UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS …¢nstter... · 2015. 5. 5. · orientadora: drª...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
HANSTTER HALLISON ALVES REZENDE
PREVALÊNCIA DE PARASITOS INTESTINAIS EM GATOS
ERRANTES EM GOIÂNIA – GOIÁS: ÊNFASE NO
DIAGNÓSTICO DE Toxoplasma gondii EAVALIAÇÃO DA
ACURÁCIA DE TÉCNICAS PARASITOLÓGICAS
Goiânia
2015
TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA
DISPONIBILIZAR AS TESES E
DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG
Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de
Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações
(BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Leinº 9610/98, o documento
conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de
divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
1. Identificação do material bibliográfico: [X] Dissertação [ ] Tese
2. Identificação da Tese ou Dissertação
Autor (a): HANSTTER HALLISON ALVES REZENDE
E-mail: [email protected]
Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [X]Sim [ ] Não
Vínculo empregatício do autor Secretaria Municipal de Saúde de Aparecida de Goiânia
Agência de fomento: Fundação de Amparo a pesquisa de
Goiás
Sigla: FAPEG
País: Brasil UF: GO CNPJ:
Título: PREVALÊNCIA DE PARASITOS INTESTINAIS EM GATOS ERRANTES EM GOIÂNIA – GOIÁS: ÊNFASE NO
DIAGNÓSTICO DE Toxoplasma gondii EAVALIAÇÃO DA ACURÁCIA DE TÉCNICAS PARASITOLÓGICAS.
Palavras-chave: Toxoplasmose, parasitos intestinais, gatos errantes, acurácia diagnóstica
Título em outra língua: PREVALENCE OF INTESTINAL PARASITES IN STRAY CATS IN GOIÂNIA, GOIÁS: EMPHASIS
OF DIAGNOSTIC Toxoplasma gondii AND EVALUOTION ACCURACY PARASITOLOGY
TECHNIQUES.
Palavras-chave em outra língua: Toxoplasmosis, intestinal parasites, stray cats, accuracy diagnostic
Área de concentração: Parasitologia
Data defesa:(dd/mm/aaaa) 20/02/2015
Programa de Pós-Graduação: Medicina Tropical e Saúde Pública
Orientador (a): Ana Maria de Castro
E-mail: [email protected]
Co-orientador (a):* Marina Clare Vinaud
E-mail: [email protected]
*Necessita do CPF quando não constar no SisPG
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apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat.
________________________________ Data: 20/02/2015
Assinatura do (a) autor (a)
1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste
prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão
disponibilizados durante o período de embargo. iii
ii
HANSTTER HALLISON ALVES REZENDE
PREVALÊNCIA DE PARASITOS INTESTINAIS EM GATOS
ERRANTES EM GOIÂNIA – GOIÁS: ÊNFASE NO
DIAGNÓSTICO DE Toxoplasma gondii E AVALIAÇÃO DA
ACURÁCIA DE TÉCNICAS PARASITOLÓGICAS
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de PósGraduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás para obtenção do título de Mestre em Medicina Tropical e Saúde Pública. Área de concentração em Parasitologia. Orientadora: Profª Drª Ana Maria de Castro
Co-orientadora: Profª Drª Marina Clare Vinaud
Goiânia
2015
iii
iv
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Públicada Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Aluno: HANSTTER HALLISON ALVES REZENDE
Orientadora: DRª ANA MARIA DE CASTRO
Co-orientadora: DRª MARINA CLARE VINAUD
Membros:
1. DRª ANA MARIA DE CASTRO – IPTSP/UFG
2. DR. EVERTON KORT KAMP FERNANDES – IPTSP/UFG
3. DRª JULIANA BOAVENTURA AVELAR – UniRV
4. DRª TATIANE LUIZA DA COSTA (Suplente) – HC/UFG
5. DR. SÉRGIO HENRIQUE N. COSTA (Suplente) – PUC GOIÁS
6. DRª LILIANE DA ROCHA SIRIANO (Suplente) – HC/UFG
Data: 20/02/2015
v
“O topo da inteligência é alcançar a humildade”
Pensamento Judaico
vi
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar agradeço a Deus por sempre me conduzir e me dar
a oportunidade de ser um eterno estudante, contribuindo com a comunidade
científica.
Agradeço a minha orientadora Drª Ana Maria de Castro, por sempre
acreditar no meu potencial, e me mostrar como posso cada dia me tornar
uma pessoa melhor.
Agradeço a toda minha família por sempre acreditar que eu sou capaz,
mesmo quando surgia uma enorme dúvida na minha mente, e por sempre
me apoiarem, mesmo não entendendo muito bem toda essa dedicação aos
estudos. Aos meus pais Sirlene Alves e Almiro Rezende, aos irmãos
Grackélly e Rafael. Tios queridos Lindomar, Patrícia e Lucirene. Avós
Aledicia e Lindolfo, aos que não estão mais comigo Altina e Sebastião. Aos
primos Luma, Guilherme, Débora, Wélica, Weila e Wérica.
A co-orientadora Drª Marina Clare Vinaud pelas incansáveis
colaborações para que o trabalho fosse realizado, ao professor Dr. Éverton
Kort Kamp Fernandes pela atenção e disposição em ser o veterinário
participante do projeto. A professora Drª Joana D’arc pelas colaborações e
dúvidas a respeito de Toxoplasma gondii. Ao professor Dr. José Clecildo
Barreto pelo companheirismo, dedicação e por buscar a inovação tecnológica
em nosso instituto. A professora Drª Mirian Dorta pela disposição em retirar
dúvidas sobre procedimentos experimentais. A professora Eliana Isac, por ter
se tornado uma grande companheira da pós-graduação.
Aos funcionários do IPTSP pela dedicação e carinho, ao José
Clementino, Marco Antônio, Jéssica e a técnica do LAERPH que esteve por
muitos anos ao meu lado, agora aposentada, a querida Marli.
Aos meus amigos que fiz no IPTSP, Juliana Boaventura, Francesca
Chapadense, Liliane Siriano, Tatiane Luiza da Costa, Aline Barbaresco,
Carolina Fraga, Carolina Aguiar, Lilian Cristina, Heloísa Storchilo, Ildefonso
Júnior Kamilla Soares, Marcos Gontijo, Luciana Damascena, Letícia Leandro,
Taynara Batista e Vitor Alves.
vii
Aos meus amigos de todas as horas, Rafael Brandão, Caroene Martins,
Alcilas Júnior, Jhonathan Rocha, Jaqueline Sousa, Mônica Alves, Jacqueline
Rodrigues, Nayra Dias e Larissa Rezende por estarem presentes nas horas
boas e difíceis.
Aos meus colegas de trabalho da Secretaria Municipal de Saúde de
Aparecida de Goiânia pelo carinho e pela compreensão em meus momentos
de ausência, em especial as biomédicas Alice Queiroz, Fabiely Rodrigues,
Kelly Galvão e aos técnicos de laboratório Marlene Soares, Amós Virgínio,
Donizete José, Helena, Terezinha, Wallyson Martins e Loyane Ribeiro.
A todos os funcionários do Centro de Controle de Zoonoses de
Goiânia, pela atenção e paciência, em especial a médica veterinária Sabrina
Arruda.
A fundação de amparo à pesquisa de Goiás (FAPEG) pela concessão
da bolsa de mestrado.
A todos meus sinceros agradecimentos.
viii
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS.............................................................................................. V
SUMÁRIO............................................................................................................... VII
TABELAS, FIGURAS E ANEXOS.......................................................................... IX
SIMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS.............................................................. X
RESUMO................................................................................................................ XI
ABSTRACT............................................................................................................. XII
1 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 01
1.1 PRINCIPAIS PARASITOS EM GATOS................................................... 01
1.2 TOXOPLASMOSE: ASPECTOS GERAIS E HISTÓRICOS.................... 03
1.3 Toxoplasma gondii: CLASSIFICAÇÃO E CICLO BIOLÓGICO............... 04
1.4 EPIDEMIOLOGIA DA INFECÇÃO POR Toxoplasma gondii................... 08
1.5 A TOXOPLASMOSE NO GATO.............................................................. 09
1.6 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE PARASITOS INTESTINAIS........ 11
1.7 DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO EM GATOS.......................................... 12
2 JUSTIFICATIVA................................................................................................... 15
3 OBJETIVOS......................................................................................................... 16
3.1 OBJETIVO GERAL.................................................................................. 16
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................................... 16
4 METODOS........................................................................................................... 17
4.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO.............................................................. 17
4.2 DESCRIÇÃO DO GRUPO DE ESTUDO................................................. 17
4.3 COLETA DAS AMOSTRAS FECAIS....................................................... 17
4.4 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS FECAIS.................................... 17
4.4.1 – Método de Sheather (S) – 1923.................................................... 18
4.4.1.1Material utilizado....................................................................... 18
4.4.1.2 Preparação da solução e Sheather, densidade 1,2 g/mL......... 18
4.4.1.3 Procedimento técnico................................................................ 19
4.4.2 – Método de Faust e Colaboradores (F) – 1938............................... 19
4.4.2.1 Material utilizado........................................................................ 19
4.4.2.2 Preparação da solução de Sulfato de Zinco.............................. 20
ix
4.4.2.3 Procedimento técnico.................................................................. 20
4.4.3 – Método de Hoffman, Pons e Janer ou Lutz (HPJL) – 1919/1934.. 21
4.4.3.1 Material utilizado........................................................................ 21
4.4.3.2 Procedimento técnico................................................................ 21
4.4.4 – Método de Willis (W) – 1921..................................................... 21
5.4.4.1 Material utilizado........................................................................ 22
5.4.4.2 Preparação da solução de NaCl, densidade 1,20 g/mL............ 22
5.4.4.3 Procedimento técnico................................................................ 22
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA......................................................................... 22
4.6 SOROLOGIA DOS GATOS PELO TESTE DE AGLUTINAÇÃO
MODIFICADO (MAT)
24
4.6.1– Preparo do antígeno para o MAT................................................... 24
4.6.2– Realização do MAT........................................................................ 25
5 RESULTADOS..................................................................................................... 26
6 DISCUSSÃO........................................................................................................ 30
6.1 – Prevalência de parasitos intestinais e soroprevalência de anticorpos anti-
T.gondii...................................................................................................
30
6.2 – Avaliação da acurácia das técnicas parasitológicas............................. 33
7 CONCLUSÕES.................................................................................................... 36
REFERÊNCIAS...................................................................................................... 37
ANEXO I – Parecer do comitê de ética................................................................... 53
ANEXO II – Artigos................................................................................................. 56
x
TABELAS E FIGURAS
Figura 1: Morfologia geral da forma taquizoíto de Toxoplasma 05 gondii.
Figura 2: Cisto no cérebro de um camundongo infectado com 06 Toxoplasma
gondii, CEPA ME49, ampliação de 400 vezes.
Figura 3: Oocisto de Toxoplasma gondii esporulado em material a 07 fresco, ampliação de 400 vezes, régua micrométrica na escala de 10µm.
Figura 4: Ciclo de vida do Toxoplasma gondii. 08
Figura 5: Prevalência de parasitos intestinais em 154 amostras 26
fecais de gatos errantes capturados pelo Centro de Controle de Zoonoses de
Goiânia-Goiás por um período de doze meses.
Tabela 1: Resultados de sorologia anti-Toxoplasma gondii em gatos
domésticos, em inquéritos realizados em estados do Brasil.
14
Tabela 2: Tabela de contingência 2x2. 23
Tabela 3: Escala de concordância do índice k. 24
Tabela 4: Prevalência de parasitos intestinais em gatos errantes capturados
pelo centro de zoonoses em Goiânia-Goiás.
27
Tabela 5: Avaliação da acurácia das técnicas de Sheather, Faust e
Hoffman-Pons-Janer-Lutz em relação à técnica de Willis (padrão-ouro),
para o diagnóstico de Ancilostomídeos.
27
Tabela 6:Avaliação da acurácia das técnicas de Sheather, Faust e
Hoffman-Pons-Janer-Lutz em relação à técnica de Willis (padrão-ouro),
para o diagnóstico de Cystoisospora sp.
28
Tabela 7:Avaliação da acurácia das técnicas de Sheather, Faust e
Hoffman-Pons-Janer-Lutz em relação à técnica de Willis (padrão-ouro),
para o diagnóstico de Toxoplasma gondii.
28
Tabela 8: Avaliação da concordância através do índice kappa (k) pelas
técnicas de Sheather, Faust e Hoffman-Pons-Janer-Lutz em relação à
técnica de Willis (padrão-ouro).
29
Tabela 9: Resultados da sorologia por MAT para Toxoplasma 29
gondiiem amostras de soro de gatos errantes capturados pelo Centro de Controle de Zoonoses em Goiânia-Goiás.
xi
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
µL Microlitro
2-ME 2 – Mercaptoetanol
AIDS Acquired immunodeficiency syndrome
CEUA Comitê de ética para Uso de Animais
cm Centímetro
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
F Faust
FAE Formalina-Acetato-Etila
H3BO3 Ácido Bórico
HAI Hemaglutinação Indireta
HIV Vírus da Imunodeficiência Adquirida
HJPL Hoffman-Janer-Pons-Lutz
IFI Imunofluorescência Indireta
IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoglobulina M
IPTSP Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública
K Ìndice kappa
LAERPH Laboratório de Estudos da Relação Parasito-Hospedeiro
M Molar
MAT Teste de Aglutinação Modificado
mg Miligramas
mL Mililitro
µm Micrômetros
NaCl Cloreto de Sódio
NaOH Hidróxido de Sódio
PBS Tampão Fosfato Alcalino
RPM Rotações Por Minuto
S Sheather
UFG Universidade Federal de Goiás
VIF Vírus da Imundeficiência Felina
VPN Valor Preditivo Negativo
VPP Valor Preditivo Positivo
W Willis
ZnSO4 Sulfato de Zinco
xii
RESUMO
O gato doméstico é um importante transmissor de agentes zoonóticos para o
homem, em especial Toxoplasma gondii. O gato infectado é capaz de
eliminar milhões de oocistos no meio ambiente, provocando uma
contaminação maciça nestes locais, sendo considerado um problema de
saúde pública. A toxoplasmose é uma doença com alta prevalência em todo
o mundo, sendo o gato responsável pela perpetuação do parasito. Avaliar a
acurácia de métodos parasitológicos é de extrema importância para melhorar
o diagnóstico laboratorial veterinário, utilizando testes de alta sensibilidade,
especificidade e reprodutibilidade. O objetivo deste trabalho foi verificar a
prevalência de parasitos intestinais em gatos errantes em GoiâniaGO,
verificar a soroprevalência de anticorpos anti-T. gondii pelo teste de
aglutinação modificado (MAT) e realizar a avaliação da acurácia de técnicas
parasitológicas aplicadas no diagnóstico de parasitos intestinais. Foram
coletadas 155 amostras de fezes no ano de 2012 no Centro de Controle de
Zoonoses de Goiânia-GO e 50 amostras de sangue de gatos no mesmo
período. As amostras de fezes foram processadas pelos métodos de Willis
(padrão-ouro), Sheather, Faust e Hoffman-Janer-Pons-Lutz (HJPL). Nas
amostras de sangue foi realizado o MAT. A análise de acurácia foi realizada
determinando a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP),
valor preditivo negativo (VPN) e índice kappa (k). A prevalência de parasitos
intestinais no ano de 2012 foi de 71,68% (115/154), sendo os
Ancilostomídeos o helminto mais prevalente 83,48% (96/115), o protozoário
mais prevalente foi Cystoisospora sp. em monoparasitismo 7,83% (9/115). T.
