Universidad Nacional Autónoma de México

Curso de Genética y Biología Molecular Licenciatura

Química Farmacéutico Biológica (1630) Química en Alimentos (0144) (Optativa)

Facultad de Química

Dra. Herminia Loza Tavera Profesora Titular de Carrera Departamento de Bioquímica

Laboratorio 105, Edificio E 5622-5280

hlozat@unam.mx

IV. METABOLISMO DEL DNA

•  Objetivo general –  El alumno revisará los diferentes procesos

metabólicos en los que el DNA es la molécula central, i.e. la replicación, la reparación y la recombinación. Describirá la enzimología de los diferentes procesos y destacará la importancia de la fidelidad de la replicación y de la necesidad de conservar la estructura y función del DNA

IV. METABOLISMO DEL DNA

El alumno... Conoci-miento

Compren-sión

Aplica-ción

3. Reparación del DNA 3.1. Describirá los daños que causan agentes químicos y físicos al DNA. X

3.2. Comprenderá los mecanismos que conducen a una mutación cuando el DNA dañado no es reparado. X

3.3. Describirá los principales mecanismos de reparación del DNA (fotoreactivación, reparación por escisión de bases, reparación por escisión de nucleótidos).

X

3.4. Reconocerá la importancia de la síntesis de DNA y de las enzimas replicativas en los procesos de reparación del DNA.

X

3.5. Conocerá la respuesta SOS en bacterias y la función de la reparación sujeta a errores. X

3.6. Distinguirá los mecanismos generales de reparación (reparación global del genoma y reparación acoplada a transcripción) en eucariontes.

X

3.7. Conocerá algunas enfermedades asociadas a defectos en los sistemas de reparación del DNA. X

Obje%vospar%culares

Metabolismo celular

Exposición Luz UV

Radiación ionizante

Exposición Química

Errores en replicación

Activación Punto de control Ciclo

celular

Activación Programa

transcripcional

Reparación de DNA: ü  Reversión directa ü  Excisión de base ü  Excisión de nucleótido ü  Reparación de error ü  Reparación por Recombinación homóloga

Apoptosis

El DNA puede ser dañado de muchas maneras, pero este daño solamente conduce a una mutación cuando NO es reparado.

•  Daño: cambios químicos en el DNA •  Mutación: cambios en la secuencia de bases del DNA

Reparación del DNA

FRECUENCIA DE MUTACIONES Mutaciones espontáneas (105 – 108) Mutaciones inducidas (por mutágenos), más frecuentes

TIPOS DE MUTACIONES

Genetics home reference http://ghr.nlm.nih.gov/

(cambio de sentido)

Genetics home reference http://ghr.nlm.nih.gov/

(sin sentido)

Genetics home reference http://ghr.nlm.nih.gov/

Genetics home reference http://ghr.nlm.nih.gov/

Genetics home reference http://ghr.nlm.nih.gov/

(fuera de fase)

Tipos de mutaciones de pares de bases

Sustituciones de pares de bases • transición: pirimidina por pirimidina o purina por purina • transversión: pirimidina por purina o purina por pirimidina

CATGCACCTGTACCA GTACGTGGACATGGT

CATCCACCTGTACCA GTAGGTGGACATGGT

Transición (T-A por C-G) Transversión (T-A por G-C)

CATTCACCTGTACCA GTAAGTGGACATGGT

Secuencia silvestre

Repercusión a nivel de proteína v  Mutación sinónima

v  Mutación de error

v  Mutación sin sentido

v  Mutación de marco

Conservativa No conservativa

Daño al DNA causados por Rayos X y rayos gamma

Ionizan moléculas que rodean al DNA generando radicales libres, algunos de estos contienen oxígeno que tienen un electrón desapareado. Son especies altamente reactivas y pueden atacar la molécula del DNA causando rupturas en una o en las dos cadenas.

También pueden modificar quimicamente una base, como la guanina.

Generación de 8-oxo-guanina. Causa transversiones: GC -> TA

Daño al DNA causado por luz UV

Entrecruzamiento covalente de pirimidinas adyacentes en la misma cadena de DNA. Generalmente son timinas. Formación de dímeros de timina.

