. 3. Menor tasa de aciertos en los ensayos de búsqueda (Silver, L. L. 2011). 4. La susceptibilidad depende del flujo a través de la membrana externa de dos flujos opuestos por medio de porinas y canales inespecífico (Li, X. Z., Plésiat, P., & Nikaido, H. (2015). 5. Esta membrana externa es más rígida constituida por una bicapa asimétrica de lipopolisacáridos y fosfolípidos. La presencia de LPS hace más lento el paso de los compuestos hidrofóbicos, mientras que por los poros estrechos se limitan por tamaño la penetración de los fármacos hidrofílicos. 6. Transportadores de eflujo multifármaco, que expulsan sustancias bioactivas entre ellas antibióticos a través de la membrana interna y reducen las concentraciones de antibióticos en el citoplasma, y transportadores de eflujo adicionales que expulsan del periplasma al medio externo. Todas estas fuerzas que impiden el ingreso y promueven la salida de fármacos en bacterias gram negativas le confieren su resistencia a múltiples fármacos (Zgurskaya, H. I., 2015). La composición de las bicapas y sus propiedades determinan su permeabilidad. Tanto de la composición de las que contienen LPS como la de las porinas (Li, X. Z., Plésiat, P., & Nikaido, H. (2015). La estructura básica de lípido A contiene una cadena principal de diglucosamina bisfosfato acilada y N-terminal. Existen variaciones en los grupos acilo primario y secundario (tipo de ácidos grasos). Así como las condiciones del medio contenido de agua y de electrolitos como el magnesio que modifican la cantidad de ácidos grasos y las condiciones de acilación del lípido A. Los núcleos de LPS y de antígeno A se modifican de acuerdo a las condiciones de crecimiento y tensiones específicas, y estas condiciones modifican la permeabilidad de la membrana y desestabilizan el LPS; estos cambios modifican el entorno de las proteínas que están incrustadas en la membrana externa y las interacciones proteína - proteina (Zgurskaya, et all., 2015). Proteínas de membrana externa y relación con la permeabilidad: (Tabla 1) son tanto las proteínas integrales de membrana, las porinas, otras proteínas menores o porinas específicas, receptores de membranas, componentes de sistemas de exportación, proteínas de biogenes de pilis, flagelos y enzimas. Las porinas tienen un límite de exclusión de 600 Da, y las moléculas de antibióticos más grandes penetran por difusión lenta. La interacción de proteínas de

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membrana y porinas con moléculas de antibióticos y la ausencia en mutantes de estas porinas determina la entrada del antibiótico y de la muerte del patógeno. Sin embargo, estas porinas en su estructura son específicas de especie y su tamaño varía de acuerdo a cada una de ellas, en tamaño y permeabilidad, selectividad y velocidad de absorción de nutrientes para cada una de las bacterias gram negativas (Zgurskaya, H. I., 2015). Bombas de eflujo de membrana externa han sido identificadas para las bacterias gram negativas, con al menos un transportador multifuncional de flujo de salida que le confiere protección contra agentes antimicrobianos, actúan múltiples antibióticos por medio de una proteína periplasmática a través de un canal periplasmático, su funcionamiento es dependiente de transferencia de protones a través de la membrana periplasmática, por la carga que genera el paso de las moléculas del medio citoplasmático al periplasma (Van den Berg, B. 2012). Propuesta de nuevos enfoques para superar la barrera de permeabilidad en gram negativos 1. Inhibición de nuevos objetivos accesibles en la membrana o periplasma. Representados por las polimixinas y los lipopéptidos cíclicos catiónicos, se unen a LPS y permeabilizan la membrana externa, aunque tóxicos han sido la tabla de salvación en infecciones multiresistentes. Burkholderia spp. son intrínsecamente resistentes a los péptidos catiónicos, pero tienen una alta eficacia contra las entero bacterias susceptibles, P. aeruginosa y A. baumannii. 2. Identificación de vías de captación y el enfoque del "caballo de Troya" Enfoque de absorción rápida o facilitada de un antibiótico, para contrarrestar el eflujo y aumentar la concentración intracelular. P. aeruginosa y otras especies Gram-negativas mantienen sus demandas metabólicas por medio de porinas y un sistema de absorción, y estas pueden alterarse para permitir la captación de antibióticos (Eren, E., 2013) (Van den Berg, B. 2012). El enfoque de Caballo de Troya se basa en la asociación de antibióticos a moléculas de hierro, estos se pueden transportar al periplasma y el citoplasma por transportadores de hierro. Un transportador de membrana se une al hierro y al sideroforo, facilitado por la carga y lo trasloca al espacio periplasmático, y de igual manera ingresa al citoplasma. Aprovechando este enfoque se puede facilitar el ingreso de antibióticos al citoplasma incluso en aquellos con resistencia a múltiples fármacos (Schalk, I. J., 2012). (Page, M. G., 2010).

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Tabla 1. Proteínas de membrana externa y relación con la permeabilidad (Zgurskaya, H. I., 2015).

