UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS...
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UNIVERSIDAD DEGUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA DE QUÍMICA Y FARMACIA SEMESTRAL TEMA: VALIDACIÓN DE MÉTODO ANALÍTICO A pH 6.8 PARA LA CUANTIFICACIÓN DE LOSARTAN INCORPORADO A SISTEMA DE LIBERACIÓN PROLONGADO TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO PARA OPTAR POR EL GRADO DE QUIMICO Y FARMACÉUTICO AUTOR GARCIA ROMERO TATIANA BELEN TUTOR FERNANDA KOLENYAK DOS SANTOS PhD. GUAYAQUIL – ECUADOR 2018
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UNIVERSIDAD DEGUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICASCARRERA DE QUÍMICA Y FARMACIA
SEMESTRAL
TEMA:
VALIDACIÓN DE MÉTODO ANALÍTICO A pH 6.8 PARA LACUANTIFICACIÓN DE LOSARTAN INCORPORADO A SISTEMA DELIBERACIÓN PROLONGADO
TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIOPARA OPTAR POR EL GRADO DE QUIMICO Y FARMACÉUTICO
AUTOR
GARCIA ROMERO TATIANA BELEN
TUTOR
FERNANDA KOLENYAK DOS SANTOS PhD.
GUAYAQUIL – ECUADOR
2018
I
II
III
IV
V
AGRADECIMIENTO
En primer lugar, agradezco a Dios por darme fuerzas y vida para seguiradelante con la carrera, a mi madre ya que gracias a ella y su esfuerzo tuvelas posibilidades para continuar con mis estudios; a mis hermanos por confiaren mí y ofrecerme siempre su ayuda para todo lo que necesité.
Le doy gracias a mi pareja por demostrarme que siempre se puedenconseguir las metas que uno se propone, sin necesidad de dar excusas ydecir no puedo.
Agradezco también de todo corazón a mi tutora por ayudarme tanto en mítesis y apoyarme en cada detalle que conllevó realizarla.
VI
DEDICATORIA
Este trabajo de titulación lo dedico especialmente a mi hija, para demostrarleque siempre se podrá conseguir lo que uno se propone solo debepermanecer fuerte.
A mi madre que con tanto esfuerzo hizo todo lo que estuvo a su alcance paradarme una muy buena educación estando sola a cargo de todos nosotros.
A mi papá quien no creyó en mí, jamás pensó en que podría graduarme, estetrabajo espero le demuestre que todo lo contrario y que le agradezco por noser parte de nuestra educación.
VII
ÍNDICE DE ABREVIATURAS
MEs: Microemulsiones
HA: Hipertensión arterial
pH: Potencial de hidrogeno
HPLC: Cromatografía liquida de alta eficiencia
UV: Ultravioleta
LOD: Límite de detección
LOQ: Límite de cuantificación
DS: Diclofenaco sódico
UV-DAD: Detector UV con arreglo de diodos
IC: Insuficiencia cardiaca
AVE: Accidente vascular encefálico
AIT: Accidente isquémico transitorio
SRA: Sistema renina-angiotensina
Ang I: Angiotensina I
Ang II: Angiotensina II
NO: Óxido nítrico
ECA: Enzima de conversión de la Angiotensina
LC-MS / MS: Cromatografía líquida-espectrometría de masas
VIII
Índice de ContenidoAprobación del tutor.....................................¡Error! Marcador no definido.Certificado del tribunal .................................¡Error! Marcador no definido.Certificación del tutor revisor ....................... ¡Error! Marcador no definido.Agradecimiento...........................................................................................VDedicatoria ................................................................................................ VIÍndice de abreviaturas ..............................................................................VIIÍndice de tablas...........................................................................................XÍndice de figuras ........................................................................................XIÍndice de anexos.......................................................................................XIIResumen .................................................................................................XIIIAbstract .................................................................................................. XIVIntroducción ................................................................................................ 1Capítulo I .................................................................................................... 4
I.1 Formulación del problema.................................................................. 4I.2 Hipótesis ............................................................................................ 4I.3 Planteamiento del problema............................................................... 5I.4 Justificación e importancia ................................................................. 7I.5 Objetivos ............................................................................................ 8
I.5.1 Objetivo general .......................................................................... 8I.5.2 Objetivo especifico ...................................................................... 8
I.6 Tipo De Investigación Y Técnica........................................................ 8I.7 Técnica De Recogida De La Información........................................... 8I.8 Variables ............................................................................................ 9
I.8.1 Variable Dependiente .................................................................. 9I.8.2 Variable Independiente................................................................ 9I.8.3 Variable interviniente ................................................................... 9
I.9 Operacionalización de las variables. .................................................. 9CapÍtulo II ................................................................................................. 10
II.1 Antecedentes .................................................................................. 10II.2 Marco Teórico ................................................................................. 13
IX
II. 2.1 La hipertensión ........................................................................ 13II.2.2 Validación de métodos analíticos ............................................. 19
CapÍtulo III ................................................................................................ 28Materiales y métodos ............................................................................ 28
III.1 Materiales ................................................................................... 28III.2 Metodología empleada ............................................................... 30
Resultados................................................................................................ 34Preparación de las Microemulsiones................................................. 34Validación de la metodología analítica .............................................. 35Linealidad .......................................................................................... 35Precisión............................................................................................ 36Especificidad ..................................................................................... 38Robustez ........................................................................................... 39Exactitud............................................................................................ 40Límite de detección: .......................................................................... 41Límite de cuantificación: .................................................................... 42
Conclusión................................................................................................ 43Recomendaciones .................................................................................... 44Bibliografía................................................................................................ 45Glosario .................................................................................................... 51Anexos...................................................................................................... 53
X
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I......................................................................................................... 9
Tabla II...................................................................................................... 36
Tabla III..................................................................................................... 37
Tabla IV .................................................................................................... 40
Tabla V ..................................................................................................... 41
XI
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Cascada Renina-Angiotensina ................................................... 14
Figura 2 Estructura Química del Losartán ................................................ 16
Figura 3 Formación de microemulsiones.................................................. 34
Figura 4 Curva analítica del losartán ........................................................ 35
Figura 5 Curva de Especificidad ............................................................... 38
XII
ÍNDICE DE ANEXOS
Ilustración 1 Estándar del losartán............................................................ 53
Ilustración 2 Micropipeta Labnet ............................................................... 53
Ilustración 3 Solución madre y solución Buffer ......................................... 53
Ilustración 4 Espectrofotómetro UV Shimadzu ......................................... 53
Ilustración 5 Dilución 70 ul ........................................................................ 54
Ilustración 6 Balanza gramera .................................................................. 54
XIII
FACULTAD: CIENCIAS QUÍMICASCARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA
UNIDAD DE TITULACIÓN
“VALIDACIÓN DE MÉTODO ANALÍTICO A pH 6.8 PARA LACUANTIFICACIÓN DE LOSARTAN INCORPORADO A SISTEMA DELIBERACIÓN PROLONGADO”
Autor: Tatiana Belén García Romero
Tutor: Fernanda Kolenyak Dos Santos PhD.
