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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ESCUELA DE POSTGRADO Sección Ciencias Médicas “Efecto inhibidor del extracto etanólico de Caesalpinia spinosa (Taya) en comparación a hidróxido de calcio, paramonoclorofenol alcanforado y clorhexidina en gel al 2 %, sobre cepas de Enterococcus faecalis. Estudio in vitro.” TESIS PARA OPTAR EL GRADO DE MAESTRA EN ESTOMATOLOGÍA. AUTOR CINTYA LISET FLORES ARMAS ASESOR DR. GUSTAVO GUARDIA MÉNDEZ. TRUJILLO – PERÚ
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
ESCUELA DE POSTGRADO
Sección Ciencias Médicas
“Efecto inhibidor del extracto etanólico de Caesalpinia spinosa
(Taya) en comparación a hidróxido de calcio,
paramonoclorofenol alcanforado y clorhexidina en gel al 2 %,
sobre cepas de Enterococcus faecalis. Estudio in vitro.”
TESIS
PARA OPTAR EL GRADO DE
MAESTRA EN ESTOMATOLOGÍA.
AUTOR
CINTYA LISET FLORES ARMAS
ASESOR
DR. GUSTAVO GUARDIA MÉNDEZ.
TRUJILLO – PERÚ
i
DEDICATORIA
A Dios, por brindarme salud para poder
seguir logrando cada uno de mis objetivos,
por guiar mis pasos y llenar mi vida de amor .
A mi familia ; Ita, Raúl y Martha, por ser mi fortaleza
en la realización de cada uno de los proyectos que
emprendo en el camino de la vida .
ii
AGRADECIMIENTOS
Al Doctor Gustavo Guardia Méndez, asesor y amigo, por todos los consejos y
enseñanzas brindados para la obtención de cada una de mis metas.
A la Doctora Elva Mejía Delgado, por su apoyo y orientación para la realización del
presente estudio.
Al Magister y especialista en endodoncia Paul Herrera Plasencia, por su tiempo,
paciencia y aportes que enriquecieron este estudio
iii
INDICE
DEDICATORIA
AGRADECIMIENTOS
RESUMEN
ABSTRACT
Página
I. INTRODUCCIÓN............................................................................ 1
II. MATERIALY MÉTODOS.............................................................. 16
III. RESULTADOS................................................................................ 22
IV. DISCUSIÓN.................................................................................... 29
V. CONCLUSIONES........................................................................... 32
VI. RECOMENDACIONES................................................................. 33
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………................... 34
VIII. ANEXOS......................................................................................... 42
iv
RESUMEN
El objetivo de este estudio de tipo experimental fue comparar el efecto inhibitorio
in vitro del extracto etanólico de Caesalpinia spinosa (taya), en comparación al
hidróxido de calcio, paramonoclorofenol alcanforado, y clorhexidina al 2%,
sobre cepas de Enterococcus faecalis. Se realizó la prueba de susceptibilidad,
utilizando el método de difusión de disco. Las cepas de E. faecalis fueron
sembradas en placas que contenían el medio de cultivo Mueller Hinton, se
colocaron discos con las diferentes concentraciones del extracto y discos con
paramonoclorofenol alcanforado, hidróxido de calcio y clorhexidina al 2%. Las
placas se incubaron a 37°C, después de lo cual se realizó la medición de los halos
de inhibición con una regla pie de rey a las 24 horas.
Para el análisis de los resultados se utilizó el análisis de varianza para una
comparación conjunta y la prueba de Duncan para una comparación de los
medicamentos intraconductos con la concentración del extracto etanólico de
Caesalpinia spinosa (Taya) que presentó el mayor efecto inhibitorio.
Obteniendo que extracto etanólico de Caesalpinia spinosa, presenta igual efecto
inhibitorio que la clorhexidina en gel al 2%, y un efecto significativamente mayor
al del paramonoclorofenol alcanforado e, hidróxido de calcio, sobre cepas de
Enterococcus faecalis.
Palabras Clave: Extracto etanólico, Caesalpinia spinosa, taya, efecto inhibidor,
paramonoclorofenol alcanforado, hidróxido de calcio, clorhexidina al 2% , Enterococcus
faecalis.
v
SUMMARY
The aim of this experimental study was to compare the inhibitory effect in vitro of the
etanolic extract Caesalpinia spinosa (taya) to calcium hidroxide, camphorated
paramonochlorophenol, and 2% chlorhexidine against Enterococcus faecalis. The
susceptibility test was made, using the method of dissemination in discs. The strains os
e. faecalis were sown in plates containing culture médium Mueller Hinton, and placed
discs with differents concentrations of etanolic extract, calcium hidroxide, camphorated
paramonochlorophenol, y 2% chlorhexidine. The plates were incubed at 37°C.,
afterwards a vernier caliper was used to measure the inhibition halos at 24 hours.
Using ANOVA and Duncan test, the results, showed that Caesalpinia spinosa (taya)
etanolic extract has equal inhibitory effect than 2% chlorhexidine.
In addition, this has significantly greater inhibitory effect tan calcium hidroxide and
camphorated paramonochlorophenol sobre cepas de E. faecalis.
Key words: Etanolic extract, Caesalpinia spinosa, taya, inhibitory effect, camphorated
paramonochlorophenol, calcium hidroxide, 2% chlorhexidine, Enterococcus faecalis.