Bombas principales de Porinas y Eflujo de bacterias Gram-Negativas representativas

Especies Permeabilidad relativa de ME

(%)

Principales porinas generales

Principales bombas de eflujo

E. coli 100 OmpF / OmpC AcrAB-TolC

P. aeruginosa

.0,106 OprF MexAB-OprM, MexXY-

OprM

B. cepacia 11 OpcP1 / OpcP2 AmrAB-OprA, BpeAB-

OprB, BpeEF-OprC

A. baumannii

0,105 OmpA-AB AdeABC y AdeIJK

1.1.7 Resistencia a múltiples antibióticos Las infecciones causadas por bacterias resistentes son más difíciles y más costosas de tratar debido a que estas bacterias presentan distintos mecanismos de resistencia a uno o más grupos de antibióticos dejando pocas opciones para su tratamiento (Coates, Halls, & Hu, 2011). Estudios epidemiológicos muestran un fenómeno interesante en el cual cuando existe un germen resistente a una familia de antibióticos, existe también una mayor probabilidad de resistencia a otra familia de antibióticos. Estas bacterias resistentes pueden presentar diferentes mecanismos genéticos, proteómicos o de transcripción implicados en la aparición de estas cepas multidrogoresistentes. En este sentido, también se plantea que hay mecanismos compartidos entre las distintas cepas, tanto en bacterias gram positivas y gram negativas como en micobacterias (Chang et al., 2015). Desde hace más de 100 años se usa la teoría de un coctel de antibióticos para el tratamiento de las infecciones por TBC para evitar la aparición de cepas resistentes a antibióticos. Esta teoría consiste en utilizar varios antibióticos al tiempo con el fin de superar posibles mecanismos de resistencia de las cepas. Para ello se usa el cálculo del tamaño de la población bacteriana (N) y la frecuencia de bacterias resistentes a los medicamentos (P) usados en la terapia. Si el producto N*P es mucho menor que 1, entonces las bacterias presentes en el huésped serán susceptibles puesto que no presentan resistencia a todos los medicamentos administrados. En este sentido, es factible predecir la aparición de resistencia durante el tratamiento, la cual es más probable si hay más de un mutante resistente para más de un antibiótico,

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puesto que puede pasar dicha resistencia a las demás bacterias (Chang et al., 2015). Por lo anterior, es importante utilizar tecnologías de diagnóstico molecular de las cepas resistentes para así evitar el retraso en el ajuste de la terapia antibiótica, mejorando a su vez el pronóstico de tratamiento y evitando la presión de selección y aparición de nuevas cepas resistentes (Hingley-wilson et al., 2013). Los mecanismos por los cuales la resistencia bacteriana avanza y se mantiene en el tiempo son secundarios al uso de antibióticos, ya que estos generan la susceptibilidad de cepas y la aparición de mutantes resistentes, que a su vez pueden compartir dicha resistencia a otras cepas. La resistencia también depende de la farmacocinética del antibiótico, una bacteria puede ser sensible en razón de la concentración mínima inhibitoria MIC, y en la práctica ser resistente durante la terapia (por sus siglas en inglés Minimal Inhibitory Concentration) (Chen, Lu, Lin, Lin, & Chen, 2011). Finalmente, otro aspecto que se debe tener en cuenta en la administración de terapias antibióticas es la aparición de resistencia en gérmenes no patógenos, por esto, administrar antibióticos de espectro estrecho protege a la flora comensal de la exposición a antibióticos que puedan generar resistencia y por lo tanto, nuevas mutantes (Gupta et al., 2011). 1.1.8 Bacterias multidrogo resistentes El desarrollo de nuevos medicamentos ha mejorado la calidad de vida alrededor del mundo, y en particular, el descubrimiento de nuevos antibióticos ha permitido el tratamiento de las infecciones causadas por bacterias desde su descubrimiento. Sin embargo, la prevalencia de las enfermedades infecciosas no ha disminuido, debido a la capacidad que tienen estos microorganismos para adaptarse y expresar resistencia (Cherkasov et al., 2014). Es por esto, que en la época actual se presentan múltiples infecciones causadas por bacterias gram positivas y gram negativas resistentes a antibióticos y que constituyen un potencial problema de salud pública. Un ejemplo de estas bacterias multidrogo resistentes es Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA), agente gram positivo común en infecciones comunitarias y del ambiente hospitalario, y causante tanto de infecciones triviales como de aquellas capaces de comprometer la vida. En los últimos años se han reportado cepas resistentes a múltiples antibióticos y a nuevos antibióticos como glicopéptidos (Haque et al., 2010; Klevens et al., 2007). Así mismo preocupa los elevados costos de salud derivados de la morbilidad y mortalidad causados por esta infección (Nguyen, D. 2013). La OMS ha lanzado una alerta por la creciente resistencia bacteriana. Así como el problema de la falta de investigación de antibióticos ha llevado al punto del descubrimiento de sólo 4 nuevas moléculas en los últimos 40 años. Se necesita que tanto la industria farmacéutica como la academia unan esfuerzos en la investigación de nuevas moléculas de antibióticos. Los costos de la