gondii apresentou alta prevalência: 18,27% (21/115). Ao analisar a
soroprevalência de um grupo de 50 animais, 64% (32/50) eram soropositivos
e 36% (18/50) soronegativos. A análise de acurácia demonstrou que as
técnicas de HJPL e Sheather apresentaram associação ao padrão-ouro para
o diagnóstico de parasitos intestinais. No diagnóstico específico de oocistos
de T. gondii a técnica de Faust apresentou melhor acurácia comparada ao
padrão-ouro, com isso ressaltamos a importância do uso de duas técnicas
parasitológicas para o diagnóstico de parasitos intestinais.
xiii
ABSTRACT
The domestic cat is an important zoonotic agent for humans, especially as a
transmissor of Toxoplasma gondii. The cat is capable of the elimination of
millions of oocysts in the environment leading to a massive contamination of
these places and leading to a public health issue. Toxoplamosis is a disease
with high prevalence throughout the world and the cat is responsible for the
parasite’s perpetuation. The evaluation of the accuracy of parasitological
diagnostic methods is of vital importance to improve the veterinarian
laboratory diagnosis through the use of high sensitivity, specificity and
reproducible tests. The aim of this study was to verify the prevalence of
intestinal parasites from stray cats in Goiania-GO, to verify the
seroprevalence of anti-T. gondii antibodies through the modified aglutination
test (MAT) and to perform the evaluation of the accuracy of the parasitological
tests applied. Therefore 155 samples of feces and 50 blood samples from
stray cats from the Zoonosis Center of Goiania were collected during the year
of 2012. The feces samples were processed by the Willis (gold standard),
Sheather, Faust and Hoffman-Janer-Pons-Lutz (HJPL) techniques. The MAT
was performed in the blood samples. The accuracy was performed through
the determination of sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV),
negative predictive value (NPV), and kappa index (k). The intestinal parasites
prevalence in the feces from stray cats was 71.68% (115/154). The most
prevalent helminth was Ancylostomatids (83.48%, 96/115) and the most
prevalent protozoan in monoparasitism was Cystoisospora sp (7.83%, 9/115).
T. gondii presented high prevalence (18.27%, 21/115) in fecal samples, 64%
in blood samples (32/50) while 36% seronegative (18/50). The accuracy
showed that the HJPL and Sheather techniques presented association to the
golden standard for the intestinal parasites diagnosis. For the specific
diagnosis of T. gondii oocysts the Faust techniques was the one with high
accuracy in comparasion to the golden standard, with we emphasize the
importance of using two parasitological techniques for the diagnosis of
intestinal parasites
1
1. INTRODUÇÃO
A domesticação dos gatos surgiu a cerca de 5.000 anos. O homem
primitivo recorreu aos animais para obter proteção, auxílio para o trabalho,
estimulação e prazer pela companhia (BERGLER, 1988). Esta convivência entre
homens e animais está associada ao comportamento social e gregário; os
homens permitem aos animais livre acesso às residências, os animais recebem
um nome, e conseguem ter um tipo de compreensão dos gestos dos humanos
permitindo certa linguagem (THOMAS, 2001; ROSSI, 2004; FARACO, 2008).
O convívio com os gatos influencia o estado psicológico e fisiológico do ser
humano, provoca impacto na pressão sanguínea, sensação de bem estar, além
do desenvolvimento psicológico e social com outras pessoas (BECK; MEYERS,
1996).
Entretanto, o grande número de gatos errantes nas cidades levou os
órgãos governamentais a criarem programas de controle populacional, mas um
controle eficaz deveria englobar ações de educação em saúde, legislação,
controle reprodutivo e registro de animais. Os problemas do crescimento sem
controle da população felina é a poluição ambiental, danos às propriedades
públicas e privadas, risco de mordeduras e transmissão de agentes causadores
de doenças (INSTITUTO PASTEUR, 2000).
O contato entre o homem e os animais domésticos expõe o homem ao
risco de transmissão de agentes zoonóticos (TESSEROLLI; FAYZANO;
AGOTTANI, 2005; SANTOS; CASTRO, 2006). Além de poder expor o homem ao
risco de desenvolvimento de alergia ao pelo e agressões por mordedura (BECK;
MEYERS, 1996).
1.1 PRINCIPAIS PARASITOS INTESTINAIS EM GATOS
Os parasitos de ciclo heteroxeno, além de serem responsáveis
diretamente por danos à saúde de seus hospedeiros habituais podem
ocasionalmente infectar o homem, sendo capazes de acarretar doenças. Tal
situação cria desafios à saúde pública, para planejar estratégias de controle,
triagem dessas doenças de modo prático e abrangente, facilitando o diagnóstico
de pessoas parasitadas (SERRA; UCHÔA; COIMBRA, 2003).
2
As doenças de potencial zoonótico são disseminadas principalmente pelos
gatos errantes, isso pode ocasionar no homem doenças importantes, como a
larva migrans cutânea provocada por Ancylostoma braziliense, e a larva migrans
visceral causada por Toxocara sp. Entre os protozoários, Giardia lamblia,
Cryptosporidium felis e Toxoplasma gondii são os mais frequentes nos gatos
domésticos, por esse motivo os enteroparasitos nos felinos são um risco a saúde
pública (SCHANTZ, 1991; CIMERMAN; CIMERMAN; LEWI, 1999; MCCARTHY;
MOORE, 2000; GUIMARÃES et al., 2005; LIMA et al., 2006; MENDES-DE-
ALMEIDA; SILVA; LABARTE, 2007; THOMPSON; PALMER; HANDLEY, 2007;
FUNADA et al., 2007; PALUDO et al., 2007; MORO et al., 2008; TZANNES et al.,
2008; PALMER et al., 2008).
No Brasil, os helmintos mais prevalentes no gato doméstico são
Ancylostomasp., Toxocara cati e Dipylidium caninum (CÔRTES; PAIM;
ALCENCAR-FILHO, 1988; GENNARI et al., 1999; SILVA et al., 2001; RAGOZO
et al., 2002; SERRA; UCHÔA; COIMBRA, 2003; COELHO, 2008).
Os ancilostomídeos, principalmente A. braziliense, provoca a larva migrans
cutânea, o homem entra em contato com a larva presente no solo, as larvas
penetram na pele através dos pés, pernas, nádegas e mãos. No organismo
humano estas larvas não conseguem completar o ciclo habitual, dessa forma
escavam e escoriam a região da derme e epiderme e morrem. Durante esse
caminho formam lesões serpiginosas em forma de mapa, por esta razão é
conhecida como bicho geográfico em humanos (ARAÚJO; SILVA; LANGONI,
2000; NUNES et al.,2000; REY, 2002; NEVES, 2005).
Entre os protozoários, G. lamblia apresenta alta prevalência (COELHO,
2008). Entre os coccídeos, T. gondii é um parasito importante, pelo gato ser seu
hospedeiro definitivo; os gatos excretam os oocistos de T. gondii na fase aguda
da doença, num período em torno de 30 dias até adquirirem imunidade, isso
denota uma baixa prevalência do parasito em exames parasitológicos nesses
animais adultos, pois estão normalmente infectados cronicamente (DUBEY;
BATTIE 1988).
Todos os felídeos são susceptíveis a infecção por T. gondii, independente
do sexo, idade e raça. Os felídeos menores de um ano de idade podem eliminar
milhões de oocistos no meio ambiente quando infectados. O processo de
3
esporulação no meio ambiente leva de dois a cinco dias, sendo dependente de
condições favoráveis incluindo temperatura, umidade e aeração adequada.
Podendo permanecer viáveis por até 18 meses (DUBEY; SWAN; FRENKEL,
1972). Os gatos podem se reinfectar com diferentes genótipos podendo eliminar
oocistos novamente durante outra fase de sua vida (DUBEY, 1995).
1.2. TOXOPLASMOSE: ASPECTOS GERAIS E HISTÓRICOS
A toxoplasmose é uma zoonose causada pelo protozoário T. gondii, o qual
é um parasito intracelular obrigatório. O parasito foi descrito de forma
independente por Alfonso Splendore, num coelho de laboratório em 1908 em
São Paulo (SPLENDORE, 1908) e por Nicolle e Manceaux no roedor
Ctenodactylus gondii em pesquisas desenvolvidas no Instituto Pasteur de Tunis
(NICOLLE ; MANCEAUX, 1908); na ocasião estes pesquisadores acreditaram se
tratar de uma espécide do gênero Leishmania, sendo denominado de
Leishmania gondii.
Em 1909 Nicolle e Manceaux caracterizaram o parasito como uma nova
espécie, denominaram de T. gondii, sendo Toxoplasma derivado da sua forma
crescente (toxon= arco e plasma= forma, em grego) e gondii deriva do primeiro
roedor onde foi identificado.
Janku em 1923, na cidade de Praga, descreveu o primeiro caso de
toxoplasmose em humanos, sendo identificado na retina de uma criança com 11
meses de idade com hidrocefalia e cegueira (JANKU, 1923). No Brasil Torres em
1927 descreveu o primeiro caso de toxoplasmose no país na cidade de Rio de
Janeiro-RJ, em um recém-nascido falecido no 29º dia de vida (TORRES, 1927)
Levaditi et al., (1929)descreveram os cistos teciduais como o estágio
latente do parasito. Pinkerton e Weinman (1940) foram os primeiros a descrever
um caso de toxoplasmose disseminada em um adulto.
Em 1937 e 1939, Wolf et al., descreveram a toxoplasmose congênita,
Pinkerton e Hendersen em 1940 e 1941 identificaram o parasito como causador
de doença aguda e crônica em seres humanos. A hipótese de que o gato seria o
eliminador do estágio infectante do parasito foi formulada por Hutchison em 1965.
4
Frenkel et al., em 1987 descreveu a fase sexuada no intestino delgado do gato
doméstico, produzindo oocistos nas fezes (FRENKEL et al., 1987). No ano de
1983 Luft et al., relataram o primeiro caso de neurotoxoplasmose em um paciente
com HIV/AIDS, demonstrando a importância da coinfecção em pacientes
imunocomprometidos (LUFT et al., 1984).
1.3. Toxoplasma gondii: CLASSIFICAÇÃO E CICLO BIOLÓGICO
Toxoplasma gondii pertence ao filo Apicomplexa, Classe Sporozoea,
ordem Eucoccida, Subordem: Eimeriina, Família Sarcocystidae e Sub-família
Toxoplasmatinae, Gênero Toxoplasma, apresentando apenas uma espécie válida
T. gondii (LEVINE et al., 1980), sendo capaz de infectar várias espécies de
animais: mamíferos (principalmente carneiro, cabra e porco) e aves (KAWAZOE,
2003). É um parasito intracelular obrigatório, realiza reprodução assexuada
denominada de endodiogenia, e reprodução sexuada no epitélio intestinal de
felídeos, denominada de esporogonia (REY, 2002; SACKS; SHER, 2002).
O protozoário apresenta três formas infectivas distintas: taquizoíto,
bradizoíto (em cistos teciduais) e esporozoíto (em oocistos). Tanto o hospedeiro
intermediário, quanto o definitivo são suscetíveis aos três estágios, podendo
adquirir a infecção pelas vias: Horizontal, através da ingestão de oocistos
esporulados no meio ambiente e pela ingestão de cistos teciduais em carnes
cruas ou mal cozidas e até mesmo vísceras de hospedeiros intermediários, por
transfusão sanguínea e até mesmo transplante de órgãos; e Vertical pela
transmissão transplacentária de taquizoítos. Dessa forma, o parasito pode ser
transmitido entre hospedeiros definitivos e intermediários não necessitando da
presença dos dois tipos de hospedeiros para estabelecer o ciclo (TENDER;
HECKEROTH; WEISS, 2000).
Os taquizoítos (Figura 1) possuem formato de lua crescente, intracelular, é
uma forma de multiplicação rápida, encontrada dentro do vacúolo parasitóforo de
vários tipos celulares, está presente nos líquidos orgânicos, mede 2 µm x 6 µm
de tamanho. Multiplicam-se assexuadamente por endodiogenias repetidas até a
ruptura da célula, esse processo leva a uma intensa reação inflamatória e
5
destruição tecidual, causando as manifestações clínicas da toxoplasmose aguda.
Após um número desconhecido de divisões passam para o estágio de
bradizoítos, dentro dos cistos tissulares, a diferenciação ocorre por fatores
endógenos e exógenos do hospedeiro, como sua imunidade, pH, temperatura e
falta de nutrientes (DUBEY et al., 2004; MONTOYA; LIESENFIELD, 2004;
SKARIAH, MCLNTRYRE; MORDUE, 2010).
Figura 1. Morfologia geral da forma taquizoíto de Toxoplasma gondii. (A) Representação
esquemática. O esquema foi consitituído a partir de cortes aleatórios do parasito observados em
microscopia eletrônica de transmissão. (B) corte longitudinal onde várias das estruturas
representadas em (A) estão assinaladas: N – Núcleo, c – conóide, R – róptrias, A – apicoplasto, CG
– Complexo de Golgi, g – grânulo denso, seta – micronema, VP – vacúolo parasitóforo.
Barra 1µm. Disponível em:
http://revistaseletronicas.pucrs.br/ojs/index.php/scientiamedica/article/viewFile/5957/4881
Os bradizoítos, medem de 1,5 µm a 7 µm de tamanho, formam os cistos
tissulares (Figura 2) que variam de 5 µm a 70 µm, possuindo uma membrana
dupla elástica, contendo poucos a várias centenas de bradizoítos. Os cistos são
as formas de resistência do parasito, intactos e inofensivos podem resistir ao
longo da vida do hospedeiro. São mais prevalentes nos tecidos musculares e
neural, incluindo o cérebro, olhos, músculos cardíaco e esquelético (DUBEY;
FRENKEL, 1976; DUBEY et al., 1998).
6
Figura 2: Cisto no cérebro de um camundongo infectado com Toxoplasma gondii, CEPA ME49,
ampliação de 400 vezes. Fonte: Arquivo do autor.
Quando ingerido por um gato a parede do cisto é digerida por enzimas
proteolíticas no estômago e intestino delgado e então são liberados os
bradizoítos. Alguns penetram na lâmina do intestino e se multiplicam como
taquizoítos e em poucas horas se disseminam pelos tecidos extra-intestinais.
