Universidad Nacional de La MatanzaCiencias de la Salud - MEDICINA

AU1 - Formación del Ser Humano

Aplicaciones del diagnóstico molecular en Genética

Dra. Mariana Herrera1

DESORDENES MONOGÉNICOS

Aparecen cuando un gen está alterado en todas las células del organismo

Las alteraciones se deben a mutaciones genéticas que son cambios en las secuencias de los nucleótidos de la

cadena de ADN

HERENCIA AUTOSÓMICA DOMINANTE

HERENCIA AUTOSÓMICA

RECESIVA

HERENCIA LIGADA AL X

HERENCIA MITOCONDRIAL

Patrones de herencia de una enfermedad monogenica

ENFERMEDADES DE ORIGEN POLIGÉNICO

Originadas por la sumatoria de efectos aditivos de varios genes y de factores ambientales que las favorecen

La recurrencia en un grupo familiar se establece en función de tablas estadísticas específicas de cada desorden.

Enfermedades de origen poligénico analizables por Biología Molecular

Diabetes juvenil

Alzheimer

Enfermedad celíaca

Enfermedad cardiovascular

Parkinson

PCR: reacción en cadena de la polimerasa

-ADN total-Taq polimerasa-Mg-Buffer-Primers

Ciclos:

-Desnaturalización

-Hibridación

-Elongación

AMPLIFICACION DEL ADN

PCR

10 rep 20

rep

20 rep

10 rep

Pocas copias de un fragmento

Millones de copias

Hacer copias Hacer copias (extensión)(extensión)

DNA dianaDNA diana5’5’ 3’3’

5’5’

5’5’

3’3’

3’3’Pegador de los Pegador de los

primers primers (annealing)(annealing) 5’5’3’3’

Forward primerForward primer

Reverse primerReverse primer

Separación de las cadenasSeparación de las cadenas

DesnaturalizaciónDesnaturalización

5’5’3’3’

En 32 ciclos se hacen más de 1000 millones de copias (2 n = 2 32 copias)

En 32 ciclos se hacen más de 1000 millones de copias (2 n = 2 32 copias)

Las copias de PCR se incrementan exponencialmente con el Las copias de PCR se incrementan exponencialmente con el número de ciclosnúmero de ciclos

Thermal cycleThermal cycleThermal cycle

Ejemplos de diagnósticos que se hacen por PCR (monogénicas)

- Distonía de torsión temprana (autosómica dominante)

- Ataxia de Friedreich (autosómica recesiva)- Enfermedad de Duchenne (ligada al X)

Distonía primaria (DYT1)

Deleción de tres pares de bases (GAG) en el gen DYT1

Frecuencia 72% de los pacientes con distonía primaria de comienzo temprano

Herencia autosómica dominante

Técnica PCR y corrida electroforéticaen geles de poliacrilamida

Se amplifica un fragmento de 250 pares de bases que contiene al triplete GAG con una PCR radiactiva y se corre en un gel de poliacrilamida.

Distonía primaria (PTD)

250 pb247 pb

Ctrol

N/M

Padre

Madre

Hijo Hija

Se han descripto numerosos casos de aparición de novo de esta deleción

Microsatélites

Son repeticiones de di, tri o tetranucleótidos un número n de veces

dinucleótidos: ---ATATATAT(AT)n--- ---CGCGCGCG(CG)n

trinucleótidos: ---CAGCAGCAG(CAG)n--- ---CCTCCTCCT(CCT)n---

tetranucleótidos: --(CATG)n-- ó --(CCGG)n--

Características:

-Hay alelos con distinto número de repeticiones

-Se heredan mendelianamente

-Muchas enfermedades neurológicas se originan por un incremento anormal del número de repeticiones

Southern Blot

• Extracción de una gran cantidad de ADN genómico total

• Digestión con enzimas de restricción• Corrida electroforética• Transferencia a una membrana de nylon• Identificación de una zona específica del ADN con

sondas marcadas

• Se usa en diagnósticos de enfermedades como la Distrofia Miotónica.

FUNDAMENTOS DE LA TECNICA DE Southern Blot

Corte mediante enzimas deRestricción.

