UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDA mis padres (Stella y Jairo) son el principio de todo, no tengo...
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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Departamento de Fisiología (Fisiología Animal II) ASOCIACIÓN DE LAS SUBUNIDADES DE PI3-CNIASA DE CLASE IA A ICOS (CD278) Y SU IMPORTANCIA EN LA COESTIMULACIÓN MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Yeni Yasbleidy Acosta Ampudia Bajo la dirección del doctor José María Rojo Hernández Madrid, 2013 © Yeni Yasbleidy Acosta Ampudia, 2013
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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Departamento de Fisiología (Fisiología Animal II)
ASOCIACIÓN DE LAS SUBUNIDADES DE PI3-CNIASA DE CLASE IA A ICOS (CD278) Y SU IMPORTANCIA EN LA
COESTIMULACIÓN
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR
Yeni Yasbleidy Acosta Ampudia
Bajo la dirección del doctor
José María Rojo Hernández
Madrid, 2013
© Yeni Yasbleidy Acosta Ampudia, 2013
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA ANIMAL II
ASOCIACIÓN DE LAS SUBUNIDADES DE PI3-CINASA DE CLASE IA A ICOS (CD278) Y SU IMPORTANCIA EN
LA COESTIMULACIÓN
Memoria presentada para optar el grado de Doctor por la Universidad Complutense de Madrid
YENY YASBLEIDY ACOSTA AMPUDIA
Madrid, 2012 Dirigida por el Dr. José María Rojo Hernández
CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE MEDICINA CELULAR Y MOLECULAR
Esta tesis Doctoral ha sido realizada gracias a la financiación de una Beca Predoctoral
del programa “Junta para la Ampliación de Estudios” del C.S.I.C. correspondiente al año 2008.
A mis padres que son el pilar fundamental de mi vida, han creído en mí y me han apoyado
siempre. A Leonardo que con su amor, confianza y apoyo me ha ayudado a alcanzar esta
meta, se ha sacrificado junto a mí y ha sido mi soporte para no darme por vencida.
"La vida no es sino una continua sucesión de oportunidades para sobrevivir"
Gabriel García Márquez
Agradecimientos
Es difícil entender la importancia de los agradecimientos de una tesis doctoral hasta que no se
ha terminado. Intentaré resumir en unas líneas la gratitud que siento a todas las personas que
han estado presentes durante esta etapa, haciendo posible que hoy deje de ser un sueño para
ser una realidad.
En primer lugar, le agradezco al Dr. José María Rojo, el abrirme las puertas de su grupo de
investigación hace ya cuatro años, la dedicación de su tiempo y esfuerzo y por asesorarme tan
acertadamente en el desarrollo de esta Tesis. Del mismo modo, agradezco a la Dra. Pilar
Portolés, su colaboración e importante aportación al trabajo realizado en esta tesis y muy
especialmente por su apoyo.
Me gustaría agradecer al Centro de Investigaciones Biológicas los medios que me ha ofrecido
para realizar este trabajo. Además, agradezco a todo el personal del centro por su colaboración
y amabilidad, en especial a los servicios de citometría de flujo, proteómica, microscopía y al
animalario.
Agradezco a todos los que han formado parte del laboratorio del CIB y de Majadahonda, por
brindarme su apoyo y amistad cuando lo necesite, Marisa, Marypaz, María José, Sandra, Gabi,
Gloria, María, Laura y Almudena. Gracias de corazón me hicieron sentir como en casa.
Estos cuatro años fuera de mi país estuvieron llenos de alegrías y tristezas. Pero al mismo
tiempo encontré amigos que hicieron menos difícil este camino. A todos ellos mi especial
agradecimiento: Luisa, Lu, Eva, Virginia, Cristina, Eunate, Blanco, Mikel, Lucia y Elisa, gracias
por adoptarme como una becaria de su laboratorio, echaré de menos los chistes malos y los
mil y un temas de debate en las comidas. También agradezco a todos mis amigos de Colombia
su amistad y cariño, a pesar de la distancia los sentí muy cerca. Dianita y Tatiana, decidimos
juntas venir a España, gracias por su amistad incondicional, son muchas las cosas que hemos
compartido y que seguiremos compartiendo.
Quisiera expresar mi gratitud y más sincero cariño a la Universidad del Tolima por todas sus
enseñanzas y a la Fundación Instituto de Inmunología de Colombia por guiar mis primeros
pasos en la Investigación.
El más especial de los agradecimientos va dedicado a toda mi familia, por haber soportado
tanto tiempo sin vernos, por todo su cariño y apoyo. A mis padres (Stella y Jairo) son el
principio de todo, no tengo palabras para agradecer todo lo que han hecho por mí siempre. A
mis hermanas Valentina y Yadira, a mi sobrino Juanjo y a mi cuñado Guillermo, ya que de una
u otra forma siempre estuvieron cerca para apoyarme y animarme a continuar.
Nada hubiera sido fácil sin ti, Leonardo, como olvidar todos los sacrificios para estar aquí en
España, dejaste tu familia, tus amigos, tu trabajo y todo por seguir mi sueño. Gracias por
hacerme feliz, por tu amor y apoyo incondicional. Por todo eso y mucho más este triunfo
también te pertenece… Lo hemos logrado!!!
A mi segunda familia Sabina, Carlos, Laura, Angie, Santi y Carlitos, gracias por su cariño, por
quererme como una hija y apoyarme durante todo este tiempo.
A “Don Hernando y a mi tío Jairo” siempre su recuerdo estará presente en mi mente y en mi
corazón, dándome la fortaleza para seguir superándome.
A las personas que, aunque no aparecen aquí con nombres, han estado presentes de alguna
forma durante el desarrollo de este trabajo y lo han hecho posible.
Finalmente y no por eso menos importante, le doy las gracias a Dios por cada una de las
personas que ha puesto en mi vida en el momento indicado, por darme la fe y la esperanza de
luchar cada día.
A todos mi sincero agradecimiento.
