UNIVERSIDAD DE COLIMA -...
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UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE MEDICINA BASES ESTRUCTURALES MOLECULARES DEL BLOQUEO DEL CANAL DE POTASIO RECTIFICADOR ENTRANTE Kir2.1 POR CLOROQUINA TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS PRESENTA M. en C. ALDO AZMAR RODRÍGUEZ MENCHACA ASESOR Dr. JOSÉ ANTONIO SÁNCHEZ CHAPULA COASESOR Dr. RICARDO ANTONIO NAVARRO POLANCO COLIMA, COL, NOVIEMBRE DE 2007
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UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE MEDICINA
BASES ESTRUCTURALES MOLECULARES DEL BLOQUEO DEL CANAL DE POTASIO RECTIFICADOR ENTRANTE Kir2.1 POR
CLOROQUINA
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOR EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS
PRESENTA
M. en C. ALDO AZMAR RODRÍGUEZ MENCHACA
ASESOR
Dr. JOSÉ ANTONIO SÁNCHEZ CHAPULA
COASESOR
Dr. RICARDO ANTONIO NAVARRO POLANCO
COLIMA, COL, NOVIEMBRE DE 2007
A mis padres, Delma y Antonio
a mis hermanos, Arelí, Albián y Anuar
a Mayra
por su gran amor y apoyo
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. José Antonio Sánchez Chapula
Al Dr. Ricardo Antonio Navarro Polanco
Al Dr. Colin G. Nichols Washington University in St. Louis
Al Dr. Martin Tristani Firouzi University of UTAH
A mis compañeros y amigos
Gabriel, Martín, Iván, Edgar, Eloy, Arael, Miguel, Angélica, Daniela y muchos otros que me han brindado su amistad.
A los revisores de este proyecto por sus valiosas sugerencias.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, por el apoyo económico otorgado para la realización de este Doctorado.
ÍNDICE
ÍNDICE DE FIGURAS 1
ABREVIATURAS 2
RESUMEN 4
ABSTRACT 5
ANTECEDENTES 6
Identidad molecular de los canales rectificadores entrante cardiacos 8
Mecanismo de la rectificación entrante o “anómala” 10
Farmacología de los canales de potasio rectificadores entrantes 16
Efectos electrofisiológicos de la cloroquina 17
JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROYECTO 21
HIPÓTESIS 24
OBJETIVOS 25
METODOLOGÍA 26
Biología molecular 26
Transfección de DNA en la línea celular HEK-293 26
Experimentos de fijación de voltaje en la línea celular HEK293 26
Análisis de los datos 27
RESULTADOS 28
La cloroquina aplicada del lado extracelular bloquea preferentemente las
corrientes salientes del canal Kir2.1 28
La cloroquina bloquea los canales Kir2.1 por la superficie citoplasmática 29
Dependencia de voltaje del bloqueo por cloroquina 32
El desbloqueo de la cloroquina a voltajes negativos a EK es dependiente de [K+]
extracelular 35
Los bloqueadores endógenos no protegen al canal Kir2.1 del bloqueo por
cloroquina 37
El sitio de unión de la cloroquina en el canal Kir2.1 es dentro del poro
citoplasmático 40
Modelo de bloqueo del canal Kir2.1 por cloroquina en presencia de bloqueadores endógenos 42
DISCUSIÓN 43
CONCLUSIONES 48
BIBLIOGRAFÍA 49
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Curvas corriente-voltaje de una conductancia linear y una que presenta rectificación entrante.
7
Figura 2 Topología de una subunidad de un canal de K+ de rectificación entrante.
9
Figura 3 Estructura general de los canales rectificadores entrantes. 10 Figura 4 Esquema del modelo hipotético del mecanismo de
compuerta (“gating”) de los canales Kir. 11
Figura 5 Modelo del “largo poro” de conducción de los canales Kir basado en las estructuras cristalizadas de los canales Kir2.1 y KirBac1.1.
13
Figura 6 Modelo del bloqueo del canal Kir2.1 por espermina. 14 Figura 7 Modelo del bloqueo secuencial del canal Kir2.1 por
espermina. 15
Figura 8 Efecto de la cloroquina en potenciales de acción de fibras de Purkinje y miocitos ventriculares de gato.
18
Figura 9 Efecto de la cloroquina sobre Ik1 en miocitos ventriculares de gato.
19
Figura 10 Estructura química de la cloroquina. 22 Figura 11 Inhibición del canal Kir2.1 expresado en células HEK293
por cloroquina. 29
Figura 12 Efecto de la cloroquina sobre el canal Kir2.1 durante un potencial de acción ventricular de gato.
30
Figura 13 Curso temporal del bloqueo por cloroquina de los canales Kir2.1.
31
Figura 14 Efecto de la cloroquina sobre los canales Kir2.1 en ausencia de bloqueadores endógenos.
33
Figura 15 Cinética del desbloqueo de cloroquina en los canales Kir2.1.
34
Figura 16 Relaciones corriente relativa-voltaje del bloqueo del canal Kir2.1 por cloroquina.
35
Figura 17 El desbloqueo de cloroquina a voltajes negativos a EK es dependiente de voltaje y de [K+]o.
36
Figura 18 Lenta recuperación del bloqueo por cloroquina del canal Kir2.1.
38
Figura 19 La espermina no protege a los canales Kir2.1 del bloqueo por cloroquina.
39
Figura 20 Mutaciones por alanina de las regiones del poro transmembranal y citoplasmático del canal Kir2.1.
41
Figura 21 Modelo en caricatura del bloqueo por cloroquina del canal Kir2.1.
42
ABREVIATURAS
ATP: trifosfato de adenosina.
Ba2+: bario.
CO2: dióxido de carbono.
CQ: cloroquina.
CTRL: control.
ADN: ácido desoxirribonucleico.
ARN: ácido ribonucleico.
EK: potencial de equilibrio para el potasio.
FV: fibrilación ventricular.
GFP: proteína verde fluorescente.
ICa-L: corriente de calcio tipo L.
IK1: corriente de potasio de rectificación entrante cardiaca.
IKACh: corriente de potasio activada por acetilcolina.
IKATP: corriente de potasio modulada por la concentración intracelular de ATP.
IKur: corriente de potasio de rectificación tardía ultrarrápida.
IKr: corriente de potasio de rectificación tardía rápida.
IKs: corriente de potasio de rectificación tardía lenta.
INa: corriente de sodio.
Itof: corriente de potasio transitoria rápida.
Itos: corriente de potasio transitoria lenta.
IKp: corriente de meseta.
K+: potasio.
Kd: constante de disociación.
KirBac1.1: canal de K+ rectificador entrante bacteriano.
Phe: fenilalanina.
TEA: tetraetil amonio.
VIH-1: virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1.
Z: valencia.
[K+]o: concentración de potasio extracelular.
[Na+]: concentración de sodio.
RESUMEN
Aunque la cloroquina continua siendo un importante agente terapéutico para el
tratamiento de la malaria en muchas partes del mundo, su margen de seguridad es
muy estrecho. La cloroquina inhibe la corriente de K+ de rectificación entrante
cardiaca IK1 y puede inducir arritmias ventriculares letales. En el presente estudio,
caracterizamos las bases moleculares y biofísicas del bloqueo por cloroquina del
canal Kir2.1 que forma la corriente IK1 cardiaca. La dependencia de voltaje y de K+
del bloqueo por cloroquina implica que el sitio de unión esta localizado en el poro de
conducción. Mutaciones sitio-dirigidas revelaron que el sitio de unión de la
cloroquina es dentro del poro citoplasmático y no dentro del poro transmembranal. A
diferencia de la mayoría de los bloqueadores de canales, la cloroquina no se une
dentro del poro transmembranal y puede ocupar su sitio de unión aun cuando las
poliaminas permanezcan unidas profundamente en el poro. Estos resultados explican
como un fármaco de relativa baja potencia como la cloroquina puede efectivamente
bloquear la corriente IK1 aún en presencia de bloqueadores endógenos de alta
afinidad. Por otro lado, nuestros resultados proporcionan un marco estructural para el
diseño de compuestos alternativos más seguros que carezcan del efecto de
bloqueo sobre el canal Kir2.1.
ABSTRACT
While chloroquine remains an important therapeutic agent for treatment of malaria
in many parts of the world, its safety margin is very narrow. Chloroquine inhibits the
cardiac inward rectifier K+ current IK1 and can induce lethal ventricular arrhythmias. In
this study, we characterized the biophysical and molecular basis of chloroquine block
of Kir2.1 channels that underlie cardiac IK1. The voltage- and K+-dependence of
chloroquine block implied that the binding site was located within the ion conduction
pathway. Site-directed mutagenesis revealed the location of the chloroquine binding
site within the cytoplasmic pore domain, rather than within the transmembrane pore.
Unlike most ion channel blockers, chloroquine does not bind within the
transmembrane pore and thus can reach its binding site, while polyamines remain
deeper within the channel vestibule. These findings explain how a relatively low-
affinity blocker like chloroquine can effectively block IK1 even in the presence of high
affinity endogenous blockers. Moreover, our findings provide the structural framework
for the design of safer, alternative compounds that are devoid of Kir2.1 blocking
properties.
ANTECEDENTES
La excitabilidad de la membrana es una característica de muchos tipos celulares. Los
canales de K+ son los determinantes primarios del potencial de membrana en reposo
de la célula y moduladores importantes de la forma, duración, y frecuencia de los
potenciales de acción en las células excitables (Hille, 1994).
Los canales de K+ son esenciales en la excitabilidad cardiaca y en la repolarización
del potencial de acción. Al contrario de los potenciales de acción de los nervios que
duran solo unos pocos milisegundos, los potenciales de acción de los miocitos
ventriculares duran varios cientos de milisegundos. Esta fase de despolarización
prolongada es esencial para el proceso de excitación-contracción y mantiene a los
miocitos en periodo refractario para evitar una excitación prematura. Varias clases de
canales de K+ con diferentes dependencias de tiempo y voltaje y diferentes
propiedades farmacológicas funcionan de manera conjunta para regular la frecuencia
cardiaca, fijar el potencial de reposo, regular la amplitud y duración del potencial de
acción y su periodo refractario (Shieh, Coghlan, Sullivan y Gopalakrishnan, 2000).
