UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO FACULTAD DE …repositorio.uta.edu.ec/bitstream/123456789/26603/1/AL...

I

UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN

ALIMENTOS

CARRERA DE INGENIERÍA EN ALIMENTOS

Evaluación de la digestibilidad gastrointestinal in vitro y actividad antioxidante en

concentrados proteicos de zarandaja (Lablab purpureus L. Sweet).

Trabajo de Titulación, Modalidad: Proyecto de Investigación. previo a la obtención del

Título de Ingeniera en Alimentos, otorgado por la Universidad Técnica de Ambato, a

través de la Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos.

El estudio es parte del proyecto: “Aislamiento y caracterización de nuevos

ingredientes funcionales a partir de proteínas de Amaranto y Quinua para la

elaboración de un alimento funcional” aprobado por el Honorable Consejo

Universitario y financiado por el Centro de Investigaciones de la Universidad Técnica de

Ambato. Resolución 1373-CU-P-2014.

Y del proyecto “Valorización de la calidad nutricional y funcional de alimentos

tradicionales de la población ecuatoriana” perteneciente a la red de cereales,

pseudocereales, tubérculos, raíces y leguminosas de la Red Ecuatoriana de Universidades

y Escuelas Politécnicas para la Investigación y Posgrado, aprobado por PI-REDU-2015-

012M según la resolución 2074-CU-P-2016.

Autora: Irina Jacqueline Galarza Baicilla

Tutor: Ph.D. Mayra Liliana Paredes Escobar

Ambato – Ecuador

Octubre– 2017

II

APROBACIÓN DEL TUTOR

Dra. Mayra Liliana Paredes Escobar

CERTIFICO:

Que el presente trabajo de titulación ha sido prolijamente revisado. Por lo tanto, autorizo

la presentación de este Trabajo de Titulación modalidad Proyecto de Investigación, el

mismo que responde las normas establecidas en el Reglamento de Títulos y Grados de la

Facultad.

Ambato, 19 de Julio del 2017

III

DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD

Yo, Irina Jacqueline Galarza Baicilla, manifiesto que los resultados obtenidos en el

proyecto de investigación, previo a la obtención del título de Ingeniera en Alimentos son

absolutamente auténticos y personales a excepción de las citas.

IV

APROBACIÓN DE LOS MIEMBROS DE TRIBUNAL DE GRADO

Los suscritos profesores Calificadores, aprueban el presente Trabajo de Titulación

modalidad Proyecto de Investigación, el mismo que ha sido elaborado de conformidad

con las disposiciones emitidas por la Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos de la

Universidad Técnica de Ambato.

Para constancia firman:

Ambato, 22 de septiembre del 2017

V

DERECHOS DE AUTOR

Autorizo a la Universidad Técnica de Ambato, para que haga de este Proyecto de

Investigación o parte de él un documento disponible para su lectura, consulta y procesos

de investigación, según las normas de la Institución. Cedo los derechos en línea

patrimoniales de mi Proyecto, con fines de difusión pública, además apruebo la

reproducción de este Proyecto dentro de las regulaciones de la Universidad, siempre y

cuando esta reproducción no suponga una ganancia económica y se realice respetando

mis derechos de autor.

VI

DEDICATORIA

A Dios por regalarme un día más de vida.

A mis padres por el apoyo y amor que me han brindado durante toda mi vida. En

especial a mi madre por la confianza y el cariño que he necesitado durante los

momentos más difíciles de mi vida. A mi padre por el apoyo moral que a pesar de todos

los problemas siempre estará presente en mi corazón.

VII

AGRADECIMIENTOS

Agradezco primeramente a Dios y a la Virgencita por todas las bendiciones que me ha

dado, por la salud y por la vida.

A mis padres por guiarme por el camino del bien.

Al Doc. Ismael por la confianza que deposito en mí para poder iniciar el desarrollo de

mi tesis.

A la Doc. Mayra por la paciencia que tuvo en mí, para ayudarme a redactar la tesis.

A mis amigas las ladys, Yos, Anita, Jeka, Zoy, Karin, Katy, Alexa, Fer A y Tefa, por

todos esos momentos de locuras que sin duda algunas los volvería a repetir y como

siempre les he dicho la vida es una sola disfrutemos mientras podamos. Gracias por esa

verdadera amistad, las quiero mucho mis ladys.

Amor, Paz, FÉ y Felicidad.

ÍNDICE DE CONTENIDO CAPÍTULO I ...................................................................................................................... 1

EL PROBLEMA ................................................................................................................ 1

1.1. TEMA .................................................................................................................. 1

1.2. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................ 1

1.3. OBJETIVOS ........................................................................................................ 2

1.3.1. Objetivo General .......................................................................................... 2

1.3.2. Objetivos Específicos ................................................................................... 2

CAPÍTULO II .................................................................................................................... 3

MARCO TEÓRICO ........................................................................................................... 3

2.1. ANTECEDENTES INVESTIGATIVOS ............................................................ 3

2.2. HIPÓTESIS ......................................................................................................... 5

2.3. SEÑALAMIENTO DE VARIABLES DE LA HIPÓTESIS .............................. 5

CAPÍTULO III ................................................................................................................... 6

MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................................... 6

3.1. MATERIALES .................................................................................................... 6

3.1.1. Materia prima ............................................................................................... 6

3.1.2. Equipos ......................................................................................................... 6

3.1.3. Reactivos ...................................................................................................... 6

3.1.4. Insumos y Utensilios .................................................................................... 7

3.2. MÉTODOS .......................................................................................................... 8

3.2.1. Obtención de la harina de Zarandaja ............................................................ 8

3.2.3. Concentrados de proteínas de harina de Zarandaja ...................................... 9

3.2.4. Determinación de Fenoles Totales (FT) ..................................................... 10

3.2.5. Caracterización del concentrado proteico .................................................. 10

3.2.6. Actividad antioxidante de los concentrados proteicos (Método TBARS) . 13

3.2.7. Simulación de la digestibilidad gastrointestinal in vitro en proteína ......... 13

3.2.8. Cromatografía líquida ................................................................................ 14

CAPÍTULO IV ................................................................................................................. 15

RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................................................................................... 15

4.1. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ............................................. 15

4.1.1. Análisis proximal ....................................................................................... 15

4.1.2. Rendimiento de los concentrados proteicos de la harina de zarandaja ...... 15

4.1.3. Contenido de polifenoles totales ................................................................ 17

4.1.4. Caracterización de los concentrados proteicos .......................................... 18

4.1.6. Actividad Antioxidante de los concentrados proteicos................................... 23

4.1.7. Técnica RP-UHPLC ....................................................................................... 24

4.2. Verificación de la hipótesis .................................................................................. 28

CAPÍTULO IV ................................................................................................................. 29

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................................................... 29

5.1. Conclusiones ..................................................................................................... 29

5.2. Recomendaciones .............................................................................................. 30

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Métodos de análisis proximal para la harina de zarandaja................................... 9

Tabla 2. Preparación del tampón de corrida para geles ................................................... 11

Tabla 3. Preparación de las soluciones buffer. ................................................................. 12

Tabla 4. Fórmula para la preparación del gel de electroforesis. ...................................... 12

Tabla 5. Análisis proximal de la harina de Zarandaja ...................................................... 15

Tabla 6.Contenido de proteína de los concentrados proteicos de zarandaja a diferentes

pHs mediante el método Dumas. ....................................................................... 19

Tabla 7. Reporte de los pesos y porcentaje de rendimientos de los concentrados

proteicos a diferentes pHs de precipitación a partir de 5 gramos de muestra. ... 38

Tabla 8. Datos de la curva estándar con GAE para el cálculo de polifenoles.................. 39

Tabla 9.Datos del contenido de polifenoles de los sobrenadantes a diferentes pH con

Absorbancia de 750 nm. .................................................................................... 39

Tabla 10.Valores de la cuantificación proteica de los concentrados elaborados a

diferentes pHs de precipitación por el método Dumas. ..................................... 40

Tabla 11.Datos de absorbancia a 532 nm de los controles para el cálculo de la

actividad antioxidante. ....................................................................................... 41

Tabla 12.Datos de absorbancia a 532 nm a diferentes concentraciones. ......................... 41

Tabla 13.Valores de actividad antioxidante del BHT obtenidos a absorbancia de 532

nm ...................................................................................................................... 41

Tabla 14.Valores promedio de la actividad antioxidante de los concentrados proteicos

determinada in vitro con TBA luego de 24 horas de incubación a 38 °C

obtenidos a la absorbancia de los productos de la reacción a 532 nm. .............. 42

Tabla 15.Valores promedio de la actividad antioxidante de los concentrados proteicos

determinada in vitro con TBA luego de 48 horas de incubación a 38 °C

obtenidos a la absorbancia de los productos de la reacción a 532 nm. .............. 43

Tabla 16. Análisis de varianza de los rendimientos proteicos ......................................... 45

Tabla 17.Cuadro de análisis de varianza de los rendimientos proteicos .......................... 45

Tabla 18. Prueba de Tukey de los rendimientos proteicos............................................... 45

Tabla 19. Análisis de varianza del contenido de polifenoles ........................................... 46

Tabla 20. Cuadro de análisis de varianza del contenido de polifenoles........................... 46

Tabla 21. Prueba de Tukey del contenido de polifenoles ................................................ 46

Tabla 22.Cuadro de análisis de varianza de la actividad antioxidante in vitro a 200

μg/mL y del control BHT. ................................................................................. 47

Tabla 23.Test de Tukey de la actividad antioxidante in vitro a 200 μg/mL y del

control BHT. ...................................................................................................... 47

Tabla 24.Cuadro de análisis de varianza de la actividad antioxidante in vitro a

400.μg/mL y del control BHT. .......................................................................... 47

Tabla 25.Test de Tukey de la actividad antioxidante in vitro a 400 μg/mL y del control

BHT.................................................................................................................... 48


1000.μg/mL y del control BHT. ........................................................................ 48


control BHT. ...................................................................................................... 48



Tabla 29. Test de Tukey de la actividad antioxidante in vitro a 1000 μg/mL y del

control BHT. ...................................................................................................... 49

Tabla 30. Cuadro de análisis de varianza de la actividad antioxidante in vitro a 200



control BHT. ...................................................................................................... 50




control BHT. ...................................................................................................... 50




control BHT. ...................................................................................................... 51




control BHT. ...................................................................................................... 51

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Zarandaja (Lablab purpureus L. Sweet). ............................................................ 8