ÍNDICES
INDICE GENERAL
I
ÍNDICE
ÍNDICE ................................................................................................................ I
ÍNDICE DE FIGURAS ........................................................................................ V
ABREVIATURAS ............................................................................................... 2
RESUMEN ......................................................................................................... 6
1 INTRODUCCIÓN ......................................................................................... 9
1.1 ACTIVACIÓN DE LINFOCITOS T .............................................................................. 9
1.1.1 Estímulos mediados por el receptor de células T .............................................. 10
1.2 PI3-CINASAS .......................................................................................................... 13
1.2.1 PI3-cinasas de clase I ...................................................................................... 13
1.2.2 PI3-cinasa de clase II y III ................................................................................ 16
1.2.3 Papel de PI3-cinasa en la activación de linfocitos T .......................................... 16
1.2.4 Papel de PI3-cinasa en la coestimulación ......................................................... 18
1.2.5 Interacción de PI3-cinasa con otras moléculas de señalización ........................ 19
1.2.5.1 Tirosina cinasas ........................................................................................... 19
1.2.5.2 Factores intercambiadores de nucleótidos de guanina .................................. 19
1.2.5.3 Serina/Treonina cinasas ............................................................................... 20
1.3 LIGANDOS DE LA FAMILIA B7 ............................................................................... 22
1.4 RECEPTORES DE LA FAMILIA CD28..................................................................... 23
1.4.1 CD28 y CTLA-4 ................................................................................................ 23
1.4.2 ICOS ................................................................................................................ 26
1.4.2.1 Expresión y estructura de ICOS ................................................................... 26
1.4.2.2 Señalización a través de ICOS. .................................................................... 28
1.4.2.3 Efecto de ICOS en la respuesta de las células T “in vitro” ............................. 28
1.4.2.4 Efecto de ICOS en la respuesta de las células T “in vivo” ............................. 29
INDICE GENERAL
II
1.5 PAPEL DEL CITOESQUELETO EN LA ACTIVACIÓN DE LA CELULA T ................. 30
1.5.1 Microdominios de membrana ........................................................................... 31
1.5.2 La familia de Rho-GTPasas como reguladores del citoesqueleto ...................... 32
2 OBJETIVOS .............................................................................................. 36
3 MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................... 38
3.1 MATERIALES .......................................................................................................... 38
3.1.1 Animales de laboratorio .................................................................................... 38
3.1.2 Líneas celulares ............................................................................................... 38
3.1.3 Estirpes bacterianas ......................................................................................... 39
3.1.4 Anticuerpos policlonales ................................................................................... 39
3.1.5 Otros anticuerpos ............................................................................................. 41
3.1.6 Medios de cultivo ............................................................................................. 41
3.1.7 Vectores .......................................................................................................... 42
3.1.8 ARN de Interferencia o silenciamiento (siARN) ................................................. 43
3.1.9 Péptidos ........................................................................................................... 43
3.1.10 Tampones ........................................................................................................ 43
3.1.11 Otros reactivos y productos .............................................................................. 45
3.2 MÉTODOS .............................................................................................................. 45
3.2.1 Aislamiento de linfocitos T CD4+ de ratón ......................................................... 45
3.2.2 Aislamiento de linfocitos T CD4+ Naive de ratón ............................................... 46
3.2.3 Obtención de blastos a partir de linfocitos T CD4+ ............................................ 46
3.2.4 Activación celular por anticuerpos adsorbidos a esferas de poliestireno ........... 47
3.2.5 Activación celular por anticuerpos adsorbidos a placas de cultivo ..................... 47
3.2.6 Medida de proliferación celular ......................................................................... 47
3.2.7 Silenciamiento con siARN ................................................................................ 48
3.2.8 Transfección de COS-7 con fosfato cálcico ...................................................... 48
3.2.9 Adhesión, elongación celular y tinción de F-Actina ........................................... 49
3.2.10 Tinción de vinculina .......................................................................................... 49
3.2.11 Detección de balsas lipídicas por fluorescencia ................................................ 50
3.2.12 Muerte celular .................................................................................................. 51
3.2.13 Lisis celular ...................................................................................................... 51
INDICE GENERAL
III
3.2.14 Ensayo de interacción y precipitación (“pull-down”) .......................................... 51
3.2.15 Electroforesis bidimensional ............................................................................. 52
3.2.16 Identificación de proteínas mediante espectrometría de masas ........................ 53
3.2.17 Aislamiento de balsas lipídicas ......................................................................... 53
3.2.18 Inmunoprecipitación ......................................................................................... 53
3.2.19 Electroforesis SDS-PAGE e “inmunoblot” ......................................................... 54
3.2.20 Tinción de plata ................................................................................................ 55
3.2.21 Obtención y purificación de anticuerpos ........................................................... 55
3.2.22 Cuantificación de interleucinas mediante ELISA de captura .............................. 55
3.2.23 qRT-PCR ......................................................................................................... 56
3.2.24 Clonación de las subunidades catalíticas p110 y p110 de PI3-cinasa ........... 58
4 RESULTADOS .......................................................................................... 61
4.1 SEÑALES MEDIADAS POR ICOS: PROTEÍNAS ASOCIADAS AL DOMINIO
CITOPLASMÁTICO DE ICOS ............................................................................................. 61
4.1.1 Identificación de moléculas asociadas a motivos YMxM: Unión de PI3-cinasa de
clase IA al péptido de ICOS pYMFM ................................................................................ 61
4.1.2 Abundancia relativa de las subunidades de PI3-cinasa de clase IA en
inmunoprecipitados de ICOS ........................................................................................... 66
4.1.3 La unión diferencial de las subunidades catalíticas de PI3-cinasa a ICOS refleja
las diferencias en la unión de estas subunidades a la subunidad reguladora ................... 68
4.2 IMPORTANCIA DE LAS SUBUNIDADES CATALÍTICAS DE PI3-CINASA DE CLASE
IA EN LA ESTIMULACIÓN Y COESTIMULACIÓN DE LINFOCITOS T ................................ 74
4.2.1 Efecto del silenciamiento (siARN) de las subunidades catalíticas de PI3-cinasa
de clase IA en la estimulación y la coestimulación por ICOS ............................................ 74
4.2.2 Papel de las subunidad catalítica p110 en la coestimulación por ICOS ........... 79
4.2.2.1 Efecto diferencial de inhibidores de p110 en la producción de IFN- y la
fosforilación de Akt ...................................................................................................... 81
4.2.3 Papel de la subunidad catalítica p110 en la coestimulación por CD28 y en la
viabilidad celular .............................................................................................................. 84
4.2.4 Importancia de la subunidad catalítica p110 de PI3-cinasa en la supervivencia
de linfocitos T .................................................................................................................. 87
4.2.4.1 La muerte celular inducida por el inhibidor de p110 es dependiente de
caspasas en linfocitos T CD4+ ..................................................................................... 91
INDICE GENERAL
IV
4.3 CAMBIOS MORFOLÓGICOS EN LINFOCITOS T INDUCIDOS POR ICOS ............. 93
4.3.1 Elongación celular inducida por ICOS .............................................................. 94
4.3.2 Gránulos de Actina inducidos por ICOS.......................................................... 100
4.3.3 Disociación de la polimerización de actina y acumulación de “balsas” lipídicas
por ligandos de ICOS .................................................................................................... 103
5 DISCUSIÓN ............................................................................................. 108
5.1 UNIÓN DE LAS SUBUNIDADES DE PI3-CINASA DE CLASE IA A ICOS .............. 108
5.2 PAPEL DE LA SUBUNIDAD CATALÍTICA p110 EN LA ACTIVACIÓN DEL TCR Y