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investigación hasta llegar a fase III son altos y pueden ser alrededor de US $ 70 millones. En 2009 se propuso una iniciativa para incentivar no solo la inversión por empresas farmacéuticas grandes y además, ahora la de la inversión de pequeñas empresas con insuficiente capital pero suficiente experiencia. Adicionalmente se promete incentivos económicos, duración de las patentes y subsidios para la formación de nuevas empresas de biotecnología, y los gobiernos a su vez, ahorrarían los costos de morbimortalidad con 2 millones de infecciones anuales y más de $ 20 mil millones anuales en costos de salud (Cooper. 2011). No existe a la fecha un solo antibiótico al cual no se haya descrito algún tipo de resistencia. El enfoque actual de la resistencia y la terapia antibiótica se basa en el concepto de la viabilidad in vitro, y se propone un enfoque a variadas dianas bacterianas buscando aquellas que causan el mayor daño y enfermedad al hospedero como son los mecanismos de virulencia, disminuyendo los efectos adversos como la alteración de la flora bacteriana endógena y la presión de selección (Clatworthy, A. E., 2007). De acuerdo al centro de control y prevención de enfermedades CDC (por sus siglas en inglés Center for Disease Control and Prevention), se necesita urgentemente de soluciones para al menos 15 microorganismos clasificados en tres categorías: Amenazas urgentes, amenazas serias y amenazas de cuidado (Ver Tabla 2). Tabla 2. Clasificación de microorganismos considerados como amenaza de acuerdo al CDC. https://www.cdc.gov/drugresistance/biggest_threats.html

Microorganismo Número de infecciones por año

Amenazas Urgentes

Clostridium Difficile 250.000

Enterobacteriaceae resistente a los carbapenemes

9.000

Neisseria gonorrhoeae 246.000

Amenazas Serias Acinetobacter multidrogo resistente

7.300

Campylobacter resistente 310.000

Candida resistente fluconazole

3.400

Bacterias productoras de betalactamasas de espectro extendido

26.000

Enterococos resistentes a la vancomicina

20.000

Pseudomonas aeruginosa multidrogo resistente

6.700

https://www.cdc.gov/drugresistance/biggest_threats.html

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Microorganismo Número de infecciones por año

Salmonela no tifoidea

resistente 100.000

Salmonela serotipo Typhi

resistente 3.800

Shigella resistente 27.000

Staphylococcus aureus resistente a la meticilina

80.461

Streptococcus pneumoniae resistente

1.200.000

Mycobacterium Tuberculosis resistente

1.042

Amenazas de Cuidado

Staphylococcus aureus resistente a la vancomicina

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Streptococcus del grupo A resistentes a eritromicina

1.300

Streptococcus del grupo B resistentes a clindamicina

7.600

Es por esto que la creciente resistencia a los antibióticos establece un reto y existe la necesidad de descubrir nuevos fármacos con potencial bactericida o bacteriostático, con mecanismos de acción novedosos y que puedan contrarrestar los mecanismos de acción natural de resistencia de las bacterias (Kelley et al., 2011).

Se requiere la creación de nuevas terapias antibióticas con mecanismos de acción novedosos, menos propensos a la resistencia bacteriana, con mecanismos de acción específicos de clase y que reduzcan la carga de drogas (Mugumbate y Overington G., 2015)

El objetivo de la investigación se debe centrar en las etapas I y II del desarrollo de antibióticos basados en las propiedades fisicoquímicas de los medicamentos y modelos basados en los ya descubiertos para determinar que compuestos pueden ser candidatos para remplazarlos (Mugumbate y Overington G., 2015)

1.1.9 Diseño de medicamentos asistido por computador

El primer gran paso para el diseño de medicamentos asistidos por computador fue la secuenciación del genoma humano que permitió a los científicos la identificación de nuevos objetivos terapéuticos, el conocimiento de las

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estructuras de las proteínas y de los objetivos moleculares a los cuales dirigir las terapias (de Ruyck, et all. 2016).

El diseño de medicamentos dirigido requiere la identificación de nuevos objetivos, requiere la caracterización de vías bioquímicas específicas contra cepas resistentes y se ve limitado por la eficacia, toxicidad, reacciones adversas a medicamentos y resistencia a múltiples fármacos. El enfoque tradicional basado en los ensayos fenotípicos celulares omite el complemento de validación de la interacción objetivo – agente activo, por lo que seguirá siendo necesario y valido en el proceso de investigación, pese a que no pueden confirmar el mecanismo molecular de su unión con el ligando (Wang, L., Le, X. 2014).

La combinación de métodos de diseño de medicamentos y técnicas fenotípicas para corroborar in vitro la actividad de un fármaco puede ayudar para construir modelos predictivos de detección virtual (Wang, L., Le, X. 2014).

El proceso para producir un nuevo medicamento involucra varios pasos como la selección de la enfermedad, la hipótesis del blanco a utilizar, la identificación de los compuestos potenciales, la optimización de los compuestos y las pruebas pre-clínicas y clínicas, entre otros. En este sentido, la demora en uno de estos pasos, implica la demora en todo el proceso de descubrimiento de una nueva medicina. Es por esto, que las herramientas computacionales han surgido como una potencial solución a los largos tiempos y costos asociados al proceso de producción de un nuevo medicamento (Firdaus Begam & Satheesh Kumar, 2012) (Xu & Hagler, 2002).

