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“Evaluación de la protoxina Cry1Ac coadministrada con Ovoalbúmina (OVA) por vía intragastrica en ratones BALB/c en un modelo de alergia”. T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE B I O L O G O PRESENTA Roberto Raúl Servin Garrido DIRECTORA DE TESIS DRA. Leticia Moreno Fierros Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Estudios Superiores Iztacala
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“Evaluación de la protoxina Cry1Ac
coadministrada con Ovoalbúmina (OVA) por
vía intragastrica en ratones BALB/c en un
modelo de alergia”.
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
B I O L O G O
PRESENTA
Roberto Raúl Servin Garrido
DIRECTORA DE TESIS
DRA. Leticia Moreno Fierros
LOS REYES IZTACALA TLALNEPANTLA, EDO DE MEX. 2012
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
B I O L O G O
PRESENTA
Alfredo Meneses Aguirre
Universidad Nacional Autónoma de
México
Facultad de Estudios Superiores Iztacala
I
DEDICATORIA
Esta tesis se la quiero dedicar principalmente a mi papá (Raúl) y a mi mamá
(María), quienes me dieron la vida y lo han dado todo por mi y mis hermanas,
me han apoyado incondicionalmente; gracias por guiarme por un camino de
rectitud y por enseñarme que es lo mejor para mi, gracias por hacer de mi el
hombre que soy hoy, los AMO.
Tambien quiero dedicarle este trabajo a mis hermanas, Tania y Monica, con
quienes he pasado momentos muy felices, son como mi fuente de alegria,
quiero que vean este logro como un ejemplo y logren igualmente una carrera
profesional. Las AMO.
II
AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer principalmente a mi tutora la Doctora Leticia Moreno por
darme la confianza de trabajar con ella, le agradezco por todo su apoyo
durante la realizacion de esta tesis, tambien le agradezco por todo lo que me
ha enseñado en mi formación como profesional.
Agradezco a la Doctora Ana Lilia, quien me apoyo durante toda la tesis, quien
ademas es una muy buena amiga. Tambien le doy a gracias a mis
compañeros de laboratorio Karla, Damaris, Nestor, Chavita, Marilu, la dra.
Marisa, Saul, Scarlette, con quienes es muy divertido trabajar y convivir día a
día en el laboratorio.
Obviamente tambien tengo que agradecer a todos mis compañeros de la
carrera, con quienes he pasado momentod inolvidables, gracias a Betito,
Jonas, Karen, Franklin, Sarita, Oscar, Karla, Aldo, Luis Angel, Tania, Neto,
Uriel, Nancy, Laurita, Angelica, Brenda, Itzel y Erick, espero que no se me
haya olvidado alguien, gracias a todos por su amistad y su apoyo.
Nuevamente quiero agradecer a mis papas y a mis hermanas por apoyarme
los quiero.
III
ÍNDICE
LISTA DE ABREVIATURA ........................................................................................... 5
RESUMEN .................................................................................................................... 8
Sistema inmune intestinal ......................................................................................... 9 Respuestas de tipo Th1/Th2 .................................................................................. 11 Alergia por alimentos ............................................................................................... 13
Antecedentes ............................................................................................................ 17
JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................ 19
HIPÓTESIS ................................................................................................................ 19
OBJETIVO GENERAL ............................................................................................... 19
OBJETIVOS PARTICULARES ............................................................................. 19
MATERIAL Y METODOS ........................................................................................... 20
Esquema de inmunización ..................................................................................... 20
Obtención de células de bazo, placas de Peyer y ganglio mesentérico......... 22
Obtención de lavados intestinales y células intraepiteliales de la mucosa intestinal .................................................................................................................... 22
Obtención de células de lámina propia de la mucosa intestinal ...................... 23
Obtención de células mononucleares .................................................................. 23
Tinción de linfocitos, y células mononucleares ................................................... 24
Detección de citocinas en suero ........................................................................... 24
Detección de anticuerpos específicos en suero (IgG1, IgG2a, IgM, IgA e IgE) .................................................................................................................................... 25
Detección de anticuerpos específicos en lavados intestinales (IgG1, IgG2a, IgM, IgA e IgE) ......................................................................................................... 26
Obtención y purificación de protoxina PCry1Ac ................................................. 26
ANÁLISIS ESTADÍSTICO .......................................................................................... 27
RESULTADOS ........................................................................................................... 28
IV
La administracion de CT/OVA 50 μg, CT/OVA 5 mg y PCry/OVA inducen una
población atípica de celulas CD3+/CD19+. ......................................................... 28
La inmunizacion con PCry/OVA y CT/OVA no modifica las proporcion de linfocitos T y B en compartimientos intestinales. ................................................ 29
La población de células T CD4+ se incrementó en el grupo de CT/OVA 50 µg en ganglio mesentérico ........................................................................................... 31
El tratamiento de CT/OVA 5 mg incrementó la población de granulocitos (Gr1+) en ganglio mesentérico. ............................................................................. 32
La coadministracion de PCry/OVA y CT/OVA incrementó la población de células B220+/IgE+en compartimientos del intestino ........................................ 34
Respuesta de anticuerpos anti-OVA de las subclases IgG1, IgG2a, IgM, IgA, IgE en suero de ratones inmunizados. ................................................................. 36
Respuesta de anticuerpos anti-PCry de las subclases IgG1, IgG2a, IgM, IgA, IgE en suero. ............................................................................................................ 38
Respuesta de anticuerpos anti-OVA y anti-PCry de las subclases IgG1, IgG2a, IgM, IgA, IgE en lavados de intestino delgado en ratones BALB/c .... 41
Respuesta de anticuerpos anti-OVA y anti-PCry de las subclases IgG1, IgG2a y los isotipos IgM, IgA, IgE en lavados de intestino grueso en ratones BALB/c ....................................................................................................................... 44
La inmunización por vía intra-gastrica de CT/OVA induce un perfil de citocinas Th1/Th2 ..................................................................................................... 47
DISCUSION ................................................................................................................ 49
CONCLUSION ............................................................................................................ 53
REFERENCIAS .......................................................................................................... 55
APENDICE I ............................................................................................................... 60
APENDICE II .............................................................................................................. 63
5
Lista de abreviatura
ABTS 2,2`-Azino-bis-(3-Ethylbenzthiazoline-6-Sulfonic Acid)
Ag. Antígeno
Al(OH)3 Hidróxido de alumínio.
APC´s Células presentadoras de antígeno
Bt Bacillus thuringiensis
CT Toxina de cólera.
DC´S Células dendríticas.
DTT Ditiotreitol. Del ingles dithiothreitol E. coli Escherichia coli EDTA Ácido etilendiaminotetraacético. ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FITC Isotiocianato de fluoresceína.
GALT Tejido linfoide asociado al intestino. GM Ganglio mesentérico.
ID Intestino delgado IEC´S Células epiteliales de intestino IEL Células intraepiteliales
IG Intestino grueso IgG1 Subclase de Inmunoglobulina G. IgG2a Subclase de Inmunoglobulina G. i.g. Intra-gástrica IgA Inmunoglobulina A.
IgE Inmunoglobulina E.
6
IL Interleucina LP Lámina propia. LPS Lipopolisacárido
IgM Inmunoglobulina M
INF- Interferón gamma i.n. Intranasal i.p. Intraperitoneal
mAb Anticuerpos monoclonales. MALT Sistema inmune de las mucosas NaCl Cloruro de sodio
MLN Nudo linfoide mesentérico OVA Ovoalbúmina PAF Factor activador de plaquetas
PBA Amortiguador de fosfatos con azida de sodio. PBS Amortiguador de fosfatos en solución salina. PBS-Tween Amortiguador de fosfatos en solución salina-Tween 20. PE Extracto de proteína de cacahuate. PHMB Inhibidor de proteasas p- hidroxibenzoato de mercurio PP Placas de Peyer.
r Rectal
Rpm Revoluciones por minuto. RPMI Medio Roswell Park Memorial Institute. SBF Suero bovino fetal. SEB Enterotoxina B de Staphylococcus aureus.
SED Domo subepitelial.
7
SNB Suero neonatal bovino.
PCry1Ac Protoxina Cry1Ac.
TGF-β Factor de crecimiento transformante beta.
TNF-α Factor de necrosis tumoral alfa. v Vaginal
8
RESUMEN
La protoxina Cry1Ac de Bacillus thuringiensis es altamente inmunogénica, es capaz de producir
una respuesta de anticuerpos específicos en suero y en secreciones de mucosas. PCry1Ac
tiene actividad adyuvante a nivel sistemico y de mucosas, ya que favorece una alta respuesta
de anticuerpos especificos de antígenos (Ags) con el que es coadministrado. La protoxina
Cry1Ac parece ser un buen candidato para el diseño de vacunas; pero debido a que su
inmunogenicidad y efecto adyuvante son similares a las observadas con la Toxina de colera
(CT), la cual es conocida como un potente adyuvante de mucosas. El uso de la CT se limita a
modelos experimentales porque se sabe que tiene efectos tóxicos y alergénicos. Por lo tanto,
nos propusimos evaluar si la coadministracion de la protoxina Cry1Ac con Ovoalbúmina (OVA)
por vía intragastrica desarrolla respuestas alérgicas a nivel intestinal. Se estandarizó un modelo
murino de alergia intestinal hacia OVA, en el que la sensibilizacion de logró mediante la
coadministracion intragastrica (ig) de CT con OVA. Y con este modelo se evaluó si la
coadministracion de PCry con OVA induce cambios similares a CT/OVA (control positivo de
alergia) o si los efectos son comparables al grupo control PBS. El análisis mediante citometría
de flujo de la proporción de linfocitos T y B mostró de manera interesante una población atípica
(CD3+/CD19+) en bazo (B), ganglio mesentérico (GM) y placas de Peyer (PP) en los grupos
inmunizados con CT/OVA y PCry/OVA. Esta población no había sido descrita en modelos de
alergia anteriores. La coadministracion de PCry/OVA incrementó la proporción de linfocitos B
que expresan IgE+ en B, GM y PP, este efecto fue similar al observado en el grupo CT/OVA.
Tambien se observó un ligero incremento con respecto al control PBS en la proporción de
granulocitos (eosinófilos y neutrófilos) en B, GM y PP en el grupo PCry/OVA, similar al
observado en el grupo CT/OVA. Al evaluar la respuesta específica anti-OVA en suero, se
observó al grupo CT/OVA con altos títulos de IgG1 y niveles significativos de IgE, IgA, IgG2a e
IgM con respecto al control PBS. Mientras que en el grupo PCry/OVA no se observó una
respuesta significativa de anticuerpos. Finalmente al analizar las respuestas de citocinas Th1
(INF-γ) Th2 (IL-4 e IL-13) en suero, se observó una respuesta tipo Th1/Th2 en el grupo positivo
de alergia (CT/OVA), mientras que el grupo PCry/OVA mostró una respuesta de tipo Th1
similar a la observada en el grupo de OVA y al grupo control PBS. En conjunto estos resultados
indican una polarización de una respuesta Th2 en el grupo CT/OVA, mientras que la
administración intra-gástrica de PCry/OVA parece desarrollar una respuesta mixta Th1/Th2. Por
lo tanto no podemos afirmar con seguridad si la coadministracion de PCry/OVA desarrolla
respuestas alergicas a nivel intestinal, ya que en algunos parametros la respuesta es parecida
al grupo control positivo (CT/OVA) y en otros al grupo control negativo (PBS).
9
INTRODUCCIÓN
Sistema inmune intestinal
El sistema inmune de mucosas (MALT del inglés Mucosa-Associated Lymphoid
Tissues) es la primera línea de defensa física e inmunológica contra patógenos
invasivos. A través de la respuesta innata y adquirida, el MALT mantiene la
homeostasis a lo largo de una extensa área de superficies epiteliales, que van desde
la cavidad oral, nasal, respiratoria, tracto genitourinario y la cavidad gastrointestinal
(Fukiyono y Fukuyana, 2004).
El sistema inmune intestinal es la parte más grande y compleja del sistema inmune, no
solamente porque en él se encuentra una gran cantidad de antígenos (Ag), mas que
en cualquier otra parte del cuerpo, sino porque se encarga de discriminar entre
organismos patógenos y Ag propios, así como proteínas de la dieta y bacterias
comensales (Mowat A, 2003).
El tejido linfoide asociado a intestino (GALT del inglés Gut-Associated Lymphoid
Tissues) puede dividirse en tejido linfoide organizado y tejido linfoide difuso. El tejido
linfoide organizado es responsable de la fase inductiva de la respuesta inmune. En
estos sitios hay estructuras llamadas placas de Peyer (PP del inglés Peyer´s Patch)
que son pequeños agregados linfoides, que se encuentran distribuidos a lo largo de la
pared del intestino delgado (ID) y en el ganglio linfoide mesentérico (GM). Mientras
que en el tejido linfoide difuso se encuentran los sitios efectores, los cuales consisten
en linfocitos dispersos a través de las células epiteliales del intestino (IEL del inglés
Intra-epithelial Lymphocyte) y la lámina propia (LP) de la mucosa (Mowat A., 2003)
(Fig.1.1).
Las PP son estructuras linfoides organizadas que se encuentran distribuidas en el ID.
Las PP están formadas de centros germinales constituidos por linfocitos B. Estos
centros germinales se encuentran rodeados de linfocitos. Los linfocitos B están
comprometidos a la producción de IgA. Al recibir la apropiada señal, los linfocitos B
migran al nódulo linfático mesentérico (MLN del inglés Mesenteric Lymph Node),
donde maduran a precursoras de células plasmáticas y posteriormente migran hacia la
LP, donde son diferenciados y secretan IgA. Las PP tienen células epiteliales
especializadas en la captación de antígenos (Ags), referidas como células M. El
antígeno a su vez es entregado en la región del domo subepitelial (SED del inglés
Subepithelial Dome) de la PP, estas regiones se encuentran enriquecidas de células
10
dendríticas (DC del inglés Dendritic Cells), que se encargan de captar el Ag y
presentarlo a linfocitos T o linfocitos B para iniciar una respuesta inmune (Chehade M.,
2004).
Fig. 1.1 Representación esquemática de los elementos linfoides del sistema inmune intestinal. El tejido organizado de
las placas de Peyer (PP)(1) y los nódulos linfoides mesentéricos (MLN´s)(2) están implicados en la inducción de la
inmunidad, mientras que los sitios efectores están dispersos en el epitelio (3) y la lamina propia (LP)(4) de la mucosa.