LA COESTIMULACIÓN ..................................................................................................... 110
5.3 CAMBIOS MORFOLÓGICOS EN LINFOCITOS T INDUCIDOS POR ICOS ........... 114
5.4 DISOCIACIÓN DE LA POLIMERIZACIÓN DE ACTINA Y LA ACUMULACIÓN DE
“BALSAS” LIPÍDICAS POR LIGANDOS DE ICOS ............................................................. 119
5.5 PAPEL DE PI3-CINASA EN LA SUPERVIVENCIA DE LINFOCITOS T .................. 119
6 CONCLUSIONES .................................................................................... 123
7 BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................... 126
ANEXOS ........................................................................................................ 140
ÍNDICE DE FIGURAS
V
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Fases de la respuesta de células T CD4+. ................................................................ 10
Figura 2. Procesos de señalización celular inducida por la activación de la célula T. ............... 12
Figura 3. Estructura esquemática del heterodímero p85/p110 de clase IA de PI3-cinasa. ........ 14
Figura 4. Clasificación y estructura de PI3-cinasa. ................................................................... 15
Figura 5. Mecanismos de activación y reclutamiento de PI3-cinasa en linfocitos T................... 17
Figura 6. Representación de los dominios citoplasmáticos de CD28, ICOS y CTLA-4. ............. 25
Figura 7. Alineación de la secuencia de ICOS y CD28. ........................................................... 27
Figura 8. Mecanismo de regulación de los filamentos de actina por las Rho GTPasa. ............. 34
Figura 9. Separación de proteínas asociadas a péptidos de ICOS y CD28 por ensayos de “pull
down”. ..................................................................................................................................... 62
Figura 10. Abundancia de las subunidades de PI3-cinasa de clase IA en diferentes tipos de
células T CD4+ de ratón. ......................................................................................................... 63
Figura 11. Abundancia relativa de las subunidades de PI3-cinasa de clase IA en ensayos de
“pull-down” con péptidos de ICOS. .......................................................................................... 64
Figura 12. Comparación de las subunidades de PI3-cinasa de clase IA asociadas a péptidos
fosforilados (ICOS pTir, sICOS pTir) o no fosforilados (ICOS) y a un péptido de CD28
fosforilado (CD28 pTir) por ensayos de “pull-down”. ................................................................ 66
Figura 13. Asociación de las subunidades de PI3-cinasa a inmunoprecipitados de ICOS
expresado en la superficie celular antes y después de la inducción de la fosforilación de
proteínas intracelulares con pervanadato. ............................................................................... 67
Figura 14. Abundancia de las subunidades catalíticas de PI3-cinasa de clase IA en
inmunoprecipitados de la subunidad reguladora alfa comparado con la abundancia en linfocitos
T. ............................................................................................................................................ 69
Figura 15. La depleción eficiente de la subunidad reguladora de PI3-cinasa elimina la
subunidad catalítica p110, pero no p110 en células SR.D10. ............................................... 70
ÍNDICE DE FIGURAS
VI
Figura 16. Abundancia de las subunidades catalíticas de PI3-cinasa de clase IA exógena en
inmunoprecipitados de la subunidad reguladora alfa. .............................................................. 72
Figura 17. Abundancia de las subunidades catalíticas de PI3-cinasa de clase IA exógena en
inmunoprecipitados del epítopo V5 presente en el vector de clonación. ................................... 73
Figura 18. Efecto del silenciamiento de la subunidad catalítica p110 de PI3-cinasa en la
coestimulación por ICOS. ........................................................................................................ 75
Figura 19. Asociación de las subunidades de PI3-cinasa a inmunoprecipitados de ICOS
expresado en la superficie de células tratadas con siARN para la subunidad catalítica p110
............................................................................................................................................... 76
Figura 20. Efecto del silenciamiento de la subunidad catalítica p110 de PI3-cinasa en la
coestimulación por ICOS. ........................................................................................................ 77
Figura 21. Efecto del silenciamiento de ambas subunidades catalíticas p110y p110 de PI3-
cinasa en la coestimulación por ICOS. .................................................................................... 78
Figura 22. Efecto de inhibidores farmacológicos en la secreción de IL-4 o IL-10 inducida por la
coestimulación con ICOS en SR.D10 y blastos de linfocitos T CD4+. ....................................... 79
Figura 23. Efecto de inhibidores farmacológicos en las señales tempranas de Akt y Erk
inducidas por la coestimulación con ICOS en células SR.D10. ................................................ 81
Figura 24. Efecto de la inhibición de las subunidades catalíticas p110 y p110 en la secreción
de IL-2, IL-4, IL-10 o IFN- inducida por la coestimulación con ICOS en blastos de linfocitos T
CD4+. ...................................................................................................................................... 82
Figura 25. Efecto de la inhibición de PI3-cinasa en las señales tempranas de Akt y Erk
inducidas por la coestimulación con ICOS en blastos de linfocitos T CD4+. ............................. 83
Figura 26. Efecto de la inhibición de la subunidad p110 en la coestimulación por CD28 y en la
viabilidad celular. .................................................................................................................... 85
Figura 27. Apoptosis de linfocitos T CD4+ inducida por inhibidores de PI3-cinasa. ................... 86
Figura 28. Efecto de la inhibición de la subunidad p110 en la proliferación celular y en la
producción de IFN-. ............................................................................................................... 87
Figura 29. Papel del silenciamiento de las subunidades catalíticas p110 y p110 de PI3-cinasa
en la supervivencia de linfocitos T. .......................................................................................... 88
Figura 30. La supervivencia de células SR.D10 activadas con IL-2 es dependiente de p110,
Akt y NFB.............................................................................................................................. 89
ÍNDICE DE FIGURAS
VII
Figura 31. La supervivencia de células SR.D10 sin activar es dependiente de p110, Akt y
NFB. ..................................................................................................................................... 90
Figura 32. Efecto de la inhibición de la subunidad p110 en la apoptosis y la viabilidad de
linfocitos T CD4+ y células SR.D10. ......................................................................................... 91
Figura 33. La apoptosis inducida por el inhibidor de NFB y de Akt en linfocitos T CD4+ es
dependiente de caspasas........................................................................................................ 92
Figura 34. La muerte celular inducida por el inhibidor de p110en células SR.D10 no es un
proceso autofágico. ................................................................................................................. 93
Figura 35. Elongación y cambios en el citoesqueleto de actina en células SR.D10. ................. 94
Figura 36. Papel de PI3-cinasa, Lck y Akt en la elongación celular inducida por ICOS. ............ 95
Figura 37. Papel de Vav-1 en la elongación celular inducida por ICOS. ................................... 96
Figura 38. Papel de las Rho GTPasas en la elongación celular inducida por ICOS. ................. 97
Figura 39. Papel de ROCK en la elongación celular inducida por ICOS. .................................. 98
Figura 40. Papel de MLCK en la elongación celular inducida por ICOS. .................................. 99
Figura 41. Papel de calmodulina en la elongación celular inducida por ICOS. ......................... 99
Figura 42. Papel de la GTPasa dinamina en la elongación celular inducida por ICOS. ........... 100
Figura 43. Gránulos de actina inducidos por ICOS. ............................................................... 101
Figura 44. Distribución de vinculina y actina en células incubadas con ligandos de ICOS. ..... 102
Figura 45. Efecto de la ligación de ICOS y de otras moléculas en la polimerización de actina y
la acumulación de “balsas” lipídicas. ..................................................................................... 104
Figura 46. ICOS no está presente en las balsas lipídicas de lisados celulares. ...................... 105
Figura 47. La ligación de CD3 más ICOS induce acumulación de balsas lipídicas en el sitio de
contacto celular. .................................................................................................................... 106
Figura 48. Representación esquemática de la potencial vía de señalización involucrada en los
cambios en el citoesqueleto de actina inducidos por la coestimulación con ICOS en linfocitos T.
............................................................................................................................................. 118
ABREVIATURAS
ABREVIATURAS
ABREVIATURAS
2
ABREVIATURAS
AP-1: Activador de proteína 1.
ARN: Ácido ribonucleico.
BAD: Inductor de muerte celular asociado a Bcl-2.
BCL-XL: Oncogén de leucemia de células B.
BTLA-4: Atenuador de linfocitos B y T.
CD: Cúmulo de diferenciación.
Cdc42: Proteína del ciclo células 42, proteína G.
CPA: Célula presentadora de antígeno.
CREB: Elemento de respuesta al cAMP.
CTLA-4: Antígeno 4 asociado al linfocito T citotóxico.
DAG: Diacilglicerol.
DH: Homología a Dbl.
ERK: Cinasa reguladora por señales extracelulares.
FAK: Cinasa de adhesión focal.
GADs: Proteína adaptadora relacionada con Grb2.
GAPs: Proteínas activadoras de GTPasas.
GDP: Guanosina difosfato.