Por otra parte, las industrias farmacéuticas han recurrido a tecnologías tales como la química combinacional, en la búsqueda de nuevas moléculas que pudieran convertirse en medicamentos. Sin embargo, debido a la gran cantidad de moléculas que se pueden generar con esta tecnología es necesario crear filtros que permitan seleccionar aquellas moléculas que tengan las características indicadas para determinada actividad biológica (Xu & Hagler, 2002).

Es así como surge la quimio informática, la cual consiste en la aplicación de técnicas informáticas en el área de la química farmacéutica. Estas técnicas permiten transformar los datos en información útil al momento de seleccionar moléculas en el proceso de descubrimiento de medicamentos. Los métodos de la quimio informática se deben aplicar al momento de hacer el screening de los compuestos, para tratar de asegurar que cumplan propiedades óptimas ADMET (absorción, distribución, metabolismo, excreción y toxicidad) en aquellos que puedan ser seleccionados (Firdaus Begam & Satheesh Kumar, 2012) (Xu & Hagler, 2002).

A su vez, las herramientas de bioinformática utilizan la información estructural de una proteína o de un ligando, y a través de algoritmos de acoplamiento, identifican blancos y agentes potenciales. En este sentido, se debe identificar

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una molécula que cumpla con una serie de condiciones ideales tales como especificidad, esencial en caso de antibióticos, estabilidad y que sea fármaco elegible. Adicionalmente, se busca que sea una molécula pequeña que se pueda unirse al sitio activo del blanco deseado y que pueda propiciar la actividad biológica deseada (McPhillie et al., 2015).

Por otra parte, QSAR nace hace más de 50 años como la extensión de la química orgánica, usando métodos de análisis de regresión para analizar una gran cantidad de datos de miles de moléculas. La combinación del trabajo del científico computacional y del químico es fundamental para la predicción de la estructura y la síntesis del producto (Cherkasov et al., 2014).

Adicionalmente, QSAR se basa en la relación cuantitativa entre estructura y actividad, y utiliza propiedades fisicoquímicas, que permitan separar grupos de compuestos de acuerdo a su actividad biológica (McPhillie et al., 2015). Estas técnicas permiten predecir nuevas relaciones de una posible actividad biológica con respecto a los cambios estructurales, y a partir de estas relaciones es posible predecir, de manera teórica, la posible actividad biológica de bibliotecas de compuestos y moléculas (Bueso-Bordils et al., 2017). Por lo tanto, los métodos QSAR permiten identificar familias de compuestos con estructuras similares. De esta forma, una nueva molécula que sea parecida en estructura a una familia de compuestos, tiene una buena probabilidad de tener la misma actividad biológica (Cherkasov et al., 2014).

De manera similar, un modelo farmacóforo se utiliza para definir los rasgos estructurales o químicos de una molécula, que son necesarios para interactuar con un receptor y que pudieran ser responsables de la actividad biológica, ya sea estimulando o bloqueando al receptor. Entre los rasgos utilizados por un modelo farmacóforo se encuentran: si la molécula es hidrófoba, aromática, aceptora de hidrógeno, catiónica o aniónica, puentes de hidrógeno y las interacciones con sus receptores de acuerdo a su polaridad (McPhillie et al., 2015).

En el diseño de medicamentos también se utiliza la topología molecular para desarrollar modelos que sean capaces de clasificar compuestos de acuerdo a su potencial actividad antimicrobiana contra gram positivos como S. Aureus. Por ejemplo, el trabajo de Bueso-Bordils y colaboradores (Bueso-Bordils et al., 2017), utilizó descriptores topológicos entre los que se encuentran descriptores estructurales 2D, para predecir la posible actividad antimicrobiana.

Otro enfoque utilizado, consiste en analizar estructuralmente el blanco deseado, su función biológica y el sitio de unión, y se buscan o diseñan moléculas que puedan tener una mejor orientación en este sitio activo, logrando así una mejor actividad biológica. Un ejemplo de este tipo de enfoque se puede encontrar en el trabajo de Raj K. y colaboradores (Raj et al., 2015).

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1.1.10 Descriptores moleculares

En términos generales un descriptor molecular puede ser visto como un valor numérico que brinda información sobre la estructura, la composición, la topología y las características químicas de una molécula. Estos descriptores son ampliamente utilizados en el diseño de medicamentos asistido por computador y por lo general se agrupan en dos categorías: descriptores QSAR 2D y descriptores QSAR 3D (Dudek, Arodz, & Gálvez, 2006).

Los descriptores de la primera categoría no necesitan información de la estructura tridimensional de la molécula puesto que estos miden las propiedades topológicas y geométricas. En esta categoría los descriptores se pueden agrupar en descriptores constitucionales, electrostáticos y químico-cuánticos, topológicos, geométricos, basados en fragmentos y huellas moleculares. Por el contrario, los descriptores 3D QSAR necesitan la conformación del compuesto a nivel experimental o mediante técnicas de mecánica molecular. Estos descriptores ofrecen información acerca de la estructura y se pueden organizar en los siguientes grupos: descriptores para el análisis comparativo del campo molecular, descriptores para el análisis comparativo de índices de similitud molecular, descriptores para el análisis de momento molecular comparativo, descriptores moleculares invariantes holísticos ponderados, descriptores independientes de la malla (Dudek, Arodz, & Gálvez, 2006).

