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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD CIENCIAS QUÍMICAS MODALIDAD: INVESTIGACIÓN TEMA: DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE EXTRACTOS DE LAS HOJAS DE Mangifera indica L. TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO PARA OPTAR AL GRADO DE QUÍMICO Y FARMACÉÚTICO AUTORES KATHERINE JULIANA GUERRA GUAMÁN ANDRÉS JAVIER ROMÁN SALMERÓN TUTORA: DRA. CELESTE JACQUELINE CARRILLO TOMALÁ CO – TUTOR: ING. RAÚL DIAZ TORRES PHD GUAYAQUIL - ECUADOR 2016
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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUILFACULTAD CIENCIAS QUÍMICAS
MODALIDAD: INVESTIGACIÓN
TEMA: DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEEXTRACTOS DE LAS HOJAS DE Mangifera indica L.
TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIOPARA OPTAR AL GRADO DE QUÍMICO Y FARMACÉÚTICO
AUTORESKATHERINE JULIANA GUERRA GUAMÁN
ANDRÉS JAVIER ROMÁN SALMERÓN
TUTORA:DRA. CELESTE JACQUELINE CARRILLO TOMALÁ
CO – TUTOR:ING. RAÚL DIAZ TORRES PHD
GUAYAQUIL - ECUADOR
2016
I
APROBACIÓN DEL TUTOR
En calidad de tutora del Trabajo de Titulación, Certifico: Que he asesorado,
guiado y revisado el trabajo de titulación en la modalidad de investigación, cuyo
título es DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEEXTRACTOS DE LAS HOJAS DE Mangifera indica L., presentado por
KATHERINE JULIANA GUERRA GUAMÁN, con cédula de ciudadanía N°
0923568018, y ANDRÉS JAVIER ROMÁN SALMERÓN con cédula de
ciudadanía Nº 0914331517 previo a la obtención del título de Químico y
Farmacéutico.
Este trabajo ha sido aprobado en su totalidad y se adjunta el informe de
Antiplagio del programa URKUND. Lo Certifico.-
Guayaquil, Enero 2017
FIRMA TUTOR DE TESIS FIRMA CO-TUTOR DE TESIS
II
CERTIFICADO.
El plagio encontrado durante la revisión de Trabajo de Titulación
denominado: DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEEXTRACTOS DE LAS HOJAS DE Mangifera indica L., llevado a cabo por
Urkund, fue del 3%.
III
IV
CERTIFICADO DEL TRIBUNAL
El Tribunal de Sustentación del Trabajo de Titulación de la Srta. KATHERINE
JULIANA GUERRA GUAMÁN y el Sr. ANDRÉS JAVIER ROMÁN SALMERÓN,
después de ser examinado en su presentación, memoria científica y defensa
oral, da por aprobado el Trabajo de Titulación.
________________________
PRESIDENTE - MIEMBRO DEL TRIBUNAL
KATHERINE BUSTAMANTE LAURA VALDEZ
DOCENTE–MIEMBRO DEL TRIBUNAL DOCENTE–MIEMBRO DEL TRIBUNAL
ING. NANCY VIVAR CÁCERES
SECRETARIA ENCARGADA
V
CARTA DE AUTORIA DE TITULACIÓN
Guayaquil, 11 de Enero del 2017
Nosotros, KATHERINE JULIANA GUERRA GUAMÁN Y ANDRÉS JAVIER
ROMÁN SALMERÓN, autores de este trabajo declaramos ante las autoridades
de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Guayaquil, que la
responsabilidad del contenido de este TRABAJO DE TITULACIÓN, nos
corresponde a nosotros exclusivamente; y el patrimonio intelectual de la misma a
la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Guayaquil.
Declaro también es de nuestra autoría, que todo el material escrito, salvo el que
está debidamente referenciado en el texto. Además, ratificamos que este trabajo
no ha sido parcial ni totalmente presentado para la obtención de un título, ni en
una Universidad Nacional, ni una Extranjera.
KATHERINE JULIANA GUERRA GUAMÁN
C.I. 0923568018
ANDRÉS JAVIER ROMÁN SALMERÓN
C.I. 0914331517
VI
AGRADECIMIENTO
Agradecemos a DIOS, ser todopoderoso que nos dio la fuerza y Fe para poder
concluir con el presente trabajo, a nuestras familias por ayudarnos y siempre ser
un apoyo incondicional. A los docentes de la facultad de Ciencias Químicas por
brindarnos sus conocimientos que nos servirán para la vida profesional en
especial a nuestros tutores de tesis, quienes nos supieron guiar durante la
realización de esta investigación. A la cooperación de personas e instituciones
que ayudaron para la realización de este trabajo.
VII
ÍNDICE GENERAL
Página
CAPÍTULO I REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
1.1. Mangifera indica L.....................................................................................8
1.1.1. Composición química.............................................................................8
1.1.2. Propiedades bioactivas..........................................................................9
1.1.3. Variedades de Mangifera indica L........................................................10
1.2. Actividad antimicrobiana. ........................................................................12
1.2.1. Método de difusión...............................................................................12
1.2.2. Método de dilución...............................................................................13
1.3. Microorganismos ................. ..................................................................13
1.3.1. Staphylococcus....................................................................................14
1.3.2. Enterococcus .......................................................................................15
1.3.3. Escherichia ..........................................................................................16
1.3.4. Salmonella...........................................................................................18
1.3.5. Pseudomonas......................................................................................19
CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS.
2.1. Microorganismos ....................................................................................21
2.2. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria ...........................21
2.2.1. Preparación de las suspensiones microbianas. ...................................21
2.2.2. Preparación de las diluciones. ............................................................21
VIII
2.2.3. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y
Concentración Mínima Bactericida (CMB). ....................................................22
2.3. Evaluación de la actividad antimicrobiana por discos..............................22
2.4. Técnica de Kirby Bauer modificado.........................................................23
2.5. Operacionalización de las variables: conceptualización e indicadores....24
2.5.1. Conceptualización de la variable..........................................................24
2.6. Métodos estadísticos ..............................................................................25
CAPITULO III RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Actividad antimicrobiana .........................................................................27
3.2. Resultados de los halos de inhibición frente a los cinco microorganismos
estudiados. ....................................................................................................28
3.3. Concentración mínima inhibitoria y Concentración mínima bactericida. ..33
CONCLUSIONES..........................................................................................35
RECOMENDACIONES..................................................................................37
REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA. .................................................................38
ANEXOS .......................................................................................................46
Anexo A.........................................................................................................46
Anexo B.........................................................................................................52
Anexo C.........................................................................................................57
Anexo D.........................................................................................................60
IX
ÍNDICE DE GRÁFICOS
Página
Figura 1 .........................................................................................................58
Figura 2 .........................................................................................................58
Figura 3 .........................................................................................................59
Figura 4 .........................................................................................................59
Figura 5 .........................................................................................................60
Figura 6 .........................................................................................................61
Figura 7 .........................................................................................................61
Figura 8 .........................................................................................................62
Figura 9 .........................................................................................................62
Figura 10 .......................................................................................................62
X
ÍNDICE DE TABLAS
Página
Tabla I. ..........................................................................................................10
Tabla II. .........................................................................................................11
Tabla III. ........................................................................................................12
Tabla IV .........................................................................................................32
Tabla V ..........................................................................................................33
Tabla VI .........................................................................................................34
Tabla VII ........................................................................................................34
Tabla VIII .......................................................................................................46
Tabla IX .........................................................................................................47
Tabla X ..........................................................................................................48
Tabla XI .........................................................................................................49
Tabla XII ........................................................................................................50
Tabla XIII .......................................................................................................51
Tabla XIV.......................................................................................................52
Tabla XV........................................................................................................53
Tabla XVI.......................................................................................................54
Tabla XVII......................................................................................................55
Tabla XVIII.....................................................................................................56
XI
RESUMEN
Se evalúo la actividad antimicrobiana de extractos hidroalcohólicos de hojas
de Mangifera indica L (Tommy Atkins y Edward), que fueron obtenidos por
diferentes métodos de extracción (maceración, digestión y ultrasonido) con
diferentes concentraciones de alcohol (50 y 90%), mismos que tuvieron un alto
contenido de compuestos fenólicos.
Los extractos utilizados para estudiar la actividad antimicrobiana fueron
Tommy Atkins 90% obtenido por maceración, Tommy Atkins 50% obtenido por
digestión y Edward 50% obtenido por ultrasonido, evaluándose la actividad
antimicrobiana frente a cepas bacterianas ajustadas 0.5 en la escala Mc. Farland
(1.5 x 108 UFC/ml) de Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Staphylococcus
aureus (ATCC 29213), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Escherichia coli
(ATCC 25922) y Enterococcus faecalis (ATCC 29212), mediante los métodos de
Kirby Bauer (discos), Kirby Bauer modificado (pozos) y se determinó la
concentración mínima inhibitoria y concentración mínima bactericida. Estos
análisis se realizaron bajo condiciones de incubación de 37oC por 24 horas, en
ambiente aséptico. Cada extracto fue llevado a cinco concentraciones distintas
(10%, 25%, 50% ,75%, 100%). Se obtuvo inhibición frente a las cepas ya
mencionadas, existiendo mayor sensibilidad frente a P. aeruginosa (ATCC
27853), y S. aureus (ATCC 29213) en todos los análisis.
Palabras claves: Antimicrobiana, Mangifera indica, extractos, microorganismos.
XII
ABSTRACT
Antimicrobial activity of hydro alcoholic extract from Mangifera indica L.,
leaves was evaluated, which were obtained through different extraction methods
(maceration, digestion and ultrasound) with different alcohol concentrations (50 &
90 %), all of them had a high contents of phenolic compounds.