GEFs: Factores intercambiadores de nucleótidos de guanina.
GM-CSF: Factor estimulador de colonia de granulocitos y macrófagos.
GPCRs: Receptores asociados a proteínas G.
GRB-2: Proteína de unión a receptores de crecimiento 2.
GSK3: Glucógeno sintasa cinasa 3.
GST: Enzima glutatión-S-transferasa.
GTP: Guanosina trifosfato.
HLA: Antígeno leucocitario humano.
ICAM-1: Molécula de adhesión intercelular 1.
ICOS: Coestimulador inducible.
ICOS-L: Ligando de ICOS.
IFN-: Interferón gamma.
IkB: Inhibidor de NF-B.
IKK: Cinasas de IkB.
IL: Interleucina
IL-2R: Receptor de IL-2.
ITAM: Motivos de activación del inmunoreceptor basados en tirosina.
ABREVIATURAS
3
JNK: Cinasa del NH2-terminal de c-Jun.
kDa: Kilo Dalton.
LAT: Conector para la activación de las células T.
LcK: Proteína tirosina cinasa específica de leucocitos.
MAPK: Proteína cinasa activada por mitógenos.
MDM2: Murino doble minutos clon 2.
MEK: Cinasa de las proteínas cinasa activadas por mitógenos.
MHC: Complejo principal de Histocompatibilidad.
MLC: Miosina de cadena ligera.
MLCK: Cinasa de la cadena ligera de la miosina.
mTOR: Diana de la rapamicina en mamíferos.
NF-AT: Factor nuclear de células t activadas.
NF-B: Factor nuclear estimulador de la cadena ligera de células B activadas.
NK: Células agresoras naturales.
P70S6: Cinasa de S6 de 70 kDa.
PAK: Proteína cinasa activada por p21.
PD-1: Muerte celular programada 1.
PDK: Proteína cinasa dependiente de fosfoinosítidos.
PH: Homología a Pleckstrina.
PKA: Proteína cinasa A.
PKB: Proteína cinasa B.
PKC: Proteína cinasa C.
PLC-: Fosfolipasa C gamma.
PTEN: Fosfatasa homologa de tensina.
PTK: Proteína tirosina cinasa.
PX: Homología phox.
Pyk2: Tirosina cinasa rica en prolina.
Raf: Factor activado por ras.
ROCK: Cinasa asociada a Rho.
SH2: Dominio de homología Src de tipo 2.
SH3: Dominio de homología Src de tipo 3.
SHIP: Fosfatasa de inositol que contiene dominio SH2.
SI: Sinapsis inmunológica.
siARN: Acido ribonucleico interferente pequeño.
SLP-76: Fosfoproteína específica de leucocitos que contiene dominio SH2.
SMAC: Complejo supramolecular de activación.
Sos: Proteína cuyo nombre deriva de “Hijo de sevenless”.
TCR: Receptor de células T.
TGF-: Factor de crecimiento transformante beta.
Th: Célula T cooperadora.
ABREVIATURAS
4
TNF-: Factor de necrosis tumoral alfa.
TRIM: Proteínas de motivo Tripartito.
VCAM: Molécula de adhesión de las células vasculares.
WASP: Proteína del síndrome de Wiskott-Aldrich.
ZAP-70: Proteína de 70 kDa asociada a .
RESUMEN
RESUMEN
RESUMEN
6
RESUMEN
ICOS es una molécula coestimuladora expresada en linfocitos T activados; comparte con CD28
un motivo citoplasmico (YxxM), importante en la señalización celular por ser potencialmente
capaz de asociar las subunidades reguladoras de PI3-cinasa. Puesto que hay una diversidad
de subunidades catalíticas en las PI3-cinasas de clase IA (, , ), con importantes diferencias
en su expresión y –posiblemente- en sus funciones, hemos analizado la asociación de las
distintas subunidades de PI3-cinasa a ICOS.
En este trabajo se analizaron por ensayos de “pull-down” aquellas proteínas de lisado de
células SR.D10, linfocitos T CD4+ y linfoblastos capaces de unirse a péptidos de ICOS
fosforilados en el residuo de tirosina (ICOSpTir) y a inmunoprecipitados de ICOS.
Los péptidos ICOSpTir asocian las subunidades reguladoras de PI3-cinasa (p85, p85, p50-
55) y las subunidades catalíticas (p110, p110 y p110). Por ensayos de “inmunoblot” se
encontró una asociación preferencial de la subunidad catalítica p110 a péptidos ICOSpTir
pero también a inmunoprecipitados de ICOS. Además, al inmunoprecipitar PI3-cinasa con
anticuerpos frente a la subunidad reguladora se observó una unión preferencial de la
subunidad p110 a la subunidad reguladora, explicando la asociación preferencial de esta
subunidad a ICOS.
Como se ha postulado una importancia funcional preferente de la subunidad catalítica p110 en
la activación de linfocitos T, se han analizado las funciones de ambas subunidades p110 y
p110 en la coestimulación por ICOS.
Al estudiar la fosforilación de Akt y la producción de citocinas inducida por anti-CD3 y anti-ICOS
en diferentes tipos celulares observamos una diferente sensibilidad de los residuos Ser473 y
Tre308 de Akt al utilizar inhibidores dirigidos a diferentes subunidades catalíticas p110,
confirmando la importancia de estas subunidades en la activación de Akt. Así, en células
SR.D10 la activación temprana de Akt (Ser473), fue bloqueada parcialmente al inhibir las
subunidades catalíticas p110 y p110 de PI3-cinasa con siARN o con inhibidores
farmacológicos; en blastos de linfocitos T CD4+, la fosforilación en la Treonina 308 de Akt fue
inhibida eficientemente por inhibidores de p110 (A66), p110 (IC87114), o de todas las
isoformas (LY294002), mientras que la fosforilación en la Serina 473 fue inhibida parcialmente
por el inhibidor de p110 (A66), y totalmente por el de p110, o por LY294002. Estos
resultados confirman la importancia de estas subunidades en la activación de Akt. En cuanto a
la secreción de citocinas encontramos que la producción de IL-4 e IL-10 es dependiente de la
vía PI3-cinasa/Akt en células SR.D10, ya que el inhibidor general de PI3-cinasa (LY294002) y
de las subunidades catalíticas p110 y p110 inhiben la secreción de estas citocinas En
blastos no se observó un efecto significativo sobre la producción de IL-4 o IL-10, pero si sobre
la producción de IFN- con concentraciones más bajas de los dos inhibidores de p110.
RESUMEN
7
La asociación preferente de las subunidades catalíticas p110 a las subunidades reguladoras
de PI3-cinasa no es específica de la región citoplasmática de ICOS, también pudimos
observarla asociada a un péptido de CD28 fosforilado en su motivo YxxM. Al analizar el papel
de p110 en la coestimulación por CD28 encontramos que, a concentraciones de 1-0,1 M, el
inhibidor de p110 (PIK-75) inhibía completamente la proliferación a tres días y la producción
de citocinas como IL-2 o IFN-. Sin embargo, observamos que esta inhibición estaba
acompañada por una fuerte pérdida de viabilidad en las células a partir de las 24 horas de
cultivo. El uso de inhibidores y el silenciamiento de la subunidad catalítica p110 confirmaron la
importancia de esta subunidad en la supervivencia de linfocitos T. Además, la muerte celular
inducida por PIK-75 es dependiente de caspasas en linfocitos T CD4+ pero no en la línea
celular SR.D10.