Figura 2. Precipitación de proteína a diferentes pH a partir de harina de zarandaja........ 16

Figura 3. Valores promedio de los rendimientos obtenidos por precipitación

isoeléctrica a diferentes pHs. Las barras sobre las medias indican desviación

estándar. Medias con una letra en común representan que no existe diferencia

significativa (p>0,05). ........................................................................................ 17

Figura 4. Valores promedio del contenido de polifenoles a diferentes pHs. Letras

iguales indican que no existe diferencia significativa (p> 0,05) de acuerdo al

test de Tukey. ..................................................................................................... 18

Figura 5. Gel de electroforesis SDS-PAGE sin agente reductor 2-mercaptoetanol de

los concentrados proteicos de zarandaja a diferentes pHs de precipitación y

del estándar. ....................................................................................................... 19

Figura 6.Gel de electroforesis SDS-PAGE con 2-mercaptoetanol de los concentrados

proteicos de zarandaja a los diferentes pHs de precipitación y del estándar. .... 20

Figura 7.Gel de electroforesis NATIVE-PAGE de los concentrados proteicos de

zarandaja a diferentes pH de precipitación. ....................................................... 21

Figura 8. Gel de electroforesis SDS-PAGE con agente reductor 2-mercaptoetanol de

la simulación de la digestión gástrica de los concentrados proteicos de

zarandaja a pH 4................................................................................................. 22

Figura 9. Gel de electroforesis SDS-PAGE con agente reductor 2-mercaptoetanol de

la simulación de la digestión duodenal de los concentrados proteicos de

zarandaja precipitados a pH.4. ........................................................................... 22

Figura 10. Porcentaje de actividad antioxidante durante 24 horas de los concentrados

proteicos a diferentes pH de precipitación evaluados a varias concentraciones

frente al patrón BHT. ......................................................................................... 24

Figura 11. Perfil cromatográfico de los concentrados proteicos de zarandaja obtenidos

a pH de precipitación pH 4 (azul) y pH 5 (rojo). ............................................... 25

Figura 12.Perfil cromatográfico de los concentrados proteicos de zarandaja obtenidos

a pH 6,0 (azul) y a pH 7,0 (rojo). ....................................................................... 26

Figura 13.Perfil cromatográfico de los hidrolizados proteicos de zarandaja

provenientes de la fase de digestión gástrica realizada a pH 1,2 (negro)

pH 2,0 (rojo) pH 3,2 (azul). ............................................................................... 27

Figura 14. Perfil cromatográfico de los hidrolizados proteicos de zarandaja de la fase

duodenal obtenido a partir de los digeridos gástricos realizados a pH 1,2

(negro), pH 2,0 (rojo) y pH 3,2 (azul). ............................................................... 28

Figura 15.Curva de calibración del ácido gálico para la determinación del contenido

de polifenoles. .................................................................................................... 39

Figura 16.Porcentaje de actividad antioxidante durante 48 horas de los concentrados

proteicos a diferentes pH de precipitación evaluados a varias concentraciones

frente al patrón BHT. ......................................................................................... 43

LISTA DE ABREVIATURAS

BHT Butilhidroxitolueno

EDTA Ácido etilendiaminotetraacético

GAE Equivalente de ácido gálico

h Horas

HCl Ácido clorhídrico.

HPLC High-performance liquid chromatography: cromatografía líquida de alta

eficacia

INIAP Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias.

KDa Kilo Dalton

M Molar

mg Miligramos

min Minutos

mL Mililitros

N Normal

NaOH Hidróxido de sodio.

PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida.

PM Peso molecular

PSA Persulfato de amonio.

rpm Revoluciones por minuto

SDS Dodecilsulfato de Sodio por sus siglas en inglés

SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio

TBA Ácido 2-tiobarbitúrico.

TBARS Sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico

TEMED Tetrametile tilenediamina.

TFA Ácido trifluoroacético

V Voltios

μL Microlitros

RESUMEN

La presente investigación se basó en la obtención de concentrados proteicos de zarandaja

(Lablab purpureus L. Sweet) para evaluar su digestibilidad gastrointestinal in vitro y la

actividad antioxidante.

Los concentrados proteicos fueron obtenidos mediante precipitación isoeléctrica a

diferentes pHs: 4,0; 5,0; 6,0 y 7,0 luego de solubilizar las proteínas a pH 8,0. El mejor

rendimiento fue de 15,06.% a pH.4.

El contenido de polifenoles determinado en los sobrenadantes de las muestras varió entre

155,86 a 353,01 mg GAE/ 100 g, encontrándose el mayor contenido de polifenoles en el

sobrenadante de la muestra precipitada a pH 7 con un valor de 353,01 mg GAE/ 100 g.

Se identificó el perfil proteico en los concentrados mediante la técnica de electroforesis

SDS-PAGE, obteniéndose bandas aproximadamente entre 11 y 135 kDa correspondiente

a las globulinas 7S, 11S y albuminas 2S.

Se determinó la digestibilidad gástrica y duodenal in vitro de los concentrados proteicos

a condiciones fisiológicas humanas. Los resultados mostraron que las proteínas no se

digirieron completamente, quedando una banda de mayor expresión de 38 kDa que

corresponde a las globulinas ácidas 11S para todos los pH.

Palabras claves: digestibilidad gastrointestinal, actividad antioxidante, polifenoles,

electroforesis, precipitación proteica.

ABSTRACT

This research was based on obtaining protein concentrates of zarandaja (Lablab purpureus

L. Sweet) to evaluate their in vitro gastrointestinal digestibility and antioxidant activity.

The protein concentrates were obtained by isoelectric precipitation at different pH 4.0;

5.0; 6.0 and 7.0 after the solubilization of the proteins at pH 8.0; as a result the best yield

was 15.06% at pH.4.

The polyphenol content determined in the supernatants of the samples ranged from 155.86

to 353.01 mg GAE / 100 g; the highest polyphenol content was found in the supernatant

obtained at pH 7 with a value of 353.01 mg GAE / 100 g.

The protein profile in the concentrates was identified by the technique SDS-PAGE, it

ranged approximately between 11 and 135 kDa and corresponds to the 7S and 11S

globulins, and 2S albumins

The in vitro gastric and duodenal digestibility of the protein concentrates were determined

at human physiological conditions, resulting in a not complete digestion of the proteins

leaving a band of higher expression of 38 kDa corresponding to the 11S acid globulins at

all pH.

Key words: gastrointestinal digestibility, antioxidant activity poliphenols,

electrophoresis, protein precipitation.

INTRODUCCIÓN

El Lablab purpureus L. Sweet es originario de África y Asia, es comúnmente conocido

como zarandaja, frijol Jacinto, frijol egipcio y en Japón Fuji name (Valenzuela et al., 2002)

pertenece a la familia Fabaceae y es considerado como una leguminosa importante en las

zonas tropicales y subtropicales de Australia, contiene el 20 – 28 % de proteína cruda.

Las leguminosas son la principal fuente de proteína ya que contienen alrededor de 20 y

40.% superando a los cereales con 7 y 14 % de proteína , aporta antioxidantes y complejos

fenólicos que son beneficiosos para el ser humano en especial para personas que padecen

de cáncer y personas con enfermedades cardiovasculares (Savón et al., 2007).

El consumo de las leguminosas con alto contenido de antioxidantes es recomendable

porque reduce el daño oxidativo, que se produce por los radicales libres (Avello et al.,

2006). Las proteínas son esenciales para el desarrollo del crecimiento y el metabolismo

en el ser humano ya que aportan proteínas de almacenamiento y reserva como las

globulinas y albúminas (Orozco et al., 2016).

Se han realizado varios estudios para aumentar el consumo de leguminosas no

convencionales mediante la preparación de aislados, harinas y concentrados proteicos con

el fin de consumir las fuentes vegetales como alimento funcional para el mejoramiento de

las condiciones nutricionales del producto (Chel et al., 2003).

Varios autores reportan que las hojas de zarandaja no poseen taninos, pero aportan un

excelente alimento para animales monogástricos, sin embargo, las semillas del Lablab

purpureus L. Sweet poseen factores antinutricionales, como fitatos, taninos e inhibidores

de tripsina que mediante métodos de procesamiento se pueden reducir o eliminar la capa

de las semillas para ser ingeridos en la dieta (Shaahu et al., 2015). Por tal motivo es de

suma importancia el presente estudio ya que permite recolectar información de la

actividad antioxidante y contenido de fenoles para considerarlo como una buena fuente de

alimentación para el ser humano y la industria alimentaria.

1

CAPÍTULO I

EL PROBLEMA

1.1. TEMA

Evaluación de la digestibilidad gastrointestinal in vitro y actividad antioxidante en

concentrados proteicos de zarandaja (Lablab Purpureus L. Sweet).

1.2. JUSTIFICACIÓN

La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y Agricultura (FAO,

2016) indica que los granos son la principal fuente de consumo humano.

En Ecuador el cultivo de zarandaja no se encuentra fomentado, existiendo pocos

lugares como Celica, Pindal y Espíndola en la provincia de Loja que realizan su cultivo

y cosecha. Sin embargo, el Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca

promueve el desarrollo del territorio rural sostenible a través de la “Política

Agropecuaria Ecuatoriana” con el objetivo de incrementar la actual producción de

cultivos sub – valorizados, entre ellos la zarandaja (MAGAP, 2015).

El fréjol en general es una fuente de proteína que con la mezcla de cereales permite

mantener una función nutricional equilibrada, por esta razón es recomendable para

personas que sufren de desnutrición y anemia. La desnutrición se debe a la carencia de

proteínas de buena calidad y a la baja absorción de ciertas vitaminas y minerales. Su

incidencia en los niños afecta su desarrollo y posterior desempeño físico y mental

(Fraile et al., 2007).

La zarandaja es una variedad de fréjol, cuyo contenido de proteína oscila entre el 20 y

28% que sumado a la alta cantidad de vitaminas del complejo B y contenido de fibra

que también contiene, lo hacen apto para alimentación humana y animal (Franco et al.,

2006).

Según el MIES (2008), el consumo de esta leguminosa ayuda a mantener niveles

saludables de colesterol y disminuye el riesgo de diabetes ya que mediante su fibra

2

ayuda a la filtración de carbohidratos facilitando la regulación de la glucosa en la

sangre y permitiendo el desarrollo de las células, órganos, tejidos, huesos y dientes.

La presente investigación permitirá realizar una caracterización de concentrados

proteicos de zarandaja mediante la determinación de la actividad antioxidante,

cantidad de polifenoles y la simulación gastrointestinal.

