UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD CIENCIAS QUÍMICAS...

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD CIENCIAS QUÍMICAS

MODALIDAD: INVESTIGACIÓN

TEMA:

ANÁLISIS DE RESIDUOS DE VERDE DE MALAQUITA Y LEUCOVERDE DE MALAQUITA EN CAMARÓN ECUATORIANO DE EXPORTACIÓN

TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO

PARA OPTAR AL GRADO DE QUÍMICO Y FARMACÉUTICO

AUTOR:

CHRISTIAN DAVID CHICAIZA VERA.

TUTOR: Lcda. MIGDALIA MIRANDA MARTÍNEZ PhD.

GUAYAQUIL - ECUADOR

2018

FACULTAD: CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA

UNIDAD DE TITULACIÓN

FICHA DE REGISTRO DE TESIS/TRABAJO DE GRADUACIÓN

TÍTULO Y SUBTÍTULO: Análisis de residuos de verde de malaquita y leucoverde de malaquita en camarón ecuatoriano de exportación

AUTOR: Chicaiza Vera Christian David

TUTORA: Lcda. Miranda Martínez Migdalia PhD

INSTITUCIÓN: Universidad de Guayaquil

UNIDAD/FACULTAD: Ciencias Químicas

MAESTRÍA/ESPECIALIDAD: Química y Farmacia

GRADO OBTENIDO: Tercer Nivel – Químico y Farmacéutico

FECHA DE PUBLICACIÓN: 2018 No. DE PÁGINAS: 45

ÁREAS TEMÁTICAS: Inocuidad alimentaria y definición de protocolos en caso de muestras positivas

PALABRAS CLAVES/ KEYWORDS:

Camarón, LC-MS/MS, verde de malaquita, leucoverde de malaquita.

RESUMEN/ABSTRACT (150-250 palabras): Con el desarrollo de los sistemas de producción intensiva e hiperintensiva del camarón, han aparecido también una serie de factores productores de mortalidad, que actúan directa e indirectamente sobre las poblaciones cultivadas con impactos de diferentes magnitudes. Estos factores van desde organismos parásitos patógenos hasta factores fisicoquímicos propios de la ecología de los acuarios, además de la acción de organismos depredadores y errores humanos en el manejo del cultivo. Todo ello ha conllevado al empleo de distintos medicamentos y sustancias químicas para prevenir o tratar enfermedades, controlar los parásitos, ayudar al proceso productivo y favorecer el crecimiento. De ahí que la utilización no reglamentada de algunos ingredientes como conservantes y colorantes empleados con fines de control de enfermedades, puede también ocasionar un riesgo en la inocuidad de los alimentos y del medio ambiente. En este proyecto se desarrolló el estudio durante seis meses sobre la presencia en productos de exportación de dos colorantes: verde malaquita (VM) y leuco verde malaquita (LVM), en muestras de camarón de exportación, analizadas en el periodo de julio a diciembre del año 2015 y que son usados como antimicrobianos. Los resultados indicaron que, durante los meses de estudio, no se detectó la presencia de los colorantes VM y LVM en las muestras analizadas. La aplicación de la técnica LC-MS/MS, resultó adecuada para este tipo de análisis.

ADJUNTO PDF: SI NO

CONTACTO CON AUTOR:

Teléfono: 0993424129 4541746

E-mail: [email protected]

CONTACTO CON LA INSTITUCIÓN:

Nombre: Secretaria Ciencias Químicas Teléfono: (04)2-293680 E-mail: www.fcq.ug.edu.ec

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AGRADECIMIENTO En el presente trabajo de tesis mi agradecimiento va dirigido primordialmente hacia Dios, por permitirme llegar a estas instancias de mi vida tanto personal como profesional. Especial agradecimiento hacia mi madre Olga Vera García, mis hermanos Johanna Castro Vera, Steven Chicaiza Vera, por apoyarme durante toda esta travesía que es mi formación como futuro profesional. Agradezco a la Facultad de Ciencias Químicas, así como también a cada uno de los docentes que impartieron sus conocimientos y sus experiencias propias de la vida profesional. Mi agradecimiento al Instituto Nacional de Pesca y a la Ing. Fernanda Hurtado, al laboratorio de HPLC-MS/MS en el cual me ayudaron con sus conocimientos a realizar mi tesis la QF. Fátima Chalen, QF. Manuel Cambisaca y QF. Diana Palacios.

Finalmente, le agradezco a mi tutora la PhD. Migdalia Miranda, y QF. Celeste Carrillo para ayudarme en este proceso diario de realización de este trabajo.

I

ÍNDICE GENERAL

Contenido INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 1

Problema ....................................................................................................................... 3

Hipótesis ........................................................................................................................ 3

Objetivo general ........................................................................................................... 3

Objetivos específicos ................................................................................................... 3

CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. ......................................................... 4

I.1 CULTIVO DEL CAMARÓN ................................................................................... 4

I.1.1 Obtención de la semilla .................................................................................. 7

I.1.2 La Pre engorda ................................................................................................ 7

I.1.3 Fertilización de los estanques ....................................................................... 8

I.1.4 Fertilizantes orgánicos .................................................................................... 8

I.1.5 Fertilizantes inorgánicos ................................................................................. 8

I.2 PROBLEMAS DEL CULTIVO DE CAMARONES ............................................. 9

I.3 PRODUCTOS QUE MÁS SE EMPLEAN EN LOS CULTIVOS DE

CAMARONES ............................................................................................................. 10

I.3.1 Alimentos naturales ....................................................................................... 10

I.4.- METODOLOGIA ANALITICA ........................................................................... 15

I.4.1 Cromatografía liquida.................................................................................... 15

I.4.2 Espectrometría de masas ............................................................................ 16

I.4.3 Acoplamiento LC-MS/MS ............................................................................. 18

CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................... 20

II.1 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN .................................................................... 20

II.2 DELIMITACION ................................................................................................... 20

II.3 MUESTRA ............................................................................................................ 20

II.4 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS ...................................................... 20

II.4.1. Equipos ......................................................................................................... 20

II.4.2. Materiales ..................................................................................................... 21

II

II.4.3. Reactivos ...................................................................................................... 21

II.4.4 Estándares .................................................................................................... 21

II.5 DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO ............................................................ 22

II.5.1 Preparación de soluciones estándar ............................................................. 22

II.5.2 Preparación de curva de calibración ............................................................... 24

II.5.3 Preparación de reactivos (hidroxilamina) ........................................................ 26

II.5.4 Preparación de la fase móvil ............................................................................ 26

II.6 CONDICIONES ANALÍTICAS ....................................................................... 27

II.6.1 Verificaciones preliminares ............................................................................... 27

II.6.2 Registro de observaciones y de los resultados ........................................... 30

II.7 PREPARACIÓN DE MUESTRAS .................................................................. 30

II.7.1 Preparación del blanco de reactivo ................................................................. 31

II.7.2 Preparación del blanco matriz .......................................................................... 31

II.7.3 Fortificación de las muestras de control .......................................................... 31

II.7.4 Extracción de muestras .................................................................................... 31

CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. .................................................... 33

CAPÍTULO IV. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................. 39

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 41

III

ÍNDICE DE TABLAS

Contenido

Tabla I. Cantidad en µl de soluciones de estándares y agua pura utilizadas para

la preparación de la curva de calibración de verde de malaquita y leucoverde de

malaquita. .......................................................................................................... 25

Tabla II. Gradientes de concentraciones de la fase móvil. ................................. 27

Tabla III. Transiciones monitoreadas para la detección de (verde y leucoverde de

malaquita) .......................................................................................................... 29

Tabla IV. Valores de tiempos de retención (Tr) y áreas para la concentración de

1 µg/kg de los patrones. .................................................................................... 34

ÍNDICE DE FIGURAS Contenido Figura 1. Etapas del cultivo del camarón ............................................................ 6

Figura 2. Estructura química del verde de malaquita ........................................ 12

Figura 3. Estructura química del leucoverde de malaquita ................................ 13

Figura 4. Cromatogramas de los estándares de VM y LVM .............................. 34

Figura 5. Curva de calibración para el LVM D6 empleado como patrón interno. 35

Figura 6. Curva de calibración para VM. ........................................................... 35

Figura 7. Curva de calibración para LVM. ......................................................... 36

Figura 8. Cromatogramas de VM y LVM en matrices de camarón. ................... 36

IV

RESUMEN

Con el desarrollo de los sistemas de producción intensiva e hiperintensiva del

camarón, han aparecido también una serie de factores productores de

mortalidad, que actúan directa e indirectamente sobre las poblaciones cultivadas

con impactos de diferentes magnitudes. Estos factores van desde organismos

parásitos patógenos hasta factores fisicoquímicos propios de la ecología de los

acuarios, además de la acción de organismos depredadores y errores humanos

en el manejo del cultivo. Todo ello ha conllevado al empleo de distintos

medicamentos y sustancias químicas para prevenir o tratar enfermedades,

controlar los parásitos, ayudar al proceso productivo y favorecer el crecimiento.