También demostramos que la ligación de ICOS induce elongación celular y gránulos densos o
puntos de actina polimerizada que se encuentran muy cerca de la superficie de contacto célula-
cristal; estos cambios morfológicos son dependientes de PI3-cinasa, en especial de la
subunidad catalítica p110. Los cambios en el citoesqueleto de actina inducidos por ICOS son
dependientes de Vav, de las GTPasas Rac-1 y Cdc42, y de la cinasa de la cadena ligera de
miosina (MLCK), pero independientes de la vía de Akt o de ROCK. ICOS incrementa el
agrupamiento de balsas lipídicas inducida por anticuerpo anti-CD3 en el sitio de contacto con el
estímulo. Sin embargo, ICOS, es indetectable en las balsas de membrana, incluso empleando
ligandos (CD3 o ICOS) capaces de inducir cambios claros en el citoesqueleto de actina.
En conjunto, en este trabajo resaltamos la importancia de PI3-cinasa de clase IA en la
coestimulación de ICOS; no solo confirmamos la importante función de la subunidad catalítica
p110, sino que también atribuimos un papel dominante a la subunidad catalítica p110, que la
convierte en una nueva diana potencial en la terapéutica inmunomoduladora. La investigación
adicional de los modelos de ratón seguirá aportando pistas sobre los posibles beneficios y retos
de una terapia dirigida a p110 de PI3-cinasa.
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
9
1 INTRODUCCIÓN
1.1 ACTIVACIÓN DE LINFOCITOS T
La defensa contra patógenos implica la actuación coordinada de un conjunto de elementos
defensivos –moleculares y celulares- de la inmunidad innata y de la inmunidad adaptativa que,
una vez eliminado el patógeno, se desactivan para no perjudicar al huésped. Entre los
elementos defensivos propios de la inmunidad adaptativa destacan los linfocitos T. Éstos, una
vez activados, contribuyen de un modo antígeno-específico al desarrollo y control de las
respuestas inmunes mediante la secreción de moléculas efectoras (citocinas) y mecanismos de
citotoxicidad.
El proceso de activación de los linfocitos T se produce tras una compleja sucesión de
interacciones celulares. Se inicia cuando el receptor de los linfocitos T (TCR) reconoce
moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) junto al péptido que éstas
transportan en la superficie de células presentadoras de antígeno (Antigen-presenting cells,
APC). La unión entre el TCR y el péptido junto con la molécula de MHC es específica y
reforzada por la unión, de las moléculas de MHC de Clase II y I a los receptores CD4 y CD8,
respectivamente, fortaleciendo las interacciones entre el TCR/MHC y el péptido (Davis et al.
1988, Konig 2002).
El proceso de reconocimiento varía si el receptor para antígeno de células T (T-cell receptor,
TCR) está formado por un heterodímero / o si es del tipo /. Sin embargo, para que la
activación se inicie adecuadamente, se requieren las moléculas CD3 que forman un complejo
plurimolecular con el TCR (complejo TCR/CD3) y que transmiten las señales recibidas del TCR
hasta el interior celular (Alarcon et al. 2003, Rojo et al. 2008a). Además se requiere la
participación de diferentes moléculas presentes en la membrana de los linfocitos, incluyendo
CD4, CD8 y CD28, que facilitan la unión intercelular y potencian la transmisión de señales al
interior celular. Por último, diversas moléculas de adhesión fortalecen la unión entre los
linfocitos T y las células presentadoras de antígeno (McAdam et al. 1998, Montoya et al. 2002,
Rudd 1996).
En ausencia de señales coestimuladoras, la señal mediada por el TCR puede conducir al
linfocito a la muerte celular o a un estado de anergia, en la que el linfocito no responde a
nuevas estimulaciones. Después de la ocupación de los receptores T por el antígeno, se
produce la activación de los linfocitos y la iniciación de eventos tempranos de transducción de
señales que finalmente conducen a la reprogramación génica y a la adquisición de funciones
efectoras.
Una vez activados los linfocitos T, estos producen citocinas o factores citotóxicos, según se
trate de linfocitos T CD4+ o CD8
+. De esta manera se desarrolla la respuesta inmune. Los
linfocitos T CD4+ colaboran en la posterior activación de otras células como NK, T CD8
+,
INTRODUCCIÓN
10
linfocitos B o macrófagos. A su vez los linfocitos T CD8+ tras su activación ejercen su función
citotóxica destruyendo células blanco (Figura 1).
Figura 1. Fases de la respuesta de células T CD4+.
El reconocimiento del antígeno por una célula T (CD4+
) induce la secreción de citocinas (IL-2), la
expansión clonal y la diferenciación de las células T en células T efectoras o en células de memoria. En la
fase efectora, las células efectoras responden al antígeno produciendo citocinas que permiten la
activación de macrófagos, de linfocitos B y de células T CD8+ y la inducción de la inflamación. (Abbas et
al. 1999).
____________________________________________________________________________
1.1.1 Estímulos mediados por el receptor de células T
Cuando el linfocito T ha sido estimulado a través del complejo TCR/CD3 se produce una rápida
activación de proteínas con actividad tirosina cinasa y tirosina fosfatasa (Acuto & Cantrell 2000,
June et al. 1990a), incrementando la fosforilación en tirosina de las cadenas no polimórficas del
CD3. La molécula CD45 a través de su actividad fosfatasa activa por defosforilación a las dos
proteínas cinasas de la familia Src (Lck y Fyn) (Cahir McFarland et al. 1993, Hegedus et al.
1999, Mustelin & Tasken 2003).
La asociación física y funcional del CD4 y del CD8 con el TCR/CD3, hace que la cinasa Lck
asociada a estas moléculas se aproxime a la porción citoplasmática de las proteínas del
complejo CD3. Fyn, al igual que Lck es otra tirosina cinasa que pertenece a la familia de
cinasas Src. Esta cinasa está físicamente asociada al TCR y su actividad está regulada por la
ocupación y activación del mismo. Las cadenas del CD3 poseen en sus dominios
intracitoplasmáticos motivos de secuencia similares denominados ITAM que se fosforilan por
acción de las tirosina cinasas Lck y Fyn (Palacios & Weiss 2004, van Oers et al. 1996). Una vez
que los ITAM son fosforilados en residuos de tirosinas, se convierten en sitios específicos de
INTRODUCCIÓN
11
acoplamiento que se unen a proteínas citoplasmáticas con dominios SH2. La proteína con
actividad tirosina cinasa de la familia Syk denominada ZAP-70 se activa cuando a través de sus
dominios SH2 se une a las cadenas que han sido previamente fosforiladas por Fyn o Lck (Chu
et al. 1998, Mustelin & Tasken 2003).
ZAP-70 acopla señales desde la superficie celular hasta el núcleo por fosforilación de los
adaptadores LAT y SLP-76 (Qian et al. 1996, Yamasaki & Saito 2005). LAT es una proteína
transmembrana cuya función, una vez fosforilada, es organizar complejos multimoleculares en
determinados subdominios lipídicos de la membrana plasmática. Estos complejos contienen
proteínas claves para la señalización al interior celular como lo es PLC--1 (Acuto & Cantrell
2000, Finco et al. 1998). PLC--1 se fosforila en tirosina y se activa dentro de los complejos de
la membrana plasmática donde induce la hidrólisis de fosfatidilinositol bifosfato (PIP2), en
metabolitos como inositol trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG). De este modo se regula el
aumento del calcio intracelular y se activa la proteína cinasa C (PKC) y posiblemente algunas
cinasas activadas por mitógenos (MAPKs).