RESUMENEl losartán es un fármaco antihipertensivo que ejerce su acción mediante elbloqueo de los receptores de angiotensina II. Es considerado como fármacode elección para el tratamiento de la hipertensión, por esta razón, estápresente en el Cuadro Básico de Medicamentos de Ecuador. A pesar de serrecomendado por los médicos, el losartán presenta algunos problemas quelimitan su uso, por ejemplo, la tolerancia al fármaco con el uso prolongado.Una alternativa empleada para mejorar las limitaciones del losartán es eldesarrollo de sistemas nanoestructurados para la liberación prolongada.Dentro de esta clase de sistemas se encuentran las microemulsiones (MEs),que son termodinámicamente estables y utilizados para la liberaciónprolongada del fármacos, que en un futuro puede ser empleado comonuevos medicamentos. Para la cuantificación de la concentración y el perfilde disolución de los medicamentos desarrollados con las MEs, es necesariovalidar un método analítico que garantice la confiabilidad de los resultados.El objetivo del presente proyecto fue validar un método analítico a pH 6.8para la cuantificación de losartán incorporado a sistema de liberaciónprolongado. Todos los resultados obtenidos en la presente investigacióncumplen con lo recomendado por la USP 39 e ICH (2005). Con losresultados presentados se demostró que es posible validar un método paralos ensayos de disolución y para los sistemas de liberación prolongada dellosartán incorporado a microemulsiones.
Palabras claves: hipertensión, losartán, microemulsión, validación demetodología analítica.
XIV
FACULTAD: CIENCIAS QUÍMICASCARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA
UNIDAD DE TITULACIÓN
“VALIDATION OF ANALYTICAL METHOD AT pH 6.8 FOR THEQUANTIFICATION OF THEARTART INCORPORATED TO PROLONGEDRELEASE SYSTEM”
Author: Tatiana Belén García Romero
Advisor: Fernanda Kolenyak Dos Santos PhD
ABSTRACT
Losartan is an antihypertensive drug that exerts its action by blockingangiotensin II receptors. It is considered the drug of choice for the treatmentof hypertension. For this reason, it is present in the Basic Table of Medicinesof Ecuador. Despite being highly recommended by doctors, losartan presentssome problems that limit its use, for example, tolerance to the drug withprolonged use, a alternative used to improve the limitations of losartan is thedevelopment of nanostructured systems for the release prolonged using akeind class of systems are microemulsions (MEs), which arethermodynamically stable and used for the prolonged release of drugs, whichin the future can be used as new medicines. For the quantification of theconcentration and the dissolution profile of the drugs development with theMEs, it is necessary to validate an analytical method that guarantees thereliability of the results. The objective of the present project was to validate ananalytical method at pH 6.8 for the quantification of losartan incorporated to aprolonged release system. All the results obtained in the present investigationcomply with the recommendations of USP 39 and ICH (2005). With theresults presented it was demonstrated that it is possible to validate a methodfor the dissolution tests and for the prolonged release systems of losartanincorporated to microemulsions.
Keywords: hypertension, losartan, microemulsion, validation of analyticalmethodology.
1
INTRODUCCIÓN
La hipertensión arterial (HA) es una enfermedad causada por los altos
niveles de sal en la sangre, y también es considerado el factor de riesgo
comúnmente detectado en pacientes que desarrollan insuficiencia cardíaca
(Tagle, 2018; Longo et al, 2011). El losartán sal de potasio, es un fármaco
antihipertensivo, no péptido, antagonista de los receptores de angiotensina II
que ejerce su acción mediante bloqueo específico de estos receptores.
Este fármaco presenta un efecto progresivo y de larga duración como
antihipertensivo, convirtiéndose en una alternativa en el tratamiento de
enfermedades crónicas, como la hipertensión (presión arterial elevada),
disminuyendo el riesgo de accidente cerebrovascular, evitando el
estrechamiento de los vasos sanguíneos y disminuye la presión de la sangre,
mejorando aún más el flujo sanguíneo. A pesar de ser recomendado por los
médicos, el losartán presenta algunos problemas que limitan su uso. (Peng
et al, 2018)
Con el objetivo de mejorar las limitaciones del uso del losartán, nuevas
tecnologías han sido desarrolladas como las microemulsiones, que son
sistemas termodinámicamente estables y utilizados para la liberación
prolongada de fármacos. (Nozaki et al, 2018)
2
Los sistemas de liberación prolongada de los fármacos han sido
investigados con frecuencia con el objetivo de mejorar las propiedades
fisicoquímicas de fármacos, tales como: la baja solubilidad en agua, y como
consecuencia la baja biodisponibilidad en los medios biológicos, dosis de
medicamentos, además estos sistemas pueden reducir problemas con la
toxicidad de fármacos y también actúan como transportadores que pueden
direccionar el fármaco hacia una diana. (Jung, et al, 2012)
Los sistemas de liberación de fármacos carecen de métodos validados
para su cuantificación. Para determinar la dosis de un fármaco en el interior
de la matriz lipídica es de gran importancia los estudios de eficiencia de
encapsulación y en el caso de tabletas, se realiza el perfil de disolución.
(Ballesta, 2015)
El perfil de disolución es definido como el método in vitro aceptado para la
determinación de la intercambiabilidad entre un medicamento de patente y
un medicamento genérico. La absorción de un fármaco desde una forma de
dosificación sólida tras la administración oral depende de la liberación de la
sustancia medicinal del producto medicinal, la disolución o solubilización del
fármaco bajo condiciones fisiológicas y la permeabilidad por el sistema
gastrointestinal. (Jung, et al, 2012)
Para cuantificar el losartán dentro de la matriz de las MEs y realizar los
estudios de disolución de las tabletas desarrolladas, es necesario la
validación de un método analítico. La validación de un procedimiento
analítico es un proceso realizado, empleando estudios de laboratorio, con la
3
finalidad de establecer parámetros de procedimientos que cumplan con los
requisitos de aplicaciones analíticas previstas. (USP, 39)
Considerando lo expuesto anteriormente, en el presente proyecto se
validó un método analítico para cuantificación del losartán incorporado a MEs
y cristales líquidos. La validación de la metodología analítica fue realizada
según los parámetros descritos por la USP 39 y el ICH (2005); exactitud,
precisión, repetibilidad, precisión intermedia, reproducibilidad límite de
detección, límite de cuantificación, linealidad, intervalo, especificidad,
robustez; demostrando así que los protocolos realizados pueden ser
reproducibles con resultados exactos y aceptables. (ICH, 2005)
4
CAPÍTULO I
I.1 Formulación del problema
¿El método analítico será eficaz para la cuantificación del losartán
incorporado a microemulsiones?
I.2 Hipótesis
El método analítico es eficaz para la cuantificación del losartán
incorporado a microemulsiones.
5
I.3 Planteamiento del problema
El losartán al ser un fármaco antihipertensivo presente en el Cuadro
Básico de Medicamentos del Ecuador, lo que indica que es el más prescrito
por los médicos. Esto puede generar problemas como la tolerancia durante el
uso prolongado. Una alternativa tecnológica para mejorar los problemas del
losartán es el desarrollo de nuevos sistemas de liberación prolongada como
las microemulsiones.
Los sistemas de liberación prolongada de los fármacos han sido
investigados con el objetivo de mejorar las propiedades fisicoquímicas de los
fármacos, tales como: la baja solubilidad en agua, como consecuencia la
baja biodisponibilidad en los medios biológicos, disminución del número de
ingestas y dosis de medicamentos, además estos sistemas pueden reducir
problemas con la toxicidad de fármacos y también actúan como
transportadores que pueden direccionar el fármaco hacia una diana.