Los canales de K+ cardiacos fueron inicialmente clasificados en base al análisis de
las corrientes totales. Diferentes tipos de corrientes han sido identificadas: 1)
rectificadores entrantes, IK1, IKACh e IKATP, 2) rectificadores tardíos: IKur, IKr e IKs, 3) las
corrientes transitorias de salida Itof, e Itos. Otra corriente, Ikp, ha sido identificada en
ventrículo de cobayo y llamada corriente de meseta debido a que esta activa en esa
fase del potencial de acción.
Los canales de potasio de rectificación entrante son un grupo de proteínas integrales
de membrana que se encuentran involucrados en un amplio rango de procesos
fisiológicos, tales como la regulación de la actividad eléctrica cardiaca y neuronal, en
el acople entre la secreción de insulina y los niveles de glucosa en sangre, el
mantenimiento del balance electrolítico celular, etc. (Lu, 2004). Como se mencionó
anteriormente en las células cardiacas se han caracterizado tres corrientes
rectificadoras entrantes que son determinantes importantes de las propiedades
eléctricas de estas células. La corriente rectificadora entrante clásica, IK1, la corriente
de potasio activada por acetilcolina (IKACh), y la corriente de potasio modulada por la
concentración intracelular de ATP (IKATP). Una de las funciones más importantes de la
corriente rectificadora entrante IK1 en la función cardiaca es en el mantenimiento de la
meseta, ya que su fuerte rectificación entrante resulta en una muy baja conductancia
durante la meseta del potencial de acción (-20 a +50 mV), lo que permite que
corrientes entrantes relativamente pequeñas mantengan la meseta (Figura 1).
Cuando la membrana se repolariza debido a la inactivación de las corrientes
entrantes y la activación de las corrientes de potasio rectificadoras tardías, la
corriente IK1 participa en la última fase de la repolarización del potencial de acción
cardiaco y en la estabilización del potencial de reposo. IK1 es abundantemente
expresada en células auriculares, ventriculares y fibras de Purkinje, pero
relativamente poco expresada en células nodales. Esta distribución relativa de
canales IK1 en los diferentes tipos celulares cardiacos podría explicar las diferencias
en los potenciales de reposo (Lopatin y Nichols, 2001).
-80 0 80
-1
0
1
Rectificación entrante
Lineal
I, nA
V, mV
Figura 1. Curvas corriente-voltaje de una conductancia linear y una que presenta rectificación entrante. La corriente (I, nA) es graficada en función del voltaje (V, mV), en presencia de
concentraciones iguales de K+ (100 mM) en ambos lados de la membrana.
Identidad molecular de los canales rectificadores entrantes cardiacos
En los últimos años, una gran variedad de genes que codifican para subunidades de
canales de potasio han sido clonados. La mayoría de los canales de potasio
consisten de cuatro subunidades homologas α que forman la región del poro a través
del cual pasan los iones de K+, un filtro de selectividad que permite que los iones de
K+ y no otros iones pasen a través del mismo, un mecanismo de apertura-cierre
(gating) que controla si el canal se cierra o se abre en respuesta a cambios en el
potencial de membrana (canales dependientes de voltaje) o a la unión de ligandos.
Entre los canales de potasio con estructuras más simples, se encuentran los
rectificadores entrantes, que son codificados por la familia de genes KCNJ. Se han
descrito 14 genes que pertenecen a esta familia, los cuales se han clasificado en 7
subfamilias de acuerdo a su homología e identidad. Estas subfamilias se han
identificado desde Kir1.X a Kir7.X (Stanfield, Nakajima y Nakajima, 2002).
Los rectificadores entrantes son tetrámeros de subunidades formadoras del poro que
cuentan con dos dominios transmembranales (TM1 - TM2) separados por la región P
que forma el filtro de selectividad (Figura 2). Una característica notable es que mas
de la mitad de la masa molecular de las subunidades esta formada por los terminales
amino (-NH2) y carboxilo (COOH).
La corriente rectificadora entrante de las células cardiacas IK1 es conducida por
canales homo y/o tetraméricos formados por la subfamilia de proteínas Kir2.X (Kir2.1,
Kir2.2 y Kir2.3) (Nishida y MacKinnon, 2002). La expresión de ARNm y de las
proteínas ha sido estudiada en aurículas y ventrículos de corazón de humano,
encontrándose que Kir2.1 es mucho más abundante que otras subunidades Kir2.X
en ambos tejidos, auricular y ventricular (Wang, Yue, White, Pelletier y Nattel, 1998).
La estructura determinada por rayos X del canal rectificador entrante bacteriano
homólogo, KirBac1.1 muestra que los terminales amino y carboxilo forman una
extensión del poro mas allá de la superficie interna de la membrana dentro del
citoplasma (Kuo, et al., 2003). Esta extensión aumenta aproximadamente al doble la
longitud del poro del canal (Figura 3).
Figura 2. Topología de una subunidad de un canal de K+ de rectificación entrante. En el
esquema se aprecian los dominios transmembranales TM1 y TM2, flanqueando la región del poro y
los terminales amino (N) y carboxilo (C). (Modificado de Logothetis, Jin, Lyupan y Rosenhouse-
Dantsker, 2007).
Esta estructura también la presentan los canales rectificadores entrantes de
mamífero (Nishida y MacKinnon, 2002; Pegan, et al., 2005). La estructura de los
canales rectificadores entrantes ha sido dividida en cinco regiones (Figura 3). Sobre
el lado extracelular se encuentra el filtro de selectividad, seguido por una cavidad, la
compuerta, unos enlaces flexibles, y el vestíbulo citoplasmático del canal. Es muy
poco probable que los iones K+ entren al canal pasando a través de los enlaces que
unen los segmentos transmembranales con los terminales amino y carboxilo debido
a la presencia de residuos cargados positivamente que repelen cationes (Figura 4A),
por lo tanto, los iones para moverse en uno u otro sentido a través de la membrana,
tienen que atravesar la estructura completa del canal, Figura 4B (Kuo, et al., 2003,
Nishida y MacKinnon, 2002).
Figura 3. Estructura general de los canales rectificadores entrantes. La posición de la membrana
es representada por la barra sombreada de azul y tonos de gris. En el lado izquierdo se representan
los cuatro monómeros (subunidades) que forman el canal de diferente color. En el lado derecho se
muestran solo dos de los monómeros (por razones de claridad), de tal manera que las posiciones de
los siguientes elementos estructurales pueden ser claramente vistos: enlaces flexibles (en rosa),
hélice externa (verde), hélice del poro (azul), hélice interna (amarilla) y C-terminal (rojo). (Tomado de
Kuo et. al., 2003).
Mecanismo de la rectificación entrante o “anómala”
Los canales rectificadores entrantes son llamados así por su propiedad de actuar
como bio-diodos en la membrana celular. Estos canales selectivamente conducen
iones de K+, y acarrean mucho más corriente entrante a potenciales negativos al
potencial de equilibrio del ión K+ (EK), que corriente saliente a potenciales positivos al
potencial de equilibrio (Figura 1), aun cuando las concentraciones de K+ sean iguales
a ambos lados de la membrana (Lopatin y Nichols, 2001, Matsuda, Saigusa y
Irisawa, 1987, Nichols y Lopatin, 1997, Stanfield, et al., 2002).
Figura 4. Esquema del modelo hipotético del mecanismo de compuerta (“gating”) de los canales Kir. (A) Subunidad Kir mostrando los residuos positivos arginina y lisina, que previenen el
paso de cationes a través de los enlaces que unen los segmentos transmembranales y los terminales
amino y carboxilo. (B) Vista esquemática del canal KirBac1.1 en los estados cerrado (izquierda) y
abierto (derecha). La barra verde representa la membrana. Los residuos bloqueadores Phe146 se
muestran en color rojo. Las flechas indican la dirección potencial en la cual los diferentes elementos
estructurales se mueven cuando el canal se abre. Los círculos verde oscuro representan los iones de
potasio, observándose el camino que deben recorrer para moverse de un lado a otro de la membrana.
(Tomado de Kuo y et. al., 2003)
Hace más de treinta años que Armstrong (1969) sugirió que la rectificación entrante
podría ser resultado de un bloqueo dependiente de voltaje del poro del canal, por una
partícula positivamente cargada. Al final de la década de los 80´s fue demostrado
que el ion magnesio intracelular puede causar rectificación entrante en los canales
IK1 de miocitos ventriculares por mecanismo de bloqueo dependiente de voltaje
desde el lado intracelular (Vandenberg, 1987). Sin embargo, las propiedades del
bloqueo por Mg2+ no fueron suficientes para explicar cuantitativamente la fuerte
rectificación del canal. El modelo de rectificación por el bloqueo de partículas
intracelulares fue reforzado por la demostración de que una familia de cationes
orgánicos intracelulares llamados poliaminas (espermina, espermidina y putresina)
son capaces de inducir un bloqueo dependiente de voltaje, el cual puede explicar
casi todas las características de la fuerte rectificación entrante (Lopatin y Nichols,
2001). Solo concentraciones micromolares de espermina y espermidina
intracelulares son necesarias para reproducir el grado de rectificación observada en
células nativas cardiacas a potenciales de membrana relevantes fisiológicamente
(Nichols y Lopatin, 1997).