El aumento de la concentración de calcio intracelular es importante durante las fases iniciales
del proceso de activación de la célula T, ya que actúa como segundo mensajero, activando a
múltiples cinasas y fosfatasas que dependen de calcio, como la calcineurina (Crabtree &
Clipstone 1994, Smith-Garvin et al. 2009). Dentro de las múltiples proteínas que son
fosforiladas por la PKC o por proteínas dependientes de calcio se encuentran algunos factores
de transcripción nucleares como NF-AT (Macian et al. 2001, Northrop et al. 1994), NF-B, o
AP-1 (Baier-Bitterlich et al. 1996). Estos factores nucleares se unen al promotor de distintos
genes, haciéndolos más atractivos a la ARN polimerasa. Como respuesta, se comienzan a
transcribir en el núcleo un conjunto de genes que permitirán al linfocito T desarrollar sus
funciones efectoras, incluyendo de modo destacado la producción de citocinas (Figura 2).
Las tirosinas cinasas activadas por el TCR también activan vías de señalización a través de
Ras y mediadas por LAT (Izquierdo Pastor et al. 1995, Wange 2000). Este adaptador
fosforilado por ZAP-70 se une a otro adaptador intermediario (Grb-2) que contiene dominios
SH2 y SH3. Grb-2 se une a proteínas específicas fosforiladas en tirosina a través de su dominio
SH2 y a la proteína de intercambio de nucleótidos de guanina (Sos) mediante su dominio SH3.
La proteína de intercambio actúa sobre la forma inactiva de Ras (Ras-GDP) convirtiéndola en
su forma activa (Ras-GTP), de esta manera puede unirse y retener a c-Raf cerca de la
membrana plasmática (Downward 1996). Esta acción mediada por Ras, hace que Raf se active
y actúe como una cinasa de MAPK (MAPKK) que a su vez activa y fosforila una o más MAPKs,
incluyendo a ERK-1 y ERK-2; una vez que las ERKs son activadas, migran al núcleo donde
regulan la transcripción de c-fos, que forma dímeros con c-jun para formar el complejo AP-1,
que es fosforilado por las JNK en la subunidad c-jun, regulando su actividad transcripcional
(Genot et al. 1996).
INTRODUCCIÓN
12
Figura 2. Procesos de señalización celular inducida por la activación de la célula T.
La unión del receptor de la célula T (TCR) a los correceptores del complejo MHC en las células
presentadoras de antígeno (CPA) inicia los procesos de señalización que conducen a la fosforilación de
las cadenas CD3 , y , del complejo TCR/CD3, a la unión y activación de ZAP-70, a la fosforilación de
proteínas adaptadoras y a la activación de enzimas celulares que se encargaran de activar factores de
transcripción que estimulan la expresión de genes importantes en la respuesta de la célula T.
____________________________________________________________________________
Existen otras enzimas que participan en el metabolismo de fosfolípidos, las fosfatidilinositol-3
cinasas, las cuales catalizan la fosforilación de los fosfatidilinositoles, principalmente del
P(4,5)P2 (PIP2), para dar como producto el PI(3,4,5)P3 (PIP3) que es el segundo mensajero de
esta ruta (Ward et al. 1996). Los productos de PI3-cinasa, en especial PI(3,4,5)P3, se unen a
dominios de homología a pleckstrina (PH), que se encuentran en una gran variedad de
moléculas implicadas en diferentes vías de señalización, modificando así su actividad o su
localización subcelular (Rameh et al. 1997). Una de las dianas mejor caracterizadas de la
INTRODUCCIÓN
13
acción de estos lípidos fosforilados es la proteína cinasa B (PKB) también denominada Akt
(Fayard et al. 2010, Reif et al. 1997). En las células T, Akt es capaz de fosforilar y activar a su
vez una gran variedad de substratos implicados en la supervivencia celular y la transcripción de
diversos genes (BAD, CREB, factores de transcripción E2F, la cinasa IB y la procaspasa-9),
explicando la importancia de esta cinasa en los procesos de proliferación y diferenciación
celular (Alessi & Cohen 1998, Fayard et al. 2010).
1.2 PI3-CINASAS
Las PI3-cinasas (Fosfatidilinositol 3-cinasas) son una familia de proteínas que regulan múltiples
funciones celulares, ya que son capaces de fosforilar el grupo hidroxilo de la posición 3' del
anillo inositol de fosfatidilinositol. Las PI3-cinasas se definen en base a su estructura primaria,
regulación y especificidad por el sustrato. Las diferentes isoformas de PI3-cinasa se clasifican
en tres grupos: PI3-cinasa de clase I, PI3-cinasa de clase II y PI3-cinasa de clase III.
1.2.1 PI3-cinasas de clase I
Son heterodímeros formados por dos subunidades, una subunidad catalítica y una subunidad
reguladora. Las PI3-cinasa son capaces de convertir “in vitro” PI en PI(3)P, PI(4)P en PI(3,4)P2
y PI(4,5)P2 en PI(3,4,5)P3, mientras que “in vivo” su substrato generalmente es PIP2.
La activación de PI3-cinasa está regulada negativamente por fosfatasas SHIP y PTEN. La
primera tiene actividad 5´fosfoinosítido fosfatasa convirtiendo PI(3,4,5)P3 en PI(3,4)P2 y la
segunda hidroliza PI(3,4,5)P3 en PI(4,5)P2, inactivando así un segundo mensajero en la
señalización celular y convirtiéndola en supresor tumoral (Torres & Pulido 2001).
Las PI3-cinasas de clase I se pueden subdividir en enzimas de clase IA y clase IB. Las PI3-
cinasas de clase IA son activadas por receptores con actividad tirosina-cinasa asociada,
incluyendo receptores de antígenos, moléculas coestimuladoras y receptores de citocinas. En
mamíferos se encuentran tres isoformas de la subunidad catalítica (, , ) con pesos
moleculares de 110 kDa y codificadas por tres genes diferentes. Las subunidades catalíticas
posen 4 dominios de homología conservados: un dominio de unión a Ras (RBD), un dominio de
unión a fosfolípidos de membrana (C2), un dominio implicado en la interacción proteína-
proteína (PIK) y un dominio catalítico de cinasa (DC). Este dominio contiene residuos cargados
negativamente los cuales son importantes para la actividad enzimática. Las subunidades
catalíticas p110 y p110 se distribuyen ampliamente en tejidos de mamíferos, mientras que la
subunidad catalítica p110 tiene una expresión más restringida, especialmente a leucocitos
(Vanhaesebroeck et al. 1997).
La clase de PI3-cinasa IA también posee una subunidad reguladora con dos dominios SH2 que
permiten la unión a proteínas con fosfotirosina en motivos de secuencia de tipo YxxM. La unión
INTRODUCCIÓN
14
a fosfotirosina permite la translocación de PI3-cinasa a la membrana plasmática. Existen en
mamíferos 5 isoformas de la subunidad reguladora, dos subunidades de 85 kDa (p85 y p85),
dos subunidades de 55 kDa (p55 y p55) y una subunidad de 50 kDa (p50) que surgen del
procesamiento alternativo de tres genes (Fruman et al. 1996). Las isoformas de 85 kDa
poseen un dominio SH3, dos fragmentos ricos en prolina (PRDs) separados por un dominio
homólogo BCR y dos dominios SH2 separados por una secuencia iSH2 (inter-SH2); esta
secuencia es el sitio de unión con la subunidad catalítica (Figura 3). p55 tiene una estructura
idéntica a p55, y parecida a p50, con los dominios SH2 como en la subunidades p85 pero sin
los dominios SH3 y BCR. Las subunidades p85 y p85 se expresan de forma ubicua, la
expresión de p55 está restringida fundamentalmente al cerebro.