Tanto PP como LP están drenados por vasos linfáticos aferentes que se dirigen hacia los MLN´s. (modificado de
Mowat 2003).
El MLN es el nódulo linfático más grande del cuerpo, su desarrollo es muy diferente al
de las PP y a los nódulos linfoides periféricos, el MLN es de vital importancia en el
inicio de la respuesta inmune a Ag del intestino. El MLN se encuentra enriquecido de
linfocitos B vírgenes y de aquí pueden migrar a sitios efectores (Brandtzaeg, 2005 y
Mowat A., 2003).
La LP es de vital importancia en la fase efectora de la respuesta inmune en el
intestino. Se encuentra conformado de tejido conjuntivo, en el cual se encuentran
numerosas células inmunes, entre las que podemos encontrar linfocitos TCD4+,
macrófagos, células T efectoras y de memoria, linfocitos B (principalmente células
plasmáticas secretoras de IgA), DC, etc., y es aquí donde se dá la respuesta inmune
local (Brandtzaeg P., 2002).
11
Las células epiteliales del intestino (IEC del inglés Intraepithelial Cells), no solamente
tienen la función de la absorción y la digestión de los alimentos, además de ser una
barrera física, juegan un papel importante en la homeostasis de las respuestas
inmunes. Las IEC se encuentran entre la frontera de un enorme número de Ag de la
dieta y de bacterias comensales presentes en el lumen intestinal y un sin número de
linfocitos de la mucosa presentes en la lámina propia del intestino (Chehade M., 2004;
Dahan S., 2007).
El sistema inmune intestinal esta continuamente expuesto a un vasto número de
material antigénico, así como la ingestión de más de 100 g de proteína por día en
nuestra dieta (Chehade M., 2004). Al mismo tiempo, la barrera mucosal es muy
delgada y vulnerable a infecciones. Lo que significa que el sistema inmune intestinal
tiene que discriminar entre generar inmunidad contra antígenos patogénicos y
tolerancia contra material inocuo. Como resultado, de una respuesta usual hacia
antígenos inocuos del intestino, se lleva a cabo la inducción de tolerancia inmune a
nivel sistémico y local, también conocido como tolerancia oral. Los efectos de la
tolerancia oral son disminuir la hipersensibilidad, la proliferación de células T y la
producción de citocinas. También se puede suprimir la respuesta de anticuerpos de
tipo IgE y la producción de IgG2a dependiente de células Th1 (Pabst O., 2012). Se
cree que la incapacidad de generar tolerancia a proteínas de la dieta, es el resultado
de procesos de hipersensibilidad o alergia a los alimentos (Meresse B., 2009).
Respuestas de tipo Th1/Th2
Las respuestas de tipo Th1 tienen doble función. La primera es controlar bacterias
capaces de iniciar infecciones intravesiculares en los macrófagos. La segunda función
es estimular la producción de anticuerpos contra patógenos extracelulares induciendo
señales coestimuladoras para linfocitos B indiferenciados, además en las respuestas
Th1 se producen citocinas como INF-γ (Maggi E., 1998).
Las respuestas de tipo Th2 realizan una función similar, inducen la activación de
células B y el cambio a la producción de anticuerpos de la clase IgE, así como la
producción de citocinas como la IL-4 e IL-13, perpetuando la respuesta Th2, la
polarización de respuestas de tipo Th2 están relacionadas a procesos de alérgicos
(Lewis D. B., 2002).
12
Alergia
La alergia es una reacción de hipersensibilidad iniciada por mecanismos
inmunológicos específicos, dando como resultado una reacción inflamatoria
sintomática de hipersensibilidad inmediata a un Ag normalmente inocuo. Estas
enfermedades están mediadas por la producción de IgE específica en respuesta a la
re-exposición a un alérgeno, también son conocidas como reacciones de
hipersensibilidad de tipo I (Madsen C., 2005).
La inducción de la alergia requiere de la participación de varios tipos de células que
funcionan de manera orquestada y que incluyen de manera predominante a las células
presentadoras de antígeno (APC del inglés Antigen Presenting Cells), células Th2,
células B, células cebadas, eosinófilos, entre otras. Los Ags que penetran al
organismo a través de las mucosas son capturados principalmente por DCs, las cuales
procesan y presentan el Ag a células T, en este punto, se induce una respuesta
inmune de tipo Th2 (Snider D.P, 1994). No está claro cómo es que en individuos
atópicos se favorece la diferenciación de células Th2 sobre células Th1 (Jelinek D. F.,
2000).
Las respuestas de tipo Th2 inducen la producción de citocinas, como IL-4, IL-13 e IL-5,
las cuales tienen un papel importante en el recambio de anticuerpos de la subclase
IgE por parte de células plasmáticas. La IgE tiene afinidad a unirse a los receptores
FcεRI de la superficie de las células cebadas, provocando su activación. La activación
de las células cebadas ocurre cuando la IgE unida a los receptores FcεRI interacciona
con el alérgeno homologo. El contacto con el Ag dispara en las células cebadas una
serie de cambios morfológicos y bioquímicos, provocando la degranulación de dichas
células, liberando mediadores entre los que destacan la histamina, triptasa, quimasa,
heparina, TNF-α, TGF-β y algunas citocinas como la IL-4, IL-5 e IL-8. Estos
mediadores reclutan eosinófilos y a la vez perpetúan la respuesta Th2.
A través de la activación de las células cebadas y los mediadores que éstas
producen, se dan procesos inflamatorios, así como procesos de coagulación,
angiogénesis y fibrosis (Shakoory B., 2004, Yamasaki S., 2005).
13
Alergia por alimentos
Mientras que las alergias al polen u otros alérgenos típicamente provocan síntomas en
ciertas épocas del año, la alergia a los alimentos es una condición que no reconoce
estaciones, presentándose en cualquier momento (Zubeldia J. M., 2012).
En los países industrializados, entre el 6 y el 8% de los niños tienen alergia a algún
alimento, mientras que en adultos la prevalencia es alrededor del 3%. La alergia a los
alimentos es catalogada como una reacción adversa y no tóxica a antígenos
alimenticios, estas reacciones pueden o no estar mediadas por la IgE. La alergia
mediada por IgE, es la responsable de la mayoría de las reacciones de
hipersensibilidad (Urrego J. R., 2009).
Relativamente son pocos los alimentos responsables de la mayoría de las reacciones
alérgicas: entre ellos encontramos la leche, el cacahuate, el huevo, el pescado y
algunos mariscos (Sicherer S. H., 2006).
El tracto gastrointestinal se encuentra en contacto con abundantes cantidades de Ag´s
a los que tiene que “tolerar” como nutrientes, frente a los que no tiene que evocar
respuesta alguna (Bozzola C., 2003). La tolerancia, hace referencia a la inhibición
activa de la respuesta inmune a nivel sistémico y local, ante la exposición de un Ag
específico a través de la ruta oral (Chehade M., 2004). Una falla en el desarrollo de
tolerancia o una interrupción en sus mecanismos, resulta en una excesiva producción
de anticuerpos IgE específicos contra estos alérgenos. Los mastocitos están presentes
en el tracto gastrointestinal; cuando los alérgenos alimentarios penetran las barreras
mucosas, y alcanzan los anticuerpos IgE unidos a los mastocitos, se liberan
mediadores químicos, induciendo una reacción de hipersensibilidad manifestada por
una gran variedad de síntomas que van desde gastrointestinales como nauseas,
vómito, dolor abdominal y diarrea, cutáneos (urticaria, angiodema y eczema) y
sistémicos como la anafilaxis (Bailey M., 20003, Bjorksten B., 2005).
Se conoce poco sobre los procesos celulares y moleculares de la patología en la
alergia por alimentos, por este motivo es de vital importancia desarrollar modelos que
permitan estudiar los mecanismos de esta patología y proponer tratamientos
potenciales. Algunos modelos experimentales en animales, que han sido propuestos
para evaluar la alergenicidad de proteínas de la dieta, tienen algunas limitaciones, en
cuanto a las rutas de sensibilización y el análisis de la respuesta inmune a la cual se
recurre, lo que limita el potencial de dichos modelos.
14
Modelos de alergia en ratón
Los modelos en ratón para evaluar la alergenicidad de proteínas son favorables, ya
que poseen ciertas ventajas comparadas con otras especies, además de que su
inmunología esta bien caracterizada y comparten con los humanos muchos
mecanismos inmunológicos importantes, como las respuestas de tipo Th1, Th2, Th17
y respuestas reguladoras (Aldemir H., 2003 y Mosmann T. R., 1986).
La mayoría de los estudios han sido realizados en ratones BALB/c, los cuales tienen
respuestas Th2 basadas en altas respuestas de IgE, simulando lo sucedido con
individuos atópicos (Hsieh C. S., 1995). Un mejor entendimiento de los mecanismos
que llevan a la alergia y a la tolerancia oral nos ayudaría aclarar recomendaciones de
prevención y ayudarnos a establecer tratamientos, los cuales en la actualidad se
limitan solamente a evitar el alérgeno.
En la actualidad existen dos tipos de modelos los cuales se utilizan para estudiar los
procesos alérgicos. El primero, consiste en la sensibilización sistémica de los ratones
con el alérgeno y un adyuvante (Hidroxido de Aluminio AL(OH)3, adyuvante completo
de Freud), seguido de repetidos retos por vía oral, el cual induce anafilaxis intestinal
(Brandt E. B., 2003 y Kweon M. N., 2000). La segunda alternativa consiste en la
sensibilización a base de repetidas administraciones del alérgeno con toxina de cólera
(CT) por vía intra-gastrica, seguido de un solo reto por vía intra-gástrica, el cual induce
anafilaxis sistémica. Los alergenos mayormente utilizados en estos modelos son la
Ovoalbúmina (OVA), proteínas del cacahuate y proteínas de la leche (Li X. M., 1999, Li
X. M., 2000).
En algunos modelos la sensibilización, se basa en administrar dosis repetidas de OVA
sola y son comparadas con un grupo de OVA/AL(OH)3 ,ambos grupos por vía intra-
peritoneal, mientras que el reto es por vía intra-gástrica (Knippels L. M., 1999 y
Dearman R. J., 2007). Otros modelos utilizan la vía intra-gástrica para la
sensibilización y el reto, pero se limitan a analizar las respuestas a nivel sistémico,
dejando de lado la respuesta en la mucosa intestinal (Dearman R. J., 2001 y Adele-
Patient, 2011). Sin embargo estos modelos que se utilizan para estudiar los
mecanismos de alergia son artificiales debido a que no reflejan la patogenicidad real
en la alergia a los alimentos.
En la mayoría de estos modelos evalúan la producción de IgE específica contra el
antígeno al cual sensibilizaron y la producción de citocinas en suero o en agregados
linfoides, además de caracterizar las reacciones de hipersensibilidad.
15
Otra característica de los modelos en la que se sensibiliza por via oral, es la utilización
de CT como adyuvante, ya que se caracteriza por romper la tolerancia cuando es
coadministrado con algún antígeno, además de polarizar una respuesta tipo Th2 y la
producción de anticuerpos IgE específicos del antígeno administrado; y cuando los
ratones son retados por vía oral, se presentan reacciones de anafilaxis sistémica,
caracterizada por liberación de histamina y una baja en la temperatura corporal. (Berin
M. C. y Mayer L., 2008).
Por lo tanto nosotros nos propusimos establecer un modelo de alergia intestinal hacia
OVA que nos permita evaluar los procesos alérgicos, acercándonos mas a la
patogenicidad en la alergia a los alimentos, realizando las sensibilizaciones del
alérgeno mas CT como adyuvante por vía intra-gástrica al igual que el reto. Evaluando
detalladamente los procesos alérgicos tanto a nivel local, caracterizando las población
de células implicadas en la alergia (eosinófilos, neutrófilos, linfocitos B/IgE+), así como
a nivel sistémico evaluando la respuesta de anticuerpos específicos y la producción de
citocinas.
Para la estandarización de nuestro modelo de alergia, nos basamos en dos trabajos,
Perrier et al. utilizó un modelo de alergia intestinal hacia OVA que consistía en una
inmunización semanal durante siete semanas, sin embargo nosotros usamos dosis
màs bajas de OVA tanto para las sensibilización como para el reto porque
consideramos que las usadas, en el modelo de Perrier y col. eran demasiado
evevadas, ya que la sensibilización consistía en administrar dosis de 20 mg OVA/ 10
μg de CT y un reto de 100 mg de OVA ambas por vía intra-gástrica. Perrier y col.
evaluaron la respuesta de anticuerpos específicos en suero y heces fecales, así como
la producción de citocinas en suero. (Perrier et al., 2010).
Por esto en cuanto a la dosis empleada nos basamos en el modelo de Ganeshan K.,
quien propone un modelo de alergia intestinal hacia OVA utilizando CT como
adyuvante, las sensibilizaciones consistían en inmunizaciones semanales durante 9
semanas con dosis de 100 μg de OVA/10 mg de CT y un reto de 5 mg de OVA ambas
por vía intra-gástrica, en el que evaluaron la presencia de eosinófilos en cortes
histológicos de intestino y los niveles de histamina en suero (Ganeshan K., 2009).
16
Adyuvantes mucosales
Debido a que la administración de un antígeno típicamente llevan a la tolerancia y en
muy raras ocasiones llevan a la sensibilización, los modelos murinos de alergia a los
alimentos emplean la toxina de cólera (CT) producida por Vibrio cholerae, como un
adyuvante, se caracteriza por romper la tolerancia y puede inducir sensibilización
hacia algunas proteínas como proteínas del cacahuate, leche y OVA (Adele-Patiente.,
2005, Snider D., 1994, Li X. M., 2000).
La exposición de un antígeno junto con la CT resulta en el incremento de anticuerpos
específicos IgE, producción de citocinas de tipo Th2 y reacciones de anafilaxis a nivel
local y sistémico (Adele Patient K., 2005).