SOUTHERN BLOT

Distrofia Miotónica (DM)

Secuenciación del ADN

• Manual o automática• PCR con nucleótidos especiales• Permite conocer la secuencia exacta

de pares de bases en un fragmento de ADN

• Está basada en la idea de Southern de que Está basada en la idea de Southern de que

moléculas de ADN marcadas pueden ser usadas moléculas de ADN marcadas pueden ser usadas

para analizar otras moléculas de ADN unidas a un para analizar otras moléculas de ADN unidas a un

soporte sólidosoporte sólido

• El “Southern blot” fue el primer array El “Southern blot” fue el primer array

Tecnología de MicroarraysTecnología de Microarrays

• Análisis de expresión hibridando moléculas de ARNm a Análisis de expresión hibridando moléculas de ARNm a librerías de ADNc sobre membranas de nylon librerías de ADNc sobre membranas de nylon

• Dot-blot con sondas ASO Dot-blot con sondas ASO

Estudio de portadores de mutaciones recesivas (Panel Ashkenazi):Tay Sachs, Canavan, Gaucher, Galactosemia, Disautonomía Familiar, Bloom, Nieman Pick, Fibrosis Quística, Mucolipidosis, etc.

Paneles de riesgo para enfermedades complejas:-Enfermedad arterial coronaria-Infarto de miocardio-Fibrilación auricular-Cuadro trombótico-Enfermedad arterial periférica

Al leer el informe de un estudio genético:

• ¿Qué mutación/es se estudió/aron?• Si no se encontró ninguna mutación,

¿se puede descartar la enfermedad?• ¿Qué técnicas se usaron? ¿Es la

técnica adecuada para el/la paciente?• ¿Cuál es el grado de informatividad

del estudio?• ¿Existe una buena correlación

genotipo/fenotipo?

DIFERENCIAS ENTRE POLIMORFISMO Y MUTACIÓN

99.9%

0.1%

94%

6%

TIPOS DE POLIMORFISMO

-----AGACTAGACATT----

-----AGATTAGACCTT----

-----(GATA)(GATA)(GATA)----

-----(GATA)(GATA)----

-----(GATA)(GATA)(GATA )(GATA )----

Polimorfismo de longitudPolimorfismo de secuencia

A los polimorfismos debidos al cambio de una base por otra en la cadenadel ADN se los denomina Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs).

¿Cómo se transmiten los caracteres hereditarios de generación en

generación?

Padres

Hijos

La Herencia de los Genes. La Fecundación

ÓVULOESPERMATOZOIDE +

=

Organismo unicelular. Embrión

n 2n

n

+

HIJO

23 CROMOSOMAS 23 CROMOSOMAS

23 PARES DE CROMOSOMAS

Gen de “la bondad”GAMETAS

FEMENINAS

GAMETAS MASCULINAS

La herencia de los genes

Gen de “la bondad”

“mucha bondad”

“mediana bondad”

“poca bondad”

“excesiva bondad”

Cada variante se denomina alelo.

Imaginando este ejemplo, el gen de “la bondad” presenta cuatro alelos: “mucha bondad” “mediana bondad” “poca bondad” “excesiva bondad”.

“La bondad” de un hijo es el resultado de la interacción de los genes de la bondad que recibió de sus progenitores.

Gen “La bondad” Gen “La Inteligencia” Gen “La Belleza”

Variantes Alélicas

Mucha Bondad Gran Inteligencia Extremada Belleza

Mediana Bondad Inalcanzable Inteligencia Amigable Belleza

Poca Bondad Incomparable InteligenciaMínima Belleza

Excesiva Bondad

En cada individuo este grupo de genes puede presentarse con diferentes combinaciones.

Cuando más loci o genes se investiguen mayor será la caracterización de la persona y menor será la posibilidad de

encontrar dos personas que compartan exactamente las mismas características.

Los estudios de identificación biológica permiten determinar la huella propia de un individuo y reconocer el 50 % heredado de la

madre y el 50 % heredado del padre.

Los STRs

Locus preciso

Un fragmento de ADN se repite n veces “en tandem”. El

número de repeticiones en que se encuentra se corresponde con un

alelo.

Se observan alelos de 2, 3, 4, 5 y 6 repeticiones entre los

individuos.

De acuerdo a las leyes de la herencia, cada

individuo tiene dos alelos, uno heredado de su

madre y el otro de su padre

PCR

10 rep 20

rep

20 rep

10 rep

Pequeñas cantidades de ADN

Grandes cantidades de ADN

Los dos alelos de un STR de

un individuo

Material biológico a partir del cual pueden realizarse los estudios de

identidad.

Óvulo materno

+

espermatozoide paterno

Infinitas divisiones celulares

El niño tiene en todas las células de

su organismo la misma información genética que en la célula originaria

Puede utilizarse cualquier tejido para

analizar su ADN.