Este estudio será un importante aporte en la investigación de fuentes alternativas de

proteínas con características biofuncionales, permitiendo generar información sobre la

composición de alimentos tradicionales, aportando así a la seguridad alimentaria del

país.

1.3. OBJETIVOS

1.3.1. Objetivo General

Evaluar la digestibilidad gastrointestinal in vitro y la actividad antioxidante de

concentrados proteicos de harina de Zarandaja (Lablab purpureus L. Sweet).

1.3.2. Objetivos Específicos

o Obtener aislados proteicos a diferentes niveles de pH mediante precipitación

isoeléctrica.

o Identificar la presencia de polifenoles en sobrenadantes de la precipitación

isoeléctrica a diferentes pH y actividad antioxidante mediante el ensayo de

TBARS.

o Caracterizar por peso molecular el perfil proteico mediante la técnica de

electroforesis SDS-PAGE.

o Cuantificar la concentración proteica mediante el método DUMAS.

3

CAPÍTULO II

MARCO TEÓRICO

2.1. ANTECEDENTES INVESTIGATIVOS

La Zarandaja (Lablab purpureus L. Sweet) es una leguminosa perteneciente a la

familia Fabaceae conocida también como frijol Jacinto, frijol egipcio y en Japón

Fujiname (Valenzuela y Smith, 2002) y es considerada como una leguminosa

importante en las zonas tropicales y subtropicales de Australia, es originaria de Asia y

África (Laguna, 2001) y se encuentra en algunos países Bolivia, Colombia, Panamá y

Ecuador (Bruce et al., 2001).

Las leguminosas tienen alto contenido de nutrientes ya que son ricas en proteínas

magras, contienen el doble de proteína que los cereales de grano entero (avena, trigo

y cebada), son ricas en fibra y en vitaminas esenciales como la tiamina, niacina,

riboflavina y ácido fólico, contienen minerales como potasio, magnesio, zinc entre

otros, son altas en carbohidratos complejos lo que aporta energía y contribuye a

estabilizar los niveles de glucemia y convierte a las leguminosas en la opción ideal

para personas con diabetes, dado que mejora la resistencia a la insulina (Fraile et al.,

2007).

Las proteínas, las cuales están compuestas en su mayor parte de aminoácidos, poseen

propiedades funcionales (Peña et al., 1988). El comportamiento de la proteína depende

de la conformación, peso molecular, carga neta y secuencia de aminoácidos (Boatella

et al., 2004).

En la actualidad se promueve la extracción de las proteínas vegetales en forma de

aislados proteicos como un vía para la eliminación o disminución de los factores

antinutricionales contenidos en las semillas, a la vez que hace posible el uso de las

proteínas como ingredientes funcionales en la industria de los alimentos (Girón et al.,

2005).

Un método que permite la separación de las moléculas de las proteínas es la

electroforesis que mediante la creación de un campo eléctrico hace circular a las

4

moléculas cargadas eléctricamente a diferentes velocidades. La técnica más utilizada

es la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-

PAGE), en la cual reactivos químicos como el dodecilsulfato de sodio (SDS), el 2-

mercaptoetanol y en presencia de calor, desnaturalizan las proteínas destruyendo sus

estructuras secundarias y terciarias, además el SDS aporta con cargas negativas

permitiendo la separación de las moléculas por tamaños (García, 2000).

Según Photur (2012) dos factores importantes en la separación de proteínas por

electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS son la carga superficial

y el peso molecular.

Los concentrados proteicos son de interés, porque pueden presentar una capacidad

antioxidante. Los antioxidantes se caracterizan por retrasar o impedir la oxidación de

varias sustancias como los ácidos grasos cuya reacción se origina tanto en los

alimentos como en el organismo humano (Zamora, 2007). La acción de los

antioxidantes se puede determinar mediante el método de las sustancias reactivas al

ácido tiobarbitúrico (TBARS). Según Vicario et al. (1997) la técnica más adecuada

para el método TBARS es la extracción simple, modificada y optimizada en aceites de

oliva, aplicable con igual eficacia a los aceites de semilla.

Los compuestos polifenólicos son metabolitos secundarios de las plantas, poseen en

sus estructuras anillos aromáticos y conforme aumenta el número de sustituyentes va

incrementando la complejidad de la estructura (Mercado et al., 2013). Los polifenoles

son los principales antioxidantes en la dieta y pueden tener efectos favorables en el

sistema cardiovascular, inhiben el crecimiento de tumores y el bloqueo de las vías

metabólicas que pueden ocasionar carcinogénesis (Quiñones et al., 2012).

De igual manera, otro parámetro importante para la determinación de la calidad de las

proteínas es la digestibilidad. La digestibilidad de las proteínas, se mide en varias

formas: in vitro e in vivo, la primera se da cuando las proteínas por acción de la pepsina

y la pancreatina son sometidas a una digestión artificial. La digestión incluye dos

procesos, la hidrólisis de moléculas complejas de los alimentos y la absorción de

pequeñas moléculas como aminoácidos y ácidos grasos en el intestino (FAO, 1994).

La cromatografía líquida es un método físico que permite la separación física y

cuantitativa de varios componentes de una solución mediante la permeabilidad

5

selectiva de una mezcla. La cromatografía utiliza una fase móvil y una fase

estacionaria; la fase móvil es un líquido que fluye constantemente durante el análisis

a través de una columna que contiene a la fase estacionaria (Bermeo, 1991). La

cromatografía líquida en fase reversa en base a su polaridad permite separar grandes

cantidades de moléculas. Por lo tanto, para el análisis se emplean mezclas de solventes

polares, tales como acetonitrilo, agua, acetato de etilo (Harris, 2001).

2.2. HIPÓTESIS

Hipótesis nula

Ho: Los diferentes pHs de precipitación de los concentrados proteicos de zarandaja no

influyen significativamente en el rendimiento y en la actividad antioxidante.

Hipótesis alternativa

Ha: Los diferentes pHs de precipitación de los concentrados proteicos de zarandaja

influyen significativamente en el rendimiento y en la actividad antioxidante.

2.3. SEÑALAMIENTO DE VARIABLES DE LA HIPÓTESIS

Variable independiente:

Diferencia de pH de precipitación

Variable dependiente:

Rendimiento de los concentrados proteicos

Actividad antioxidante en los sobrenadantes

6

CAPÍTULO III

MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. MATERIALES

3.1.1. Materia prima

Se utilizó el fréjol de Zarandaja (Lablab purpureus L. Sweet) proveniente de la

Provincia de Loja.

3.1.2. Equipos

o Agitador vórtex VWR

o Balanza de precisión Mettler

o Congelador Mabe

o Congelador Panasonic Ultra-low Temperature

o Dumas Analyzer VELP

o Equipo de electroforesis Mini-Protean Tetra System, BIO-RAD

o Equipo para RP-UHPLC de Agilent Technologies modelo 1260 Infinity

equipado con un detector de arreglo de diodos.

o Estufa VWR

o Homogenizador T25 Ultra Turrax IKA

o Incubadora VWR

o Liofilizador Bench Top Pro with Omnitronics modelo BTP-3ES0VW

o Microencubadora Esco Provolcell Shaking

o Microcentrífuga Labnet Modelo C2400-B

o Microcentrífuga digital Spectrafuge 24D

o Molino universal modelo Ika Werke M20

o pH-metro Thermo Scientific y Mettler Toledo

o Plancha agitadora Isotemp (Fisher Scientific)

o Refrigerador Indurama

3.1.3. Reactivos

o Aceite virgen de Oliva “El arbolito”

7

o Ácido acético glacial Merck

o Ácido tiobarbitúrico (TBA) de Panreac

o Ácido clorhídrico de Merck

o Ácido trifluoro acético de Merck

o Azul de bromofenol de Bio-Rad

o Acrilamida de Invitrogen

o Coomassie Blue R-250 de Bio-Rad

o Bis-acrilamida de Invitrogen

o Bicarbonato de sodio,

o Butil hidroxi tolueno (BHT),

o Carbonato de sodio de Merck

o Cloruro de sodio

o Dodecil sulfato de sodio (SDS) de Invitrogen

o Folin-Ciocalteu de Biomedicals

o Glicina # 161-0724, BIO-RAD

o Glicerol de Invitrogen

o Hidróxido de sodio de Merck

o Metanol grado HPLC de Merck

o Persulfato de amonio (PSA) de BIO-RAD

o Pancreatina de Sigma

o Pepsina gástrica porcina de Sigma

o Soluciones Buffer de pH 4, 7 y 10 para calibración del medidor de pH

o TEMED (N,N,N’,N´-tetrametilen-diamina) de Bio-Rad

o Tris-HCl de Bio-Rad

o 2-mercaptoetanol de BIO-RAD

3.1.4. Insumos y Utensilios

o Agua destilada

o Agua miliQ

o Cámara fotográfica

o Cinta adhesiva

o Envases de plástico

o Espátulas

8

o Frascos para reactivos

o Gotero plástico y de vidrio

o Gradillas

o Guantes de látex

o Materiales de vidrio

o Marcadores

o Magnetos

o Micropipetas

o Papel filtro

o Papel Parafilm

o Papel absorbente

o Papel aluminio

o Probetas de varios volúmenes

o Puntas de 100-1000 µL, 20-200 µL, 0,5-10 µL, 1 mL, 5 mL y 10 mL.

o Tamiz de 250 μm.

o Tubos eppendorf de 1,5 y 2,0 mL

o Tubos para centrífuga de 15 y 50 mL

o Varillas de agitación

o Vasos de precipitación de varios volúmenes

3.2. MÉTODOS

3.2.1. Obtención de la harina de Zarandaja

Para la obtención de la harina se procedió a moler el frijol de Zarandaja en un molino

universal modelo Ika Werke M20 durante 5 minutos aproximadamente, el tamaño de

partícula obtenido fue de 250 μm.

Figura 1. Zarandaja (Lablab purpureus L. Sweet).

Fuente: Laboratorio BIO-PROPEPTI.

9

3.2.2. Análisis Proximal

Se realizó el análisis proximal de la harina de Zarandaja en base seca en el Laboratorio

del Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIAP) – Santa Catalina,

ubicado en Quito.