La mayoría de los adyuvantes actúan principalmente en la respuesta innata en el cual
provocan la maduración y mejora la migración de las APC desde la LP hasta a los
MLN donde procesan y presentan el Ag a linfocitos T (Anjuere F. et al., 2004). La
administración de CT con un antígeno induce la producción de citocinas Th2 (Blazquez
A. B., 2008).
En las placas de Peyer, la CT induce la migración de DCs del domo subepitelial a
zonas de células T, lo cual mejora la presentación del antígeno. (Anosova N. G., 2008
y Shreedhar V. K., 2003). Recientemente se ha observado que además de la
maduración de las DCs, la CT induce la expresión de moléculas coestimuladoras
como OX40L y Jagged2 en DCs de LP que migran hacia los MLN, se sabe que estas
moléculas facilitan las respuestas de tipo Th2 (Blazquez A. B., 2008).
Otras toxinas bacterianas tienen actividad adyuvante cuando son coadministradas con
antígenos. Yang et al. usó la enterotoxina B de Staphylococcus aureus (SEB) para
sensibilizar ratones con OVA. La administración de SEB mas OVA, tiene como
resultado la expresión de TIM-4 en DCs gastrointestinales (Fig 1.2).
Sin embargo, a pesar la potente actividad adyuvante de CT y SEB, la administración
en humanos no es factible debido a su toxicidad y a sus altos costos de producción.
Debido a las características que tienen los adyuvantes en mucosas y la alta
importancia para comprender procesos inmunológicos y para desarrollar nuevas
terapias, se resalta la importancia de estudiar nuevos adyuvantes mucosos, que no
sean tóxicos para humanos, que puedan aplicarse de manera segura por vías
mucosas, que sean estables y tengan bajos costos de producción.
17
La proteína Cry1Ac producida por la bacteria Bacillus thuringiensis, reúnen ciertas
características que las hacen un serio candidato a utilizarse como herramienta
vacunal; ya que presentan alta resistencia a proteólisis, son estables en pH alcalino,
no son tóxicas en vertebrados y sus costos de producción son bajos (Höfte & Whiteley
1989).
Fig. 1.2 Toxina de cólera (CT) de Vibrio cholerae y la enterotoxina B de Staphylococcus aureus (SEB) inducen
respuestas de tipo Th2 en el tracto gastrointestinal cuando son administradas por ruta oral junto con un antígeno. La
administración de adyuvantes induce la expresión de OX40L y TIM-4. Modificado de Berin MC., 2009.
Antecedentes
Las proteínas Cry son producidas por Bacillus thuringiensis (Bt), una bacteria gram
positiva, que durante su fase de esporulación produce un cuerpo paraesporal en forma
de cristal, estas estructuras de naturaleza proteica están formadas de δ-endotoxinas
también conocidas como Cry. Las proteínas son producidas como protoxina que tiene
un peso molecular de 133 KD, al ser procesada proteolíticamente se genera la toxina
con un peso de 65 KD. La proteína Cry1Ac es estable a pH altamente alcalino,
resistente a proteólisis, no es tóxica para vertebrados y sus costos de producción son
bajos (Höfte y Whiteley 1989).
En los últimos años las proteínas Cry de Bt han sido utilizadas como bioinsecticidas
debido a su toxicidad en algunos insectos de los órdenes Lepidóptera, Díptera y
Coleoptera. Su exitoso uso como bioinsecticida ha llevado al desarrollo nuevas
plantas transgénicas, las cuales expresan proteínas Cry, confiriéndole resistencia a las
plantas frente a las plagas (Soberón y Bravo, 2007).
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En reportes previos del laboratorio se ha comprobado que la protoxina Cry1Ac es
altamente inmunogénica y tiene actividad adyuvante, igual de potente que la CT, tanto
a nivel sistémico como de mucosas (Vazquez et al 1999ª, b, Moreno-Fierros et al
2000, 2002,2003).
La inmunogenicidad de la proteína Cry1Ac ha sido evaluada al aplicar la proteína por
ruta intra-nasal (in.), rectal (r), vaginal, intra-peritoneal (ip.) y ruta oral a ratones
BALB/c. Los resultados indicaron que Cry1Ac es capaz de producir una respuesta de
anticuerpos específicos en suero y en secreciones de mucosas vaginal, intestinal y
tracto respiratorio (Vázquez et al. 1999ª, Moreno-Fierros et al. 2000, 2002).
El efecto adyuvante de la proteína Cry1Ac a nivel sistémico y de mucosas se evaluó al
coadministrarla con proteínas y polisacáridos por la vía oral, ip., in. y r. encontrando
una respuesta de anticuerpos hacia el antígeno de superficie de hepatitis B (Vazquez-
Padrón et al 1999ª), péptidos de VIH (Esquivel-Perez y Moreno-Fierros 2005) y
polisacáridos de pneumococos (Moreno-Fierros et al. 2003). También se ha
encontrado que Cry1Ac incrementa la protección ante la infección de Naegleria Fowleri
cuando es coadministrada con lisados amebianos por ruta in. (Rojas-Hernandez,
Rodriguez-Monroy et al. 2007).
El potencial alergénico de la protoxina Cry1Ac por vía in. (Meneses, 2010) se observó
en la coadministración de PCry1Ac con OVA en un modelo murino de alergia hacia
OVA. Cry1Ac parece no potenciar efectos de alergia, ya que los resultados de
citometría de flujo y el análisis inmunohistológico indicaron que en el grupo de
PCry/OVA no hubo incremento de linfocitos B/IgE+, ni de granulocitos/IgE+ en pulmón,
en comparación a los grupos positivos Al(OH)3/OVA y CT/OVA. En dicho trabajo se
confirmó el efecto adyuvante de la protoxina Cry1Ac, al detectarse la incrementada
respuesta de anticuerpos específicos IgG1 e IgG2a. También se observó la producción
de citocinas de tipo Th2, sin embargo fue menor a la observada en los grupos
positivos de alergia Al (OH)3/OVA y CT/OVA. Obteniendo así, que la coadministración
de PCry/OVA por vía in. indujo una respuesta mezclada de tipo Th1/Th2 (Meneses,
2010).
Para definir la utilidad de la protoxina Cry1Ac como adyuvante para mejorar vacunas,
es de vital importancia evaluar el potencial alergénico por vía oral de la protoxina
Cry1Ac, debido a que la inmunogenicidad y el efecto adyuvante de las proteínas
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Cry1Ac a nivel sistémico y de mucosas (Rodríguez-Monroy y Moreno-Fierros, 2010)
son similares al de la CT, que es considerada el más potente inmunógeno y adyuvante
de mucosas; y que se ha descrito que además de sus conocidos efectos tóxicos,
favorece el desarrollo de respuestas alérgicas (Simecka et al., 2000, Wikstrom et al.,
2006).
Por lo tanto en el presente trabajo nos propusimos desarrollar un modelo de alergia
intestinal hacia OVA en ratones BALB/c para evaluar si la coadministración de la
protoxina Cry1Ac con OVA desarrolla respuestas alérgicas en la mucosa intestinal.
JUSTIFICACIÓN
La protoxina Cry1Ac parece ser un buen candidato para mejorar vacunas, pero debido
a que la inmunogenicidad y el efecto adyuvante de la protoxina Cry1Ac son similares
a la observada en la CT, la cual es un potente adyuvante de mucosas, cuyo uso se
limita a modelos experimentales, ya que se sabe que tiene efectos tóxicos y
alergénicos. Por lo tanto, nos propusimos evaluar si la coadministración de la protoxina
Cry1Ac con OVA por vía intra-gástrica desarrolla respuestas alérgicas a nivel
intestinal.
HIPÓTESIS La administración de la protoxina Cry1Ac con OVA por vía intra-gástrica no favorece el
desarrollo de respuestas alérgicas.
OBJETIVO GENERAL Determinar si la coadministración de la protoxina Cry1Ac con OVA favorece el
desarrollo de alergia intestinal.
OBJETIVOS PARTICULARES
Evaluar si la coadministración de la protoxina Cry1Ac induce cambios en la
proporción de granulocitos, linfocitos T, linfocitos B en bazo, tejido linfoide
organizado y difuso del intestino delgado y grueso.
Evaluar si la coadministración de PCry/OVA induce respuestas específicas anti-
OVA y anti-PCry en suero y lavados intestinales de los isotipos IgG1 (Th2),
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IgG2a (Th1), IgA, IgM e IgE en comparación con los grupos positivo (CT/OVA)
y negativos (OVA sola y PBS) de alergia.
Evaluar si la coadministración de PCry/OVA modifica el perfil de citocinas Th1 y
Th2 (IL-4, IL-13, INF-ɣ , IL-10) en suero, en comparación con los grupos
positivos y negativos de alergia.
MATERIAL Y METODOS
Se utilizó un modelo de alergia hacia ovoalbúmina para determinar si la inmunización
intragastrica de OVA con Protoxina Cry1Ac como adyuvante induce respuestas
alérgicas en la mucosa intestinal. Como control positivo se estandarizó un modelo
usando dosis similares al descrito por Ganeshan y col. en 2008 y el esquema de
sensibilizacion, en cuanto a duracion y frecuencia, similar al usado por Perrier y col. en
2010, en estos modelos las sensibilizaciones son semanales administrando OVA con
CT y los retos con OVA sola.
Esquema de inmunización
Se utilizaran ratones hembra BALB/c de 6 a 8 semanas de edad. Proporcionadas por
el bioterio de la FES Iztacala, que cuentan con la aprobación del comité de
bioseguridad de la FES Iztacala. Se formaran 4 grupos experimentales (n=7) y 3
grupos control.
Como controles positivos se administrara durante 7 semanas, una inmunización
semanal de 50 µg de OVA+ 10 µg de CT en 100 µl de PBS, a otro grupo se le
administrara 5 mg de OVA+ 10 µg de CT en 100 µl de PBS, ambos por vía
intragastrica. Mientras que los demás grupos serán inmunizados con 50 µg de OVA
sola o coadministrada con 50 µg PCry1Ac. Posteriormente en la semana 8 los grupos
serán retados con 100 µg de OVA, sacrificados el día 49, 24 horas después de la
última inmunización (Fig. 1.3) Se aislaran células intraepiteliales y de lámina propia de
intestino grueso y delgado, así como células de bazo, ganglio mesentérico y placas de
Peyer, y se analizaran por citometría de flujo las poblaciones de linfocitos y
granulocitos (De Heer, 2004). Obtendremos sueros y lavados intestinales para análisis
de citocinas y anticuerpos.
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Fig. 2.1 Esquema de inmunización vía oral. Se formaron 4 grupos experimentales y 1 grupo control. PBS (100 µl), OVA
(50 µl/100 µl), CT/OVA (10 µg/50 µg/100 µl), CT/OVA (10 µg/5 mg/100 µl), PCry/OVA (50 µg/ 50 µg/100 µl), dichos
grupos fueron sensibilizados 1 vez a la semana, durante 7 semanas. En el día 48 se reto a los ratones con una
concentración mayor de OVA sola, este mismo reto se realizó el día 49, 1 hora antes del sacrificio. Se obtuvieron
células de bazo (B), ganglio mesentérico (GM), placas de Peyer (PP), células intraepiteliales (IEL) y células de lamina
propia (LP) de intestino delgado e intestino grueso. También se obtuvieron sueros y lavados intestinales para detectar
perfil de citocinas (IL-4, IL-13, 1L-10 e INF-ɣ ) y anticuerpos específicos de las subclases IgG1 , IgG2a, IgA, IgM e IgE.
Obtención de suero
Los organismos fueron sacrificados con sobredosis de anestesia. Mediante una incisión
abdominal se descubrió el corazón de la cavidad torácica y con ayuda de una jeringa de
insulina de 25G x 16mm se hizo una punción en el corazón para extraer la sangre del
organismo. La sangre se colocó en tubos eppendorf rotulados y marcados, se centrifugaron
3,000 rpm 10 minutos y posteriormente se recuperó el suero sanguíneo de cada organismo en
tubos eppendorf (este proceso se repite 2 veces para eliminar el coagulo y obtener un mayor
volumen de suero).
Inmunización de
ratones BALB/c de 5 a
6 semanas de edad
Días de inmunización
1 7 14 21 28 35 42 48 49
Reto y
sacrificio
PBS
(control negativo)
OVA
(50 µg/100 µl)
CT/OVA (10 µg/50 µg/100 µl)
PCry/OVA (50 µg/50 µg/100 µl)
Sensibilización (oral)
Reto (oral)
OVA (100 µg/100 µl)
CT/OVA (10 µg/5 mg/100 µl)
Obtención de células de: (B), (GM), (PP), (IEL) y (LP). Las células fueron marcadas con anticuerpos, y analizadas mediante citometría de flujo: CD3+, CD19+, CD4+, CD8+, B220+, Gr1+,
IgE+
Obtención de suero y lavados intestinales. Mediante ELISA análisis de:
IgG1, IgG2a, IgA, IgM, IgE
IL-4, IL-13, IL-10, INF-ɣ
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Obtención de células de bazo, placas de Peyer y ganglio mesentérico
Posteriormente a la incisión, se extrajo tanto bazo e intestinos y colocados en cajas de
Petri con medio RPMI y 200 μl de suero fetal bovino (SFB), con ayudad de una tela de
organza y un embolo de jeringa se disgregó el bazo, y después la suspensión celular
se filtró con tela de organza y recuperó en tubos cónicos de 15 ml. con 200 μl de SFB
(se llevó a 8 ml. de volumen con medio RPMI). Los tubos se centrifugaron a 1500 rpm
a 4 °C durante 10 minutos. Después se decantaron los tubos y la pastilla celular
obtenida se re suspendió en 2 ml. de buffer de lisis para eliminar los eritrocitos y se
dejó a temperatura ambiente durante 7 minutos, después se agregó PBS 1X frío y se
centrifugaron a 1500 rpm 10 minutos a 4 °C, se decantaron los tubos y se re
suspendieron en 3 ml. de RPMI+ 200 µl de SFB para repartir en tubos eppendorf (1
ml./muestra) para la tinción celular.
Para obtener las placas de Peyer con ayuda de un gancho del # 4 se hizo pasar el
intestino delgado a través del gancho y con tijeras quirúrgicas se separaron las placas
del intestino cortando superficialmente, las placas se colocaron en cajas de Petri con 5
ml. de RPMI+ 200 µl de SBF. El ganglio mesentérico fue retirado del intestino con
pinzas y después se colocó en una caja de Petri con 5 ml. de RPMI + 200 µl. Tanto
placas de Peyer como ganglio mesentérico se disgregaron con tela de organza y un
émbolo de jeringa. La suspensión celular se recuperó filtrándola con tela de organza
en tubos cónicos de 15 ml. + 200 µl de SFB (se llevó a 8 ml. de volumen con medio
RPMI), se centrifugaron a 1500 rpm 10 minutos a 4 °C y posteriormente se decantaron
los tubos y la pastillas se re suspendieron en 3 ml. de RPMI + 200 µl de SFB para
repartir en tubos eppendorf (1 ml./muestra) para la tinción celular.