The extracts used to study the antimicrobial activity were Tommy Atkins 90%
obtained through maceration, Tommy Atkins 50% obtained through digestion y
Edward 50% obtained through ultrasound, evaluated antimicrobial activity against
adjusted bacterial strains 0.5 on Mc. Farland scale (1.5 x 108 UFC/ml) of
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Staphylococcus aureus (ATCC
29213), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Escherichia coli (ATCC 25922)
and Enterococcus faecalis (ATCC 29212), through Kirby Bauer method (discos),
Kirby Bauer modified (wells) and both, minimum inhibitory and minimum
bactericide concentrations were decided. These analysis were done under
incubation conditions of 37oC during 24 hours, on aseptic atmosphere. Each
extract was carried to five different concentrations (10%, 25%, 50%, 75% and
100%). Inhibition against the mentioned strains was obtained, showing more
sensitivity in front of P. aeruginosa (ATCC 27853), and S. aureus (ATCC 29213)
in all analysis.
Keys words: Antimicrobial, Mangifera indica, extracts, microorganisms
1
INTRODUCCIÓN
La necesidad de los consumidores por comestibles con menor cantidad de
aditivos sintéticos ha favorecido estudios sobre aditivos de origen vegetal que
puedan conservar la calidad de los alimentos por más tiempo. Se han
descubierto propiedades en especies de origen vegetal que retardan la
descomposición debido a la actividad antimicrobiana, estas especies contienen
compuestos fenólicos que poseen una amplia actividad antibacteriana, antiviral o
antifúngica pero sobretodo su importancia radica en que las bacterias no
generan resistencia contra ellos. (Cerón, Munguía, García & Santisteban, 2014).
Desde la antigüedad, las especies vegetales han sido utilizadas como
conservantes naturales con el fin de retardar el deterioro de los alimentos,
debido a las propiedades antimicrobianas y antioxidantes que estas poseen. En
los últimos años ha aumentado el interés de disminuir el uso de conservantes
químicos y reemplazarlos por extractos vegetales que aportan sus propiedades
beneficiosas al alimento y al consumidor. (López, 2013)
Ecuador con tan solo 0.17% de la superficie terrestre alberga la mayor
cantidad de fauna y flora por kilómetro cuadrado en comparación con el resto de
países del mundo convirtiéndolo en un ecosistema mega-diverso. (Montaluisa,
2011)
Dentro de esta flora se encuentra el mango, Mangifera indica L., que es una
fruta tropical proveniente de la India, pertenece a la familia Anacardiaceae, esta
especie aporta con antioxidantes, polifenoles, vitamina C, vitamina B5, entre
otros, lo que le confiere propiedades farmacológicas a las distintas partes del
árbol de mango, actividades como hipoglicemiantes, antimicrobianos, antivirales,
antinflamatorios, antioxidantes, antidiarreicos, antialérgicos, hipotensores,
2
hepatoprotectores y antitusivos. (Troncoso, Gajardo, Benites, López & Rojas,
2010)
Varios países han contribuido con estudios acerca de la actividad
antimicrobiana. En Chile se han realizado investigaciones a partir del extracto
hidroalcohólico de la cáscara del mango para realizar lociones con el fin de
combatir el acné debido a que este extracto posee metabolitos bioactivos. Se
realizó el estudio de la actividad antimicrobiana por el método de dilución,
demostrando ser seguro y estable, presentando actividad antimicrobiana
parecida a la del estándar utilizado, frente a los patógenos involucrados en el
acné. (Troncoso et al., 2010).
En Brasil se evaluó por el método de difusión en disco la actividad
antimicrobiana in vitro del extracto hidroalcohólico de las hojas de Mangifera
indica, el cual demostró poseer esta actividad frente al S. aureus,
proporcionando evidencia científica para su potencial uso terapéutico.
(Menesses & França, 2014).
En el 2015, en Ecuador, se realizó el estudio de la actividad antimicrobiana de
la corteza del árbol de Mangifera indica obteniendo resultados positivos, los
cuales sirvieron para la elaboración de una película comestible junto al
quitosano, esta solución demostró poseer un sinergismo en la propiedad
antibacteriana frente a microorganismos de interés sanitario como Salmonella
typhimurium, Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes.
(Ortiz, 2015).
En este trabajo se evalúa, empleando los métodos de difusión en agar y
concentración mínima inhibitoria, la actividad antimicrobiana de los extractos
3
hidroalcohólicos obtenidos por diferentes métodos de extracción (maceración,
digestión y ultrasonido) con diferentes concentraciones de etanol (50 y 90% v/v),
de las hojas de Mangifera indica L. de las variedades Tommy Atkins y Edward
frente a microorganismos de interés sanitario.
PROBLEMA.
¿Influirán el método de extracción, la concentración alcohólica y la variedad
de mango en la actividad antimicrobiana de los extractos hidroalcohólicos
seleccionados?
HIPÓTESIS.
El método de extracción, la concentración alcohólica y la variedad de mango
influyen en la actividad antimicrobiana de los extractos hidroalcohólicos
seleccionados.
OBJETIVO GENERAL.
Determinar la actividad antimicrobiana de extractos hidroalcohólicos de
las hojas de Mangifera indica L.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
Determinar la actividad antimicrobiana de los extractos hidroalcohólicos
de las hojas de Mangifera indica L por el método de difusión Kirby Bauer
modificado (pozos).
4
Evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos hidroalcohólicos de
las hojas de Mangifera indica L por el método de difusión Kirby Bauer
(discos).
Calcular la concentración mínima inhibitoria de los extractos
hidroalcohólicos de las hojas de Mangifera indica L por el método de
dilución en caldo infusión cerebro - corazón.
VARIABLES.
Dependientes.Halo de inhibición
Concentración mínima inhibitoria
Independientes.Método de extracción.
Concentración hidroalcohólica.
Variedad.
5
CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA.
Actualmente existe una gran demanda de alimentos listos para el consumo;
para elaborar estos alimentos y prolongar su periodo de vida se han utilizado
varias estrategias, una de ellas el uso de agentes antimicrobianos que pueden
ser tanto de origen sintético como vegetal. Los agentes de origen vegetal
comprenden extractos de plantas que poseen características beneficiosas para
el alimento.
Se han realizado diversos estudios alrededor del mundo evaluando la
actividad antimicrobiana de extractos vegetales. Un estudio desarrollado en
Argelia, África en el año 2015, evaluó la actividad antimicrobiana del extracto de
las hojas de Ficus carica, donde se mostró que posee actividad bactericida y
antifúngica moderada, empleándose el método de difusión en disco y el método
de macrodilución en caldo para determinar la concentración mínima inhibitoria
frente a cepas de Bacillus cereus y Staphylococcus aureus. (Mahmoudi, Khali,
Benkhaled, Benamirouche & Baiti, 2015).
En el año 2013, en México, con el fin de buscar alternativas para la
prevención de infecciones de tipo alimentario se determinó la actividad
antimicrobiana de extractos de las inflorescencias de palmas comestibles
(Astrocaryum mexicanum y Chamaedorea alternans) frente al Staphylococcus
aureus, Salmonella typhimurium y Bacillus cereus con resultados adversos ya
que los extractos etanólicos y hexánicos no presentaron actividad antimicrobiana
frente a estos patógenos. (Hidalgo, Espinoza, Mayo, Frias & Velásquez, 2013).
Otro trabajo fue realizado en México, en el año 2014 a los extractos
etanólicos del tallo de Euforbia antisyphilitica, especie vegetal utilizada en la
industria alimenticia, farmacéutica y cosmética. Este estudio demostró actividad
6
antimicrobiana frente a microorganismos como la Erwinia amylovora,
Clavibacter michiganensis y Xanthomonas axonopodis por el método de difusión
en agar en disco, siendo el Clavibacter michiganensis el más susceptible a estos
extractos. (Burboa, Ascacio, Zugasti, Rodríguez & Aguilar, 2014).
Otro estudio sobresaliente de actividad antimicrobiana se realizó a la especie
Cestrum buxifolium kunth en frutos y hojas frente a tres microorganismos
(Escherichia coli, Pseudomona aeruginosa y Staphylococcus aureus), por el
método de difusión en agar presentándose resultados positivos frente a
Escherichia coli y Pseudomona aeruginosa. (Corson, 2012)
En el Instituto Superior de Ciencias Médicas de la Habana, Cuba, en el año
2000, se investigó la actividad antimicrobiana de extractos etanólicos de hojas
de Eschinus terebinthifolius raddi (Copal), frente a cepas de Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Pseudomona aeruginosa y Candida albicans mediante
el método de difusión en agar, donde se demostró la actividad antimicrobiana en
concentraciones del 1% al 80% aumentando gradualmente respaldando así su
uso etnobotánico como antimicrobiano. (Martínez, López, Morejón & Rubalcaba,
2000).
En los países Sudamericanos también existen estudios alrededor de este
tema como por ejemplo en Colombia se investigó el efecto antioxidante y
antimicrobiano de extractos acuosos e hidroalcohólicos de Passiflora ligularis
(granadilla). La actividad antimicrobiana se analizó frente a bacterias como
Staphylococcus aureus y Escherichia coli, donde se observó la capacidad de
inhibir el crecimiento bacteriano utilizando el método de difusión en disco de
Kirby Bauer. (Cabrera, Sandoval & Forero, 2014).
7
En Chile se han llevado a cabo investigaciones referentes a la actividad
antimicrobiana de las plantas nativas de esa zona. Por ejemplo se trabajó con
las cáscaras de frutos del Oasis de Pica (Citrus reticulata, Mangifera indica,
Citrus cinensis, Psidium guajava, Citrus grandis y Citrus aurantifolia), la
actividad antimicrobiana fue estudiada por el método de difusión en agar y
dilución en caldo presentando una inhibición moderada frente a Staphylococcus
aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli y Salmonella typhimurium.
(Benitez, Díaz, López, Gajardo, Kusch & Rojas, 2011).
En Argentina se evaluó la actividad antimicrobiana de extractos alcohólicos de
hojas y cortezas de Polylepis australis Bitter (queñoa) frente a Staphylococcus
aureus y Pseudomona aeruginosa, donde se demostró una inhibición
moderada. (Daud, Habib & Sanchez, 2008).
En Venezuela se determinó la actividad antimicrobiana del extracto etanólico
de Aloe vera frente a Escherichia coli, Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus
aureus y Candida albicans, los resultados demostraron que el extracto utilizado
inhibe el crecimiento de estos patógenos demostrando así que el Aloe vera
posee efecto antimicrobiano. (Reyes & Fernández, 2014).