1
I. INTRODUCCIÓN
Las principales condiciones para que se indique la realización del tratamiento
endodóntico están relacionadas con el compromiso de la pulpa dentaria que,
mediante procesos inflamatorios o infecciosos, pueden repercutir en la región
periapical. El tejido pulpar y/o periapical acometido por estas patologías
requiere de diferentes resultados que deben ser alcanzados durante la terapia,
a pesar de los procedimientos, en líneas generales, sean los mismos. 1
El medio que permite cumplir este objetivo es la combinación de la
instrumentación (limpieza mecánica de las paredes dentinarias del canal
mediante instrumental endodóntico estandarizado) y la irrigación de los
conductos mediante soluciones que posean capacidad antiséptica, pero que no
sean excesivamente irritantes para el tejido conectivo periapical. 1
Muchas veces, estos procedimientos no son suficientes para que se alcancen
estos resultados. Por esto, la utilización de coadyuvantes químicos se torna
imprescindible para que se puedan alcanzar una mayor limpieza y
descontaminación. 1
La medicación intraconducto será entonces un auxiliar valioso en la
desinfección del sistema de conductos radiculares, sobre todo en lugares
inaccesibles a la instrumentación, como las ramificaciones del conducto
principal y túbulos dentinarios. Haciéndose necesaria la medicación entre
sesiones. Esta se caracteriza por la colocación de un fármaco en el interior de
la cavidad pulpar entre las sesiones necesarias para la conclusión del
tratamiento endodóntico. 2
2
La selección del medicamento intraconducto presenta como referenciales tres
parámetros principales: su potencial antimicrobiano, su histocompatibilidad y
por último su capacidad de estímulo de los tejidos del huésped con el objetivo
de favorecer la reparación del tejido periapical.3
Durante décadas se han usado gran variedad de sustancias antibacterianas
como medicación temporal intraconducto haciendo depender el éxito del
tratamiento en dicha medicación temporal: eugenol, paramonoclorofenol
alcanforado, formocresol, glutaraldehído, penicilina, estreptomicina,
corticoides, hidróxido de calcio, etc. 4
El potencial antimicrobiano de ellas ha sido estudiado, sobre todo la acción
que tienen sobre el Enterococcus faecalis, bacteria identificada como causa
frecuente de infección de sistema de conductos radiculares .
El Enterococcus faecalis, es un patógeno oportuno, anaerobio, facultativo,
gram positivo, que puede sobrevivir en pares o en cortas cadenas. Crece en
presencia o ausencia de oxígeno, y sobreviven a un pH alcalino de 9,6. Pueden
crecer en un rango de 10 a 45°C y sobrevivir a una temperatura de 60°C por
30 min. 5-7
Esta bacteria se adhiere a la pared dentinaria del conducto radicular, tiene la
capacidad de invadir los túbulos dentinarios y sobrevivir con los fluidos
procedentes del ligamento periodontal. Su habilidad de sobrevivir por largos
periodos de tiempo está relacionada con la expresión de la gelatinasa del E.
faecalis, debido a que en algunos estudios encontraron que la producción de
3
la gelatinasa se observó en un 70% de los E. faecalis aislados en los conductos
radiculares 5,7.
También se dice que la actividad de la gelatinasa mejora la formación del
biofilm, facilita la adherencia a la dentina, aunque esto todavía no está claro.
La gelatinasa es un endopeptido extracelular que contiene zinc capaz de
hidrolizar gelatina, colágeno y otros péptidos. 6,8-9
Esta bacteria presenta factores de virulencia como son:
1. La capacidad de adherirse a la dentina a través de su proteína A que se une
al colágeno I de la dentina.
2. La habilidad para invadir y crecer en los túbulos dentinarios utilizando los
fluidos provenientes del ligamento periodontal y del hueso alveolar.
3. Forma biofilms.
4. Soporta periodos prolongados de suspensión nutritiva.
5. Suprime la acción de los linfocitos.
6. Mantiene la homeostasis de pH.
7. Resistente al hidróxido de calcio.
8. Altera la respuesta del huésped.
Esta bacteria es identificada como la especie que mayormente se encuentra en
fracasos de tratamientos endodóncicos, ya que se la asocia a infecciones
endodóncicas persistentes, así como es muy común detectarla en infecciones
endodóncicas asintomáticas. Es el primer agente etiológico de la periodontitis
apical post tratamiento5,7.
4
Estudios han demostrado que esta bacteria prevalece del 26-77% en dientes
obturados con periodontitis apical y se ha observado más a menudo en
monoinfecciones, pero también se ha encontrado en infecciones mixtas dentro
del sistema del canal radicular. 5-7
El Enterococcus faecalis es resistente al uso de Hidróxido de calcio como
medicación intraconducto, también es resistente a la actividad antimicrobiana
de los materiales de obturación. Tiene la habilidad de sobrevivir por largos
periodos de tiempo en áreas del conducto radicular no instrumentadas con
escasos nutrientes, es decir se adapta a condiciones diferentes. 6,9
También se han realizado otras investigaciones dirigidas a aclarar el papel que
juegan los factores de virulencia de E. faecalis, en la colonización por parte
de esta bacteria en un medio tan pobre en nutrientes, como el conducto
radicular medicado. La adhesión a la superficie de la dentina constituye un
paso esencial que determina el potencial patógeno de este microorganismo,
en el conducto radicular medicado. 12,13 Puesto que la dentina contiene
colágeno y otras proteínas, se sugiere que las proteasas sintetizadas por E.
faecalis, así como la proteína de unión al colágeno (Ace) pudieran participar
o por lo menos influir en la adhesión bacteriana, y por lo tanto permitir que la
bacteria colonice el conducto radicular. 13
Un medicamento intraconducto es un agente que posee propiedades
antimicrobianas, que debe ser introducido en el sistema de canales radiculares
entre sesiones endodónticas con el intento de eliminar microorganismos
residuales que hayan sobrevivido a la preparación químico mecánica y
5
también de prevenir la reinfección. Dentro de los medicamentos disponibles
el hidróxido de calcio es el más utilizad debido a sus capacidades
antimicrobianas.14
El hidróxido de calcio fue introducido por Herman en 1920, como agente de
protección pulpar. El medicamento se presentó como un polvo blanco,
alcalino (ph12.8) y de baja solubilidad. Las propiedades del hidróxido de
calcio derivan de su disociación iónica en iones calcio y iones hidroxilo,
siendo que la acción de esos iones sobre los tejidos y sobre los
microorganismos explicaría sus propiedades biológicas y antimicrobianas. 15
Muchos autores evaluaron la actividad antimicrobiana del hidróxido de calcio
en estudios clínicos de laboratorio. En tanto el efecto sobre la bacteria de E.
faecalis parece ser limitado, principalmente cuando la desinfección es
evaluada dentro de los conductos radiculares16, lo cual sería confirmado por
algunos estudios clínicos.17 A pesar que la actividad antimicrobiana es
discutible existen estudios que determinan que la descontaminación del canal
radicular fue posible gracias a su uso. 18
Numerosas pastas de hidróxido de calcio son utilizadas en combinación con
otros componentes del tipo antimicrobiano o también en asociación a
diferentes radiopacificadores. Dentro de esos componenetes pueden ser
citados el paramonoclorofenol, oxido de zinc, iodoformo; o sulfato de bario.