1.1.11 El proceso del diseño de fármacos basado en la estructura

El proceso de diseño de fármacos basados en su estructura es repetitivo, con múltiples ciclos. El primero de ellos requiere determinar mediante bases biologías y bioquímicas la estructura de la proteína, del ácido nucleico, proteína de acople de membrana como proteína G, canales iónicos, proteasas, quinasas, receptores nucleares, de hormonas, al cual se va a hacer diana en un sitio de unión pequeño, el cual puede ser modulado a distinta potencia, por cualquiera de los métodos disponibles como clonación, purificación y determinación por cristalografía de rayos X, RMN o modelado de homología. Se seleccionan compuestos o fragmentos de compuestos de bases de datos que interactúan con el fragmento diana y se hacen puntuaciones, mediante algoritmos informáticos. Clasificándose por sus interacciones estéricas y electrostáticas para elegir los mejores candidatos, para posteriormente optimizar la potencia del compuesto, determinar su estructura y mejorando su unión y la especificidad para el objetivo. (Anderson, A. C. 2003)

Cuando se unen a proteínas el objetivo es modular su funcionamiento, mientras que las de origen bacteriano es la inhibición total de la bacteria y con esto lograr la muerte.

Los fármacos dirigidos contra blancos microbianos requieren varios requisitos esenciales:

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1. Que sean únicos del patógeno.

2. Que cumplan una función única en el patógeno.

3. Que puedan ser inhibidos por una molécula pequeña.

4. La diana debe ser esencial en el ciclo de vida para que genere la muerte.

5. El objetivo debe ser único y no ser capaz de desviar la función por un inhibidor o mediante una vía alterna.

En ocasiones las macromoléculas no cumplen estos requisitos por lo que se diseñan inhibidores aprovechando las diferencias estructurales. En este caso puede ser una alternativa la inhibición de enzimas bacterianas en sus sitios de unión que inhiban las formas activas de ellas. El paso siguiente después de determinar el blanco es determinar su estructura precisa mediante cristalografía de rayos X, RMN y modelado de homología. La estructura por cristalografía es la más frecuente y más usada, y puede determinar desde unos pocos aminoácidos hasta 998 kDa (Nissen, P.2000). Se puede utilizar el método de RMN que da los datos más cercanos de la estructura terciaria de la diana en cuestión y de modelo de homología. A estos datos se añaden átomos de hidrógeno ausentes en los modelos de cristalografía, protonación y estados tautoméricos de los residuos, así como el estado de los residuos de histidina (Anderson, A. C. 2003).

Con la identificación de la proteína diana, se identifica el sitio especifico de unión con sus características, de donantes y aceptores de hidrógeno, características de hidrofobicidad, en el caso de enzimas el sitio de activación, o de unión con otra proteína. Cuando el objetivo es ARN tiene la ventaja de ser específico de especie, e incluso específicos de una enfermedad (Lind, K. E. 2002; Shortridge, M. D., 2015). Ya identificado se pueden usar los métodos de generación virtual por inspección de las moléculas ya conocidas, las cuales se modifican y se unen al sitio. Mediante cribado virtual en bases de datos de moléculas pequeñas identificadas y con funciones que pueden predecirse in silico o de generación de Novo pueden ser sintetizados y probados (Anderson, A. C. 2003). La figura 4 muestra un esquema del proceso de generación de medicamentos.

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Figura 4. El proceso de diseño de drogas basado en la estructura (adaptado de Anderson, A. C. 2003).

Diferencias en propiedades fisicoquímicas de fármacos y antibióticos

Las propiedades físico químicas entre compuestos dirigidos contra proteínas humanas y de patógenos ha sido tema de constante estudio, comparando los antibióticos actualmente comercializados con bases de datos de productos con potenciales dianas, con serias dificultades para convertirlos en potenciales antibióticos. Se cree que se requiere de una cantidad de propiedades fisicoquímicas distintivas del espacio que ocupan las demás drogas. No está claro si estas propiedades fisicoquímicas son las que determinan el espectro de actividad antibacteriana (Ebejer, Chaton., Finn., 2016).

Análisis recientes han estudiado la relación entre la clase de objetivo y las propiedades fisicoquímicas, una distinción entre los antibacterianos dirigidos a las riboproteínas se encuentra en que en promedio estos son grandes y polares, y aquellos con objetivos proteicos, caen dentro de los rangos clásicos similares a las drogas dirigidas contra proteínas humanas (Mugumbate y Overington G., 2015)

