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UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÓRDOBA
FACULTAD DE MATEMÁTICA, ASTRONOMÍA, FÍSICA Y COMPUTACIÓN
SERIE “A”
TRABAJOS DE FÍSICA
N.º 15/2018
CARACTERIZACIÓN DE LA PREPARACIÓN DE LIPOSOMAS UTILIZANDO RELAXOMETRÍAMAGNÉTICA NUCLEAR
María B. Marzola, Carla C. Fraenza, Esteban Anoardo
Editor: Miguel A. Chesta
CIUDAD UNIVESITARIA – 5000 CÓRDOBA
REPÚBLICA ARGENTINA
Caracterización de la preparación deliposomas utilizando Relaxometría
Magnética Nuclear
M. B. Marzola Coronel, C. C Fraenza, E. Anoardo
Laboratorio de Relaxometría y Técnicas Especiales, Grupo de RMNFacultad de Matemática, Astronomía y Física, Universidad Nacional de Córdoba
M. Allende y H. de la Torre Ciudad Universitaria, X5016LAE Córdoba, Argentina
Resumen
Este trabajo de investigación consistió en caracterizar cada paso de la preparación de liposomasutilizando la técnica de relaxometría con ciclado rápido de campo magnético. Para ello, se midieron perfilesde dispersión de la tasa de relajación espínred R1 en cada una de las instancias relevantes de la preparación,verificando la efectividad de las mismas. Adicionalmente, se realizaron experimentos complementarios conla técnica de dispersión dinámica de luz o DLS por sus siglas en inglés.
Abstract
This work consisted in characterizing each step of the liposome preparation using the fast fieldcyclingNMR relaxometry technique. The dispersion profiles of the spinlattice relaxation rate R1 were measuredfor every relevant instance of the preparation in order to check their effectiveness. Additionally, experimentsusing dynamic light scattering (DLS) technique were carried out.
1. Introducción
Las propiedades de la membrana de vesículas lipídicas, comunmente llamadasliposomas, resultan de particular interés
en una creciente cantidad de problemas biotecnológicos. La importancia de esudiar estetipo de sistemas es su utilidad para el transporte controlado por diferentes vías, de fármacoshidrofílicos e hidrofóbicos en su núcleo acuoso y bicapa lipídica respectivamente, asi comotambién para contrastes, transfección, etc.
En trabajos previos [1], [2], [3], [4], [5] sepresentó un modelo para interpretar la dispersión de la tasa de relajación espínred deprotones, obtenida con la técnica de relaxometría magnética nuclear con ciclado rápidode campo magnético (o FFC por sus siglas en
inglés) [6], para liposomas unilamelares. Además de proporcionar información general sobre la dinámica de los lípidos que conformanla membrana de los liposomas, este modelonos permite inferir sobre las propiedades elásticas de la misma. La técnica utilizada ofrecedos potenciales ventajas escasamente exploradas a la fecha: es factible extender los estudiosa sistemas de escalas de pocas decenas de nanómetros en forma no invasiva, y es posiblepensar en instrumentación de costo razonable,volumen y peso limitado, facilidad de instalación, así como mantenimiento y uso. Por loque se ha demostrado que es de gran utilidadestudiar estos sistemas con la técnica de FFC.
Específicamente el objetivo de este trabajofue la verificación de la sensibilidad de la técnica con ciclado rápido de campo a las distintas
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FSA Trabajos Originales en Física Serie A1 (2018) 1-10
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instancias de la preparación de liposomas conel fin de asegurar la efectividad de los diversosprocesos a los que el sistema es sometido.
2. Sistema deEstudio Liposomas
Un lípido es una molécula orgánica compuesta principalmente por carbono e hidrógeno y en menor medida oxígeno. Tambiénpueden contener fósforo, azufre y nitrógeno.