Es posible que la actividad antimicrobiana de las pastas de hidróxido de calcio
sea influenciada por su asociación con estos componentes, a pesar de eso el
efecto del hidróxido de calcio aún es poco conocida.16
6
Otros antimicrobianos utilizados en la terapia endodóntica incluyen a la
clorhexidina en gel al 2%. La clorhexidina en gel fue utilizada como
medicamento intracanal por .Una ventaja del medicamento es que presenta
efectiva actividad antimicrobiana, especialmente cuando es comparado al
hidróxido de calcio.19
El éxito del tratamiento antiinfeccioso endodóntico se asocia directamente
con el control de microorganismos y la disrupción del biofilm bacteriano.20
La medicación del canal es la aplicación de un fármaco en el interior de la
cavidad pulpar necesaria para eliminar la infección;21 es requerida en
infecciones crónicas, rebeldes y en tratamientos endodónticos fallidos. La
clorhexidina (CHX) se utiliza como medicación intracanal por su
sustantividad y por su concentración.22
La sustantividad antimicrobiana depende del número de moléculas de CHX
disponibles para interactuar con la dentina. Por lo tanto, medicar el canal con
una preparación CHX más concentrada da lugar a un aumento de la resistencia
a la colonización microbiana.22
La CHX se usa como medicamente intraconducto endodóntico en
concentraciones 2%. 23,24 y 25 Se ha utilizado como agente antiséptico de rutina
en el control de la placa dental y la reducción de la microbiota endodóntica
durante la irrigación del canal radicular sin eliminar endotoxinas.26, 27
La molécula de CHX plantea un riesgo sistémico debido a que, al
descomponerse, genera subproductos reactivos tales como para-cloroanilina
(PCA).24 ,29
7
La PCA es generada por la hidrólisis de CHX en función del tiempo, pH
alcalino y calor.Adicionalmente, la presencia de PCA se ha detectado en
soluciones de CHX. 25
Basrani et al. han observado que al calentar CHX por encima de 45° Celsius
se produce la formación de PCA como subproducto.29 La PCA ha sido
clasificada por la Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer
(IARC, 2006) en su grupo 2B, como agente posiblemente cancerígeno para
los seres humanos.30
Así también, el paramonoclorofenol así como los anti-infamatorios
esteroideos comúnmente utilizados en endodoncia pueden ser utilizados como
adjuntos al tratamiento endodóntico. Siendo el paramonoclorofenol empleado
como medicamento durante el tratamiento endodóntico de dientes donde se
diagnosticó necrosis. El paramonoclorofenol (PMCF) alcanforado es el
antiséptico intraconducto más utilizado. Su acción antibacteriana deriva de
los dos radicales que lo componen, el fenol y el cloro. 31
El PMCC, a partir de su historia, fue utilizado en endodoncia por Walkhoff,
que los asociaba con el yodoformo en los casos de la medicación
intrarradicular y hasta en la confección de pastas reabsorbibles. Esta pasta
también fue utilizada como material obturador. Dentro de algunas otras
asociaciones observamos: Paramonoclorofenol asociado con un
corticoesteroide, asociado con el hidróxido de calcio (Calen con PMCC),
asociado con la dexametasona (NDP) .1
8
Llamas et al, evaluaron en ratas el efecto in vitro del PMC y el PMCC
alcanforado sobre los macrófagos y demostraron que estos compuestos
disminuyeron significativamente la capacidad de adhesión de macrófagos al
sustrato. Tomando en cuenta que la adhesión es el primer paso de la
fagocitosis por parte de macrófagos además de la presentación del antígeno,
tanto el PMCF como el PMCF alcanforado pueden inhibir la función del
macrófago y modular las respuestas inflamatorias e inmune en los tejidos
periapicales. Por lo tanto, cuando son usados intraconducto, pueden retardar
los procesos reparativos. Quizá estos medicamentos sólo deban ser usados en
tratamientos de conductos de dientes con pulpas necróticas. 31
Comprobado el efecto citotóxico y la actividad antibacteriana inespecífica de
estos medicamentos, con el presente estudio se buscará comparar su eficacia
in vitro con una sustancia de origen natural, extracto etanólico de Caesalpinia
spinosa, taya.
La Caesalpinia spinosa (Taya) es una planta producida en varias zonas del
país. En el Perú, se encuentra en los valles interandinos secos entre 1000 y
3100 msnm, los departamentos de mayor producción son Cajamarca (41%),
Ayacucho (16%), La Libertad (13%), Huánuco (13%), también se reporta su
presencia en Huancavelica, Apurímac. 32
9
En Perú, numerosos estudios han reportado la presencia de taninos,
flavonoides, gomas, alcaloides y proteínas en la Taya, que se pueden hallar
tanto en la vaina como en la semilla. 33
Esta planta muy utilizada en la actualidad en la industria por sus altas
concentraciones de tanino y ácido gálico, es conocida además por su alto
poder astringente por coagular las albúminas de las mucosas y de los tejidos,
creando una capa aislante y protectora que reduce la irritación y el dolor; por
tal motivo son usados externamente para detener pequeñas hemorragias
locales; en inflamaciones de la cavidad bucal, catarros, bronquitis,
quemaduras, hemorroides, e internamente contra la diarrea, enfriamiento
intestinal, afecciones vesiculares, y como contraveneno en caso de
intoxicación por alcaloides vegetales. 34
Los taninos tienen la propiedad de formar complejos con macromoléculas,
particularmente con las proteínas; así forman enlaces puentes de hidrógeno, y
una unión covalente, colocándose entre las fibras de colágeno de la piel,
empleándolos en medicina en tratamientos de excoriaciones y quemaduras de
la piel donde las proteínas forman una capa protectora antiséptica bajo la cual
se regeneran los tejidos. 34
En caso de la Caesalpinia spinosa "taya"; solo el extracto obtenido de la
cáscara de la Caesalpinia spinosa, tenía efecto inhibitorio mas no la pepa, que
mostró un efecto inhibitorio nulo. 35
10
Siendo este un aporte significativo para aquellas fórmulas tradicionales que
utilizan el fruto completo de la taya.