Los elementos estructurales que determinan las propiedades de la rectificación
entrante fueron inicialmente identificados utilizando técnicas de mutagénesis puntual
combinada con registros electrofisiológicos. El primer residuo identificado que
contribuye a la rectificación fue el D172, localizado en el segmento TM2 del canal
Kir2.1, el cual al ser neutralizado reduce la susceptibilidad al bloqueo por poliaminas
y Mg2+ (Stanfield, et al., 1994). Posteriormente se identificaron dos residuos acídicos
en el vestíbulo citoplasmático, E224 y E299, que también participan en la
rectificación entrante, ambos residuos al ser mutados muestran una disminución en
la susceptibilidad al bloqueo por bloqueadores citoplasmáticos (Kubo y Murata,
2001, Yang, Jan y Jan, 1995).
En 2005 Pegan y col. resolvieron la estructura cristalográfica del vestíbulo
citoplasmático del canal Kir2.1. Como era de esperarse, los residuos E224 y E299
están localizados en la pared del poro citoplasmático, e identificaron otros dos
residuos negativos en este vestíbulo, D255 y D259, que de manera similar
contribuyen de manera importante en determinar el grado de rectificación entrante.
También se identificaron dos residuos que a diferencia de los descritos
anteriormente, estos presentan carga positiva, R228 y R260, los cuales al ser
neutralizados producen un ligero cambio en la rectificación (Pegan, et al., 2005;
Fujiwara y Kubo, 2006). Más recientemente, Shin, Xu y Lu, 2005, reportaron otro
residuo, una fenilalanina en la posición 254, la cual estaría formando el sitio más
interno con el cual interaccionan los bloqueadores citoplasmáticos y por lo tanto
participando en la rectificación entrante (Figura 5).
Figura 5. Modelo del “largo poro” de conducción de los canales Kir basado en las estructuras cristalizadas de los canales Kir2.1 y KirBac1.1. Los aminoácidos cargados negativamente se
muestran en color rojo, los que presentan carga positiva en azul y el filtro de selectividad se muestra
en color amarillo. (Modificado de Fujiwara y Kubo, 2006)
Con esta información, se han propuesto diferentes modelos que tratan de explicar el
mecanismo por el cual se produce la rectificación entrante. Un concepto general en
los diferentes modelos implica una fuerte dependencia de voltaje de bloqueo del
canal por las poliaminas, lo cual es resultado de la unión de las poliaminas a un sitio
profundo dentro del poro, desplazando hasta cinco iones K+ a través del filtro de
selectividad, arrojando una valencia aparente (Z) ~ 5 (Lopatin y Nichols, 1996; Gou y
Lu, 2001; Shin, et al., 2005).
Uno de los modelos propuestos sugiere que la espermina se une profundamente
dentro del vestíbulo interno del canal entre el “residuo controlador de la
rectificación” (D172) y el filtro de selectividad. El grupo amino de uno de los extremos
de la espermina, “amino delantero”, se mueve profundamente hasta el filtro de
selectividad, desplazando iones K+ del poro, mientras que la amina del extremo
opuesto “amino trasero” es estabilizado por interacciones electrostáticas con el
residuo D172 (Chang et al., 2003; John et al., 2004; Kurata et al., 2004). Los residuos
E224 y E299 localizados en el poro citoplasmático del los canales Kir2.1 servirían
como cargas negativas de superficie para unir poliaminas, concentrándolas y
preposicionándolas para su entrada al sitio profundo del poro cerca al residuo D172
(Xie et al., 2002; Xie et al., 2003) (Figura 6).
Figura 6. Modelo del bloqueo del canal Kir2.1 por espermina. Representación de dos subunidades,
basada en la estructura de cristal del canal KirBac1.1, que ilustra el sitio final en el cual la molécula de
espermina se une al canal para producir la rectificación. (Modificado de Kurata et. al., 2006)
Otro grupo ha sugerido la unión del bloqueador en 2 lugares de diferente
profundidad dentro del poro del canal Kir2.1, produciendo dos estados bloqueados
secuenciales con incremento en la dependencia de voltaje. La espermina se uniría
primero con modesta dependencia de voltaje a un sitio poco profundo (en el poro
citoplasmático) interaccionando principalmente con los residuos E224 y E299, donde
encontrarían al ion K+ mas interno e impediría la conducción. De ahí, la espermina
se movería a un sitio mas profundo, en el poro transmembranal, entre el residuo
D172 y el residuo M183, desplazando algunos iones potasio más y por lo tanto
produciendo la dependencia de voltaje observada (Shin y Lu, 2005; Shin et al., 2005)
(Figura 7).
Figura 7. Modelo del bloqueo secuencial del canal Kir2.1 por espermina. La unión de la molécula de
espermina al canal produce dos estados de bloqueo secuenciales, uno en la región superficial (centro)
y un sitio profundo (derecha). Los puntos negros representan iones potasio y la barra negra la
molécula de espermina. (Tomado de Shin, et al., 2005)
Farmacología del canal de potasio rectificador entrante, IK1.
La farmacología de IK1 se ha desarrollado muy poco y no se conocen bloqueadores
específicos de la misma, por lo cual se ha progresado lentamente en el
entendimiento de la función de IK1 en condiciones fisiológicas y fisiopatológicas, mas
allá de su conocida importancia en la estabilización del potencial de reposo y en la
última fase de repolarización del potencial de acción cardiaco. Se han reportado
varios fármacos que inhiben IK1 (Tamargo, Caballero, Gomez, Valenzuela y Delpon,
2004), sin embargo casi nada se sabe de los mecanismos de inhibición y
determinantes estructurales del efecto de estos fármacos.
Existe mucha controversia acerca de si el bloqueo de la corriente rectificadora
entrante, IK1 es una intervención farmacológica antiarrítmica o proarrítmica (Kleber,
1994, Opthof, 1994, Rees y Curtis, 1994). Diversas evidencias han sido mostradas
acerca de los efectos proarrítmicos de fármacos y estados patológicos que
disminuyen IK1. La evidencia más sólida es que una pérdida de la función del canal
por mutaciones (Síndrome de Andersen-Tawil) induce una forma hereditaria de
Síndrome Q-T largo (Tawil, et al., 1994), esto sugiere que un bloqueo farmacológico
del canal podría también inducir las arritmias.
Por otro lado, se ha planteado la posibilidad de que un bloqueo de la corriente IK1
puede ser un mecanismo antiarrítmico en ciertos tipos de arritmias (Jalife,
Anumonwo y Berenfeld, 2003). La formación de “rotores” estables de alta frecuencia,
como un mecanismo inductor de arritmias cardiacas (fibrilación ventricular) ha sido
propuesto. En esta misma hipótesis y utilizando simulación con modelos, se ha
propuesto que la estabilización de los rotores en el ventrículo izquierdo y la
propagación de las ondas fibrilatorias al ventrículo derecho, son el resultado de
diferencias en la expresión de los canales rectificadores Kir2.1 en las diferentes
regiones del ventrículo izquierdo y entre el ventrículo izquierdo y el derecho. Esto es
ocasionado porque la rectificación que exhiben los miocitos del ventrículo izquierdo y
el derecho no es homogénea, lo que se constituye en un sustrato proarrítmico. El
bloqueo de IK1 por Ba2+ disminuyó la estabilidad y la frecuencia de la actividad de
los rotores en el ventrículo izquierdo y la propagación de esta actividad al ventrículo
derecho (Jalife, et al., 2003, Warren, et al., 2003). Estos resultados sugieren que el
bloqueo de la corriente IK1 puede ser un mecanismo antiarrítmico, al desestabilizar la
actividad de los “rotores” responsables de la fibrilación ventricular.
Efectos electrofisiológicos de cloroquina
La cloroquina continúa siendo un importante agente terapéutico para la prevención y
tratamiento de la malaria en muchas partes del mundo, además se utiliza en la
terapia de desordenes del sistema inflamatorio (Wozniacka y McCauliffe, 2005;
Wozniacka, Lesiak, Narbutt, McCauliffe y Sysa-Jedrzejowska, 2006; Jang, Choi,
Byun y Jue, 2006). Recientemente, ha emergido un renovado interés en la cloroquina
después de reportes recientes sobre su eficacia en la reducción de cargas virales de
VIH-1(Sperber, et al., 1995; Naarding, Baan, Pollakis y Paxton, 2007). A pesar de su
amplio uso, la cloroquina tiene un rango muy estrecho de seguridad y su uso ha sido
asociado con efectos cardiovasculares tóxicos, incluyendo arritmias cardiacas. Se
han estudiado algunos de los mecanismos celulares y aun moleculares que pueden
explicar los efectos proarrítmicos de la cloroquina (Sánchez-Chapula, Salinas-
Stefanon, Torres-Jacome, Benavides-Haro y Navarro-Polanco, 2001; Sánchez-
Chapula, Navarro-Polanco, Culberson, Chen y Sanguinetti, 2002). A concentraciones
clínicas relevantes (0.3 – 10 µM), cloroquina produce un aumento en la duración del
potencial de acción en músculo ventricular y fibras de Purkinje de gato. A
concentraciones de 1 -10 µM, también incremento la actividad automática de las
fibras de Purkinje (Figura 8) (Sánchez-Chapula, et al., 2001). Estos mecanismos han
sido propuestos como los responsables del efecto proarrítmico de la cloroquina.
En experimentos con miocitos ventriculares aislados, utilizando la técnica de fijación
de voltaje se ha encontrado que cloroquina es capaz de inhibir diferentes corrientes
iónicas entrantes y salientes. La potencia de inhibición de las corrientes iónicas es la
corriente rectificadora entrante, IK1 > la corriente de rectificación tardía rápida, IKr > la
corriente entrante rápida de sodio, INa > la corriente de calcio tipo L, ICa-L. Como
podemos apreciar, la corriente mas sensible al bloqueo es IK1 (Sánchez-Chapula, et
al., 2001), en la Figura 9 se presentan registros de la corriente IK1 en condiciones
control y en presencia de 3 µM cloroquina, así como la curva corriente-voltaje en
ambas condiciones experimentales. La cloroquina bloquea la corriente IK1 de manera
dependiente de voltaje y de la concentración. El bloqueo de IK1 e IKr han sido
propuestos como los principales determinantes de los cambios en el automatismo y
el potencial de acción de los tejidos cardiacos (Sánchez-Chapula, et al., 2001).