Preparación del ADN de las tres personas

Estudio de Paternidad.

LABORATORIOToma de

muestras: sangre, cepillado bucal o

uñas

FORMULARIO Nombre completo

Fecha de nacimiento Nro. de Documento

Relación con el Probando Huella digital Foto

Firma

P H M

P+H+M

ESTUDIO DE PATERNIDAD EN SECUANCIADOR AUTOMÁTICO

ESTUDIO DE MATERNIDAD

Herencia del Cromosoma Y Estudio de la Línea Paterna

Todas las células femeninas tienen dos

cromosomas sexuales X (XX)

Todas las células masculinas tienen un

cromosoma sexual X y uno Y (XY)

Las gametas femeninas (óvulos) llevan siempre un único cromosoma X

Las gametas masculinas (espermatozoides)

llevan o un cromosoma X o un cromosoma Y

X X YX

X

X

Y

+

+

MUJER

VARON

Herencia del Cromosoma Y

X YX X

X Y X YX X X X

X YX Y

ABUELO, HIJOS VARONES, NIETOS VARONES, HERMANOS VARONES, PRIMOS VARONES POR VIA PATERNA, TIO

PATERNO Y SOBRINO, COMPARTEN EL MISMO CROMOSOMA Y

El ADN mitocondrial

presenta pequeñas regiones

diferentes entre las personas

espermatozoide + óvulo fecundación

Primer célula embrionaria que originará todo el

embrión

núcleos

mitocondrias

Herencia Mitocondrial Estudio de la Línea Materna

DNA MIT.1

DNA MIT.1

DNA MIT.1

DNA MIT.1

DNA MIT.1

DNA MIT.2

DNA MIT.3

DNA MIT.4

DNA MIT.5

DNA MIT.5

Está dado por las diferentes variables en que se presenta en la población.

POLIMORFISMO DE UN GEN

TIPOS DE POLIMORFISMO

-----AGACTAGACATT----

-----AGATTAGACCTT----

-----(GATA)(GATA)(GATA)----

-----(GATA)(GATA)----

-----(GATA)(GATA)(GATA )(GATA )----

Polimorfismo de longitudPolimorfismo de secuencia

A los polimorfismos debidos al cambio de una base por otra en la cadenadel ADN se los denomina Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs).

En cada individuo este grupo de genes puede presentarse con diferentes combinaciones.

Los seres humanos compartimos el 99,9% de nuestro genoma. Las diferencias responden a variaciones en tan solo el 0.1 % de la secuencia del ADN.

DIFERENTES ALELOS EN LA POBLACIÓN

PROYECTO GENOMA HUMANO

A partir de la secuenciación completa del genoma humano se ha determinado que existen aproximadamente 30.000 genes.

Se encontraron más de 6.000.000 sitios con SNPsPero lo importante fue entender cómo las diferentes variantes alélicas de un gen polimórfico se relacionan con características particulares de las personas.

AAACCGG Bondad alta AAAACGG Bondad media

TTTGGCC TTTTGCC

Proyecto Genoma Humano

GWAS (Genomic wide association studies)

FarmacogenéticaFarmacogenética

Farmacogenética: reducción de riesgos de la terapiaComparación de riesgos fatales

1 en 107 1 en 106 1 en 105 1 en 104 1 en 103 1 en 102

Incremento del riesgo fatal (anual)

Reacción fatal frente al fármaco prescritoFuente: Consumer Reports

Farmacogenética

Electrocución

Accidente aéreo

Asesinato

Accidente de coche

El genotipo: impacto significativo en el metabolismo de fármacos

Concentraciones de fármaco según Fenotipo Metabolizador

Fenotipo metabolizadorGenotipo Tipo de respuesta a dosis típicas

Lento

Intermedio

Eficiente

Ultrarrápido = Reacciones adversas

= Intervalo terapéutico

= No efectivo

Conc.

Tiempo

Actividad

normal

Actividad

reducida

no activida

d

= Reacciones adversas

= Intervalo terapéutico

= No efectivo= Reacciones adversas

= Intervalo terapéutico

= No efectivo= Reacciones adversas

= Intervalo terapéutico

= No efectivo

Los polimorfismos genéticos también llamados variaciones genéticas se relacionan, entre otras cosas, con el metabolismo de los medicamentos antineoplásicos e influyen en su toxicidad y respuesta a la quimioterapia

en pacientes con cáncer.