De ahí que la utilización no reglamentada de algunos ingredientes como

conservantes y colorantes empleados con fines de control de enfermedades,

puede también ocasionar un riesgo en la inocuidad de los alimentos y del medio

ambiente. En este proyecto se desarrolló el estudio durante seis meses sobre la

presencia en productos de exportación de dos colorantes: verde malaquita (VM)

y leuco verde malaquita (LVM), en muestras de camarón de exportación,

analizadas en el periodo de julio a diciembre del año 2015 y que son usados

como antimicrobianos. Los resultados indicaron que durante los meses de

estudio, no se detectó la presencia de los colorantes VM y LVM en las muestras

analizadas. La aplicación de la técnica LC-MS/MS, resultó adecuada para este

tipo de análisis.

Palabras clave

Camarón, LC-MS/MS, verde de malaquita, leucoverde de malaquita.

V

ABSTRACT

With the development of intensive and hyperintensive shrimp

production systems, a number of mortality-producing factors have also

appeared, which act directly and indirectly on farmed populations with

impacts of different magnitudes. These factors range from pathogenic

parasitic organisms to physicochemical factors specific to aquarium

ecology, as well as the action of predatory organisms and human errors in

crop management. All this has led to the use of different drugs and

chemical substances to prevent or treat diseases, control parasites, help

the production process and promote growth. Hence, the unregulated use

of some ingredients such as preservatives and colorings can also cause a

risk in food safety and the environment. In this project, the study was

carried out for six months on the presence of two dyes: malachite green

(VM) and malachite green leuco (LVM) in export products, analyzed in the

period from July to December. Year 2015 and are used as antimicrobials.

The results indicated that during the study months, although the presence

of the VM and LVM dyes was detected in the analyzed samples, the

concentrations were well below the limits established by the International

Standards. The application of the LC-MS/MS technique was adequate for

this type of analysis.

Keywords

Shrimp, LC-MS / MS, malachite green, leucomalachite green.

1

INTRODUCCIÓN

El porcentaje de la producción pesquera mundial utilizada para el consumo

humano directo ha aumentado considerablemente en los últimos decenios,

pasando del 67 % en la década de los 60 al 87 % (más de 146 millones de

toneladas) en 2014. En los últimos cinco decenios, el crecimiento del suministro

mundial de pescado destinado al consumo humano ha sido superior al de la

población y el consumo mundial aparente de pescado per cápita se ha

duplicado, pasando de unos 10 kg en el decenio de 1960 a los 20 kg en la

actualidad (FAO, 2016).

La acuicultura se define como ‘’el arte de multiplicar y cultivar las especies

animales y plantas acuáticas ‘’. Engloba todas las actividades que tienen por

objeto la producción, crecimiento (desarrollo) y comercialización de organismos

acuáticos, animales o vegetales, de aguas dulces, salobres o saladas

(maricultura) (Barnabé, 1991).

No obstante, dicha producción presenta una problemática referida a aspectos

biológicos y técnicos consecuencia de la producción masiva de especies, así

como problemas de índole ecológica (posible impacto de las instalaciones),

social (posibles competencias con el sector pesquero tradicional), e incluso legal

(utilización de espacios comunes como son costas y áreas de mar). Así mismo,

uno de los principales problemas a los que se enfrenta es la aparición de

enfermedades infecciosas causada por virus, bacterias, hongos y parásitos

(Castello Orvay, 1993).

Con el objetivo de reducir este tipo de enfermedades, se suelen adicionar

compuestos antimicrobianos, generalmente en los alimentos, originando un

problema si no se administran al principio del brote, antes de que aparezca la

pérdida del apetito en los animales (Castello Orvay, 1993).

Como alternativa, se emplean baños cortos de antibióticos a concentraciones

elevadas o baños largos a bajas concentraciones (Castello Orvay, 1993).

2

En ocasiones, entre estos compuestos se emplean algunos colorantes

debidos a su bajo coste y alta efectividad. Así la presencia de ciertos colorantes

antimicrobianos en productos de mar (como los camarones) es una realidad,

como demuestran las alertas emitidas por la Unión Europea (UE) (RASFF,

2012).

Además de la detección de colorantes como resultado de su utilización en

baños para eliminar parásitos en acuicultura (Sudova & Machova, 2007), se

pueden encontrar en los productos de mar como consecuencia de hallarse en

aguas contaminadas con vertidos industriales que los contengan (Boxall y col.,

2003), aunque acostumbra a ser menos frecuente.

Un colorante es un compuesto orgánico que contiene grupos cromóforos y

auxócromos unidos a un anillo benceno (Kim, 2000). Son sustancias que dan

color a un alimento o le devuelven su color original; pueden ser componentes

naturales de los alimentos y de otras fuentes naturales que normalmente no se

consumen, ni se emplean como componentes característicos de los alimentos

(CE, 2008).

Se pueden clasificar en dos grandes grupos: colorantes naturales y

artificiales. A los colorantes naturales permitidos por el momento en alimentos

pertenecen el β-caroteno, el jugo de remolacha roja, los zumos de frutas de

cereza, naranja, pimentón, así como la clorofila (Lindner, 1994). Por otro lado,

entre los colorantes sintéticos tenemos el amarillo de quinoleína o eritrosina

(BOE, 1996), o el empleo de verde de malaquita como medicamento veterinario

en peces ornamentales (JOINT/ FAO/WHO, 2008).

En este proyecto desarrolla el estudio durante seis meses sobre la presencia

en productos de exportación de dos colorantes: verde de malaquita y leuco

verde de malaquita, usados como antimicrobianos en los cultivos de camarón.

3

Problema

¿Será factible la detección inequívoca de verde de malaquita y leucoverde de

malaquita mediante técnica analítica acoplada a espectrometría de masas en

tándem (MS/MS) en camarón ecuatoriano de exportación?

Hipótesis

Mediante la técnica analítica de HPLC acoplada a espectrometría de masas

en tándem (MS/MS), es posible detectar el verde de malaquita y el leucoverde

de malaquita de forma inequívoca.

Objetivo general

Evaluar la concentración de residuos de verde de malaquita y leucoverde de

malaquita en muestras de camarón de exportación, analizadas en el periodo de

julio a diciembre del año 2015

Objetivos específicos

Estudiar mediante LC-MS/MS, si existe contaminación por verde de malaquita

y leucoverde de malaquita en camarones ecuatorianos de exportación.

Definir el protocolo de control acorde a criterios del Instituto Nacional de

Pesca en caso de detección de muestras positivas.

4

CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA.

I.1 CULTIVO DEL CAMARÓN

El cultivo de cualquier organismo, requiere necesariamente del conocimiento

de aspectos tales como su anatomía y fisiología, alimentación, aspectos

reproductivos, efecto de parámetros ambientales, etcétera (Rojas y col., 2005).

Los camarones son artrópodos mandibulados con apéndices birrameados

articulados, con dos pares de antenas, caparazón, branquias y larvas nauplio

(Botello & Álvarez, 2013).