C D
Figura 8. Efecto de la cloroquina en el potencial de acción. A, potenciales de acción registrados de
una fibra de Purkinje durante la estimulación a 1 Hz, utilizando la técnica de microelectrodos estándar,
bajo condiciones control y en presencia de 1 y 10 µM de cloroquina. B, efecto de 1 y 10 µM de
cloroquina en el potencial de acción de un miocito ventricular registrado durante la estimulación a 1 Hz,
utilizando la técnica de parche perforado. C y D. Efecto de la cloroquina en la automaticidad de fibras
de Purkinje de gato. Disparo de potenciales de acción espontáneos bajo condiciones control (C) y en
presencia de 3 µM de cloroquina (B). (Tomado de Sánchez-Chapula et. al., 2001)
En un estudio previo, se determinó que la cloroquina además de bloquear IK1, también
bloquea con una potencia similar al rectificador entrante activado por acetilcolina, IKACh
y a la corriente de potasio modulada por ATP (rectificador entrante débil), IKATP
(Benavides-Haro y Sanchez-Chapula, 2000). Estos resultados sugieren que uno de
los mecanismos proarrítmicos de la cloroquina es el bloqueo de las corrientes
rectificadoras entrantes.
Figura 9. Efecto de la cloroquina sobre Ik1 en miocitos ventriculares de gato. De un potencial de
mantenimiento de -60 mV, se aplicaron pulsos de prueba en un rango de -100 a -40 mV a una
frecuencia de 0.1 Hz. A, trazos de corriente activada por los pulsos de prueba a -100, -90, -80, -60, y -
40 mV, obtenidas bajo condiciones control y en presencia de 3 µM de cloroquina. B, relaciones
corriente-voltaje de la corriente medida al final de los pulsos, bajo condiciones control (ם) y en
presencia de 3 µM de cloroquina (ס). (Tomado de Sánchez-Chapula et. al., 2001)
Estudios combinados de mutagénesis y registros electrofisiológicos han permitido
caracterizar los sitios de interacción de fármacos bloqueadores con canales iónicos.
Así se han caracterizado los sitios de unión de fármacos anestésicos locales en el
canal de sodio (Ragsdale, McPhee, Scheuer y Catterall, 1994). Estos estudios han
mostrado evidencias de que los anestésicos locales bloquean a los canales de sodio
en el estado abierto e ingresando a la cavidad interna del canal desde el interior de
las células. Similares resultados con diferentes tipos de fármacos como
metansulfonanilidas (MK-499), quinidina y cloroquina han sido descritos en el canal
HERG (corriente rectificadora tardía rápida, IKr) (Mitcheson, Chen, Lin, Culberson y
Sanguinetti, 2000; Sanchez-Chapula, Ferrer, Navarro-Polanco y Sanguinetti, 2003;
Sanchez-Chapula, et al., 2002). Los residuos que participan conformando el sitio de
unión de los fármacos, forman parte de la cavidad interna del canal HERG y de
acuerdo a los modelos homólogos desarrollados, las cadenas laterales de estos
residuos dan hacia esa cavidad (Mitcheson, et al., 2000). Las aminoquinolinas
cloroquina y quinidina son algunos de los fármacos hasta ahora estudiados, en los
que se han determinado los componentes estructurales de su sitio de unión dentro del
canal HERG (Sánchez-Chapula, et al., 2003, Sánchez-Chapula, et al., 2002). Algunas
de las características mas importantes de la interacción de cloroquina y quinidina con
el canal HERG son que el sitio de unión de los fármacos se encuentra en la cavidad
interna del canal y que los residuos mas importantes en la interacción son residuos
aromáticos (Y652 y F656) que forman parte de la “pared” de la cavidad interna del
mismo, siendo las interacciones mas importantes de tipo hidrofóbico (Fernandez,
Ghanta, Kauffman y Sanguinetti, 2004).
JUSTIFICACION Y PLANTEAMIENTO DEL PROYECTO
Como ha sido planteado previamente, el canal rectificador entrante IK1, juega un
papel importante en la excitabilidad, en la génesis del potencial de acción cardiaco y
en la fisiopatología de algunas arritmias cardiacas. Por otro lado, poco se sabe sobre
la farmacología de este canal, sobre todo del mecanismo de acción de fármacos que
inhiben la corriente y de los mecanismos celulares y moleculares de dicha inhibición.
Un mejor conocimiento de las características de la inhibición de la corriente IK1 por
fármacos, y las bases estructurales de la interacción de estos fármacos con el
probable sitio de unión en el canal, seguramente serán de gran utilidad desde el
punto de vista clínico y básico.
En el presente proyecto se pretende estudiar el mecanismo de inhibición de la
corriente IK1 por la cloroquina e intentar caracterizar el probable sitio de unión del
fármaco en el canal. Como también se mencionó previamente, uno de los
mecanismos proarrítmicos de la cloroquina es su efecto inhibidor de la corriente
rectificadora entrante, IK1. Se han mostrado evidencias de que este efecto de
cloroquina es dependiente de voltaje, mostrando una mayor inhibición a potenciales
de membrana positivos (Figura 9). También se ha planteado la hipótesis de que el
fármaco pudiera estar actuando desde el interior de la membrana en su forma
catiónica (Sánchez-Chapula et al., 2000). La cloroquina es una 4-amino quinolina
que tiene en su estructura 3 grupos amino (Figura 10), con pKa´s de 4.0, 8.4 y 10.8,
por lo cual a pH entre 7.2 y 7.4 se encuentra en mas de un 99% en su forma
catiónica.
Dado que muy poco sabemos del mecanismo de inhibición de IK1 por cloroquina y
otros fármacos inhibidores de la corriente (Tamargo et al., 2004) en el presente
proyecto nos hemos planteado caracterizar dicho mecanismo y sitio de acción.
Algunas de las preguntas que queremos contestar son: ¿la cloroquina interacciona
con el canal desde la cara externa o interna del mismo? Para lo cual se utilizan dos
versiones de la técnica de “patch clamp”, célula completa en la cual el fármaco es
aplicado desde la cara externa del canal y parches escindidos con la cara interna
hacia fuera, aplicando el fármaco directamente a la cara interna de la membrana.
Otro objetivo es la caracterización del efecto dependiente de voltaje de la inhibición
de IK1, observado en los estudios previos (Sánchez-Chapula et al., 2000).
Figura 10. Estructura química de la cloroquina. Los sitos de ionización se ilustran con el signo (+).
Los átomos están coloreados como se describe a continuación: nitrógeno, azul; cloro, rojo; carbono,
verde; hidrogeno, gris.
El otro objetivo primordial del presente proyecto es la caracterización del probable
sitio de unión de cloroquina al canal. El mecanismo de rectificación entrante de este
canal se debe al bloqueo por cationes intracelulares, Mg2+ y poliaminas (espermina,
espermidina y putrescina) (Vandenberg, 1987; Nichols y Lopatin, 1995; Lopatin y
Nichols, 2001). El efecto de las poliaminas es fuertemente dependiente de voltaje, a
concentraciones fisiológicas las poliaminas únicamente bloquean IK1 a potenciales
positivos al potencial de inversión para el potasio, EK. Los sitios de bloqueo de las
poliaminas han sido caracterizados y se encuentran en la cavidad transmembranal
del poro del canal y en la cavidad citoplasmática del mismo (Figura 5). Los residuos
más importantes en dicha interacción son el residuo acídico D172 que se encuentra
en el poro transmembranal y los residuos acídicos E224, D255, D259 y E299 y el
residuo aromático F254 (Lopatin y Nichols, 1996; Gou y Lu, 2001; Chang et al., 2003;
Shin, et al., 2005).
Por las características catiónicas de la cloroquina y algunas de las características de
la inhibición dependiente de voltaje de IK1 observadas en los estudios previos
realizados en miocitos cardiacos (Benavides-Haro y Sánchez-Chapula, 1999;
Sánchez-Chapula et al., 200), los residuos involucrados en la interacción con
poliaminas son candidatos naturales a ser considerados como probables sitios de
interacción con cloroquina. En caso de que el sitio de interacción de cloroquina con el
canal sea el mismo que las poliaminas, seria de interés para nosotros el estudiar la
posible interacción de cloroquina con las poliaminas.
Por otro lado, muchos de los fármacos que inhiben corrientes iónicas actuando sobre
canales dependientes de voltaje (Ragsdale, et al., 1994; Mitcheson, et al., 2000;
Sanchez-Chapula, et al., 2003; Sanchez-Chapula, et al., 2002)) lo hacen
interaccionando con la cavidad interna (transmembranal) de los mismos. Cloroquina
inhibe la corriente rectificadora tardía rápida de K+ (IKr), interaccionando con residuos
aromáticos que dan a la cara interna de la cavidad (transmembranal) del canal HERG
(Sánchez-Chapula et al., 2003). A diferencia de los canales dependientes de voltaje
mencionados anteriormente, los canales rectificadores entrantes poseen una cavidad
muy larga, la cavidad interna clásica (transmembranal) y una cavidad citoplasmática
formada por los terminales amino y carboxilo. Por lo tanto, en el presente proyecto,
también nos proponemos como objetivo el determinar si cloroquina interacciona con
alguno/s de los residuos que de acuerdo a los modelos del canal Kir2.1 forman el
poro transmembranal ó con los residuos cuyas cadenas laterales dan a la cara
interna del poro citoplasmático. Para este objetivo se realiza un mapeo (“scanning”),
sustituyendo puntualmente los residuos por alanina y determinando si las mutaciones
producen modificaciones en la potencia de bloqueo de cloroquina.
HIPOTESIS
La cloroquina interacciona para ejercer su bloqueo sobre el canal Kir2.1 (IK1) con
residuos que se encuentran formando parte de la pared de la cavidad interna
(transmembranal) del canal. Uno de los residuos que parecen mas probables es el
D172, el cual interacciona con las poliaminas, las cuales son responsables de la
rectificación entrante que exhibe el canal.