Tabla 1. Métodos de análisis proximal para la harina de zarandaja

ENSAYOS METODOS

Humedad MO-LSAI-01.01

Cenizas MO-LSAI-01.02

Extracto etéreo o grasa MO-LSAI-01.03

Proteína MO-LSAI-01.04

Fibra cruda MO-LSAI-01.05

Elementos libres de nitrógeno MO-LSAI-01.06

FUENTE: INIAP (2017)

3.2.3. Concentrados de proteínas de harina de Zarandaja

Se obtuvieron los concentrados proteicos a partir de la harina de Zarandaja por

precipitación isoeléctrica siguiendo el método propuesto por Martínez et al. (1996) con

ligeras modificaciones, se pesó 5 gramos de harina de zarandaja y se dispersó en 50

mL de agua destilada se realizó por triplicado, la solubilización se realizó a un pH fijo

de 8.0 con hidróxido de sodio 2 N durante 1 hora y se separó la fracción soluble en

una centrífuga marca Labnet a 4400 rpm por 20 min. A continuación, se procedió a

precipitar la proteína a pH 4,0; 5,0; 6,0; 7,0. El ajuste de los pHs se realizó con ácido

clorhídrico 1 M en una plancha agitadora Isotemp (Fisher Scientific) por 10 minutos

en constante movimiento. Seguidamente se refrigeró durante 24 horas y se separó el

sobrenadante del precipitado, el precipitado se congeló a -80°C, luego se liofilizó en

un Liofilizador Bench Top Pro modelo BTP-3ES0VW a temperatura de -50°C y a

presión de 0,2 Pa. El rendimiento se calculó con la siguiente formula:

% 𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 =𝑃𝑓

𝑃𝑜∗ 100

10

Donde:

Pf: Peso final de la muestra liofilizada (g).

Po: Peso inicial de la harina de zarandaja (g)

3.2.4. Determinación de Fenoles Totales (FT)

Se determinó los fenoles totales según la metodología descrita en el trabajo de Vasco

et al. (2008) con ligeras modificaciones, en un matraz de 5 mL se añadió 0,1 mL del

sobrenadante obtenido en el proceso de precipitación a pH de 4,0; 5,0; 6,0; 7,0 y de un

blanco, luego 0,1 mL de reactivo de Folin-Ciocalteu y se agitaron los matraces en un

vórtex durante 3 minutos, seguidamente se colocó 2 mL de Na2CO3 al 7,5.% y se

completó hasta 5.mL con agua destilada, se dejó reposar durante 1 hora a temperatura

ambiente, luego se midió la absorbancia en un espectrofotómetro a 750 nm. Los

resultados obtenidos se expresaron como equivalentes de ácido gálico, utilizando una

curva de calibración en el rango de 50 a 200 ppm.

Los fenoles totales se calculó con la siguiente fórmula:

𝐴 = (𝑚 × 𝐶) + 𝐵

A: Absorbancia (750nm)

m: Pendiente de la curva estándar

C: Concentración (mg/L).

B: Interacción del valor de la absorbancia.

3.2.5. Caracterización del concentrado proteico

3.2.5.1. Cuantificación proteica por el método Dumas

Se pesó 50 mg de los concentrados proteicos sobre el papel aluminio (proporcionado

por el fabricante), luego se colocó las muestras en el equipo Vel Scientifica-NDA

Series para el análisis. Se escogió una curva de calibración estándar con ácido

etilendiaminotetraacético (EDTA), para el rango de concentración de proteína y se

ajustó a los siguientes factores:

11

o Factor de proteína (% N = PROT): 5,7

o Factor de oxígeno (mL O2 / mg de muestra): 1,8

o Caudal de Oxígeno (mL O2 / min): 400

3.2.5.2. Electroforesis (SDS-PAGE)

Se utilizó el método descrito por Laemmli (1970) con modificaciones, se empleó un

equipo Bio-Rad LifeScience, USA modelo Mini Protean II, con voltaje constante de

200.V y se aplicó la técnica analítica de electroforesis en gel de poliacrilamida con

dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). La composición de los geles se detalla en la

Tabla 4 y la del tampón de corrida en la Tabla 2.

Para la preparación de las muestras se pesó 10 mg de los concentrados proteicos de

zarandaja a los diferentes pHs de precipitación en tubos eppendorf de 1,5 mL, se

añadió 1 mL de agua destilada y se agitó en el vórtex. Se utilizó tres tubos eppendorf

para cada pH y se colocó 200 μL de la solución a cada tubo seguidamente se añadió al

primer tubo 200.μL del buffer con agente reductor (Tabla 3), al segundo tubo 200 μL

del buffer sin agente reductor (Tabla 3) y al tercer tubo 200 μL del buffer native (Tabla

3). Las muestras fueron calentadas en un microincubadora a 90°C por 5 minutos a 500

rpm.

Tabla 2. Preparación del tampón de corrida para geles

Buffer running Buffer native

Tris-HCl 5 g 1,5 g

Glicina 7,5 g 7,5 g

SDS 0,5 g ---

12

Tabla 3. Preparación de las soluciones buffer.

Buffer con el

agente

reductor

Buffer sin el agente

reductor

Buffer

native

Agua destilada 4,8 mL

Tris-HCl 0,5 M (pH 6,8) 1,2 mL

Glicerol puro 1,0 mL

SDS al 10.% 2,0 mL ---

Mercaptoetanol 0,6 mL --- ---

Azul de bromofenol 1 punta de espátula

Tabla 4. Fórmula para la preparación del gel de electroforesis.

Gel separador al 16% Gel compactador al 4%

Agua destilada 1,2 mL Agua destilada 2,2 mL

Tris- HCl pH 8,8 1,3 mL Tris- HCl pH 6,8 0,42 mL

Acrilamida 2,7 mL Acrilamida 0,7 mL

SDS al 10.% 75 mL SDS al 10.% 3,3 μL

TEMED 10 mL TEMED 6 μL

PSA al 10% 20 mL PSA al 10% 20 μL

Con la preparación del gel separador y compactador se formó un gel de 1 mm de

espesor, se colocó en las placas de vidrio y se añadió a cada pocillo 15 μL de la

solución de los concentrados proteicos, en el primer pocillo se colocó el estándar con

pesos moleculares de 11 a 180 kDa marca Dual Color de Bio Rad # 161 03734. La

corrida de los geles se realizó a 200 V durante un tiempo aproximado de 30 minutos,

seguido a esto se tiñeron los geles con la solución de azul de Coomassie brilliant R-

250 compuesta por 50.mL Metanol, 10 mL ácido acético, 40 mL Agua y 0,1 % R-250

durante 2 horas y por último se destiñeron con la solución metanólica compuesta por

50.% Metanol, 5.% ácido acético y 45.% Agua.

13

3.2.6. Actividad antioxidante de los concentrados proteicos (Método TBARS)

El análisis se realizó según el método descrito por (Guzmán-Chozas et al., 1999) con

modificaciones. Se pesó 4 mg del concentrado proteico en 2 mL de agua destilada y

se realizó diluciones para 0,20; 0,40; 1,0; 2,0 mg/mL en tubos eppendorf de 1,5 mL,

se añadió 500 µL de muestra y 500 µL de aceite de oliva oxidado en un tubo eppendorf

de 2 mL (se oxidó el aceite en una estufa a 68°C por 10 días). Las muestras se

colocaron en la estufa por 24 y 48 horas a 28°C, luego se añadió 1 mL de ácido 2-

tiobarbitúrico 0.067 M (TBA) en ácido acético glacial al 90 %, se utilizó el control

positivo y negativo con aceite de oliva no oxidado y oxidado, respectivamente.

En el control negativo se colocó 500 µL de agua destilada y 500 µL de aceite de oliva

oxidado y 1 mL de TBA al 1 % y para el control positivo se realiza el mismo

procedimiento. Seguidamente se incubaron las muestras a 95°C por 60 minutos. Luego

se realizaron las lecturas de absorbancia en un espectrofotómetro a 532 nm.

Los datos obtenidos fueron comparados con el antioxidante sintético BHT siguiendo

el mismo procedimiento. El porcentaje de actividad antioxidante se calcula con la

siguiente formula:

% 𝐴𝐴 =𝐶 − 𝑀

𝐶∗ 100

Donde:

AA: Inhibición de peroxidación lipídica o actividad antioxidante (%)

C: Promedio de la absorbancia del aceite oxidado.

M: Absorbancia de la muestra.

3.2.7. Simulación de la digestibilidad gastrointestinal in vitro en proteína

3.2.7.1. Fase gástrica

Se utilizó el método descrito por Jiménez-Saiz et al. (2011) para lo cual se tomó 10

mg del concentrado proteico, se añadió 1 mL de fluido gástrico simulado (NaCl 0,35

M a pH 1.2, 2.0, 3.2), se colocó 100 µL de solución pepsina a 2000 U/mg de proteína,

seguidamente se incubó en una microencubadora Esco Provolcell Shaking a 37.°C

14

durante 60 min a 500 rpm, se detuvo la reacción con 200 µL de bicarbonato de sodio

1.M a 90 °C por 10 min. El avance de la hidrólisis de las proteínas se analizó mediante

electroforesis en gel SDS-PAGE con la presencia del agente reductor 2-

mercaptoetanol (García, 2000).

3.2.7.2. Fase Duodenal

Para la fase duodenal se utilizó los hidrolizados gástricos hasta antes de detener la

reacción, seguidamente se tomó 1 mL de la muestra de digestión gástrica y 1 mL de

solución de pancreatina (100 U/mg), luego se incubó a 37 °C durante 2 horas a 500

rpm y se detuvo la reacción por calentamiento a 90 °C por 5 min. El avance de la

hidrólisis de las proteínas se analizó mediante electroforesis en gel SDS-PAGE con la

presencia del agente reductor 2-mercaptoetanol (García, 2000).

3.2.8. Cromatografía líquida

Se pesó 5 mg de los concentrados e hidrolizados proteicos de todos los pHs en un tubo

eppendorf a los cuales se añadió 1 mL de agua destilada y se agitó para solubilizar las

muestras. Se centrifugó en una microcentrífuga Labnet Modelo C2400-B las muestras

por 1 min a 13000 rpm, se filtró en los viales y se analizó en el equipo de Cromatografía

Líquida de Alta Eficacia en Fase Reversa (RP-HPLC) de Agilent Technologies modelo

1260 Infinity. Se utilizó una columna Zorbax EC C18 de 4,6 mm y 2,5 µm de tamaño

de partícula y se empleó un solvente A compuesto por agua miliQ + ácido

trifluoroacético (TFA) al 0,27 % (v/v) y un disolvente B de metanol + TFA al 0,37%

(v/v). Se utilizó un gradiente de trabajo el cual fue de 0.% B hasta 70.% B en una

rampa que se ejecutó en 12 minutos con flujo de 1 mL/min y la detección se realizó a

280 nm de acuerdo al método descrito por Carrillo et al. (2016).