Los camarones del genero Penaeus, son considerados entre los más

importantes a nivel mundial, tanto para las pesquerías como para el cultivo. Los

miembros del genero Penaeus, han sido divididos por Pérez Farfante en el año

1969, en cuatro subgéneros: Penaeus, Litopenaeus, Fenneropenaeus,

Melicertus (Botello & Álvarez, 2013).

Uno de los parámetros más importantes en el cultivo del camarón es el

nutricional ya que, para lograr un desarrollo óptimo de organismos es

indispensable contar con todos los nutrimentos necesarios, tanto en cantidad

como en calidad (Rojas y col., 2005).

Podemos identificar dos grandes etapas de vida del camarón: la etapa de

desarrollo y la de la madurez. En la etapa de desarrollo el camarón requiere

nutrimentos indispensables para desarrollar todo su potencial genético; de esta

etapa dependen en gran medida las características físicas, como son peso y

talla, del camarón adulto. En la madurez, el camarón utiliza los nutrimentos para

mantener las características físicas y funcionales desarrolladas durante la etapa

de crecimiento y para la reproducción de la especie (Rojas y col., 2005).

El cultivo de camarón data de hace varios siglos y se ha venido practicando

en diferentes países. La forma de cultivar estos organismos ha sufrido diversas

modificaciones de acuerdo a los lugares y a las circunstancias en que se ha

5

llevado a cabo, por esta razón existe una gran cantidad de sistemas de cultivo,

desde los más extensivos, hasta los hipertensivos; muchas veces resulta difícil

establecer la frontera entre un sistema y otro (Programa de información de

especies acuáticas, 2006)

Por cuestión de orden se han establecido los siguientes parámetros para

diferenciar entre cuatro sistemas principales (Programa de información de

especies acuáticas, 2006)

✓ Sistema Extensivo. Es aquel en el que se siembra de 1 a 2 camarones

por metro cuadro y los organismos son mantenidos en condiciones

naturales sin alimentación. La semilla es por lo general obtenida del

medio natural.

✓ Sistema Semiintensivo. Aquí el número de camarones sembrados es de 6

a 10 por metro cuadro y los organismos, aun cuando son mantenidos en

condiciones ambientales naturales, se les proporciona alimento

suplementario. La semilla puede ser obtenida del medio natural o través

de cultivo larvario en condiciones controladas.

✓ Sistema Intensivo. El número de camarones sembrados originalmente en

este sistema, va de 20 a 40 por metro cuadrado, a los organismos se les

proporciona alimentación y aireación artificial para poder mantener estas

altas densidades de población. La semilla es obtenida a través de cultivo

larvario en laboratorio.

✓ Sistema Hiperintensivo. También conocido como superintensivo. En este

sistema se siembra de 200 a 500 organismos por metro cuadrado y los

camarones son mantenidos con alimentación artificial, aireación e

intercambio continuo de agua. La semilla proviene de cultivos larvarios de

laboratorio.

La elección de uno u otro sistema de cultivo depende de diferentes factores,

tales como: capital disponible para la inversión, disponibilidad de terrenos para el

cultivo, área geográfica (Programa de información de especies acuáticas, 2006).

6

En la figura 1 se representan las diversas etapas para el cultivo del camarón.

Figura 1. Etapas del cultivo del camarón

7

I.1.1 Obtención de la semilla

Las postlarvas y juveniles para la siembra eran obtenidos normalmente por

captura del medio natural, aunque en la actualidad existen ya, laboratorios de

producción de larvas. En la forma natural la semilla es capturada de los sistemas

estuarinos en las épocas de mayor abundancia (Silva Rubio & Bermúdez

Huertas, 2013).

Uno de los problemas que enfrenta este tipo de obtención de semilla, es que

la población natural de estos organismos está sujeta a fluctuaciones

estacionales ocasionadas por diferentes parámetros, de tal manera que es

impredecible la disponibilidad de suficientes existencias en el momento en que

estas sean requeridas. Por otra parte, existe el problema de que en cierta forma

se está compitiendo con los pescadores de este recurso al capturar grandes

cantidades de juveniles que deberían volver al mar como adultos. En razón de

esto es cada vez mayor la tendencia a cultivar las larvas que luego se utilizaran

para la siembra (Silva Rubio & Bermúdez Huertas, 2013).

I.1.2 La Pre engorda

Las post-larvas o juveniles capturados o cultivados son colocados en un pre-

criadero, que por lo general consiste de un estanque cavado en tierra y

previamente fertilizado para promover el desarrollo de micro algas y

posteriormente de otros organismos que sirva de alimento al camarón, en

densidades de 150 por metro cuadrado, son mantenidos en esta área por

espacio de unos 30 a 40 días, durante los cuales se les proporciona alimento

complementario. Se toma en cuenta especialmente algunos parámetros del agua

y del sedimento (Chávez-Sánchez & Higuera Ciapara, 2003; Moreno y col.,

2008; Silva Rubio & Bermúdez Huertas, 2013).

8

I.1.3 Fertilización de los estanques

Además del alimento artificial o en algunos sistemas, en vez de este, se

fertilizan los estanques con el fin de promover la producción natural de

organismos que pueden servir de alimento al camarón: fitoplancton, macroalgas,

zooplancton y bentos (anélidos, ostrácodos, otros crustáceos). Sin embargo, la

fertilización depende de una serie de factores que hay que tener en cuenta tales

como: temperatura, fotosíntesis, naturaleza del suelo, intercambio de agua

(Chávez-Sanchez & Montoya-Rodriguez, 2006; Moreno y col., 2008; Silva Rubio

& Bermúdez Huertas, 2013)

I.1.4 Fertilizantes orgánicos

Se utilizan principalmente: gallinaza, estiércol de ganado vacuno y de cerdo.

La proporción de fertilizante orgánico es variable y depende de la calidad de

agua y de la productividad del sistema, generalmente se utilizan entre 1000 y

3000 Kg por hectárea, por cultivo. Puede en ocasiones promover mejor el

crecimiento que los inorgánicos por contener micro elementos que no contienen

aquellos. La aplicación de fertilizantes no tratados, puede promover el

florecimiento de grandes cantidades de bacterias, algunas de las cuales pueden

ser dañinas para los organismos cultivados (Moreno y col., 2008; Silva Rubio &

Bermúdez Huertas, 2013)

I.1.5 Fertilizantes inorgánicos

Los más usados son la urea y el superfosfato y se distribuyen en proporción

de 50 a 1000Kg/ha. La fertilización se puede llevar a cabo al principio del cultivo

y durante el mismo o ambas cosas (Moreno y col., 2008).

9

I.2 PROBLEMAS DEL CULTIVO DE CAMARONES

Con el desarrollo de los sistemas de producción intensiva e hiperintensiva,

han hecho también su aparición una serie de factores productores de mortalidad

que actúan directa e indirectamente sobre las poblaciones cultivadas y con

impactos de diferentes magnitudes (Espinoza, 2014).

Estos factores van desde organismos parásitos patógenos hasta factores

fisicoquímicos propios de la ecología de los acuarios, además de la acción de

organismos depredadores y errores humanos en el manejo del cultivo

(Thompson, 2004; Ponce y col., 2005)

Los principales problemas registrados fueron debido a muertes por hipoxia,

producida por la infestación de la cámara branquial por bacterias filamentosas y

protozoarios pedúnculos del orden Peritrichidae, debido a fallas de

mantenimiento y errores de operación en lo que se refiere a la aplicación de los

tratamientos químicos preventivos, y la regulación de flujos y procedimientos de

limpieza (Leyton & Riquelme, 2008).

El manejo excesivo del camarón durante las labores de limpieza o durante el

levantamiento de muestras para la estimación de las variables de las

poblaciones, puede ser factor de mortalidad (Ponce y col., 2005; Jayasree,

2006).

En los cultivos a cielo abierto, la depredación por aves de diversos órdenes y

familias, ha ocasionado una pérdida de hasta el 50% de la producción esperada.