Consecuencias de un polimorfismo genético:

La presencia de uno u otro polimorfismo PUEDE RESULTAR INDIFERENTE.

Si afectan a la secuencia codificante PUEDEN PRODUCIR cambios importantes en la estructura de la proteína.

Si afectan a la secuencia reguladora del gen PUEDEN MODIFICAR su expresión.

TIOPURIN METIL TRANSFERASA: TPMT

Thiopurine Methyltransferase (TPMT) Gene

Enzyme Activity Levels in 300 Caucasian Patients

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

low medium high

TPMT Enzyme Activity

% o

f S

ub

jects

a

b

c

Thiopurine Methyltransferase(TPMT) Polymorphism affects6MP Pharmacodynamics

10

8

6

4

2

00 5 10 15 20 25 30

TPMT Activity

2000

1000

0Mut/Mut Wt/Mut Wt/Wt

HPRT

TGNs DNAincorporation

MP MeMPTPMT

toxicityrisk of relapse

myelosuppressionrisk secondary cancer

wt/wt

wt/m

m/m

Leukemia 14:567-72, 2000

Relling & Dervieux Nature Ca Rev 2001;1:99-108

Gene for TPMT hasA common variant thatCauses low activity, High levels of 6MP Metabolites

0

10

20

30

40

50

60

70

80

dose

(mg/d

ay)

mut/mut wt/mut wt/wt

Inherited differences in Metabolism

Inherited differencesIn drug levels

Optimal Dose for Each Child

UDP-glucuronosiltransferasa UGT1

ENZIMA POLIMORFISMO FARMACO CONSECUENCIA

UDP-glucuronosiltransferasa

UGT1

Secuencias TA repetidas

Irinotecan Inestabilidad proteica. Diarrea, mielo depresión.

Dihidropirimidina Deshidrogenasa (DPD)

Mutación Puntual

Fluoropirimidinas Neurotoxicidad, mielo depresión.

Drogas que presentan en sus prospectos la recomendación por la FDA De estudio farmacogenético antes de medicar.

http://www.fda.gov/Drugs/ScienceResearch/ResearchAreas/Pharmacogenetics/ucm083378.htm

REACCIÓN AL MEDICAMENTO

Nombre del medicamento

Análisis genético para: Resultados del análisis

Abacavir Hipersensibilidad El alelo HLA-B*5701 se asocia a mayor riesgo de presentar hipersensibilidad al abacavir.

Antibióticos aminoglucósidos

Pérdida auditiva Polimorfismo asociado a la pérdida auditiva como consecuencia del tratamiento con antibióticos amigo glucósidos.

Cafeína Metabolismo Polimorfismo asociado a ser metabolizador lento de la cafeína, y riesgo de toxicidad y riesgo de sufrir un infarto cardíaco.

Carbamazepina Hipersensibilidad El alelo HLA-B*5702 está asociado a la hipersensibilidad a la carbamazepina.

Clopidogrel Metabolismo Polimorfismo asociado a la respuesta.

Metotrexato Toxicidad Polimorfismo asociado a riesgo de toxicidad inducida por el metotrexato.

LAS PREDICCIONES YA ESTÁN HECHAS

QUÉ FALTA PARA APLICAR ESTOS ESTUDIOS PREVIO AL TRATAMIENTO?

Pacientes con genotipos tratados de acuerdo a las predicciones.

Pacientes sin genotipos y tratamiento clásico

La farmacogenética, mejora la efectividad del tratamiento?

EJEMPLOS DE ASOCIACIONES GENÉTICAS

GEN PPARG (PEROXISOME PROLIFERATOR ACTIVATED RECEPTOR GENE)-El alelo C codifica para una Prolina en el codon 12 en lugar de una Alanina.-PPARG asociado a la reducción de el peso corporal en respuesta a la restricción calorica.-Polimorfismo Pro12Ala asociado a Sindrome Metabolico, Resistencia a la Insulina y diabetes tipo 2 en población sana. GEN APOA-2: GEN DE LA APOLIPOPROTEINA A2-Presencia de una C en lugar de una T en el promotor del gen.-Genotipo C/C :-Influye en la obesidad y el riesgo cardíaco. GEN ADIPOQ: GEN DE LA ADIPONECTINA-Presencia de una G en lugar de una A en la posición -11391 G/A, en el gen ADIPOQ.-Tendencia a recuperar el peso perdido inmediatamente.-Riesgo de Resistencia a la insulina y syndrome metabolico.-Alelo A da protección a la recuperación del peso luego de 32-60 semanas luego de dieta baja en calorías. GEN MCM6: minichromosome maintenance complex component 6.-El a alelo C en lugar del T en la posición -13910 del gen MCM6.-Influye sobre el gen LCT y se asocia a hipolactasia o intolerancia a la lactosa.