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Datos más recientes de los fármacos antibacterianos de moléculas pequeñas disponibles en ChEMBL, analizó compuestos con actividad e inactividad, provenientes de ensayos bioquímicos e inhibición del crecimiento. Se subdividieron en análisis de quimiotipo y espectro contra bacterias Gram-positivas y negativas. Se compararon con fármacos antibacterianos comercializados y otros fármacos (Ebejer, Chaton., Finn., 2016). . Analizaron de la base de datos distribuciones de peso molecular, LogD calculado, TPSA y número de enlaces giratorios para compuestos antibacterianos de ChEMBL-20. El peso molecular promedio es más alto para los compuestos antibacterianos y aquellos bioquímicamente activos (definidos como aquellos con al menos un estudio que demuestra actividad antibacteriana), de acuerdo con la tendencia observada que mayor peso molecular se asocia con una mayor afinidad por el blanco. El 75% de los antibacterianos comercializados tienen un peso molecular inferior a 500 Da. 70,4% de los activos antibacterianos tienen un log P que cae dentro de la regla de los 5. Aquellos antibacterianos, biológicamente activos y medicamentos no antibacterianos comercializados tienen propiedades relacionadas con la polaridad, donantes de enlaces de hidrógeno, el aceptor de enlaces de hidrógeno y las distribuciones de TPSA son similares en todas las categorías de fármacos antibacterianos, bioquímicos y comercializados. Solo el TPSA es distinto a los demás grupos con TPSA inferior a 120 Å2 con 52.6% para los antibacterianos comercializados (Ebejer, Chaton., Finn., 2016). .

Los medicamentos comercializados en estos estudios son consistentes con los previos siendo más polares, con un logP medio calculado menor, recuentos de donantes y aceptadores elevados y TPSA mayor. Sin embargo, el análisis del estudio de la base de datos de ChEMBL indica que este no es un perfil necesario para obtener actividad antibacteriana. Las razones para no encontrar diferencias en los compuestos comercializados a diferencia de los compuestos de investigación, es que las familias de antibióticos constituyen pequeñas variaciones de moléculas estructuralmente relacionadas con escasos quimiotipos. La alta polaridad de los compuestos no la hace una propiedad necesaria para ser antibacterianos. Para la administración intravenosa la alta solubilidad es requisito clave para ser eficaz. Al desarrollar un fármaco después de las fases necesarias para su comercialización su actividad antibacteriana es solo una de las que debe cumplir, por lo que las demás propiedades definen características de la molécula para su actividad biológica, y un perfil farmacocinético adecuado como la solubilidad para la administración intravenosa (Ebejer, Chaton., Finn., 2016). . No hay diferencia en la flexibilidad de las moléculas. En este estudio no hubo diferencia tampoco en las propiedades analizadas y el espectro para gram negativos y gram positivos. Sin embargo, se sabe que los antibióticos con espectro para gram negativos tienden a ser fármacos de administración endovenosa con mayor peso molecular mayor de 800 Da, mayor lipofìlia y alta polaridad (Leeson, y Davis. 2004).

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No hay claridad sobre el mecanismo de muerte bacteriano determinado por las propiedades fisicoquímicas de los compuestos comercializados y se necesitan estudios adicionales.

1.1.12 Moléculas naturales como potenciales medicamentos y antibióticos.

En los últimos años, se han descubierto múltiples compuestos de origen natural o derivados sintéticos con aplicaciones en distintos ámbitos, en especial en el área de la medicina. Entre estos compuestos se encuentran los detergentes que alteran la permeabilidad de la membrana de algunas bacterias. Adicionalmente, también se ha logrado determinar que la variación de las estructuras de los compuestos está relacionada con un cambio en la actividad biológica, y que variaciones sencillas pueden hacer que un compuesto sea más activo contra un tipo específico de agente bacteriano (Soukup et al., 2016).

En este sentido, el diseño asistido por computador se ha convertido en una poderosa y rutinaria herramienta para el diseño de medicamentos. Distintos métodos computacionales, bibliotecas biológicas y software, comparan miles compuestos y se pueden crear modelos que permitan identificar potenciales moléculas con actividad farmacológica de acuerdo a propiedades fisicoquímicas y electrofísicas (Shin et al., 2017).

En los últimos años, se han identificado en productos naturales sustancias con propiedades biológicas, antibacterianas, entre otras, que son de gran interés académico y farmacéutico. En especial, en la búsqueda de nuevos agentes antibacterianos, las moléculas de origen natural han ganado un gran interés considerando que las bacterias han desarrollado resistencia a agentes terapéuticos sintéticos (Taylor, 2013). Sin embargo, pese a lo alentador de la gran cantidad de probables agentes naturales efectivos contra bacterias, no es posible realizar pruebas experimentales para todas las moléculas de origen natural y es necesario utilizar técnicas computacionales, (como QSAR) que permitan seleccionar aquellas moléculas que tengan una buena probabilidad de tener actividad antibacteriana.

Nuevas fuentes de antibacterianos de origen natural

Nuevas Fuentes de antibióticos están disponibles en la naturaleza, provenientes de frutas, vegetales, nueces, semillas, tallos y flores. Existe evidencia que compuestos extraídos de estos tienen propiedades antioxidantes, antiinflamatorias, antibacterianas, anticancerígenas, especialmente los taninos y flavonoides provenientes de la dieta (Coppo, A. 2014).

Polifenoles: se pueden clasificar por su estructura química, fuente de origen y función biológica. De acuerdo a su estructura química, los compuestos fenólicos tienen al menos un anillo aromático con uno o más grupos hidroxilo y se dividen en flavonoides y no flavonoides, poseen bajo peso molecular por la combinación de derivados de fenilalanina y ácido acético. Su origen es

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ampliamente distribuido en la naturaleza y en los productos de la dieta, se han descubierto en ellos propiedades antioxidantes como oxidantes y protectores cardiovasculares, con aplicaciones en procesos de inflamación crónica y enfermedades degenerativas, las propiedades oxidantes dependerán de la estructura del polifenol y el estado de óxido reducción celular, nivel de proteínas celulares, capacidad de eliminación de oxidantes y lípidos (Chen, L. 2014).