Obtención de lavados intestinales y células intraepiteliales de la mucosa intestinal
Los intestinos fueron tratados por separado, el intestino delgado inicia cortando la
zona distal del estómago hasta el ileon (donde inicia ciego), mientras que el intestino
grueso se obtuvó desde el ciego hasta el recto, fueron colocados en cajas de Petri con
4 ml. de RPMI y 200 μl de SFB. Los intestinos fueron lavados con ayuda de una sonda
con medio RPMI (5 ml. intestino delgado, 3 ml. intestino grueso), y recuperados en
tubos corning con 250 µl. de inhibidor de proteasas (PHMB 100 mM en TRIzma
base 150 mM) para intestino delgado y 200 µl para el intestino grueso. Los tubos se
centrifugaron a 10 000 rpm 10 minutos a 4 °C, y posteriormente el sobrenadante se
recupera en tubos eppendorf marcados.
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Los intestinos se voltearon con ayuda de un gancho (placas de Peyer separadas).
Cada intestino se incubó en 15 ml. de RPMI+EDTA 1.5mM+DTT 1 mM por 30 minutos
a 37 °C a 170 rpm, pasado el tiempo de incubación los intestinos se pasan a cajas
Petri donde se movieron ligeramente para desprender las células, se recuperó la
suspensión celular filtrándola con tela de organza en 2 tubos cónicos de 15 ml. y
agregando 200 μl de suero bovino fetal, los tubos se centrifugaron 10 minutos a 1500
rpm a 4 °C, después la pastilla celular se re suspendió en 2 o 3 ml de medio RPMI
para dividirlos en tubos eppendorf para la tinción celular.
Obtención de células de lámina propia de la mucosa intestinal
Después de la incubación y recuperación de las células intraepiteliales, cada intestino
se incubó en 20 ml. de RPMI+ 60 U/ml. de colágenas por 30 minutos a 37°C a 170
rpm (sin agregar SFB ya que desactiva la actividad de la colágenas), pasado el
tiempo de incubación los intestinos se pasaron a cajas Petri y con ayuda de un émbolo
de jeringa se oprimieron y movieron suavemente. La suspensión celular se recuperó
en 2 tubos cónicos de 15 ml. filtrándola con tela de organza y se agregó 200 μl de SFB
a cada tubo. Se centrifugaron los tubos 10 minutos a 1500 rpm a 4 °C, posteriormente
la pastilla se re suspendió en 2 o 3 ml. de medio RPMI para dividirlos en tubos
eppendorf para la tinción celular.
Obtención de células mononucleares
Para obtener células mononucleares se utilizó un método de separación mediante
gradiente de percoll. Se decantaron los tubos de las células finales recuperadas, tanto
intraepiteliales como de lámina propia. A las pastillas se les agregó 200 µl se SBF y se
les agregó 4 ml. de percoll al 40% y se re suspendieron cuidadosamente con pipetas
Pasteur, después se adicionó a tubos cónicos con 4 ml de percoll al 75%, la
suspensión celular lentamente por la pared del tubo. Los tubos se centrifugaron a 2000
rpm sin aceleración y freno, por 30 minutos a temperatura ambiente. Se extrajo
cuidadosamente con una pipeta Pasteur el anillo celular que queda en la parte media
del tubo (células mononucleares), y se colocaron en tubos cónicos con 8 ml de RPMI +
200 µl de SBF, las células se centrifugaron a 1500 rpm por 10 minutos a 4 °C,
posteriormente se decantaron los tubos y el botón celular se volvió a resuspender con
8 ml. de RPMI + 200 µl de SBF, se centrifugaron las células 1500 rpm por 10 minutos
a 4 °C. Finalmente se decantó el sobrenadante de los tubos y se agregó 3 ml. de
RPMI + 200 µl. se SBF y colocar las células en tubos eppendorf para la tinción celular.
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Tinción de linfocitos, y células mononucleares
Las células contenidas en los tubos eppendorf se centrifugaron a 1500 rpm 5 minutos
a 4 °C, posteriormente de retiró el sobrenadante de los tubos con ayuda de una
micropipeta y se agregó a cada tubo eppendorf 20 µl de CD16/32 para bloquear los
receptores Fc, se resuspendió cuidadosamente cada tubo eppendorf y se incubaron
20 minutos en hielo. Cumplido el tiempo de incubación, se agregó para lavar 1 ml. de
PBA y se centrifugaron las células a 1500 rpm 5 minutos a 4 °C. Se retiró el
sobrenadante cuidadosamente con una micropipeta, y se agregó a las células 25 µl de
solución de los siguientes anticuerpos (1:100): IgE FITC, Gr1 PE, CD11c Cy5, B220
Cy5, CD4 FITC, CD19 PE, CD8 PECy5, CD3 APC, se resuspendieron e incubaron en
hielo durante 30 minutos, pasado este lapso se les agregó 1 ml de PBA para
posteriormente centrifugarlas a 1500 rpm por 5 minutos a 4 °C. Después a las células
se les agregó 300 µl. de paraformaldehído, se resuspendieron con micropipeta y se
pasaron a tubos de citometría, las muestras se almacenaron a 4 °C, las muestras se
analizaron en un citómetro de flujo de 2 laser y 4 detectores de florescencia (BD FACS
CALIBUR).
Detección de citocinas en suero
Los niveles de citocinas en suero (IL-4, IL-13, IL-10, INF-ɣ ) se evaluaron por el
método de Enzyme-Linked Inmunosorbent Assay (ELISA), Preprotech, siguiendo las
instrucciones de manufactura (Murino INF-g ELISA development Kit 900-K98
Lot#0709098,Murino IL-10 ELISA development Kit 900-K53 Lot#0210053, Murino IL-4
ELISA development Kit 900K49 Lot#0708049, Murino IL-13 ELISA development Kit
900K207 Lot#1009207). Las placas de marca Nunc de 96 pozos se recubrieron con
100 µl de anticuerpo de captura a una concentración de 0.5 µg/ml (IL-13), 1 µg/ml (IL-
4, INF-ɣ ) y 2µg/ml (IL-10) en PBS 1x-0.05%Tween20 , y se dejaron incubando 24
horas a 4 °C. Se lavaron las placas 4 veces con PBS 1x-0.05%Tween20 y se
bloquearon con 200 µl de Albúmina sérica bovina (PBA) al 1% en PBS 1x-
0.05%Tween20 y se dejaron incubar por 2 horas a 4 °C. Posteriormente las placas se
lavaron 4 veces con PBS 1x-0.05%Tween20 y se agregaron las muestras de suero
por duplicado a una dilución (1:4) en PBS-Tween+ BSA al 0.1%. En otros pozos, igual
por duplicado, para hacer una curva de concentración de las citocinas a detectar (IL-4,
IL-13, INF-ɣ , IL-10) y se incubaron 24 horas a 4 °C. Después de la incubación, las
placas se lavaron 4 veces con PBS 1x-0.05%Tween20 y se agregó 100 µl del
anticuerpo de detección a cada pozo a una concentración de 0.25 µg/ml (INF-ɣ ), 0.5
µg/ml (IL-13, IL-10) y 1 µg/ml (IL-4) en PBS 1x-0.05%Tween20 + BSA al 0.1% y se
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incubaron por 2 horas a 4 °C. Las placas se lavaron 4 veces con PBS-Tween y se
agregó a cada pozo 100 µl de un conjugado de avidina peroxidasa a una dilución de
1:2000 en PBS 1x-0.05%Tween20 + BSA al 0.1% y se incubaron las placas 1 hora a 4
°C. Después se lavaron las placas 4 veces con PBS 1x-0.05%Tween20 y se revelaron
las placas añadiendo 100 µl del sustrato ABTS 2,2`-Azino-DI-(3-Ethylbenzthiazoline-6-
Sulfonic Acid), y se incubó de 5 – 30 minutos, midiendo la absorbancia a 405 nm en un
lector de microplacas (Termo-Labysistems), la concentración de citocinas de las
muestras se calcularon mediante la interpolación de las lecturas de absorbancia en las
curvas estándar de cada citocina.
Detección de anticuerpos específicos en suero (IgG1, IgG2a, IgM, IgA e IgE)
Para determinar la presencia de inmunoglobulinas específicas contra OVA en suero,
se utilizó el método de ELISA indirecta. Las placas con 96 pozos se recubrieron con
100 µl de OVA y PCry a una concentración de 1 µg/100 µl diluida en buffer de
carbonatos (Na2CO3 1mM + NaHCO3 3mM, pH 9.6) y se incubaron 24 horas a 4 °C,
después las placas se lavaron 4 veces con PBS 1x-0.05%Tween20 v/v , y se agregó a
cada pozo 200 µl de leche al 6% diluida en PBS-Tween20, y se incubaron durante 2
horas a 4 °C. Pasado el tiempo de incubación se lavaron las placas 4 veces con PBS
1x-0.05%Tween20 v/v , se recubrieron cada uno de los pozos con 100 µl de PBS 1x-
0.05%Tween20 v/v. Se colocaron diluciones seriadas de los sueros en PBS-Tween20,
comenzando en 1:100 (IgG2a, IgA, IgM, IgEe) y 1:500 (IgG1) y se incubaron por 24
horas a 4 °C. Posteriormente las placas se lavaron 4 veces con PBS 1x-
0.05%Tween20 v/v y se agregaron 100 µl de anticuerpos peroxidados anti-IgA, anti-
IgM, anti-IgG1, anti-IgG2a y anti-IgE a las correspondientes placas. Para IgG1, IgG2a,
IgA e IgE se hizo una dilución 1:1000 y para IgM se utilizo una dilución 1:2000 y se
incubaron 2 horas a 4 °C, después se lavaron las placas 4 veces con PBS 1x-
0.05%Tween20 v/v . Se añadió 100µl de solución de sustrato ABTS 2,2`-Azino-DI-(3-
Ethylbenzthiazoline-6-Sulfonic Acid) con 100 µl de H2O2 al 3% y se incubó de 5 – 30
minutos, midiendo la absorbancia a 405 nm (cada 10 minutos a partir de 5 minutos de
agregar ABTS) en un lector de microplacas (Termo-Labysistems).
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Detección de anticuerpos específicos en lavados intestinales (IgG1, IgG2a, IgM, IgA e IgE)
Para detectar la presencia de inmunoglobulinas específica contra OVA en lavados
intestinales se utilizo el método de ELISA indirecta. Las placas de 96 pozos se
recubrieron con 100 µl de OVA y PCry a una concentración de 1 µg/100 μl en buffer de
carbonatos (Na2CO3 1mM + NaHCO3 3mM, pH 9.6) y se incubaron 24 horas a 4 °C,
después las placas se lavaron 4 veces con PBS 1x-0.05%Tween20 v/v , y se agregó a
cada pozo 200 µl de leche al 6% diluida en PBS 1x-0.05%Tween20 v/v para bloquear
los sitios de uniones inespecíficas, y se incubaron durante 2 horas a 4 °C. Después se
lavaron las placas 4 veces con PBS 1x-0.05%Tween20 v/v. Se colocaron las
muestras de los lavados intestinales por duplicado a una dilución de 1:2 diluidas en
leche al 3% y se incubaron por 24 horas a 4 °C. Pasado el tiempo de incubación las
placas se lavaron 4 veces con PBS 1x-0.05%Tween20 v/v y se agregaron 100 µl de
anticuerpos peroxidados anti-IgA, anti-IgM, anti-IgG1, anti-IgG2a y anti-IgE a las
correspondientes placas. Para IgG1, IgG2a, IgA e IgE se hizo una dilución 1:1000 y
para IgM se utilizo una dilución 1:2000 y se incubaron 2 horas a 4 °C. Después se
lavaron las placas 4 veces con PBS 1x-0.05%Tween20 v/v. Se añadió 100µl de
solución de sustrato ABTS 2,2`-Azino-DI-(3-Ethylbenzthiazoline-6-Sulfonic Acid) con
100 µl de H2O2 al 3% y se incubó de 5 – 30 minutos, midiendo la absorbancia a 405
nm en un lector de microplacas (Termo-Labysistems).
Obtención y purificación de protoxina PCry1Ac
Se utilizó la cepa recombinante de E. coli. Las bacterias se cultivaron en medio Luria
Broth (USBiological Swampscott, MA 01907) y se adicionó ampicilina (100 µg/ml).
Posteriormente se incubó a 37° C por 48 hrs. a 300 rpm en agitación constante. Para
la cosecha de las bacterias se centrifugó a 10000 rpm. a 4°C por 15 minutos y se
lavaron dos veces con amortiguador TE (Tris-HCl 0.05M, EDTA 1mM, pH 8.0).
Posteriormente se lisaron las bacterias incubándolas a 37°C durante 1 hora con 20
mg/ml de lisozima+ sacarosa al 15% para posteriormente sonicarlas durante 5 ciclos
de 5 min. cada uno, a una amplitud de 100 htz. Los cuerpos de inclusión se
recuperaron por centrifugado a 10000 rpm a 4°C por 10 minutos, al término la pastilla
se lavó cinco veces con 50 ml de NaCl 0.5M más Triton X-100 al 1% sonicando entre
cada lavado. Posteriormente se realizó otra centrifugación bajo las mismas
condiciones para resuspender la pastilla en 30 ml de agua bidestilada a 4ºC. Una vez
más se centrifugó a 10000 rpm por 15’ a 4° C y se solubilizó la pastilla en 10 ml de
amortiguador de carbonatos (Na2CO3 0.1M, NaHCO3 0.1M, pH 9.6 más 10mM de DTT)
por 30 minutos a 37ºC en agitación a 300 rpm. La pCry1Ac solubilizada se obtiene por
27
centrifugación a 10000 rpm 4°C por 15 minutos, recuperando el sobrenadante. Los
restos de endotoxina se eliminaron purificando la proteína por una columna de
Polimixina (BioRad Lab, CA) y se verificó la ausencia de LPS mediante la prueba de E-
Toxate. Finalmente la concentración de proteínas se determinó por el método de
Bradford y la pureza mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS- PAGE).