La utilización de solventes orgánicos (como alcohol y acetona) tienen la
ventaja de preservar mejor los extractos e inhibir el crecimiento de bacterias,
hongos y otros, además de desnaturalizar las enzimas que pueden degradar
los compuestos biológicamente activos. En el caso de los extractos usando
como solvente agua, estos dan muestras viscosas y gelatinosas las cuales se
hicieron difíciles de procesar (dados estos factores, no podrían difundirse
adecuadamente en el agar, y los resultados obtenidos serían inconcluyentes).
36
El uso de cepas bacterianas tanto Gram positivas como Gram negativas
permitió una idea representativa del efecto inhibitorio sobre dichos
microorganismos. Demostrándose un efecto preferencial por las Gram
positivas, debiéndose aún probar su efecto en un mayor número de cepas
bacterianas. 36
Infantes, Y. 37 (2004). Determinó el efecto antiinflamatorio de una pasta
dental conteniendo “tara” en el tratamiento de la gingivitis marginal crónica.
Al grupo experimental compuesto por 64 niños se les aplicó esta pasta dental;
el sangrado gingival desaparece al noveno día, el enrojecimiento y el edema
gingival desaparece al doceavo día y la presencia de puntillado al décimo
quinto día, contra lo que ocurre al aplicarse una pasta dental placebo (grupo
control).
11
Añanca,38 en sus investigaciones con el extracto acuoso de vainas de C.
spinosa en concentraciones que corresponden a 17,5; 16,25; 15; 13,75; 12,5;
11,25; 10; 8,75; 7,5; 6,25 µg/mL, determinó el efecto antibacteriano sobre
cepas de Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes.
En investigaciones realizados por Escobar se determinó que el extracto
alcohólico de la C. spinosa (Molina) Kuntze a diferentes concentraciones
posee efecto antibacteriano sobre cepas de Corynebacterium diphtheriae.39
Sampaio, F. (2009). En la región amazónica de Brasil los frutos de
Caesalpinia ferrea Martius fueron utilizados ampliamente como
antimicrobiano para curar algunas infecciones orales. En este estudio se
determinó la actividad antimicrobiana del extracto de la C. ferrea Martius
contra los microorganismos patógenos orales más comunes. Los valores de la
concentración mínima inhibitoria para Candida albicans, S. mutans, S.
salivarius, S.oralis y Lactobacillus casei fueron de 25.0, 40.0, 66.0, 100.0,
66.0 μg/mL, respectivamente. Se utilizó la clorhexidina como control positivo
y solución salina como control negativo. El extracto de C. ferrea Martius
inhibió el crecimiento in vitro de las bacterias patógenas orales.40
Liu H. 37 (Perú, 2010), evaluó la actividad antibacteriana in vitro de extractos
de Caesalpinia Spinosa "tara" y Eucalyptus sp. "eucalipto" utilizando cepas
bacterianas Gram positivas (Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis) y
Gram negativas (Escherichia coli, Klebsiella sp. y Shigella flexneri). Se
12
utilizó como solvente de extracción una mezcla de alcohol-acetona (1:1) y se
analizó la actividad biológica de los extractos obtenidos mediante la técnica
de difusión en disco. La cáscara del fruto de Caesalpinia Spinosa y las hojas
del Eucalyptus sp. mostraron una actividad selectiva sobre las bacterias Gram
positivas evaluadas.
Bornaz, J (2014), realizó un estudio donde compara el efecto in vitro de la
solución de Caesalpinia espinosa (tara) al 60%, e hidróxido de calcio y
gluconato
de clorexhidina al 2% ( en una sola solución), y teniendo como control
positivo Amoxicilina – Acido clavulánico). Los resultados obtenidos
indicaron que el promedio del halo inhibitorio formado por la Caesalpinia
spinosa era mayor que el halo inhibitorio formado por el Hidróxido de Calcio
más clorhexidina , había diferencia estadísticamente significativa entre los
datos obtenidos entre ambos grupos experimentales. 41
Haro, A (2015) realizó un estudio in vitro de la eficacia antibacteriana entre
el extracto alcohólico de Tara 100% e hipoclorito de sodio 5,25% sobre el E.
faecalis.; siendo durante las primeras 24 h el NaOCl 5,25% más efectivo en
comparación con el extracto de Tara 100%. Adicional a esto, se investigó el
efecto de sustantividad de las soluciones en el transcurso de 48 y 72 h;
encontrando que el extracto de Tara 100% posee un efecto antimicrobiano
mayor y prolongado en contraste con el NaOCl 5,25%, el cual presentó un
efecto antibacteriano menor.42
13
Así mismo, en varios trabajos de investigación se concluye que la cáscara
(vaina) de Caesalpinia spinosa demuestra una buena acción inhibitoria sobre
Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis. Mediante técnica de difusión en
disco. Los extractos fueron preparados usando como solvente alcohol-acetona
(1:1). Se observó actividad inhibitoria sobre cepas Gram positivas para el
extracto de la vaina de tara más no para el de la semilla. No se determinó la
concentración mínima inhibitoria. 38
Existen muchos estudios actualmente sobre el efecto atibacteriano del
extracto etanólico de Caesalpinia spinosa , a nivel nacional y en países
vecinos, donde esta planta crece y se cultiva , sin embargo hasta el momento
no se ha realizado un estudio donde se lo compare a estas soluciones y
tampoco a la clorhexidina al 2 %, que es de los medicamentos intraconductos
el más utilizado , sin embargo presenta cierta citotoxicidad, al comprobarse
que el efecto inhibitorio del extracto etanólico de taya es el mismo que el de
este solución, se podría seguir la investigación a nivel celular; para
posteriormente proponerlo como un opción para la medicación intraconducto
, de origen natural, que reduzca los fracasos endodónticos ocasionados por
infecciones persistentes y evitando la exposición local y sistémica a sustancias
tóxicas.
14
1.1. Enunciado del problema:
¿Cuál es el efecto inhibitorio del extracto etanólico de Caesalpinia spinosa (Taya)
comparado al hidróxido de calcio, paramonoclorofenol alcanforado y clorhexidina al 2
% sobre cepas de Enterococcus faecalis, en un estudio in vitro?