Como en aplicaciones biológicas el solventeutilizado es agua, se puede decir que los lípidosanfifílicos son un tipo de lípidos que consistende una parte hidrofóbica y una parte hidrofílica. En general, la parte hidrofóbica consistede cadenas hidrocarbonadas, mientras que laparte hidrofílica está compuesta por un grupo polar. Dentro de esta clase de lípidos seencuentran los fosfolípidos, los cuales están compuestos por una molécula de glicerol, a la quese unen dos ácidos grasos y un grupo fosfato.Este último está unido a otro grupo de átomos,entre los que generalmente está incluido unnitrógeno, como es el caso del grupo colina, abase del cual se forman las fosfatidilcolinas.
Los fosfolópidos poseen una función estructural ya que son un componente principal detodas las membranas celulares debido a su capacidad de formar bicapas lipídicas [7]. En estetrabajo se utilizó un fosfolípido particular llamado fosfatidilcolina de soja (SPC) adquiridode la empresa “Lipoid” con el nombre comercial “PHOSPHOLIPON 90 G” y cuya especiepredominante es en un 94 %C42H80NO8P concadenas doblemente insaturadas y, en un 4 %,Lisofosfatidilcolina (C25H50NO7P). En la figura 1 se esquematiza la estructura de la especiepredominante:
Figura 1: Estructura molecular de la fosfatidilcolina desoja (SPC). En el extremo derecho se observan los grupospolares, y en el extremo izquierdo se muestran las cadenasapolares.
En solución acuosa, los lípidos anfifílicos alprincipio se disuelven como monómeros pero,al superar cierta concentración, se unen espontáneamente para minimizar las interaccióneshidrofóbicas desfavorables y formar una variada gama de estructuras, que dependen engeneral de la concentración y la temperatura.
Para determinadas concentraciones en unmedio acuoso, los fosfolípidos forman bicapasque se curvan y se cierran espontáneamenteen estructuras cuasiesféricas llamadas liposomas, los cuales encierran en su interior partedel solvente que los rodea. Tales sistemas noestán en equilibrio termodinámico pero pueden ser estables durante varios días. El tamañode un liposoma puede ir desde unos 20nm hasta varios micrómetros de radio, y puede estarcompuesto de una (unilamelar) o varias membranas concéntricas (multilamelar),cada unade las cuales tiene aproximadamente 6nm deespesor. En la figura 2 se esquematiza un liposoma.
Figura 2: Respresentación esquemática de un liposoma.Los círculos representan los grupos polares mientras quelas líneas onduladas hacen referencia a las cadenas hidrocarbonadas.
3. Experimental
I. Preparación de la muestra
Se prepararon liposomas de SPC (Fosfatidilcolina de Soja) suspendidos en agua deuterada(D2O). Se procuró que el diámetro de los mismos no supere los 100nm por la aplicabilidaddeseada.
Las suspensiones de liposomas fueron preparadas en el Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba (CIQUIBIC), de lafacultad de ciencias químicas, UNC, en la ciudad de Córdoba.
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El motivo por el que el medio de suspensión es agua deuterada (D2O) y no agua ( H2O)es que se desea detectar la señal de RMN proveniente unicamente de los núcleos de hidrógenode los lípidos. Por el contrario, si el medio desuspensión fuera agua, la señal que se detectaría sería en mayor medida proveniente de losnúcleos de hidrógeno del H2O. Debido a la falta de resolución espectroscópica de la técnicade RMN a utilizar, no se podría discriminar laseñal proveniente de cada tipo de hidrógeno.
Como la frecuencia de la perturbación aplicada en los experimentos a realizar es proporcional a la constante giromagnética del hidrógeno, no se generan transiciones entre los niveles de energía provenientes de la interaccióndel campo externo
−→B0 con los restantes elemen
tos que componen la muestra ya sean deuterios, oxígenos, fósforos, carbonos, etc. Es decirque lo que ocurre es que se “invisibilizan” losnúcleos de todos los elementos que no seanhidrógenos.
Pasos de la preparación
1. PESAJE
Se utilizó una balanza digital “HR120”(A&D Weighing) con una apreciación de0,0001g. El pesaje se realizó colocando elmaterial dentro de un tubo cónico de vidrio de peso conocido. La masa total quese utilizó en todos los eperimentos fue:Mli p = (61,19 ±0,05)mg
2. DISOLUCIÓN
Los lípidos se disolvieron en 2ml de cloroformo aproximadamente.