Las microemulsiones (MEs), son sistemas isotrópicos, que poseen una
estabilidad termodinámica y están compuestas por agua, aceite que son
estabilizados por tensoactivos. Una característica importante para las MEs es
la facilidad de preparación, ya que estos sistemas no se requieren de una
gran cantidad de energía para su formación.
Varios estudios han reportado que las MEs contribuyen en el transporte
de fármacos lipofílicos e hidrofílicos, ya que favorece la capacidad de
6
solubilización de estos. Pero para cuantificar la concentración de fármaco
incorporado a MEs o evaluar el perfil de disolución de tabletas, es necesario
validar procedimientos que cumplan con las exigencias vigentes y que sean
eficaces para esta finalidad. En la actualidad no existen protocolos
disponibles en la literatura relacionados con el tema expuesto.
.
7
I.4 Justificación e importancia
Los sistemas de liberación prolongados carecen de métodos validados para
la cuantificación de fármacos en el interior de la matriz. Este parámetro es
importante, ya que permite conocer la dosis real de fármaco incorporado a
una matriz nanoestructurada y con eso avanzar hasta una posible forma
farmacéutica. Para evaluar esta dosis con precisión es necesario validar un
método analítico que sea eficaz para esta finalidad. Hasta el presente, la
ciencia ha reportado diversos trabajos que validan metodología analítica
empleando técnicas cromatográficas, por ejemplo, el uso de cromatografía
líquida de alta eficiencia (HPLC).
Debido a la escasez de equipos cromatográficos avanzados en instituciones
o empresas se propone como método alternativo la validación de método por
espectroscopia ultravioleta (UV-Vis).
8
I.5 Objetivos
I.5.1 Objetivo general
Validar un método analítico a pH 6.8 para la cuantificación de losartán
incorporado a sistema de liberación prolongado
I.5.2 Objetivo especifico
Desarrollar la metodología analítica por espectroscopia ultravioleta
visible (UV-Vis).
Establecer los parámetros de la validación de la metodología analítica.
Validar el método para la cuantificación de perfil de disolución de
losartán incorporado a microemulsiones.
I.6 Tipo De Investigación Y Técnica
El presente trabajo de titulación es de tipo investigativo con un enfoque
cuantitativo y con un diseño deductivo.
I.7 Técnica De Recogida De La Información
La recolección de información se la realizará mediante ensayos de
laboratorio dentro de la matriz de las MEs.
9
I.8 Variables
I.8.1 Variable Dependiente
Validación de métodos analíticos a pH 6.8
I.8.2 Variable Independiente
Concentración del losartán
I.8.3 Variable interviniente
pH del medio
I.9 Operacionalización de las variables.
Tabla I
Operacionalización de variables
VARIABLE CONCEPTUALIZACIÓN INDICADOR INSTRUMENTO
Validaciónde método
Es el proceso que seestablece, medianteestudios en laboratorio
Dilución UV-Vis
Losartán Es un fármacoantihipertensivo, nopéptido, antagonista de losreceptores deangiotensina II
Presencia/ausencia Concentración
pH Son los múltiples alelos deun gen entre unapoblación.
6.8 Variación
10
CAPÍTULO II
II.1 Antecedentes
El desarrollo de las tecnologías ha avanzado en la última década como lo
indica el autor Yuji Mano (2018) quien realizó un estudio de validación de
métodos por cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC, por su sigla en
inglés) y un estudio de validación cruzada entre laboratorios del ensayo del
lenvatinib que es un medicamento para el tratamiento de ciertos tipos de
cáncer de tiroides en plasma humano utilizando LC-MS/MS; se abordaron
temas sobre los métodos de ensayo desarrollado en cada laboratorio, siendo
validado con éxito con los parámetros dentro de los criterios de aceptación
recomendados por las farmacopeas.
La investigación antes mencionada está relacionada con este trabajo de
titulación debido a que nos muestra que los parámetros a utilizar en la
validación de métodos analíticos fueron validados con éxito y los criterios de
aceptación son recomendados y fácilmente reproducibles y se pueden
comparar a través de otros resultados de laboratorios.
tuwfeeq alquadeib, B (2018) quien desarrollo y validó un nuevo método
analítico de HPLC para la determinación de diclofenaco en tabletas, se
abordó temas acerca de métodos validados para cumplir con los requisitos
de la de la norma ICH (2005). Esta validación consideró parámetros como
especificidad, linealidad, límite de detección (LOD), límite de cuantificación
(LOQ), precisión, exactitud y robustez. En la investigación se indica que se
11
han informado varias técnicas analíticas para la cuantificación de diclofenaco
sódico (DS) en diferentes matrices. La detección por cromatografía líquida a
alta presión (HPLC) es el método más utilizado para la determinación de
diclofenaco sódico.
Este estudio especifica cómo debe estructurarse la metodología a cumplir
para la validación de métodos analíticos debido a que es el método más
utilizado para la determinación de en muestras biológicas o formas de
dosificación.
En esta misma línea de investigación y consulta se encontró el trabajo de
grado, titulado “Validación de la metodología analítica de paracetamol y
aplicación a un estudio de Bioexención” presentado en el año 2014 por
Francisco Javier Gaete Castro ante la Unidad de Práctica Tutorial; en la
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile,
como requisito para optar el título de Químico Farmacéutico.
La validación de la metodología analítica de paracetamol tuvo como
principal objetivo demostrar similitud de comportamiento farmacocinético
entre un medicamento genérico o similar en comparación con el
medicamento de referencia o innovador. Estos análisis se realizaron
mediante cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) acoplada a detector
UV-DAD (detector UV con arreglo de diodos). La obtención de los perfiles de
disolución y su posterior análisis estadístico fue realizada determinando el
porcentaje de principio activo liberado en cada tiempo de muestreo.
12
Este trabajo de grado ayudó en la comprensión de los procesos de
análisis mediante la utilización de un espectrofotómetro UV-Vis, ya que la
detección del principio activo no suele mostrar señal o lectura en una
muestra mal preparada, dando los resultados como falsos positivos o no
cumplen con los parámetros establecidos en las normas regulatorias ya
establecidas.
13
II.2 Marco Teórico
II. 2.1 La hipertensión
La hipertensión arterial (HA) es una enfermedad causada por los altos
niveles de sal en la sangre y también considerada el factor de riesgo
comúnmente detectado en pacientes que desarrollan insuficiencia cardíaca
(Tagle, 2018; Longo et al, 2011). Está asociada con comorbilidades tales
como diabetes mellitus, coronariopatía, insuficiencia cardiaca (IC) crónica.
Esta enfermedad presenta algunos factores de riesgo, tales como, accidente
vascular encefálico (AVE), accidente isquémico transitorio (AIT), enfermedad
vascular periférica, insuficiencia renal crónica, infarto de miocardio, IC y
aneurisma arterial (Sánchez, Ayala, Baglivo, & Velázquez, 2010). La
fisiopatología de la HA está relacionada con el sistema Renina-Angiotensina-
Aldosterona. (Vítovec et al., 2018).
El sistema renina-angiotensina (SRA) es un elemento importante de los
mecanismos interrelacionados que regulan la hemodinámica y el equilibrio de
agua y electrolitos. Los factores que activan el sistema son: la disminución de
la velocidad del sedimento, la presión de perfusión renal o de concentración
de sodio en plasma. (Camin, 2015)
La renina es una proteasa aspártica sintetizada como un zimógeno
inactivo convirtiéndose en un precursor enzimático inactivo producida en las
células granulares del aparato yuxtaglomerular renal a partir de un precursor,
la prorrenina. Actúa sobre su sustrato, el angiotensinógeno, glucoproteína de
14
452 aminoácidos, de la familia de las alfa-2-globulinas, sintetizada en el
hígado, y lo transforma en el decapéptido denominado Angiotensina I (Ang I).