Outros bradizoítos penetram nas células do intestino e iniciam-se as gerações
assexuadas (esquizontes). Os merozoítos, liberados dos esquizontes, formam os
gametas masculinos e femininos. Após a fertilização formam-se as paredes dos
oocistos em volta dos gametas e quando os oocistos se formam são liberados na
luz intestinal através da ruptura das células do epitélio intestinal (DUBEY, 2004).
Os oocistos (Figura 3) são esféricos, com diâmetro de 12 µm e dupla
membrana, sendo esta a forma de resistência ambiental. São eliminados não
esporulados para o meio ambiente, e dentro de cinco dias ocorre à esporulação
dependendo de condições de aeração e temperatura. Cada oocisto esporulado
contêm dois esporocistos elipsoides e dentro de cada um destes existem quatro
esporozoítas, que são infectantes, medindo 2 µm de largura por 6 µm de
comprimento (DUBEY et al., 1972; DUBEY; LINDSAY; SPERR, 1998).
7
Figura 3: Oocisto de Toxoplasma gondii esporulado em material a fresco, ampliação de 400 vezes,
régua micrométrica na escala de 10µm. Fonte: Arquivo do autor.
Oocistos de T. gondii são eliminados pelos gatos domésticos e outros
felinos, resultando na contaminação do ambiente, sendo os gatos domésticos a
maior fonte de contaminação ambiental, pois, uma simples defecação do gato
pode conter em torno de 10 milhões de oocistos. Oocistos não esporulados
podem sobreviver pelo menos três meses no meio ambiente e conservar sua
capacidade de infectar, quando colocados sob condições apropriadas (DUBEY;
BEATTIE, 1988; LINDSAY; BLAGBURN; DUBEY, 2002).
O ciclo de T. gondii é heteroxeno (Figura 4), e possui duas fases distintas:
a fase assexuada ocorre nos tecidos de diversos hospedeiros intermediários
incluindo o homem. A fase sexuada ocorre somente nos gatos e felídeos
silvestres, que são os hospedeiros definitivos. O gato se infecta naturalmente
pela ingestão de oocistos presentes em solo contaminado, e pela ingestão de
roedores com cistos tissulares, além de carcaças e vísceras fornecidos pelo
homem como forma de alimento (DUBEY; LINDSAY; SPERR, 1998; KAWAZOE,
2003).
8
Figura 4: Ciclo de vida do Toxoplasma gondii (Kawazoe, 2003).
1.4. EPIDEMIOLOGIA DA INFECÇÃO POR Toxoplasma gondii
O parasito contém ampla distribuição na natureza, à infecção já foi
comprovada em mais de 30 espécies de aves e 300 de mamíferos. Ocorre com
muita frequência na população humana. Admite-se que 1/3 das pessoas sejam
sorologicamente positivas sob a forma de infecção crônica assintomática. Em
cada região a prevalência varia com a abundância de gatos e com os hábitos
alimentares, sendo que a prevalência aumenta com a idade do indivíduo,
supostamente pelo maior tempo de exposição ao parasito (REY, 2002; HILL;
DUBEY, 2002).
A prevalência de toxoplasmose em adultos varia de acordo com a idade e
a população estudada, este fato ocorre pelas diferentes formas de infecção,
(FEBRASGO, 2011; SILVA, 2011, VAZ et al., 2011; BICHARA, 2012).
9
Dados epidemiológicos demonstram que 50 - 90% da população mundial
apresentam anticorpos sanguíneos contra T. gondii, demonstrando prévia
imunidade (REMINGTON et al., 1995, REMINGTON et al., 2001).
Oocistos infectantes podem sobreviver até 18 meses em condições
adversas, contaminando a água e as pastagens, disseminando por sua vez o
parasito entre herbívoros. Os gatos são susceptíveis em qualquer idade, sexo e
raça, sendo que os gatos infectados congenitamente podem eliminar oocistos
logo ao nascer (DUBEY; SWAN; FRENKEL, 1972; DUBEY; BEATTIE, 1988;
DUBEY et al., 2004).
Humanos imunocompetentes infectados com T. gondii podem ser
assintomáticos, enquanto que em pacientes imunocomprometidos existem altas
taxas de mortalidade (HO-YEN, 1992). A progressão e a severidade da doença
dependem de fatores genéticos relacionados ao hospedeiro e ao parasito
(GROSS, 1996; SUZUKI et al., 1996). É bem conhecido que a virulência do T.
gondii em diferentes animais é dependente do tipo de cepa (JHONSON, 1997). A
identificação de uma possível correlação entre a severidade ou o tipo de doença
e a genotipagem da cepa pode ser muito importante para um tratamento correto
e um possível prognóstico da doença em diversos casos da doença, pois permite
inferir o tipo de cepa identificado com o padrão clínico esperado (SUZUKI et al.,
1996).
As cepas podem ser classificadas em linhagem de tipo I classificadas
como virulentas, tipo II classificadas como avirulentas (crônicas) e tipo III
relacionada com a infecção em animais (HOWE; SIBLEY, 1995; DOLIWA et al.,
2013).
1.5. A TOXOPLASMOSE NO GATO
O gato é o principal responsável pela perpetuação do parasito T. gondii no
meio ambiente, por ser quem produz e elimina oocistos. Os gatos eliminam
oocistos de 7 a 21 dias. Antes de infectantes os oocistos devem esporular, esse
processo dura cerca de cinco dias, assim fezes frescas não representam um
risco para a transmissão (BROWN et al., 2003).
10
O simples fato de possuir um gato como animal de estimação não
configura um risco pra a toxoplasmose, esses animais possuem o hábito de
enterrar suas fezes e de se limpar constantemente e isto retira qualquer resquício
de oocistos do seu pêlo (REIF, 1980). Gatos de companhia são considerados de
baixo risco para infecção por T. gondii em relação aos gatos errantes, pelo
consumo de ração e cuidados do proprietário, porém vale salientar que a ração
tem que obedecer a princípios rígidos de armazenamento e higiene. Mas felídeos
errantes que se alimentam de caça e que defecam em qualquer lugar, são um
risco para a disseminação de oocistos, contaminado o solo e consequentemente
são fonte de infecção para os outros animais, inclusive o homem (JONES et al.,
2001).
Felídeos silvestres tem um papel muito importante na transmissão de T.
gondii. Em alguns ambientes onde não há populações de felídeos, a infecção é
virtualmente ausente, como em pequenas ilhas e atóis, mesmo com a ampla
distribuição mundial do parasito (TENTER et al., 2000). Na Nova Guiné, onde a
presença de gatos domésticos e felídeos silvestres é pouco freqüente,
verificaram uma prevalência inferior a 2% nas populações primitivas. Enquanto a
prevalência em populações humanas que convivem com gatos é de 14 a 34%;
em uma população primitiva da Colômbia a prevalência foi de 50%, mesmo não
havendo gatos, mas essa população se alimentava de felídeos silvestres
(WALLACE; ZIGAS; GAJDUSEK, 1974).
A doença clínica no animal não é muito frequente, mas os sinais e
sintomas clínicos incluem: febre intermitente, apatia, tosse, dispneia, letargia,
anorexia, vômito, icterícia, diarreia, alterações miocárdicas, hiperestesia
muscular, alterações neurológicas e oculares. Fatores iatrogênicos que podem
alterar o sistema imune, como a administração de corticosteroides, ou a infecção
do vírus da imunodeficiência felina (FIV) podem reativar a infecção latente
levando a quadros de toxoplasmose aguda (OLAFSON; MONLUX, 1942, MEIER;
HOLZWORTH; GRIFFITHS, 1957; PETRAK; CARPENTER, 1965; MCKINNEY,
1973; DUBEY, 1986; WITT et al., 1989; HEIDEL et al., 1990; BIRCHARD;
SHERDING, 2003).
O diagnóstico da toxoplasmose nos gatos deve ser baseado em uma
combinação de sinais clínicos, testes sorológicos, demonstração histopatológica
11
do parasito nos tecidos, prova biológica em camundongos e exame de fezes para
o encontro de oocistos. O diagnóstico da toxoplasmose clínica é difícil por
apresentar sinais clínicos variados e inespecíficos. O exame histopatológico é
limitado, enquanto a imunohistoquímica é indicada por ser específica e muito
sensível (SPARKERS, 1991; LINDSAY et al., 1997).
1.6. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE PARASITOS INTESTINAIS
Os exames laboratoriais devem ser utilizados para identificar o agente
etiológico, já que o diagnóstico clínico diferencial é difícil. Para uma identificação
correta é necessária uma coleta bem realizada do material biológico, e uma
conservação adequada para que haja a preservação das estruturas morfológicas
utilizadas para a identificação do parasito. Inúmeros métodos laboratoriais estão
sendo empregados com o objetivo de concentrar as diferentes formas evolutivas
dos parasitos favorecendo um diagnóstico mais fidedigno, como as técnicas de
Faust, Sheather, Willis, Hoffman-Ponjs-Janer-Lutz e Fórmol-éter (DE CARLI,
2001; DE CARLI; OLIVEIRA 2001; MARIANO et al., 2005; MACHADO; SANTOS;
COSTA-CRUZ, 2008).
Mesmo com inúmeros métodos laboratoriais disponíveis para o
diagnóstico de parasitos intestinais, muitos laboratórios fazem a utilização de
forma inadequada de tais métodos, seja pela complexidade operacional, baixa
sensibilidade e falta de pessoal treinado (CHAVES et al., 1979). Dessa forma, a
acurácia do teste parasitológico depende do treinamento do pessoal, recursos do
laboratório e aplicação de procedimentos de controle de qualidade interno e
externo (ASH; ORIEHL, 1991).
O controle de qualidade inclui avaliar a preparação adequada,
armazenamento e preservação dos espécimes submetidos à análise. Neste
aspecto deve-se adotar os seguintes critérios: avaliação permanente dos
reagentes utilizados no laboratório, análise da qualidade da água destilada,
monitoramento de equipamentos, como a centrífuga, banho-maria, microscópio e
vidrarias, supervisão e treinamento periódico da equipe técnica. O uso de
procedimentos operacionais padrão que devem estar disponíveis para os
técnicos e analistas da seção de parasitologia (DE CARLI, 1994).
12
Os analistas clínicos e veterinários buscam uma metodologia
parasitológica específica, sensível, rápida e de baixo custo operacional. A
realização do exame parasitológico de fezes pode indicar o agente etiológico
causador da doença, a carga parasitária, permite o acompanhamento do
tratamento e pode ser utilizado para inquéritos epidemiológicos, para direcionar
as medidas profiláticas locais e verificar a qualidade da saúde da população. Por
esse motivo, o exame parasitológico de fezes é de extrema importância para a
medicina humana e veterinária (VAZ, 2001; SILVA; MENEZES, 2003; MENDES
et al., 2005; TOSATO et al., 2005; MACHADO; SANTOS; COSTA-CRUZ, 2008).
Rotineiramente a técnica empregada no exame parasitológico é a técnica
de Hoffman-Pons-Janer ou Lutz (HPJL), que possui como vantagem a
necessidade mínima de materiais e recursos financeiros, mas como
desvantagem apresenta uma grande quantidade de detritos fecais na amostra,
dificultando a identificação microscópica pelo analista. Além disso, a combinação
de diferentes técnicas parasitológicas é útil para identificar diferentes espécies de
parasitos, aumentando a acurácia diagnóstica (FLANAGAN,1992; TASCA, 2001).
Assim, recomenda-se a coleta de três amostras fecais obtidas em dias diferentes
para aumentar a confiabilidade do resultado do exame parasitológico.
A associação de metodologias é notória no diagnóstico parasitológico,
Menezes et al., (2013) demonstraram que a associação do método HPJL com o
método de centrifugação em formalina-acetato de etila (FAE), melhorou a
acurácia no diagnóstico parasitológico em fezes humanas.
1.7. DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO EM GATOS
A sorologia é o método mais convencional utilizado para o diagnóstico da
toxoplasmose, devido às limitações e dificuldades dos métodos parasitológicos, e
por permitir a identificação da fase clínica da doença em aguda ou crônica.
Geralmente a análise baseia-se na detecção de anticorpos da classe IgG
específica anti-T.gondii em amostras de soro dos felídeos. Anticorpos IgM anti-T.
gondii são importantes para o diagnóstico da toxoplasmose aguda, pois aparece
no soro logo após a infecção e permanece por um curto período de tempo até
haver a soroconversão (ARAÚJO; SILVA; LANGONI, 1998, REY, 2002).
13
A interpretação da sorologia em gatos deve ser acurada, uma vez que
amostras não reagentes indicam que uma infecção no futuro é possível, e um
único título reagente pode indicar imunidade. Gatos recém-nascidos apresentam
títulos de anticorpos da classe IgG que foram passados passivamente pela
barreira placentária pela gata mãe, e esses títulos tendem a diminuir
progressivamente após três meses (FRANKEL et al., 1987, SPARKERS et al.,
1993).
Araújo et al., (1998), explicaram que de uma forma prática a interpretação
da sorologia, por imunofluorescência indireta, nos gatos com suspeita clínica de
toxoplasmose deve ser:
- Títulos iguais ou superiores a 512 podem indicar infecção ativa
recente; - Títulos entre 128 e 256 podem indicar infecção recente, ou
crônica bloqueada;
- Títulos iguais ou inferiores 16 ou 32 podem indicar início da doença
aguda.
O teste de Aglutinação Modificado (MAT) descrito por Desmonts e
Remington (1980), vem sido utilizado para demonstrar aglutininas anti-T.gondii
em diversos animais domésticos e silvestres, pela facilidade metodológica, por
não necessitar de um conjugado espécie-específica, além de possibilitar a
identificação de casos crônicos ou agudos pela adição do 2-mercaptoetanol
(DUBEY, 1986).
Diversos trabalhos no Brasil realizaram a sorologia para T. gondii em gatos
errante, o que mostra a distribuição do parasito por todo o país, sendo realizados
apenas um trabalho na região Nordeste e Nenhum trabalho nas regiões Norte e
Centro-Oeste (Tabela 1). Observa-se uma diferença na prevalência de anticorpos
inclusive na mesma localidade, isso pode ter ocorrido pelos critérios adotados
para definir a amostragem, o período em que a pesquisa foi realizada e a
metodologia utilizada no estudo. Estudos mostram que não há uma diferença
significativa entre o sexo dos animais para a prevalência, mas que animais
adultos possuem uma prevalência maior, isso pode ser devido pelo maior tempo
de vida e consequentemente maior risco do animal entrar em contato com o
parasito (GARCIA et al., 1999, LUCAS et al., 1999, PINTO et al., 2009).
14
Tabela 1: Resultados de sorologia anti-Toxoplasma gondii em gatos domésticos,
em inquéritos realizados em estados do Brasil.