3. FORMACIÓN DEL “FILM”
Se secó el solvente con una corriente denitrógeno gaseoso, mientras se maniobraba el recipiente de tal forma de facilitarla adhesión de los lípidos a las paredesdel mismo durante el secado del solvente,formandose un film.
Figura 3: Respresentación esquemática de la formacióndel film dentro del recipiente.
Una vez formado el film, se dejó el recipiente en vacío durante tres horas aproximadamente para terminar de evaporarel solvente.
Todo el procedimiento descripto hastaahora se realizó con el objetivo de favorecer la hidratación cuando se agrega la solución acuosa ya que el lípido es bastanteinsoluble en agua. Por lo que, si se agregara directamente el bufer acuoso, el lípido tendería a excluirse del agua formando grandes agregados difíciles de desarmar. Entonces, con este procedimiento selogran formar capas monomoleculares enlas paredes del tubo cónico.
4. HIDRATACIÓN
La muestra se hidrató con (1,3 ± 0,1)mlde agua deuterada. Primero se agregaron 0,8ml y se agitó la solución con un“agitador vortex” para ayudar a la hidratación. Luego se agregaron los 0,5ml deD2O restantes y se volvió a agitar. Si alfinalizar este procedimiento se observabaque todavía quedaban restos de film sindisolver, se introducía la muestra en unbaño térmico a 40◦C aproximadamentepor unos minutos y se volvía a agitar.
Figura 4: Respresentación esquemática del proceso dehidratación.
5. TRATAMIENTO TÉRMICO
Una vez realizada la hidratación se transpasó la muestra a un “eppendorf” y se
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Caracterización de la preparación de liposomas utilizando Relaxometría Magnética Nuclear
lo sometió a cinco ciclos térmicos de fríocalor que consisten en introducir la muestra 5 min en un baño térmico a 313 K einmediatamente después ponerla en unrecipiente con Nitrógeno líquido (77 K)otros 5min. Este tratamiento favorece aque el agua pesada interactúe mejor conlos grupos polares de los fosfolípidos. Loque se obtiene en esta instancia es unasuspensión de liposomas multilamelares.
Como la distribución de tamaños de estasvesículas no es uniforme se realizó el siguiente y último paso de la preparación.
6. EXTRUSIÓN
Este proceso consiste en pasar las vesículas por membranas de policarbonatocon poros de 100nm en este caso. De estaforma se obliga a las vesículas a adoptaruna forma esférica con diámetro promedio definido por los poros de la membrana, implicando esto también que lasvesículas dejen de ser multilamelares. Elinstrumento utilizado para realizar estatarea se denomina extrusor y consta básicamente de una estructura cilíndrica deteflón dentro de un recinto metálico quesostiene firmemente las mebranas porosas y, de cada lado de la estructura seadosa una jeringa. Así se hizo pasar diezveces la muestra de una jeringa a la otraatravesando la membrana porosa.
Figura 5: Respresentación esquemática del proceso deextrusión.
II. Determinación del tamaño de losliposomas
Para determinar los tamaños promedios delas vesículas que se formaron una vez terminada la preparación, se utilizó un equipo de dispersión dinámica de luz láser (Zetasizer NanoZs, Malvern Instruments, UK), utilizando un
ángulo de detección de 173◦ y provisto de unláser de HeNe operando a una longitud deonda de 633nm.
III. Medición de un perfil de dispersión
Se define “tiempo de relajación espínred”ó T1 al tiempo característico asociado con la recuperación hacia la condición de equilibrio dela componente longitudinal (dirección paralelaal eje de cuantzación impuesto por el campoexterno B0) de la magnetización y está determinado por los mecanismos que involucranuna transferencia energética desde el sistemade espines a la red.