Los estímulos principales de secreción de renina son:
1) La disminución de flujo de la arteria aferente del glomérulo renal;
2) La disminución de Na+ plasmático (sensada por la mácula densa, que
es parte del aparato yuxtaglomerular renal);
3) Estímulos simpáticos (estimulación beta-1- adrenérgica de las células
yuxtaglomerulares);
4) Factores locales como las prostaglandinas, la dopamina, la adenosina,
y el óxido nítrico (NO). (Jiménez, 2017)
La Angiotensina I es transformada en Angiotensina II (Ang II), octapéptido,
por medio de una enzima dipeptidil-carboxipeptidasa ubicada en la
membrana de las células endoteliales, llamada enzima de conversión de la
Angiotensina (ECA). (Jiménez, 2017) como se ilustra en la Figura 1
Figura 1 Cascada Renina-Angiotensina
15
La Angiotensina II es un péptido excitador del simpático con efectos en
diferentes focos que incluyen el hipotálamo y el bulbo, la médula espinal, los
ganglios simpáticos, y las terminaciones nerviosas. Además, la Angiotensina
II inhibe a función barorrefleja. A nivel central genera efectos sobre la presión
arterial. (Cerezo, & Muñiz, 2013)
La angiotensina II estimula la secreción de aldosterona por las glándulas
suprarrenales, por lo cual, al bloquear el receptor AT1, ocurre la reducción de
las resistencias vasculares sin producir cambios significativos de la
frecuencia cardíaca. (Cerezo, & Muñiz, 2013)
El losartán sal de potasio, es un fármaco antihipertensivo, no péptido de
formula molecular C22H23ClN6O (Figura 2) antagonista de los receptores de
angiotensina II y ejerce su acción mediante bloqueo específico de estos
receptores. Presenta un efecto progresivo y de larga duración como
antihipertensivo, convirtiéndose en una alternativa en el tratamiento de
enfermedades crónicas, como la hipertensión (presión arterial elevada),
disminuyendo el riesgo de accidente cerebrovascular, evitando el
estrechamiento de los vasos sanguíneos y disminuye la presión de la sangre,
mejorando aún más el flujo sanguíneo. Se puede utilizar como un agente de
tratamiento de primera línea para la hipertensión no complicada, la hipertrofia
ventricular izquierda y la hipertensión sistólica aislada. (Peng et al, 2018)
16
Figura 2 Estructura Química del Losartán
El losartán y su metabolito activo de larga duración E-3174 (metabolito
ácido 5-carboxílico, designado como E-3174) son antagonistas específicos y
selectivos de los receptores de la angiotensina I. Mientras que los inhibidores
de la enzima de conversión de angiotensina (ECA) bloquean la síntesis de la
angiotensina II a partir de la angiotensina I, el fármaco impide que la
angiotensina II formada pueda interaccionar con su receptor endógeno. El
metabolito activo del losartán es 10-40 veces más potente que el mismo,
como ligando de los receptores AT1, siendo el principal responsable de los
efectos farmacológicos. Una vez unidos al receptor, ni el losartán, ni su
metabolito, muestran actividad agonista. La angiotensina II es la principal
hormona vasoactiva del sistema renina-angiotensina (Figura 1), jugando un
importante papel en la patofisiología de la hipertensión. (Estrada, 2015)
El losartán relaja el musculo liso y así favorecen la vasodilatación, una vez
que aumenta la excreción renal de sal y agua, es bien absorbido por el tracto
gastrointestinal, sin embargo, sufre metabolismo de primer paso, generando
los metabolitos activos que se une fuertemente a proteínas plasmáticas.
Losartán posee biodisponibilidad oral alrededor de 33% y se absorbe con
17
rapidez y alcanza una concentración plasmática máxima en una hora; y de 3
a 4 horas para su metabolito activo (E-3174). (Estrada, 2015)
La eliminación del losartán ocurre en aproximadamente 35% de la dosis
por vía renal, 4% sin alteraciones y aproximadamente 61% en forma de
metabolitos que son excretados por las heces. La semi-vida de eliminación
del losartán y de su metabolito activo son de 2 y 6 horas, respectivamente,
en los pacientes sin insuficiencia renal y de 1 y 2 horas en pacientes con
funcionamiento renal normal. Los efectos máximos del losartán se observan
por lo general en la primera semana de tratamiento, aunque en algunos
casos son evidenciadas entre 3 y 6 semanas. (Nozaki et al, 2018)
A pesar de ser recomendado por los médicos, el losartán presenta
algunos problemas que limitan su uso, como lo es, la tolerancia al fármaco
con el uso prolongado. Con el objetivo de mejorar las limitaciones del uso del
losartán, nuevas tecnologías han sido desarrolladas como lo son las
microemulsiones, que son sistemas termodinámicamente estables y
utilizados para la liberación prolongada de fármacos. (Nozaki et al, 2018)
El losartán es vendido en formas de tabletas normalmente de 50mg. Para
su comercialización se requiere que este sea aprobado por un control de
calidad, lo cual garantiza la calidad del producto. Entre los ensayos
requeridos por las farmacopeas e industrias farmacéuticas está el perfil de
disolución. (USP, 39)
18
El perfil de disolución es definido como el método in vitro aceptado para la
determinación de la intercambiabilidad entre un medicamento de patente y
un medicamento genérico. La absorción de un fármaco desde una forma de
dosificación sólida tras la administración oral depende de la liberación de la
sustancia medicinal del producto medicinal, la disolución o solubilización del
fármaco bajo condiciones fisiológicas y la permeabilidad por el sistema
gastrointestinal. (Jung, et al, 2012)
Debido a la naturaleza crítica de estos primeros dos pasos, la disolución in
vitro puede ser relevante a la predicción del rendimiento in vivo. En base a
esta consideración general, se utilizan las pruebas de disolución in vitro para
las formas de dosificación oral sólidas, como comprimidos y cápsulas, para
evaluar la calidad de un producto medicinal lote a lote; guiar el desarrollo de
nuevas formulaciones; y asegurar la calidad y el rendimiento continuados del
producto después de ciertos cambios, tales como variación en la formulación,
el proceso de fabricación, el sitio de fabricación y el aumento en escala del
proceso de fabricación; o bien sean de diversos orígenes afectando así el
patrón de flujo hidrodinámico en la interfaz sólido-líquido y así obtener
resultados reproducibles. (Ballesta, 2015)
Este ensayo es parte de otras pruebas analíticas empleadas para evaluar
las formas farmacéuticas terminadas durante su desarrollo, estabilidad y
control de la calidad. La prueba implica el control de una serie de variables
como son; evaluar la calidad de un producto farmacéutico lote a lote;
asegurar la calidad y el rendimiento continuados del producto después de
19
ciertos cambios, tales como cambios en la formulación, el proceso de
fabricación, el sitio de fabricación y el aumento en escala del proceso de
fabricación; o bien sean de origen diverso afectando el patrón de flujo
hidrodinámico en la interfaz sólido-líquido y así determinar la obtención de
resultados reproducibles. (Ballesta, 2015)
A pesar de que el ensayo de disolución es una exigencia para el control de
calidad de un medicamento, las farmacopeas lo describen solo para los
medicamentos convencionales, lo que indica que todavía no existe ensayos
para los sistemas deliberación prolongada de fármacos, por esta razón la
validación de una metodología analítica es de fundamental importancia para
conocer y cuantificar las tabletas desarrolladas a partir de sistemas de
liberación. (USP, 39)
II.2.2 Validación de métodos analíticos
Según la USP 39 la validación de un procedimiento analítico es el proceso
que se establece, mediante estudios en laboratorio, donde se verifican que
las características de desempeño del procedimiento cumplan los requisitos
con las aplicaciones analíticas previstas. Cada una de las características de
desempeño se define en este capítulo, junto con un esbozo de un método o
métodos típicos mediante los cuales puede medirse. Las definiciones hacen
referencia a "resultados de las pruebas". (USP, 39)
Cabe indicar que no necesariamente, el resultado de una prueba debe ser
el valor final informable, que se va a comparar con los criterios de aceptación
de una especificación. La validación de métodos de propiedades físicas
20
puede implicar la evaluación de modelos quimiométricos. No obstante, las
características analíticas típicas usadas en la validación de métodos se
pueden aplicar a los métodos derivados del uso de modelos quimiométricos.