La relativa poca profundidad y la transparencia de la columna de agua hacen

muy disponible la población para los depredadores (Jayasree, 2006; Leyton &

Riquelme, 2008).

La muerte por el rebasamiento de los límites letales de los factores

fisicoquímicos, debido a fallas en el manejo de los sistemas de recirculación,

aireación, o control de los recambios de agua (Leyton & Riquelme, 2008).

10

Al respecto de la temperatura, se ha registrado en diversas ocasiones que el

rebasamiento de los límites de los 18-20 0C y los 30-32 0C hacia abajo y hacia

arriba respectivamente producen la disminución del consumo del alimento, que

se acumula en el piso de las estructuras de cultivo, donde su putrefacción

conduce a una baja de las condiciones sanitarias (Leyton & Riquelme, 2008).

El canibalismo es un factor que en determinados momentos produce

mortalidades abundantes en las diferentes etapas del ciclo de cultivo. Durante el

desarrollo de todas las etapas del cultivo, la aparición del canibalismo significa

también una probable deficiencia de los niveles de alimentación, por lo que

deben aumentarse las raciones de alimento balanceado (Espinoza., 2014).

También se acentúa cuando la temperatura excede los 29-30 0C, y sobre todo

si coincide con fases terminales de las etapas del cultivo, donde el síntoma

precedente es la hiperactividad de la población y la aparición de mudas masivas

(Espinoza., 2014).

I.3 PRODUCTOS QUE MÁS SE EMPLEAN EN LOS CULTIVOS DE

CAMARONES

I.3.1 Alimentos naturales

✓ Cultivos de diatomeas

A partir del estadio larvario de protozoea 1, el camarón necesita de un

alimento para satisfacer sus requerimientos nutricios y energéticos, por lo que es

necesario agregar un alimento artificial del tamaño adecuado o producir un

florecimiento de fitoplancton, del tipo diatomeas, ya que hasta ahora estas

microalgas al ser suministradas como alimento a las diferentes especies han

dado los mejores resultados en cuanto a crecimiento y supervivencia (Pérez

Castro, 1997; Balda, 2016).

11

La diatomea utilizada como alimento para las larvas de camarón es

Skeletonema costatum, la cual no ha presentado problemas en cuanto a su

mantenimiento e incubaciones a temperaturas de 27 y 29 0C (Pérez Castro,

1997; Balda, 2016).

✓ La vitamina C

El uso de vitaminas, especialmente la vitamina C, a través del denominado

núcleo biotecnológico, parece estar ayudando a la supervivencia de los

camarones en las piscinas (Fenucci & Fernández, 2004; García, 2016; Talavera

& Zapata, 2016, Tacón, 2016)

✓ Kilol DF-100

Es una biomasa biológicamente activa extraída de la pulpa y semilla de la

toronja, con propiedades bactericida, fungicida, viricida, y antiparasitario de

amplio espectro altamente eficaz (Álvarez y col., 2016; Soluap, 2016).

Sus componentes otorgan un fortalecimiento a las funciones inmunológicas,

promoviendo la elaboración de ciertas enzimas imprescindibles para su

metabolismo (Álvarez y col., 2016; Soluap, 2016).

El kilol DF-100 es el único producto 100% orgánico natural aprobado por la

FDA y aceptado por organismos internacionales en defensa del medio ambiente

(Álvarez y col., 2016; Soluap, 2016).

Se lo utiliza en la desinfección de equipos de laboratorio, en la desinfección

de la artemia Salina después de eclosionar dando resistencia inmunológica a los

nauplios y desparasitando las larvas, además lo utilizan las empacadoras por

que ayuda a disminuir el uso de metasulfito de sodio e hipoclorito que son de

usos restringidos por el HCCCP (Álvarez y col., 2016; Soluap, 2016).

12

✓ Kilomar plus

Es aplicado en suelos y aguas de piscina camaroneras evita la proliferación

de organismos patógenos, aplicado al suelo contrarresta una elevada

descomposición orgánica. En el agua primordialmente actúa contra algas

nocivas, bacterias, hongos y virus, además de regular el pH (Álvarez y col.,

2016).

✓ Kilol SP 100

Es promotor del crecimiento con propiedades inmunoestimulantes directas y

que además mantiene el tracto digestivo del camarón libre de parásitos,

protozoarios y microorganismos patógenos en todas y cada una de las etapas de

desarrollo (Soluap, 2016).

✓ Biomasa del camarón

La biomasa se refiere al peso estimado de camarones en el estanque en un

momento dado y excluye a todas las demás especies ya sea peces y otros

organismos que pudiesen estar en el estanque (Álvarez y col., 2016).

✓ Verde malaquita

El verde de malaquita (C23H25ClN2 Pm 369.91 g mol-1) también denominado

verde de la anilina o verde básico, es un sólido de color verde oscuro. Disponible

en varias formas principalmente sal de oxalato o cloruro (Srivastava y col., 2004).

Se trata de un compuesto soluble en metanol y muy soluble en agua (figura 2).

Figura 2. Estructura química del verde de malaquita

13

Entre sus aplicaciones se puede destacar que el verde de malaquita es un

colorante que inicialmente se utilizó en la industria textil y del papel o como

aditivo en alimentos (Srivastava y col., 2004).

Sus aplicaciones más relevantes están relacionadas con su capacidad para

eliminar bacterias, protozoos (Tojo & Santamarina, 2001), cestodos, nematodos

(Hecht & Endermann, 1998). Además, es un excelente fungicida (Campbell y

col., 2001).

Como consecuencia de todas sus propiedades, actualmente en algunos

países está registrado como medicamento veterinario para peces ornamentales,

encontrándose prohibida su utilización en piscifactoría por su toxicidad.

(JOINT/FAO/WHO, 2008).

Estudios han indicado que la toxicidad de compuesto se incrementa cuando

se aumenta la temperatura o disminuye el pH (Srivastava y col., 2004). Entre los

efectos que presenta, destaca causar tumores hepáticos y renales en roedores

(Culp y col., 2006), así como anomalías en el sistema reproductivo

(JOINT/FAO/WHO, 2008).

✓ Leucoverde de malaquita

De formula (C23H26N2, Pm 330.47 g mol-1) es un metabolito producido a partir

del verde malaquita (figura 3). Se trata de un polvo blanco, que es ligeramente

soluble en agua. Este compuesto tiene una vida media bastante superior a la del

compuesto del que procede, siendo aproximadamente de 40 días (Roybal y col.,

1995; Plakas y col., 1996).

Figura 3. Estructura química del leucoverde de malaquita

14

Este compuesto puede considerarse como potencialmente tóxico, además de

poseer un alto potencial cancerígeno (Culp y col., 2002).

Diversos experimentos en ratones han demostrado que el leucoverde de

malaquita aumenta la incidencia de aparición de tumores en la tiroides, como

consecuencia de la inhibición de la peroxisada tiroidea. Además, se han

efectuado numerosos estudios sobre sus posibles propiedades genotóxicas.

Según estos, el leucoverde de malaquita es capaz de unirse covalentemente al

acido desoxirribonucleico (ADN), originando mutaciones en los genes del hígado

(CRD, 2010.).

15

I.4.- METODOLOGIA ANALITICA

I.4.1 Cromatografía liquida

La cromatografía líquida de alta eficacia se encuadra dentro de las

técnicas de elución. En ésta, un líquido (fase móvil), circula en íntimo contacto

con un sólido u otro líquido inmiscible (fase estacionaria). Al introducir una

mezcla de compuestos en la corriente de fase móvil, cada uno de ellos

avanzará a lo largo del sistema con una velocidad diferente que dependerá

de su afinidad por cada una de las fases. Esto supone que después de

terminado el recorrido de la muestra por la columna, cada uno de los

compuestos introducidos en el sistema eluirá con un tiempo diferente, es decir,

estarán separados (Gismera y Quintana, 2009).