La relaxometría con ciclado rápido de campo ó FFC NMR (por sus siglas en inglés) esuna técnica de Resonancia Magnética Nuclearque permite obtener tiempos de relajación deun sistema de núcleos en función del campomagnético externo aplicado [6]. Debido a quela frecuencia de Larmorω0 es proporcional a lamagnitud del campo magnético aplicado comose indica en la siguiente ecuación 1:
ω0 = γB0, (1)
donde γ es la constante giromagnética decada elemento, suele expresarse el campo magnético externo (B0) en función de la frecuenciade Larmor (de núcleos de Hidrógeno en estecaso) ω0.
Si se mide la dependencia deT1 con el valorde campo, se obtiene la denominada “curva dedispersión de la tasa de relajación espínred”,la cual consiste en expresar la tasa de relajación R1 = T1
−1 en función de la frecuencia deLarmor.
Las dos secuencias de campo ciclado que seusan comunmente para la medición deT1 son:la secuencia Pre Polarizada (PP) y la secuenciaNo Polarizada (NP). El principio de funcionamiento y sus características se describen acontinuación.
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Secuencia PP
Esta secuencia se utiliza para medir T1a campos muy bajos (en general menores a10MHz). En la figura 6 se muestra un esquemade la misma.
Figura 6: Esquema de la secuencia prepolarizada. Semuestra gráfica y cualitativamente los distintos valoresque toma el campo B0. Se puede ver que el campo Br seesquematiza con más de una “linea” debido a que su valorvaría durante el experimento. El pulso de radiofrecuenciase denota con las letras PW , τ es el período temporal enque la magnetización se encuentra bajo la acción del campoBr, y el lapso de tiempo en que el campo B0 cambia de unvalor a otro se denota con las letras sw [8].
La muestra es polarizada en un campo magnético Bp, tan alto como técnicamente sea posible donde se forma una magnetización deequilibrio proporcional al campo M0(Bp). Elproceso de relajación tiene lugar en un campoBr el cual es el que cambia su valor para poder medir el perfil de dispersión y, el intervalode tiempo que el sistema se encuentra sometido a este campo, depende de las propiedadesrelaxométricas de la muestra. La magnetización inicial en este campoBr se asume igual ala magnetización en el campo de polarizaciónya que se ignora la relajación ocurrida durante el intervalo de cambio “sw”, por lo que setiene Mz(0) = M0(Bp). Luego, la misma empieza a relajar hacia la nueva magnetizaciónde equilibrio proporcional al campo de relajación M0(Br), y relajará (disminuirá en estecaso) más, mientras mayor sea el tiempo τ quese deje expuesta a este campo. Este tiempo τes el que va cambiando en cada secuencia acampo Br fijo para determinar un valor deT1.En este intervalo de tiempo, el valor al que relaja la magnetización está dado por una de lassoluciones de las ecuaciones de Bloch:
Mz(τ) = M0(Br) + [M0(Bp) −M0(Br)]e−τ/T 1
(2)
La señal remanente después de este intervalo de relajación es detectada en un campoBd, de nuevo, tan alto como sea posible. Parala detección de la señal remanente, se aplica eneste caso un pulso deπ / 2 de duración de 6,5µs(también se pueden utilizar ecos de espín) paraobservar la señal nuclear (señal de inducciónlibre o FID por su siglas en inglés). Se adquirióla integral bajo un sector muy pequeño de laFID cercano al punto máximo de la misma, demodo de aprovechar el mayor valor de señal y,al mismo tiempo, no lidiar con posibles imperfecciones de los primeros puntos de la misma.Finalmente toma lugar el proceso de repolarización de la muestra, antes de que comience elciclo nuevamente.
Secuencia NP
Cuando el valor del campo de relajaciónes próximo al valor de polarización, la evolución de la magnetización toma lugar entre unvalor inicial y final de campo muy cercanos,lo cual incrementa el error de la medición. Enestos casos es preferible utilizar la secuenciaNP ya que aumentar el valor del campo Bpno es una posibilidad debido a impedimentoselectrónicos.