Los taninos son moléculas de alto peso molecular de 3000 hasta 30000 Da, que varían en su estructura química y actividad biológica.

Existen estudios y publicaciones amplias en cuanto a la actividad biológica de cada uno de los compuestos derivados de las dos familias y su espectro de acción contra gram positivos y gram negativos. Estos compuestos encontrados en alimentos como el propoleo, té verde, cítricos, extractos de bayas y uvas, tienen alta concentración de polifenoles con actividad antibacteriana como se muestra en la Tabla 3 (Chen, L. 2014). Mediante distintos mecanismos, alteran funciones de la membrana, inhibiendo factores de virulencia, como enzimas y entero toxinas, la formación de biopelículas bacterianas y bloqueando receptores de señales.

Aún se requiere estandarización de métodos de cultivos en caldo y discos de dilución para establecer la MIC y posteriores ensayos in vivo. En este momento son objeto de amplia investigación en la búsqueda de moléculas de acción antimicrobiana no sólo contra bacterias sino además contra virus y parásitos.

Tabla 3. Compuestos naturales con potencial actividad antibacteriana (Chen, Lu, Lin, Lin, & Chen, 2014).

FLAVONOIDES

flavonoles

Galangina

S. aureus

Enterococcus spp.

S. pyogenes

P. aeruginosa

Quercitina

S. aureus

S. epidermidis

B. subtilis

B. cereus

M. lentus

E. coli

S. enteridis

C. pneumoniae

Resveratrol C. pneumoniae

Ramnentina C. pneumoniae

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FLAVONOIDES

Morina S. enteridis

B. cereus

Flavonas e isoflavonas

Apigenina

S. aureus

B. subtilis

E. coli

K. pneumoniae

S. entertidis

P. aeruginosa

A. niger

C. albicans

Luteolina

S. aureus

B. subtilis

E. coli

P. fluorescens

Genisteina V. harvey

Flavanonas

Naringenin

S. aureus

S. epidermidis

B. subtilis

M. luteus

E. coli

P. aeruginosa

L. lactis

H. pylori

Eryodictiol

E. coli

S. enterica

P. putida

B. subtilis

L. innocua

L. lactis

S. aureus

S. cerevisiae

Hesperetin

E. coli

S. enterica

P. putida

H. pylori

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FLAVONOIDES

Flavon 3-ol

EGCG S. aureus

S. aureus S. mutans

S. mutans E. coli

E. coli P. aeruginosa

P. aeruginosa K. pneumoniae

K. pneumoniae Candida spp.

Candida spp. Dermatophytes

EGC E. Coli

TANNINS

Condensated tannins

E. coli

P. aeruginosa

S. mutans

Taninos Gallotannina Hidrolizable

E. coli

Salmonella spp.

V. cholera

S. aureus

S. epidermidis

S. mutans

S. salivarius

L. acidophylus

POLIFENOLES NO FLAVONOIDES

Phenolic acid

P. aeruginosa

M. catarralis

S. aureus

E. faecalis

L. monocytogenes

S. mutans

1.1.13 Efecto sinérgico de antibióticos y extractos de plantas

Debido a la creciente resistencia antibacteriana, una estrategia que se plantea es la combinación de terapias antibióticas y compuestos extraídos de plantas con propiedades bioactivas, entre ellas antibacterianas (fitofármacos). El por qué de esta estrategia es potenciar la acción biológica contra gérmenes multidrogoresistentes, además de ser extremadamente agresivos como el

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Staphylococcus aureus meticilino resistente (SARM) (Malani, P. N. 2014; Stefani, S., 2012). La combinación de extractos de plantas en combinación con los antibióticos es una alternativa plausible desde el punto de vista de investigación para disminuir la resistencia bacteriana. Extractos de 4 plantas usados como inhibidores de proteínas de unión a betalactámicos PBP2a o PBP4 con buenas propiedades similares a las de los fármacos, ofrecen buenos resultados disminuyendo la MIC contra SARM. Esta estrategia de terapia combinada ya ha sido utilizada con buenos resultados con este mismo fin, potenciando la acción de dos grupos de antibióticos distintos y disminuyendo la probabilidad de efectos adversos (Fujimura, S., 2015; El Haj, C., 2015). El efecto sinérgico de antibióticos y fitofármacos de experiencia en la medicina tradicional China ya ha sido evaluado con resultados prometedores, y han sido evaluados contra cepas de SARM logrando una disminución de la MIC. En estos estudios se identificaron además las propiedades fisicoquímicas que determinan absorción, distribución, metabolismo y excreción (ADME) y la seguridad del fármaco. Todo lo anterior con el fin de superar los problemas de seguridad y verificar su potencial farmacoelegibilidad, requisitos importantes para disminuir el tiempo de generación de un fármaco comercializable.

Se han documentado estudios de fitofármacos de medicina tradicional China con propiedades terapéuticas contra enfermedades infecciosas, por lo que se han realizado ensayos in silico con el fin de confirmar o descartar moléculas bioactivas como posibles tratamientos (Barlow, D. J., 2012; Zuo, G. Y., 2012).