15

CAPÍTULO IV

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

4.1.1. Análisis proximal

En la tabla 5 se muestra la composición proximal (%) de la harina de zarandaja en base

seca, presentando un valor de 22,46% de proteína. Estos resultados se corroboran con

los determinados por Savón et al. (2007) que obtuvieron 19,47 % de proteína. Otro

resultado similar fue encontrado en el estudio realizado por Díaz et al. (2011), con un

valor de 19,76 % de proteína al someter los granos en una solución de hipoclorito de

sodio para la obtención de la harina. Por lo tanto Sangronis et al. (2007) indica que el

contenido proteico de una matriz vegetal va a depender de las variedades de las

semillas, especies y condiciones de germinación.

Tabla 5. Análisis proximal de la harina de Zarandaja

Análisis Contenido (%)

Humedad 9,3

Proteína 22,46

Grasa 0,63

Cenizas 3,15

Fibra cruda 12,35

Carbohidratos totales 61,41

Fuente: INIAP (2017)

4.1.2. Rendimiento de los concentrados proteicos de la harina de zarandaja

Para obtener el rendimiento de los concentrados proteicos se utilizó la harina de

zarandaja, ésta fue mezclada con agua destilada en relación 1:10 y llevada a pH 8 con

adición de solución de NaOH (2N), con la finalidad de solubilizar las proteínas

16

presentes en la harina. Las proteínas fueron precipitadas a diferentes pHs: 4,0; 5,0; 6,0

y 7,0 con solución de HCl (1M).

En la figura 2 se puede observar claramente que existe mayor cantidad de proteína

precipitada a pH 4,0 y 5,0 sin embargo, a pH 6,0 hubo menor cantidad en relación a

los demás pH y a pH 7,0 no hubo precipitación proteica, ésto puede deberse a que el

punto isoeléctrico de las proteínas vegetales generalmente se encuentra por debajo del

pH 6.

Figura 2. Precipitación de proteína a diferentes pH a partir de harina de zarandaja.

La figura 3 muestra que el mayor rendimiento proteico se obtuvo a pH 4,0 con

15,06.%, seguido por el rendimiento a pH 5,0 con un valor de 14,48.% en tanto que el

menor porcentaje de rendimiento de concentrado proteico se produjo a pH 7 con

0,83.%.

El análisis de varianza aplicado refleja que el pH influye en el porcentaje de

rendimiento proteico, por lo que se aplicó el Test de Tukey al 95 % de confianza, el

cual indicó que existe diferencia significativa entre el rendimiento obtenido a pH 6,0

y 7,0 con valores de 5,90.% y 0,83.%, respectivamente. En cambio, los concentrados

obtenidos a pH 4,0 y 5,0 no presentan diferencias. Con este test se corrobora que el

mejor tratamiento corresponde al concentrado obtenido a pH 4 presentando un

porcentaje de 15,06.%, Por lo tanto, se podría asumir que el punto isoeléctrico de las

proteínas de zarandaja se encuentra cercano a este pH.

pH 4 pH 5 pH 7 pH 6

17

Figura 3. Valores promedio de los rendimientos obtenidos por precipitación isoeléctrica a

diferentes pHs. Las barras sobre las medias indican desviación estándar. Medias con una letra

en común representan que no existe diferencia significativa (p>0,05).

4.1.3. Contenido de polifenoles totales

La determinación del contenido de polifenoles se realizó con los sobrenadantes que

se obtuvieron de la precipitación isoeléctrica a los diferentes pHs. Para el ensayo se

preparó una curva patrón utilizando el estándar de ácido gálico cuyos resultados se

expresan en miligramos de equivalentes de ácido gálico (GAE) por cada 100 gramos

de muestra. (Kuskoski et al., 2005).

En la figura 4 se observa que el contenido de fenoles es mayor a pH 7 con 353,01 mg

GAE/ 100 g encontrándose por debajo del valor reportado por (Cevallos, 2016) que

obtuvo 369,26 mg GAE/100 g en solución acuosa. Sin embargo, (Aguilera et al., 2013)

mediante una solución de metanol obtuvo 170 mg GAE/ 100 g el cual difiere del

resultado reportado en este estudio. Otro ensayo se realizó con fréjol Caupí y Jack bean

que presentaron valores de 370 y 360 mg GAE/ 100 gramos de harina del fréjol,

respectivamente.

18

Figura 4. Valores promedio del contenido de polifenoles a diferentes pHs. Letras iguales

indican que no existe diferencia significativa (p> 0,05) de acuerdo al test de Tukey.

4.1.4. Caracterización de los concentrados proteicos

4.1.4.1. Cuantificación proteica por el método Dumas

Se determinó el contenido proteico presente en los concentrados obtenidos a diferentes

pHs mediante el método Dumas, el análisis se realiza por medio de una combustión en

base a una pirólisis y la medición de gases nitrogenados orgánicos e inorgánicos

(Romero, 1997)

La tabla 6 muestra que la mayor cantidad de proteína se encuentra en el concentrado

preparado a pH.4 con un valor de 81, 60 %; a pH 5 se obtuvo un contenido proteico de

79,34 %; a pH.6 un valor de 74, 50 % y el menor contenido proteico presentó el

concentrado a precipitado a pH 7 con 50,55%. Los resultados arrojados por el método

Dumas fueron similares con el rendimiento obtenido de los concentrados proteicos a

pH 4,0 y 5,0.

19

Tabla 6. Contenido de proteína de los concentrados proteicos de zarandaja a

diferentes pHs mediante el método Dumas.

Tratamientos Peso (mg) Proteína (%)

pH 4 50,02 81,604

pH 5 50,10 79,341

pH 6 50,03 74,507

pH 7 50,00 50,553

4.1.4.2. Electroforesis SDS-PAGE y Native PAGE

Estudios previos mencionan que las proteínas se pueden fraccionar según su

solubilidad utilizando diferentes solventes como el agua para las albuminas, las

soluciones salinas para las globulinas seguidas por las glutelinas y prolaminas solubles

en álcalis y alcohol, respectivamente (Chi-Wah et al., 1994).

En la figura 5 se presenta el gel de electroforesis SDS-PAGE en ausencia del agente

reductor 2-mercaptoetanol. Se observa bandas proteicas de 11 a 100 kDa, para los

concentrados precipitados a pH 4,0 y 5,0 comparadas con los concentrados de los

demás pHs existe una banda de mayor intensidad que corresponde a las globulinas 11S

de la subunidad básica con peso molecular de 20 kDa y de las albuminas 2S con 11

kDa, respectivamente.

También, a todos los pHs ensayados se visualiza una banda proteica de mayor

expresión que va de 29 a 40 kDa perteneciente a las globulinas 11S de la subunidad

ácida y bandas de 135 kDa que corresponden a las globulinas 7S.

Figura 5. Gel de electroforesis SDS-PAGE sin agente reductor 2-mercaptoetanol de los

concentrados proteicos de zarandaja a diferentes pHs de precipitación y del estándar.

KDa PM pH 4.0 pH 5.0 pH 6.0 pH 7.0

180 135 100 75 63

48 35

25 17 11

Albúmina 2S

Globulina (Subunidad básica 11S)

Globulina (Subunidad ácida 11S)

Globulina 7S

20

Por otro lado, se analizaron los concentrados proteicos de los diferentes pHs de

precipitación: 4,0; 5,0; 6,0 y 7,0 mediante el gel de electroforesis SDS-PAGE en

presencia del agente reductor 2-mercaptoetanol que rompe los puentes disulfuro.

En la figura 6 se observan bandas proteicas que van desde 11 a 50 kDa

aproximadamente a todos los pHs ensayados, identificándose bandas de 11kDa que

corresponden a las albuminas 2S, seguidas por las globulinas de la subunidad básica

11S que se encuentran en el rango de 18 a 20 kDa y por último las bandas proteicas de

mayor expresión que son las globulinas de la subunidad ácida 11S con pesos

moleculares de 29 a 35 kDa. A diferencia de los demás concentrados, el obtenido a pH

6 presenta una banda proteica de aproximadamente 135 kDa perteneciente a las

globulinas 7S.

Figura 6.Gel de electroforesis SDS-PAGE con 2-mercaptoetanol de los concentrados

proteicos de zarandaja a los diferentes pHs de precipitación y del estándar.

En la figura 7 se observa el gel de electroforesis Native-PAGE de los concentrados

proteicos de zarandaja a diferentes pHs de precipitación. El gel native se ejecutó en

condiciones no desnaturalizantes manteniendo la estructura natural y por tanto la

migración se efectuó en función de su carga, tamaño y forma. Se identificaron banda

de mayor expresión para los pH 4,0; 5,0 y 6,0

KDa PM pH 4.0 pH 5.0 pH 6.0 pH 7.0

180 135 100 75 63

48 35

25 17 11

Albúmina 2S

Globulina (Subunidad básica 11S)

Globulina (Subunidad ácida 11S)

Globulina 7S

21

Figura 7. Gel de electroforesis NATIVE-PAGE de los concentrados proteicos de zarandaja a

diferentes pH de precipitación.

4.1.5. Simulación de la digestibilidad gastrointestinal in vitro.

La hidrólisis es la ruptura de los enlaces peptídicos de las proteínas y péptidos, que

mediante los ácidos y la pepsina del estómago se rompen para formar cadenas más

pequeñas de aminoácidos (Rivas, 2014).

Se llevó a cabo la digestión gástrica con el concentrado del pH 4 del cual se obtuvo

mayor rendimiento proteico, simulando la condiciones fisiológicas humanas usando

fluidos gástricos con una solución de NaCl ajustada a pH 1,2 (personas con

enfermedades gástricas), a pH 2,0 (adulto sano) y a pH 3,2 (niños no lactantes) para el

ensayo (Jiménez-Saiz et al., 2011).

En la figura 8 se observa la separación electroforética SDS-PAGE en presencia de

agente reductor de los concentrados de proteínas que fueron sometidos a un proceso

de hidrólisis gástrica a pH 1,2; 2,0 y 3,2 y como control se utilizó el concentrado puro

obtenido a pH 4 con 2-mercaptoetanol.