En Perú se investigaron los extractos metanólicos, etanólicos e
hidroalcohólicos de Cassia reticulata (planta entera), Ilex guayusa Loes (hojas),
Piper lineatum (hojas) y Terminaliam catappa (hojas) frente a Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomona aeruginosa, Escherichia coli y
hongos como Aspergillius niger, Candida albicans, y Microsporum canis,
empleando el método de difusión en agar obteniendo como resultados que los
microorganismos más susceptibles fueron Candida albicans (83%),
Staphylococcus aureus (67%), Staphylococcus epidermidis (67%) y Microsporum
canis (50%). (Ruiz & Roque, 2009).
8
Un estudio realizado en Ecuador fue la evaluación antimicrobiana del extracto
hidroalcohólico de la corteza de Mangifera indica frente a microorganismos de
interés sanitario (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella
typhimurium, Listeria monocytogenes), que tuvo como resultado que el extracto
hidroalcohólico al 90% presentó mayor inhibición frente a Staphylococcus
aureus, basándose en el método de difusión en agar de Kirby Bauer modificado
y dilución en caldo para determinar la concentración mínima inhibitoria. (Ortiz,
2015).
1.1. Mangifera indica L.
Conocido por su nombre común como Mango, es una fruta tropical originaria
de la India, siendo el país con mayor exportación de esta fruta. (Masefield,
Wallis, Harrison & Nicholson, 1980). Se trata de un árbol que pertenece a la
familia Anacardiaceas, puede llegar a medir alrededor de 15 metros; posee
hojas perennes estrechas de color verde oscuro formando una copa extendida,
flores amarillentas y corteza rugosa. El fruto mide de 5 a 15 cm de longitud y su
forma, color y tamaño depende de la variedad. (Alonso, 2004).
1.1.1. Composición química.
1.1.1.1. Hoja:
Ácido cuxantínico (45%), cuxantona, ácido hipúrico, ácido benzoico,
bufadienólidos, cardenólidos, esteroles insaturados, flavonoides (mangiferina,
kaempferol, quercetina, etc.) leucoantocianinas, antocianidinas (delfinidina,
petunidina, poconidina, cianidina), polifenoles, taninos gálicos y catequicos
(hasta 10%), taraxerona, taraxerol, friedelina, lupeol y b-sitosterol. (Alonso, 2004)
1.1.1.2. Corteza:
9
En el extracto acuoso de la corteza se han identificado una serie de
polifenoles, destacando: mangiferina, ácido benzoico, ácido 3,4-
dihidroxibenzoico, ácido benzoico propilester, ácido gálico, ácido gálico
metilester, ácido gálico propilester, catequina y epicatequina, etc. (Alonso, 2004).
1.1.1.3. Otras partes:
En la flor se ha identificado la presencia de aceite esencial (hasta 0.04%) y
benzenoides derivados del galacto y ácido gálico. En el fruto: ácidos volátiles
destacando el ácido 5-OH-7-decenoico (2 mg/k) y ácido 3-HO-octanoico (1,1
mg/k). También se hallaron saponinas triterpénicas: indicósidos A y B. (Alonso,
2004).
1.1.2. Propiedades bioactivas:Este árbol presenta numerosas propiedades bioactivas:
1.1.2.1. Actividad antimicrobiana:
El extracto acuoso de la hoja demostró tener este efecto frente a
microorganismos productores de periodontopatías. El extracto etanólico al 80%
de la corteza de mango no demostró esta actividad frente a bacterias como
Escherichia coli, Pseudomona aeruginosa y Bacillus subtilis, mientras que para
Staphylococcus aureus presento actividad débil. El extracto etanólico de la
semilla presento actividad inhibitoria mayor en bacterias Gram positivas en
relación a las Gram negativas. (Alonso, 2004).
1.1.2.2. Actividad antiinflamatoria-analgésica:
Esta propiedad se demostró mediante el test de edema plantar en ratas por
carragenina por vía subcutánea, frente a inductores de inflamación como el
dextrán y la bradiquinina utilizando el extracto alcohólico de la semilla de
10
Mangifera indica que actúa como antiinflamatorio a través de dos vías:
antibradiquinina y anti –dihidrotriptamina. (Alonso, 2004).
1.1.2.3. Actividad inmunológica:
El extracto hidroalcohólico de la corteza del mango presentó un aumento de
anticuerpos humorales en un estudio realizado en ratas. (Alonso, 2004).
Debido a la presencia de flavonoides, principalmente la mangiferina, el
extracto hidroalcohólico de las hojas del mango posee, además de las
propiedades mencionadas anteriormente, actividad antidiarreica y diurética
cuando se utilizan mediante una decocción (Alonso, 2004).
1.1.3. Variedades de Mangifera indica L.El mango ecuatoriano presenta diferentes tipos de variedades, entre las que hay:
1.1.3.1. Haden:
Es una de las más antiguas de Florida, originaria de la variedad Mulgoba. Su
fruto es de 14 cm de largo y de 600 g de peso con forma ovoide redondeada,
con fondo de color amarillo sobre un color rojizo. Su pulpa es jugosa casi sin
fibra con sabor ligeramente ácido y de buena calidad. (Fundación Mango
Ecuador, 2015).
Tabla I. “Descripción de la hoja de Mangifera indica variedad Haden”. (Coello,
Fernández & Galan, 2000)
Característica Expresión
Hoja joven Coloración antociánica Cobrizo
Hoja adulta
Longitud del limbo Corta
Anchura Estrecha
Forma Elíptico-lanceolada
11
Ondulación del margen Ausente
Forma de ápice Aguda
Forma de la base Atenuada
Longitud del peciolo Media
1.1.3.2. Tommy Atkins:
Originaria de la Florida, aparentemente de la variedad Haden, es una fruta de
13 cm de largo y bordea los 700 g de peso, similar al Haden con su forma ovoide
casi redonda presenta un color con base morado a rojizo, presenta una cascara
gruesa que resiste a los daños mecánicos. Posee una pulpa jugosa que carece
de fibra y un buen sabor. (Fundación Mango Ecuador, 2015).
Tabla II. “Descripción de la hoja de Mangifera indica L. variedad Tommy Atkins”.
(Coello, et al., 2000).
Característica Expresión
Hoja joven Coloración antociánica Cobrizo
Hoja adulta
Longitud del limbo Corta
Anchura Estrecha
Forma Lanceolada
Ondulación del margen Ausente
Forma de ápice Obtusa
Forma de la base Atenuada
Longitud del peciolo Media
1.1.3.3. Edward:
Es un árbol con tamaño mayor a los 10 metros de altura, con hojas planas
lanceoladas y rectas, su fruto pesa aproximadamente 600 g con forma oblonga
oval de 12 cm de largo y 8 cm de ancho, su cáscara es lisa de color amarillo
12
intenso con abundante tonalidades rojizas purpuras. Posee un sabor muy dulce.
(Soto, Avilan, Unai, Rodriguez & Ruiz, 2004).
Tabla III. “Descripción de la hoja de Mangifera indica L. variedad Edward”.
(Coello, et al., 2000).
Característica Expresión
Hoja joven Coloración antociánica Cobrizo
Hoja adulta
Longitud del limbo Larga
Anchura Media
Forma Lanceolada
Ondulación del margen Ausente
Forma de ápice Aguda
Forma de la base Atenuada
Longitud del peciolo Larga
1.2. Actividad antimicrobiana.
La actividad antimicrobiana es la capacidad que posee un extracto, en este
caso de origen vegetal, de inhibir el crecimiento de microorganismos; este
proceso se comprueba mediante un antibiograma, donde los resultados se dan
por el tamaño del halo de inhibición que se forma por la interacción del extracto
con el microorganismo en estudio.
La actividad antimicrobiana se analiza mediante dos métodos que se clasifican
en:
1.2.1. Método de difusión.Este procedimiento establece la relación que existe entre la concentración de
la sustancia que tiene la función de inhibir a un microorganismo, y el halo de
13
inhibición de crecimiento que se desarrolla en la superficie del medio de cultivo,
sembrado de manera homogénea con la cepa, depositando sobre el agar un
disco, el cual posee la sustancia inhibidora, o también realizando pozos de
tamaños estándar con cantidades conocidas de la sustancia inhibidora. (Stella &
Marín, 2009).
Los diámetros de los halos inhibición son expresados en mm (Picazo, 2000).
1.2.2. Método de dilución.
Este procedimiento es útil para determinar la concentración mínima inhibitoria
(CMI) y la concentración mínima bactericida (CMB). La CMI se define como la
concentración mínima de extracto o sustancia que es capaz de inhibir al
microorganismo de forma macroscópica, después de haber sido incubada por 24
horas. La CMB se define como la concentración de extracto vegetal que elimina
a más del 99,9% de los microorganismos después de un tiempo de incubación
de 24 horas. (Horna, Silva, Taboada & Ortiz, 2005).
Cuando este procedimiento se realiza con caldo, se usan tubos o microtubos
que van a contener concentraciones crecientes del extracto vegetal. La bacteria
se va a cultivar en los tubos y después de la incubación se podrá determinar la
concentración mínima inhibitoria. La desventaja de este método es la cantidad
de extracto vegetal que utiliza. (Stella & Marín, 2009).
1.3. Microorganismos.Los microorganismos son organismos no visibles a simple vista, están
presentes en todas las superficies, en el aire, en el agua, en los alimentos y en
todas las cavidades del cuerpo (Andino & Castillo, 2010).
14
Los microorganismos de interés sanitario se clasifican en dos tipos según la
función que ejercen sobre el alimento, los benéficos son aquellos que favorecen
al desarrollo de un producto alimenticio por ejemplo el yogurt; y los dañinos
aquellos que son capaces de modificar química y fìsicamente al alimento,
volviendolo no apto para el consumo. (Plasencia, 2015).
1.3.1. Staphylococcus.-
El género Staphylococcus, son cocos Gram positivos, su nombre se basa en
su apariencia microscópica, las células se encuentran ordenadas en forma de
racimos de uvas, esto se debe a la división celular en distintas formas. Sus
características comprenden al grupo de los aerobios facultativos, solo forman
citocromos en condiciones aeróbicas y es altamente resistente a la desecación.