El manejo de las bacterias se realizó cumpliendo el reglamento Bioseguridad de la
UNAM –FES Iztacala.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Las diferencias significativas se determinaron con la prueba estadística One-way
ANOVA seguida de la prueba de Tukey con un nivel de significancia de 0.05 (P<0.05)
usando el programa GRAPH PAD PRISM 5.
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RESULTADOS
La administracion de CT/OVA 50 μg, CT/OVA 5 mg y PCry/OVA inducen una
población atípica de celulas CD3+/CD19+.
El análisis mediante citometría de flujo de la proporción de linfocitos T y B en bazo,
ganglio mesentérico y Placas de Peyer en el grupo de PBS y los inmunizados con
OVA, CT/OVA 50 µg, CT/OVA 5 mg y PCry/OVA, se muestran en la figura 3.1. En
células de bazo del grupo control PBS, se encontró una mayor proporción de linfocitos
B que T, observándose esta tendencia en los grupos inmunizados con OVA y CT/OVA
50 µg, sin embargo en el grupo inmunizados con CT/OVA 5 mg se observó una
disminución de linfocitos B en comparación con el grupo control PBS, encontrando
diferencias significativas entre estos grupos, mientras que la proporción de linfocitos T
es igual a la del grupo control. En el grupo inmunizado con PCry/OVA tambien se
encontró una disminución significativa de linfocitos B en comparación con los grupos
de PBS, OVA y CT/OVA 50 µg. Sorprendentemente al analizar la proporción de
linfocitos T y B se observó una población atípica (CD3+, CD19+) en los grupos
inmunizados con CT/OVA 50 µg, CT/OVA 5 mg y PCry/OVA.
En ganglio mesentérico, en el grupo control de PBS se observó una mayor cantidad de
linfocitos T (67.8% ±0.3) que B (17.3% ±0.2), observándo proporciones similares de
linfocitos T en todos los grupos (OVA, CT/OVA 50 µg, CT/OVA 5 mg y PCry/OVA). Sin
embargo, la proporción de linfocitos B en los grupos OVA y CT/OVA 50 µg no se
modificó significativamente. En los grupos CT/OVA 5 mg (8% ±0.7) y PCry/OVA (9.1%
±0.2) se observó una disminución significativa de linfocitos B en comparación con el
grupo control de PBS (17.3% ±0.2) y OVA (22.9% ±0.8). Ademas en ganglio
mesentérico fue observada tambien la población atípica (CD3+,CD19+) detectada en
bazo en los grupos inmunizados con CT/OVA 50 µg, CT/OVA 5 mg y PCry/OVA.
En placas de Peyer se observó una mayor proporción de linfocitos B que T en el grupo
control (PBS), observándose esta misma tendencia en los grupos de OVA, CT/OVA 50
µg y CT/OVA 5 mg; mientras que el grupo inmunizado con PCry/OVA mostró un
aumento significativo de linfocitos T (40.9% ±0.4) en comparación con el grupo de PBS
(28.3% ±0.4). También se observó en placas de Peyer la población atípica (CD3+,
CD19+) en los grupos de CT/OVA 50 µg, CT/OVA 5 mg y PCry/OVA.
29
Fig. 3.1 Porcentajes de poblaciones de linfocitos T y B en bazo, ganglio mesentérico y placas de Peyer de ratones BALB/c inmunizados con con OVA sola o coadministrada con CT y PCry1Ac, los cuales recibieron un esquema de inmunización que constó de 7 dosis de sensibilización (1c/semana) y retados con OVA a la octava semana y 1 hora antes del sacrificio, como se describe en métodos. Las células fueron marcadas con mAbs anti-CD3 y anti-CD19 marcados con fluorocromos y analizadas por citometría de flujo. Los plots son representativos de cada grupo experimental y los valores representan la media de los porcentajes. El * señala las diferencias significativas encontradas en los porcentajes de las células CD3+, CD19+ con una P<0.05 en comparación con el grupo control PBS. El ɣ indica las diferencias significativas con una P<0.05 en comparación con el grupo OVA. El ξ señala las diferencias significativas con una P<0.05 en comparación con el grupo CT/OVA 50 µg.
La inmunizacion con PCry/OVA y CT/OVA no modifica las proporcion de linfocitos T y B en compartimientos intestinales.
El análisis de citometría de flujo de la proporción de linfocitos T y B en células
intraepiteliales de intestino delgado e intestino grueso , así como en células de lámina
propia de intestino delgado e intestino grueso del grupo PBS y los grupos inmunizados
con OVA, CT/OVA 50 µg, CT/OVA 5 mg y PCry/OVA se muestran en la figura 3.2 , en
la que como era de esperarse se observó una mayor proporción de linfocitos T y un
bajo porcentaje de linfocitos B, tanto en el grupo control PBS, como en los grupos de
OVA, CT/OVA 50 µg, CT/OVA 5 mg y PCry/OVA en células intraepiteliales de intestino
delgado. Se observó una pequeña disminución de linfocitos T en los grupos de
CT/OVA 50 µg y PCry/OVA en comparación del grupo control (PBS), sin embargo no
se encontraron diferencias significativas entre estos grupos.
En células intraepiteliales de intestino grueso se observó también mayor proporción de
linfocitos T que B; sin embargo se observó una mayor proporción de linfocitos B tanto
en el grupo control PBS como en todos los grupos experimentales (CT/OVA 50 µg,
CT/OVA 5 mg, PCry/OVA), en comparación con las células de intestino delgado. En
30
estas células intraepiteliales de intestino grueso no se encontraron diferencias
significativas entre los grupos inmunizados con respecto al control.
También se muestran en la (figura 3.2) el análisis de citometría de flujo de la
proporción de linfocitos T y B en lámina propia de intestino delgado y grueso del grupo
control y los inmunizados con CT/OVA 50 µg, CT/OVA 5 mg, PCry/OVA. En lámina
propia de intestino delgado, en el grupo control PBS, se observó una mayor proporción
de linfocitos T que B, esta misma tendencia se dio en los demás grupos, sin embargo
en los grupos inmunizados con CT/OVA µg y CT/OVA 5 mg se pudo apreciar una
disminución de linfocitos T en comparación del grupo control (PBS), mientras que en el
grupo PCry/OVA se encontró un aumento de linfocitos T en comparación del grupo
control. En células de lámina propia de intestino grueso de los ratones control, como
se esperaba se observó una proporcion mayor de linfocitos B en comparación con el
intestino delgado. No se encontraron diferencias significativas por efecto de ninguno
de los tratamientos, ya que todos los grupos experimentales presentaron una mayor
cantidad de linfocitos B que T.
Fig. 3.2 Porcentajes de poblaciones de linfocitos T, B intraepiteliales y lámina propia en intestino delgado y grueso. Los linfocitos fueron aislados de ratones normales y ratones inmunizados con OVA coadministrada con CT y PCry1Ac . Las células fueron marcadas con mAbs anti-CD3 y anti-CD19 marcados con fluorocromos y analizadas por citometría de flujo. Los dotplots son representativos de cada grupo experimental y los valores representan la media de los porcentajes.
31
La población de células T CD4+ se incrementó en el grupo de CT/OVA 50 µg en ganglio mesentérico
Al analizar la proporción de células TCD4+ y TCD8+, en los controles PBS se pudo
apreciar en bazo y placas de Peyer que hay una mayor cantidad de linfocitos TCD4
que de TCD8, asi mismo en todos los grupos experimentales (OVA CT/OVA 50 µg,
CT/OVA 5 mg, PCry/OVA) se observó esta misma relacion.
En ganglio mesentérico también se observó que predominan los linfocitos TCD4 con
respecto a los TCD8 en los controles, sin embargo, si se observaron cambios
significativos por efecto de los tratamientos. Se pudo observar una disminución
significativa de linfocitos T CD8 en los grupos de CT/OVA 50 µg (6.5% ±0.2) y CT/OVA
5 mg (5.3% ±0.9) en comparación con el grupo control PBS (19.6% ±0.3) y OVA
(22.9% ±0.5), mientras que la subpoblación de T CD4 en los grupo de CT/OVA 50 µg
(90.8% ±0.2) y CT/OVA 5 mg (92% ±0.9) se ve un pequeño incremento en
comparación al grupo control PBS (77.7% ±0.2) y OVA (75% ±0.5), encontrando
diferencias significativas entre estos grupos. (Figura 3.3).
Fig. 3.3 Porcentaje de subpoblaciones T-CD4 y T-CD8 en ganglio mesentérico. Los linfocitos fueron aislados de
ratones normales y ratones inmunizados con OVA coadministrada con CT y PCry1Ac . Las células fueron marcadas
con mAbs anti-CD4 y anti-CD8 marcados con fluorocromos y analizadas por citometría de flujo. Los dotplots son
representativos de cada grupo experimental y los valores representan la media de los porcentajes. El * señala las
diferencias significativas encontradas en los porcentajes de las células T-CD4+y T-CD8+ con una P<0.05 en
comparación con el grupo control PBS. El ɣ indica las diferencias significativas en los porcentajes de celulas T-CD4+ y
T-CD8+ con una P<0.05 en comparación con el grupo OVA.
Como era de esperarse se observó una mayor proporción de linfocitos T-CD8 que de
T-CD4 en células intraepiteliales y lámina propia de intestino delgado e intestino
grueso, en todos los grupos (PBS,CT/OVA 50 µg, CT/OVA 5 mg y PCry/OVA).
32
El tratamiento de CT/OVA 5 mg incrementó la población de granulocitos (Gr1+) en ganglio mesentérico.
Para determinar si se modifica la proporción de granulocitos en células de bazo,
ganglio mesentérico y placas de Peyer del grupo control PBS, OVA y los
coadministrados con adyuvantes (CT/OVA 50 µg, CT/OVA 5 mg y PCry/OVA), se
analizó mediante citometría de flujo usando marcador de Gr1 de leucocitos
polimorfonucleares con el cual se identificaron poblaciones de granulocitos totales,
población de eosinófilos (Gr1+) y población de neutrófilos (Gr1++), basado en un
reporte en el cual la expresión baja de Gr1+ corresponde a eosinófilos, mientras que
una expresión mayor de Gr1++ corresponde a neutrófilos. (de Heer, Hammad et al.
2004). Los resultados se muestran en la figura 4.1. En células de bazo de los controles
se observa una cantidad mínima de granulocitos, incluso mayor proporción de
eosinófilos que de neutrófilos, además se observó un leve aumento en la población de
granulocitos en los grupos CT/OVA 50 µg, CT/OVA 5 mg y PCry/OVA en comparación
con el grupo control PBS, a pesar de esto no se encontraron diferencias significativas.
En ganglio mesentérico se puede apreciar una menor cantidad de granulocitos en el
grupo control PBS en comparación con los encontrados en bazo; Se encontró un
aumento significativo en la población total de granulocitos totales (14.38% ±4.3),
eosinófilos (0.8% ±0.5) y neutrófilos (13.24% ±4.2) en el grupo de CT/OVA 5 mg en
comparación con los grupos de PBS, OVA y CT/OVA 50 µg. Mientras que el grupo
inmunizado con PCry/OVA registro un aumento en la población de granulocitos totales
pero en especial de neutrófilos (0.6% ±0.5) en comparación con el grupo control PBS
(0.05% ±0.5), OVA (0.03% ±0.03) y CT/OVA 50 µg (0.05% ±0.02), encontrando
diferencias significativas con estos grupos.
33
Fig. 4.1 Poblaciones de granulocitos (eosinófilos y neutrófilos) en ratones Balb/c normales e inmunizados. Los
porcentajes en los plots de lado izquierda representan la media del porcentaje de la población de granulocitos, los
porcentajes de la derecha superior e inferior representan la media de los porcentajes de la población de eosinófilos y
neutrófilos respectivamente. Las células fueron teñidas con mAbs anti-Gr1 con fluorocromos y analizadas mediante
citometria de flujo. Los dotplots son representativos de cada grupo experimental y los valores representan la media de
los porcentajes. El * señala las diferencias significativas con una P<0.05 en comparación con el grupo control PBS. El γ
señala las diferencias significativas con una P<0.05 en comparación con el grupo OVA. El ξ señala las diferencias
significativas con una P<0.05 en comparación con el grupo CT/OVA 50 μg. El π señala las diferencias significativas con
una P<0.05 en comparación con el grupo CT/OVA 5 mg. El & señala las diferencias significativas con una P<0.05 en
comparación con el grupo PCry/OVA.
En placas de Peyer, en el grupo control PBS se pudo observar una mayor proporción
de neutrófilos que eosinófilos, esta misma tendencia se observó en los grupos OVA y
PCry/OVA, este ultimó presentó un aumento significativo en la población de eosinófilos
en comparación con los grupos OVA y CT/OVA 5 mg, un aumento de neutrófilos en
comparación con los grupos OVA, CT/OVA 50 µg y CT/OVA 5 mg, encontrando
diferencias significativas con estos grupos. Por su parte el grupo control positivo
(CT/OVA 50 µg) mostró un aumento significativo en la población de eosinófilos (0.6%
±0.01) en comparación con el grupo control PBS (0.2% ±0.04) y PCry/OVA (0.2%
±0.05).
34
Los tratamientos PCry/OVA y CT/OVA 50 μg incrementaron la población de
células B220+/IgE+ en B, GM y PP
Los resultados de la poblaciones B220+/IgE+ en células de bazo, ganglio mesentérico
y placas de Peyer de los ratones inmunizados con PBS, OVA, CT/OVA 50 μg, CT/OVA
5 mg y PCry/OVA se muestran en la figura 5.1. En células de bazo en el grupo control
PBS mostró un bajo porcentaje en las poblaciones de B220+/IgE+ (9.3% ±0.5),
mientras que en los demás grupos se observó un incremento en dicha población,
siendo los grupos CT/OVA 50 μg (46.4% ±0.5) y PCry/OVA (57.4% ±0.7) donde se
encontraron diferencias significativas.
En ganglio mesentérico el grupo control PBS expusó un porcentaje mayor de células
B220+/IgE+ en comparación con el grupo control PBS en células de bazo. En el grupo
OVA se observó un porcentaje similar al grupo control PBS, los ratones inmunizados
con CT/OVA 50 μg, CT/OVA 5 mg y PCry/OVA tuvieron un aumento significativo en
células IgE+/B220+ (74.8% ±0.3), (54.7% ±1.6), (56.5% ±0.7) respectivamente, en
comparación con los grupos control PBS (30.5% ±0.9) y OVA (32.14% ±1.2).