A pH 1,2; 2,0 y 3,2 no se hidrolizaron completamente las proteínas debido a que

algunas de ellas presentaron resistencia a la acción de la pepsina, pero hidrolizó

polipéptidos pequeños de bajo peso molecular (albuminas 2S), quedando una banda

de mayor expresión de 38 kDa aproximadamente que corresponde a las globulinas

ácidas 11S para todos los pHs.

kDa PM pH 4.0 pH 5.0 pH 6.0 pH 7.0

180 135 100 75 63

48 35

25 17 11

Globulina 7S

22

Figura 8. Gel de electroforesis SDS-PAGE con agente reductor 2-mercaptoetanol de la

simulación de la digestión gástrica de los concentrados proteicos de zarandaja a pH 4.

Al continuar con la digestión se realizó la simulación de la degradación duodenal de

los concentrados y se observa en la figura 9 que existe una banda de menor expresión

con peso molecular entre 38 kDa y 30 kDa en todos los pHs, que corresponde a las

globulinas 7S. La resistencia de la banda se debe a que la estructura se mantiene intacta

limitando el acceso de las enzimas proteolíticas (Sen et al., 2002). Por lo tanto, se

concluye que las proteínas hidrosolubles presentes en la harina de zarandaja no podrían

ser hidrolizadas en su totalidad en el proceso de digestión humana.

Figura 9. Gel de electroforesis SDS-PAGE con agente reductor 2-mercaptoetanol de la

simulación de la digestión duodenal de los concentrados proteicos de zarandaja precipitados a

pH.4.

kDa PM pH 3.2 pH 2.0 pH 1.2 conc. pH 4 180 135 100 75 63

48 35

25 17 11

KDa PM pH 1.2 pH 2.0 pH 3.2 conc. pH 4

180 135 100 75 63

48 35

25 17 11

23

4.1.6. Actividad Antioxidante de los concentrados proteicos

Los antioxidantes son compuestos que permiten la inhibición o el retardo de la

oxidación de otras moléculas, impidiendo la formación o propagación de las

reacciones en cadena de los radicales libres (Muñoz et al., 2009). Existen antioxidantes

sintéticos como el butilhidroxianisol (BHA) y butilhidroxitolueno (BHT), en la

industria alimentaria pero por la toxicidad que genera el antioxidante se ha restringido

el uso debido a que provoca riesgos en la salud (Rojano et al., 2009).

En la figura 10 se muestra la capacidad antioxidante de los concentrados proteicos de

zarandaja a diferentes concentraciones 200, 400, 1000 y 2000 (µg/mL) y se utilizó el

aceite de oliva oxidado para evaluar la capacidad de los concentrados proteicos de la

leguminosa para inhibir la peroxidación lipídica y como control se utilizó el

antioxidante sintético BHT.

A concentraciones de 200, 400 y 1000 (µg/mL) se observa que a pH 4 posee mayor

actividad antioxidante con valores de 92,89.%, 92,80.% y 92,62.%, respectivamente y

para el antioxidante sintético BHT se obtuvo valores de 94,91 %, 94,78.% y 94,11.%

siendo significativamente diferente al concentrado.

Sin embargo, a concentración de 2000 (µg/ml) el pH 5 posee una actividad

antioxidante de 92,40.%, valor superior a la de los demás pH ensayados. Por tanto, de

los resultados se deduce que los concentrados proteicos de zarandaja son una fuente

importante de antioxidante que podrían presentar grandes beneficios a personas con

enfermedades cardíacas y evitar el padecimiento de cierto tipo de cáncer (Ruiz et al.,

2013).

24

Figura 10. Porcentaje de actividad antioxidante durante 24 horas de los concentrados

proteicos a diferentes pH de precipitación evaluados a varias concentraciones frente al patrón

BHT.

4.1.7. Técnica RP-UHPLC

Los concentrados proteicos de zarandaja obtenidos a pHs de precipitación 4,0; 5,0; 6,0

y 7,0 y los hidrolizados gástricos y duodenales con el mejor rendimiento, fueron

analizados mediante RP-UHPLC, con un tiempo de análisis estimado de 12 min a un

registro de la señal a 280 nm, bajo un gradiente de 0 % hasta 70 % de metanol.

En la figura 11 se observa que el pico más alto para los concentrados obtenidos a pHs

de precipitación 4,0 y pH 5,0 oscila entre 13,98 y 17,38 ua, respectivamente con un

tiempo de retención de 3,42 min y 3,51 min.

87,000

88,000

89,000

90,000

91,000

92,000

93,000

94,000

95,000

96,000

pH4 pH5 pH6 pH7 BHT

%A

ct. A

nti

oxi

dan

te200 (µg/mL)

400 (µg/mL)

1000 (µg/mL)

2000 (µg/mL)

25

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

0

20

40

60

80

100

120

140

3 4 5 6

0

5

10

15

20

Inte

nsi

dad (

ua)

Tiempo de retención (min)

Inte

nsi

da

d (

ua

)Tiempo de retención (min)

Figura 11. Perfil cromatográfico de los concentrados proteicos de zarandaja obtenidos a pH

de precipitación pH 4 (azul) y pH 5 (rojo).

En la figura 12 se observa que el primer pico para los concentrados precipitados a pH

6,0 y 7,0 tiene una intensidad de aproximadamente 25,16 y 45,37 ua con un tiempo de

retención igual a 3,04 min. El último pico se observa que tiene un tiempo de retención

e intensidad similar que el de los pHs 4,0 y 5,0. El pico más alto es la proteína más

representativa en todos los pH.

26

0 2 4 6 8 10 12

0

50

100

150

200

250

300

350

3 4 5

0

10

20

30

40

50

Inte

nsid

ad (

ua)


Inte

nsid

ad (

ua)


Figura 12.Perfil cromatográfico de los concentrados proteicos de zarandaja obtenidos a pH

6,0 (azul) y a pH 7,0 (rojo).

En el perfil cromatográfico de la figura 13 se observa que en las muestras de

hidrolizado obtenidas por incubación a los pH 1,2; 2,0 y 3,2 existen varios picos lo

cual indica que la proteína de zarandaja tiene gran cantidad de péptidos. Sin embargo,

no se hidrolizó por completo ya que no existió ruptura de algunos enlaces peptídicos

y no formaron fracciones más pequeñas, estos resultados concuerdan con lo observado

en el gel de electroforesis SDS-PAGE.

27

0 2 4 6 8 10 12

0

200

400

600

800

1000

1200

3 4 5 6

0

20

40

60

80

100

120

Inte

nsi

dad (

ua)


Inte

nsi

dad

(ua

)Tiempo de retención (min)

Figura 13.Perfil cromatográfico de los hidrolizados proteicos de zarandaja provenientes de la

fase de digestión gástrica realizada a pH 1,2 (negro) pH 2,0 (rojo) pH 3,2 (azul).

En la figura 14 correspondiente al perfil cromatográfico de la fase de digestión

duodenal, se visualiza lo mismo que en la digestión gástrica, esto es no se hidrolizó

completamente la muestra debido a que la pancreatina no ha fraccionado el péptido en

secciones pequeñas manteniendo así la estructura intacta de los enlaces peptídicos, a

excepción de la muestra gástrica digerida a pH 3,2 que muestra la hidrólisis pero en

pequeñas fracciones, resultado que concuerda con el gel de electroforesis SDS-PAGE.

28

0 2 4 6 8 10 12

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

3 4 5 6

0

20

40

60

80

100

120

140

Inte

nsid

ad (

ua)


Inte

nsid

ad (

ua)


Figura 14. Perfil cromatográfico de los hidrolizados proteicos de zarandaja de la fase duodenal

obtenido a partir de los digeridos gástricos realizados a pH 1,2 (negro), pH 2,0 (rojo) y pH 3,2

(azul).

4.2. Verificación de la hipótesis

Con la información obtenida y con un nivel de confianza del 95% se puede decir que

se acepta la hipótesis alternativa afirmando que los diferentes pHs de precipitación

para obtener los concentrados proteicos de zarandaja influyen significativamente en el

rendimiento y en la actividad antioxidante.

29

CAPÍTULO IV

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

5.1. Conclusiones

Se obtuvo los concentrados proteicos de zarandaja a diferentes pHs de

precipitación mediante la técnica de precipitación isoeléctrica utilizando agua

como solvente, obteniendo como mejor tratamiento el concentrado a pH4 con

un rendimiento de 15,06%.

Se identificó la presencia de polifenoles en los sobrenadantes obtenidos a los

diferentes pHs de precipitación mediante el método de Folin-Ciocalteu, con

valores de 155,86 a 353,01 mg GAE/ 100 g de muestra, observándose que a

pH 7 se obtuvo mayor contenido de fenoles.

Se determinó la actividad antioxidante de los concentrados proteicos mediante

el método TBARS, el tratamiento que presentó mayor actividad fue el obtenido

a pH.4 con un valor de 92,89.% a una concentración de 200 (μg/ml) y con

menor actividad antioxidante el concentrado obtenido a pH 7, encontrándose

valores entre 92,51% y 91,06%.

Se caracterizó por peso molecular el perfil proteico de los aislados mediante la

técnica de electroforesis SDS-PAGE, identificándose bandas de 11 a 180 kDa

con las proteínas más representativas como las albúminas y globulinas

presentes en los concentrados de zarandaja y se determinó la digestibilidad

gastrointestinal in vitro de los concentrados proteicos de zarandaja mediante

electroforesis, observando que en la digestión gástrica a los pHs 1,2; 2,0 y 3,2

no se hidrolizaron por completo las proteínas debido a que la pepsina no

fraccionó completamente, quedando una banda de mayor expresión en la fase

duodenal con 38 kDa.

Se cuantificó el porcentaje de proteína en los concentrados proteicos de

zarandaja mediante el método Dumas, obteniendo mayor contenido en el

30

aislado preparado a pH 4 con 81, 60 % y con menor cantidad proteica el aislado

precipitado a pH 7 con 50,55%.

5.2. Recomendaciones

Buscar otros métodos que permitan realizar la precipitación isoeléctrica usando

varios solventes como el alcohol y sal.

Se recomienda que para los próximos ensayos el fréjol de zarandaja sea

remojado con el fin de eliminar las cáscaras de las semillas ya que contienen

antinutricionales como el tanino, fitatos e inhibidores de tripsina.

Buscar un método exacto que permita analizar el perfil de aminoácidos de la

harina de zarandaja.