(Schlegel & Zaborosch, 1997). Estos microorganismos, son el grupo más
peligrosos de los cocos piógenos. La infección causada por este grupo de
bacterias siempre va acompañada por grandes cantidades de pus. (Stuart, 2001)
La especie S. aureus, es un coco Gram positivo hemolítico beta catalasa
positivo, coagulasa positivo y fermenta el manitol. Los estafilococos producen
tres tipos de exotoxinas: enterotoxina estafilocócica, la toxina exfoliativa y la
toxina 1 de Síndrome de choque tóxico. La enterotoxina estafilocócica, se
denomina así, debido a que afecta las funciones del aparato digestivo. Los
genes de las enterotoxinas son portados por un número ilimitado de
bacteriófagos y se introducen a los estafilococos mediante conversión de fago.
Estas enterotoxinas no se inactivan cuando quedan expuestas a temperaturas
de 100 ºC durante 30 minutos, y resisten la acción de enzimas proteolíticas.
(Stuart, 2001)
15
Los indicios de intoxicación alimenticia causadas por Staphylococcus ocurren
desde la primera a la sexta hora tras la ingestión de un alimento rico en
proteínas (pasta rellena, ensalada de jamón, ensalada de pollo, carne enlatada)
infectado por una cepa de E. aureus productora de enterotoxina. Los alimentos
se contaminan fácilmente cuando las personas que los manipulan portan la
bacteria en la nariz y las manos y cuando su almacenamiento es de forma
incorrecta. El tratamiento para este tipo de intoxicación no requiere de
antibióticos, se recomienda mantener al paciente hidratado y vigilar su estado
electrolítico. (Stuart, 2001)
1.3.2. Enterococcus.-
En la antigüedad las especies enterocóccicas pertenecían al género
Streptococcus, hasta el año de 1984 donde Schleifer y Klipper-Balz publicaron
que debido a estudios de hibridación genética de ADN y ARN, estas especies
serian clasificadas a un nuevo género denominado Enterococcus. Las primeras
especies que pertenecieron a este género fueron E. faecalis y E. faecium. (Prats,
Prats, Jorge, Jawetz, Morse, Butel, & Singleton, 2013).
Estas bacterias presentan las siguientes características, poseen formas
esféricas u ovoides, su tamaño oscila de 0,6 – 2,0 um. Son cocos Gram
positivos, que no forman endosporas. Por lo general se presentan en forma de
pares o cadenas cortas y no poseen movilidad. Son anaerobios facultativos que
fermentan un amplio rango de carbohidratos, son catalasa negativa y fermentan
la lactosa. (Díaz, Rodríguez & Zhurbenko, 2010).
Los enterococos se localizan aproximadamente en todos los animales. En el
humano, son microbiota normal del tracto gastrointestinal, tracto genitourinario,
vías respiratorias superiores, cavidad oral, piel, vagina y uretra femenina.
16
También se hallan en las superficies del entorno ambiental, en el agua y en la
vegetación, esto se debe a la contaminación por heces de animales y en aguas
no tratadas. En el humano, la concentración de este microorganismo en las
heces es de 108 UFC/g. (Prats et all, 2013).
Enterococcus faecalis está relacionado directamente con gastroenteritis,
enfermedades respiratorias, conjuntivitis y dermatitis, entre otras. (Díaz, 2010).
El control de la calidad sanitaria de alimentos, sedimentos y aguas destinadas
al consumo humano, la agricultura, la industria y la recreación se lleva a cabo
mediante bacterias o grupos de ellas que actúan como indicadoras de
contaminación fecal. Enterococcus faecalis se encuentran dentro del grupo de
microorganismos indicadores de la inocuidad de los alimentos, debido a su
amplia distribución pueden encontrarse en estos productos, especialmente en
los de origen animal. Suelen considerarse buenos indicadores porque mueren
más lentamente que los coliformes, debido a que son muy resistentes a
condiciones adversas como congelación, desecación y como resultado
sobreviven más que éstos. (Díaz, 2010).
1.3.3. Escherichia.-
Su característica principal es su producto de la fermentación, se desarrollan
bajo condiciones anaeróbicas, obtienen la energía necesaria por fermentación y
excretan ácidos orgánicos, como por ejemplo el ácido fórmico. (Schlegel &
Zaborosch, 1997).
E. coli, forma parte de la microbiota intestinal normal de humanos y animales.
Cada gramo de heces humanas contiene hasta 108 microorganismos de esta
bacteria. Este microorganismo crece en medios de gran simplicidad, posee
17
movilidad y flagelos. Sobre el agar de eosina y azul de metileno forman un brillo
verdoso; hidroliza el triptófano para formar indol. (Stuart, 2001)
Existen cepas especiales de E. coli que ocasionan infecciones de vías
urinarias y otras que causan diarrea, estas cepas se clasifican como:
enterotoxigena (ETEC), enteropatógena (EPEC), enteropenetrante (EIEC) y
enterohemorrágica (EHEC). (Stuart, 2001).
La ETEC es la causa frecuente de diarrea acuosa en lactantes y la principal
causa de diarrea del viajero. Esta infección se adquiere al consumir alimentos o
agua contaminada con heces, los microorganismos ETEC colonizan el intestino
delgado donde se adhieren a la mucosa. (Stuart, 2001).
La EPEC ocasiona diarreas y epidemias entre lactantes, la mayoría de los
pacientes tienen 6 meses de edad o menos, la diarrea es acuosa y mucoide
aunque las heces no poseen sangre. (Stuart, 2001).
El ganado es la fuente principal de la EHEC. La diarrea provocada por estas
bacterias se debe al consumo de carne molida mal cocida que contiene niveles
altos de heces bovinas. (Stuart, 2001).
La EIEC este tipo de bacterias se une a la mucosa del colon cuando el
individuo ha ingerido agua o alimentos contaminados con heces, al principio da
lugar a diarrea acuosa y luego se detecta sangre y mucosidad en las heces.
(Stuart, 2001).
Dentro de los productos bacterianos que participan en la virulencia están:
18
Adhesinas.- son pilis o fimbrias que le permiten a la bacteria adherirse a las
mucosas por ejemplo las cepas EPEC que producen diarreas en los lactantes
por adherirse a la mucosa intestinal. (Stuart, 2001).
Enterotoxinas.- son toxinas proteicas que influyen en el funcionamiento del
aparato digestivo, existen enterotoxinas estables al calor y enterotoxinas lábiles
al calor, los síntomas que presenta el individuo que es infectado por este
microorganismo son diarreas profusas, acuosas y semejantes al cólera. (Stuart,
2001).
1.3.4. Salmonella.-
Son bacterias anaeróbicas, liberan ácidos orgánicos como producto de su
fermentación. (Schlegel & Zaborosch, 1997). Son un grupo muy extensos de
microrganismos entéricos que conforman cerca de 2200 serotipos, no fermentan
la lactosa, otra de sus características generales son negativos para indol y
positivo para la producción de ácido sulfhídrico. (Stuart, 2001).
Los serotipos typhi y paratyphi se diferencian del resto por su
comportamiento bioquímico por ejemplo, son negativos para citrato de Simmons,
descarboxilasa de ornitina, producción de gas a partir de glucosa, fermentación
de dulcitol, arabinosa, rhamnosa y mucinato; estos serotipos son importantes
porque son los principales causantes de casos de fiebre entérica. Los serotipos
responsables de la enteritis penetran la pared intestinal y producen enterotoxinas
que provocan nauseas, vómitos y diarrea. (Stuart, 2001).
En países como EEUU se reportan cerca de 50000 casos de enteritis por
Salmonella al año, esto se debe a que la Salmonella se disemina en la carne de
ave mal cocida que es consumida por los humanos o quienes manipulan estos
alimentos no lavan de manera adecuada sus manos o utensilios. (Stuart, 2001).
19
1.3.5. Pseudomonas.-
El género Pseudomonas, pertenece a la familia Pseudomonaceae, está
constituido por bacterias Gram negativas, las especies con mayor importancia en
patología médica son P. aeruginosa, P. mallei y P. Pseudomallei. La especie que
más se ha aislado es la P. aeruginosa y está asociada con la contaminación de
fuentes comunes como agua, antisépticos y equipos médicos. (Lebeque, Morris,
& Calás, 2006).
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria que presenta una amplia
distribución, aislándose de tierra, agua, plantas, animales y seres humanos.
Debido a la tolerancia que posee frente a condiciones físicas extremas se
comporta como un patógeno oportunista eficaz. Su función como patógeno
responsable de infecciones comunitarias y nosocomiales está plenamente
reconocida y resulta problemática la elección del antimicrobiano más adecuado.
Esto se debe a que posee una elevada resistencia intrínseca a múltiples
antibióticos y a una extraordinaria capacidad para adquirir nuevos mecanismos
de resistencia, principalmente por mutaciones. Por otra parte el Código
Alimentario Argentino considera a esta bacteria como un indicador de la calidad
microbiológica del agua destinada a consumo humano. (Lösch, Merino, &
Alonso, 2005).
P. aeruginosa es rara vez un miembro de la microbiota normal en seres
humanos. las tasas de colonización representativos para sitios específicos en los
seres humanos son de 0 a 2% para la piel, de 0 a 3,3% para la mucosa nasal, de
0 a 6,6% para la garganta, y 2,6 a 24% para las muestras fecales. (Lister, Wolter,
& Hanson, 2009).
20
Tiene una intensa actividad metabólica, degradando proteínas, grasas,
carbohidratos y otros sustratos, provocando cambios en las características
químicas y sensoriales de alimentos frescos, tanto de origen animal como
vegetal. La elevada presencia de este microorganismo en el procesamiento final,
reduce la vida útil de los productos refrigerados, esto se debe a la producción de
mucosidad en la superficie del alimento, así como los olores y sabores y, por
tanto, su estudio es de gran importancia para la industria alimenticia. (De Araújo,
Cantisani, De Miranda, Silva, Dos Praseres, Dos Prazeres & Dos Santos, 2009).
21
CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS.