En células de placas de Peyer se encontró un porcentaje de 16.6% ±0.6 en el grupo
control PBS. Los grupos inmunizados con CT/OVA 50 μg, CT/OVA 5 mg y PCry/OVA
mostraron un aumento de células B220+/IgE+, en comparación con el grupo control
PBS.
La coadministracion de PCry/OVA y CT/OVA incrementó la población de células B220+/IgE+en compartimientos del intestino
Los resultados de la poblaciones B220+/IgE+ en células intraepiteliales y lámina propia
de intestino delgado e intestino grueso en los ratones inmunizados con PBS, OVA,
CT/OVA 50 μg, CT/OVA 5 mg y PCry/OVA se muestran en la figura 5.2. El grupo
control PBS en células intraepiteliales de intestino delgado, mostró un bajo porcentaje
de células B220+/IgE+, observándose esta misma tendencia en los grupos OVA,
CT/OVA 50 μg, CT/OVA 5 mg y PCry/OVA.
En células intraepiteliales de intestino grueso se observó un porcentaje mayor de
células B220+/IgE+ en el grupo control PBS en comparación con el intestino delgado,
no se observó un aumento significativo de celulas B220+/IgE+ en los demas grupos
experimentales. Sin embargo hay que considerar que la proporcion de linfocitos B
intraepiteliales es mayor en el intestino grueso con respecto al intestino delgado (Fig.
3.2).
35
Fig. 5.1 Población de células B220+/IgE+ en bazo, ganglio mesentérico y placas de Peyer. Los linfocitos fueron aislados de ratones normales y ratones inmunizados con OVA sola o coadministrada con CT y PCry1Ac . Las células fueron marcadas con mBbs ant-IgE FITC y anti-B220 Cy5, analizadas por citometría de flujo. Los dotplots son representativos de cada grupo experimental y los valores representan la media de los porcentajes. El * señala las
diferencias significativas con una P<0.05 en comparación del grupo control PBS. El γ señala las diferencias
significativas con una P<0.05 en comparación con el grupo OVA.
El análisis de la población de células B220+/IgE+ en células de lámina propia de
intestino delgado en el grupo control mostró un bajo porcentaje, viéndose este mismo
comportamiento en los demás grupos (OVA, CT/OVA 50 μg, CT/OVA 5 mg y
PCry/OVA). En células de lámina propia de intestino grueso pudo apreciarse en el
grupo control PBS mayor cantidad de células B220+ en comparación con las
analizadas en lámina propia de intestino delgado e intraepiteliales de ambos intestinos,
se observa la misma tendencia en los demás grupos experimentales a excepción del
grupo OVA, sin embargo no se encontraron diferencias significativas entre los grupos
experimentales.
36
Fig. 5.2. Población de células B220+/IgE+ en lámina propia y células intraepiteliales de intestino delgado e intestino grueso. Los linfocitos fueron aislados de ratones normales y ratones inmunizados con OVA sola o coadministrada con CT y PCry1Ac . Las células fueron marcadas con mBbs ant-IgE FITC y anti-B220 Cy5, analizadas por citometría de flujo. Los dotplots son representativos de cada grupo experimental y los valores representan la media de los porcentajes
Respuesta de anticuerpos anti-OVA de las subclases IgG1, IgG2a, IgM, IgA, IgE en suero de ratones inmunizados.
Se cuantificaron los anticuerpos específicos contra OVA en suero de ratones
inmunizados con PBS, OVA, CT/OVA 50 µg, CT/OVA 5 mg, PCry/OVA. En la tabla 1 y
en la figura 6.1 se observan los títulos obtenidos de los anticuerpos de las subclases
de IgG. IgG1 IgG2a y de los isotipos IgA, IgM e IgE en suero, también se muestran la
media de las absorbancias de la subclase IgE específica.
La respuesta específica de anticuerpos de la subclase IgG1 en el grupo control PBS
como de esperarse es baja encontrándose títulos muy bajos, mientras que el grupo
inmunizado con OVA sola mostró titulos bajos pero significativamente mayores en
comparación con el grupo control PBS. En el grupo de ratones inmunizados con
PCry/OVA no se indujeron respuestas significativas hacia OVA. Además como era de
esperarse en los grupos control positivos de alergia (OVA/CT 50 μg y OVA/CT 5 mg)
se encontraron títulos altos de anticuerpos específicos anti-OVA de la subclase IgG1
significativamente mayores en comparación con el control PBS, hallando en el grupo
37
de CT/OVA 50 μg diferencias significativas con respecto a los grupo control PBS, OVA
y PCry/OVA.
Al analizar la respuesta de anticuerpos IgG2a hacia OVA se encontró que unicamente
el grupo CT/OVA 50 μg presentó títulos significativamente mayores al grupo control
PBS. Los títulos de IgG1 inducidos por la inmunizacion de CT/OVA fueron
significativamente mayores a los de IgG2a.
Al analizar la respuesta específica de anticuerpos de la subclase IgA en el grupo
control de PBS, como era de esperarse, se observaron títulos muy bajos en los grupos
de OVA y PCry, no se detectaron respuestas significativas de anticuerpos hacia OVA.
El hecho de que no se haya observado efecto adyuvante de la protoxina Cry1Ac en la
respuesta de anticuerpos hacia OVA, pudiera deberse al esquema de inmunización, el
cual constó de 7 sensibilizaciones y 2 retos antes del sacrificio, siendo un esquema
crónico, que pudiera estar causando tolerancia hacia OVA. En contraste en los grupos
de CT/OVA 50 µg y CT/OVA 5 mg si se pudieron observar títulos altos de anticuerpos
anti-OVA en comparación con los demás grupos, encontrando en el grupo de CT/OVA
50 µg diferencias significativas con respecto a los grupos inmunizados con PBS, OVA
y PCry/OVA y confirmando el efecto adyuvante que caracteriza a la toxina de cólera
(CT).
La respuesta de anticuerpos específicos anti-OVA de la subclase IgM fue baja en
general con todos los tratamientos incluyendo el grupo de OVA/CT, lo cual no es raro
ya que el isotipo IgM corresponde a una respuesta primaria , lo que indica que son los
primeros anticuerpos en generarse y conforme pasan las inmunizaciones estos
isotipos disminuyen debido al cambio de isotipo en los grupos inmunizados con OVA,
CT/OVA 5 mg, PCry/OVA no mostró respuestas significativas de IgM, presentando
títulos similares al grupo control PBS, mientras que los ratones inmunizados con
CT/OVA 50 µg mostraron títulos bajos, pero encontrando diferencias significativas con
el grupo de PBS y PCry/OVA.
En la figura 6.3 también se muestran las medias de las absorbancias obtenidas en la
detección de la subclase IgE específica contra OVA en los ratones inmunizados con
PBS, OVA, CT/OVA 50 µg, CT/OVA 5 mg y PCry/OVA, se aprecia que unicamente en
el grupo CT/OVA 50 μg se encontraron valores de absorbancia significativos de IgE
específica con respecto al control.
38
Respuesta de anticuerpos anti-PCry de las subclases IgG1, IgG2a, IgM, IgA, IgE en suero.
A pesar que no observamos efecto adyuvante de PCry1Ac, si observamos el efecto
inmunogénico al analizar la respuesta de anticuerpos específicos hacia PCry (IgG1,
IgG2a, IgA e IgM), en los cuales apreciamos diferencias significativas con respecto al
grupo de PBS. Tabla 1, figura 6.2 y 6.3
Tabla 1. Respuesta de anticuerpos anti-OVA en suero de ratones BALB/c.
Inmunización Anti-OVA
Titulo
IgG1
Titulo
IgG2a
Titulo
IgA
Titulo
IgM
ABS
IgE
PBS 11.03 ±0.7 127.4 ±2.3 120.6 ±2.1 598.7 ±1.3 0.06 ±0.005
OVA 11796 ±27 86.9 ±2.3 240.8 ±3.4 654.1 ±2.1 0.08 ±0.03
CT/OVA 50 µg 118855.5 ±37 *γ 3211.9 ±5.2 *γ 6355.2 ±8.5 *γ 1021.7 ±2.1 * 0.11 ±0.02 *
CT/OVA 5 mg 41829.7 ±52.6*γ 642.3 ±20.1*γ 899.6 ±14.5*γ 685.5 ±13.9 0.07 ±0.06
PCry/OVA 67.9 ±2.96 125.1 ±2.1 178.3 ±12.5 0.07 ±0.009
Tabla 1. Títulos de la respuesta de anticuerpos específicos anti-OVA y anti-PCry de las subclases IgG1, IgG2a, IgA, IgM e IgE en suero de ratones inmunizados. Los datos representan las medias, ± SD, * señala las diferencias significativas con p<0.05 con respecto al grupo PBS. γseñala las diferencias significativas con p<0.05 con respecto al
grupo OVA.
En la figura 6.2 se muestran los resultados del análisis obtenido de la respuesta en
suero de anticuerpos específicos anti-PCry de las subclases IgG1, IgG2a, IgA, IgM,
IgE de los ratones inmunizados con PCry/OVA, en la que se puede apreciar al
anticuerpo de la subclase IgG1 con el título mas alto en comparación con el PBS y los
demás anticuerpos. Estos resultados confirman la respuesta de tipo Th2 en los ratones
inmunizados con el control positivo de alergia CT/OVA 50 µg, en los cuales se
detectaron títulos altos de la subclase IgG1 en comparación a los de la subclase
IgG2a, además que se observó una mayor absorbancia en el análisis de la subclase
IgE en este grupo control positivo. Mientras que en el grupo de PCry/OVA no se
observaron respuestas significativas de IgG1 e IgG2a con respecto al control PBS.
Inmunización Anti-PCry
Titulo
IgG1
Titulo
IgG2a
Titulo
IgA
Titulo
IgM
ABS
IgE
PCry/OVA 32099.9 ±83.9 3019.8 ±25.9 2635 ±24 3682.6 ±13 * 0.08 ±0.03
39
Fig. 6.1 Título de anticuerpos anti-OVA de las subclases IgG1, IgG2a, IgA, IgM y absorbancia de IgE específica e IgE
total en suero de ratones BALB/c inmunizados. El suero fue obtenido de ratones BALB/c inmunizados y se cuantífico
por el método de ELISA. El * señala las diferencias significativas con una P<0.05 en comparación con el grupo control
PBS. El ɣ señala las diferencias significativas con una P<0.05 en comparación con el grupo OVA. El & señala las
diferencias significativas con una P<0.05 en comparación con el grupo PCry/OVA.
40
Fig. 6.2 Título de anticuerpos específicos contra PCry de las subclases IgG1, IgG2a, IgA, IgM y media de las absorbancias del isotipo IgE, en suero de ratones inmunizados con PCry/OVA. El * señala las diferencias significativas con una P<0.05 con el grupo control PBS.
Fig. 6.3 Título de anticuerpos específicos contra PCry de las subclases IgG1, IgG2a, IgA, IgM y media de las absorbancias del isotipo IgE, en suero de ratones inmunizados con PCry/OVA. El * señala las diferencias significativas con una P<0.05 con el grupo control PBS.
41
Respuesta de anticuerpos anti-OVA y anti-PCry de las subclases IgG1, IgG2a, IgM, IgA, IgE en lavados de intestino delgado en ratones BALB/c
La absorbancia de los anticuerpos específicos anti-OVA y anti-PCry de las subclases
IgG1, IgG2a e isotipos IgA, IgM e IgE, detectados en intestino delgado en los grupos
inmunizados con PBS, OVA, CT/OVA 50 µg, CT/OVA 5 mg y PCry/OVA, se muestra
en la figura 7.1 y el cuadro 2. La respuesta específica de anticuerpos anti-OVA de la
subclase IgG1 en intestino delgado en los grupos OVA y PCry/OVA mostró bajos
niveles al igual que el control PBS, mientras que como era de esperarse los ratones
inmunizados con CT/OVA 50 µg y CT/OVA 5 mg mostraron mayor cantidad de IgG1,
encontrando diferencias significativas de ambos grupos con respecto a los grupos de
PBS, OVA y PCry/OVA.
Al analizar la respuesta específica anti-OVA de la subclase IgG2a se pudo apreciar
que no se detectaron niveles significativos en los grupos los grupos OVA, CT/OVA y
PCry/OVA ya que mostraron niveles similares entre si, similares al grupo control PBS,
siendo el grupo CT/OVA 5 mg donde se encontraron los mayores valores de IgG2a,
encontrando diferencias significativas con respecto al grupo control PBS.
La respuesta de anticuerpos del isotipo IgA en lavados de intestino delgado detectada
en los grupos inmunizados con OVA, PCry/OVA no fue significativa ya que mostró
niveles similares en el grupo control PBS, mientras que en los ratones inmunizados
con CT/OVA 50 µg y CT/OVA 5 mg se observó una respuesta mayor en comparación
con los demás grupos, en especial el grupo CT/OVA 5 mg, en el cual se encontraron
diferencias significativas con respecto a los grupos inmunizados con PBS, OVA,
PCry/OVA e incluso CT/OVA 50 µg, esto nuevamente confirma el efecto adyuvante de
la toxina de cólera (CT).
La respuesta específica anti-OVA del isotipo IgM en intestino delgado mostró bajos y
similares niveles de absorbancia en todos los grupos que no fueron significativos con
respecto al control PBs. Esta misma tendencia se observó al analizar la respuesta
específica anti-OVA de la subclase IgE en la que tampoco se detectaron valores
significativos.
El análisis de la respuesta especifica anti-PCry de los las subclases IgG1, IgG2a, IgA,
IgM e IgE en lavado de intestino delgado de ratones inmunizados con PCry/OVA se
muestran en la figura 7.1, donde se aprecio que se indujo la respuesta significativa de
IgG1 e IgA específica anti-PCry.
42
Tabla 2. Respuesta de anticuerpos anti-OVA en lavado de intestino delgado de ratones BALB/c.