SU RESULTADO

MAYOR PROBABILIDAD

Las personas con su mismo genotipo tienen un probabilidad mayor de ser intolerantes a la lactosa y pueden sufrir efectos

secundarios al ingerir lactosa, que es el azúcar que se encuentra en

la leche.

Gen analizado

GENES RELACIONADOS

Su Genotipo

Valor Científico

MCM6-rs498835 C/C ****

EJEMPLO / REACCIONES A ALIMENTOS

La intolerancia a la lactosa es la capacidad de digerir la lactosa, que es el azúcar que se encuentra en la leche y los productos lacteos. Esta condición se debe a la falta de una enzima llamada lactasa. La variante genética rs4988235 está situada cerca del gen de la lactasa (LCT), en el gen MCM6, y se ha demostrado que nivela los niveles de lactasa en el organismo . Las personas con el genotipo C/C (marcador genético rs4988235) tienen una “Mayor probabilidad” de ser intolerantes a la lactosa, mientras que las personas con otro genotipo tienen una “Menor probabilidad” de ser intolerantes a la lactosa.Esta variante se ha asociado con la intolerancia a la lactosa en estudio de personas caucásicas, mientras que otras variantes podrían tener un papel importante en otros grupos étnicos.

INTOLERANCIA A LA LACTOSA

www.SNPedia.com

PMID, acrónimo de «PubMed Unique Identifier», es un número único asignado a cada cita de un artículo de revistas biomédicas y de ciencias de la vida que recoge PubMed.

PubMed es un motor de búsqueda de libre acceso a la base de datos MEDLINE de citaciones y resúmenes de artículos de investigación biomédica. Ofrecido por la Biblioteca Nacional de Medicina de los Estados Unidos como parte de Entrez. MEDLINE tiene alrededor de 4.800 revistas publicadas en Estados Unidos y en más de 70 países de todo el mundo desde 1966 hasta la actualidad.

[PMID 18959602]

Las personas con este mismo genotipo tienen mayor

probabilidad de presentar niveles mas bajos de vitaminas B12 en

sangre. Se puede ajustar el consumo de la vitamina B12

poniéndole ingiriendo alimentos ricos en vitamina B12.

Gen analizado

GENES RELACIONADOS

Su Genotipo

Valor Científico

FUT2-rs602662 A/G ****

En múltiples estudios genéticos se ha identificado a un marcador en el gen FUT 2, que está asociado a niveles bajos de Vitamina B12 en sangre. Esto se puede deber a una absorción deficiente de la vitamina en el intestino. Se recomienda a las personas con genotipos G/G o A/G “Ajustar el consumo” porque es probable que tengan niveles bajos de Vitamina B12. El consumo de cereales enriquecidos con vitamina B12 puede ayudar a obtener niveles adecuados, sobre todo en personas mayores de 50 años.

VITAMINA B12

EJEMPLO / NECESIDADES NUTRITIVAS

AJUSTE EL CONSUMO

ASOCIACIÓN ENTRE LOS NÍVELES DE VITAMINA B12 EN PLASMACON LOS GENOTIPOS DEL GEN FUT2.(MUJERES DEL GWAS Y REPLICA EN OTROS ESTUDIOS)

SNP Association by Study

EDAD N FRECUENCIA DEL ALELO

ESTIMADO (S.E.)

P-VALORCANTIDAD PG/ML

rs602662GWAS

Ser/Ser A/A

Ser/Gly G/A

Gly/Gly G/G

Gly=0.49

NHS CGEMS 59 1,658 489.82 418.67 417.05 -0.08(0.01) 6.54x10-10

Total (Gwas+Grupo replica)

Ante la necesidad de un estudio genético:

-La información siempre debe estar mediada por el médico.-Es el médico quien debe asesorar al paciente respecto de las conveniencias y los riesgos de someterse a una prueba genética.-Explicar muy bien el significado de un estudio de asociaciones. --No caer en la GENOMANÍA. -Recordar que la genética es sólo una parte de lo que somos fenotípicamente y que el medio ambiente juega un rol importantísimo tanto en la expresión de nuestros genes (epigenética) como en los riesgos de desarrollar enfermedades complejas (cáncer, diabetes, enf. Cardíaca, etc).