Localidade Método Número de
Gatos
%
Positivos
Referência
Porto Alegre /RS HAI 100 24 MENDEZ, 1983
Araraquara/SP IFI 27 25,9 ROSA et al., 1987
São Paulo/SP IFI 350 37,7 CAMARGO et al.,
1998
Jaguapitã/PR IFI 163 73 GARCIA et al., 1999
SP IFI 115 17,7 LUCAS et al., 1999
SP/PR IFI 191 19,4 LANGONI et al., 2001
Guarulhos/SP MAT 502 26,3 SILVA et al., 2002
Porto Alegre/RS HAI 100 37 ARAUJO et al., 2003
Niterói/RJ HAI 41 21,9 NETTO et al., 2003
PR MAT 58 84,4 DUBEY et al., 2004
SP ELISA 100 40 MEIRELES et al., 2004
SP MAT 237 35,4 PENA et al., 2006
SP IFI 400 25 BRESCIANI et
2007
al.,
Porto Alegre/RS HAI 245 26,9 PINTO et al., 2009
IFI 37,9
Lages/SC IFI 300 14,33 DALLA-ROSA et
2010
al.,
São Luís/MA IFI 200 50,5 BRAGA et al., 2012
IFI: Imunofluorescência Indireta. HAI: Hemaglutinação. MAT: Teste de Aglutinação
Mofidicado. ELISA: Enzimaimunoensaio.
2. JUSTIFICATIVA
O gato doméstico esta cada vez mais presente nos lares dos seres
humanos, no entanto pode transmitir parasitos de interesse zoonótico, sendo que
o contato desses animais infectados com o homem é considerado um problema
de saúde pública (MOOJEN, 1976, TESSEROLLI et al., 2005). Por esse motivo,
15
se torna de extrema importância a verificação da prevalência dos parasitos
intestinais que infectam gatos errantes em Goiânia-GO.
T. gondii é um protozoário de prevalência mundial, com registros em todos
os continentes e em todos os climas devido à transmissão por oocistos liberados
nas fezes dos gatos jovens não imunes. Os gatos e felídeos selvagens são os
únicos animais que podem realizar o ciclo sexuado, eliminando após a
primoinfecção milhões de oocistos imaturos nas fezes. A presença de gatos
errantes pode ser um fator que contribui para elevada prevalência, podendo
contaminar o meio ambiente com milhares de oocistos (KAWAZOE, 2003).
A grande preocupação a respeito da toxoplasmose é a transmissão
congênita. Estudos em Goiânia-GO demonstraram que 34,2% das gestantes
estão sob risco de adquirem a doença com uma taxa de soroconversão de 8,6%
(AVELINO; CAMPOS; CASTRO, 2003). Avelar (2013) demonstrou uma
prevalência de 51,85% de mães cronicamente infectadas com toxoplasmose em
uma maternidade de referência em Goiânia-GO.
Devido a possibilidade de transmissão de parasitos intestinais pelos gatos
errantes, e o seu papel na contaminação do ambiente, é necessária a utilização
de técnicas laboratoriais que apresentem boa sensibilidade, especificidade e
reprodutibilidade para diagnosticar tais parasitos. Assim, a avaliação da acurácia
de diferentes técnicas parasitológicas permite determinar a concordância e
reprodutibilidade para a aplicação destas técnicas no laboratório veterinário.
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Estudar a prevalência de parasitos intestinais em gatos errantes em Goiânia,
Goiás e avaliar a acurácia de técnicas parasitológicas aplicadas para o
diagnóstico de helmintos e protozoários de importância para a medicina
veterinária e humana.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
16
- Estimar a prevalência de parasitos intestinais em gatos
errantes capturados pelo Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) de
Goiânia – Goiás por um período de 12 meses.
- Determinar a soroprevalência de anticorpos anti-T.gondii em
um grupo de animais capturados pelo Centro de Controle de
zoonoses de Goiânia (CCZ) – Goiás pela técnica de MAT.
- Avaliar a acurácia dos diferentes métodos parasitológicos de
fezes para a detecção de parasitos intestinais, dando ênfase para o
diagnóstico de oocistos de T. gondii.
4. MÉTODOS
4.1 – DELINEAMENTO DO ESTUDO
Trata-se de um estudo de prevalência, para avaliar a frequência de
parasitos intestinais em gatos errantes capturados pelo Centro de Controle de
Zoonoses (CCZ) em Goiânia-Goiás por um período de doze meses.
Avaliação de testes diagnósticos parasitológicos empregados, por meio da
sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP), valor preditivo
negativo (VPN) e índice kappa (k).
4.2 DESCRIÇÃO DO GRUPO DE ESTUDO
O projeto foi apreciado e aprovado pelo comitê de ética em pesquisa para
animais/CEUA da Universidade Federal de Goiás, sob o protocolo 054/2013
(ANEXO I).
Os gatos errantes analisados foram oriundos do CCZ de Goiânia-GO.
Esses animais foram capturados e mantidos em gaiolas coletivas, com até 20
animais, não sendo separados por sexo ou idade.
4.3 COLETA DAS AMOSTRAS FECAIS E DE SANGUE
17
As amostras de fezes e sangue foram coletadas no período de Janeiro de
2012 à Dezembro de 2012. Foram coletadas 154 amostras de fezes diretamente
nas gaiolas coletivas dos animais e armazenadas em coletores universais
estéreis. Pela rotina realizada pelo CCZ, não foi possível a identificação individual
do animal com sua respectiva amostra fecal.
Os animais ficam retidos no CCZ por um período de três dias, sendo então
eutanasiados pelos médicos veterinários responsáveis. Durante o período do
estudo foram coletadas 50 amostras de soro de gatos durante o procedimento de
eutanásia pelo médico veterinário de plantão.
4.4 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS FECAIS:
Para a identificação de cistos e oocistos de protozoários, ovos e larvas de
helmintos nas amostras fecais dos gatos foram empregadas quatro técnicas
parasitológicas, técnica de Sheather , Hoffman-Janer-Pons ou Lutz (HJPL), Faust e
Willis, sendo a técnica de Willis considerada a padrão ouro para este estudo, devido
a sua capacidade de detecção de ovos e larvas de helmintos e na detecção de
oocistos de coccídeos, em especial oocistos de T. gondii.
4.4.1. Método de Sheather (S) – (1923)
O método de Sheather possui como princípio a flutuação em solução
saturada de sacarose, isso aumenta a sensibilidade e diminui os artefatos fecais.
A técnica é utilizada principalmente para a pesquisa de ovos leves como de
Ancilostomídeos e para a pesquisa de oocistos como os de Cystoisospora sp. e
de T. gondii.
4.4.1.1. Material utilizado
• Dois gramas de fezes;
• Solução de Sheather, na densidade de 1,2 g/mL;
• Solução fisiológica de NaCl à 0,9%;
• Gazes;
• Lâmina e lamínula de vidro;
• Bastão de vidro ou palitos descartáveis de madeira;
18
• Béquer (capacidade 100ml);
• Microscópio óptico;
• Tubos para centrífuga de 10mL;
• Pipeta automática 20µL;
• Centrífuga para tubos de 10mL.
4.4.1.2. Preparação da solução de Sheather, densidade 1,2 g/mL
• 500 de sacarose
• 6,5 g de fenol (Fundido a 44ºC)
• 320mL de água destilada
A solução de sacarose foi fervida até ocorrer à clarificação, então o fenol foi
adicionado. Em seguida a solução foi colocada em temperatura ambiente até seu
resfriamento para o uso.
4.4.1.3. Procedimento técnico
• A amostra fecal foi colocada em béquer com auxílio do bastão;
• Em seguida a amostra foi misturada com solução fisiológica, até ocorrer à
fluidificação;
• Peneirou-se com o auxílio das gazes, para obter um material mais límpido;
• Os tubos plásticos de 10mL foram preenchidos até a metade com a
suspensão filtrada;
• Adicionou-se uma quantidade igual da solução de Sheather;
• Realizou-se uma homogeneização do tubo por inversão;
• O tubo foi levado para centrifugação durante 5 minutos a 2500 RPM;
Após centrifugação, a camada superficial do material foi retirada com o
auxílio de uma pipeta automática de 20µL, foram montadas três lâminas
para cada amostra;
• As lâminas foram examinadas com o auxílio do microscópio óptico nos
aumentos de 200x e 400x.
4.4.2. Método de Faust e Colaboradores (F) – (1938)
A técnica de Faust é baseada no princípio da centrifugo-flutuação em
solução de sulfato de zinco (ZnSO4), à 33% com densidade de 1,18 g/mL. Pela
19
diferença na densidade específica entre os ovos de helmintos, cistos de
protozoários do material fecal, onde esses organismos flutuam para a superfície
do tubo. A técnica de Faust é utilizada para o diagnóstico de cistos de
protozoários, e também possui bastante utilidade para a pesquisa de ovos leves
de helmintos.
4.4.2.1. Material utilizado
• Dois gramas de fezes;
• Água destilada;
• Solução de sulfato de zinco à 33 % (densidade 1,18 g/mL);
• Solução de lugol;
• Lâmina e lamínula de vidro;
• Copos plásticos descartáveis; • Pipeta automática de 20µL;
• Bastão de vidro ou palitos descartáveis de madeira;
• Peneira;
• Microscópio óptico;
• Centrífuga e tubos plásticos de (10mL).
4.4.2.2. Preparação da solução de Sulfato de Zinco, densidade 1,18 g/mL
• Sulfato de Zinco (ZnSO4): 330 g
• Água destilada: 600 mL
Adicionar o ZnSO4em água e agitar bem. A densidade é crítica nesse reagente,
devendo em alguns casos ser ajustada.
4.4.2.3. Procedimento técnico
• As fezes foram homogeneizadas em 10 ml de água destilada;
• Em seguida a mistura foi peneirada com gazes;
• A suspensão foi colocada em um tubo de centrífuga com capacidade para
15 ml;
• Centrifugou-se o filtrado durante 2 minutos a 2500 RPM;
• Desprezou-se o sobrenadante e reteu-se o sedimento;
• Adicionou-se ao sedimento 10 mL de água destilada;
20
• A operação foi repetida por 2 a 3 vezes até que o sobrenadante ficasse
límpido;
• O sobrenadante foi descartado retendo apenas o sedimento;
• Completou-se o volume do tubo com a solução de sulfato de zinco até
chegar a 1 cm da borda do tubo;
• O tubo foi centrifugado durante 1 minuto a 2500 RPM. Após esse processo,
tubos ficaram em repouso por 5 minutos;
• Coletou-se com a pipeta a película superficial, onde montamos três lâminas
de cada amostra;
• As lâminas foram examinadas no microscópio adicionando uma gota de
lugol ao sedimento, no aumento de 200X e 400X.
4.4.3. Método de Hoffman, Pons e Janer ou Lutz (HPJL) – (1934/1919)
Fundamenta-se na sedimentação espontânea em água (combinação da
gravidade e da sedimentação).
É utilizado para evidenciar ovos pesados de helmintos quando a
sedimentação permanecer por um período de no mínimo duas horas. Para cistos
e ovos leves o indicado é o período de 24 horas. É o método de rotina utilizado
nos laboratórios quando não é solicitada metodologia específica.
4.4.3.1. Material utilizado
• 10 gramas de fezes;
• Copo plástico descartável;
• Microscópio;
• Lugol;
• Canudo (também pode ser usada uma pipeta graduada);
• Água destilada; Cálice de Sedimentação; Tamis com gazes.
4.4.3.2. Procedimento técnico
21
• As fezes foram diluídas com água destilada;
• Em seguida o material diluído foi passado na tamisdeixando descansar no
cálice de sedimentação;
• Recolheu-se o sedimento do fundo do cálice o material com a ajuda de um
canudo de plástico;
• Uma gota do material recolhido foi colocada sobre a lâmina colocando uma
gota de lugol em cima do material, e coberta com a lamínula;
• Foram montadas três lâminas para cada amostra, que foram observadas no
microscópio nos aumentos de 200X e 400X.
4.4.4. Método de Willis (W) – (1921)
O método de Willis é um método simples e eficiente pela capacidade dos
ovos flutuarem numa solução com densidade elevada aderindo a superfície inferior
da lâmina, colocada na parte superior do líquido. O método possui como principio a
flutuação para pesquisa de ovos leves como os ovos de Ancilostomídeos, que
apresentam baixa densidade específica. A técnica não é indicada para cistos de
protozoários, pois os cistos se retraem pela concentração.
4.4.4.1. Material utilizado
• Dez gramas de fezes
• Bastão de vidro;
• Gaze ou peneira;
• Copo plástico descartável de 50 mL;
• Solução de NaCl, densidade 1,20 g/mL;
• Lâminas e lamínulas;
• Microscópio; Lugol.
5.4.4.2. Preparação da solução de NaCl, densidade 1,20 g/mL
• 40 g NaCl;
• 100 mL água destilada.
22
Realizou-se a mistura dos reagentes e levou-se ao bico de Bunsen até a
ebulição. Após resfriar a solução foi filtrada em papel filtro para eliminação dos
cristais formados.
4.4.4.3. Procedimento técnico
• A amostra foi emulsionada em solução saturada de cloreto de sódio no
copo plástico;
• Após a emulsificação, completou-se até a borda do copo plástico com a
solução de NaCl;
• Colocou-se a lâmina de vidro sobre o recipiente para haver o contato com a
solução por 5 minutos;
• A lâmina foi invertida, e adicionou-se uma gota de lugol;
• Foi realizada a observação ao microscópio no aumento de 200 X e 400X.
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados dos exames parasitológicos foram lançados no banco de
dados no programa EpiInfo® versão 3.2.1. Neste programa foi possível realizar a
avaliação da prevalência dos parasitos intestinais, a frequência de positividade
para cada parasito encontrado, a frequência de positividade para cada técnica
parasitológica empregada, e para a avaliação dos testes diagnósticos
empregados, como a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP),
valor preditivo negativo (VPN) e índice Kappa (K), comparando com a técnica de
Willis, que foi adotada neste estudo como padrão-ouro. Os gráficos foram
plotados no programa Excel 2007®.
Os cálculos de sensibilidade, especificidade, VPP, VPN e K foram calculados
em uma tabela de contingência ou tabela 2x2 (Tabela 2):
Tabela 2: Tabela de contingência 2x2
TESTE PADRÃO OURO TOTAL
Positivo Negativo
Positivo a b a+b
Negativo c d c+d
23
Total a+c b+d n
Onde segundo PEREIRA, 1995:
Sensibilidade: a/(a+c) É a capacidade que o teste diagnóstico apresenta de
detectar os indivíduos verdadeiramente positivos, ou seja, de diagnosticar
corretamente os doentes.
Especificidade: d/(b+d) É a capacidade que o teste diagnóstico tem de detectar
os verdadeiros negativos, isto é, de diagnosticar corretamente os indivíduos
sadios.
Valor preditivo positivo: a/(a+b) É a proporção de doentes entre os positivos pelo
teste.
Valor preditivo negativo: d/(c+d) É a proporção de sadios (sem a doença) entre os
negativos ao teste.