Los diferentes tipos de cromatografía líquida se pueden clasificar de

diferentes maneras, pero la forma más habitual de clasificación es la realizada

en base a la naturaleza de la fase estacionaria, ya que es ésta la que impone

fundamentalmente el mecanismo de separación; de este modo, se pueden

enumerar cuatro tipos de técnicas (Gismera y Quintana, 2009):

✓ Cromatografía de adsorción (líquido-sólido).

La fase estacionaria es un adsorbente y la separación se basa en repetidas

etapas de adsorción-desorción.

✓ Cromatografía de reparto/adsorción (fases ligadas químicamente).

La separación en este caso, se basa en un reparto del soluto entre la fase

móvil y la fase estacionaria.

✓ Cromatografía de intercambio iónico.

Este tipo de cromatografía se da cuando la fase estacionaria presenta en

su superficie grupos ionizados capaces de retener selectivamente a iones de

16

signo contrario que circulan en la fase móvil.

✓ Cromatografía de exclusión molecular.

La fase estacionaria, en este caso, es un material poroso de tamaño de

poro controlado, que permite la entrada de ciertas moléculas de manera

selectiva, dejando fuera otras de mayor tamaño.

El mecanismo de retención en los dos primeros casos es similar, variando

únicamente el tipo de interacciones que se producen y de ellas cual sería la

predominante; por esta razón, en la práctica se realiza otra división de los dos

primeros tipos de cromatografía la cual está basada en la polaridad de la fase

estacionaria:

✓ Cromatografía de fase normal:

La fase estacionaria presenta puntos activos de alta polaridad y las

interacciones que se producen con el soluto son específicas del grupo activo. La

fase estacionaria puede ser un sólido adsorbente (sílice o alúmina), o bien, un

soporte al que se unen químicamente moléculas orgánicas que presentan grupos

funcionales de alta polaridad (ciano, amino, etc.).

✓ Cromatografía de fase reversa (inversa):

La fase estacionaria tiene una naturaleza apolar (cadenas hidrocarbonadas,

grupos fenilo) y las interacciones que se producen son inespecíficas (efecto

solvófobo).

I.4.2 Espectrometría de masas

La espectrometría de masas es, sin duda alguna, la técnica analítica

instrumental más extraordinaria y completa. Entre las cualidades que justifican

esta afirmación, de acuerdo con Esteban (1993), podemos citar:

17

a) Su capacidad de identificación, puede identificar cualitativamente y de

forma inequívoca, casi cualquier tipo de sustancia, desde átomos o

compuestos sencillos hasta moléculas extraordinariamente compleja y

lábiles.

b) Es cualitativa y cuantitativa, no solo es capaz de identificar las

sustancias analizadas proporcionando un espectro que es la ‘’huella

digital’’ de la molécula, sino que también puede cuantificar y medir la

concentración de las mismas.

c) Puede analizar mezclas complejas, es capaz de identificar una

sustancia, incluso en presencia de otras de composición similar.

d) Posee una gran sensibilidad puede detectar prácticamente cualquier

elemento en concentraciones del orden de hasta la ‘’ppq’’.

e) Es universal y específica, es decir, puede analizar sustancias o

mezclas de sustancias sólidas, liquidas o gaseosas.

f) Puede proporcionar información estructural de la molécula analizada,

energía de enlaces, información cinética, físico-química, cuántica, etc.

g) Es una técnica muy rápida, puede realizar un espectro en décimas de

segundo. Por ello puede utilizarse para monitorización de procesos,

suministrando información en tiempo real sobre la composición de una

mezcla de gases en un reactor.

18

I.4.3 Acoplamiento LC-MS/MS

Las técnicas que se usan rutinariamente en la actualidad para la introducción

y análisis de muestras liquidas por espectrometría de masas, se pueden

clasificar en dos grupos: las que solo introducen la muestra en la fuente iónica

del espectrómetro, y las que, además, consiguen la ionización ‘’blanda’’ de la

misma (Esteban, 1993).

La ionización por electrospray (ESI), al realizarse a presión y temperatura

prácticamente ambientales, es extremadamente suave, consiguiendo iones

quasi-moleculares intactos, evitando la rotura de enlaces de tipo covalente por

muy delicados que sean. Esta cualidad es muy conveniente en el análisis de

proteínas.

Otra cualidad importante de la ionización ESI es que la formación de aductos

es muy pequeña, y se eliminan muy eficazmente por bombardeo con moléculas

de gas envolvente, a su paso por la primera pre-cámara de vacío (Esteban,

1993).

Una de las limitaciones de la técnica electrospray ‘’clásica’’ es el limitado

rango de flujo de muestra que es capaz de aceptar, típicamente de 1 a 50 µl/min,

aunque ya se han desarrollado técnicas de nebulización asistida

neumáticamente, que son capaces de aceptar flujos de 1ml/min o más. Estas

técnicas asistidas en algunos casos reciben el nombre de ‘’Mega Flow’’

(Esteban, 1993).

El espectro obtenido por ESI es totalmente diferente al que se consigue por

otras técnicas de ionización, y consiste en una serie de señales discretas a lo

largo de todo el dominio espectral, que corresponden, cada una de ellas, a una

molécula intacta cargada con diferente número de cargas, y con un cierto

número de protones añadidos, de tal modo que la diferencia entre señales

adyacente es un protón.

19

El analizador cuadrupolar, filtro de masas cuadrupolar o, simplemente

cuadrupolo, está formado por cuatro barras o polos de sección cilíndrica o

hiperbólica, alineadas paralelamente entre sí, y equidistante una distancia de ro

de un eje central imaginario situado sobre el eje Z cartesiano.

Mediante la aplicación a cada pareja de barras opuestas, de voltajes variables

de corriente continua (DC) y de radiofrecuencia (RF) superpuestos, se consigue

que iones de masas determinadas pasen por el ‘’túnel’’ formando por las cuatro

barras polares, siguiendo trayectorias oscilantes estables que conducen al

detector, mientras que las demás masas, al ser inestables sus trayectorias, no

alcanzan el detector, siendo desviadas fuera del conjunto de barras. Variando

convenientemente estos voltajes se puede ir enfocando de modo sucesivo las

diferentes masas presentes, y así obtener el espectro correspondiente (Esteban,

1993).

20

CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS

II.1 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN

El tipo de diseño de investigación que se aplicó a este proyecto corresponde

al tipo experimental.

II.2 DELIMITACION

El estudio se llevó a cabo en el Laboratorio del Instituto Nacional de Pesca-

Guayaquil Ecuador, siguiendo los procedimientos descritos por Sanders y col.,

(2005) y Tao y col., (2007) y establecidos en el laboratorio.

II.3 MUESTRA

Las muestras trabajadas en el presente estudio consistieron en muestras de

camarón de exportación en diferentes presentaciones (congelado entero,

congelado semicocido, congelado limpio, en mariposa), recibidas en el

laboratorio de análisis durante los meses de julio a diciembre de 2015, para

recibir certificado de venta.