(USP, 39)
La Farmacopea De Argentina (2016) define a la validación de métodos
analíticos como el proceso por el cual se establece por medio de estudios de
laboratorio, que un método sea apropiado para el uso propuesto las buenas
prácticas de fabricación y control, empleados para evaluar las
especificaciones establecidas y estas sean apropiados. (CODEX, 2016)
La información puede variar según el tipo de valoración empleada. Sin
embargo, en la mayoría de los casos una presentación constará de las
siguientes secciones.
Justificación - Debe identificar la necesidad y las ventajas del método
propuesto. Para métodos revisados, debe proporcionarse un a comparación
de las limitaciones del método vigente en los libros oficiales y las ventajas
ofrecidas por el método propuesto.
Método analítico propuesto – Contiene la descripción completa y
suficientemente detallada del método analítico para permitir que personas
capacitadas puedan repetirlo. La redacción debe incluir todos los parámetros
operativos importantes e indicaciones específicas, como por ej., la
preparación de reactivos, las condiciones de aptitud del sistema, descripción
de los blancos empleados, precauciones y fórmulas para calcular los
resultados.
21
Datos - Se proporciona la documentación detallada y completa de la
validación del método, incluyendo datos experimentales y cálculos que
fundamenten cada uno de los atributos estudiados. (CODEX, 2016)
Los ensayos generales ya establecidos deben validarse para comprobar
su exactitud (ausencia de posibles interferencias) cuando se emplea para un
producto o materia prima nuevos. La validez de un método analítico puede
comprobarse sólo mediante estudios de laboratorio. En consecuencia, la
documentación que avale tales estudios es un requisito básico para
determinar si un método es apropiado para una aplicación determinada.
Cualquier método analítico propuesto debe estar acompañado de la
documentación necesaria. (CODEX, 2016)
Según el ICH (2005) el objetivo de la validación de un procedimiento
analítico es demostrar que es adecuado para su propósito previsto. Se
incluye una suma tabular de las características aplicables a la identificación,
control de impurezas y procedimientos de ensayo. (ICH, 2005)
La obtención de resultados analíticos apto para su uso implica que éste
debe ser lo suficientemente fiable para que cualquier decisión basada en él
pueda ser tomada con confianza. Debe validarse el desempeño del método y
estimar la incertidumbre del resultado para un determinado nivel de
confianza. La incertidumbre se debe evaluar y citar de tal manera que sea
ampliamente reconocida, internamente consistente y fácil de interpretar.
(Eurolab, 2016)
22
La validación analítica comprende un programa documentado a través del
cual se establece que un método analítico posee todos los requisitos para el
uso propuesto. La validación de los procedimientos analíticos está en función
del tipo de procedimiento a realizar, los cuatro tipos más comunes son:
• Pruebas de identificación
• Pruebas cuantitativas para el contenido de impurezas
• Pruebas límite para el control de impurezas
• Pruebas cuantitativas del activo en muestras de la sustancia o del
producto terminado o de los otros componentes seleccionados del producto.
(Vasquez, 2002)
Para realizar la validación analítica, la ICH (2005) estipula algunos
parámetros que deben ser realizados, tales como: exactitud, precisión,
repetibilidad, precisión intermedia, reproducibilidad límite de detección, límite
de cuantificación, linealidad, intervalo, especificidad, robustez, los cuales son
detallados a continuación:
Exactitud.- La exactitud de un método analítico; es la cercanía de los
resultados de la prueba obtenidos por dicho método al valor aceptado como
verdadero. La exactitud debe establecerse a lo largo del intervalo
especificado del procedimiento analítico Se evalúa utilizando un mínimo de 9
determinaciones en un mínimo de 3 niveles de concentración que cubran el
intervalo especificado (por ejemplo, 3 replicados en cada una de tres
concentraciones del procedimiento analítico total). (ICH, 2005; USP 39)
23
Precisión.- Evidencia el grado de concordancia entre resultados
individuales cuando el método se aplica repetidamente a múltiples muestras
de una mezcla homogénea. La precisión de un método analítico es
generalmente expresada como la desviación estándar, desviación estándar
relativa o coeficiente de variación (CV) de una serie de mediciones, que
indican una serie de errores aleatorios y puede ser considerada en tres
niveles: repetibilidad, precisión intermedia y reproducibilidad. (ICH, 2005;
USP 39)
Repetibilidad.- Expresa la precisión bajo las mismas condiciones de
operación en un corto periodo de tiempo, utilizando el mismo analista, con el
mismo equipo. Es también llamada precisión intra-análisis. Debe evaluarse
utilizando: un mínimo de 9 determinaciones que cubran el intervalo
especificado para el procedimiento (por ejemplo, 3 replicados de cada una de
3 concentraciones) o, un mínimo de 6 determinaciones en el 100 % de la
concentración de la prueba. (ICH, 2005; USP 39)
Precisión intermedia.- Manifiesta la variación dentro del laboratorio, en
diferentes días, o con diferentes analistas o equipo dentro del mismo
laboratorio. La evaluación de la precisión intermedia depende de las
circunstancias bajo las cuales se usara el procedimiento. El analista debe
establecer los efectos de eventos aleatorios (variaciones como días,
analistas, equipo, etc.) en la precisión del procedimiento analítico. (ICH,
2005; USP 39).