O índice kappa (k) é uma forma de avaliar a concordância entre técnicas
diagnósticas. O k informa a proporção de concordância não aleatória entre as
técnicas utilizadas, e seu valor varia de "menos 1" (completo desacordo) a "mais
1" (concordância total). Se a medida concorda mais frequentemente do que seria
esperado pela chance, então o índice k é positivo; se a concordância é completa
k = 1. Zero indica o mesmo que leituras feitas ao acaso (Kraemer & Bloch 1988).
A Tabela 3 demonstra a interpretação do índice k:
Tabela 3 – Escala de concordância do índice k
Kappa Concordância
< 0,00 Nenhuma
0,00-0,20 Fraca
0,21-0,40 Sofrível
0,41-0,60 Regular
0,61-0,80 Boa
0,81-0,99 Ótima
1,00 Perfeita
24
4.6. SOROLOGIA PELO TESTE DE AGLUTINAÇÃO MODIFICADO (MAT) A
análise sorológica do sangue coletado de 50 gatos capturados pelo CCZ foi
realizada pelo teste de aglutinação modificado (MAT) descrito por Desmonts e
Remington (1980).
4.6.1. Preparo do antígeno para o MAT
Para realizar o MAT foi utilizado como antígeno formas taquizoítas de T. gondii
da CEPA RH, mantidos no Laboratório da Relação Parasito Hospedeiro
(LAERPH), através de passagens sucessivas em camundongos da linhagem
BALB/c no biotério do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da
Universidade Federal de Goiás- IPTSP/UFG.
Os camundongos infectados foram sacrificados por deslocamento cervical,
seguindo as normas de experimentação animal adotadas pelo Biotério
IPTSP/UFG. Foram realizados os lavados intraperitoneais de cerca de 10
camundongos, onde se obteve o material rico em taquizoítos do parasito. Os
lavados foram misturados, e centrifugados a 5000 RPM por 15 minutos, o
sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspenso em 5 mL de PBS. Foi
realizada a contagem de taquizoítos com o auxílio do hemocitômetro de
Neubauer. A concentração foi ajustada em cerca de 25.000 taquizoítas/µL, o
material foi novamente centrifugado, o sobrenadante descartado e o sedimento
ressuspenso em formalina diluída em PBS 1:5 (Solução de formaldeído à 6%).
Foi realizada nova contagem dos parasitos para confirmar a concentração na
solução. Os taquizoítos foram mantidos nesta solução por 16 horas, e então
centrifugados e ressuspensos em PBS por três vezes, para a retirada do
formaldeído. Após a última lavagem, o sedimento foi ressuspenso em tampão
alcalino (7,02g de NaCl; 3,09g de H3BO3; 24mL de NaOH; 4g de albumina bovina
e água destilada suficiente para alcançar 1 litro) pH 8,7 (ALVES, 2007).
4.6.2. Realização do MAT
Os testes foram realizados em placas de fundo em U, sendo adicionado
em cada poço 50 µL de 2-mercaptoetanol 0.2 M (14 mL/litro), 50 µL de antígeno
e 50 µL do soro a ser testado. Foram utilizados três controles positivos e três
25
controles negativos para validar a reação. Nesse estudo foi adicionado ao
tampão de diluição do antígeno 2-mercaptoetanol, para eliminar as IgM residuais
e não específicas para T. gondii.
Os soros dos animais foram previamente diluídos na concentração 1:5 para a
realização da triagem, sendo que, aqueles com resultado positivo foram então
testados até a diluição 1/640. Após a pipetagem, as placas foram agitadas
cuidadosamente, e incubadas por 48 horas à 37ºC. As leituras das placas foram
realizadas após 48 horas (a leitura pode ser feita entre 16 e 72 horas). Os
anticorpos anti-T.gondii presentes nas amostras positivas, se ligam ao antígeno
através de uma reação de aglutinação, formando uma rede que impede a
precipitação dos taquizoítos, desta forma, os poços positivos se apresentavam
límpidos, enquanto nos negativos havia um precipitado no fundo do poço, não
evidenciando a reação antígeno-anticorpo.
5. RESULTADOS
Do total de 154 amostras de fezes de gatos capturados pelo CCZ de
Goiânia-GO durante por um período de doze meses. 74,7% (115/154) foram
positivas (Figura 5).
Figura 5: Prevalência de parasitos intestinais em 154 amostras fecais de gatos errantes
capturados pelo Centro de Controle de Zoonoses de Goiânia-Goiás por um período de doze
meses.
26
Analisando a prevalência por parasito, a Tabela 4 mostra a distribuição em
monoparasitismo e poliparasitismo. Em monoparasitismo o helminto mais
prevalente foi o Ancilostomídeo com 50,4% (58/115) e o protozoário
Cystoisospora sp. com 7,7% (9/115). No poliparasitismo a associação entre
Ancilostomídeos e Cystoisospora sp. representaram 20% (23/115) das amostras
positivas. O parasito T. gondii em monoparasitismo representou 3,5% (4/115) e
em poliparasitismo: Ancilostomídeos+T. gondii 7,0% (8/115), T. gondii +
Cystoisospora sp. 3,5% (4/115) e Ancilostomídeos +T. gondii + Cystoisospora sp.
4,3% (5/115).
Tabela 4 – Prevalência de parasitos intestinais em fezes de gatos errantes
capturados pelo Centro de Controle de Zoonoses em Goiânia-Goiás.
Parasito N %
Ancilostomídeos 58 50,4
Cystoisosporasp. 9 7,7
Giardia sp. 1 0,9
Toxocara cati 1 0,9
Toxoplasma gondii 4 3,5
Ancilostomídeos + T. gondii 8 7,0
Ancilostomídeos + Cystoisospora sp. 23 20,0
T. gondii + Cystoisospora sp. 4 3,5
Ancilostomídeos + T. gondii + Cystoisospora sp. 5 4,3
Ancilostomídeos + Cystoisospora sp. + Giardia sp. 1 0,9
Ancilostomídeos + Cystoisospora sp. + T. cati 1 0,9
Total 115 100
Nas 115 amostras positivas, foi realizada a análise da frequência de
positividade por técnica. A técnica de Willis detectou 97,4% (112/115) com três
falsos negativos. A técnica de HPJL detectou 86,1% (99/115) dos positivos,
seguido pela técnica de Sheather com 79,1% (91/115) e Faust com 73%
(84/115).
Realizando a análise de acurácia das técnicas parasitológicas HPJL, Faust
e Sheather comparando com a técnica de Willis (padrão-ouro) para o diagnóstico
27
de ovos de ancilostomídeos, a técnica que apresentou melhor acurácia foi à
técnica de Sheather, com 81,1% de sensibilidade e 98,4% de especificidade com
VPP de 98,6%, VPN 78,8% e índice k demonstrando boa concordância com o
padrão-ouro (Tabela 5).
Tabela 5 - Avaliação da acurácia das técnicas de Sheather, Faust e
HoffmanPons-Janer-Lutz em relação à técnica de Willis (padrão-ouro), para o
diagnóstico de Ancilostomídeos.
Sensibilidade
% (IC 95%)
Especificidade
% (IC 95%)
VPP%
(IC 95%)
VPN%
(IC 95%)
Sheather 81,1 98,4 98,6 78,8
Faust 73 96,9 97 72,1
HPJL 78,9 92,2 93,4 75,6
VPP: valor preditivo positivo; VPN: valor preditivo negativo, HPJL: HoffmanPons-Janer-Lutz, IC: índice de confiança.
Analisando a acurácia no diagnóstico de oocistos de Cystoisospora sp., as
técnicas HPJL e Sheather tiveram os mesmos resultados, ambas com 66,7% de
sensibilidade, 97,4% de especificidade, VPP de 89,7%, VPN de 89,6% e k de
0,700 demonstrando boa concordância ao padrão-ouro (Tabela 6).
Tabela 6 - Avaliação da acurácia das técnicas de Sheather, Faust e
HoffmanPons-Janer-Lutz em relação à técnica de Willis (padrão-ouro), para o
diagnóstico de Cystoisospora sp.
Sensibilidade
% (IC 95%)
Especificidade
% (IC 95%)
VPP%
(IC 95%)
VPN%
(IC 95%)
Sheather 66,7 97,4 89,7 89,6
Faust 53,8 97,4 87,5 86,2
HPJL 66,7 97,4 89,7 89,6
VPP: valor preditivo positivo; VPN: valor preditivo negativo, HPJL: HoffmanPons-Janer-Lutz, IC: índice de confiança.
28
Analisando os resultados de acurácia para oocistos de T. gondii, a técnica
de Faust demonstrou a maior sensibilidade 66,7%, especificidade 99,3%, VPP
92,3%, VPN 95,7% e índice k com concordância boa com a técnica padrão-ouro
(Tabela 7).
Tabela 7 - Avaliação da acurácia das técnicas de Sheather, Faust e Hoffman
Pons-Janer-Lutz em relação à técnica de Willis (padrão-ouro), para diagnóstico
de Toxoplasma gondii.
Sensibilidade
% (IC 95%)
Especificidade
% (IC 95%)
VPP%
(IC 95%)
VPN%
(IC 95%)
Sheater 61,1 97,1 73,3 95
Faust 66,7 99,3 92,3 95,7
HPJL 55,6 98,5 83,3 94,4
VPP: valor preditivo positivo; VPN: valor preditivo negativo, HPJL: HoffmanPons-Janer-Lutz, IC: índice de confiança.
Avaliando o índice kappa para o diagnóstico de Ancilostomídeos, a técnica
de Sheather demonstrou boa concordância com o padrão-ouro (k=0,768). Para o
diagnóstico de Cystoisospora sp. as técnicas de Sheather e HPJL apresentaram
boa concordância, ambas com k=0,700. Na análise de acuraria para T. gondii a
técnica de Faust apresentou boa concordância comparada ao padrão-ouro
(k=0,750) (Tabela 8).
Tabela 8 - Avaliação da concordância através do índice kappa (k) pelas técnicas
de Sheather, Faust e Hoffman-Pons-Janer-Lutz em relação à técnica de Willis
(padrão-ouro).
Sheather
(IC 95%)
Faust(IC
95%)
HPJL
(IC 95%)
Ancilostomídeos 0,768 0,667 0,689
29
Cystoisospora sp. 0,700 0,587 0,700
Toxoplasma gondii 0,627 0,750 0,632
IC: índice de confiança.
A análise da frequência de anticorpos anti-T. gondii nos soros dos 50
gatos examinados pela técnica de MAT demonstrou que 64% dos animais foram
soropositivos, com diferentes títulos, sendo o título 320 o mais frequente. 36%
dos animais examinados apresentaram sorologia não reagente (Tabela 9).
Tabela 9 – Resultados da sorologia por MAT para Toxoplasma gondii em
amostras de soro de gatos errantes capturados pelo Centro de Controle de
Zoonoses em Goiânia-Goiás.
Resultado da Titulação N %
Não Reagente ( <10) 18 36
Reagente: 10 1 2
Reagente: 20 2 4
Reagente: 40 3 6
Reagente: 80 1 2
Reagente: 160 8 16
Reagente: 320 11 22
Reagente: >/= 640 6 12
Total 50 100
MAT: Aglutinação modificada
30
6. DISCUSSÃO
6.1 – PREVALÊNCIA DE PARASITOS INTESTINAIS E SOROPREVALÊNCIA
DE ANTICORPOS ANTI-Toxoplasmagondii
O estudo da prevalência dos parasitos intestinais em gatos errantes tem
demonstrado ser um importante indicador da contaminação ambiental e
consequentemente risco para a saúde humana pela transmissão de parasitos
com potencial zoonótico.
No grupo de animais estudados, a prevalência dos animais infectados por
Ancilostomídeos foi de 50,4% (58/115) em monoparasitismo e 33,1% (38/115)
em poliparasitismo com outras espécies de parasitos; totalizando 83,5% (96/115)
das amostras positivas apresentavam Ancilostomídeos. A prevalência de
ancilostomídeos é bem maior a dos demais parasitos devido à forma de infecção
dos animais, pela ingestão de larvas ou pela penetração ativa em solos
contaminados. O parasito é mais prevalente nos trabalhos, mesmo quando se
adota diferentes técnicas parasitológicas (LABRUNA et al., 2006). Em Goiânia,
em 1974, Campos et al., encontraram uma prevalência de 73% em gatos
necropsiados.
Estudos com gatos errantes mostram prevalências variadas para
Ancilostomídeos, Silva et al., (2002) demonstraram 100% de positividade,
Coelho et al., (2009)96%, Serra et al., (2003) 60,6%, Pereira et al., (2012)
57,1%, Mundim et al., (2004) 52%, Vital et al., (2012) 50%, Tavares (2005) com
42,1%, Torrico et al., (2008) 22,58%, Dall’Agnol et al., (2010) 18,1%, Pegoraro et
al., (2011) 15,79%, Ragozo et al., (2002) 8,7%, Pivoto et al., (2013) com 2,6% e
Funada et al., (2007) onde encontraram apenas 2,1% dos gatos errantes
infectados. A variação apresentada entre os trabalhos pode estar relacionada
com o método utilizado para o diagnóstico utilizado não ser específico para o
parasito.
Goiânia apresenta elevada prevalência de ancilostomídeos, o que constitui
um risco para população humana em relação à larva migrans cutânea. É
importante ressaltar que a presença destes parasitos nas fezes de felídeos
31
demonstra o papel destes animais como fonte de contaminação ambiental com
parasitos que podem infectar outros felídeos domésticos e humanos.
Toxocara cati é muito frequente em areias de parques e praças públicas,
Blazius et al.; (2006) demonstraram uma prevalência de 20,69% em amostras de
areia, em amostras de fezes de gatos errantes Coelho et al., (2009)identificaram
43,1% positivos, Ragozo et al., (2002) em 31,16%, Serra et al., (2003)
demonstraram uma prevalência de 28,8%, Pivoto et al., (2013) em 18,8%,
Pegoraro et al., (2011) em 15,79%, Mundim et al., (2004) com 14%, Funada et
al., (2007) encontraram 6,1% de amostras positivas,Tavares (2005) demonstrou
uma prevalência de 6%, Torrico et al., (2008) demonstraram 4,83%, Dall’Agnol et
al., (2010) em 0,86%, Campos et al., (1974) encontraram uma prevalência de
19% em Goiânia-Goiás, em nosso estudo a prevalência também foi baixa em
casos de monoparasitismo 0,9% (1/115) e poliparasitismo 0,9%, mas demonstra
a importância de se realizar medidas profiláticas para evitar a larva migrans
cutânea, larva migrans visceral e enterite eosinofílica (PARSONS, 1987;
SCHANTZ, 1994; SMYTH, 1995; PROVIC; CROESE, 1996).
Ancilostomídeos e Toxocara sp. são os principais causadores de
contaminação ambiental e levam a riscos de contaminação zoonótica (BRENER
et al., 2005).