2.1. Microorganismos.
Las cepas de Pseudomona aeruginosa (ATCC 27853), Staphylococcus aureus
(ATCC 29213), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Escherichia coli (ATCC
25922) y Enterococcus faecalis (ATCC 29212) fueron donadas por el Hospital
“Iborio Panchana” de la provincia de Santa Elena.
2.2. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria.
2.2.1. Preparación de las suspensiones microbianas.
Las cepas se hidrataron en caldo Infusión Cerebro Corazón (ICC), para luego
incubarse por 24 horas a 37°C en la incubadora marca Memmert del laboratorio
de docencia de Microbiología II de la Facultad de Ciencias Químicas, para su
reproducción en condiciones normales. Luego se sembraron en agares
selectivos dependiendo del microorganismo, incubándose por 24 horas a 37°C.
Posteriormente, se seleccionaron colonias aisladas suspendiéndolas en Caldo
ICC, incubándose nuevamente por 24 h a 37°C, después se ajustó la turbidez de
las mismas al patrón de 0,5% Mc Farland, equivalente a 1.5 x 108 UFC/mL.
(Reyes & Fernández, 2014).
2.2.2. Preparación de las diluciones.
A partir de los extractos obtenidos, se realizaron diferentes diluciones con Caldo
ICC. (Reyes & Fernández, 2014).
22
2.2.3. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) yConcentración Mínima Bactericida (CMB).
Se tomó una alícuota de 750 uL de la suspensión microbiana, ya ajustada (Mc
Farland), la cual se sembró en caldo ICC, para que interactúe con 2250 uL de la
dilución del extracto durante 48 h a 37ºC. Transcurrido el tiempo de exposición
de los microorganismos ya descritos, se procedió a inocular una alícuota de 50
uL de la suspensión microbiana con el extracto a diferentes concentraciones en
Agar ICC en placas de Petri, utilizando la técnica de siembra en superficie con
espátula de Drigalsky, además de inocular en tubos con 10 uL en caldo ICC,
empleando asa de inoculación calibrada. Se evaluó cuantitativamente el primero
a través del número de unidades formadoras de colonias (UFC) y
cualitativamente el segundo mediante la presencia de turbidez del medio,
estableciéndose para las cepas bacterianas la concentración mínima inhibitoria
(CMI) y la concentración mínima bactericida (CMB). (Reyes & Fernández, 2014).
2.3. Evaluación de la actividad antimicrobiana por discos.
El ensayo antimicrobiano se realizó utilizando el método de difusión en disco,
donde cada disco de papel estéril de 6,0 mm de diámetro se impregnó con el
extracto a diferentes concentraciones. Se utilizó como control positivo alcohol
etílico (50 μg.disco-1). El inóculo bacteriano se preparó por suspensión en caldo
infusión cerebro corazón incubándose por 24 h a 37 ºC. La suspensión se ajustó
por 0,5 Mc Farland escala estándar (1.5x10 8 UFC.mL-1) y se sembró en placas
de Petri que contienen agar Mueller-Hinton (AMH). En la superficie del agar,
después de la siembra del microorganismo se procedió a colocar los discos con
los extractos ya impregnados.
Las placas se incubaron a 37 °C durante 24 h. Después de llevar a cabo el
período de incubación se leyó el diámetro de los halos de inhibición completa de
crecimiento bacteriano, incluyendo el diámetro del disco. Los halos se midieron
23
en milímetros. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. (Menesses &
França, 2014).
2.4. Técnica de Kirby Bauer modificado.
La técnica de Kirby Bauer modificado consiste en el método de difusión en
pozos, donde en AMH se realizaron pozos de 5 mm para poder depositar la
dilución del extracto. Luego de tener las cepas ATCC se tomó un inóculo de
cada microorganismo y se lo sembró en 5 ml de caldo ICC, luego se incubó a
37ºC por 24 horas. Luego de incubar se preparó una suspensión microbiana
ajustada a la concentración 0,5 en la escala de Mc Farland (1.5x108 UFC/ml). La
suspensión ajustada se sembró en AMH en cajas Petri, para cada
microorganismo. Se incubó la placa a 37°C durante 24 horas. Luego del período
de incubación se realizó la lectura de los halos de inhibición (mm). Todos los
ensayos de actividad antimicrobiana se realizaron por triplicado. (Ortiz, 2015).
24
2.5. Operacionalización de las variables: conceptualización eindicadores
2.5.1. Conceptualización de la variable:
Halo de inhibición: área alrededor del disco o pozo en la cual no se observa
crecimiento bacteriano después de la incubación.
Concentración mínima inhibitoria: valor mínimo de la concentración capaz de
inhibir el crecimiento bacteriano después de la incubación.
Método de extracción: proceso que permite extraer los metabolitos de una
especie vegetal.
Concentración hidroalcohólica: grado de alcohol a la que se encuentra una
disolución.
Variedad: conjunto de plantas de un solo taxón botánico del rango más bajo
conocido
TEMA: DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEEXTRACTOS DE LAS HOJAS DE Mangifera indica L.
VARIABLES INDICADOR UNIDADES
Halo de inhibición Diámetro de inhibición mm
Concentración mínima
inhibitoria
Turbidez Ausencia/presencia
Método de extracción Técnica de extracción
utilizada
N/A
Concentración
hidroalcohólica.
Grado alcohólico %
Variedad Rango taxonómico N/A
25
2.6. Métodos estadísticos.
Se realizó el Análisis de Varianza (ANOVA) para evaluar los efectos de las
variables independientes sobre las variables dependientes. En caso de ser
necesario se realizó la Prueba de rangos múltiples de Duncan para establecer
las diferencias entre tratamientos. El paquete estadístico utilizado fue IBM SPSS
Statistics versión 22. El nivel de confianza utilizado fue del 95%.
27
CAPÍTULO III RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Actividad antimicrobiana
El árbol del mango (Mangifera indica L) crece en las regiones tropicales y
subtropicales del planeta y sus partes son ampliamente utilizadas en la
medicina ancestral para una gran variedad de remedios (Wauthoz, Balde, Balde,
Van Damme, & Duez, 2007). Para los extractos de mango se han reportado
numerosas propiedades bioactivas, entre ellas la actividad antimicrobiana
(Singh, Singh, Maharia, & Garg, 2015).
La actividad antimicrobiana de los extractos de origen vegetal no puede
atribuirse a la presencia de una sola molécula presente en el extracto, sino a la
acción de varios compuestos, principalmente los de carácter fenólico, que
ejercen efectos sinérgicos, formando un fitocomplejo activo en la inhibición
microbiana. (Sotelo y col., 2010).
Se ha reportado que la presencia de triterpenoides, flavonoides y taninos pueden
ser responsables de la actividad antimicrobiana. Sin embargo, en el caso del
mango, la presencia de la glucoxantona mangiferina parece ser responsable en
gran medida de esta actividad (Singh, Tiwari, Sinha, Danta, & Prasad, 2012),
pero debe considerarse que la composición de los extractos puede variar
cualitativa y cuantitativamente en función del método de extracción y el tipo de
solvente utilizado, en particular, de la polaridad del solvente.
La actividad antimicrobiana depende entonces del tipo de microorganismo que
se quiere combatir, del carácter hidrófilo o hidrófobo de los agentes activos y la
presencia de otros compuestos químicos presentes.
28
En este estudio se determinó la actividad antimicrobiana frente a las cepas
seleccionadas empleando el método de difusión Kirby Bauer modificado y el
método de difusión disco-placa. Se analizaron tres extractos, los cuales fueron
previamente seleccionados por poseer un alto contenido de compuestos
fenólicos determinados por el método Folin-Ciocalteu, los mismos fueron:
extracto hidroalcohólico de Tommy Atkins 90% obtenido por el método de
maceración, extracto hidroalcohólico de Tommy Atkins 50% obtenido por
digestión y extracto hidroalcohólico de Edward 50% obtenido por ultrasonido. Se
consideró trabajar con cinco diferentes concentraciones para cada extracto.
Estas pruebas se efectuaron por triplicado para obtener resultados fiables.
3.2. Resultados de los halos de inhibición (ver anexo A) frente a loscinco microorganismos estudiados.
Estos resultados fueron sometidos a un análisis de varianza, el cual mostró que
la interacción entre las diluciones y los tratamientos fue significativa, por lo cual
se compararon las 30 medias obtenidas para cada microorganismo. Estos
resultados se muestran en el Anexo B de las tablas XV a la XIX.
Como puede observarse, en todos los casos, existe una relación directamente
proporcional entre la dilución y el efecto antimicrobiano, tal como se muestra en
el Anexo C en las figuras 1 a 5.
Por otra parte, se observa claramente que los tratamientos donde se utiliza el
método de los discos, son menos sensibles a mostrar el efecto inhibitorio de los
extractos que aquellos donde se emplea el mismo extracto con el método de los
pozos. La razón de estos efectos puede deberse a que por el método de difusión
Kirby Bauer modificado, el extracto vegetal se encuentra en contacto directo con
el agar, mientras que con el método de difusión disco-placa se emplea un
29
vehículo que en este caso es el disco, este medio puede que absorba
metabolitos que ayudan a la inhibición del microorganismo y al momento de
reaccionar con el microorganismo, dichos metabolitos no puedan interactuar y
cumplir con su función.
Otro punto que puede provocar desventaja en el método de difusión disco-placa
se puede relacionar con el hecho de que como el extracto se debe impregnar en
el disco, este absorbe hasta cierto límite lo que provocaría que al momento de
colocar los discos sobre la superficie del agar con la cepa no se encuentre la
misma cantidad de extracto que se espera haber impregnado. Mientras que en el
caso del método de difusión Kirby Bauer modificado, el investigador conoce la
cantidad exacta de extracto que se coloca en cada pozo. Entonces al momento
de colocar el disco en la superficie del agar genera resultados con halos
menores que en relación a los pozos por desconocer la cantidad exacta de
extracto que contiene.