Alternativamente:
La cloroquina interacciona para ejercer su bloqueo sobre el canal Kir2.1 con residuos
que se encuentran en el vestíbulo citoplasmático del canal. Dos de los residuos mas
probables son el E224 y el E299 los cuales interaccionan con las poliaminas y
producen la rectificación entrante.
OBJETIVO GENERAL
Caracterizar el mecanismo de bloqueo, y las bases estructurales moleculares del
bloqueo del canal de potasio rectificador entrante Kir2.1 (IK1) por el fármaco
cloroquina.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
1. Caracterizar el mecanismo de bloqueo del canal Kir2.1 por cloroquina. Bloqueo
desde la parte externa o interna de la membrana citoplasmática. Dependencia
de voltaje. Posible interacción del bloqueo de la cloroquina con el bloqueo de
las poliaminas.
2. Determinar si la cloroquina se une a residuos que se encuentran en la cavidad
interna (transmembranal) del canal y/o en el vestíbulo citoplasmático del canal
Kir2.1.
3. Caracterizar puntualmente el sitio de interacción de la cloroquina con residuos
del canal, en la cavidad interna, en el vestíbulo o en ambos sitios.
METODOLOGÍA
Biología Molecular.
En los experimentos se utilizó el canal Kir2.1 tipo silvestre y mutado. El ADN para el
transcripto del Kir2.1 de ratón (generosamente provisto por el Dr. Martin Tristani, Salt
Lake City, USA), se subclonó en el plásmido pcDNA3.1(+). Las mutaciones puntuales
fueron hechas con el Kit para mutaciones sitio dirigidas QuickChange (Stratagene),
utilizando primers conteniendo la mutación y ADN del canal Kir2.1 tipo silvestre. La
introducción de cada mutación fue confirmada por secuenciación.
Transfección de DNA en la línea celular HEK-293.
Células HEK293 (Gibco-BRL), se mantuvieron en DMEM (Dulbeccoo´s modified
Eagle´s médium) suplementado con 10% de suero de caballo y con una mezcla de
antibiótico-antimicótico (1%), en una incubadora con atmósfera de 5% CO2/95% O2 a
37 oC. Las células fueron transitoriamente transfectadas con cantidades variables de
ADN (1 – 5 µg) del canal Kir2.1 silvestre y mutado insertos en el vector pcDNA3.1(+),
por medio de precipitación con fosfato de calcio. Como marcador se utilizó la proteína
verde fluorescente (GFP) la cual fue cotransfectada junto con el ADN de las
subunidades del canal. Para los estudios electrofisiológicos, las células fueron
dispersadas de los platos de cultivo por tripsinización y mantenidas en medio DMEM
a temperatura ambiente para su uso.
Experimentos de fijación de voltaje en la línea celular HEK293.
Las células fueron colocadas en una cámara de registro en la platina de un
microscopio invertido con fluorescencia (Nikon, Japon), y las células transfectadas
fueron identificadas con la señal fluorescente de la GFP cotransfectada. Se
registraron corrientes macroscópicas con la técnica de fijación de voltaje en las
configuraciones de célula completa y parche escindido con el lado interno hacia fuera
(inside out) (Hamil, Marty, Neher, Sakmann y Sigworth, 1981), para lo cual se utilizó
un amplificador Axopatch 200B (Axon Instruments). La adquisición de los datos y los
potenciales de prueba fueron controlados con el software pClamp9.0 (Axon
Instruments). Se utilizaron pipetas con resistencia entre 1 y 2 MΩ. Para los registros
en célula completa la solución interna contenía (en mM): 100 KCl, 10 HEPES, 5
K2BAPTA y 5 K2ATP, el pH fue ajustado a 7.2 con KOH. La solución del baño
contenía (en mM): 130 NaCl, 4 KCl, 1.8 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES y 10 glucosa; el
pH fue ajustado a 7.4 con NaOH. En los experimentos utilizando alta [K+] externo, se
disminuyo la [Na+] hasta que la suma de ambos permaneciera constante. Los
registros en inside out se realizaron utilizando la misma solución libre de poliaminas y
Mg2+ a ambos lados de la membrana. La solución contenía (en mM): 123 KCl, 5
K2EDTA, 7.5 K2HPO4 y 8 KH2PO4, 5 KF, 10 pirofosfato, 0.1 vanadato; el pH fue
ajustado a 7.2 con KOH.
Análisis de los datos.
Los datos están presentados como la media ± error estándar (n= número de células).
La fracción de corriente no bloqueada fue graficada en función de la concentración
de cloroquina y los datos fueron ajustados a la ecuación de Hill:
f = 1/1 + (IC50/[CQ]nh
para determinar la concentración inhibitoria al 50% (IC50) y el coeficiente de Hill, nH.
La dependencia de voltaje de bloqueo fue medida al ajustar la fracción de corriente
no bloqueada en función del voltaje con la ecuación de Woodhull (Woodhull, 1973):
ICQ/ICTRL=1/(1+([CQ]/Kd(0)e-zFV/RT))
donde V = voltaje de membrana, Kd(0) = constante de disociación a 0 mV, z =
valencia de bloqueo, y F, R y T sus valores usuales (Guo y Lu, 2000).
RESULTADOS
La cloroquina aplicada del lado extracelular bloquea preferentemente las corrientes salientes del canal Kir2.1.
Los efectos de la cloroquina sobre los canales Kir2.1 expresados en células HEK293
fueron inicialmente estudiados con la técnica de fijación de voltaje en su configuración
de célula completa. En condiciones control, se aplicaron pulsos hiper y
despolarizantes de 4 segundos de duración a potenciales de membrana entre -140
y 0 mV que originaron grandes corrientes entrantes, pero pequeñas corrientes
salientes, típicas de un canal de rectificación entrante fuerte (Figura 10A). La
cloroquina disminuyó significativamente la amplitud de la corriente de manera
dependiente de voltaje, ejerce mayor bloqueo sobre las corrientes salientes
comparado con las corrientes entrantes (Figura 11A y B). Se observó una lenta
recuperación del bloqueo durante los pulsos hiperpolarizantes a voltajes de
membrana negativos (Figura 11A)
Para determinar los efectos de la cloroquina sobre la corriente del canal Kir2.1 en
condiciones fisiológicamente relevantes, utilizamos un potencial de acción como
pulso comando (Figura 12A). Las corrientes evocadas por el puso comando se
registraron en condiciones control, en presencia de cloroquina y después de la
aplicación de 2 mM de BaCl2. Las corrientes control y en presencia de cloroquina se
presentan sustraídas de la corriente resistente a Ba2+. En condiciones control, se
observa una pequeña corriente saliente durante la fase de meseta del potencial de
acción, que rápidamente se incrementa durante la fase terminal de la repolarización y
declina en la diástole temprana. La cloroquina inhibe el pico de corriente saliente de
manera dependiente de la concentración (Figura 12B) La IC50 del bloqueo por
cloroquina de la corriente Kir2.1 al pico originada por el pulso comando aplicado fue
de 8.7 ± 0.9 µM con un coeficiente de Hill de 1.0 (n = 5 células, Figura 12C).
4 s0 mV
-140 mV
-80 mV
B-100 0
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
Cor
rient
e no
rmal
izad
a
Voltaje (mV)
Control CQ 0.3 µM CQ 3 µM CQ 30 µM
A CQ 30 µMCQ 3 µMControl
1 s50
0 pA
Figura 11. Inhibición del canal Kir2.1 expresado en células HEK293 por cloroquina. (A) Trazos
representativos de la corriente del canal Kir2.1 registrados en fijación de voltaje versión célula
completa en ausencia (control) y presencia de cloroquina a las concentraciones indicadas. El
protocolo de registro se muestra en la figura. Las líneas punteadas indican el nivel “0” de corriente.
(B) Relaciones corriente-voltaje normalizadas del canal Kir2.1 medidas al final de los pulsos de
prueba, en ausencia y presencia de cloroquina a las concentraciones indicadas en la figura.
La cloroquina bloquea los canales Kir2.1 por la superficie citoplasmática.
Para determinar si la cloroquina bloquea los canales Kir2.1 por la superficie
citoplasmática o por la superficie extracelular, comparamos el tiempo en que se
alcanza el bloqueo en parches de membrana en la configuración de inside out y lo
comparamos con lo observado en la configuración de célula completa. En la Figura
13A se muestran registros de corriente del canal Kir2.1 en ambas condiciones, célula
completa (Figura 13Aa) e inside out (Figura 13Ab). Cuando se aplicó sobre la cara
citoplasmática de los parches escindidos, la cloroquina produce un bloqueo en estado
estable en ~ 15 segundos, comparado a los 6 – 8 minutos cuando se aplicó a la
superficie externa en la configuración de célula entera (Figura 13A y B). Por lo tanto,
consideramos que la cloroquina accede a su sitio de unión entrando al poro canal por
la superficie citoplasmática.