24
Reproducibilidad.- Demuestra la precisión en diferentes laboratorios, (se
utiliza en estudios de colaboración y se aplica generalmente a la
estandarización de metodología, como la inclusión de procedimientos en
farmacopeas). Se evalúa mediante un estudio inter-laboratorio, una práctica
común es analizar muestras tomadas de un lote homogéneo en 2 días, 2
analistas y 3 determinaciones independientes por día y por analista. (ICH,
2005; USP 39)
Límite de detección (LOD).- Se define como la mínima cantidad de
analito que puede ser detectada en una muestra, pero no necesariamente
cuantificada como un valor exacto; así el límite de detección solamente
establece que la concentración de analíto está arriba o por abajo de cierto
nivel. Se expresa como la concentración del analito (por ejemplo: en tanto
por ciento o en ppm) en la muestra. (ICH, 2005; USP 39)
Límite de cuantificación (LOQ). - El límite de cuantificación es la menor
concentración del analito en la muestra, que puede ser determinado con una
precisión y exactitud aceptables, bajo las condiciones de operación
establecidas, es un parámetro para análisis cuantitativos. Se expresa en
tanto por ciento (%) o en ppm. De la misma forma que el límite de detección,
existen diversos medios para determinar el límite de cuantificación,
dependiendo si el método es o no instrumental. (ICH, 2005; USP 39)
Linealidad.- La linealidad de un método es su capacidad (dentro de un
intervalo dado) para obtener resultados que son directamente proporcionales
a la concentración (cantidad) del analito en la muestra. Se expresa
25
generalmente en términos de la varianza alrededor de la pendiente de la
línea de regresión obtenida por análisis de muestras con concentraciones de
analito en el intervalo del método. La linealidad habitualmente se calcula
utilizando un programa de regresión de cuadrados mínimos adecuado.
Típicamente, el cuadrado del coeficiente de correlación (R2~ 0,98) demuestra
linealidad. Además, la ordenada al origen y no debe ser significativamente
diferente de cero. El intervalo del procedimiento es el intervalo entre las
concentraciones superior e inferior del fármaco (incluyendo estos niveles)
que ha demostrado tener un nivel de precisión, exactitud y linealidad
adecuado usando el procedimiento tal como se describe. (ICH, 2005; USP
39)
Intervalo.- Son rangos que interpretan los límites superior e inferior que se
pueden determinar en el analito con un grado aceptable de exactitud,
precisión y linealidad. El intervalo normalmente se deriva de los estudios de
linealidad y depende de la aplicación que se pretenda dar al procedimiento
analítico. Se expresa en los mismos resultados del análisis. Se especifican
los siguientes intervalos específicos mínimos:
Para el análisis de una sustancia o un producto terminado, normalmente
del 80 al 120% de la concentración de prueba.
Para uniformidad de contenido, se establece un mínimo de 70 a 130 % de
la concentración de prueba, a menos que se justifique un intervalo más
amplio basado en la naturaleza de la forma de dosificación.
26
Para pruebas de disolución: ± 20% sobre el rango especificado. (ICH,
2005; USP 39)
Especificidad.- Es la habilidad de un método analítico para medir exacta
y específicamente el analito en presencia de impurezas, productos de
degradación o excipientes que puedan estar presentes en la muestra. La
investigación de la especificidad debe realizarse durante la validación de las
pruebas de identificación, la determinación de las impurezas y el ensayo; los
procedimientos usados para demostrar especificidad dependerán del objetivo
del procedimiento analítico. (ICH, 2005; USP 39)
Robustez.- La robustez de un método analítico es el grado de
reproducibilidad de los resultados obtenidos del análisis de las mismas
muestras bajo diversas condiciones tales como diferentes laboratorios,
analistas, instrumentos, lotes de reactivos, temperaturas, días, etc. Un
método analítico es robusto cuando proporciona resultados con presión y
exactitud aceptables en condiciones de trabajo ambientales y/o analíticas
diferentes. (ICH, 2005; USP 39)
Como mencionado anteriormente, la validación de un método analítico es
de gran importancia porque permite evaluar un analito con precisión, sin
embargo, para los nuevos sistemas de liberación de fármacos no hay
métodos analíticos validados para cuantificación de tabletas realizadas con
microemulsiones.
27
Actualmente nuestro grupo de investigación ha desarrollado
microemulsiones con gemfibrozilo para el tratamiento del
hipercolesterolemia, los resultados mostraron que fue posible incorporar gran
cantidad de fármaco en la matriz de los sistemas (Díaz, 2018; Baque, 2018).
Considerando los resultados obtenidos, el grupo está dedicado a comprobar
si las MEs también son eficaces para la incorporación de otros fármacos
como el losartán.
Para cuantificar el losartán dentro de la matriz de las MEs y realizar un
estudio de disolución de futuras tabletas, es necesario la validación de un
método analítico. Considerando esto, en el presente proyecto se validó un
método analítico para cuantificación del losartán incorporado a MEs y
cristales líquidos.
28
CAPÍTULO IIIMateriales y métodos
III.1 Materiales
Materiales de vidrio
Matraz: 10ml, 100ml, 250ml, 500ml
Vaso de precipitación: 40ml, 300ml, 400ml, 500ml
Pipetas volumétricas: 2ml, 3ml, 5ml, 10ml
Pipetas: 1ml, 5ml
Varilla de vidrio o agitador
Vidrio reloj
Equipos
Balanza (mg): Genersa® S.A. instrumentación química
Balanza (g): BOECO® Germany
Espectrofotometro UV: Shimadzu® UV-VIS 1700 PharmaSpec
Micropipeta: 10-100 ul
Micropipeta: 100-1000 ul
Reactivos
Acetonitrilo: J.T Baker
Monofosfato de potasio. J.T Baker
29
Hidróxido de sodio: J.T Baker
Agua destilada: Laboratorios Cevallos
Losartán: lote C5455
30
III.2 Metodología empleada
III.2.1 Desarrollo de las MEs
Las MEs fueron desarrolladas por otros participantes de nuestro grupo de
investigación, para ello se construyó un diagrama de fases para la
identificación de las regiones (MEs, cristales líquidos, emulsiones y
separación de fases) (datos no mostrados). Una vez separada las muestras
escogidas, se procedió a preparar las muestras con y sin fármaco para la
realización de la validación de la metodología analítica.
III.2.2 Validación de la metodología analítica
La metodología se realizó empleando los parámetros descritos por la USP
39 e ICH 2005.
Linealidad: Se construyó una curva analítica de 6 puntos, realizando
diluciones a partir de una solución madre de 100mg/mL, las concentraciones
variaron desde 0.01mg/mL a 0.08mg/mL, las lecturas se realizaron por
triplicado y el coeficiente de correlación aceptado fue de 0.99, que es lo
estipulado por la ICH (2005).
Especificidad: Se realizó utilizando los sistemas de liberación prolongados
vacío, es decir, sin la adición del fármaco.
Robustez: La robustez se aplicó cambiando el analista y el valor de pH de
la muestra.
31
Precisión: Se la realizó en tres diferentes días, se evaluó dos parámetros:
precisión intra e interday. Esta etapa se realizó por triplicado.
Exactitud: Se la determinó aplicando el cálculo de recuperación
presentada en el ICH (2005). Utilizando los datos de la comparación del
grado de cercanía entre el valor experimental obtenido durante un ensayo
con el valor considerado como verdadero. El porcentaje de la recuperación
fue calculada utilizando la Ecuación 1.
%Recuperación: 100 %
Ecuación 1
Donde,
Y=absorbancia de la muestra;
X=absorbancia del estándar
Criterio de aceptación % de recuperación: 98-102%
Para la exactitud, el criterio de aceptación debe estar basado a un coeficiente
de variación inferior al 3%
Límite de detección: Se determinó según lo establecido por el ICH (2005),
y el cálculo se ejecutó basado en la Ecuación 2.
= 3.3σS
32
Ecuación 2
Donde,
σ = la desviación estándar de la respuesta
S = la pendiente de la curva de calibración
Límite de cuantificación: Se determinó según lo indicado por el ICH (2005),
el cálculo está basado en lo expresado en la Ecuación 3.