Al analizar los resultados de los tratamientos frente a cada microorganismo,
estos últimos pueden separarse en dos grupos. Las bacterias Enterococcus
faecalis y Staphylococcus aureus son Gram positivas, mientras que las
bacterias Pseudomona aeruginosa, Escherichia coli y Salmonella typhimurium
son Gram negativas. La resistencia de las bacterias Gram negativas se debe a
que la membrana externa de estas actúa como barrera para muchas sustancias,
incluidos los antibióticos (Daud et al., 2008). Si se comparan todos los halos de
inhibición, el mayor efecto inhibitorio fue el encontrado frente al Staphylococcus
aureus con el tratamiento T2, lo que significa una concentración hidroalcohólica
del 50 %. Esto se explica por tratarse de una bacteria Gram positiva, que posee
una estructura hidrófilica simple, que permite el paso de moléculas polares y por
tanto presenta menor resistencia en su barrera externa que las bacterias Gram
negativas.
30
Sin embargo para el Enterococcus faecalis, siendo una bacteria Gram positiva,
no se observan resultados similares, esto puede deberse a que su pared celular
es más compleja que la del Staphylococcus aureus, por la presencia de las beta-
lactamasas producidas por los enterococos de forma permanente, mientras que
Staphylococcus aureus lo hace de una forma inducible (Cercenado, 2011).
Por otra parte, los resultados que se obtuvieron demuestran que la bacteria
Pseudomona aeruginosa presenta mayor inhibición frente a extractos con
concentraciones del 90% (T1, T4), esto se explica debido a que este
microorganismo no presenta péptidoglicanos en su membrana a diferencia de las
otras dos bacterias Gram negativas estudiadas; los péptidoglicanos son los
encargados de otorgar rigidez a la pared celular. Los extractos etanólicos al
90%, podrían poseer compuestos polares en menor cantidad y compuestos no
polares en mayor cantidad, y por ello, a esta concentración las moléculas
pueden atravesar la membrana de las Gram negativas y ejercer el efecto
antimicrobiano. Cabe recalcar que existió actividad antimicrobiana frente a
Enterococcus faecalis, Salmonella typhimurium y Escherichia coli aunque
demostrando sensibilidad intermedia, de acuerdo a los criterios emitidos por la
Sociedad Latinoamericana de Fitomedicina en el documento “Técnicas de
comprobación de la actividad terapéutica de las plantas medicinales” donde se
indica que “Si el halo dio mayor a 9 mm, el resultado es positivo. Si el halo dio
entre 6-9 mm, la actividad se considera intermedia o moderada. Si el halo fue
inferior a 6 mm, se considera negativo (sin actividad).”, estos valores solo se
aplican para extractos vegetales.
Con todos los extractos aplicados al 100 % se encontraron valores de actividad
positiva o al menos intermedia o moderada. Por consiguiente se deduce que los
resultados presentados en el trabajo revelan que el extracto de Mangifera indica
L. presenta efecto antimicrobiano frente a los cinco microorganismos estudiados.
31
Si comparamos los mejores tratamientos entre sí, tal como se muestra en la
tabla IV, podemos observar que, de conjunto, los extractos más efectivos son los
obtenidos de la variedad Tommy Atkins, con una Concentración Hidroalcohólica
del 90 %, mediante el método de maceración.
Los resultados obtenidos en este trabajo demostraron que los extractos
vegetales estudiados inhiben a los microorganismos Staphylococcus aureus y
Pseudomona aeruginosa, pero tienen menor actividad antimicrobiana frente a
Enterococcus faecalis, Salmonella typhimurium y Escherichia coli. Estos
resultados coinciden con lo reportado en un trabajo anterior (Ortiz, 2015) donde
se emplearon extractos de Mangifera indica L obtenidos de la corteza de la
planta, pero solo parcialmente con los resultados de Meneses y Franca (2014)
quienes encontraron actividad antimicrobiana frente al Staphylococcus aureus,
pero no frente a las bacterias Gram negativas. Debe destacarse que en este
trabajo se empleó el método de los discos.
Otro trabajo reciente (da Silva, Liberio, do Amaral, do Nascimento, Torres, Neto,
& Guerra, 2016) muestra que los extractos etanólicos de las hojas de
Anacardium occidentale L. mostraron sistemáticamente poseer menor actividad
antimicrobiana que los extractos de flores y corteza, y en todos los casos, el
Staphylococcus aureus resultó más sensible que la Escherichia coli o el
Enterococcus faecalis, lo cual también concuerda con nuestros resultados.
Otros estudios (Daud, Habib, & Sánchez, 2008), han mostrado mayor
sensibilidad de la bacteria Staphylococcus aureus frente a extractos alcohólicos
que la presentada por Pseudomona aeruginosa. En ambas bacterias se
detectaron alteraciones en la estructura celular, incluso la desintegración de la
superficie celular que podría conducir a la muerte, en el caso de Staphylococcus
32
aureus y menores efectos estructurales en Pseudomonas aeruginosa. Estos
resultados podrían explicar las diferencias observadas en nuestro trabajo.
Tabla IV. “Comparación de los mejores tratamientos.”
Tratamiento Método ConcentraciónHidroalcohólica Variedad Diámetro
medio Microorganismo
T1 Pozo Maceración 90 TommyAtkins
12,667 P. aeruginosa12,000 S. aureus12,000 S. typhimurium11,333 E. faecalis11,000 E. coli
T2 Pozo Digestión 50 TommyAtkins
13,667 S. aureus10,667 P. aeruginosa10,000 E. coli9,667 S. typhimurium9,667 E. faecalis
T3 Pozo Ultrasonido 50 Edward
10,667 S. aureus9,667 P. aeruginosa8,333 E. faecalis8,000 S. typhimurium8,000 E. coli
T4 Disco Maceración 90 TommyAtkins
8,667 P. aeruginosa8,667 S. aureus8,333 S. typhimurium8,333 E. faecalis7,667 E. coli
T5 Disco Digestión 50 TommyAtkins
9,667 S. aureus9,000 P. aeruginosa8,667 S. typhimurium8,667 E. coli8,333 E. faecalis
T6 Disco Ultrasonido 50 Edward
9,333 S. aureus8,667 P. aeruginosa7,667 S. typhimurium7,667 E. faecalis7,333 E. coli
33
3.3. Concentración mínima inhibitoria y Concentración mínimabactericida.
Para la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) y la
concentración mínima bactericida (CMB) se realizaron diluciones del 5% al
100%, en secuencia de 5 en 5, para cada uno de los extractos ya antes
mencionados frente a los microorganismos seleccionados.
Como se observa en la tabla V, la bacteria que resulta más sensible frente al
extracto obtenido por maceración con la variedad Tommy Atkins con una
concentración hidroalcohólica del 90%, es Pseudomona aeruginosa para la cual
ocurre la inhibición con una dilución al 30 % y el efecto bactericida con una
dilución del 35%. Este resultado se explica debido a la ausencia de
péptidoglicanos en la pared celular, ya antes mencionada.
Tabla V. “Resultados de la concentración mínima inhibitoria y bactericida con el
extracto de maceración hidroalcohólico 90% de la variedad Tommy Atkins.”
Microorganismos CMI CMBPseudomona aeruginosa 30% 35%Staphylococcus aureus 35% 40%Salmonella typhimurium 40% 45%Enterococcus faecalis 55% 60%
Escherichia coli 55% 60%
Las tablas VI y VII permiten observar que con los extractos obtenido por
digestión con la variedad Tommy Atkins con una concentración hidroalcohólica
del 50%, y el obtenido por el método de ultrasonido con una concentración
hidroalcohólica de 50 % de la variedad Edward, la bacteria que presenta mayor
sensibilidad es Staphylococcus aureus.
34
Tabla VI. “Resultados de la concentración mínima inhibitoria y bactericida del
extracto de digestión hidroalcohólico 50% de la variedad Tommy Atkins.”
Microorganismos CMI CMBStaphylococcus aureus 35% 40%
Pseudomona aeruginosa 40% 45%Escherichia coli 50% 55%Salmonella typhi 55% 60%
Enterococcus faecalis 75% 80%
Tabla VII. “Resultados de la concentración mínima inhibitoria y bactericida del
extracto de ultrasonido hidroalcohólico 50 % de la variedad Edward.”
Microorganismos CMI CMBStaphylococcus aureus 45% 50%
Pseudomona aeruginosa 50% 55%Enterococcus faecalis 50% 55%
Salmonella typhi 65% 70%Escherichia coli 80% 85%
Como se observa en todos los casos, de las cepas bacterianas estudiadas, las
más sensibles frente a los extractos probados son Staphylococcus aureus y
Pseudomona aeruginosa. Debe destacarse que Staphylococcus aureus es Gram
positivo, y Pseudomona aeruginosa es Gram negativa, pero ambos
microorganismos son los que presentan una pared celular menos compleja, lo
que explica los resultados obtenidos.
Estos resultados concuerdan con los obtenidos al analizar la influencia del tipo
de extracto sobre los halos de inhibición donde se observó que el extracto
obtenido por el método de ultrasonido y concentración hidroalcohólica 50 % de la
variedad Edward, mostró menor capacidad antimicrobiana.
35
CONCLUSIONES.
Se demostró que los extractos de las hojas de Mangifera indica L. variedad
Tommy Atkins y Edward, poseen actividad antimicrobiana.
Se determinó la actividad antimicrobiana por el método de difusión Kirby Bauer
modificado (pozos), en el extracto obtenido por maceración con concentración
hidroalcohólica al 90% variedad Tommy Atkins, el microorganismo que presentó
mayor sensibilidad frente a este extracto fue Pseudomona aeruginosa con halos
de 12-13 mm, le sigue Staphylococcus aureus con halos de 12 mm. En el
extracto obtenido por digestión con concentración hidroalcohólica al 50%
variedad Tommy Atkins se registra que el microorganismo con mayor halo de
inhibición fue S. aureus (13-15 mm), y P. aeruginosa, fue la segunda bacteria
con halos de 10-13 mm. Con el extracto obtenido por ultrasonido con
concentración hidroalcohólica 50% variedad Edward, los halos fueron pequeños
en relación a los extractos anteriores pero S. aureus (10-12 mm) y P.
aeuroginosa (9-10 mm) son las bacterias con mejores halos de inhibición. Lo que
indica que el extracto vegetal de M. indica L., inhibe a las bacterias S. aureus y
P. aeruginosa.
Se evaluó la actividad antimicrobiana por el método de difusión Kirby Bauer
(discos). El extracto obtenido por maceración con concentración hidroalcohólica
al 90% variedad Tommy Atkins, P. aeruginosa (8-9 mm), y S. aureus (8-9 mm),
fueron las cepas con mejores resultados. El extracto obtenido por digestión con
concentración hidroalcohólica al 50% variedad Tommy Atkins los
microorganismos con mayor sensibilidad fueron S. aureus (9-10 mm), y P.
aeruginosa (9 mm), y por último el extracto obtenido por ultrasonido con
concentración hidroalcohólica 50% variedad Edward, los diámetros de halos para
S. aureus (9-10 mm) y P. aeruginosa (8-9 mm) fueron altos en relación a las
36
cepas de S. typhimurium, E. faecalis y E. coli, que presentaron halos pero sus
diámetros fueron pequeños en relación a las bacterias mencionadas.