C20
0 pA
50 ms
B
A
0.1 1 10 1000.0
0.5
1.0
Inhi
bici
ón re
lativ
a
[CQ], µM
Control CQ 1 µM CQ 3 µM CQ 10 µM CQ 30 µM
Figura 12. Efecto de la cloroquina sobre el canal Kir2.1 durante un potencial de acción ventricular de gato. (A) Potencial de acción ventricular de gato (B) Trazos de corriente del canal Kir2.1
obtenidos al aplicar pulsos de prueba con un potencial de acción como el que se muestra en A, en
condiciones control y a las concentraciones de cloroquina indicadas en la figura (C) Relación
concentración-efecto de la corriente al pico de registros como el que se muestra en B. Las corrientes
fueron normalizadas. La línea continua muestra al ajuste con la ecuación de Hill, obteniendo una IC50 =
8.7 ± 0.9 µM y un coeficiente de Hill de 1.0 (n = 5)
inside out
célula completa
480 s300 s
180 s
0 s
15 s
0 s
b
aBA
500
pA
200 ms
200
pA
500 ms
CQ 30 µM
-120 0 120 240 360 480 6000.0
0.5
1.0 célula completa inside out
Cor
rient
e no
rmal
izad
a
Tiempo (s)
Figura 13. Curso temporal del bloqueo por cloroquina de los canales Kir2.1. (Aa) trazos
representativos de la corriente del canal Kir2.1 registrados en la configuración de célula completa en
ausencia (0 s) y presencia (180 s, 300 s y 480 s) de cloroquina 30 µM. (Ab) trazos representativos de la
corriente del canal Kir2.1 registrados en la configuración de inside out en ausencia (0 s) y presencia (15
s) de cloroquina 30 µM. El protocolo de pulsos utilizado fue partiendo de un potencial de mantenimiento
de -70 mV, se aplicó un pulso despolarizante a 50 mV y posteriormente un pulso repolarizante a -80
mV. Las flechas en los registros indican el lugar donde se midieron los registros para su análisis. (B)
Curso temporal del bloqueo por cloroquina 30 µM sobre los canales Kir2.1 registrados en célula
completa (círculos) y en inside out (diamantes).
Dependencia de voltaje del bloqueo por cloroquina.
Para determinar la dependencia de voltaje del bloqueo de IK1 por cloroquina,
evaluamos el bloqueo en parches escindidos versión lado interno hacia fuera (inside
out) en ausencia de bloqueadores endógenos. Al igual que en los experimentos en
célula entera, la aplicación de cloroquina sobre parches escindidos produce un
pronunciado bloqueo dependiente de concentración de las corrientes salientes (Figura
14A). La dependencia de voltaje de bloqueo del canal Kir2.1 genera curvas corriente
voltaje (I-V) con rectificación entrante (Figura 14B). La fracción de corriente no
bloqueada a tres voltajes de membrana representativos es graficada en función de la
concentración de cloroquina en la Figura 14C. Las curvas a través de los datos son
ajustes con la ecuación de Hill arrojando valores de IC50 de 2.10 ± 0.41, 0.82 ± 0.10 y
0.29 ± 0.02 µM para 30, 40 y 50 mV respectivamente, reflejando una vez más la
dependencia de voltaje de bloqueo. Los coeficientes de Hill obtenidos en los ajustes
para los tres voltajes (30, 40 y 50 mV), fueron 1.03, 0.95 y 0.93 respectivamente,
indicando que una sola molécula de cloroquina bloquea el canal. Evidencia adicional
sobre la unión de una sola molécula de cloroquina a un único sitio del canal se obtuvo
del análisis del la dependencia de concentración en la velocidad de desbloqueo del
canal por cloroquina. Si un fármaco se une a un solo sitio dentro del canal o este no
interfiere con otros probables sitios de unión, la velocidad de desbloqueo del fármaco
dependerá solamente del voltaje de membrana y no de la concentración del fármaco,
como es el caso de la cloroquina (Figura 15). Para estimar la distancia que penetra la
cloroquina dentro del canal, graficamos la fracción de corriente no bloqueada en
presencia de varias concentraciones de cloroquina contra el voltaje de membrana
(Figura 16). Los datos fueron ajustados con la ecuación de Woodhull (Woodhull,
1973) arrojando una Kd (a 0 mV) de 27 ± 12 µM con una valencia aparente (Z) de
2.06 ± 0.6 (n = 6). La valencia aparente es una medida de la habilidad de un
bloqueador de desplazar iones K+ a través del campo eléctrico de la membrana y es
una medida indirecta de la distancia penetrada por el bloqueador. La relativa baja
valencia aparente arrojada por el bloqueo de cloroquina, sugiere que esta no penetra
profundamente dentro del canal y por lo tanto desplaza menor numero de iones K+
que las poliaminas, como la espermina (Valencia ~ 5, Lu, 2004; Shin y Lu, 2005).
CB
A
0.01 0.1 1 10 100
0.0
0.5
1.0I C
loro
quin
a/I Con
trol
[Cloroquina], µM
30 mV 40 mV 50 mV
Cloroquina 3 µMCloroquina 1 µMControl
-80 -40 0 40 80
-0.8
-0.4
0.0
0.4
0.8
Cor
rient
e no
rmal
izad
a
Voltaje (mV)
Control CQ 0.3 µM CQ 1 µM CQ 3 µM CQ 10 µM CQ 30 µM
500
pA
500 ms
Figura 14. Efecto de la cloroquina sobre los canales Kir2.1 en ausencia de bloqueadores endógenos. (A) Trazos representativos de la corriente del canal Kir2.1 registrados en la configuración
de inside out sin poliaminas y Mg2+, en condiciones control y en presencia de 1 y 3 µM de cloroquina
(la línea punteada indica el nivel “0” de corriente) (B) Relaciones corriente-voltaje del canal Kir2.1 en
ausencia y presencia de cloroquina a las concentraciones indicadas en la figura (C) Fracción de
corriente no bloqueada graficada en función de la concentración de cloroquina. Las curvas a través de
los datos muestran ajustes con la ecuación de Hill arrojando valores de IC50 de 2.10 ± 0.41, 0.82 ±
0.10 y 0.29 ± 0.02 µM para 30, 40 y 50 mV respectivamente (n = 5).
B
A
500
pA200 ms
CQ 30 µMCQ 3 µM
τ desb
loqu
eo (m
s)
Voltaje (mV)
-100 -80 -60 -401
10
100
1000
CQ 1 µM CQ 3 µM CQ 10 µM CQ 30 µM
Figura 15. Cinética del desbloqueo de cloroquina en los canales Kir2.1. (A) trazos representativos
de la corriente del canal Kir2.1 en presencia de cloroquina (3 y 30 µM) registrados en inside out en
respuesta a pulsos de voltaje a potenciales entre -40 y -100 mV después de un pre-pulso a +50 mV,
partiendo de un potencial de mantenimiento de -70 mV. (B) constantes de tiempo de desbloqueo (tau)
obtenidas de ajustes exponenciales a trazos de desbloqueo similares a los mostrados en A graficados
en función del voltaje.
-80 -40 0 40 800.0
0.5
1.0
CQ 0.1 µM CQ 0.3 µM CQ 1 µM CQ 3 µM CQ 10 µM
I CQ/I C
ontro
l
V (mV)
Figura 16. Relaciones corriente relativa-voltaje del bloqueo del canal Kir2.1 por cloroquina. Curvas corriente relativa-voltaje obtenidas del bloqueo de la corriente del canal Kir2.1 por cloroquina a
las concentraciones indicadas en la figura. Las líneas continuas muestran ajustes con la ecuación de
Woodhull, obteniendo una Kd (0 mV) = 27 ± 12 µM y una valencia aparente Z = 2.06 ± 0.6 (n = 6).
El desbloqueo de la cloroquina a voltajes negativos a EK es dependiente de [K+] extracelular.
Una característica común de muchas partículas cargadas que bloquean canales
iónicos por un mecanismo de unión al poro, es que su desbloqueo es acelerado al
incrementar la concentración de K+ externo ([K+]o), fenómeno llamado “knock –off”. El
desbloqueo de cloroquina es dependiente de voltaje y de [K+]o (Figura 17). En
experimentos de fijación de voltaje en célula entera, al incrementar [K+]o se produce
un incremento en la velocidad de desbloqueo de la cloroquina (Tau de desbloqueo),
consistente con el fenómeno “knock –off”. Por ejemplo, la velocidad de desbloqueo en
presencia de una [K+]o de 4 mM fue 16 veces más lenta que la observada a una [K+]
de 75 mM, medidas a -100 mV (Figura 17B). Este fenómeno explica, en parte, el
desbloqueo mas completo de cloroquina observado en parches escindidos (inside
out) donde la [K+]o es de 150 mM (Figura 14).
B
A
-140 mV
0 mV
-80 mV
Kext 75 mM
Kext 20 mM
Kext 4 mM
-140 -120 -100 -80 -60
10
100
1000
Kext 4 mM Kext 20 mM Kext 75 mM Kext 150 mM (I/O)
Log
(τm
s)
Voltaje (mV)
-1.0
-0.5
0.0
2 4 6
I
Tiempo (s)
Cor
rient
e no
rmal
izad
a
Figura 17. El desbloqueo de cloroquina a voltajes negativos a EK es dependiente de voltaje y de [K+]o. (A) trazos de corriente normalizados generados por un pulso de 0 a -140 mV en presencia de
cloroquina 10 µM, y 4, 20 y 75 mM de potasio extracelular. Las curvas sobre los trazos son ajustes
monoexponenciales. Las constantes de tiempo del desbloqueo de cloroquina fueron 830 ± 103, 218 ±
15 y 14 ± 3 ms para 4, 20 y 75 mM de potasio extracelular a -140 mV, respectivamente. (B)
dependencia de voltaje del desbloqueo de cloroquina a varias concentraciones de potasio extracelular.
En resumen, la cloroquina comparte características de los clásicos bloqueadores de
poro iónico, incluyendo el bloqueo y desbloqueo dependiente de voltaje, el fenómeno
“knock-off” en presencia de [K+]o elevadas. La valencia aparente del bloqueo por
cloroquina sugiere que esta penetra al poro de conducción desplazando iones K+,
pero a menor profundidad que las poliaminas. Todas estas observaciones sugieren
que el sitio de unión de la cloroquina se localiza dentro del poro de conducción.
Los bloqueadores endógenos no protegen al canal Kir2.1 del bloqueo por cloroquina.