Evaluar varios métodos que permitan cuantificar proteínas

31

BIBLIOGRAFÍA

Aguilera, Y., Diaz M, F., Jimenez, T., Benitez, V., Herrera, T., Cuadrado, C., Martin-

Pedrosa, M., y Martin-Cabrejas M, A. (2013). Changes in nonnutritional

factors and antioxidant activity during germination of nonconventional

legumes. Journal of agricultural and food chemistry, 61(34), 8120-8125. doi:

10.1021/jf4022652

Avello, M., y Suwalsky, M. (2006). Radicales libres, antioxidantes naturales y

mecanismos de protección. Atenea (Concepción), 161-172.

Boatella, J., Codony, R., y López, P. (2004). Propiedades funcionales de los

ingredientes de los alimentos: Introducción a la bases teóricas. Química y

bioquímica de los alimentos II (pp. 19). Barcelona: Universidad de Barcelona.

Bruce, C., Pengelly, y Maass, B. (2001). Lablab purpureus (L.) Sweet – diversity,

potential use and determination of a core collection of this multi-purpose

tropical legume. Genetic Resources and Crop Evolution, 48, 261-272.

Carrillo, W., Tubón, J., y Vilcacundo, R. (2016). Isolation of hen egg white lysozyme

by cation exchange chromatography, analysis of its digestibility and evaluation

of the inhibition lipid peroxidation in the zebrafish model. Asian Journal of

Pharmaceutical and Clinical Research, 9(3), 345-349.

Cevallos, L. (2016). Optimización de extración de antioxidantes de zarandaja (Lablab

purpureus L.). Universidad Técnica Particular de Loja.

Chel, L., Corzo, L., y Betancur, D. (2003). Estructura y propiedades funcionales de

proteínas de leguminosas. Revista de la Universidad Autónoma de Yucatán,

34-43.

Chi-Wah, C., y Dixon, R. (1994). Amino Acid Composition and Subunit Constitution

of Protein Fractions from Cowpea (Vigna unguiculata L. Walp) Seeds. Journal

of agricultural and food chemistry, 42(9). doi: 10.1021/jf00045a005

Díaz, M., Martín-Cabrejas, M., González, A., Torres, V., y Noda, A. (2011).

Biotransformación de Lablab purpureus durante el proceso de germinación.

Revista Cubana de Ciencia Agrícola, 45(4), 433-438.

FAO. (1994). Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y

Agricultura. La digestibilidad como criterio de evaluación de alimentos- su

32

aplicación en peces y en la conservación del medio ambiente. Retrieved from

http://www.fao.org/docrep/field/003/ab482s/AB482S08.htm

FAO. (2016). Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y

Agricultura. Legumbres, semillas nutritivas para un futuro sostenible.

Retrieved from http://www.fao.org/3/a-i5528s.pdf

Fraile, M., García, D., Martínez, A., y Slomianski, R. (2007). Nutritivas y apetecibles:

conozca de leguminosas comestibles. Parte I. Hojas, vainas y semillas.

Departamento de Biología. UAM-I. Retrieved from

http://www.izt.uam.mx/newpage/contactos/anterior/n66ne/leguminosas.pdf

Franco, L., Peters, M., y Shultze-Kraft, R. (2006). Centro Internacional de Agricultura

Tropical. Proyecto de Forrajes Tropicales. Lablab purpureus. Retrieved from

http://ciatlibrary.ciat.cgiar.org/Forrajes_Tropicales/pdf/Brochures/004%20La

blab%20purpureus%202006.pdf

García, H. (2000). Electroforesis en geles de poliacrilamida: fundamentos, actualidad

e importancia. Universo Diagnóstico, 47(1), 31-41.

Girón, J., Pedroche, J., Yust, M., Lqari, H., Megías, C., Villanueva, A., Alaiz, M.,

Vioque, J., y Millán, F. (2005). Obtención y actividad biológica de hidrolizados

proteicos vegetales. In J. Girón-Calle, J. Pedroche, J. Rodríguez & F. Millán

(Eds.), Proteínas alimentarias y coloides de interés industrial. (pp. 385).

España: Universidad de Sevilla.

Guzmán-Chozas, M., Vicario, I., y Guillen, R. (1999). Spectrophotometric profiles of

off-flavor aldehydes by using their reactions with 2-thiobarbituric acid.

Agricultural and Food Chemistry, 45, 2452-2457.

Jiménez-Saiz, R., Martos, G., Carrillo, W., López-Fandiño, R., y Molina, E. (2011).

Susceptibility of lysozyme to in-vitro digestion and immunoreactivity of its

digests. Food Chemistry, 127(4), 1719-1726. doi:

10.1016/j.foodchem.2011.02.047

Kuskoski, M., Asuero, A., Troncoso, A., Mancini-Filho, J., y Fett, R. (2005).

Aplicación de diversos métodos químicos para determinar actividad

antioxidante en pulpa de frutos. Food Science and Technology (Campinas), 25,

726-732.

Laemmli, U. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head

of bacteriophage Nature, 227, 680-685.

http://www.fao.org/docrep/field/003/ab482s/AB482S08.htm

http://www.fao.org/3/a-i5528s.pdf

http://www.izt.uam.mx/newpage/contactos/anterior/n66ne/leguminosas.pdf

33

Laguna, E. (2001). Sobre el fríjol flamenco o careto "Lablab purpureus (L.) Sweet".

Flora Montiberica 17, 12-20 pp.

MAGAP. (2015). Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca. La

política agropecuaria ecuatoriana: hacia el desarrollo territorial rural

sostenible: 2015-2025. Parte II. Retrieved from

http://servicios.agricultura.gob.ec/politicas/La%20Pol%C3%ADtica%20Agro

pecuaria%20%20al%202025%20II%20parte.pdf

Martínez, E., y Añón, C. (1996). Composition and Structural Characterization of

Amaranth Protein Isolates. An Electrophoretic and Calorimetric Study.

Agricultural and Food Chemistry, 44, 2523-2530. doi: 10.1021/jf960169p

Mercado, G., Carrillo, L., Wall, A., Lopez, J., y Álvarez, E. (2013). Compuestos

polifenólicos y6 capacidad antioxidante de especias típicas consumidas en

México. Nutrición Hospitalaria, 28(1), 36-46. doi: 10.3305/nh.2013.28.1.6298

MIES. (2008). Ministerio de Inclusión Económica y Social. Guías de alimentación del

componente alimentario nutricional. Retrieved from

http://www.infa.gob.ec/catalogo/catalog/ejemplares/d223.pdf.

Muñoz, M., y Gutiérrez, D. (2009). Determinación de actividad antioxidante de

diversas partes del árbol Nicotiana glauca. Facultad Química, Universidad

Autónoma de Queretaro.

Orozco, E., Toledo, N., Ordoñez, A., y Galván, L. (2016). Caracterización de las

proteinas de reserva de la semilla de Parota (Enterolobium cyclocarpum).

Investigación y Desarrollo en Ciencia y Tecnología de Alimentos, 1(2), 147-

152.

Peña, A., Arroyo, A., Gómez, A., y Tapia, R. (1988). Bioquímica: Limusa.

Photur, R. (2012). Introduction to Protein Electrophoresis. In T. Biji & R. Hal (Eds.),

Protein Electrophoresis. Methods and Protocols (pp. 23-28). University of

Oklahoma Health Sciences Center: Humana Press.

Quiñones, M., Miguel, M., y Alexaindre, A. (2012). Los polifenoles, compuestos de

origen natural con efectos saludables sobre el sistema cardiovascular.

Nutrición Hospitalaria, 27(1), 76-89. doi: 10.3305/nh.2012.27.1.5418

Rivas, E. (2014). Desarrollo de un prototipo simulador del tracto gastrointestinal

mediante reactores químicos automatizados.

http://servicios.agricultura.gob.ec/politicas/La%20Pol%C3%ADtica%20Agropecuaria%20%20al%202025%20II%20parte.pdf

http://servicios.agricultura.gob.ec/politicas/La%20Pol%C3%ADtica%20Agropecuaria%20%20al%202025%20II%20parte.pdf

http://www.infa.gob.ec/catalogo/catalog/ejemplares/d223.pdf

34

Rojano, B., Gaviria, C., Ochoa, C., Sánchez, N., Medina, C., Lobo, M., Galeano, P.,

Mosquera, A., Tamayo, A., y Lopera, Y. (2009). Actividad antioxidante e

inhibición de la peroxidación lipídica de extractos de frutos de mortiño

(Vaccinium meridionale SW) Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas

Medicinales y Aromáticas, 8(6), 519 - 528

Romero, N. (1997). Produción y manejo de datos de composición química de

alimentos en nutrición. . In C. Morón, I. Zacarías & Saturnino de Pablo (Eds.),

Métodos de análisis para la determinación de nitrógeno y constituyentes

nitrogenados en alimentos. Universidad de Chile.

Ruiz, J., Segura-Campos, M., Betancur-Ancona, D., y Chel-Guerrero, L. (2013).

Proteínas y péptidos biológicamente activos con potencial nutracéutico.

OmniaScience Monographs.

Sangronis, E., y Machado, C. (2007). Influence of germination on the nutritional

quality of Phaseolus vulgaris and Cajanus cajan. LWT - Food Science and

Technology, 40(1), 116-120. doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.lwt.2005.08.003

Savón, L., Scull, I., Orta, M., y Martínez, M. (2007). Harinas de follajes integrales de

tres leguminosas tropicales para la alimentación avícola. Composición

química, propiedades físicas y tamizaje fitoquímico. Revista Cubana de

Ciencia Agrícola, 41(4), 359-361.

Sen, M., Kopper, R., Pons, L., Abraham, E., Burks, A., y Bannon, G. (2002). Protein

structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine

immunodominant IgE-binding epitopes. Journal of Inmunology, 169, 882-887.

Shaahu, D., Kaankuka, F., y Okpanachi, U. (2015). Proximate, amino acid, anti-

nutritional factor and mineral composition of different varieties of raw lablab

purpureus seeds. International Journal of Scientific y Technology Research, 4,

157-161.

Valenzuela, H., y Smith, J. (2002). Lablab Purpureus. Sustainable Agriculture Green

Manure Crops.

Vasco, C., Ruales, J., y Kamal-Eldin, A. (2008). Total phenolic compounds and

antioxidant capacities of major fruits from Ecuador. Food Chemistry, 111(4),

816-823. doi: 10.1016/j.foodchem.2008.04.054

http://dx.doi.org/10.1016/j.lwt.2005.08.003

35

Vicario, I., Guillén, S., y Guzman, M. (1997). Utilización del ensayo del ácido 2-

tiobarbitúrico (ATB) para evaluar el proceso autooxidativo en alimentos.