Dímeros de timina

Exposición a radiaciones ultravioleta

Alteraciones espontáneas en el DNA

Depurinación y desaminación de bases

100 al día

5000 al día

Desaminación por ácido nitroso

Desaminación de citosina genera uracilo

Desaminación de 5-metil citosina genera timina

Desaminaciones

Depurinaciones

Introduction to Genetic Analysis Anthony Griffiths, VIII Ed.

Etil Metano Sulfonato: Mutágeno Agente alquilante Transición de base

Mutágenos

Alquilación

Metilación o acetilación de las bases en los átomos (O/N) que participan en la formación de puentes de H, desestabiliza la doble hélice de DNA y hace esa zona susceptible a mutación.

La presencia de estas regiones dañadas puede causar detención de la replicación, o si ésta continúa, está sujeta a errores.

Cuando los daños no son reparados, se pueden generar cambios en las secuencia de las bases

durante la replicación, produciendo una mutación.

Corrección directa del DNA dañado

Eliminación de la región dañada del DNA y relleno con DNA recién sintetizado.

REPARACIÓN

MECANISMOS DE REPARACIÓN 1. Fotoreactivación: ruptura de dímeros de pirimidinas por acción de

una fotoliasa (phr) activada mediante luz visible. 2. Reparación por Escisión de bases (BER): DNA glicosilasa (fpg) reconoce el nt dañado,

intervienen exo III (xth), endo IV (nfo), de nucleótidos (NER): necesita la otra hebra como molde (hasta 30

bp), intervienen las endonucleasas uvrA,B,C y la helicasa uvrD 3. Reparación post- replicativa Reparación de apareamiento erróneo de bases (“mismatch”): una

metilasa reconoce DNA recientemente replicado (dam) e intervienen las proteínas “mut” (helicasas, etc)

Reparación por recombinación

Reparación directa de daños al DNA Fotorreactivación

Sistema de reparación que se activa en presencia de luz.

Fotoliasa. Detecta al DNA dañado y se une a éste. La enzima absorbe luz azul y se activa. Rompe los enlaces covalentes entre los dímeros de timina.

La enzima se disocia y se separa del DNA.

Reacción dependiente de FADH

Acción de la fotoliasa (fotoreactivación)

Reversión directa dímeros de pirimidinas Solo se activa por luz visible

Reparación de DNA por Escisión Implica la remoción del DNA dañado incluyendo algunas secuencias adyacentes.

BER: “Base excision repair”

NER: “Nucleotide excision repair”

Reparación de DNA por Escisión de Bases (BER)

Cuando una base dañada en el DNA es reconocida, una glicosilasa actúa y rompe el enlace N-glicosídico entre la base y el azúcar. Esto deja un sitio AP (apurínico/ apirimidínico). Una endonucleasa AP reconoce este “hueco” e hidroliza los enlaces fosfodiéster adyacentes.

La DNA pol I repara degradando el DNA (5’->3’) y sintetiza DNA nuevo.

DNA ligasa sella el último enlace.

Las DNA glicosilasas reconocen bases dañadas

Reparación por escisión de base BER

Reparación de DNA por Escisión de Nucleótidos (NER)

Escinucleasa uvrABC realiza este tipo de reparación en dímeros de timina, otros fotoproductos y bases dañadas.

Escinucleasa (246 kDa) está compuesta por tres subunidades (A, B y C)

UvrA se une al DNA en la región dañada.

UvrB/UvrC tienen actividad de endonucleasa y corta en los lados adyacentes de la cadena liberando un oligonucleótido de unos 12-13 nts de largo. La región “vacía” es rellenada por una DNA polimerasa I y sellada por una DNA ligasa.

Reparación por escisión de nucleótidos

uvrABC: exinucleasa

NER

uvrD: helicasa

BER NER

¿Cómo se identifica a la cadena molde

cuando se repara un error?

MutS MutL

MutH

MutH corta la cadena NO metilada

Reparación por escisión de nucleótidos

Reparación por escisión de nucleótidos o Mismatch repair

(NER) “Mismatch Repair” A pesar de la alta fidelidad que exhiben las DNA polimerasas y de su actividad correctora, pueden cometer errores, dejando las dos cadenas desapareadas.

¿Cómo distingue el sistema de reparación cuál de las dos cadenas debe reparar? Las cadenas parentales están metiladas (-GATC-). Sistema de reparación MUTATOR: Identificación del sitio de desapareamiento y unión al DNA. Corte de la cadena de DNA no metilada. Eliminación del DNA de cadena sencilla. DNA pol III rellena el “hueco”

DNA ligasa sella el último enlace.