II.4 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS

II.4.1. Equipos

▪ Licuadora de Laboratorio ▪ Balanza analítica Máx. 210 g d= 0.01 mg, ▪ Agitador vórtex ▪ Micro centrífuga ▪ Centrífuga refrigerada ▪ Equipo de ultrasonido ▪ Bomba de Vacío y Presión ▪ Equipo para filtración de fases móviles con membranas de filtración, tipo

PVDF, tamaño de poro 0.22 µm, 47 mm diámetro ▪ Estufa ▪ Sorbona

21

▪ Sistema de Purificación de agua ▪ Thermohigrómetro de pared ▪ Refrigeradora ▪ Congelador horizontal ▪ Cromatógrafo Líquido Alliance 2695 XE, con desgasificador en línea,

automuestreador, horno para columna, Waters ▪ Espectrofotómetro de Masas, cuadrupolo tandem Quattro Premier XE

system (Micromass, Altrincham, Cheshire, UK). ▪ Columna Symmetry Waters C18, 3.5 um, 2.1 x 100 mm, y precolumna

Waters C18, 3.5 um

II.4.2. Materiales

▪ Pipeta automática 1-5 ml ▪ Micropipeta 1000 µl ▪ Micropipetas 100-1000 µl ▪ Pipeta automática 2000 µl ▪ Pipeta automática 2-10 µl ▪ Pipeta automática 1-5 ml ▪ Micropipeta 1000 µl ▪ Micropipetas 100-1000 µl ▪ Tubos de centrífuga de polipropileno, 15 y 50 ml ▪ Viales de 2 ml de capacidad para HPLC con tapa

II.4.3. Reactivos

• Acetonitrilo grado HPLC

• Acido Fórmico 98%

• Agua grado HPLC

• Metanol grado HPLC

• Clorhidrato de Hidroxilamina ≥ 99%

II.4.4 Estándares

• Estándar de leucoverde de malaquita Pureza: ≥ 92.5% (condiciones de almacenamiento: 20º C ± 4º C)

• Estándar de verde de malaquita Pureza: ≥ 93.5% (condiciones de almacenamiento: 20º C ± 4º C)

22

II.5 DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO

II.5.1 Preparación de soluciones estándar

Sustancia estándar de verde de malaquita en polvo de pureza 93.5 %. Pesar

14.20 mg de la sustancia y diluir a 100 ml con acetonitrilo, esta solución tendrá

una concentración de 100 µg/ml (ppm), la misma tendrá una estabilidad de un

mes.

II.5.1.1 Soluciones stock de VM y LVM

✓ Solución de verde de malaquita stock (referencia)

Sustancia estándar de verde de malaquita en polvo de pureza 93.5 %. Pesar

7.5 mg de la sustancia y diluir a 50 ml con acetonitrilo, esta solución tendrá una

concentración de 100 µg/ml (ppm), la misma tendrá una estabilidad de 1 año, no

obstante, deberá controlarse la señal de lectura con el estándar de trabajo de 5

µg /kg.

✓ Solución de leucoverde de malaquita stock (referencia)

Sustancia estándar de leucoverde de malaquita en polvo de pureza 99.9 %

EA. Pesar 10.16 mg de la sustancia y diluir a 100 ml con acetonitrilo, esta

solución tendrá una concentración de 100 µg/ml (ppm), esta solución tendrá una

duración de un mes.

✓ Solución de leucoverde de malaquita stock (referencia)

Sustancia estándar de leucoverde de malaquita en polvo de pureza 92.5 %.

Pesar 5.4 mg de la sustancia y diluir a 50 ml con acetonitrilo, esta solución

tendrá una concentración de 100 µg/ml (ppm), la misma tendrá una estabilidad

de 1 año, no obstante, deberá controlarse la señal de lectura con el estándar de

trabajo de 5 µg /kg.

23

✓ Solución estándar de VM de 100 µg /kg

Tomar 100 µl de solución stock (100 ppm) y diluir a 100 ml con acetonitrilo

puro. Almacenar en frascos ámbar de 25 ml y en refrigeración. Esta solución es

estable por 6 meses.

✓ Solución estándar de LVM de 100 µg /kg



estable por 6 meses.

II.5.1.2 Soluciones de trabajo

✓ Solución mezcla estándar de trabajo de VM y LVM de 5 µg /kg

Tomar 500 µl de cada una de las soluciones estándar de VM y LVM de 100

µg /kg y diluir a 10 ml con acetonitrilo puro. Esta solución es utilizada para

fortificar las muestras y se preparará semanalmente.

✓ Solución mezcla estándar de trabajo de VM y LVM de 10 µg /kg

Tomar 1000 µl de cada una de las soluciones estándar de VM y LVM de 100

µg /kg y diluir a 10 ml con acetonitrilo puro. Esta solución es utilizada para

fortificar las muestras y se preparará semanalmente.

II.5.1.3 Soluciones del estándar interno D6-LVM

• Solución stock LVM D6 (referencia)

Sustancia estándar de leucoverde de malaquita D6 en polvo de pureza 98.5

% EA. Pesar 2.53 mg de la sustancia y diluir a 25 ml con acetonitrilo, esta

solución tendrá una concentración de 100 µg/ml (ppm), tendrá una duración de

un año.

24

• Solución estándar de D6-LVM de 100 µg /kg



estable por 1 mes.

• Solución estándar de trabajo de D6-LVM de 20 µg /kg

Tomar 2000 µL de solución madre (100 µg /kg) y diluir a 10 ml con acetonitrilo

puro. Esta solución es utilizada para fortificar las muestras, se adicionan 200 µl

del estándar interno. Esta solución debe prepararse semanalmente.

II.5.2 Preparación de curva de calibración

✓ Preparación de curva de calibración en matriz con una mezcla de

soluciones estándar de verde de malaquita y leuco verde de

malaquita:

Para obtener la curva de calibración se parte de una mezcla estándar de

concentración de 5 y 10 µg /kg de VM y LVM que se diluye con acetonitrilo puro.

Se pesan 2 g de la matriz a utilizar en tubos de 50 ml con tapa, los necesarios

para preparar 6 puntos de la curva de calibración. En cada uno de los tubos se

adicionan 200 µl del estándar interno LVM D6 de 20 µg /kg, luego se toma por

separado 50, 100 y 200 µl de la mezcla de estándares de concentración de 5 µg

/kg; 400 y 1000 µl de la mezcla de estándares de concentración de 10 µg /kg y

se fortifican en las matrices para obtener concentraciones de 0.25, 0.50, 1.0, 2.0,

y 5.0 µg /kg de cada analito, además de estas concentraciones, se prepara un

estándar de blanco matriz al cual solo se le adiciona 200 µl el estándar interno

LVM D6 de 20 µg /kg.

25

A cada tubo utilizado para la curva de calibración se deberá adicionar agua

pura, para completar un volumen total 1200µl. En la tabla I, se especifican los

volúmenes a añadir a cada muestra que se emplea en la curva de calibración.

Tabla I. Cantidad en µl de soluciones de estándares y agua pura utilizadas para

la preparación de la curva de calibración de VM y LVM.

Una vez realizada la extracción de los analitos, para la inyección en el equipo

se colocan los extractos en viales de 2000 µl de las diferentes concentraciones

de VM Y LVM estándar filtrándolos previamente a través de un filtro de jeringa de

PTFE de 0.22 µm de poro, luego se procede a inyectar en el equipo.

Todas las soluciones de trabajo deben cumplir las siguientes especificaciones:

• La solución madre se rotulará con su respectivo nombre, se indicará la

concentración y se añadirá la fecha de preparación y técnico responsable

de la preparación.

MEZCLA DE

METABOLITOS DE VM y

LVM

VOLÚMEN A TOMAR

PARA FORTIFICAR LA

MATRIZ

µl

CONCENT.

FINAL

µg/kg

Volumen de

Agua

µl

LEUCOVERDE DE MALAQUITA D6 20 µg/kg

200 2.00 800

MIX DE VM y LVM 5 µg/kg

100 0.25 900

MIX DE VM y LVM

5 µg/kg

200 0.50 800 µl

MIX DE VM y LVM

5 µg/kg

400 1.00 600 µl

MIX DE VM y LVM

10 µg/kg

400 2.00 600 µl

MIX DE VM y LVM

10 µg/kg

800 4.00 200 µl

MIX DE VM y LVM

10 µg/kg

1000 5.00 0.00 µl

26

• Las botellas o matraces que contienen los estándares de trabajo se

marcarán con la concentración del estándar preparado, expresado en

µg/kg.

• Cada solución estándar o patrón serán registradas en formato: Preparación

de soluciones madres concentradas y diluidas (RQA3_OP5.6.3)

II.5.3 Preparación de reactivos (hidroxilamina)

✓ Solución de hidroxilamina hidrocloruro 5 g/l (w/v)

Disolver 5 g ± 0.0100 de hidroxilamina hidrocloruro en agua y aforar a 1000

ml. Esta solución tiene una estabilidad de cuatro meses.

II.5.4 Preparación de la fase móvil

A: Metanol HPLC

Filtrar con vacío a través de una membrana de PVDF, 47 mm diámetro, 0.22

µm de poro, la cantidad necesaria a utilizar.