Cystoisospora sp. apresentou uma prevalência significativa em
monoparasitismo, 7,7% (9/115), e em poliparasitismo com Ancilostomídeos que
chegou a 20% (23/115) dos animais. Em diversos trabalhos se observa alta
prevalência deste coccídeo, principalmente em gatos menores de seis meses de
idade (Ragozo e cols. 2002). Em gatos errantes a prevalência em outros estudos
é variada, Pereira et al., (2012) identificaram 85,7% de animais infectados, Serra
et al., (2003)demonstraram uma prevalência de 74,2%, Ragozo et al., (2002) com
26,06% para Cystoisospora felis e 24,64% para Cystoisospora rivolta,
Torrico et al., (2008) com 48,38%, Coelho et al., (2009)43,1%, Dall’Agnol et al.,
(2010) com 17,2%, Funada et al., (2007) 8,3%, Pegoraro et al., (2011) com
7,89%, Pivoto et al., (2013) com 3,1%. Apesar da espécie C. felis não ser de
transmissão para o homem, a elevada prevalência demonstra a importância dos
gatos errantes na epidemiologia deste coccídeo.
32
Giardia sp. se mostra um importante agente em animais domésticos,
podendo atuar como zoonose para o ser humano (SCHANTZ, 1991, GENNARI et
al., 1999), mesmo que nesse estudo a prevalência tenha sido de apenas 0,9%
(1/115) para monoparasitismo e poliparasitismo, deve-se atentar para a
transmissão desse parasito zoonótico principalmente pela contaminação de
reservatórios de água por fezes desses animais. Estudos moleculares
evidenciaram diferentes genótipos para Giardia duodenalis, sendo os subtipos A
e B podem infectar homens e gatos, e o genótipo F apenas gatos (ANDREWS et
al., 1989; MONISet al., 2003; CACIÒ; RYAN 2008; RYAN; CACIÒ 2013). No
Brasil circulam os genótipos A e B entre os humanos, e nos gatos foi identificado
o genótipo A, demonstrando o risco de transmissão zoonótica (SOUZA et al.,
2007; FENG; XIAO, 2011; SANTOS et al., 2012). Goiânia apresentou uma
prevalência pequena quando comparada a estudos realizados em outros
estados, como Dall’Agnol et al., (2010) que encontraram 34,5% de gatos errantes
infectados em Santa Maria-RS, Torrico et al., (2008) em 20,96% dos animais em
Caxias do Sul-RS.
Em um total de 18,3% (21/115) apresentavam T. gondii o que demonstra
um número significativo de oocistos contaminando o meio ambiente. Poucos
estudos revelam a prevalência de T. gondii por testes parasitológicos em
amostras fecais de gatos errantes, no estudo de Dall’Agnol et al., (2010) a
prevalência foi de 4,3% e Funada et al., (2007) de 0,3%. A baixa prevalência do
parasito pode estar relacionada com a não utilização de uma técnica específica
para oocistos, a capacidade de observação dos analistas em identificar o oocisto,
e como esses trabalhos não levaram em consideração da idade dos animais,
podem ter sido analisadas fezes de animais cronicamente infectados.
Esse resultado demonstra a capacidade de contaminação ambiental deste
parasito, pois um único gato é capaz de eliminar 10 milhões de oocistos em uma
única defecação, poderiam contaminar o ambiente constituindo um grave risco
para a saúde da população humana (DUBEY; BEATTIE, 1988; LINDSAY et al.,
2002).
Devido a limitações do exame parasitológico, a sorologia é mais difundida
no diagnóstico veterinário, permitindo além de detectar a infecção, a
determinação da fase da infecção (ARAÚJO et al., 1998).
33
Ao analisar os resultados da sorologia no grupo de 50 felídeos pela técnica
de MAT, observa-se uma prevalência de 64% (32/50) animais positivos, com
variedade nas titulações, sendo que a maioria dos animais reagentes 22%
(11/50) apresentam título de 320. De acordo com a análise da sorologia felina por
Araújo et al., (1998) esses animais estão cronicamente infectados com infecção
bloqueada. De acordo com a mesma classificação, 12% (6/50) dos animais
podem estar com infecção ativa recente, pois seus títulos são maiores ou iguais
que 640. Chama a atenção o número de animais soronegativos 36% (18/50), que
constituem um risco para a toxoplasmose felina. A elevada prevalência
caracteriza uma elevada taxa de infecção pelo parasito, o que sugere uma
elevada contaminação ambiental por oocistos, pois os anticorpos anti-IgG só
aparecem após a eliminação de oocistos (DUBEY et al., 1995).
Diversos trabalhos no Brasil realizaram a sorologia para T. gondii em gatos
errantes, o que mostra a distribuição do parasito por todo o país.Goiânia
apresentou alta soroprevalência de anticorpos, sendo que apenas o trabalho
realizado por Dubey et al, 2004 realizado no estado do Paraná apresentou uma
prevalência maior (84,4%) que a encontrada neste trabalho.
A prevalência de anticorpos anti-.T. gondii em gatos ainda não havia sido
determinada no estado de Goiás, esses resultados contribuem com a literatura
para analisar a distribuição do parasito e favorecer estudos da epidemiologia da
doença.
6.2 – AVALIAÇÃO DA ACURÁCIA DAS TÉCNICAS PARASITOLÓGICAS
A análise da frequência de positividade das técnicas parasitológicas realizadas,
demonstrou que a técnica HPJL foi próxima ao padrão-ouro (86,1%), e a técnica
de Faust foi a com menor frequência de positividade (73%). Mesmo o padrão-
ouro não foi capaz de detectar 100% dos positivos, o que reforça a necessidade
do emprego de mais de uma técnica diagnóstica. A junção de mais de um
método diagnóstico com princípios diferentes favorece a identificação de um
número maior de estruturas parasitárias, aumentando a eficiência diagnóstica
(SANTOS et al., 2003). No presente estudo fica evidenciado que a associação da
34
técnica padrão-ouro (Willis) com a técnica de HPJL, que é usualmente utilizada
nos laboratórios clínicos e veterinários, aumenta a eficiência diagnóstica.
Estudo realizado por Cerqueira e cols. 2007 se propôs a analisar a eficiência da
técnica de Willis comparando com a HPJL, onde a técnica HPJL se mostrou mais
sensível que a técnica de Willis para a técnica de Willis para o diagnóstico de
Ancilostomídeos. No presente estudo a técnica HPJL mostrou uma concordância
boa k = 0,689 com o padrão-ouro, mas a acurácia da técnica de Sheather
superou tal técnica sendo mais indicada para o diagnóstico de ancilostomídeos,
por se tratar de um parasito que possui ovos leves; a flutuação pela diferença de
densidade da técnica de Sheather favorece a identificação dos ovos (SHEATER,
1923; DE CARLI, 2011). A técnica de Faust apresentou menor sensibilidade
(73%) e menor índice k=0,667, o resultado de sensibilidade difere do trabalho de
Souza-Dantas e cols. 2007, em que a sensibilidade chegou a 100% comparada a
necropsia do tubo intestinal dos gatos.
Para oocistos de Cystoisospora sp. as técnicas de Sheather e HPJL obtiveram
os mesmos resultados na análise de acurácia, com sensibilidade de 66,7%,
especificidade de 97,4%, VPP de 89,7%, VPN de 89,6% e índice k demonstrando
boa concordância ao padrão-ouro. Para o diagnóstico de coccídeos recomenda-
se técnicas de flutuação em soluções hipertônicas, esse resultado reforça os
trabalhos citados na literatura que demonstram a acurácia das técnicas de
flutuação de Willis e Sheather associadas, ou ainda associam a técnica de HPJL
com a técnica de Willis ou Sheather na rotina laboratorial (GARCIA et al., 1995,
GARCIA, 2007).
Na análise de acurácia das técnicas parasitológicas para diagnóstico de oocistos
de T. gondii mostrou que a técnica de Faust apresentou maior sensibilidade
66,7%, especificidade 99,3%, VPP 92,3%, VPN 95,7% e índice k com
concordância ao padrão-ouro k=0,750. As três técnicas apresentaram valores de
sensibilidade menores que 70%. As técnicas de flutuação em soluções saturadas
são indicadas para oocistos e possuem boa sensibilidade diagnóstica
(SHEATHER, 1923; FAUST et al., 1938; DRYDEN, 2005). Dessa forma para o
diagnóstico de oocistos de T. gondii recomenda-se a associação da técnica de
Willis com a técnica de Faust, ou Willis associada com a técnica de Sheather,
onde k=0,627 denota boa concordância.
35
7. CONCLUSÕES
• A prevalência de parasitos intestinais em gatos errantes capturados pelo
Centro de Controle de Zoonoses de Goiânia-Goiás foi de 74,7%.
• A prevalência de T. gondii nesses animais foi de 3,5% em casos de
monoparasitismo, 7,0% em associação com Ancilostomídeos, T. gondii e
Cystoisospora sp. com 3,5% e de 4,35 na associação Ancilostomídeos+T. gondii
+ Cystoisospora sp. A população gatil estudada apresenta alta prevalência de
toxoplasmose, o que constitui um risco para a transmissão zoonótica.
• Nas fezes dos animais examinados estavam presentes o T. gondii,
salientando a importância destes animais na contaminação ambiental por
oocistos.
• A análise sorológica demonstrou alta prevalência de gatos soronegativos
que constituem um risco para a toxoplasmose. O grupo estudado de gatos possui
alta prevalência de toxoplasmose.
• A técnica HPJL e Sheather apresentaram melhor acurácia para o
diagnóstico de parasitos intestinais associadas à técnica de Willis (padrão-ouro).
• No diagnóstico parasitológico para oocistos de T. gondii, a técnica de
Faust apresentou melhor acurácia associada à técnica de Willis (padrão-ouro).
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54
ANEXOS ANEXO 1 – PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA
55
56
57
ANEXO 2: ARTIGOS
ARTIGO 1: PREVALENCE OF INTESTINAL PARASITES IN STRAY CATS
(Felis catus domesticus) IN GOIÂNIA, GOIÁS, BRASIL
Submetido a revista: Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal
NO DIAGNÓSTICO DE ENTEROPARASITOS EM GATOS
Será submetido a revista: REVISTA BRASILEIRA DE PARASITOLOGIA
VETERINÁRIA
RESUMO EXPANDIDO: SOROPREVALÊNCIA DE Toxoplasma gondii EM GATOS
ERRANTES EM GOIÂNIA, GOIÁS, BRASIL.
Science
ARTIGO 2: AVALIAÇÃO DA ACURÁCIA DE TÉCNICAS PARASITOLÓGICAS
58
Publicado nos anais do CONPEEX-UFG 2014. ARTIGO 1 - PREVALENCE OF INTESTINAL PARASITES IN STRAY CATS (Felis
catus domesticus) IN GOIÂNIA, GOIÁS, BRASIL
Hanstter Hallison Alves Rezende 1, Juliana Boaventura Avelar2, Heloísa Ribeiro
Storchilo3, Marina ClareVinaud4& Ana Maria de Castro5.
1- Mestre em Medicina Tropical e Saúde Pública (Parasitologia), Laboratório de
Estudos da Relação Parasito-Hospedeiro (LAERPH), Instituto de Patologia
Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, GO.
Email: [email protected]
Endereço: Rua 235, Setor Universitário, Goiânia, Goiás, Brasil, CEP: 74605-055
Telefone: 55 62 3209-6109
2- Doutora em Medicina Tropical e Saúde Pública (Parasitologia), Universidade de
Rio Verde – UNIRV, Campus Aparecida de Goiânia.
Email: [email protected]
Endereço: Rua 235, Setor Universitário, Goiânia, Goiás, Brasil, CEP: 74605-055
Telefone: 55 62 3209-6109
3- Mestranda em Biologia das Relações Parasito-Hospedeiro, Laboratório de
Estudos da Relação Parasito-Hospedeiro (LAERPH), Instituto de Patologia
Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, GO.
Email: [email protected]
Endereço: Rua 235, Setor Universitário, Goiânia, Goiás, Brasil, CEP: 74605-055
Telefone: 55 62 3209-6109
4- Doutora em Medicina Tropical e Saúde Pública (Parasitologia), Professora de
Parasitologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade
Federal de Goiás, Goiânia-GO.
Email: [email protected]
Endereço: Rua 235, Setor Universitário, Goiânia, Goiás, Brasil, CEP: 74605-055
Telefone: 55 62 3209-6109
5- Doutora em Parasitologia, Professora de Parasitologia do Instituto de Patologia
Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás, Goiânia-GO.
59
Email: [email protected]
Endereço: Rua 235, Setor Universitário, Goiânia, Goiás, Brasil, CEP: 74605-055 Telefone: 55 62 3209-6109
ABSTRACT
Stray cats are important reservoirs and transmitters of zoonotic intestinal
parasites. Therefore the knowledge of these parasites prevalence is important to
their prophylaxis. The aim of this study was to verify the prevalence of intestinal
parasites in stray domestic cats in Goiânia - Goiás. 154 samples of fecal material
from stray cats captured by theCenter for the Control of Zoonosis in GoianiaGoias
were analyzed during the year of 2012. For the parasitological diagnostics the
associated techniques of Hoffman-Pons-Janer-Lutz, Faust, Willis andSheather
were performed. The techniques allowed the identification of 74.68% of positive
samples. Ancilostomatids were the most prevalent helminths (50.43%) and
Cystoisospora sp the most prevalent protozoan (7.83%). The most frequent
polyparasitism association was ancylostomids and Cystoisospora sp (20%).
Toxoplasma gondii oocysts were found in 18.27% of the analyzed samples. The
results show that stray cats may be a risk for both human and animal public
health because they eliminate zoonotic parasites in their feces with consequent
environmental contamination.
Key words: prevalence, zoonosis, parasites, strays cats, public health.
RESUMO
Os gatos errantes são importantes reservatórios e transmissores de parasitos
intestinais de interesse zoonótico. Portanto, o conhecimento da prevalência
destes parasitos é importante para a sua profilaxia.O objetivo deste estudo foi
verificar a prevalência de parasitos intestinais em gatos domésticos errantes em
Goiânia – Goiás. Foram analisadas 154 amostras fecais de gatos errantes
procedentes do Centro de Zoonoses de Goiânia-Goiás, durante o ano de 2012.
Para o diagnóstico parasitológico foram empregadas as técnicas associadas de
Hoffman-Pons-Janer-Lutz, Faust, Willis e Sheather. As técnicas identificaram
74,68% das amostras como positivas. Os ancilostomídeos foram os helmintos
60
mais prevalentes com 50,43% e o protozoário Cystoisosporasp. com 7,83%. A
associação mais frequente em poliparasitismo ocorreu entre ancilostomídeos e
Cystoisosporasp. que representaram 20% das amostras.Toxoplasma gondii, apresentou elevada prevalência, em 18,27% das amostras foram detectados oocistos. Os resultados obtidos demonstram que os gatos errantes podem ser um risco para a saúde pública humana e animal, pois eliminam parasitos de transmissão zoonótica com consequente contaminação ambiental.