Se calculó la concentración mínima inhibitoria y bactericida de los extractos
estudiados. Todas las cepas analizadas presentaron sensibilidad frente a los
mismos, siendo Staphylococcus aureus y Pseudomona aeruginosa las bacterias
más sensibles.
37
RECOMENDACIONES.
Se recomienda realizar un estudio similar, donde se analice la actividad
antimicrobiana frente a hongos y levaduras.
Se recomienda experimentar con variedades criollas de Mangifera indica
L., para realizar comparaciones con las variedades de exportación.
Otra recomendación es ensayar con otros órganos de la planta, como el
fruto o la raíz, para evaluar la actividad antimicrobiana.
38
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47
ANEXOS
Anexo A.Método Kirby Bauer modificado.Los resultados obtenidos por el método de difusión Kirby Bauer modificado
fueron:
Tabla VIII. “Resultados de los diámetros de los halos de inhibición con el extracto
hidroalcohólico 90% obtenido por maceración de la variedad Tommy Atkins.”
Dilución Microorganismos
Pseudomonaaeruginosa
Staphylococcusaureus
Salmonellatyphimurium
Escherichiacoli
Enterococcusfaecalis
10%5 mm 5 mm 5 mm 5 mm 5 mm5 mm 5 mm 5 mm 5 mm 5 mm5 mm 5 mm 5 mm 5 mm 5 mm
25%5 mm 7 mm 6 mm 5 mm 5 mm6 mm 7 mm 7 mm 5 mm 5 mm5 mm 6 mm 6 mm 5 mm 5 mm
50%7 mm 8 mm 6 mm 6 mm 8 mm7 mm 8 mm 7 mm 7 mm 8 mm7 mm 9 mm 6 mm 6 mm 9 mm
75%7 mm 10 mm 10 mm 9 mm 9 mm7 mm 10 mm 11 mm 8 mm 9 mm7 mm 9 mm 11 mm 8 mm 10 mm
100%13 mm 12 mm 14 mm 10 mm 12 mm12 mm 12 mm 11 mm 10 mm 10 mm13 mm 12 mm 11 mm 13 mm 12 mm
48
Tabla IX. “Resultados de los diámetros de los halos de inhibición con el extracto
hidroalcohólico 50% obtenido por digestión de la variedad Tommy Atkins.”
Dilución Microorganismos
Pseudomonaaeruginosa
Staphylococcusaureus
Salmonellatyphimurium
Escherichiacoli
Enterococcusfaecalis
10%5 mm 5 mm 7 mm 8 mm 5 mm5 mm 5 mm 8 mm 7 mm 5 mm5 mm 5 mm 7 mm 7 mm 5 mm
25%5 mm 5 mm 8 mm 8 mm 6 mm5 mm 5 mm 9 mm 8 mm 6 mm5 mm 5 mm 8 mm 8 mm 7 mm
50%6 mm 8 mm 8 mm 8 mm 8 mm6 mm 8 mm 8 mm 9 mm 8 mm6 mm 8 mm 9 mm 9 mm 7 mm
75%6 mm 12 mm 9 mm 9 mm 9 mm6 mm 12 mm 9 mm 9 mm 9 mm6 mm 13 mm 8 mm 9 mm 8 mm
100%12 mm 13 mm 10 mm 10 mm 10 mm10 mm 15 mm 9 mm 10 mm 9 mm10 mm 13 mm 10 mm 10 mm 10 mm
49
Tabla X. “Resultados de los diámetros de los halos de inhibición con el extracto
hidroalcohólico 50% obtenido por ultrasonido de la variedad Edward.”
Dilución Microorganismos
Pseudomonaaeruginosa
Staphylococcusaureus
Salmonellatyphimurium
Escherichiacoli
Enterococcusfaecalis
10%5 mm 5 mm 5 mm 5 mm 5 mm5 mm 5 mm 5 mm 5 mm 5 mm5 mm 5 mm 5 mm 5 mm 5 mm
25%7 mm 7 mm 7 mm 7 mm 7 mm7 mm 7 mm 6 mm 6 mm 7 mm7 mm 7 mm 7 mm 7 mm 7 mm
50%8 mm 8 mm 8 mm 8 mm 7 mm7 mm 7 mm 7 mm 7 mm 7 mm7 mm 8 mm 8 mm 7 mm 7 mm
75%8 mm 9 mm 8 mm 7 mm 8 mm9 mm 8 mm 8 mm 8 mm 8 mm9 mm 9 mm 8 mm 8 mm 8 mm
100%9 mm 10 mm 8 mm 8 mm 8 mm10 mm 10 mm 8 mm 8 mm 9 mm10 mm 12 mm 8 mm 8 mm 8 mm
50
Método de difusión disco-placa.Por el método de difusión disco-placa los resultados fueron los siguientes:
Tabla XI. “Resultados de los diámetros de los halos de inhibición con el extracto
hidroalcohólico 90% obtenido por maceración de la variedad Tommy Atkins.”
Dilución Microorganismos
Pseudomonaaeruginosa
Staphylococcusaureus
Salmonellatyphimurium
Escherichiacoli
Enterococcusfaecalis
10%5 mm 5 mm 5 mm 5 mm 5 mm5 mm 5 mm 5 mm 5 mm 5 mm5 mm 5 mm 5 mm 5 mm 5 mm
25%8 mm 7 mm 7 mm 7 mm 8 mm8 mm 8 mm 7 mm 7 mm 8 mm7 mm 7 mm 7 mm 7 mm 8 mm
50%8 mm 8 mm 7 mm 7 mm 8 mm8 mm 8 mm 8 mm 7 mm 8 mm8 mm 7 mm 7 mm 7 mm 8 mm
75%8 mm 8 mm 8 mm 7 mm 8 mm8 mm 8 mm 8 mm 8 mm 8 mm9 mm 8 mm 7 mm 7 mm 8 mm
100%9 mm 9 mm 9 mm 7 mm 9 mm9 mm 9 mm 8 mm 8 mm 8 mm8 mm 8 mm 8 mm 8 mm 8 mm
51
Tabla XII. “Resultados de los diámetros de los halos de inhibición con el extracto
hidroalcohólico 50 % obtenido por digestión de la variedad Tommy Atkins.”
Dilución Microorganismos
Pseudomonaaeruginosa
Staphylococcusaureus
Salmonellatyphimurium
Escherichiacoli
Enterococcusfaecalis
10%5 mm 7 mm 8 mm 8 mm 7 mm5 mm 7 mm 8 mm 7 mm 7 mm5 mm 7 mm 8 mm 8 mm 6 mm
25%7 mm 8 mm 9 mm 8 mm 7 mm7 mm 8 mm 8 mm 8 mm 8 mm7 mm 8 mm 8 mm 8 mm 8 mm
50%8 mm 8 mm 8 mm 8 mm 8 mm8 mm 9 mm 8 mm 8 mm 9 mm7 mm 8 mm 9 mm 8 mm 8 mm
75%7 mm 8 mm 9 mm 8 mm 8 mm8 mm 8 mm 8 mm 8 mm 8 mm8 mm 9 mm 8 mm 9 mm 9 mm
100%9 mm 9 mm 9 mm 8 mm 8 mm9 mm 10 mm 8 mm 9 mm 9 mm9 mm 10 mm 9 mm 9 mm 8 mm
52
Tabla XIII. “Resultados de los diámetros de los halos de inhibición con el extracto
hidroalcohólico 50% obtenido por ultrasonido de la variedad Edward.”
Dilución Microorganismos
Pseudomonaaeruginosa
Staphylococcusaureus
Salmonellatyphimurium
Escherichiacoli
Enterococcusfaecalis
10%5 mm 5 mm 5 mm 5 mm 5 mm5 mm 5 mm 5 mm 5 mm 5 mm5 mm 5 mm 5 mm 5 mm 6 mm
25%7 mm 6 mm 7 mm 6 mm 7 mm7 mm 6 mm 7 mm 6 mm 7 mm7 mm 6 mm 7 mm 5 mm 7 mm
50%7 mm 8 mm 8 mm 7 mm 7 mm8 mm 7 mm 7 mm 7 mm 7 mm8 mm 7 mm 7 mm 7 mm 7 mm
75%8 mm 8 mm 7 mm 8 mm 8 mm8 mm 8 mm 8 mm 7 mm 7 mm9 mm 8 mm 8 mm 7 mm 7 mm
100%9 mm 9 mm 7 mm 7 mm 7 mm9 mm 9 mm 8 mm 8 mm 8 mm8 mm 10 mm 8 mm 7 mm 8 mm
53
Anexo B.