= 10σSEcuación 3
Donde,
σ = la desviación estándar de la respuesta
S = la pendiente de la curva de calibración
III.2.3 Preparación de las Microemulsiones
Para la preparación de las MEs se eligió un punto específico del diagrama
de fases construido por García et al., (2018). Los autores construyeron un
diagrama de fases para la identificación de las regiones (MEs, cristales
líquidos, emulsiones y separación de fases) (datos no mostrados). Una vez
escogidas las muestras, se procedió a preparar las, las cuales poseen 6ml
del tween 80, 3ml de aceite de coco y 1ml de agua. Los componentes fueron
mezclados lentamente con una agitación controlada. Las MEs fueron
preparadas para la realización de la validación de la metodología analítica.
33
III.2.4 Preparación del Buffer a pH 6.8
El buffer fue preparado como se encuentra descrito por la USP 39, se
pesaron 27.22g K2HPO4 llevando a un volumen final de 1000ml, la solución
se ajustó a un pH de 6.8 utilizando NaOH 1N.
III.2.5 Preparación de la solución madre
La solución madre fue preparada a una concentración de 100mg/ml: se
pesaron 100mg de losartán, se disolvieron previamente en 15ml de
acetonitrilo y se llevó a un volumen final de 100ml con buffer a pH 6.8.
34
RESULTADOS
Preparación de las Microemulsiones
Las microemulsiones son sistemas caracterizados por su transparencia y
estabilidad a largo plazo, sin que haya una separación de fases. Las MEs
fueron preparadas según lo descrito en la sección III.2.3, y el resultado está
mostrado en la Figura 3.
Figura 3 Formación de microemulsiones
Es posible observar la formación de un sistema homogéneo y
transparente, lo cual sugiere la formación de MEs. Resultados de
microscopia de luz polarizada evaluado por el grupo de investigación
muestran la presencia de un campo oscuro lo que es característico de la
formación de microemulsiones (datos no exhibidos). Resultados semejantes
fueron descritos por Froelich et al., (2017), que indicó que una de las
características principal de las MEs es la observación de transparencia
macroscópica.
35
Validación de la metodología analítica
Linealidad
La linealidad de una curva analítica dependerá del valor obtenido en el
coeficiente de correlación y la intersección de la recta son su eje. Este valor
demuestra una regresión lineal de una determinada concentración frente a la
absorbancia. Un valor mayor o igual a 0.99 generalmente es aceptable, ya
que esto indica que la curva analítica esta lineal (Shabir, 2003). La Figura 4
muestra el valor de R2 obtenido a partir de la construcción de la curva.
Figura 4 Curva analítica del losartán
En los resultados obtenidos se observa linealidad de la relación obtenida
entre concentración y la absorbancia. Los valores de R2 obtenidos en la
construcción de la curva de losartán fueron 0.9964, en este contexto, se
considera la curva analítica como referencia para la cuantificación del mismo,
ya que este está de acuerdo con lo estipulado por la USP 39 El intercepto es
significativamente cercano a cero (CV factor de respuesta ≤5%). Los
y = 0,003x + 0,0703R² = 0,9964
0,0000
0,0500
0,1000
0,1500
0,2000
0,2500
0,3000
0,3500
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Abso
rban
cias
Concentración (mg/mL)
36
resultados van de acuerdo con lo mostrado por Rodríguez et al 2016 donde
se desarrolló y validó un método para cuantificación de acetaminofén en
supositorios, mostrando un valor de R2 de 0.9971
Valores semejantes fueron encontrados por tuwfeeq (2018), donde los
autores validaron un método analítico para la cuantificación de tabletas de
diclofenaco sódico. Los resultados mostraron un valor de R2 de 0.999 lo que
indica una linealidad entre la curva.
Precisión
Se realizó la precisión relacionando el grado de concordancia entre
resultados individuales cuando el método se aplica repetidamente a múltiples
muestras de una mezcla homogénea, considerando tres niveles:
repetibilidad, precisión intermedia y reproducibilidad.
IntradayTabla II
Intra Day Precisión
Concentración(mg/mL)
Absorbancia (242nm)
Promedio Desviaciónestándar
Coeficientede
variación(%)
10 0,1203 0,1029 0,0979 0,1070 0,0118 0,110740 0,1934 0,1811 0,1811 0,1852 0,0071 0,038480 0,2784 0,2628 0,2624 0,2679 0,0091 0,0341
37
Interday
Tabla III
Inter Day Precisión
Días Concentración(mg/mL)
Promedio Desviaciónestándar
Coeficientede
variación(%)
1º10
0,1060 0,0040 0,03752º 0,0905 0,0032 0,01763º 0,1054 0,0017 0,00521º
400,1816 0,0054 0,0597
2º 0,2028 0,0045 0,02233º 0,1874 0,0016 0,00441º
800,3287 0,0089 0,0841
2º 0,3511 0,0014 0,00733º 0,2899 0,0007 0,0024
En las Tablas II y III, es posible observar que el coeficiente de variación de
los 6 valores obtenidos en cada medio de disolución fue inferior al 2%. El
coeficiente de variación (CV) es un parámetro estadístico que mide la
relación entre la desviación estándar y la media. Conocer valores de la
desviación estándar es importante ya que este indica la homogeneidad entre
las variables, es decir, altos valores de CV indican que las variables están
heterogéneas, es decir, valores muy lejanos uno de los otros, mientras que
valores bajos muestras la homogeneidad entre las variables (Lehner et al.,
2018).
Los resultados mostraron que el método es preciso para la cuantificación
del losartán y además el valor está dentro de lo recomendado por la ICH
(2005) que indica como aceptado un valor inferior al 5%. Bajos valores de CV
38
también fueron encontrados por Torregiani, et al (2017) los autores validaron
y aplicaron clínicamente el método analítico para el metotrexato, un valor
inferior a 0.99% de coeficiente de variación.
Resultados semejantes fueron encontrados por tuwfeeq (2018), quienes
validaron un método analítico para la cuantificación de tabletas de
diclofenaco sódico. Los resultados mostraron un valor inferior al 7% para el
CV de precisión intradía e intradía.
Especificidad
La especificidad fue realizada utilizando las MEs sin fármaco, se utilizó
este método para medir exacta y específicamente el analito en presencia de
impurezas, productos de degradación o excipientes que puedan estar
presentes en la muestra.
Figura 5 Curva de Especificidad
Los resultados presentados en la Figura 5 muestran que los MEs sin
fármaco (naranja) para la preparación de las MEs no interfieren con la señal
0,00000,10000,20000,30000,40000,50000,60000,70000,80000,90001,0000
239 240 241 242 243 244 245
Abso
rban
cias
Longitud de onda (nm)
Losartán
Microemulsión sin fármaco
39
en la longitud de onda correspondiente al losartán (azul), lo que indica que es
posible cuantificar el fármaco dentro de la matriz de las MEs.
Hernández 2015, validó un método para evaluar la disolución de
progesterona en suspensión oleosa contenida en una cápsula blanda de
gelatina. Los resultados mostraron que los excipientes utilizados para la
preparación de la forma farmacéutica, no interfirieron en la señal del fármaco.
Robustez
Como la precisión y la veracidad de un método analítico es evaluado
dentro de un único laboratorio, la incertidumbre debido a cambios debe ser
tomados en cuenta, este parámetro puede ser evaluado por los estudios de
robustez, el cual considera cambios en la variable de un procedimiento
analítico (González & Herrador, 2007).