B: Agua con 0.1 % v/v de ácido fórmico

✓ Medir 500 ml de agua en una probeta de 1 L.

✓ Medir 500 µl de ácido fórmico

✓ Mezclar las dos soluciones en un frasco de 500 ml

✓ Filtrar con vacío a través de una membrana de PVDF, 47 mm diámetro, 0.22 µm.

✓ Sonicar por 2 minutos.

✓ Preparar cada vez que se requiera.

27

II.6 CONDICIONES ANALÍTICAS

Para llevar a cabo la separación de las muestras se estableció las

concentraciones del sistema de disolventes en función del tiempo. Los

gradientes de concentración se presentan en la tabla II.

Tabla II. Gradientes de concentraciones de la fase móvil.

II.6.1 Verificaciones preliminares

➢ Cromatógrafo Líquido Alliance 2695 XE

Al iniciar el proceso de análisis se deberá revisar las condiciones del equipo

que incluye lo siguiente:

✓ Condiciones de las fases móviles

✓ Purga de las fases móviles de cada una de las vías

✓ Purga de inyector (se deberá observar que no haya burbujas en él)

✓ Purga de la bomba de lavado de sello

✓ Purga del sistema de lavado de agujas.

✓ Acondicionamiento de la columna (Gradiente)

➢ Espectrómetro de Masas

✓ Se procederá a revisar el estado del espectrómetro por medio de los

siguientes parámetros:

TIEMPO (min)

A % B % FLUJO

0.00 30.0 70.0 0.600

2.00 90.0 10.0 0.600

6.00 90.0 10.0 0.600

6.00 30.0 70.0 0.600

10.00 30.0 70.0 0.600

28

✓ Observar el estado de las partes externas del equipo como el cono de

muestreo, flujo del capilar.

✓ Vacío del sistema: Collision Cell Pirani, Analyser Penning

✓ Verificar el correcto flujo del nitrógeno y argón

➢ Parámetros del HPLC (Inlet method)

✓ Archivo en Mass lynx: VM Y LVM grad waters symmetry 10 min

✓ Sistema: Waters Alliance 2695

✓ Condiciones del HPLC 2695

Columna: C18 3.0 µm 150 X 2mm

Rango del Flujo: 0.2 ml/min

Volumen de Inyección: 15 µl/min

Tiempo de corrida: 10 min

➢ Condiciones iniciales de la bomba

Solventes

A% 30.0 FM A: metanol puro

B% 70.0 FM B: agua: ácido fórmico 0,1

Desgasificador continuo

Stroke volumen 50.0 µl

➢ Condiciones del sistema al inicio y fin del análisis

Rampa de flujo 2.00

Flujo (ml/min.) 0.600

Tiempo de parada (min.) 10.0

Temperatura de la columna (ºC) 40.0

Temperatura Límite de la columna (ºC) 5.0

Presión Mínima (Bar) 0.0

Presión Máxima (Bar) 300.0

Volumen de la Pre columna (µl) 0.0

Posición de la columna Columna 1

29

➢ Condiciones iniciales del auto muestreador

➢ Parámetros del método MS (MS Method)

Modo de Ionización: ES+

Tipo de Data: SIR o MRM data

Tipo Función: MRM de 5 canales

Las condiciones del espectrómetro de masa fueron ajustadas y las

condiciones de trabajo utilizadas se presentan en la tabla III.

Tabla III. Transiciones monitoreadas para la detección de (verde y leucoverde de

malaquita).

ION PRECURSOR

(m/z)

ION PRODUCT

(m/z)

DWELL (Secs)

CONE (Volts.)

COL. ENERGY

RTW (mins) ANALYTE

329.08 312.9 0.500 60.00 38.00 4.35 ± 0.5

min.

VM (Q)

329.08 207.82 0.500 60.00 48.00 VM (C)

331.16 239.01 0.500 33.00 30.00 7.3 ± 0.255

min.

LVM (Q)

331.16 315.96 0.500 33.00 20.00 LVM (C)

337.12 239.93 0.500 33.00 30.00 7.3 ± 0.5 min.

LVM D6

Leyenda: Q: Ion de Cuantificación, C: Ion de Confirmación, RTW: Tiempo de

retención de la ventana; DWELL: ventanas de tiempo; COL: Energía de colisión;

CONE: Fuente de ionización.

Velocidad de arrastre normal

Profundidad de la aguja 2.00

Temperatura de la muestra (ºC) 10.0

Límite de temperatura de la muestra (ºC) 5.0

30

II.6.2 Registro de observaciones y de los resultados

El proceso de cuantificación y registro de los resultados se efectuará con el

módulo Quanlynx del software Masslynx este archivo será creado bajo

extencion.mdb.

El software Quanlynx, realizará de forma automática los cálculos estadísticos

para la realización de la curva de calibración por medio de la regresión lineal, el

cual registrará la ecuación que caracteriza a la curva y por intermedio de ella se

efectuará la cuantificación de las muestras.

La expresión de los resultados se hará en (µg/Kg)

Para cada día de análisis se generará una nueva curva de calibración que se

guardará con la fecha de ese día.

Luego de obtenidas las lecturas en el sistema LC-MS/MS, se imprimen, firman y

guardan en su respectivo registro.

La información es respaldada mensualmente en memoria externa

II.7 PREPARACIÓN DE MUESTRAS

Se deberá preparar un blanco matriz, previamente licuado, homogenizado y

analizado para confirmar que no contiene el analito a investigar. La muestra

deberá ser colectada del tejido muscular comestible para obtener una buena

homogenización de la misma. Deberá también, almacenarse una contra muestra

de la misma tal como llegó al laboratorio con el código de identificación y congelar

la muestra para conservación.

31

II.7.1 Preparación del blanco de reactivo

Colocar 1000-2000 µl de acetonitrilo en un vial y proceder a su lectura.

II.7.2 Preparación del blanco matriz

Pesar 2 g ± 0.010 g del tejido homogenizado preparado para blancos, en un

tubo de polipropileno (tubo 1) con tapa de 50 ml, fortificar con 200 µl de D6 LVM

de 20 µg/kg, agitar para homogenizar, dejar en agitación por 15 minutos y

proceder a su extracción.

II.7.3 Fortificación de las muestras de control

Pesar 2 g ± 0.010 g del tejido homogenizado preparado (muestra blanco), en

dos tubos de polipropileno de 50 ml con tapa, por duplicado. Fortificar cada uno

con 200 µL de mezcla de estándares de VM y LVM de 5 µg/kg para obtener una

concentración de 0.5 µg/kg, agitar para homogenizar, dejar en agitación por 10

minutos y proceder a su extracción.

II.7.4 Extracción de muestras

• Pesar 2 g ± 0.0100 g de muestra en tubos de 50 ml. de capacidad, igual

peso de tejido (según matriz a analizar), se utiliza para blancos, curva de

calibración y controles.

• Proceder a fortificar las muestras con adición de 200 µl del estándar

interno D6-leucoverde de malaquita (D6 LVM) de concentración de 20

µg/kg, fortificar también una matriz para blanco, puntos de la curva

controles según la matriz a analizar.

• Adicionar 2 ml de una solución de hidroxilamina hidrocloruro de 5 g/l a las

muestras fortificadas de tejido animal, vortear para homogenizar bien.

• Fortificar una matriz de control con 200 µl a partir de una mezcla de

estándar de verde malaquita y leucoverde de malaquita (VM y LVM) de

concentración de 5 µg/kg en el caso de muestras de tejido animal, cuya

concentración será de 0.50 µg/kg; para insumos, alimentos nutricionales

32

y aditivos, se fortificará un control con 400 µl de una mezcla de estándar

de verde malaquita y leucoverde de malaquita (VM y LVM) de

concentración de 5 µg/kg, la concentración final será de 1.0 µg/kg.

• Adicionar luego a las matrices fortificadas y muestras, agua destilada

hasta completar 1200 µl según el caso.