P
SH2 SH2iSH2
P
p110
PRD
PRD
SH3
G
Figura 3. Estructura esquemática del heterodímero p85/p110 de clase IA de PI3-cinasa.
La subunidad p85 tiene un dominio SH3 (N-terminal), dos dominios PRD y dos dominios SH2, separados
por la secuencia iSH2, responsable de la unión a la subunidad catalítica p110. Las flechas indican los
sitios de unión del heterodímero con los principales activadores de PI3-cinasa: proteínas fosfotirosina (P)
y proteínas G (G).
____________________________________________________________________________
Las PI3-cinasas de clase IB son activadas por receptores acoplados a proteínas G (GPCRs);
solo se ha identificado una subunidad catalítica (p110) formando un complejo con la
subunidad reguladora p101 o p84 (Figura 4). La subunidad catalítica p110 tiene los dominios
RBD, C2, PIK, el dominio catalítico cinasa (DC) y dos dominios de unión a las subunidades
de las proteínas G (Leopoldt et al. 1998).
Se ha visto que p110 se asocia en la mayoría de los tejidos con p101 (Suire et al. 2006). En
corazón, donde la expresión de p101 es muy baja, p110 se asocia con p84. Las subunidades
INTRODUCCIÓN
15
reguladoras poseen dos dominios, uno de unión a las subunidad catalítica (C) y otro de unión a
las subunidades de las proteínas G (G) tras la estimulación de GPCR (Figura 4).
Esta unión a proteínas G produce la translocación desde el citosol a la membrana celular y la
estimulación de su actividad cinasa. Es probable que no estén relacionadas directamente con
la señalización a través del TCR, aunque pueden promover la supervivencia de las células T
por otros sistemas receptor/ligando (Sasaki et al. 2000). Por lo tanto, en los linfocitos T se
espera que el receptor de células T, inicie señales activando principalmente a PI3-cinasa de
clase IA, mientras que las quimiocinas activan a las PI3-cinasa de clase IB (Fruman 2007).
Figura 4. Clasificación y estructura de PI3-cinasa.
Las PI3-cinasas se dividen en tres grupos (Clase I-III). Todas las subunidades catalíticas poseen un
dominio C2, un dominio catalítico (DC) y un dominio implicado en la interacción proteína-proteína (PIK).
Las PI3-cinasas de clase I son heterodímeros formados por una subunidad catalítica p110 y una
subunidad reguladora. Todas las isoformas de p85 tienen dos dominios SH2, estos dominios no están
presentes en las subunidades reguladoras p101 y p84. Las PI3-cinasas de clase II carecen de
subunidades reguladoras. Las PI3-cinasas de clase II están formadas por un una subunidad catalítica
Vps34 unida a una subunidad reguladora p150.
INTRODUCCIÓN
16
1.2.2 PI3-cinasa de clase II y III
Las PI3-cinasa de clase II son moléculas muy grandes (170 kDa), que tienen un extremo C-
terminal con un dominio C2 capaz de unirse a lípidos de manera independiente del Ca2+
(Arcaro et al. 1998), un dominio de homología Phox (PX), un dominio catalítico y un dominio
PIK similares al dominio de PI3-cinasa de clase I y en el extremo N-terminal poseen un dominio
de unión a Ras (Vanhaesebroeck et al. 2010). Son capaces de fosforilar “in vitro” a PI y PI(4)P.
En mamíferos existen tres isoformas catalíticas de PI3-cinasa de clase II (C2, C2 y C2
codificadas por genes diferentes. C2 y C2 se expresan de forma ubicua y C2 se expresa
preferencialmente en el hígado (Vanhaesebroeck et al. 2001). Esta clase de enzimas no posee
subunidad reguladora (Figura 4).
Las PI3-cinasa de clase III son heterodímeros compuestos por una subunidad catalítica
(Vps34) y una reguladora (p150 o Vps15) (Figura 4). La subunidad reguladora p150 posee un
dominio catalítico (inactivo), dominios de interacción proteína-proteína (HEAT), repeticiones
WD, las cuales permiten la interacción con RAB5-GTP (Murray et al. 2002). Esta clase de PI3-
cinasa es capaz de fosforilar a PI(3)P y está involucrada en el tráfico de proteínas y en
procesos como la fagocitosis (Okkenhaug & Vanhaesebroeck 2003).
1.2.3 Papel de PI3-cinasa en la activación de linfocitos T
Existen varios modos de activación de PI3-cinasa en linfocitos T (Figura 5). En el primer
modelo, la activación de la molécula coestimuladora CD28 con sus ligandos B7-1 o B7-2
permiten la fosforilación en tirosina del motivo YxxM y la formación de una interacción de alta
afinidad entre los dominios SH2 de la subunidad reguladora p85 de PI3-cinasa y el residuo de
tirosina fosforilado de CD28 (Ward & Cantrell 2001). En este proceso es reclutada la subunidad
catalítica p110 de PI3-cinasa a la membrana plasmática, donde puede fosforilar PIP2
generando PI(3,4,5)P3. En el segundo modelo, están implicadas diferentes proteínas
adaptadoras capaces de reclutar a PI3-cinasa a la membrana plasmática en linfocitos T que
han sido activados a través del TCR. Después de la activación de algunas proteínas tirosina
cinasa (PTKs) como LcK, Fyn y ZAP-70, se fosforilan diversos sustratos incluyendo las
proteínas TRIM y LAT, las cuales forman complejos con PI3-cinasa. TRIM interactúa
directamente con PI3-cinasa a través de su motivo YxxM. LAT presenta 10 residuos de tirosina,
algunos de ellos median la interacción con PI3-cinasa, es posible que p85 interactué
directamente con LAT o por medio de Grb-2 o Cbl (Bruyns et al. 1998, Zhang et al. 1998a). En
el tercer modelo, basado en la señalización a través de citocinas, la cadena del receptor de
IL-2 (IL-2R) recluta PI3-cinasa mediante la fosforilación e interacción de los adaptadores SHP2
y Gab2. La fosforilación de Gab2 y SHP2 es dependiente de la Tirosina 338 de la cadena del
receptor IL-2R, además esta tirosina es importante en la unión al adaptador Shc para la
formación del complejo Grb-Gab2 o Grb-2-SHPS (Gu et al. 2000). En el cuarto modelo de
INTRODUCCIÓN
17
señalización a través de quimiocinas, la subunidad catalítica p110 de PI3-cinasa es estimulada
por las subunidades de proteínas G acoplada a receptores de quimiocinas (7TM), además
estos receptores pueden activar PTKs, facilitando la fosforilación de adaptadores
intermediarios, de manera similar a los dos modelos siguientes (Sotsios & Ward 2000).
Figura 5. Mecanismos de activación y reclutamiento de PI3-cinasa en linfocitos T.
Existen cuatro modelos en los cuales los receptores de superficie de las células T pueden reclutar y
activar a PI3-cinasa. a) Por activación de CD28. b) Por activación de PTKs a través del receptor de
antígenos y de proteínas adaptadoras como TRIM y LAT. c) Por señalización a través de la cadena del
receptor de IL-2 (IL-2R). d) Por señalización a través de receptores de quimiocinas acoplados a proteínas
G (7TM). (Figura obtenida de Ward & Cantrell. Current Opinion in Immunology, 2001).