Por lo tanto esta secuencia se utiliza paramedir T1 a valores de campo próximos al valorde polarización, en este caso la magnetizacióncrece desde un valor inicial proximo a cero. Lamisma se esquematiza en la figura 7.
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Caracterización de la preparación de liposomas utilizando Relaxometría Magnética Nuclear
Figura 7: Esquema de la secuencia nopolarizada. Semuestra gráfica y cualitativamente los distintos valoresque toma el campo B0. Se puede ver que el campo Br seesquematiza con más de una “linea” debido a que su valorvaría durante el experimento. El pulso de radiofrecuenciase denota con las letras PW , τ es el período temporal enque la magnetización se encuentra bajo la acción del campoBr, y el lapso de tiempo en que el campo B0 cambia de unvalor a otro se denota con las letras sw.
En esta secuencia se inicia el ciclo sin ningún campo de polarización B0(0) = 0, porlo tanto la curva de relajación se construye apartir de un valor de magnetización cercanoa cero Mz(0) ∼ 0. Luego se enciende el campo de relajación y la magnetización empiezaa crecer para llegar al valor de equilibrio coneste campo. La magnetización será más grandemientras mayor sea el tiempo τ que se dejesometido el sistema a este campo. La evoluciónde la misma puede entonces describirse con lasiguiente ecuación:
Mz(τ) = M0(Br)(1 − e−τ/T 1) (3)
Luego la señal es detectada de la mismamanera que en la seuencia PP.
Descripción general y parámetros utilizados
Los perfiles de dispersión de la tasa derelajación espínred,fueron medidos usandola técnica de relaxometría con ciclado rápidode campo, con un relaxómetro “SpinmasterFC2000/C/D” (Stelar; Mede, Italia) y usandoun volumen de muestra de 1ml. En todos loscasos se utilizó un campo magnético de polarización de 15MHz , y un campo de adquisiciónde 14,19MHz (expresados en frecuencia de Larmor para núcleos de hidrógeno). Los perfilesse midieron dentro del rango de frecuenciasde 30KHz a 15MHz (valores del campo de relajación),rango en el cual se puede asegurar
que las mediciones no están afectadas por lapresencia de campos locales [1]. La cantidadde puntos que componen el perfil se fijó en 30y, la medición del mismo demoró entre 2hs y5hs según la temperatura de la medición. Unavez preparadas la suspensión de liposomas, elperíodo de tiempo en el que se la sometió atodas las mediciones no fue nunca mayor a 10días. Luego de este lapso no se puede garantizar el estado de estabilidad de la muestra. Latemperatura de la muestra fué controlada conuna variación de 1K aproximadamente, usandoel control de temperatura del relaxómetro.
Medición genérica de un punto del perfil
Como ya se mencionó, un perfil de dispersión de la tasa de relajación es justamente ungráfico del valor de R1 en función del campomagnético Br en el cual tiene lugar la relajación.Por lo tanto, para la medición de un punto deesta curva lo que se hace es fijar un valor decampo Br, y se repite el ciclo ya descripto perovariando el tiempoτ en el que la muestra permanece en este campo. Este ciclo se realizó 16veces por lo que se obtuvieron curvas con 16puntos para la determinación de un valor deT1.
Secuencia NP: Esta secuencia se utilizó para la medición de los valores deR1 correspondientes a campos magnéticosBr entre 10MHzy 15MHz . En este caso mientras mayor sea eltiempo τ que la muestra se encuentra sometidaal campo de relajación, mayor será la magnetización adquirida y más parecida al valor desaturación correspondiente a este valor de campo Br. Por lo tanto se obtiene una curva de “recuperación de la magnetización”. Típicamenteluce como en la figura 8.
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Figura 8: Esquema cualitativo de la forma funcional dela magnetización en función del tiempo de residencia alvalor de campo Br utilizando una secuencia NP.