1.2. Hipótesis:
El extracto etanólico de Caesalpinia spinosa presenta el mismo o mayor efecto
inhibitorio in vitro sobre las cepas de Enterococcus faecalis en comparación al
hidróxido de calcio, paramonoclorofenol alcanforado y clorhexidina al 2 %
1.3. Objetivos:
1.3.1. Objetivos Generales:
Comparar el efecto inhibitorio in vitro del extracto etanólico de
Caesalpinia spinosa con el hidróxido de calcio, paramonoclorofenol
alcanforado y clorhexidina al 2 % sobre cepas de Enterococcus faecalis.
15
1.3.2. Objetivos Específicos:
Determinar el mayor efecto inhibitorio in vitro del extracto
etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa (Taya) sobre cepas de
Enterococcus faecalis.
Determinar el efecto inhibitorio in vitro del Paramonoclorofenol
alcanforado sobre cepas de Enterococcus faecalis.
Determinar el efecto inhibitorio in vitro del Hidroxido de calcio
alcanforado sobre cepas de Enterococcus faecalis.
Determinar el efecto inhibitorio in vitro de la clorhexidina al 2 %
alcanforado sobre cepas de Enterococcus faecalis.
16
II. MATERIAL Y MÉTODOS
1. MATERIAL DE ESTUDIO:
1.1. Material biológico:
- Cepa de Enterococcus faecalis de la Facultad de Medicina de la Universidad
Nacional de Trujillo “CA-MICR-FM-UNT”.
1.2. Material botánico:
- Las vainas de Caesalpinia spinosa “taya” o “tara”, vainas secas, recolectadas en
la provincia de Trujillo – La Libertad. En el laboratorio se procedió a seleccionar
las mejores vainas, quedando aptas para su procesamiento.
2. MÉTODOS Y TÉCNICAS:
Tipo de Investigación: El presente trabajo presenta un diseño experimental en
bloques completamente al azar con una observación por bloque en cada
tratamiento.
Muestra: La muestra estuvo constituida por cepas de Enterococcus faecalis,
previamente comprobadas en género y especie. Proveniente del cepario del
Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina denominada. Cada una
de estas cepas se enfrentó a cuatro concentraciones (10%, 20%, 40% y 60%) del
extracto etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa “taya”, al hidróxido de calcio
paramonoclorofenol alcanforado, y la clorhexidina al 2%.
17
Variables y escalas de medición:
VARIABLE INDICADOR TIPO ESCALA
V. Independiente
Agentes antibacterianos
Soluciones con efecto
inhibitorio, in vitro.
Concentración del
extracto etanólico
de Caesalpinia
spinosa c
Hidroxido de calcio
PMCF-A
Clorhexidina al 2 %
Cuantitativa Ordinal
V. Dependiente
Efecto inhibidor in vitro
Diámetro del halo
inhibitorio
Cuantitativa Ordinal
Definición de términos operacionales:
Extracto etanólico de Caesalpinia spinosa (Taya): Extracto cuyo
solvente es etanol y que contiene los principios activos de la planta
Caesalpinia spinosa preparado a las concentraciones del 10%, 20%, 40%,
60%.
Hidroxido de calcio: Agente antibacteriano, altamente alcalino, inodoro
Paramonoclorofenol alcanforado: Agente antibacteriano utilizado
como medicamento intraconducto
Clorhexidina al 2 %: Compuesto catiónico antibacteriano.
Efecto inhibitorio in vitro: Capacidad para detener la reproducción o
producir la muerte de una bacteria en condiciones experimentales.
Resultado de medir los halos de inhibición en las placas petri respectivas.
18
Diámetro de halo Inhibitorio: Aréa determinada en milímetros en la que
se inhibe el crecimiento bacteriano.
Diseño Procedimental:
2.5.1. Preparación del inóculo:
Cada cepa se diluyó con caldo glucosado estéril hasta que se obtuvo una
turbidez semejante al tubo 1 del Nefelómetro de Mc Farland , el cual contenía 3
x 108 UFC
2.5.2. Obtención del extracto etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa 33:
Se preparó extracto etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa (Taya), para
lo cual se siguió el siguiente procedimiento:
Se obtuvieron un kilogramo de vainas secas de “Taya” teniendo en cuenta su
tamaño, color y estado.
A continuación, se pusieron a secar al horno a una temperatura de 40ºC por
un periodo de 36 h. con la finalidad de eliminar de forma eficiente la humedad.
Luego, se procedió a moler las muestras secas utilizando un mortero, hasta
obtener un pulverizado homogéneo, de esta muestra solo se tomó 50 gr de la
muestra molida y se colocaron en un frasco oscuro de vidrio con 500 mL de etanol
comercial de 70º (C2 H5 OH), y fue llevado a maceración por 10 días.
19
Después se filtró el macerado utilizando papel Whatman Nº 4 en un matraz
estéril, la solución obtenida fue de 330 ml esta se distribuyó en 3 vasos de
precipitación de 10 ml y en un vaso de 300 ml y se llevó una estufa a 40º C hasta
la evaporación total del alcohol, obteniendo 0.85 gramos de polvo seco de
extracto de taya por cada 10 ml de la muestra después de 12 días de evaporación.
El extracto se recibió en viales estériles.
Así mismo, para comprobar la existencia de fitoconstituyentes de gran valor
antifúngico (taninos), se realizó el test de cloruro férrico. Para lo cual, se tomaron
5 gotas del extracto etanólico de Caesalpinia spinosa, y se añadió 1 gota de
solución férrica, después de lo cual se obtuvo una coloración negruzca lo que
indicaba de una manera cualitativa la gran presencia de grupos hidroxilos
fenólicos, es decir de taninos (+++).
2.5.4. Estandarización de la solución Stock 34:
Se pesó 1.0346 g de extracto seco en un vial estéril y luego se agregó 0.65
ml. de etanol, para obtener la Solución Stock cuya concentración final fue del 60
%.
Luego de obtenida la Solución Stock se procedió a preparar las
concentraciones al 10%, 20%, 40% y 60%.
2.5.5. Determinación del efecto antibacteriano (prueba de susceptibilidad):
Para la prueba de susceptibilidad, se prepararon 4 diluciones a las
concentraciones al 10%, 20%, 40%, 60% de extracto etanólico de Caesalpinia
spinosa. Dichas diluciones se conservarán a 4 ºC para el estudio microbiológico.