• Vortear para lograr una mejor homogenización luego agitar las muestras

fortificadas por 10-15 minutos mínimos.

Extracción de los analitos de verde malaquita y leucoverde de malaquita

• Adicionar en cada tubo 8 ml de acetonitrilo.

• Agitar por 10 minutos aproximadamente.

• Centrifugar a 5000 rpm por 10 minutos a 4ºC los tubos de 50 ml.

• Tomar aproximadamente 2 ml del sobrenadante con ayuda de una jeringa

y filtrar la solución a través de un filtro de jeringa de PTFE de 0.22 µm de

poro.

• Transferir el líquido filtrado a viales de 2 ml de capacidad, luego proceder

a su lectura en el LC-MS/MS por inyección de un volumen de 15 µl.

33

CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

En este trabajo, se llevó a cabo el análisis de muestras de camarón de

exportación, con el objetivo de detectar la presencia de verde de malaquita y

leucoverde de malaquita. El uso de estos compuestos en productos acuícolas, no

está permitido en varios países del mundo, debido a su efecto altamente tóxico y a

los residuos persistentes en el ambiente acuático al emplearse en terapias de

inmersión (Andersen et al., 2006; Según Chalén et al., 2010).

Según diversos autores, estos colorantes son usados globalmente como

antifúngicos y antiparasitarios en peces y mariscos de importancia en acuicultura,

pero es de señalar que, en el tejido de los peces y mariscos, existe un alto

contenido lipídico que permite una elevada absorción y acumulación de estos

compuestos (EC, 2003; Andersen et al., 2006 y Chalén et al., 2010).

Como método de análisis en el estudio para la detección del VM y LVM, se

empleó la cromatografía líquida acoplado a espectrometría de masas en tándem

(LC/MS/MS), por su sensibilidad y especificidad, ya que la Regulación Europea

tiene establecido un límite mínimo de Ejecución requerida (MRPL), que es la

sumatoria de 2 µg/Kg para ambos colorantes (CE, 2003).

En el ensayo de detección cualitativo se inyectaron soluciones de estándar de

una concentración de 1 µg/kg para VM y LVM D6 y LVM respectivamente,

estableciendo los tiempos de retención tal como se muestran en la tabla IV. En la

figura 4 se visualizan los cromatogramas de una de las réplicas obtenidas para

cada patrón a la concentración señalada.

34

Tabla IV. Valores de tiempos de retención (Tr) y áreas para la concentración de 1

µg/kg de los patrones.

Muestras Resultados

Tr (min) Áreas (mV.min) ± SD

VM 4,42 329,2 ± 0,03

LVM 7,26 337,25 ± 0,04

Leyenda: SD= desviación estándar

Figura 4. Cromatogramas de los estándares de VM y LVM

Para la determinación cuantitativa de los colorante VM y LVM se elaboró una

curva de calibración a partir de las concentraciones 0,25; 0,50; 1,00; 2,00; 4,00 y

5,00 µg/kg de las matrices fortificadas (X) vs áreas de los picos cromatográficos

(Y).

La curva de calibración para cada uno de los analitos fue determinada por medio

del método del estándar interno, utilizando LVM D6. Para ambos se obtuvo un

buen ajuste de la recta, buena linealidad para cada compuesto, constituyendo un

buen indicador de la ejecución analítica (Chalén et al., 2010).

35

La curva de calibración para el LVM D6 empleado como estándar interno, se

presenta en la figura 5.

Figura 5. Curva de calibración para el LVM D6 empleado como patrón interno.

Para el VM en el rango de concentraciones evaluadas se logró una buena

correlación entre las concentraciones y las áreas, obteniendo una ecuación de la

recta de Y = 0,56942X +0,0012449 con un valor de coeficiente de correlación (r) de

0,999853 (r >0,99) (figura 6).

Figura 6. Curva de calibración para VM.

36

Para el LVM, se logró de igual forma una buena correlación, obteniendo una

ecuación de la recta de Y = 1,35991X + 0,00654114 con un valor de coeficiente de

correlación (r) de 0,999853 (figura 7)

Figura 7. Curva de calibración para LVM.

En la figura 8 se muestran algunos de los cromatogramas obtenidos de

muestras de camarón analizado, donde no se detectaron, los picos cromatográficos

correspondientes a los compuestos investigados, es decir, que, de estar presentes,

su concentración se encuentra por debajo del límite de detección del equipo.

Figura 8. Cromatogramas de VM y LVM en matrices de camarón.

37

En general, los resultados evidenciaron valores que se ubicaron por debajo del

límite de cuantificación. Esto indica que las empresas dedicadas a la actividad de

producción y exportación de camarón, reconocen la función importante que tienen

en la producción de alimentos inocuos, pues de lo contrario el uso indebido de

estas sustancias traería consecuencias graves a la salud humana, dado que los

alimentos destinados a la nutrición constituyen una fuente de introducción de

potenciales contaminantes en la cadena alimentaria (FAO, 2008).

Los resultados obtenidos, muy por debajo del límite de detección, demuestran

que los acuicultores han tomado conciencia en el uso de este tipo de productos y

reconocen los efectos que estos residuos ocasionan tanto en el hombre como al

ambiente, por lo que están limitando la utilización de los mismos (Chalén et al.,

2010).

La importancia de este trabajo radica en su contribución a garantizar la

inocuidad de los camarones de exportación a fin de prevenir los peligros que estos

colorantes pueden producir.

La información brindada contribuye a los protocolos de vigilancia y control de

factores de riesgo debido al uso de estas sustancias durante la producción de

alimentos, particularmente en las empresas camaroneras.

En general la técnica analítica LC-MS/MS, empleada como método para la

detección de los residuos de VM y LVM, ha permitido la determinación selectiva de

estos compuestos, a través de los resultados obtenidos en la matriz estudiada.

Como último aspecto es importante señalar, que el acuerdo ministerial 227 del

Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca, establece al Instituto

Nacional de Pesca (INP) como el ente regulador de esta actividad y el único

responsabilizado en otorgar el certificado de calidad a los productos pesqueros de

las diversas empresas del país, por lo que el incumplimiento de las observancias

establecidas, puede ocasionar, no solo, la no emisión del certificado al producto,

sino también el retiro del permiso de funcionamiento de la empresa.

38

El protocolo seguido por el laboratorio de control de calidad del INP, comprende

los siguientes pasos en caso de detectar muestras positivas:

1. Se notifica al área de verificación que la muestra es positiva y que se

proceda a enviar la contra muestra y muestra a dirimir que se encuentra bajo

la custodia del área de verificación.

2. Verificación procede a enviar la contra muestra y muestra a dirimir previa

notificación al usuario para que proceda con la realización del pago para el

nuevo análisis.

3. El control de muestra ingresa al sistema automatizado la muestra y asigna al

área correspondiente.

4. Se procede a realizar el análisis de forma inmediata.

5. En caso de salir positivo una de las dos muestras o las dos muestras se

procede a comunicar a verificación para que active el sistema de gestión de

crisis.

6. Si salen dos muestras negativas se considera el resultado negativo.

39

CAPÍTULO IV. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

IV.1 CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos permiten arribar a las siguientes conclusiones:

✓ Se evaluaron durante los meses de estudio, diferentes muestras de

camarones de exportación, aplicando la técnica LC-MS/MS, la cual

resultó adecuada para este tipo de análisis.

✓ No se detectó la presencia de los colorantes VM y LVM en las muestras

analizadas.

✓ Existe, apoyado en la Resolución Ministerial 227 del Ministerio de

Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca, un Plan Nacional de Control.

Proceso de Aseguramiento de la calidad pesquera, acuícola y ambiental

(ACPAA), que establece los pasos a seguir cuando se detecta muestras

positivas en los análisis.

40

IV.2 RECOMENDACIONES.

Aunque en ninguna de las muestras analizadas se encontró estos colorantes y

teniendo en cuenta el riesgo que representan para la salud del hombre y el

medio ambiente, debe continuarse una estricta vigilancia sobre los productos

que se analicen.

41

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