Mecanismos de reparación post-replicativa

La respuesta SOS en E. coli

En células sin daño en el DNA, LexA reprime la síntesis de LexA, recA, uvrABC y de otras proteínas involucradas en la respuesta SOS.

LexA es una proteína de 22 kDa que se une a las regiones operadoras.

La respuesta SOS en E. coli

Cuando hay daño en el DNA, se activa RecA al unirse al DNA de cadena sencilla y estimular la auto-proteólisis de LexA en un enlace Ala-Gly.

Ocurre transcripción de los genes de las proteínas encargadas de la reparación del DNA.

Algunos de los mecanismos de reparación regulados por SOS son susceptibles a errores (“error prone”).

Genes y proteínas que participan en la Respuesta SOS Nombre del gen Proteína o función en la reparación de DNA

Genes de función conocida

polB (dinA) uvrA uvrB umuC umuD sulA recA dinB

Subunidad polimerasa de la DNApol II requerida para comenzar la replicación durante la reparación del DNA en recombinación Subunidades UvrA y UvrB en ABC de la excinucleasa DNA pol V Proteína que inhibe la división celular para dar tiempo a reparación del DNA Proteína RecA requerida para la reparación en recombinación DNA pol IV

Genes involucrados en metabolismo de DNA pero de función desconocida en reparación

ssb uvrD himA recN

Proteína SSB DNA helicasa II Recombinación sitio específica, replicación, transposición, regulación de la expresión Reparación en recombinación

•  Cuando se expone E. coli a altos niveles de radiación o a un mutágeno, ocurre un daño extensivo en el DNA. La célula responde induciendo la vía SOS de reparación. •  Se activan los genes umuC y umuD cuyos productos componen las subunidades de la DNA polimerasa V. •  DNA PolV replica el DNA, aún en regiones donde hay daño y es muy propensa a cometer errores. •  Se observa una alta tasa de mutación

•  Cepas de E. coli nulas en umuC son inmutables.

Reparación sujeta a errores

Reparación de DNA por Recombinación

+

+

I. Durante la replicación, se brinca la región frente al dímero.

II. Ocurre intercambio entre las cadenas y recombinación

III. Se completa la síntesis de la cadena que sufrió intercambio. El dímero se quedó sin reparar.

Reparación por escisión de nucleótidos en eucariontes

1. Reparación global de genoma. El heterodímero XPC-hHR23B localiza lesiones que distorsionan a la doble hélice de DNA.

2. Reparación acoplada a la transcripción. La RNA polimerasa identifica el daño en el DNA. Se detiene la transcripción.

Reparación por escisión de nucleótidos en eucariontes Una vez que se ha reconocido el daño, participan las

mismas proteínas en la reparación. •  TFIIH (XPB + XPD) que tiene actividad de helicasa es reclutado.

•  XPA y RPA contribuyen a mantener abierta la doble hélice de DNA.

•  XPA guía a las endonucleasas para realizar el corte del DNA.

•  Endonucleasa XPG corta el DNA en el lado 3’.

•  El complejo ERCC1-XPF corta del lado 5’ de la cadena dañada.

•  El oligonucleótido (24-32nts) con la región dañada es liberado.

•  El hueco es rellenado por la DNA polimerasa δ o ε.

Enfermedades humanas asociadas con defectos en la replicación o reparación del DNA

Asociadas con una alta frecuencia de mutaciones en cromosomas y genes. Algunas se asocian a una alta predisposición a tumores. •  Xeroderma pigmentosum

• Mutaciones en genes involucrados en reparación por escición de nucleótidos. Melanoma

•  Ataxia telangiectasia •  Mutaciones en genes que detectan daño al DNA. •  Riesgo incrementado a rayos X.

• Anemia de Fanconi •  Mutación en gene involucrado en reparación al DNA.

• Síndrome de Bloom •  Mutación en una helicasa de DNA. •  Hipersusceptibilidad a rayos X y a la luz solar.

• Síndrome de Cockayne (CSA/CSB) •  Defecto en reparación acoplada a transcripción. •  Susceptibilidad a luz solar.

•  Síndrome de Werner •  Mutación en un gen de DNA helicasa. •  Envejecimiento prematuro.