Palavras chave: Prevalência, Zoonoses, Parasitos, Gatos errantes, Saúde Pública.
INTRODUCTION
Stray cats are important transmitters of zoonotic agents and also may
beprotagonists of biting aggressions and allergic diseases (Beck e Meyers 1996;
Tesserolli, Fayzano e Agottani, 2005).Parasites that present a heteroxenic life
cycle are responsible for several lesions in their hosts and may occasionally infect
humans causing diseases. This situation leads to challenges in public health
strategies in planning control and triage agendas in a practical and broad
approach facilitating the diagnostic of humans and animals infected (Serra, Uchôa
e Coimbra, 2003).
Felids act as final hosts of Toxoplasma gondii. When these animals are
young, usually under one year old, and infected, they may eliminate millions of
oocysts in the environment (Dubey, Swan e Frenkel, 1972). Therefore the
presence of T. gondii oocysts in the feces of stray cats is an important indicative
for the evaluation of environmental contamination. All felids are susceptible to T.
gondii infection independently of gender, age or breed (Dubey e Beattie, 1988).
Zoonotic parasites causes important diseases such as cutaneous and
visceral larva migrans caused by Ancylostoma brasiliense and Toxocara cati,
respectively(Schantz, 1994; McCarthy e Moore 2000; Serra, Uchôa e Coimbra,
2003). Amongst the protozoan Giardia lamblia, Cryptosporidium felis and
Toxoplasma gondii are the most frequent. They present fecal oral transmission
both to humans and animals, constituting, therefore, a public health risk (Mendes-
de-Almeida, Silva e Labarthe, 2007; Palmer et al., 2008).
61
In face of the epidemiologic importance of several zoonotic diseases that
may be transmitted by felids and the variety of habitats in which this animal
moves through, the aim of this study was to verify the prevalence of intestinal
parasites in stray cats captured by the Center for the Control of Zoonosis in
Goiania, Goiás, Brazil.
MATERIAL AND METHODS
154 fecal samples from stray cats, from both genders, with no defined age
and that were captured by the Center for the Control of Zoonosis throughout the
whole extension of the city of Goiania, Goiás, during the year of 2012, were
analyzed.
In the routine of the Center for the Control of Zoonosis the stray captured
animals are maintained in collective cages. The fecal samples were collected
directly from those cages making it impossible for the individual identification of
the fecal sample. The samples were stored in sterilized collectors and sent to
processing in LAERPH-UFG (Laboratory of host-parasite relationship, Federal
University of Goias). All samples were processed through the spontaneous
sedimentation (Hoffman, Pons e Janer, 1934; Lutz, 1919), flotation in sodium
chloride saturated solution (Willis, 1921), zinc sulfate centrifugal flotation (Faust et
al., 1938) and flotation in sucrose saturated solution (Sheather, 1923) methods.
The results were analyzed through the combination of the sensitivity of the four
techniques aiming to increase the accuracy of detection of the different evolutive
forms of the intestinal parasites (Flanagan, 1992; Tasca, 2001).
Descriptive statistical analysis wasperformedusing EpiInfoversion 2.3.1for the
prevalence of parasites.
This study was approved by the Ethics in Animal Research Committee CEUA/
Federal University of Goias, protocol number 054/2013.
RESULTS
In this study 74.7% (115/154) cats were infected by at least one gender of
enteric parasite, which was considered monoparasitism. The most prevalent
helminthic infection was caused by ancylostomids, 50.3% (58/115), and the most
62
prevalent protozoan was Cystoisosporasp, 7.7% (9/115). The most frequent
association occurred between ancylostomids and Cystoisosporasp. with 20%
(23/115) of the samples (Table 1).
Table 1 – Prevalence of intestinal parasites in feces from stray cats captured by the
Center for the Control of Zoonosis in Goiania - Goias, during the year of 2012.
Ancylostomids 58 50,4
Cystoisosporasp. 9 7,7
Giardiasp. 1 0,9
Toxocaracati 1 0,9
Toxoplasma gondii 4 3,5
Ancylostomids+ T. gondii 8 7,0
Ancylostomids+ Cystoisosporasp. 23 20,0
T. gondii + Cystoisosporasp. 4 3,5
Ancylostomids+ T. gondii + Cystoisosporasp. 5 4,3
Ancylostomids+ Cystoisosporasp. + Giardia sp. 1 0,9
Ancylostomids+ Cystoisosporasp. + T. cati 1 0,9
115 100
DISCUSSION
The high prevalence of ancylostomid infection both in monoparasitism as in
polyparasitism is probably due to the form of the animal’s infection which is
through the ingestion of larvae and/or through the active penetration of the larvae
through the animal skin when in contact with contaminated soil. This helminth is
frequently the most found in parasitological surveys independently of the
technique used (Labruna et al., 2006).
The results obtained in this study are in accordance with several studies
performed throughout Brazil in which the enteric parasitism prevalence varied
from 50% to 100% of infected cats (Serra, Uchôa e Coimbra, 2003; Labruna et
al., 2006; Coelho et al., 2009; Pereira et al., 2012; Mundim et al., 2004; Vital,
Barbosa e Alves, 2012). The city of Goiania presented a high prevalence of
ancylostomid infection which constitutes a risk for the human population as it may
cause cutaneous larva migrans. It is important to highlight that the presence of
this parasites in the feces of felids demonstrates their role as a source of
environmental contamination with zoonotic parasites as described in a similar
study performed in Italy (Spada et al., 2013).
Parasite N %
63
Cystoisosporasp.presented prevalence in monoparasitic infections, 7.7%
(9/115), and in association with ancylostomid infections reached 20% (23/115) of
the infected animals. In several studies there is the description of a high
prevalence of this coccid especially in cats with less than six months old (Ragozo
et al., 2002). In stray cats the prevalence of Cystoisospora sp. varies from
26.06% to 85.7% of infected animals (Serra, Uchôa e Coimbra, 2003; Coelho et al., 2009; Pereira et al., 2012; Ragozo et al., 2002; Torrico et al., 2008) . In spite of C. felis, the most common species of Cystoisospora in cats, may not be transmitted to humans the high prevalence of this parasite indicates the importance of cats in the life cycle and dissemination of this parasite throughout the environment (Dubey, 2014).
Giardia sp. is an important protozoan parasite of domestic animals and
may act as a zoonotic agent for humans (Schantz, 1991; Gennari et al., 1999). In
this study the prevalence of this parasite was low, 0.9% (1/115) both for
monoparasitism and polyparasitism it is important to highlight that the
transmission of this zoonotic agent is due to the contamination of water reservoirs
with feces from infected animals. Also found a low prevalence of Giardia sp
(0.7%) in samples from stray cats from Northern Germany (Becker, 2012).
Molecular studies showed different G.duodenalis genotypes and subtypes A and
B are capable of infecting both humans and felids and subtype F is capable of
infecting only felids (Andrews et al., 1989; Monis et al., 2003; Cacciò e Ryan,
2008; Ryan e Cacciò, 2013) . In Brazil subtypes A and B are circulating among
humans and subtype A has been described in cats which demonstrates the role of
the felid in the dissemination of this subtype (Souza et al., 2007; Feng e Xiao,
2011; Santos et al, 2012). In the samples collected in Goiania a low prevalence
was found when compared to other studies performed in other states of Brazil in
which G. lambliaprevalence varied from 13% to 34.5% (Torrico et al.,
2008; Dall’Agnol et al.,2010; Brinker, Teixeira e Araújo, 2009).
The nematoid T. cati is highly frequent amongst cats and the presence of
this helminth in sand from parks and public squares demonstrates the importance
of the environmental vigilance for the prophylaxis of visceral larva migrans.
Several studies have been performed in samples from sand which demonstrated
a prevalence of 20.69% of T. cati (Blauzius et al., 2006). In fecal samples from
stray cats the prevalence varied from 0.86% to 43.1% (Serra, Uchôa e Coimbra,
2003; Mundim et al., 2004; Ragozo et al., 2002; Torrico et al., 2008; Dall ’Agnol et
64
al., 2010; Pivoto et al., 2013; Funada et al., 2007). In the city of Goiania, another
study performed in 1974 found a prevalence of 19% of this parasite while in our
study the prevalence of monoparasitismwas of 0.9% (1/115) and the same for
polyparasitism (Campos, Garibaldi e Carneiro, 1974). The presence of this
parasite highlights the importance of prophylactic measures against cutaneous
and visceral larva migrans and also against eosinophilic enteritis (Schantz, 1991;
Parsons, 1987; Smyth, 1995; Provic e Croese, 1996).
T. gondii infection was found in 3.5% (4/115) in monoparasitic infections
and in 7,0% (8/115) in association with ancylostomids, 3.5% (4/115) in
association with Cystoisosporasp, 4.3% (5/115) in association with ancylostomids
and Cystoisosporasp. From the positive samples a total of 18.3% (21/115)
presented oocysts of T. gondii which demonstrates a high number of animals
releasing the resistant form of the parasite in the environment. Few studies
performed in Brazil reveal the prevalence of T. gondii in parasitological tests of
fecal samples from stray cats, 0.3% in Rio Grande do Sul and 4.3% in
São Paulo (Dall’Agnol et al., 2010; Funada et al., 2007). In Iraq a prevalence of
30.4% of T. gondii infection in stray cats was reported (Switzer et al., 2013), 9% in
Virginia, USA (Lilly e Wortham, 2013), 2.1% in Kwait (Abdou et al., 2013) and
0.1% in Northern Germany (Becker et al., 2012). Probably the low prevalence
found in studies performed in Brazil may be related to the non use of a specific
technique capable of detecting T. gondii oocysts as the ones used in this study
such as the flotation techniques which present higher accuracy.
The studies of intestinal parasites prevalence in stray cats have
demonstrated to be an important indicator of environmental contamination and
consequent risk for human health due to the transmission of parasites with
zoonotic potential and infectious risk to other felids. Due to the growth of the
population of stray cats in cities there is the need of the creation of control
programmes that encompass actions of health education, legislation, reproductive
control and registration of these animals
ACKNOWLEDMENTS
The authors would like to thank all employees of the Center for Control of Zoonosis
in Goiania, especially to the veterinarian Sabrina Arruda.
65
CONFLICT OF INTERETS
All authors declare no conflict of interest.
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71
ARTIGO 2. - AVALIAÇÃO DA ACURÁCIA DE TÉCNICAS
PARASITOLÓGICAS NO DIAGNÓSTICO DE ENTEROPARASITOS EM
GATOS
Hanstter Hallison Alves Rezende, Juliana Boaventura Avelar, Heloísa Ribeiro
Storchilo, Marina Clare Vinaud & Ana Maria de Castro
Laboratório de Estudos da Relação Parasito-Hospedeiro (LAERPH), Instituto de
Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás,
Brasil.
Resumo
A avaliação da acurácia das técnicas parasitológicas de Willis, Hoffman-
JonesPons ou Lutz (HPJL), Sheather e Faust foram realizadas em amostras
fecais de gatos capturados pelo Centro de Controle de Zoonoses em Goiânia,
Goiás. Esta quatro técnicas foram utilizadas separadamente para análise de 154
amostras fecais. A análise de acurácia foi empregada avaliando a sensibilidade,
especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e índice kappa,
sendo a técnica de Willis eleita como padrão-ouro. 74,68% (115/154) das
amostras foram positivas para enteroparasitos. A análise de frequência de
positividade demonstrou que a técnica HPJL detectou 86,1% dos positivos
aproximando-se do padrão ouro. A avaliação da acurácia foi realizada nos
parasitos que foram mais prevalentes, sendo que para Ancilostomídeos a técnica
de Sheather apresentou melhor acurácia, para Cystoisosporasp. as técnicas de
Sheather e HPJL foram semelhantes. E para Toxoplasma gondii a técnica de
Faust apresentou melhor acurácia comparada ao padrão ouro. O estudo
demonstra a importância da associação de técnicas parasitológicas para o
diagnóstico de enteroparasitos em gatos.
Palavras chave: Acurácia, enteroparasitos, técnicas parasitológicas, gatos
errantes.
Introdução
72
Os gatos são importantes transmissores de agentes zoonóticos,
principalmente parasitos de ciclo heteroxênico que podem infectar o homem,
acarretando doenças importantes, como a larva migrans cutânea, larva migrans
visceral, toxoplasmose, giardíase e criptosporidiose (SCHANTZ 1991;
MCCARTHY & MOORE 2000; SERRA et al., 2003). Inúmeros métodos
laboratoriais estão sendo empregados com o objetivo de concentrar as formas
evolutivas dos parasitos favorecendo um diagnóstico mais fidedigno, como as
técnicas de centrífugo-flutuação em sulfato de zinco (Faust), flutuação em
solução saturada de sacarose (Sheather), flutuação em solução saturada de
cloreto de sódio (Willis), sedimentação espontânea (Hoffman-Ponjs-Janer-Lutz) e
Fórmol-éter (DE CARLI 2001; DE CARLI & OLIVEIRA 2001; MARIANO et
al.,2005; MACHADO et al., 2008).
Mesmo com inúmeros métodos laboratoriais disponíveis para o
diagnóstico de parasitos intestinais, muitos laboratórios de análises clínicas
fazem a utilização de forma inadequada de tais métodos, seja pela complexidade
operacional, baixa sensibilidade, custo elevado dos reagentes e falta de pessoal
adequadamente treinado (CHAVES et al., 1979). Dessa forma, a acurácia do
teste parasitológico depende do treinamento do pessoal, recursos financeiros do
laboratório e aplicação de procedimentos de controle de qualidade interno e
externo (ASH & ORIEHL 1991).
Os laboratoristas clínicos e veterinários buscam de uma metodologia
parasitológica específica, sensível, rápida e de baixo custo operacional. A
realização do exame parasitológico de fezes pode indicar o agente etiológico
causador da doença, a carga parasitária, permite o acompanhamento e eficácia
do tratamento e pode ser utilizado para inquéritos epidemiológicos, para
direcionar as medidas profiláticas locais e verificar a qualidade da saúde da
população. Por esse motivo, o exame parasitológico de fezes é de extrema
importância para a medicina humana e veterinária (VAZ 2001; SILVA &
MENEZES 2003; MENDES et al., 2005; TOSATO et al., 2005; MACHADO et al.,
2008).
Rotineiramente a técnica empregada no exame parasitológico é a técnica
de Hoffman-Pons-Janer ou Lutz (HPJL), que possui como vantagem a
necessidade mínima de materiais e recursos financeiros, mas como
73
desvantagem apresenta uma grande quantidade de detritos fecais na amostra,
dificultando a identificação microscópica pelo analista. Assim combinar diferentes
técnicas parasitológicas é útil para identificar diferentes espécies de parasitos,
aumentando a acurácia diagnóstica (FLANAGAN 1992; TASCA 2001). Esse
estudo teve como objetivo avaliar a acurácia dos diferentes métodos
parasitológicos de fezes para a detecção de parasitos intestinais, dando ênfase
para o diagnóstico de oocistos de T. gondii.