Tabla XIV. “Análisis de varianza Tratamiento x Diluciones de Pseudomona
aeruginosa”
Variable dependiente: Pseudomona aeruginosa
TRATAMIENTO DILUCIONES Media Errorestándar
Intervalo de confianzaal 95%
Límiteinferior
Límitesuperior
T1 10 5,000 a ,251 4,498 5,502T2 10 5,000 a ,251 4,498 5,502T2 25 5,000 a ,251 4,498 5,502T3 10 5,000 a ,251 4,498 5,502T4 10 5,000 a ,251 4,498 5,502T5 10 5,000 a ,251 4,498 5,502T6 10 5,000 a ,251 4,498 5,502T1 25 5,333 a ,251 4,831 5,835T2 50 6,000 ab ,251 5,498 6,502T2 75 6,000 ab ,251 5,498 6,502T1 50 7,000 bc ,251 6,498 7,502T1 75 7,000 bc ,251 6,498 7,502T3 25 7,000 bc ,251 6,498 7,502T5 25 7,000 bc ,251 6,498 7,502T6 25 7,000 bc ,251 6,498 7,502T3 50 7,333 bcd ,251 6,831 7,835T4 25 7,667 bcde ,251 7,165 8,169T5 50 7,667 bcde ,251 7,165 8,169T5 75 7,667 bcde ,251 7,165 8,169T6 50 7,667 bcde ,251 7,165 8,169T4 50 8,000 bcdef ,251 7,498 8,502T4 75 8,333 def ,251 7,831 8,835T6 75 8,333 def ,251 7,831 8,835T3 75 8,667 efg ,251 8,165 9,169T4 100 8,667 efg ,251 8,165 9,169T6 100 8,667 efg ,251 8,165 9,169T5 100 9,000 fg ,251 8,498 9,502T3 100 9,667 gh ,251 9,165 10,169T2 100 10,667 h ,251 10,165 11,169T1 100 12,667 i ,251 12,165 13,169
54
Tabla XV. “Análisis de varianza Tratamiento x Diluciones de Staphylococcus
aureus”
Variable dependiente: Staphylococcus aureus
TRATAMIENTO DILUCIONES MediaError
estándar
Intervalo de confianzaal 95%
Límiteinferior
Límitesuperior
T1 10 5,000 a ,285 4,429 5,571T2 10 5,000 a ,285 4,429 5,571T2 25 5,000 a ,285 4,429 5,571T3 10 5,000 a ,285 4,429 5,571T4 10 5,000 a ,285 4,429 5,571T6 10 5,000 a ,285 4,429 5,571T6 25 6,000 ab ,285 5,429 6,571T1 25 6,667 bc ,285 6,096 7,238T3 25 7,000 bcd ,285 6,429 7,571T5 10 7,000 bcd ,285 6,429 7,571T4 25 7,333 cde ,285 6,762 7,904T6 50 7,333 cde ,285 6,762 7,904T3 50 7,667 cdef ,285 7,096 8,238T4 50 7,667 cdef ,285 7,096 8,238T2 50 8,000 defg ,285 7,429 8,571T4 75 8,000 defg ,285 7,429 8,571T5 25 8,000 defg ,285 7,429 8,571T6 75 8,000 defg ,285 7,429 8,571T1 50 8,333 efgh ,285 7,762 8,904T5 50 8,333 efgh ,285 7,762 8,904T5 75 8,333 efgh ,285 7,762 8,904T3 75 8,667 fghi ,285 8,096 9,238T4 100 8,667 fghi ,285 8,096 9,238T6 100 9,333 hij ,285 8,762 9,904T1 75 9,667 ijk ,285 9,096 10,238T5 100 9,667 ijk ,285 9,096 10,238T3 100 10,667 kl ,285 10,096 11,238T1 100 12,000 mn ,285 11,429 12,571T2 75 12,333 mnñ ,285 11,762 12,904T2 100 13,667 ñ ,285 13,096 14,238
55
Tabla XVI. “Análisis de varianza Tratamiento x Diluciones de Salmonella
typhimurium”
Variable dependiente: Salmonella typhimurium
TRATAMIENTO DILUCIONES MediaError
estándar
Intervalo de confianzaal 95%
Límiteinferior
Límitesuperior
T1 10 5,000 a ,328 4,344 5,656T3 10 5,000 a ,328 4,344 5,656T4 10 5,000 a ,328 4,344 5,656T6 10 5,000 a ,328 4,344 5,656T1 25 6,333 b ,328 5,678 6,989T1 50 6,333 b ,328 5,678 6,989T3 25 6,667 bc ,328 6,011 7,322T4 25 7,000 bcd ,328 6,344 7,656T6 25 7,000 bcd ,328 6,344 7,656T2 10 7,333 bcde ,328 6,678 7,989T4 50 7,333 bcde ,328 6,678 7,989T6 50 7,333 bcde ,328 6,678 7,989T3 50 7,667 cdef ,328 7,011 8,322T4 75 7,667 cdef ,328 7,011 8,322T6 75 7,667 cdef ,328 7,011 8,322T6 100 7,667 cdef ,328 7,011 8,322T3 75 8,000 defg ,328 7,344 8,656T3 100 8,000 defg ,328 7,344 8,656T5 10 8,000 defg ,328 7,344 8,656T2 25 8,333 efgh ,328 7,678 8,989T2 50 8,333 efgh ,328 7,678 8,989T4 100 8,333 efgh ,328 7,678 8,989T5 25 8,333 efgh ,328 7,678 8,989T5 50 8,333 efgh ,328 7,678 8,989T5 75 8,333 efgh ,328 7,678 8,989T2 75 8,667 fghi ,328 8,011 9,322T5 100 8,667 fghi ,328 8,011 9,322T2 100 9,667 ij ,328 9,011 10,322T1 75 10,667 jk ,328 10,011 11,322T1 100 12,000 l ,328 11,344 12,656
56
Tabla XVII. “Análisis de varianza Tratamiento x Diluciones de Escherichia coli”
Variable dependiente: Escherichia coli
TRATAMIENTO DILUCIONES MediaError
estándar
Intervalo deconfianza al 95%
Límiteinferior
Límitesuperior
T1 10 5,000 a ,298 4,404 5,596T1 25 5,000 a ,298 4,404 5,596T3 10 5,000 a ,298 4,404 5,596T4 10 5,000 a ,298 4,404 5,596T6 10 5,000 a ,298 4,404 5,596T6 25 5,667 ab ,298 5,070 6,263T1 50 6,333 bc ,298 5,737 6,930T3 25 6,667 bcd ,298 6,070 7,263T4 25 7,000 cde ,298 6,404 7,596T4 50 7,000 cde ,298 6,404 7,596T6 50 7,000 cde ,298 6,404 7,596T2 10 7,333 cdef ,298 6,737 7,930T3 50 7,333 cdef ,298 6,737 7,930T4 75 7,333 cdef ,298 6,737 7,930T6 75 7,333 cdef ,298 6,737 7,930T6 100 7,333 cdef ,298 6,737 7,930T3 75 7,667 defg ,298 7,070 8,263T4 100 7,667 defg ,298 7,070 8,263T5 10 7,667 defg ,298 7,070 8,263T2 25 8,000 efgh ,298 7,404 8,596T3 100 8,000 efgh ,298 7,404 8,596T5 25 8,000 efgh ,298 7,404 8,596T5 50 8,000 efgh ,298 7,404 8,596T1 75 8,333 fghi ,298 7,737 8,930T5 75 8,333 fghi ,298 7,737 8,930T2 50 8,667 ghij ,298 8,070 9,263T5 100 8,667 ghij ,298 8,070 9,263T2 75 9,000 hijk ,298 8,404 9,596T2 100 10,000 kl ,298 9,404 10,596T1 100 11,000 l ,298 10,404 11,596
57
Tabla XVIII. “Análisis de varianza Tratamiento x Diluciones de Enterococcus
faecalis”
Variable dependiente: Enterococcus faecalis
TRATAMIENTO DILUCIONES MediaError
estándar
Intervalo deconfianza al 95%
Límiteinferior
Límitesuperior
T1 10 5,000 a ,272 4,456 5,544T1 25 5,000 a ,272 4,456 5,544T2 10 5,000 a ,272 4,456 5,544T3 10 5,000 a ,272 4,456 5,544T4 10 5,000 a ,272 4,456 5,544T6 10 5,333 ab ,272 4,789 5,878T2 25 6,333 bc ,272 5,789 6,878T5 10 6,667 cd ,272 6,122 7,211T3 25 7,000 cde ,272 6,456 7,544T3 50 7,000 cde ,272 6,456 7,544T6 25 7,000 cde ,272 6,456 7,544T6 50 7,000 cde ,272 6,456 7,544T6 75 7,333 cdef ,272 6,789 7,878T2 50 7,667 defg ,272 7,122 8,211T5 25 7,667 defg ,272 7,122 8,211T6 100 7,667 defg ,272 7,122 8,211T3 75 8,000 efgh ,272 7,456 8,544T4 25 8,000 efgh ,272 7,456 8,544T4 50 8,000 efgh ,272 7,456 8,544T4 75 8,000 efgh ,272 7,456 8,544T1 50 8,333 fghi ,272 7,789 8,878T3 100 8,333 fghi ,272 7,789 8,878T4 100 8,333 fghi ,272 7,789 8,878T5 50 8,333 fghi ,272 7,789 8,878T5 75 8,333 fghi ,272 7,789 8,878T5 100 8,333 fghi ,272 7,789 8,878T2 75 8,667 ghij ,272 8,122 9,211T1 75 9,333 ijk ,272 8,789 9,878T2 100 9,667 jkl ,272 9,122 10,211T1 100 11,333 m ,272 10,789 11,878
58
Anexo C.
Figura 1. Medias marginales estimadas de Pseudomona aeruginosa.
Figura 2. Medias marginales estimadas de Staphylococcus aureus.
59
Figura 3. Medias marginales estimadas de Salmonella typhimurium.
Figura 4. Medias marginales estimadas de Escherichia coli.
60
Figura 5. Medias marginales estimadas de Enterococcus faecalis.
61
Anexo D.
Figura 6. “Método Kirby Bauer (discos).”
Figura 7. “Método Kirby Bauer modificado (pozos).”
62
Figura 8. “Halos de inhibición para S. typhimurium con extracto de digestión al
75%.”
Figura 9. “Preparación de diluciones para la determinación de la Concentración
Mínima Inhibitoria.”
Figura 10. “Resultados de la Concentración Mínima Inhibitoria”
![Burrerias 0184 [por jediskater 2014]](https://static.fdocuments.ec/doc/165x107/579057581a28ab900c9d0091/burrerias-0184-por-jediskater-2014.jpg)