20
Para la prueba de susceptibilidad se utilizó el método de Difusión en Discos.
Se prepararon discos de papel de filtro estériles, los cuales fueron sumergidos
dentro de cada una de las concentraciones del extracto etanólico de taya luego
con una aguja estéril estos fueron colocados sobre los cultivos de Enterococcus
faecalis en placas petri previamente preparados. Se hicieron 16 repeticiones por
cada concentración
Posteriormente las placas se incubaron a 37°C en microanaerobiosis. Todo el
procedimiento se llevó a cabo dentro del diámetro de 10 cm. de la llama de un
mechero.
La siembra del microorganismo se hizo para cada una de las 4
concentraciones en total en 21 placas, 12 de las cuales contenias las 4 diferentes
concentraciones del extracto etanólico, 3 que contenían los discos de papel filtro
embebidos con hidróxido de calcio, 3 placas con los discos de paramonoclorofeno
alcanforado y 3 placas con los discos embebidos con clorhexidian al 2 %.
La lectura se llevó a cabo a las 24 horas. Se midieron los halos de inhibición
de cada una de las concentraciones, incluyendo el área del disco de papel de filtro,
con un calibrador vernier.
Al hacer la lectura, los halos de inhibición se midieron en mm. Se tuvo en
cuenta los siguientes parámetros: diámetro del halo mayor a 9 mm el resultado
fue positivo, si el diámetro del halo fue entre 6 a 9 mm la actividad se consideró
intermedia o moderada, y si el diámetro del halo fue inferior a 6 mm se considera
sin actividad o negativo.35
21
3. ANÁLISIS ESTADÍSTICO E INTERPRETACIÓN DE LA
INFORMACIÓN
Para analizar la información se construyeron tablas con medias y desviaciones
estándar del efecto inhibitorio del extracto etanólico de Caesalpinia spinosa Taya
en las cuatro concentraciones (10%, 20%, 40% y 60%) y en diagramas de cajas
elaboradas en Minitab 17. Las concentraciones fueron comparadas conjuntamente
empleando el análisis de varianza y en forma pareada mediante la prueba de
Duncan en el análisis post hoc empleando IBM SPSS Statistics 23.
De acuerdo a estos resultados fue seleccionada la concentración con el mayor
efecto inhibitorio. Esta concentración fue comparada con los medicamentos
intraconductos empleando también el análisis de varianza para una comparación
conjunta y la prueba de Duncan para una comparación de los medicamentos
intraconductos con la concentración del extracto etanólico de Caesalpinia spinosa
Taya con mayor efecto inhibitorio.
La significancia estadística fue considera al 5% (p<0.05).
22
III. RESULTADOS
En el presente estudio de tipo experimental “in vitro”; cuyo propósito fue comparar el
efecto inhibitorio del extracto de caesalpinia spinosa (taya) a diferentes concentraciones
(10%,20%,40% y 60%) con el del hidróxido de calcio, paramonoclorofenol alcanforado
y clorhexidina en gel al 2 %,sobre cepas de Enterococcus faecalis ATCC 29212, se
hallaron los siguientes resultado:
Las 4 diferentes concentraciones del extracto etanólico de taya presentan efecto
inhibitorio in vitro.
Se optó por establecer las comparaciones con la concentración al 60% ya que
presentaba un mayor halo de inhibición o mejor efecto inhibitorio in vitro.
El promedio de halo inhibitorio obtenido del extracto etanólico de Caesalpinia
spinosa al 60% fue de 17.3 mm, del hidróxido de calcio es 8.6 mm, del
paramonoclorofenol alcanforadode 10.4 y de la clorhexidina al 2 % de 17.5mm.
23
TABLA Nº 1: Media del halo de inhibición del extracto etanólico de Caesalpinia
spinosa, sobre el Enteroccocus Faecalis comparado al hidróxido de calcio,
paramonoclorofenol alcanforado, clorhexidina al 2%
Fuente: Datos obtenidos por el grupo investigador, año2014
N: número de repeticiones C: Cepa Enterococcus Faecalis CaOH: Hidroxido de calcio
CHX: clorhexidina PMCF-A: paramonoclorofenol alcanforado
En la tabla Nº 1 se muestran los halos inhibitorios registrados en 16 repeticiones por
cada concentración de extracto etanólico de Caesalpinia spinosa y soluciones utilizadas
como medicamento intraconducto .
DIÁMETRO DEL HALO DE INHIBICIÓN (mm)
N/C
CONCENTRACIONES DE EXTRACTO ETANÓLICO DE
Caesalpinia spinosa
10% 20% 40% 60%
T5
CaOH
F3
PMCFA
CHX
1 15 15 16 18 9 11
19
2 12 14 15 18 9
S112
X 19.5
18
17.5
3 13.5 13 15 19 9 9 18
4 13 13.5 15 19 9.5 8 17.5
5 13 13.5 15.5 20 10 13 17.5
6 13 13.5 15 20 8 15 18
7 13 13 15.5 20 8 12 15
8 11 12.5 16 21.5 8 10 16
9 14 14.5 16 13 8 10 18
10 13.5 14 15 14 8 10 18
11 13 14 19 14 11 10 18
12 13 14 18 16 8 10 16.5
13 15 13.5 17.5 16 8 10 17
14 12 13.5 17 16 8 9 16
15 11.5 12.5 18 15 8 9 16
16 11.5 13 15 17.5 8 9 20.5
Media 12.9 13.6 16.2 17.3 8.6 10.4 17.5
DE 1.2 0.7 1.2 2.6 0.9 1.8 1.4
24
Tabla Nº2: Análisis de Varianza para evaluar los bloques (diámetros de halos
inhibitorios) y las diferentes concentraciones (actividad inhibitoria del extracto
etanólico de Caesalpinia spinosa)
Fuente de variación Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrados
medios F p
Concentración 208.073 3 69.357 26.731 0.000
Error 155.671 60 2.594
Total corregido 363.744 63
Fuente: Datos obtenidos por el grupo investigador, año2015.