Inmunización Anti-PCry
ABS IgG1
ABS IgG2a
ABS IgA
ABS IgM
ABS IgE
PCry/OVA 0.2 ±0.04 0.07 ±0.01 0.13 ±0.03 0.07 ±0.01 0.07 ±0.01 * Tabla 2. Absorbancias de la respuesta de anticuerpos específicos anti-OVA y anti-PCry de las subclases IgG1, IgG2a, IgA, IgM e IgE en lavados de intestino delgado de ratones inmunizados. Los datos representan las medias, ± SD, * señala las diferencias significativas con p<0.05
Fig. 7.1 Respuesta de anticuerpos específicos contra PCry de las subclases IgG1, IgG2a, IgA, IgM e IgE, en lavados de intestino grueso de ratones inmunizados con PCry/OVA. El * señala las diferencias significativas con una P<0.05 con el grupo control PBS.
Inmunización Anti-OVA
ABS
IgG1
ABS
IgG2a
ABS
IgA
ABS
IgM
ABS
IgE
PBS 0.1 ±0.008 0.12 ±0.6 0.08 ±0.008 0.07 ±0.005 0.07 ±0.02
OVA 0.13 ±0.03 0.16 ±0.03 0.08 ±0.01 0.07 ±0.01 0.07 ±0.02
CT/OVA 50 µg 0.61 ±0.07 * 0.19 ±0.03 0.1 ±0.03 0.07 ±0.01 0.07 ±0.01
CT/OVA 5 mg 1.01 ±0.21 * 0.3 ±0.03 * 0.4 ±0.1 * 0.07 ±0.01
PCry/OVA 0.1 ±0.024 0.2 ±0.03 0.08 ±0.01 0.07 ±0.02 0.07 ±0.01
43
RESPUESTA DE ANTICUERPOS ESPECIFICOS ANTI-OVA EN LAVADO DE INTESTINO DELGADO.
Fig. 7.2. Respuesta de anticuerpos específicos contra PCry de las subclases IgG1, IgG2a, IgA, IgM e IgE, en lavados de intestino delgado de ratones inmunizados con PCry/OVA. El * señala las diferencias significativas con una P<0.05 con el grupo control PBS.
44
Respuesta de anticuerpos anti-OVA y anti-PCry de las subclases IgG1, IgG2a y los isotipos IgM, IgA, IgE en lavados de intestino grueso en ratones BALB/c
La respuesta de anticuerpos específicos de las subclases IgG1, IgG2a, IgA, IgM e IgE
específica, expresada en absorbancias, en lavados de intestino grueso de los ratones
inmunizados con PBS, OVA, CT/OVA 50 µg, CT/OVA 5 mg y PCry/OVA se muestra en
la figura 7.3.
Al analizar la respuesta específica anti-OVA de la subclase IgG1 los grupos de
CT/OVA 50 µg y CT/OVA 5 mg mostraron altos niveles de IgG1, encontrando
diferencias significativas con respecto a los grupos inmunizados con PBS. Mientras
que en el grupo PCry/OVA no se indujo respuesta. Cabe mencionar que en intestino
grueso en los controles positivos de alergia (CT/OVA 50 µg y CT/OVA 5 mg) se
registró una mayor producción de IgG1 que de IgG2a.
La respuesta específica anti-OVA de la subclase IgG2a en suero mostró una
respuesta similar en todos los grupos (PBS, OVA, CT/OVA 50 μg, CT/OVA 5 mg y
PCry/OVA).
Los niveles de IgA específico anti-OVA en lavado de intestino grueso fueron muy bajos
en comparación con los encontrados en el intestino delgado. El grupo de CT/OVA 5
mg fue el que mostró mayores niveles de IgA, encontrando diferencias significativas
con respecto al grupo control PBS, el grupo PCry/OVA no indujo respuestas anti-OVA
en este isotipo.
Al analizar los niveles de IgM específica anti-OVA, El grupo de CT/OVA 5 mg mostró
un aumento significativo con respecto a los grupos PBS. Mientras que el grupo
inmunizado con PCry/OVA tuvo una mayor producción de IgM en comparación con el
grupo control de PBS, sin embargo no se encontraron diferencias significativas. La
respuesta de IgM específica anti-OVA en intestino grueso fue mayor que la detectada
en intestino delgado.
La respuesta específica de IgE anti-OVA en intestino grueso mostró niveles similares
en todos los grupos (PBS, OVA, CT/OVA 50 µg, CT/OVA 5 mg y PCry/OVA).
La respuesta de anticuerpos específicos anti-PCry en intestino grueso de los ratones
inmunizados con PCry/OVA se muestra en la figura 7.4 y en la tabla 3, donde se indujo
respuesta significativas de IgG1 e IgA con respecto al grupo control PBS.
45
Fig. 7.3 Respuesta de anticuerpos anti-OVA de las subclases IgG1, IgG2a, IgA, IgM e IgE específica en lavados de intestino grueso de ratones BALB/c inmunizados. Los lavados fueron obtenidos de ratones BALB/c inmunizados y se cuantífico por el método de ELISA. El * señala las diferencias significativas con una P<0.05 en comparación con el grupo control PBS. El ɣ señala las diferencias significativas con una P<0.05 en comparación con el grupo OVA. El ξ indica las diferencias significativas con una P<0.05 en comparación con el grupo CT/OVA 50 µg. El & señala las diferencias significativas con una P<0.05 en comparación con el grupo PCry/OVA.
RESPUESTA DE ANTICUERPOS ESPECIFICOS ANTI-OVA EN LAVADO DE INTESTINO GRUESO.
46
Tabla 3. Respuesta de anticuerpos anti-OVA en lavado de intestino grueso de ratones BALB/c.
Inmunización Anti-OVA
ABS IgG1
ABS IgG2a
ABS IgA
ABS IgM
ABS IgE
PCry/OVA 0.58 ±0.08 0.1 ±0.02 0.18 ±0.04 0.1 ±0.02 0.07 ±0.008
Tabla 3 Absorbancias de la respuesta de anticuerpos específicos anti-OVA y anti-PCry de las subclases IgG1, IgG2a, IgA, IgM e IgE en lavados de intestino grueso de ratones inmunizados. Los datos representan las medias, ± SD, * señala las diferencias significativas con p<0.05
Fig. 7.4 Respuesta de anticuerpos específicos contra PCry de las subclases IgG1, IgG2a, IgA, IgM e IgE, en lavados
de intestino grueso de ratones inmunizados con PCry/OVA. El * señala las diferencias significativas con una P<0.05
con el grupo control PBS.
Inmunización Anti-OVA
ABS
IgG1
ABS
IgG2a
ABS
IgA
ABS
IgM
ABS
IgE
PBS 0.07 ±0.006 0.07 ±0.006 0.06 ±0.005 0.13 ±0.04 0.08 ±0.03
OVA 0.09 ±0.02 0.07 ±0.009 0.06 ±0.009 0.08 ±0.04 0.08 ±0.01
CT/OVA 50 µg 0.59 ±0.07 * 0.1 ±0.03 0.08 ±0.01 0.12 ±0.05 0.08 ±0.02
CT/OVA 5 mg 0.6 ±0.16 * 0.08 ±0.02 0.1 ± 0.03* 0.3 ±0.01 * 0.08 ±0.01
PCry/OVA 0.06 ±0.01 0.06 ±0.006 0.07 ±0.01 0.22 ±0.04 0.07 ±0.01
47
La inmunización por vía intra-gastrica de CT/OVA induce un perfil de citocinas Th1/Th2
Las citocinas son proteínas que poseen la capacidad de modular la actividad funcional
de células individuales o tejidos, tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. La
respuesta polarizada por parte de células efectoras Th2 por si mismas secretan IL-4,
IL-13, IL-5 e IL-9, comportamiento que se observa en procesos alérgicos; por el
contrario una respuesta polarizada de células Th1 secretaria INF-ɣ , mientras que la
IL-10 se caracteriza como una citocina reguladora.
El análisis de la producción de citocinas (IL-4, IL-13, INF-ɣ e IL-10) en suero de
ratones BALB/c inmunizados con PBS, OVA, CT/OVA 50 µg, CT/OVA 5 mg y
PCry/OVA se muestran en el cuadro 4 y la figura 8.1. Como era de esperarse, al
analizar la cantidad de citocinas IL-4, IL-13, IL-10, INF-γ en suero de los ratones
control, observamos valores muy bajos. Esta misma tendencia se dio en el grupo de
OVA. El grupo CT/OVA 5 mg presentó niveles mas altos de IL-4 y de IL-10 que el
control de PBS y el resto de los grupos, pero los niveles de IL-13 fueron bajos y los
niveles de INF-γ fueron ligeramente menores a los del grupo control PBS. Sin embargo
el grupo CT/OVA 50 μg presentó solamente niveles de IL-10 e INF-γ ligeramente
mayores al control PBS y OVA.
El grupo de PCry/OVA presentó niveles elevados de INF- y un ligero incremento en la
concentración de IL-4, IL-13 e IL-10 en suero en comparación con el grupo control
PBS y OVA.
48
Fig. 8.1 Niveles de citocinas IL-4, IL-13, IL-10, INF-ɣ en suero obtenido de ratones BALB/C sensibilizados por vía intra-gástrica con OVA sola o con adyuvante CT o Cry1Ac coadministrado con OVA y retados con OVA sola como se describe en la metodología. La cuantificación de las citocinas se llevo a cabo por el método de ELISA. El * indica las diferencias significativas con una p<0.05 en comparación con el grupo control PBS. El ɣ indica las diferencias significativas con una p<0.05 en comparación con el grupo OVA. El ξ indica las diferencias significativas con una p<0.05 en comparación con el grupo CT/OVA 50 µg.
49
DISCUSION Se llevo a cabo la estandarización de un modelo murino de alergia hacia OVA
mediante la coadministración de CT con OVA y con este modelo se evaluó el efecto de
la coadministracion de la protoxina Cry1Ac con OVA por ruta intra-gastrica, que nos
permitió estudiar y evaluar los procesos de alergia, tanto de la fase inductiva como
efectora del proceso alérgico hacia alimentos.
Caracterizamos la respuesta a nivel sistémico, como es estudiado en la mayoría de los
modelos de alergia, mediante la detección de citocinas y anticuerpos especificos hacia
OVA en suero. A comparación de la mayoría de los trabajos dirigidos a evaluar la
alergia hacia los alimentos, nos encargamos de caracterizar la respuesta a nivel de
mucosas, para detallar el proceso alérgico a nivel intestinal. Evaluamos los cambios en
la proporción de las poblaciones de linfocitos T, linfocitos B, subpoblaciones de
linfocitos T-CD4+ y T-CD8+, Linfocitos B/IgE+ y granulocitos (eosinófilos y neutrófilos)
en tejido linfoide organizado (placas de Peyer, ganglio mesentérico) y tejido linfoide
difuso (linfocitos intraepiteliales, lámina propia) de intestino delgado e intestino grueso.
La administración de la protoxina Cry1Ac con OVA por ruta intra-gastrica, indujo una
respuesta con algunos parametros parecidos al control positivo de alergia, esta
conclusión la basamos en las siguientes evidencias: 1) El análisis de citometría de
flujo, en el que se encontraron poblaciones atípicas de células CD19+/CD3+ en bazo,
ganglio mesentérico y placas de Peyer, en los grupos positivos de alergia (CT/OVA) y
el grupo experimental PCry/OVA. Esta población atípica no había sido descrita
previamente en modelos de alergia.
2) La inmunización de PCry/OVA incrementó la población de células Gr1+ (eosinófilos)
y en menor cantidad células Gr1++ (neutrófilos), tanto en bazo, ganglio mesentérico y
placas de Peyer.
3) La administración intra-gastrica de la protoxina Cry1Ac también incrementó de
manera significativa, y parecida al grupo positivo de alergia (CT/OVA), la proporción de
linfocitos B que expresan IgE, en bazo, ganglio mesentérico y placas de Peyer.
4) El análisis de anticuerpos en suero y lavados intestinales del grupo PCry/OVA
indujo una respuesta hacia PCry pero no induce respuesta hacia OVA, a diferencia del
grupo positivo OVA/CT .
5) La respuesta de citocinas del grupo PCry/OVA mostró altos niveles de INF-γ en
comparacion con el grupo control PBS. Mientras que el control positivo OVA/CT
mostro niveles elevados de IL-4, IL-10 e INF-γ.
50
Es importante recalcar que el análisis por citometría de flujo de la proporción de las
poblaciones de linfocitos T, linfocitos B, linfocitos TCD4+, linfocitos TCD8+, en un
principio fue realizado como prueba de control para verificar si el aislamiento de
linfocitos estaba siendo correctamente realizado, sorprendentemente, encontramos la
presencia de poblaciones atípicas CD19+/CD3+ en bazo, ganglio mesentérico y placas
de Peyer, en los grupos de CT/OVA 50 µg, CT/OVA 5 mg y PCry/OVA; esta población
atípica no había sido publicada anteriormente, mas que en un reporte local de
(Meneses, 2010), en el que encontró poblaciones doble positivas de B220+/CD3+ en
linfocitos de pulmón, en grupos positivos de alergia (Alum/OVA y CT/OVA) y el grupo
experimental PCry/OVA. La linea linfoide (linfocitos T y linfocitos B, entre otras) se
derivan de células primordiales hematopoyéticas en la medula osea (Akashi K, 1999);
quiza esta población CD19+/CD3+ se encuentran en estado inmaduro, y esten
expresando ambos receptores, las cuales estan siendo reclutadas en B, GM y PP por
efecto de los tratamientos. Como perspectivas del presente trabajo, se sugiere
caracterizar dicha población mediante el uso de distintos marcadores celulares.
A pesar de la población atípica CD19+/CD3+ que se encontró en bazo, ganglio
mesentérico y placas de Peyer, el análisis en la proporción de linfocitos T y B, TCD4 y
TCD8 en IEL y LP de intestino grueso e intestino delgado, no mostró cambios en
ninguno de los grupos, tanto controles como experimental.
El análisis de granulocitos (Gr1) estuvo basado en el trabajo de (de Heer, Hammad et
al. 2004), en el cual reporta una baja expresión de Gr1+ para los eosinófilos, mientras
que los neutrófilos presentan una mayor expresión de Gr1++ en la superficie celular.