Secuencia PP: Esta secuencia se utilizó parala medición de los valores de R1 correspondientes a campos magnéticos entre 30KHz y10MHz . A diferencia de la secuencia NP, mientras más larga sea la permanencia del sistemaen el campo de relajación, más va a decrecer lamagnetización respecto a su valor alcanzadoen el campo de polarización, pareciendose alvalor en equilibrio con el campo Br. En estecaso se obtienen gráficos como el de la figura9, que ilustran la pérdida de magnetización.
Figura 9: Esquema cualitativo de la forma funcional dela magnetización en función del tiempo de residencia alvalor de campo Br utilizando una secuencia PP.
El valor de cada T1 se obtuvo ajustando porcuadrados mínimos cada curva de crecimiento/disminución de la magnetización según seael caso. Los procesos de relajación resultaronser todos monoexponenciales y, las funcionesde ajustes utilizadas según la secuencia aplicada, fueron las dadas por las ecuaciones 2 y 3en el marco teórico.
4. Resultados yAnálisis de datos
Se realizó este estudio para verificar si cadainstancia de la preparación de la muestra de
liposomas tenía el efecto deseado y si la técnicautilizada podía detectarlo a través de mostrarcambios en la dispersión de R1.
En términos generales, lo que se midió fueun perfil de dispersión de la tasa de relajaciónespínred luego de cada proceso relevante enla preparación de liposomas, específicamente luego de la hidratación, luego de los ciclostérmicos, y por último, una vez terminada laextrusión (muestra final).
Todos los perfiles que se muestran en estasección se comparan con un perfil de dispersión obtenido previamente correspondiente auna muestra que posee la misma composiciónpero con el proceso de preparación finalizado.Los perfiles estudiados poseen 15 puntos envez de 30 (como la muestra de referencia) paraahorrar tiempo de medición, pero esto no esrelevante ya que las curvas obtenidas no vana ser ajustadas sino que sólo se desea analizarsu comportamiento.
PostHidratación
Una vez formado el film, se procedió a la hidratación de la muestra, siguiendo el protocolodescripto en la sección I.1. Luego, se separóuna pequeña parte de la muestra para realizarun experimento de DLS y, lo restante se utilizópara la medición del perfil de dispersión.
El perfil de dispersión obtenido, se ilustraen la figura 10.
105 106 1071
10
100
S P C a 3 0 5 K p r e p a r a c i ó n c o m p l e t a S P C a 3 0 5 K l u e g o d e l a h i d r a t a c i ó n
R1 [s
-1]
[Hz]
Figura 10: Dispersión experimental de la tasa de relajación espínred para una suspensión de liposomas de SPC(•) y para una suspensión de SPC luego de la hidratación(N).
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Caracterización de la preparación de liposomas utilizando Relaxometría Magnética Nuclear
Se puede observar una gran diferencia entre los dos perfiles ya que para ν0 = 15MHzlos valores de R1 de ambas muestras ilustradas son indistinguibles y es aproximadamenteR1 ∼ 7s−1, pero para ν0 = 30KHz la muestracon la preparación completa posee un valor deR1 mayor a 100s−1, mientras que el valor deR1 de la muestra que sólo está hidratada, esinferior a 30s−1. Por lo tanto se puede ver quecomparativamente, este último perfil es muchomenos dispersivo, es decir, la diferencia entreR1 a 15MHz y a 30kHz es menor en este últimocaso.
PostCiclos térmicos
Una vez terminada la medición anterior seprocedió a realizarle a la muestra el tratamientotérmico. El perfil de dispersión obtenido luegode este proceso, se ilustra en la figura 11.
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S P C a 3 0 5 K p r e p a r a c i ó n c o m p l e t a S P C a 3 0 5 K l u e g o d e l o s c i c l o s t é r m i c o s
R1 [s
-1]
[Hz]
Figura 11: Dispersión experimental de la tasa de relajación espínred para una suspensión de liposomas de SPC(•) y para una suspensión de SPC luego de el tratamientotérmico ( ).
Si se comparan las figuras 10 y 11 se puedeobservar que el perfil no cambió considerablemente respecto al paso de preparación anterior,es decir, presenta características mucho menosdispersivas que el correspondiente perfil de lamuestra con preparación completa.