Si el sitio de unión de la cloroquina se localiza dentro del poro de conducción,
esperaríamos que la unión inicial de bloqueadores endógenos del canal Kir2.1
(poliaminas y Mg2+) podrían proteger al canal del bloqueo por cloroquina. Para
responder esta pregunta se aplicó un pulso despolarizante de 90 seg de duración a
+40 mV, seguido por un pulso hiperpolarizante a -140 mV en la configuración de
célula completa, primero en ausencia (control) y después en presencia de cloroquina
(Figura 18). En condiciones control, la despolarización da origen a una pequeña
corriente saliente debido al bloqueo dependiente de voltaje (rectificación) por los
bloqueadores endógenos. En la repolarización, el rápido desbloqueo de los
bloqueadores endógenos resulta en una rápida activación de la corriente (Figura 18,
inserto). Durante el segundo pulso despolarizante (trazo rojo), se aplicó cloroquina
(30 µM) 30 segundos después de iniciado el pulso para permitir a los bloqueadores
endógenos accesar a su sitio de unión. La hiperpolarización de la membrana origina
una lenta activación de la corriente debido al lento desbloqueo de la cloroquina
(Figura 18, inserto). Por lo tanto, la unión de bloqueadores endógenos (a
concentraciones fisiológicas) no protegen al canal Kir2.1 del bloqueo por cloroquina.
Para determinar si altas concentraciones de poliaminas aplicadas exógenamente
pueden proteger a los canales Kir2.1 del bloqueo por cloroquina, aplicamos
espermina y cloroquina secuencialmente sobre la superficie citoplasmática de
parches escindidos en inside out (Figura 19). La aplicación de 10 µM de espermina
durante el pulso despolarizante origina un rápido bloqueo, con un rápido desbloqueo
durante la hiperpolarización de la membrana (trazo negro). La aplicación de
cloroquina también bloquea rápidamente la corriente saliente, pero muestra un lento
desbloqueo durante la hiperpolarización (trazo verde). Cuando la aplicación de
espermina es seguida por la aplicación de cloroquina, el desbloqueo durante la
hiperpolarización fue lento (trazo rojo), indicando que el bloqueo por cloroquina es
predominante.
6 s
300
pA
30 s
300
pA
CQ 30 µM
Figura 18. Lenta recuperación del bloqueo por cloroquina del canal Kir2.1. Con la célula
mantenida a +50 mV el canal muestra una corriente saliente muy pequeña debido a la rectificación
inducida por bloqueadores endógenos, con una rápida recuperación del bloqueo a -140 mV (trazo
negro). Al aplicar 30 µM de cloroquina 30 segundos después de iniciado el pulso despolarizante no se
observa un cambio en la amplitud de la corriente, sin embargo hay un enlentecimiento en la
recuperación del bloqueo (inserto) cuando se repolariza la membrana (trazo rojo). (La línea punteada
indica el nivel “0” de corriente)
Spm Spm + CQ
CQSpm
1 nA
2 s
Figura 19. La espermina no protege a los canales Kir2.1 del bloqueo por cloroquina. En parches
de membrana en inside out, la membrana fue despolarizada a +50 mV seguida de la aplicación sobre
la superficie citoplasmática de espermina (10 µM) y la combinación de espermina seguida por
cloroquina (30 µM). La hiperpolarización de la membrana a -80 mV origina una corriente entrante casi
instantánea en presencia de espermina sola (rápido desbloqueo de espermina), pero una corriente
entrante que crece lentamente en presencia de cloroquina (lento desbloqueo de cloroquina) aun con la
pre-aplicación de espermina.
Los resultados de estos experimentos, implican que la cloroquina se une a un sitio
distinto al de espermina y otros bloqueadores endógenos del canal Kir2.1 y que la
cloroquina puede unirse a su sitio aún con la espermina unida dentro del vestíbulo
interno (transmembranal) del canal.
El sitio de unión de la cloroquina en el canal Kir2.1 es dentro del poro citoplasmático.
Para determinar el sitio de unión de la cloroquina dentro del poro del canalKir2.1,
realizamos mutaciones puntuales por alanina de los residuos del segmento TM2
(Q164 – M180) que forman la pared del poro transmembranal del canal y evaluamos
el grado de bloqueo por cloroquina (30 µM). Todas las sustituciones por alanina
(Q164A – M180A) expresaron canales Kir2.1 funcionales que fueron efectivamente
bloqueados por 30 µM de cloroquina (Figura 20A). Esta observación fue consistente
con la relativamente baja valencia aparente (~2) del bloqueo por cloroquina,
sugiriendo que la cloroquina no penetra profundamente hasta el vestíbulo (poro
transmembranal) del canal.
Posteriormente, mutamos selectivamente los aminoácidos que se predice dan hacia
la cavidad del poro citoplasmático basados en la estructura cristalográfica del
dominio citoplasmático del canal Kir2.1 (Pegan et al., 2005). Los canales Kir2.1
mutados E224A, D259A y E299A mostraron una gran resistencia al bloqueo por
cloroquina (Figura 20B). La potencia de bloqueo por cloroquina fue reducida 657
veces por el mutante E224A, 288 veces por el mutante D259A, 94 veces por el
mutante E299A, 10 veces por el mutante F254A y 3 veces por el mutante D255A
(Figura 20C). El orden de importancia de los residuos críticos para el bloqueo por
cloroquina del canal Kir2.1 fue: E224 > D259 > E299 > F254 > D255. De manera
general, los mismos residuos importantes para el bloqueo por poliaminas también se
encontró que son importantes para el bloqueo por cloroquina, con excepción del
residuo D172 localizado en el poro transmembranal que es critico en la unión de alta
afinidad para las poliaminas, no así para la unión de cloroquina.
C
B
A
Iblock/Icontrol
[CQ], µM
Iblock/Icontrol
E224AD259AE299AF254AD255AWT
0.01 0.1 1 10 100 1000 10000
0.0
0.5
1.0
I drug/I co
ntro
l
0 20 40 60 80 100
M301A
**
***
***
*
T309AA306G
G300AE299AR260QD259AG257AD255AF254AR228AH226AA225GE224A
WT
0 20 40 60 80 100
M180AV179AA178GG177AI176AI175A
F174AA173GD172AI171AI170A
C169AG168AV167AI166A
S165AQ164A
WT
Figura 20. Mutaciones por alanina de las regiones del poro transmembranal y citoplasmático del canal Kir2.1. (A) mutaciones por alanina del poro transmembranal (segmento M2) del canal
Kir2.1. La fracción de corriente no inhibida por 30 µM de cloroquina a +50 mV (parches en inside out)
graficada en barras para el canal WT y los mutantes. (B) mutaciones por alanina del poro
citoplasmático del canal Kir2.1. Datos generados como en A. *p0.05, **p0.01, ***p0.001 ANOVA.
(C) relaciones concentración efecto de la inhibición del canal Kir2.1 WT y mutantes del poro
citoplasmático. Las IC50 determinadas por ajustes con la ecuación de Hill fueron 1.1 ± 0.2 µM para
Kir2.1 WT (n = 8), 2.8 ± 0.2 µM para D255A (n = 6), 15.1 ± 1.9 µM para F254A (n=5), 100 ± 16 µM
para E299A (n = 5), 307 ± 30 para D259A (n = 5), y 698 ± 49 para E224A (n = 6).
Modelo de bloqueo del canal Kir2.1 por cloroquina en presencia de bloqueadores endógenos.
Nuestros resultados son en general consistentes con el modelo “long-pore plugging"
del bloqueo por poliaminas (Lopatin, Makhina y Nichols, 1995) en el cual se propone
que las poliaminas como la espermina se unen dentro del poro del canal. En ese
modelo se hipotétiza que 2 moléculas de espermina pueden ocupar directamente el
poro del canal, produciendo un estado de bloqueo superficial con una baja afinidad
(B1) (la espermina unida en el poro citoplasmático) o un estado de bloqueo profundo
con una alta afinidad (B2 y B3) (la espermina unida en el poro transmembranal),
como se ilustra en la figura 21A (recuadro gris). Nosotros incorporamos dos estados
adicionales de bloqueo para representar el bloqueo directo por una sola molécula de
cloroquina ocupando el poro citoplasmático (estado B4), y un estado en el cual una
molécula de cloroquina ocupa el poro citoplasmático en presencia de una molécula de
espermina unida en el poro transmembranal (estado B5). (Figura 21A y B).
Figura 21. Modelo en caricatura del bloqueo por cloroquina del canal Kir2.1. (A) esquema del
modelo “long pore plugging” del bloqueo por espermina propuesto por Lopatin et al. (1995) (recuadro
gris), modificado para incluir el bloqueo por cloroquina. (B) caricaturas ilustrando los estados en los
cuales el canal esta abierto (A), bloqueado por espermina (B1-B3), bloqueado por cloroquina (B4), o
por ambos (B5).
DISCUSIÓN
La corriente de potasio de rectificación entrante IK1 desarrolla una función muy
importante en la estabilización del potencial de membrana en reposo y en la fase de
repolarización final del potencial de acción cardiaco (Lopatin y Nichols, 2001). La
corriente IK1 fluye a través de canales homo y/o tetraméricos formados por el
coensamble de subunidades Kir2.x (Kir2.1, Kir2.2 y Kir2.3). Se piensa que más de un
canal de K+ de rectificación entrante contribuye para formar la corriente IK1
macroscópica. La expresión de ARNm de varios miembros de la familia Kir2 ha sido
estudiada en aurícula y ventrículo de humano para evaluar los posibles mecanismos
moleculares de las diferencias entre la corriente IK1 de aurícula y de ventrículo, el
ARNm de Kir2.1 fue más abundante que cualquier otra subunidad Kir tanto en
aurícula como en ventrículo, pero no se encontraron diferencias significativas entre
ambas regiones (Wang, et al., 1998).