En nuestro trabajo encontramos una pequeña proporción de granulocitos en bazo,
ganglio mesentérico y placas de Peyer, en todos los grupos (PBS, OVA, los grupos
positivos de alergia CT/OVA y el grupo experimental PCry/OVA), cabe mencionar, que
la proporción de granulocitos fue mayor en los grupos de CT/OVA y PCry/OVA en B,
GM y PP en comparacion con el grupo control PBS. Este resultado sugiere que la
inmunización de PCry/OVA este provocando algún tipo de inflamación a nivel
intestinal. El incremento de eosinófilos esta relacionado en los procesos alérgicos
intestinales, en los cuales actúan como mediadores para generar permeabilidad en las
células epiteliales del intestino, y como consecuencia hay perdida de iones, lo que
lleva a síntomas como la diarrea (Yu C.H. et al., 2001).
Para caracterizar mejor los efectos de PCry co-administrada con OVA a nivel
intestinal, sugerimos la evaluación de cortes histológicos en intestino delgado y grueso
para observar el infiltrado de mastocitos y eosinófilos, como lo reporta (Perrier C. et
al., 2009) en el cual observó la presencia de mastocitos en lámina propia en jejuno de
ratones sensibilizados en un modelo de alergia.
51
Se encontró un incremento en la población de linfocitos B que expresan IgE+ en B,
GM y PP, en el grupo control positivo de alergia (CT/OVA) y en el grupo PCry/OVA.
Mientras que el grupo control PBS y OVA mostraron un incremento mínimo en la
población de estas células. Lo que podría sugerir que la inmunización de PCry/OVA
esta provocando la producción de IgE. Como perspectivas de estos resultados,
sugerimos la evaluación de diferentes parámetros después del reto a los ratones,
como, la medición de temperatura rectal, síntomas como inmovilidad, erizamiento de la
piel, prurito o la medición de histamina.
Tras evaluar la respuesta en la población de linfocitos T, linfocitos B, Linfocitos TCD4,
TCD8, granulocitos (eosinófilos, neutrófilos) y linfocitos B que expresaban IgE, la
inmunización de PCry/OVA mostraba respuestas similares a las observadas en el
grupo control positivo de alergia CT/OVA, sugiriendo que la protoxina Cry1Ac co-
administrada con OVA pudiera estar provocando algunos sintomas caracteristicos de
la alergia.
El análisis de respuesta de anticuerpos específicos hacia una proteína en modelos de
alergia, es uno de los parámetros mas utilizados para evaluar efectos alergénicos de
una proteína a la que se induce sensibilización, en el presente trabajo nos encargamos
de evaluar la respuesta específica de anticuerpos anti-OVA y anti-PCry de las
subclases IgG1, IgG2a, IgA, IgM e IgE en suero y en lavados intestinales para poder
caracterizar si la inmunización de PCry/OVA induce respuestas alergénicas a nivel
sistémico y de mucosas.
Al analizar la respuesta de anticuerpos anti-OVA en suero, el grupo control positivo
(CT/OVA) mostró efecto adyuvante al encontrar altos niveles de IgA e IgM; también
se encontraron altos niveles de IgG1, y como era de esperarse mostró los niveles
más altos de IgE. En comparación con los niveles reportados por (Perrier C., et. al.,
2009) los niveles que nosotros encontramos fueron menores, sin embargo los niveles
de IgE son significativos con respecto a los grupos control negativo (PBS y OVA).
Al analizar la respuesta de anticuerpos especificos anti-OVA en suero, el grupo
inmunizado con PCry/OVA mostró niveles de IgA, IgM, IgG1, IgG2a e IgE similares a
los grupos control negativos (PBS y OVA). La protoxina no tuvo efecto adyuvante
hacia OVA; esto puede deberse a que nuestro esquema de inmunización fue largo y
puede estar provocando tolerancia hacia OVA. Los reportes en donde se ha
demostrado el efecto adyuvante de la protoxina han sido esquemas de inmunización
cortos (Vázquez et al., 1999ª, b, Moreno-Fierros et al. 2000, 2002, 2003). Otra causa
por la que no observamos efecto adyuvante de la protoxina Cry1Ac, fue debido a la
baja capacidad intrínseca de PCry1Ac que pudiera estar modulando las respuestas
Th1 y Th2, esto coincide con lo reportado por (Guimaraes V. D., 2008) en donde
52
utilizó un modelo de alergia en vías respiratorias con un control positivo de CT mas
extracto de proteína de cacahuate (PE) y como grupo experimental la Protoxina
Cry1Ab mas PE administrado por vía intranasal con las mismas dosis, no fue
detectado el efecto adyuvante mucosal de la Toxina Cry1Ab en donde ellos explican
que ambas proteínas tienen diferente modo de acción.
A pesar que no observamos efecto adyuvante de PCry1Ac, si observamos el efecto
inmunogénico al analizar la respuesta de anticuerpos específicos hacia PCry (IgG1,
IgG2a, IgA e IgM), en los cuales apreciamos diferencias significativas con respecto al
grupo de PBS.
El análisis de la respuesta de anticuerpos específicos anti-OVA en lavados de intestino
delgado, fue muy parecido a lo que encontramos en suero, mostrando el grupo
positivo de alergia (CT/OVA) altos niveles de IgG1 e IgA. Esto difiere al trabajo
reportado por (Snider et al.,1994) donde encontró de altos niveles de IgG1 e IgA en
intestino grueso. También para el grupo de CT/OVA se encontró un pequeño aumento
en los niveles de IgG2a en comparación al grupo PBS.
El grupo de PCry/OVA mostró niveles de anticuerpos específicos anti-OVA(IgG1,
IgG2a, IgA, IgM e IgE) similares a los controles negativos PBS y OVA. Nuevamente se
observó la falta de efecto adyuvante por parte de la protoxina Cry1Ac, sin embargo al
analizar la respuesta de anticuerpos específicos hacia PCry encontramos niveles
significativos de IgG1 e IgA, demostrando el efecto inmunogénico de PCry.
Tras evaluar la respuesta en intestino grueso, el grupo CT/OVA mostró altos niveles
IgG1 e IgM y un pequeño aumento de IgG2a, mostrando nuevamente el efecto
adyuvante de la CT, mientras que la respuesta de anticuerpos en el grupo de
PCry/OVA fue similar a la de los grupos negativos de PBS y OVA. La respuesta de
anticuerpos específicos anti-PCry en intestino grueso mostró altos niveles de IgG1 e
IgA. Debido a la falta del efecto adyuvante de la protoxina Cry1Ac hacia OVA, y para
caracterizar mejor los efectos de PCry se sugiere utilizar un esquema mas corto de
inmunización (tres dosis), como el que se ha empleado antes con inmunizaciones por
vía intranasal e intraperitoneal (Vazquez-Padrón et al 1999ª).
Otro importante marcador de respuestas, es la evaluación de perfiles de citocinas
tanto Th1 como Th2. El análisis de citocinas en suero del grupo CT/OVA mostró
niveles de citocinas del tipo Th1/Th2, esto concuerda con lo reportado por (Perrier C.,
et. al., 2009), quien reporta la producción de citocinas Th1 (INF-γ), Th2 (IL-4, IL-13) y
Treg (IL-10, IL-17) en el grupo de CT/OVA, sugiriendo que las reacciones alérgicas no
están limitadas a una producción de citocinas de tipo Th2. Hay reportes que afirman la
presencia de INF-γ en pacientes con alergia a los alimentos (Capobianco et al., 2008).
53
Siendo esta citocina la que se encontró en mayor concentración en los ratones
inmunizados con CT/OVA.
La inmunizacion de PCry/OVA indujo altos niveles de INF-γ en suero, la cual es una
citocina Th1. Para ampliar estos resultados y caracterizar mejor el perfil de citocinas
mediado por la co-administracion de PCry/OVA, se sugiere analizar la presencia de
ARNm mediante RT-PCR a nivel intestinal.
CONCLUSION
La inmunizacion de PCry/OVA pudiera estar provocando algunos sintomas
caracteristicos de la alergia debido a que provoca:
1) Incremento en la población de granulocitos (eosinófilos, neutrófilos) en B,
GM y PP, similar al observado en el grupo de CT/OVA.
2) Incremento en la población de linfocitos B/IgE+ en B, GM y PP, similar a lo
observado en el grupo control positivo CT/OVA.
3) El incremento de una población atípica CD3+/CD19+ en B, GM y PP, al
igual que el grupo control de alergia CT/OVA.
Sin embargo presenta caracteristicas de respuesta distintas a las inducidas con
CT/OVA como:
1) La respuesta de anticuerpos específicos anti-OVA en suero y lavados
intestinales, en el grupo PCry/OVA no mostró efecto adyuvante ya que lo
niveles de anticuerpos específicos anti-OVA (IgA, IgM, IgG2a) fueron similares
a los del grupo control PBS.
2) PCry/OVA induce altos niveles de INF-γ en suero comparado con el grupo
control PBS pero no presenta el patron elevado mezclado de citocinas que
induce CT.
Por lo tanto no podemos afirmar si la coadministracion de PCry/OVA por vía
intragastrica desarrolla respuestas alergicas a nivel intestinal, ya que en algunos
parametros la respuesta es parecida al grupo control positivo (CT/OVA) y en otros al
grupo control negativo (PBS).
54
3) Se estableció un modelo en ratones BALB/c, el cual nos ayudo a estudiar la
alergia intestinal hacia OVA de forma parecida a lo sucedido de manera natural
en el cual:
i) Las sensibilizaciones y retos fueron a través de la ruta intragastrica.
ii) En nuestro trabajo se analizaron parámetros que no habían sido
estudiados previamente, como la evaluación de los cambios en las
poblaciones linfocitos T, subpoblaciones T-CD4 y T-CD8, linfocitos B,
granulocitos (eosinófilos, neutrófilos) y linfocitos B/IgE+, en células de
bazo, tejido linfoide organizado y tejido linfoide difuso de intestino
delgado e intestino grueso.
iii) Se analizó la respuesta a nivel sistémico y mucoso de anticuerpos de la
subclases IgG1, IgG2a, IgA, IgM e IgE.
iv) Se analizó el perfil de citocinas en suero de las respuestas de tipo Th1
(INF-γ), Th2 (IL-4, IL-13) y Treg (IL-10).
55
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60
APENDICE I REACTIVOS.
Disolver en agua bidestilada y aforar a la cantidad correspondiente. Almacenar a 4°C.
Disolver en 80 ml, ajustar pH a 7.4 y aforar a 100 ml. Almacenar a 40 C Usar de 2 ml de amortiguador de lisis, incubar a T.A. por 7 minutos, adicionar 12 ml de PBS1X frío y centrifugar 5 min a 4°C a 1500 rpm.
Amortiguador de fosfatos-salina (PBS).
PBS 10X 1X 5X
NaCl 80 gr. 8 gr. 40 gr.
KCl 2 gr. 0.2 gr. 1 gr.
KH2PO4 2 gr. 0.15 gr. 5.75 gr.
Na2HPO4 11.46 gr. 0.2 gr. 1 gr.
H2O aforar a 100 ml.
PBS-Tween
1 litro de PBS 1x filtrado
Ajustar pH a 7.4
Agregar 500 μl de Tween 20
Almacenar a 4 °C.
Amortiguador de lisis para eritrocitos.
0.157 gr. Tris-HCl (0.01 M)
0.830 gr Cloruro de amonio
100 ml Agua destilada
61
Medio RPMI
Volumen
de reactivo.
100 ml.
200 ml.
300 ml.
500 ml.
RPMI 1.039 gr 2.078 gr. 3.117 gr. 5.119 gr
NaHCO3 0.2 gr. 0.4 gr. 0.6 gr. 1 gr.
Antibac 100x 1 ml. 2 ml. 3 ml. 5 ml.
Ajustar el pH a 7.3, disolver y aforar al volumen indicado con agua destilada.
RPMI-EDTA-DTT RPMI + 1.5 Mm EDTA + 1Mm DTT (0.015%)
RPMI
EDTA
DTT
50 ml. 0.028 gr. 0.0075 gr.
100 ml. 0.056 gr. 0.015 gr.
200 ml. 0.112 gr. 0.03 gr.
300 ml. 0.168 gr. 0.45 gr. EDTA Backer (PM 372.24) agregar 0.05 gr por cada 100 ml de medio RPMI EDTA Sigma (PM 292.2) agregar 0.043 gr por cada 100 ml de medio RPMI Dejar a temperatura ambiente.
Inhibidor de proteasas (PHMB).
Trizma base 150 Mm. 10 ml. 100 ml.
Ácido p-hidroximercúrico 0.1 M 0.3607 gr. 3.607 gr.
Trizma base 1.8 gr. 0.9 gr. 0.18 gr.
H2O. 100 ml 50 ml 10 ml
Guardar en alícuotas de 1.5 ml a -20°C.
62
RPMI-Colagenasa.
Concentración final 60 U/ml. agregar 20 ml. por cada intestino.
RPMI Colagenasa
50 ml. 0.006 gr.
100 ml. 0.010 gr.
200 ml. 0.026 gr.
300 ml. 0.039 gr.
NO ADICIONAR SUERO, YA QUE INACTIVA LA COLAGENASA.
Parafolmaldehido 1 %
Paraformaldehido (sigma) 1 gr.
PBS o agua destilada. 80 ml.
Calentar a 60° C con agitación, al alcanzar la temperatura adicionar unas gotas de NaOH al 1 M acuoso hasta que se disuelva el paraformaldehido y dejar enfriar. Ajustar el pH con HCL 1 N o NaOH según el caso hasta ajustar a pH 7.4 y aforar a 100 ml. Guardar a 4° C no usar después de 15 días de elaborado.
PBA (Solución de Albumina-azida de sodio)
Albumina de suero bovino 0.5 gr.
Azida de sodio. 0.01% (0.01 gr. en 100 ml de H2O).
Aforar a 100 ml de agua bidestilada.
Almacenar a 4 °C.
63
APENDICE II Preparación de anticuerpos.
Los anticuerpos se utilizaron a una dilución (1:100).
Tinción 1
Esta tinción se utilizó para analizar la población de granulocitos (eosinófilos y
neutrófilos), y para la población de linfocitos B que expresaban IgE :
-CD16/32
-IgE FITC
-Gr1 PE
-CD11c PECy5
-CD45 Cy5
Tinción 2
Esta tinción se utilizó para analizar la población de linfocitos T, B y linfocitos TCD4+ y
TCD8+:
-CD3 APC
-CD19 PE
-CD4 FITC
-CD8 PECy5