Con estos resultados se determina que existe un efecto distinto entre cada una de las
concentraciones del extracto etanólico de Caesalpinia spinosa sobre las cepas de
Enterococcus faecalis
25
Gráfico Nº 1: Media del diámetro del halo de inhibición del crecimiento de
Enterococcus faecalis en función a cada una de las cuatro
concentraciones del extracto etanólico de Caesalpinia spinosa
Fuente: Datos obtenidos por el grupo investigador, año2014
En el Gráfico Nº 1, se aprecia que conforme aumenta la concentración del extracto
etanólico de Caesalpinia spinosa aumenta el diámetro de halo de inhibición, es decir
aumenta el efecto inhibitorio.
60%40%20%10%
22
20
18
16
14
12
10
Halo
de i
nh
ibic
ión
(m
m)
26
Tabla Nº 3: Efecto inhibitorio in vitro del extracto etanólico de vainas de Caesalpinia
spinosa AL 10 %, 20 %, 40% y 60 % sobre el crecimiento del Enterococcus faecalis,
según el diámetro del halo inhibitorio y mediante la prueba de Duncan.
Concentración N Subconjunto
1 2 3
10% 16 12.7
20% 16 13.5
40% 16 16.1
60% 16 17.3
p 0.277 1.000 1.000
Fuente: Datos obtenidos por el grupo investigador, año2014
En la tabla Nº 3, se muestran los promedios del diámetro de halo de inhibición de
crecimiento del Enterococcus faecalis después de la aplicación de discos con extracto
etanólico de C. spinosa a diferentes concentraciones, se realizó la Prueba de
significancia de Duncan, que comparó cada uno de los promedios de los halos,
demostrando que no existe diferencia significativa entre los diámetros promedios de los
halos inhibitorios del extracto etanólico al 10 % y al 20%; pero existe diferencia
significativa entre los los diámetros promedios de los halos inhibitorios al 10 % y 20%
con la del 40% y 60%. Así también existe diferencia significativa entre el grupo que
contenían los discos a un 40% de la concentración de extracto etanólico de c. spinosa y
el grupo al 60 % (p=0.05),
27
Gráfico Nº 2: Media del halo de inhibición del extracto etanólico de Caesalpinia
spinosa al 60 % comparado al hidroxido de calcio al paramonoclorofenol
alcanforado y a la clorhexidina en gel al 2 %.
El diagrama nos muestra, las medias del diámetro de los halos de inhibición, se puede
notar la variación en el tamaño de los halos en la concentración del extracto al 60%, es
apreciable , que la media en el tamaño del halo a una concentración del 60 % se encuentra
casi al mismo nivel que la media del diámetro del halo inhibitorio producido por la
clorhexidina.
28
Tabla Nº 3: Efecto inhibitorio in vitro del extracto extanólico de Caesalpinia spinosa
comparado al del Paramonoclorofenol alcanforado, hidróxido de calcio y
clorhexidina en gel al 2% sobre enterococcus faecalis y mediante la Prueba de
Duncan
Tratamientos
controles Media
Diferencia de medias
con el extracto
etanolítico al 60%
(Media = 17.3)
p
CaOH 8.6 -8.7 0.000
PMCFA 10.4 -6.9 0.000
CHX 17.5 0.2 0.973
Se puede apreciar que por el tamaño de los halos de inhibición el efecto del hidróxido de
calcio y del paramonoclorofenol alcanforado son significativamente diferentes al del
extracto etanólico de taya.
Sin embargo el efecto inhibitorio de la clorhexidina en gel al 2 %, no presenta diferencia
significativa al compararlo con el del extracto etanólico al 60 %, por lo que ambos
presentan el mismo efecto inhibitorio sobre cepas de Enteroccocus faecalis ATCC 29212
29
III. DISCUSIÓN
En el presente estudio al comparar el efecto inhibitorio in vitro del extracto
etanólico de Caesalpinia spinosa con el del hidróxido de calcio sobre las cepas de
enterococcus faecalis, se obtuvo un efecto mucho menor del segundo el cual presentó un
halo de tamaño promedio 8.6, por el contrario el extracto en su menor concentración
presenta un halo promedio de 12.9. Esto se puede deber a la insepecificidad que presenta
el hidróxido de calcio, como medicamento antibacteriano.
Así mismo al comparar el extracto etanólico con el efecto del paramonoclorofenol
alcanforado, se obtuvo un efecto menor también del segundo, tuvo como tamaño
promedio de halo 10.4 mm, esto corroboraría estudios anteriores, donde se afirma el poco
efecto antibacteriano de esta sustancia y su reemplazo por nuevos productos por su gran
contenido toxico.
Finalmente al comparar la media del halo inhibitorio producido por el extracto
etanolico al 60 % (17.3 mm) y la media del halo inhibitorio de la clorhexidina en gel al
2% (17.5mm), no se obtuvo diferencia significativa, lo que indica igual efecto in vitro
de ambas sustancias, este resultado es comparable con el obtenido por Bornaz, J , en
donde el efecto del extracto etanólico al 100% es el mismo que la solución producida por
la unión de clorhexidina al 2 % y el hidróxido de calcio, sin embargo la diferencia estaría
en el tamaño de los halos, ya que en este estudio el tamaño del halo promedio del extracto
fue de 9.56mm.41
Por el contrario si estos resultados se comparan con los de un aceite esencial
Malpartida, F. (2010) obtuvo que el efecto inhibidor del aceite esencial de Minthostachys
30
mollis (muña) es menor que el paramonoclorofenol alcanforado y gluconato de
clorhexidina al 2% en el cultivo bacteriano de Enterococcus faecalis a las 24 horas. 43
El mejor efecto de la Caesalpinia spinosa podría deberse a que al utilizar un
solvente orgánico (como alcohol) se preserva mejor compuestos biológicamente activos.
37
Los estudios hasta ahora realizados demuestran que la “taya” contiene taninos,
flavonoides, y gomas, de allí su uso terapéutico en medicina popular. La vaina representa
el 62% del peso posee la mayor concentración de taninos que oscila entre 40% y 60%.
Las vainas de Caesalpinia spinosa contienen hasta 25 % de ácido gálico, que es uno de
los mayores constituyentes de los taninos. Probablemente los taninos serían los
fitoconstituyentes con mayor propiedad antibacteriana, al precipitar las proteínas
(enzimas), implicadas en las diversas rutas microbianas.37
Lock de Ugaz44, en su investigación demuestra que los fenoles y flavonoides,
constituyentes también de Caesalpinia spinosa, tienen propiedades antiinflamatorias,
antibacterianas, y antifúngicas, cuya acción provoca lesiones en la membrana
citoplasmática, ocasionando una disfunción en la composición interna de las células
bacterianas.