Corresponde a una medida de la capacidad de un método analítico de
presentar resultados con exactitud y precisión aceptables, frente a cambios
pequeños, pero deliberados, en los parámetros del método ICH (2005). De
acuerdo al protocolo de validación descrito por la USP 39 y el ICH (2005), se
realizan dos pruebas de robustez sobre una solución estándar al 100% en el
sistema. La robustez fue evaluada realizando el cambio de pH y los
resultados están mostrados en la Tabla IV.
40
Tabla IV
Resultados de Robustez
pH Concentración(mg/mL)
Absorbancia (242nm) Promedio Desviaciónestándar
Coeficientede
variación(%)
6.5 30 0,2281 0,2317 0,2332 0,2310 0,00262 0,01134740 0,2388 0,2422 0,2424 0,2411 0,00202 0,008390
7,2 30 0,205 0,2085 0,2028 0,2054 0,00287 0,01399340 0,2407 0,2416 0,2517 0,2447 0,00611 0,024963
La robustez del método fue estudiada por cambios deliberados en el
método como alteración en el pH. Los resultados muestran bajos valores en
el coeficiente de variación, lo que sugiere que los cambios de pH no
interfieren la interpretación de los resultados, indicando de esta manera que
el método es robusto para la finalidad pretendida.
Exactitud
Se determinó la exactitud utilizando la formula (Sección III.2.2, Ecuación 1)
y así comparando el grado de cercanía entre el valor experimental obtenido
durante un ensayo en comparación con el valor considerado como verdadero
de un método analítico; es la cercanía de los resultados de la prueba
obtenidos por dicho método al valor aceptado como verdadero. Se evalúo
utilizando un mínimo de 9 determinaciones en un mínimo de 3 niveles de
concentración que cubrieron el intervalo especificado.
41
Tabla V
Porcentaje de exactitud
Concentración(mg/mL)
Promedio % de recuperación
10 0,1070 2,72%40 0,1852 4,36%80 0,2679 1,90%
La exactitud del método se determinó a partir del análisis de replicación de
los estándares en concentraciones dentro del rango lineal del ensayo para
fármaco (Tabla V).
El porcentaje medio de recuperación de 10-80 μl de losartán fue 95.2 ±
4.36%. Comparando los valores considerados como reales y experimentales,
la formulación de matriz estuvo dentro de los límites aceptables. Intradía e
intervalo de precisión entre días fue (97.28-102.72%), (95.64- 104.36%) y
(98.1-101.9), respectivamente.
Límite de detección:
Se determinó empleado la ecuación presentada en el ICH (2005). Los
datos provenientes de la curva de calibrado expuesta anteriormente.
LD = . ( , ), = 2,3757mg/mL
El límite de detección obtenido fue de 2,3757mg/mL. Este resultado indica
que el límite detectable del fármaco es sensible para la detección de losartán
en microemulsiones.
42
Un resultado similar se observó en el trabajo de Lusina et al (2005) los
cuales realizaron un estudio de estabilidad de tabletas de losartán /
hidroclorotiazida, donde se muestra que los límites de detección son de 3,56
mg/mL como limite detectable
Límite de cuantificación:
Se determinó empleado la ecuación presentada en el ICH (2005), y
utilizando los datos de la curva que calibrado realizada anteriormente.
LC = ( , ), = 7,1991mg/mL
El límite de cuantificación que se obtuvo fue de 7,1991mg/mL. Este
resultado nos indica que es posible cuantificar la menor concentración del
analito en la muestra, pudiendo ser determinado con una precisión y
exactitud aceptables, bajo las condiciones de operación establecidas, es un
parámetro para análisis cuantitativos, un resultado similar se observó en un
trabajo realizado por Lusina et al (2005) en su estudio de estabilidad de
tabletas de losartán / hidroclorotiazida se demostró que la concentración
mínima a cuantificar es de 5,745mg/mL
43
CONCLUSIÓN
Se desarrolló y validó un método analítico rápido y sensible para la
cuantificación de losartán incorporado a microemulsión utilizando
espectroscopia ultravioleta visible (UV-Vis). Se pudo demostrar que el
método fue reproducible según los parámetros de la USP 39 e ICH 2005
Se establecieron parámetros para definir la metodología a utilizar en la
validación de métodos para la cuantificación de losartán incorporado,
utilizando como referencia las normas ICH (2005) y USP 39
El método demostró ser preciso exacto y robusto con valores de
Desviación estándar y Coeficiente de Correlación dentro de los rangos
normales establecidos por la USP 39 e ICH (2005) indicando que es efectivo
para los ensayos de perfil de disolución del losartán en los sistemas de
liberación prolongado.
44
RECOMENDACIONES
Se recomienda utilizar los protocolos descritos en la norma USP, 39,
realizar los cálculos respectivos de la muestra evitando así un mal uso
de reactivos.
No utilizar un exceso de la muestra debido a que el losartán no es
completamente soluble en agua; el acetonitrilo y el buffer se lo debe
utilizar para su dilución completa evitando así algún tipo de
interferencia en las lecturas de detección.
Utilizar el material totalmente limpio y seco para evitar y disminuir así
el porcentaje de error absoluto. Al momento de utilizar el
espectrofotómetro UV-Vis observar que este la longitud de onda
adecuada y que la muestra del blanco no debe ser removida de la
cubeta.
45
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GLOSARIO
Aneurisma.- Dilatación anormal de las paredes de una arteria o una vena.
Angiotensina.- Es un decapéptido con función hormonal que participa en el
sistema renina-angiotensina de acción endocrina.
Antagonistas.- Es un tipo de ligando de receptor o fármaco que bloquea o
detiene respuestas mediadas por agonistas en lugar de provocar una
respuesta biológica en sí tras su unión a un receptor celular.
Antihipertensivo.- El término antihipertensivo designa toda sustancia o
procedimiento que reduce la presión arterial.
Comorbilidades.- La presencia de enfermedades coexistentes o adicionales
en relación con el diagnóstico inicial.
Hemodinámica.- Parte de la fisiología que estudia las leyes y mecanismos
que rigen la circulación sanguínea.
Hipertensión.- Presión excesivamente alta de la sangre sobre la pared de
las arterias
Perfil De Disolución.- Es definido como el método in vitro aceptado para la
determinación de la intercambiabilidad entre un medicamento de patente y
un medicamento genérico
Prorrenina.- Precursor enzimáticamente inactivo de la renina, procesado a
renina por la actividad de proteasas intracelulares (catepsina B) y otras
52
localizadas en los gránulos secretores de las células yuxtaglomerulares
humanas.
Renina.- También llamada angiotensinogenasa, es una proteína (enzima)
secretada por las células yuxtaglomerulares del riñón.
Vasodilatación.- Aumento del calibre de un vaso por relajación de las fibras
musculares.
Validación.- Es la acción y efecto de validar (convertir algo en válido, darle
fuerza o firmeza). El adjetivo válido, por otra parte, hace referencia a aquello
que tiene un peso legal o que es rígido y subsistente
53
ANEXOS
Ilustración 1 Estándar dellosartán
Ilustración 2 Micropipeta Labnet dellaboratorio de análisis de
medicamentos
Ilustración 3 Solución madre ysolución Buffer
Ilustración 4 Espectrofotómetro UVShimadzu del laboratorio de análisis de
medicamentos
54
Ilustración 5 Dilución 70 ul Ilustración 6 Balanza gramera