PostExtrusión
Por último, luego de los ciclos térmicos sesometió la muestra al proceso de extrusión.
Este paso se realizó para verificar si se podíareproducir un perfil típico de liposomas deSPC (muestra con preparación completa). Ambos perfiles (suspensión de SPC luego de laextrusión y liposomas de SPC) se ilustran en lafigura 12.
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R1 [s
-1]
[Hz]
Figura 12: Dispersión experimental de la tasa de relajación espínred para una suspensión de liposomas de SPC(•) y para una suspensión de SPC luego de la extrusión( ).
Las curvas no son 100 % indistinguibles, pero como lo que se desea observar son las propiedades dispersivas de la misma, se podríadecir que ambas curvas poseen las mismascaracterísticas a tal fin. La discrepancia observada se puede deber tal vez a diferencias en latemperatura del experimento no reportadas.
La medición de este último perfil demuestra la importancia de realizar todos y cada unode los pasos de preparación descriptos en lasección I.1 en orden de obtener un perfil conlas características del graficado en la figura 12y similares a las obtenidas para liposomas entrabajos previos [1] [2].
DLS
Para completar este análisis de la preparación, se sometió a las muestras correspondientes a las instancias previa y posterior a laextrusión, a un estudio de dispersión dinámicade luz para observar la influencia que poseeeste proceso en la distribución de tamaños delas vesículas. Los resultados se muestran enlas figuras 13 y 14 donde se pueden observarlas distribuciones de diámetros de las vesículas
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según la cantidad (“número”) que poseen undeterminado diámetro, correspondientes a antes y después de la extrusión, respectivamente.
Figura 13: Distribución de diámetros de las vesículassegún la cantidad que posee un determinado diámetro,antes de la extrusión
Figura 14: Distribución de diámetros de las vesículassegún la cantidad que posee un determinado diámetro,luego de la extrusión, usando una membrana de tamañode poro de 100nm de diámetro.
En la figura 13 se puede observar que antes de realizar la extrusión se tienen vesículasde tamaños de 800nm, 900nm y 1000nm aproximadamente, mientras que una vez realizado este proceso (diámetro de poro del filtro= 100nm), lo que se obtiene son vesículas dediámetros mucho más pequeños (∼ 30 − 40nmy ∼ 80 −90nm).
Este último análisis destaca la importanciadel proceso de extrusión para eliminar grandesagregados.
5. Conclusiones
En cuanto a las propiedades intrínsecas dela muestra, se logró caracterizar cada instanciade la preparación de liposomas. Esta caracterización será de gran utilidad para futurosexperimentos que se realicen con este tipo desistemas utilizando la técnica de relaxometríacon ciclado rápido de campo magnético. Severificó que cada instancia de la preparaciónde liposomas tiene el efecto deseado y que latécnica utilizada puede detectar tales efectos através de mostrar cambios en la dispersión deR1.
Las diferencias observadas a bajas frecuencias en el perfil de dispersión de la instanciafinal de la muestra (postextrusión) respecto alos perfiles de dispersión de los pasos previos,se deben a que en este rango de frecuencias losprocesos dinámicos que contribuyen mayoritariamente a la relajación espínred en membranas de liposomas (fluctuaciones de orden y ladifusión translacional de los lípidos [1] [2]) noson eficientes para el caso de vesículas gigantes multilamelares. La baja dispersividad en losperfiles previos a la extrusión podría explicarsecon el hecho de que los procesos que intervienen en la relajación de este tipo de sistemas(vesículas gigantes multilamelares) son demasiado rapidos como para poder ser observadosdentro del rango de freciencias estudiado.
Referencias
[1] Meledandri CJ, Perlo J, Farrher E, Brougham DF, Anoardo E. Interpretation of Molecular Dynamics on Different Time Scales in Unilamellar Vesicles Using FieldCycling NMR Relaxometry. J Phys ChemB. 2009;113:15532–40.
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Caracterización de la preparación de liposomas utilizando Relaxometría Magnética Nuclear
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