Haro, el 2015 realizó un estudio in vitro de la eficacia antibacteriana entre el
extracto alcohólico de Tara 100% e hipoclorito de sodio 5,25% sobre el E. faecalis.; el
mayor efecto se encontró en la solución de origen natural.43
31
Que el efecto del extracto etanólico de Caesalpinia spinosa al 60 % con el de la
clorhexidina en gel al 2 %, abre nuevas posibilidades en el campo de la investigación
clínica como farmacológica, ya que esta sustancia natural podría convertirse en con una
alternativa natural, eficiente y de bajo costo, para el tratamiento de conductos dentarios
en el que esté indicado la medicación intraconducto.
32
IV. CONCLUSIONES
1. El mayor efecto antibacteriano del extracto etanólico de caesalpinia spinosa se
da a la concentración de 60 %
2. El extracto etanólico de Caesalpinia spinosa presenta mayor efecto inhibitorio
in vitro en cepas de e. faecalis atcc 29212 comparado al hidróxido de calcio.
3. El extracto etanólico de Caesalpinia spinosa presenta mayor efecto inhibitorio
in vitro en cepas de e. faecalis atcc 29212 comparado al paramonoclorfenol
alcanforado.
4. El extracto etanólico de Caesalpinia spinosa presenta igual efecto inhibitorio in
vitro en cepas de e. faecalis atcc 29212 comparado a la clorhexidina al 2 %.
33
V. RECOMENDACIONES
1. Realizar fórmulas preparadas para pruebas in vivo valorando la efectividad y la
toxicidad que pueden proporcionar los componentes activos de Caesalpinia
spinosa, así como la dosis terapéutica y la concentración óptima para ser utilizado
como medicamento intraconducto en tratamientos endodónticos.
2. Realizar estudios experimentales in vivo en donde se pueda comparar el efecto
del extracto etanólico de caesalpinia spinosa al de otro medicamento
intraconducto.
3. Realizar el estudio utilizando cepas nativas, con la finalidad de evaluar la
variación con las cepas estandarizadas.
34
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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43
ANEXOS
44
Método de difusión de discos.
Lectura de halo inhibitorio después de 24 horas de incubación.
45
SUSCEPTIBILIDAD AL 10 %
SUSCEPTIBILIDAD AL 20 %
46
SUSCEPTIBILIDAD AL 40 %
SUSCEPTIBILIDAD AL 60 %
47
Susceptibilidad al PMCF-A
Suceptibilidad a la clorhexidina al 2% Suceptibilidad al hidróxido de calc
48
EVALUACIÓN DE LA TESIS
El Jurado deberá:
a. Consignar las observaciones u objeciones pertinentes relacionadas a
los siguientes ítems.
b. Anotar el calificativo final.
c. Firmar los tres miembros del jurado.
TESIS:………………………………………………............................………
……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
1. DE LAS GENERALIDADES
El Título: ………………………………………………………………………. ………………………………………………………………………………….
Tipo de Investigación: ………………………………………………………. …………………………………………………………………………………. 2. DEL PLAN DE INVESTIGACIÓN
Antecedentes: ……………………………………………………….……………………….. Justificación: …………………………………………………..……………………………. Problema:…………………………………………………………………….. …………………………………………………………………………………. Objetivos: ……………………………………………………………………. Hipótesis: ……………………………………………………………………. Diseño de Contrastación:……………...…………………………………… Tamaño Muestral:…………………………………………………………… Análisis Estadístico: ………………………………………………………
3. RESULTADOS:……………………………………………………………….
4. DISCUSIÓN: ………………………………………………………………….
5. CONSLUSIONES: …………………………………………………………
6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: …………………………………….
……………………………………………………………………………….
7. RESUMEN: …………………………………………………………………
……………………………………………………………………………….
8. RELEVANCIA DE LA INVESTIGACIÓN: ……………………………….
……………………………………………………………………………….
9. ORIGINALIDAD: …………………………………………………………...
49
10. SUSTENTACIÓN:
10.1Formalidad: ……………………………………………………...
10.2Exposición:…………………………………………………………
10.3Conocimiento del Tema: ……………………………………….
CALIFICACIÓN
(Promedio de las 03 notas del jurado)
JURADO Nombre Código Firma
Presidente: Dr. ………………………….. ………………… ……………….
Grado Académico: ………………………………………………
Secretario: Dr. ………………………….. ………………… ……………….
Grado Académico: ………………………………………………
Miembro: Dr. …………………………… ………………… ……………….
Grado Académico: ………………………………………………
50
ANEXO 03
RESPUESTAS DEL TESISTA A OBSERVACIONES DEL JURADO
El Tesista deberá responder en forma concreta a las observaciones del
jurado a manuscrito en el espacio correspondiente:
a. Fundamentando su discrepancia.
b. Si está de acuerdo con la observación registrada.
c. Firmar.
TESIS: …………………………………………………………........................... ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 1. DE LAS GENERALIDADES
El Título: …………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… Tipo de Investigación: ……………………………………………………… ………………………………………………………………………………. 2. DEL PLAN DE INVESTIGACIÓN
Antecedentes: …………………………………………………………….. Justificación: ………………………………………………………………. Problema:…………………………………………………………………….. …………………………………………………………………………………. Objetivos: ………………………………………………………………….. Hipótesis: ………………………………………………………………….. Diseño de Contrastación:………………………………………………… Tamaño Muestral:…………………………………………………………… Análisis Estadístico: ………………………………………………………
3. RESULTADOS:……………………………………………………………….
4. DISCUSIÓN: ………………………………………………………………….
5. CONSLUSIONES: …………………………………………………………
6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: …………………………………….
……………………………………………………………………………….
7. RESUMEN: …………………………………………………………………
………………………………………………………………………………….
51
8. RELEVANCIA DE LA INVESTIGACIÓN: ……………………………….
9. ORIGINALIDAD: …………………………………………………………...
10. SUSTENTACIÓN:
10.1Formalidad:………………………………………………………………
10.2Exposición: ………………………………………………………………
10.3Conocimiento del Tema: ……………………………………………….
……………………………………… Nombre
Firma