Existe controversia sobre si la inhibición de la corriente IK1 es antiarrítmica o
proarrítmica (Opthof, 1994; Rees y Curtis, 1993). Recientemente, se ha sugerido que
los rotores estables de alta frecuencia sostienen la fibrilación ventricular (FV) en
corazón de cobayo. El bloqueo de IK1 termina con la fibrilación ventricular, sugiriendo
que IK1 desarrolla un papel importante en la estabilización de los rotores y la FV
(Warren et al., 2003). Además, mutaciones en el gen KCNJ2 que codifica para la
subunidad Kir2.1 (D172N) la cual induce ganancia en la función del canal, origina
una forma de síndrome QT corto (Prior et al., 2005). Por otro lado, mutaciones en el
gen KCNJ2 que originan una pérdida en la función del canal causan el Síndrome de
Andersen, desorden asociado con arrítmias ventriculares (Plaster et al., 2001;
Tristani-Firouzi et al., 2002; Bendahhou et al., 2003; Seemann, Sachse, Weiss,
Ptacek y Tristani-Firouzi, M., 2007).
Diferentes fármacos antiarrítmicos y no antiarrítmicos como propafenona, terikalant,
RP58866 y el anestésico intravenoso tiopental, inhiben la corriente IK1 (Duan, Fermini
y Nattel, 1993; Williams, Dickenson y Beatch, 1999; Rees y Curtis, 1993; Pancrazio,
Frazer y Lynch, 1993). Sin embargo, se conoce muy poco acerca del mecanismo de
bloqueo del canal por estos fármacos. Recientemente, Benavides-Haro y cols. (2000)
mostraron que el fármaco antimalarico cloroquina inhibe la corriente IK1 de manera
dependiente de voltaje, mayor inhibición a potenciales despolarizados. Algunos
agentes farmacológicos de bajo peso molecular como el TEA y otros compuestos
amino cuaternarios y el agente antihelmíntico piperazina inhiben la corriente IK1,
mostrando un bloqueo mayor sobre las corrientes salientes que las entrantes a los
voltajes positivos y negativos correspondientes. Sin embargo, la valencia de bloqueo
es relativamente baja, entre 1 y 2 (Xu y Lu, 2004; Shin, et al., 2005). Este bloqueo
dependiente de voltaje no se debe a la presencia del residuo acídico (D172), en el
segmento TM2, aún cuando este residuo acídico es crítico para la unión de alta
afinidad de las poliaminas y el Mg2+ intracelular (Ficker, Taglialatela, Wible, Henley y
Brown, 1994; Lopatin, Makhina y Nichols, 1994; Lu y MacKinnon, 1994; Stanfield et
al., 1994; Fakler et al., 1995; Yang, et al., 1995; Xu y Lu, 2004). Esta diferencia
sugiere que los rectificadores entrantes pueden diferencialmente ser bloqueados por
agentes farmacológicos de bajo peso molecular y las poliaminas. Sin embargo, existe
aún controversia si el TEA puede alcanzar la cavidad transmembranal en los canales
Kir (Kurata, Marton y Nichols, 2006).
La cloroquina es un derivado 4-aminoquinolínico con dos sitios de ionización (Figura
10). Los valores de pKa de los grupos alquilamino y el anillo aminoquinolínico (10.4 y
8.4, respectivamente) predicen que le fármaco debería estar 99.9% en su forma
cargada a un pH intracelular normal. Por lo tanto, muy probablemente la forma
cargada de la cloroquina puede bloquear los canales Kir2.1. En nuestros
experimentos, estudiando los efectos de la cloroquina sobre los canales Kir2.1
expresados en células HEK293, utilizando la configuración de célula entera de la
técnica de fijación de voltaje, encontramos que la cloroquina a concentraciones entre
0.3 y 30 µM inhibe la corriente de K+ de rectificación entrante que fluye a través de
los canales Kir2.1 de una manera dependiente de voltaje. Una observación
importante es la lenta e incompleta recuperación del bloqueo por el fármaco a
potenciales negativos al potencial de inversión de la corriente. Estos resultados son
similares a los encontrados en miocitos ventriculares de gato y cobayo (Benavides-
Haro and Sánchez-Chapula, 2000; Sánchez-Chapula et al., 2001).
En el presente trabajo, utilizando un potencial de acción como pulso comando de
voltaje, mostramos que el bloqueo por cloroquina (1 – 30 µM) sobre los canales
Kir2.1 puede ser relevante fisiológicamente.
La comparación del tiempo en que se alcanza el bloqueo de los canales Kir2.1 por
cloroquina cuando se aplica del lado intracelular o por la superficie citoplasmática,
sugiere claramente que la cloroquina bloquea los canales por la superficie interna de
la membrana (Figura 13). Como era de esperarse para un bloqueador de poro, el
grado de bloqueo del canal Kir2.1 por cloroquina se incrementa progresivamente al
hacerse más positivo el potencial de membrana (Figura 14). Los experimentos
muestran que el efecto intracelular de la cloroquina es debido a un bloqueo
dependiente de voltaje del canal por la forma catiónica del fármaco, y que la
cloroquina se une a un solo sitio dentro del canal o esta no interfiere con otros
probables sitios de unión (Figura 15).
Resultados aparentemente contradictorios se encontraron comparando el efecto de
la cloroquina (0.3 – 30 µM) en experimentos en célula completa (Figura 11) y en
inside out (Figura 14) a potenciales de membrana negativos. No se observaron
efectos en inside out ([K+]o = 150 mM), mientras una inhibición significativa en
experimentos de célula entera ([K+]o = 4 mM) fue observada. Estos resultados
pueden ser explicados por la dependencia de la [K+]o en la recuperación del bloqueo
por cloroquina, y por el potencial de mantenimiento, 70 mV negativos a EK en
experimentos de inside out y 10 mV positivos a EK en experimentos de célula
completa. La dependencia de la [K+]o en la recuperación del bloqueo por poliaminas y
otros bloqueadores catiónicos como la piperazina había sido reportada previamente
(Xu y Lu, 2004). Fisiológicamente, ya que el potencial de membrana en reposo es
positivo respecto a EK, la corriente de K+ neta que fluye a través de los canales Kir2.1
es saliente, lo que le permite participar en importantes propiedades
electrofisiológicas cardiacas (Lopatin y Nichols, 2001).
La afinidad de la cloroquina por los rectificadores entrantes fuertes no es sorpresiva,
ya que la presencia de residuos acídicos específicos en estos canales, los hacen
sensibles al bloqueo por bloqueadores catiónicos intracelulares (Stanfield et al.,
1994; Lu y Mackinnon, 1994; Wible, Taglialatela, Ficker, y Brown, 1994; Taglialatela,
Wible, Caporaso y Brown, 1994; Yang et al., 1994; Taglalatela, Ficker, Wible y
Brown, 1995; Kubo y Murata, 2001). En experimentos neutralizando el residuo
acídico D172 (D172A), el efecto de la cloroquina sobre el canal Kir2.1 no se ve
afectado. Sin embargo, mutaciones por alanina de algunos residuos (E224A, D259A,
E299A y F254A) localizados en el extremo terminal C- y que dan hacia la cara del
poro citoplasmático, disminuyen significativamente la potencia de bloqueo por
cloroquina. Estos resultados sugieren que la interacción de la cloroquina con el canal
se da en el poro citoplasmático. La valencia de bloqueo (Z) de ~2 obtenida en
canales tipo silvestre refuerza esta sugerencia.
Bajo condiciones fisiológicas, los canales Kir son principalmente bloqueados no solo
por espermina sino también por otras poliaminas y Mg2+ con diferentes afinidades y
dependencias de voltaje. Por lo tanto, una pregunta importante es como un
bloqueador catiónico de relativa baja potencia como cloroquina puede bloquear
efectivamente los canales Kir2.1 aun en presencia de bloqueadores endógenos de
alta afinidad. Cuando la cloroquina es aplicada durante un pulso despolarizante,
después de que la rectificación es completa (por el efecto de los bloqueadores
endógenos o por una concentración elevada de espermina), el bloqueo por
cloroquina se continua observando (Figuras 18 y 19), sugiriendo que la unión de
bloqueadores endógenos conocidos o desconocidos no protegen al canal Kir2.1 de la
unión de cloroquina. Nosotros proponemos que la cloroquina y las poliaminas
compiten por el acceso a los residuos acídicos del poro citoplasmático. Sin embargo,
como las poliaminas se mueven hasta su sitio de alta afinidad en el poro
transmembranal, la cloroquina puede accesar al poro citoplasmático aún cuando las
poliaminas estén unidas profundamente dentro del canal (Figura 21). Debido a que el
desbloqueo de la cloroquina es lento con respecto al de las poliaminas, el bloqueo
por cloroquina predomina a potenciales de membrana fisiológicos.
Mientras el uso de cloroquina disminuye en muchas partes del mundo debido a la
malaria resistente a cloroquina, nuevas indicaciones terapéuticas emergen, más
notablemente para el tratamiento contra el VIH (Sperber, et al., 1995; Naarding, et
al., 2007) Sin embargo, el estrecho margen de seguridad de la cloroquina puede
limitar su potencial terapéutico.
La identificación de los sitios de unión de la cloroquina dentro del poro citoplasmático
puede ser de utilidad para el diseño de análogos de la cloroquina más seguros que
carezcan de efectos sobre el canal Kir2.1.
CONCLUSIONES
En el presente trabajo se cumplieron cabalmente los objetivos planteados en el
proyecto, lo que nos permite plantear en resumen la siguiente tesis.
La cloroquina bloquea los canales Kir2.1 de manera dependiente de voltaje,
ingresado al canal desde la superficie citoplasmática. El mecanismo de bloqueo de la
cloroquina es el típico de un bloqueador catiónico del poro. La cloroquina alcanza su
sitio de unión, aún cuando los canales Kir2.1 son pre-bloqueados por poliaminas.
Basados en la mutagénesis sitio-dirigida, proponemos que la cloroquina bloquea los
canales Kir2.1 uniéndose al poro de conducción citoplasmático, siendo estabilizada
por los aminoácidos cargados negativamente (E224, E299 y D259) y el residuo
aromático F254. Nuestros resultados explican como un fármaco de relativa baja
potencia como la cloroquina puede efectivamente bloquear los canales Kir2.1 aún en
presencia de bloqueadores endógenos de alta afinidad.
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