Dos características importantes se resaltan de este tipo de ensayos:

1. Se utilizan estructuras cristalinas obtenidas para comparar in silico con los componentes bioactivos de los extractos de plantas.

2. En los ensayos in silico se retienen las moléculas de agua porque aumentan la precisión de acoplamiento, porque pueden tener enlaces cruzados entre proteínas y ligandos que ayudan a estabilizar el complejo proteína-ligando.

Objetivos

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2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GENERAL

Establecer reglas de diseño para moléculas con actividad antibacteriana contra bacterias gram-positivas y fármaco elegibles, y utilizarlas para seleccionar moléculas naturales de la librería de la compañía Interbioscreen con potencial actividad antibacteriana https://www.ibscreen.com/natural-compounds

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Describir las principales propiedades físicas y químicas de las moléculas de la librería de compuestos antibacterianos de la compañía Asinex y de los antibióticos aprobados por la FDA y de uso clínico contra bacterias gram-positivas. http://www.asinex.com/antibacterial_compound_library-html

Establecer reglas de diseño para moléculas con actividad antibacteriana contra bacterias gram-positivas y fármaco elegibles.

Identificar moléculas de la librería de compuestos naturales de la compañía Interbioscreen que cumplan con las reglas de diseño previamente establecidas.

https://www.ibscreen.com/natural-compoundshttps://www.ibscreen.com/natural-compoundshttps://www.ibscreen.com/natural-compoundshttp://www.asinex.com/antibacterial_compound_library-htmlhttp://www.asinex.com/antibacterial_compound_library-html

Metariales y Metodos

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3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. MATERIALES

3.1.1. Librería de compuestos

Para el desarrollo del presente proyecto se hizo uso de la librería de compuestos antibacterianos de la compañía Asinex (http://www.asinex.com/antibacterial_compound_library-html/, último acceso Junio 8 de 2018), y la librería de compuestos naturales de la compañía Interbioscreen (https://www.ibscreen.com/natural-compounds, último acceso Junio 8 de 2018). Ambas librerías están disponibles para realizar análisis computacionales sin ningún costo. Adicionalmente, se tuvo en cuenta la información disponible para aquellos antibióticos aprobados por la FDA más reconocidos, de uso más amplio, aprobados para uso humano, vinculando así la mayor parte si no la totalidad de los antibióticos actualmente en uso, con evidencia clínica comprobada en el tratamiento de enfermedades infecciosas. En este sentido, la información de cada uno de ellos fue consultada de la base de datos DrugBank (https://www.drugbank.ca/, último acceso Junio 8 de 2018) y su correspondiente estructura química fue descargada en formato SDF para su posterior análisis computacional. 3.1.2. Librerías de código y software Durante el desarrollo de este proyecto se hizo uso de las siguientes librerías de código y softwares:

Las librerías Pybel (licencia Apache 2.0) (O`Boyle et al., 2008), ChemoPy (artistic license/GPL) (Hu, et all., 2013), Pychem 2.0.0 (artistic license/GPL) (Jarvis et al., 2006) y RDKit: Open-source chemoinformatics (www.rdkit.org, licencia BSD, último acceso Junio 8 de 2018), fueron utilizadas para la manipulación de los archivos de las moléculas y el cálculo de los descriptores moleculares.

El software libre DataWarrior (licencia GNU) (Sander et al., 2014) fue utilizado para visualizar las estructuras de las moléculas.

El lenguaje estadístico R (https://www.r-project.org/) fue utilizado para realizar las pruebas estadísticas entre los diferentes grupos de antibióticos. Las gráficas de cajas y bigotes también fueron realizadas con este lenguaje.

El lenguaje de programación Python 2.7 fue utilizado para la selección de las moléculas naturales de la librería de la compañía Interbioscreen, que pudieran tener actividad contra bacterias gram

Metariales y Metodos

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positivas. Adicionalmente, también se seleccionaron moléculas naturales con potencial actividad contra bacterias gram negativas, de posible administración oral, administración endovenosa, moléculas con probabilidad de atacar complejos de proteínas, proteínas individuales y riboproteínas.

Los scripts de código desarrollados para poder llevar a cabo los cálculos y análisis se pueden consultar en el Anexo A.

3.2. MÉTODOS

3.2.1. Creación de grupos de antibióticos Para la librería de antibióticos aprobados por la FDA creada en este trabajo, se crearon varias clasificaciones de los antibióticos. Teniendo en cuenta la forma de administración se organizaron en 4 grupos: a) endovenosa, b) oral, c) intramuscular y endovenosa, y d) endovenosa y oral. Considerando el espectro de acción, los antibióticos se organizaron en tres grupos: a) gram positivos (gram+), b) gram negativos (gram-) y c) gram positivos y negativos (gram+/-). Con respecto al blanco que atacan en las bacterias, estos compuestos fueron organizados en tres grupos: a) complejo de proteínas, b) proteína individual, y c) riboproteína. Finalmente, los antibióticos fueron organizados por familias en donde sólo aquellas familias que tuvieran más de cinco compuestos fueron seleccionadas: a) aminoglu