Material e Métodos
Grupo de estudo
O trabalho foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa para
animais/CEUA da Universidade Federal de Goiás, sob o protocolo 054/2013.
Foram obtidas 154 amostras fecais de gatos capturados pelo Centro de
Controle de Zoonoses de Goiânia-GO. As amostras foram coletadas em
coletores universais estéreis, e encaminhadas ao Laboratório de Estudos da
Relação Parasito-Hospedeiro (LAERPH) no Instituto de Patologia Tropical e
Saúde Pública (IPTSP) da Universidade Federal de Goiás (UFG).
Análise das amostras
Para a identificação de cistos e oocistos de protozoários, ovos e larvas de
helmintos nas amostras fecais dos gatos foram empregadas diferentes técnicas
parasitológicas, técnica de flutuação saturada em solução de sacarose
(SHEATHER 1923), Sedimentação espontânea (HOFFMAN et al., 1934 ou LUTZ
1919), centrifugo-flutuação em sulfato de zinco (FAUST et al., 1938) e flutuação
em solução saturada de cloreto de sódio (WILLIS 1921), sendo a técnica de Willis
considerada a padrão ouro para este estudo, devido a sua capacidade de
detecção de ovos e larvas de helmintos e na detecção de oocistos de coccídeos,
em especial oocistos de T. gondii.
Análise estatística
74
Os resultados dos exames parasitológicos foram lançados no programa
EpiInfo versão 3.2.1. Sendo realizada a avaliação da prevalência dos parasitos
intestinais, a frequência de positividade para cada parasito encontrado, a
frequência de positividade para cada técnica empregada, e para a avaliação dos
testes diagnósticos, como a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo
(VPP), valor preditivo negativo (VPN) e índice Kappa (K), comparando com a
técnica de Willis, que foi adotada neste estudo como padrão-ouro.
Resultados e Discussão
Das 154 amostras de fezes 74,7% (115/154) foram positivas e 25,3%
(39/154) foram negativas para enteroparasitos.
A tabela 1 demonstra a prevalência encontrada:
Tabela 1 – Prevalência de parasitos intestinais em fezes de gatos errantes
capturados pelo centro de zoonoses em Goiânia-Goiás no ano de 2012.
Parasito N %
Ancilostomídeos 58 50,4
Cystoisosporasp. 9 7,7
Giardia sp. 1 0,9
Toxocara cati 1 0,9
Toxoplasma gondii 4 3,5
Ancilostomídeos + T. gondii 8 7,0
Ancilostomídeos + Cystoisospora sp. 23 20,0
T. gondii + Cystoisospora sp. 4 3,5
Ancilostomídeos + T. gondii + Cystoisospora sp. 5 4,3
Ancilostomídeos + Cystoisospora sp. + Giardia sp. 1 0,9
Ancilostomídeos + Cystoisospora sp. + T. cati 1 0,9
115 100
Nas 115 amostras positivas, foi realizada a análise da frequência de
positividade por técnica. A técnica de Willis detectou 97,4% (112/115) com três
falsos negativos. A técnica de HPJL detectou 86,1% (99/115) dos positivos sendo a
75
mais próxima do padrão ouro, seguida pela técnica de Sheather com 79,1%
(91/115) e a técnica com menor frequência de positividade foi a de Faust com 73%
(84/115). Mesmo o padrão-ouro não foi capaz de detectar 100% dos positivos, o
que reforça a necessidade do emprego de mais de uma técnica diagnóstica. A
junção de mais de um método diagnóstico com princípios diferentes favorece a
identificação de um número maior de estruturas parasitárias, aumentando a
eficiência diagnóstica (SANTOS &CASTRO2006). Em nosso trabalho fica
evidenciado que a associação da técnica padrão-ouro (Willis) com a técnica de
HPJL que é usualmente utilizada nos laboratórios veterinários aumenta a eficiência
diagnóstica.
A análise de acurácia foi realizada nos parasitos com maior frequência,
sendo analisada os Ancilostomídeos, Cystoisospora sp. eT. gondii. Portanto a
análise de acurácia das técnicas parasitológicas HPJL, Faust e Sheather
comparando com a técnica de Willis (padrão-ouro) para o diagnóstico de ovos de
ancilostomídeos, a técnica que apresentou melhor acurácia foi à técnica de
Sheather, com 81,1% de sensibilidade e 98,4% de especificidade com VPP de
98,6%, VPN 78,8% e índice k demonstrando boa concordância com o
padrãoouro.
Tabela 2 - Avaliação da acurácia das técnicas de Sheather, Faust e
HoffmanPons-Janer-Lutz em relação à técnica de Willis (padrão-ouro), para o
diagnóstico de Ancilostomídeos.
Sensibilidade
% (IC 95%)
Especificidade
% (IC 95%)
VPP%
(IC 95%)
VPN%
(IC 95%)
k%
(IC95%)
Sheather 81,1 98,4 98,6 78,8 0,768
Faust 73 96,9 97 72,1 0,667
HPJL 78,9 92,2 93,4 75,6 0,689
VPP: valor preditivo positivo; VPN: valor preditivo negativo, HPJL: HoffmanPons-
Janer-Lutz, k: índice kappa, IC: índice de confiança.
Estudo realizado por CERQUEIRA et al., (2007) se propôs a analisar a
eficiência da técnica de Willis comparando com a HPJL, onde a técnica HPJL se
mostrou mais sensível que a técnica de Willis para o diagnóstico de
76
Ancilostomídeos. Em nosso estudo a técnica HPJL mostrou uma concordância
boa k = 0,689 com o padrão-ouro, mas a acurácia da técnica de Sheather
superou tal técnica sendo mais indicada para o diagnóstico de ancilostomídeos,
por se tratar de um parasito que possui ovos leves, a flutuação pela diferença de
densidade da técnica de Sheather favorece a identificação de ovos com estas
características (SHEATER 1923, DE CARLI 2001). A técnica de Faust se
mostrou com a menor sensibilidade (73%) e menor índice k=0,667, o resultado
de sensibilidade difere do trabalho de SOUZA-DANTAS et al., (2007), em que a
sensibilidade chegou a 100% comparada à necropsia do tubo intestinal dos
gatos.
Analisando a acurácia no diagnóstico de oocistos de Cystoisospora sp., as
técnicas HPJL e Sheather tiveram os mesmos resultados, ambas com 66,7% de
sensibilidade, 97,4% de especificidade, VPP de 89,7%, VPN de 89,6% e k de
0,700 demonstrando boa concordância ao padrão-ouro (Tabela 3).
Tabela 3 - Avaliação da acurácia das técnicas de Sheather, Faust e
HoffmanPons-Janer-Lutz em relação à técnica de Willis (padrão-ouro), para o
diagnóstico de Cystoisospora sp.
Sensibilidade
% (IC 95%)
Especificidade
% (IC 95%)
VPP%
(IC 95%)
VPN%
(IC 95%)
K%(IC9
5%)
Sheather 66,7 97,4 89,7 89,6 0,700
Faust 53,8 97,4 87,5 86,2 0,587
HPJL 66,7 97,4 89,7 89,6 0,700
VPP: valor preditivo positivo; VPN: valor preditivo negativo, HPJL: HoffmanPons-
Janer-Lutz, k: índice kappa, IC: índice de confiança.
Para o diagnóstico de coccídeos recomendam-se técnicas de flutuação em
soluções hipertônicas, esse resultado reforça os trabalhos citados na literatura
que demonstram a acurácia das técnicas de flutuação de Willis e Sheather
associadas, ou ainda associando-se a técnica de HPJL com a técnica de Willis
ou Sheather na rotina laboratorial (GARCIA et al.,1995, GARCIA 2007).
77
Analisando os resultados de acurácia para oocistos de T. gondii, a técnica de
Faust demonstrou a maior sensibilidade 66,7%, especificidade 99,3%, VPP 92,3%,
VPN 95,7% e índice k com concordância boa com a técnica padrão-ouro (Tabela 4).
Tabela 4 - Avaliação da acurácia das técnicas de Sheather, Faust e
HoffmanPons-Janer-Lutz em relação à técnica de Willis (padrão-ouro), para o
diagnóstico de Toxoplasma gondii.
Sensibilidade
% (IC 95%)
Especificidade
% (IC 95%)
VPP%
(IC 95%)
VPN%
(IC 95%)
K%(IC
95%)
Sheater 61,1 97,1 73,3 95 0,627
Faust 66,7 99,3 92,3 95,7 0,750
HPJL 55,6 98,5 83,3 94,4 0,632
VPP: valor preditivo positivo; VPN: valor preditivo negativo, HPJL: HoffmanPons-
Janer-Lutz, k: índice kappa, IC: índice de confiança.
Nessa análise as três técnicas apresentaram valores de sensibilidade
menores que 70%. As técnicas de flutuação em soluções saturadas são
indicadas para oocistos e possuem boa sensibilidade diagnóstica (SHEATHER
1923; FAUST et al., 1938; DRYDEN 2005). Dessa forma para o diagnóstico de
oocistos de T. gondii recomendamos a associação da técnica de Willis com
Faust, ou Willis com Sheather onde k=0,627 que denota boa concordância.
Em conclusão, demonstramos que a associação de técnicas parasitológicas é
importante para o diagnóstico de enteroparasitos em gatos. Para o diagnóstico
de Ancilostomídeos e Cystoisosporasp. a técnica de Sheather apresentou melhor
acurácia associadas à técnica de Willis, no diagnóstico de Toxoplasma gondii a
técnica de Faust apresentou melhor acurácia associada ao padrão-ouro.
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RESUMO EXPANDIDO : SOROPREVALÊNCIA DE Toxoplasma gondii EM
GATOS ERRANTES EM GOIÂNIA, GOIÁS, BRASIL
Heloísa Ribeiro STORCHILO; Ana Maria de CASTRO; Hanstter Hallison Alves
REZENDE; Juliana Boaventura AVELAR; Marina Clare VINAUD.
Laboratório de Estudos da Relação Parasito-Hospedeiro (LAERPH), Instituto de
Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás,
Brasil.
e-mail: [email protected]
Palavras-chave: Toxoplasmose, gatos errantes e sorologia. Agências
financiadoras: Fapeg e CNPq
Introdução
O Toxoplasma gondii é um protozoário com ampla distribuição mundial,
capaz de infectar animais com sangue quente, incluindo o homem (Dubey 2008).
O gato é o hospedeiro definitivo, elimina oocistos nas suas fezes que podem
contaminar o ambiente, permanecendo viáveis por longos períodos. Hospedeiros
intermediários podem ingerir esses oocistos, que darão origem a cistos que
podem permanecer viáveis por toda a vida em seus tecidos (Dubey et al. 1998).
Os gatos errantes constituem um risco para a transmissão de
toxoplasmose, pelo hábito de caça e defecação em locais públicos, disseminando
inúmeros oocistos (Jones e cols. 2001). A sorologia é o método convencional
para diagnosticar a toxoplasmose em gatos, geralmente a análise baseia-se na
detecção de anticorpos da classe IgG específica anti-T.gondii em amostras de
soro dos felídeos (Araújo e cols. 2003).
Uma vez que os gatos errantes são os responsáveis pela contaminação do
meio ambiente, conseqüentemente da água e alimentos, constituem importante
risco para a transmissão de toxoplasmose, esse estudo possui como objetivo
avaliar a soroprevalência de anticorpos anti-T. gondii em amostras de soros de
gatos errantes em Goiânia-Goiás.
82
Material e Métodos
Foram coletadas 50 amostras de soro de gatos capturados pelo Centro de
capturados pelo Centro de Controle de Zoonoses de Goiânia-Goiás,
independente o sexo ou idade do animal. A coleta foi realizada por punção
venosa, sendo coletadas de 2 a 5 mL de sangue, acondicionados em tubos
estéreis. Após a retração do coágulo, a amostra de soro foi obtida e armazenada
a -20ºC para posterior análise.
O método sorológico realizado foi o teste de aglutinação modificado (MAT)
descrito por Desmonts & Remington 1980. Os testes foram realizados em placas
fundo “U”, com antígeno sensibilizado de T. gondii. As amostras foram
previamente tratadas com 2-Mercaptoetanol para eliminar as IgM residuais e não
específicas para T. gondii. A positividade foi considerada com títulos menor que
cinco (<5), sendo positivas as amostras foram diluídas até o título final.
Resultados
Das 50 amostras de soro analisadas, 32 (64%) foram reagentes e 18 (36%) não
reagentes para anticorpos anti-T. gondii. Os animais apresentaram títulos
variados para a infecção conforme observado na Tabela 1:
Tabela 1 - Resultados da sorologia por MAT para Toxoplasma gondii em amostras
de soro de gatos errantes capturados pelo centro de controle de zoonoses em
Goiânia-Goiás.
Resultado da Titulação N %
Não Reagente ( <10) 18 36
Reagente: 10 1 2
Reagente: 20 2 4
Reagente: 40 3 6
Reagente: 80 1 2
Reagente: 160 8 16
Reagente: 320 11 22
Reagente: >/= 640 6 12
50 100
83
MAT: Aglutinação modificada; <= menor ; : >/= 640 = maior e ou igual
Discussão
A elevada soropositividade dos animais analisados (64%) sugere uma
importante taxa de contaminação ambiental, visto que em algum momento os
animais eliminaram oocistos no meio ambiente. A imunoglobulina analisado foi os
anticorpos da Classe IgG, marcador de a fase crônica (Dubey e cols. 1995).
Chama a atenção o número de animais soronegativos 36%, que constituem um
risco para a aquisição da toxoplasmose felina, e consequentemente para a futura
disseminação de oocistos.
Observa-se uma diferença na prevalência de anticorpos em outros
estudos, de 14,3% até 84,4%, mesmo na mesma localidade, isso pode ter
ocorrido pelos critérios adotados para definir a amostragem, o período em que a
pesquisa foi realizada e a metodologia utilizada no estudo (DALLA-ROSA e cols.
2010; DUBEY 2004; LANGONI e cols. 2001; BRESCIANI e cols. 2007; BRAGA e
cols. 2012). Neste estudo não foi considerado o sexo dos animais, visto que
dados da literatura já demonstraram que não há uma diferença significativa entre
o sexo dos animais para a prevalência, mas que animais adultos possuem uma
prevalência maior, isso pode ser devido pelo maior tempo de vida e
consequentemente maior risco do animal entrar em contato com o parasito
(Garcia e cols. 1999, Lucas e cols. 1999, Pinto e cols. 2009).
Conclusão
A presença de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em gatos errantes em
Goiânia-Goiás demonstrou-se elevada, comprovando assim a importância
desses animais como disseminadores de oocistos no ambiente,contaminando
água e alimentos que poderão ser ingeridos pelo o homem e outros animais
silvestres e domésticos.
Referências
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