Grasas y Aceites, 48(2), 96-102.

Zamora, J. (2007). Antioxidantes: Micronutrientes en lucha por la salud. Revista

Chilena de Nutrición, 34.

36

ANEXOS

37

ANEXOS A

VALORES OBTENIDOS DE LOS ANÁLISIS

38

ANEXO A-I

RENDIMIENTOS DE LOS CONCENTRADOS PROTEICOS DE ZARANDAJA

Tabla 7. Reporte de los pesos y porcentaje de rendimientos de los concentrados

proteicos a diferentes pHs de precipitación a partir de 5 gramos de muestra.

T R

Peso

inicial

harina (g)

Peso final

liofilizado

(g)

%Rendimiento Promedio Desviación

Estándar

pH 4

1 5,0024 0,7875 15,75

15,062 0,601 2 5,0021 0,7314 14,63

3 5,005 0,7404 14,81

pH 5

1 5,0051 0,7355 14,71

14,476 0,337 2 5,0023 0,7046 14,09

3 5,0002 0,7313 14,63

pH 6

1 5,001 0,3458 6,92

5,9 1,813 2 5,0008 0,1904 3,81

3 5,0027 0,3488 6,98

pH 7

1 5,0094 0,0349 0,7

0,832 0,214 2 5,0095 0,0539 1,08

3 5,0044 0,036 0,72

39

ANEXO A-II

DATOS DEL CONTENIDO DE POLIFENOLES EN SOBRENADANTES

Tabla 8. Datos de la curva estándar con GAE para el cálculo de polifenoles.

Peso

(g)

Peso

total (g)

Ácido

Gálico

mg/L

Peso

solución

(g)

Peso

teórico

(g)

Factor Conc.

mg/L Absorbancia

0,0249 0,0981 50,76 5,1843 5,1690 0,9970 50,61 0,0955

0,0491 0,0979 100,31 5,2094 5,1693 0,9923 99,53 0,1865

0,0732 0,0967 151,40 5,1763 5,1645 0,9977 151,05 0,2630

0,0975 0,0975 200,00 5,2700 5,1644 0,9800 195,99 0,3565

Figura 15.Curva de calibración del ácido gálico para la determinación del contenido de

polifenoles.

Tabla 9. Datos del contenido de polifenoles de los sobrenadantes a diferentes pH con

Absorbancia de 750 nm.

T Absorbancias Fenoles (mg GAE/100g)

Promedio Desviación

Estándar R1 R2 R3 R1 R2 R3

pH4 0,365 0,248 0,231 202,589 137,247 127,753 155,86 40,74

pH5 0,349 0,348 0,281 193,653 193,095 155,677 180,81 21,77

pH6 0,458 0,450 0,422 254,527 250,059 234,422 246,34 10,56

pH7 0,610 0,730 0,563 339,416 406,433 313,167 353,01 48,09

y = 0,0018x + 0,0026R² = 0,998

0,0000

0,0500

0,1000

0,1500

0,2000

0,2500

0,3000

0,3500

0,4000

0,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00

Ab

sorb

anci

a (7

50

nm

)

Conc. Ácido gálico (ppm)

40

ANEXOS A-III

DATOS DE LA CUANTIFICACIÓN PROTEICA DE LOS CONCENTRADOS

POR EL MÉTODO DUMAS

Tabla 10. Valores de la cuantificación proteica de los concentrados elaborados a

diferentes pHs de precipitación por el método Dumas.

T Peso

(mg)

Factor de

O2

[mg/mL]

Caudal

de

Oxígeno

(mL/min)

Proteína

factor

N

(mg)

Área

(mV x s)

N

(%)

Proteína

(%)

pH 4 50,02 1,8 400 5,7 7,1611 29411,3 14,316 81,604

pH 5 50,1 1,8 400 5,7 6,9737 28650,9 13,92 79,341

pH 6 50,03 1,8 400 5,7 6,5396 26916,7 13,071 74,507

pH 7 50 1,8 400 5,7 4,4345 18762,6 8,869 50,553

41

ANEXOS A-V

DATOS OBTENIDOS DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS

CONCENTRADOS PROTEICOS

Tabla 11. Datos de absorbancia a 532 nm de los controles para el cálculo de la

actividad antioxidante.

R1 R2 R3 PROM.

Aceite no oxidado 0,286 0,282 0,284 0,284

Aceite oxidado 1,87 1,854 1,851 1,86

Tabla 12.Datos de absorbancia a 532 nm a diferentes concentraciones.

Concentración (µg/mL)

200 400 1000 2000

BHT R1 0,284 0,291 0,312 0,328

R2 0,283 0,291 0,312 0,328

pH4 R1 0,399 0,401 0,411 0,456

R2 0,399 0,402 0,41 0,455

pH5 R1 0,418 0,421 0,449 0,427

R2 0,398 0,421 0,439 0,424

pH6 R1 0,405 0,445 0,465 0,43

R2 0,407 0,446 0,454 0,429

pH7 R1 0,432 0,511 0,52 0,498

R2 0,432 0,513 0,524 0,498

Tabla 13. Valores de actividad antioxidante del BHT obtenidos a absorbancia de 532

nm

Concentración

(µg/mL) R1 R2 PROMEDIO DESV.

200 92,93 93,06 93,00 4,04

400 92,07 92,14 92,11 4,56

1000 89,47 89,63 89,55 6,03

2000 87,48 87,96 87,72 7,09

42

Tabla 14. Valores promedio de la actividad antioxidante de los concentrados proteicos

determinada in vitro con TBA luego de 24 horas de incubación a 38 °C obtenidos a la

absorbancia de los productos de la reacción a 532 nm.

T Concentración

(µg/mL) R1 R2 Promedio

Desviación

Estándar

pH4

200 92,843 92,843 92,891 0,083

400 92,807 92,789 92,801 0,010

1000 92,628 92,646 92,628 0,018

2000 91,821 91,839 91,839 0,018

pH5

200 92,502 92,861 92,795 0,266

400 92,448 92,448 92,436 0,021

1000 91,946 92,126 92,054 0,095

2000 92,341 92,395 92,407 0,072

pH6

200 92,735 92,700 92,717 0,025

400 92,018 92,000 92,009 0,013

1000 91,659 91,857 91,758 0,140

2000 92,287 92,305 92,296 0,013

pH7

200 92,251 92,251 92,251 0,000

400 90,834 90,798 90,816 0,025

1000 90,673 90,601 90,637 0,051

2000 91,067 91,067 91,067 0,000

43

Tabla 15. Valores promedio de la actividad antioxidante de los concentrados proteicos

determinada in vitro con TBA luego de 48 horas de incubación a 38 °C obtenidos a la

absorbancia de los productos de la reacción a 532 nm.

T Concentración

(µg/mL) R1 R2 Promedio

Desviación

Estándar

pH4

200 92,789 92,789 92,789 0,010

400 90,852 90,852 90,852 0,011

1000 90,422 90,404 90,413 0,013

2000 90,296 90,296 90,296 0,000

pH5

200 90,529 90,529 90,529 0,012

400 92,143 92,143 92,143 0,014

1000 90,278 90,242 90,260 0,025

2000 91,641 91,749 91,695 0,076

pH6

200 90,852 90,852 90,852 0,124

400 91,677 91,910 91,794 0,165

1000 88,700 88,861 88,780 0,114

2000 89,309 89,525 89,417 0,152

pH7

200 90,601 90,744 90,673 0,101

400 89,758 90,009 89,883 0,178

1000 87,049 87,283 87,166 0,165

2000 89,040 89,148 89,094 0,076

Figura 16.Porcentaje de actividad antioxidante durante 48 horas de los concentrados proteicos

a diferentes pH de precipitación evaluados a varias concentraciones frente al patrón BHT.

82,000

84,000

86,000

88,000

90,000

92,000

94,000

pH4 pH5 pH6 pH7

% A

ct. A

nti

oxi

dan

te

200 (µg/mL)

400 (µg/mL)

1000 (µg/mL)

2000 (µg/mL)

44

ANEXO B

ANÁLISIS POR EL PAQUETE

ESTADÍSTICO INFOSTAT

45

ANEXO B-I

RENDIMIENTOS DE LOS CONCENTRADOS PROTEICOS DE

ZARANDAJA

Tabla 16. Análisis de varianza de los rendimientos proteicos

Tabla 17.Cuadro de análisis de varianza de los rendimientos proteicos

Tabla 18. Prueba de Tukey de los rendimientos proteicos

46

ANEXO B-II

DATOS DEL CONTENIDO DE POLIFENOLES EN SOBRENADANTES

Tabla 19. Análisis de varianza del contenido de polifenoles

Tabla 20. Cuadro de análisis de varianza del contenido de polifenoles

|

Tabla 21. Prueba de Tukey del contenido de polifenoles

47

ANEXOS B-III


CONCENTRADOS PROTEICOS A 24h.


μg/mL y del control BHT.


control BHT.

Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

Tabla 24. Cuadro de análisis de varianza de la actividad antioxidante in vitro a

400.μg/mL y del control BHT.

48


control BHT.





control BHT.




49


control BHT.


50

ANEXOS B-IV


CONCENTRADOS PROTEICOS A 48h DE INCUBACIÓN CON ACEITE DE

OLIVA OXIDADO.


μg/mL y del control BHT.


control BHT.


Tabla 32. Cuadro de análisis de varianza de la actividad antioxidante in vitro a



control BHT.


51




control BHT.





control BHT.


52

ANEXO C

FOTOGRAFÍAS

53

ANEXO C-I

CONCENTRADO DE PROTEÍNA POR PRECIPITACIÓN

Fréjol de zarandaja Harina de zarandaja

Ajuste del pH de solubilización Centrifugación

Separación del sobrenadante

54

Ajuste del pH de precipitación Separación del sobrenadante del

precipitado

Liofilización de las muestras

55

ANEXO C-II

CONTENIDO DE POLIFENOLES

Sobrenadantes Adición de las soluciones y

agitación en el vórtex

Reposo durante 1 hora Lectura de la absorbancia

56

ANEXO C-III

TÉCNICA DE ELECTROFORESIS

Armado el equipo Preparación del gel separador del

concentrador

Muestras preparadas Corrida de las muestras en el gel

Agitación de los geles Gel

57

ANEXO C-IV

ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO

Preparación de las muestras y adición del aceite de oliva

Incubación Después de la incubación

(cambio de color)

Lectura en el espectrofotómetro

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