____________________________________________________________________________
Las isoformas de las subunidades catalíticas p110 están acopladas a diferentes activadores y
efectores, y por lo tanto es posible que funcionen de manera diferente (Ward & Cantrell 2001).
El uso de inhibidores farmacológicos de PI3-cinasa, como wortmanina o LY294002 y el análisis
de ratones deficientes en las subunidades catalíticas o reguladoras de PI3-cinasa, permiten
demostrar la importancia de esta vía en muchos procesos como la progresión del ciclo celular,
la motilidad celular y la adhesión celular.
La expresión de la subunidad catalítica p110 restringida a leucocitos, le confiere un papel
importante en la señalización a través del receptor de células T. La pérdida de la función de
INTRODUCCIÓN
18
esta subunidad por medio de mutaciones (D910A) genera daños en las señales del TCR y en
la fosforilación de AKT dependientes de CD28 (Okkenhaug et al. 2006).
Ratones deficientes en p110 muestran defectos en la respuesta de macrófagos y neutrófilos
frente a las quimiocinas. Además células T de ratones p110-/-
presentan defectos en la
producción de citocinas frente a la activación inducida por el TCR (Sasaki et al. 2000).
La capacidad de las quimiocinas para regular el citoesqueleto de actina y la movilidad celular
requiere de la actividad de PI3-cinasa; una pérdida en esta respuesta podría perjudicar la
capacidad de los linfocitos T para hacer contacto celular, afectando la supervivencia y la
capacidad de las células para responder ante un estimulo.
Estudios de la función de PI3-cinasa de clase IA en células T sugieren que la inhibición de esta
subclase puede tener un efecto en la autoinmunidad. El estudio inicial de ratones p110D910A
que desarrollan una enfermedad inflamatoria intestinal, indica que las células T reguladoras
están muy afectadas en este tipo de ratones (Patton et al. 2006). De esta manera la
identificación de p110 como una proteína de señalización intracelular que regula la actividad
de las células T reguladoras podría dilucidar el mecanismo molecular responsable de la
supresión mediada por este tipo de células.
1.2.4 Papel de PI3-cinasa en la coestimulación
La molécula CD28 proporciona una señal coestimuladora esencial para la activación del
linfocito T, aumentando la producción de IL-2, incrementando la proliferación, y evitando la
muerte celular. CD28 puede activar a PI3-cinasa de manera independiente del TCR, ya que
CD28 posee en la región citoplasmática el motivo YxxM (Y170), el cual proporciona el sitio de
acoplamiento para los dominios SH2 de la subunidad reguladora p85 de PI3-cinasa. La
interacción de CD28 con su ligando también tiene un papel importante en la respuesta
dependiente del TCR.
Algunos experimentos con ratones transgénicos que expresan un mutante de CD28 donde se
ha sustituido la tirosina del motivo YxxM por una fenilalanina (Y170F) han demostrado que
CD28 puede coestimular la proliferación de las células T y la producción de IL-2 independiente
de su asociación con PI3-cinasa (Burr et al. 2001, Okkenhaug et al. 2001). Otro estudio
encontró que la proliferación y la producción de IL-2 es menor en los ratones mutantes (Harada
et al. 2001). Sin embargo, células T CD28 mutadas (Y170F) no tienen alterada la capacidad
coestimuladora de CD28 “in vivo”; estas células muestran ayudan a las células B durante la
respuesta inmune antiviral, previenen la inducción de anergia, y promueven la proliferación de
células T y la secreción de IL-2 (Okkenhaug et al. 2001). En contraste con la producción de IL-
2, estas células T CD28 (Y170F) perdieron la capacidad para promover la supervivencia a
través de la inducción de la expresión de Bcl-XL (Burr et al. 2001, Okkenhaug et al. 2001).
Es importante resaltar el papel que tiene Akt en la inducción de la expresión de Bcl-XL después
de la activación de PI3-cinasa en células T (Jones et al. 2000). La sobreexpresión de una forma
INTRODUCCIÓN
19
activa de Akt en células T CD4+ CD28
-/- devuelve a las células la capacidad para secretar IL-2
en respuesta a un péptido antigénico (Kane et al. 2001), pero células de T CD4+ CD28 (Y170F)
disminuyen la fosforilación de Akt y producen niveles normales de IL-2. Aunque la capacidad
que tiene CD28 para reclutar PI3-cinasa es importante para regular la producción de IL-2, es
posible que CD28 pueda influir en la capacidad del TCR para unirse a PI3-cinasa y activar la
vía Akt de manera independientemente de la tirosina 170.
Además del motivo YxxM de unión a PI3-cinasa presente en CD28, existen otras dos regiones
ricas en prolina con las cuales puede unirse a dominios SH3 (Kim et al. 1998). Aunque con esta
regiónes ricas en prolina CD28 no se puede unir directamente al dominio SH3 de la subunidad
reguladora p85, si puede interactuar con Lck y estimular su actividad cinasa (Holdorf et al.
2002) y de esta manera estimular la activación de PI3-cinasa a través del TCR (Acuto & Michel
2003). Es decir, tanto CD28 como el TCR contribuyen a la activación de PI3-cinasa.
1.2.5 Interacción de PI3-cinasa con otras moléculas de señalización
La función de los fosfolípidos como mensajeros consiste en permitir el anclaje de proteínas
enzimáticas citosólicas a la membrana plasmática, facilitando la interacción con sus sustratos.
Los productos de PI3-cinasa interactúan con diferentes moléculas de señalización como
tirosina cinasas, GTPasas y Serina/treonina cinasas a través de dominios de homología
pleckstrina (PH). Estos dominios son estructuralmente conservados, de aproximadamente 100
aminoácidos y se unen con alta afinidad a Fosfatidilinositoles. A continuación se encuentra una
breve descripción de las interacciones entre estas moléculas.
1.2.5.1 Tirosina cinasas
La familia de tirosina cinasas TEC, que incluye Btk, Itk y Tec poseen en el extremo amino
terminal un dominio PH de unión a PI(3,4,5)P3 (Qiu & Kung 2000, Salim et al. 1996). El dominio
PH de Bkt media la translocación de esta cinasa a la membrana plasmática, donde estas
cinasas son importantes para la fosforilación y activación de PLC- (Saito et al. 2003,
Scharenberg et al. 1998) y la movilización de calcio.
Mientras, PI3-cinasa fosforila a PI(4,5)P2, PLC- hidroliza a estos lípidos para producir IP3 y
DAG, y mediar la liberación del calcio intracelular y la activación de PKC (Ward & Cantrell
2001).
1.2.5.2 Factores intercambiadores de nucleótidos de guanina
Las proteínas GEFs o factores intercambiadores de nucleótidos de guanina son proteínas
importantes en la activación de las pequeñas GTPasas, ya que catalizan el intercambio de la
forma unida a GDP (inactiva) a la forma unida a GTP (activa). Estas GTPasas están implicadas
INTRODUCCIÓN
20
en importantes vías de señalización que afectan a la diferenciación, crecimiento celular y la
organización del citoesqueleto de actina.
El gran número existente de GTPasas requiere una multitud de GEFs para asegurar la
especificidad en las rutas de señalización. Existen varias familias de dominios GEFs con
secuencias y estructuras completamente distintas (Cherfils & Chardin 1999). Los GEFs que
regulan a la familia Rho se caracterizan por presentar un dominio DH (homología Dbl) de 200
aminoácidos, que es necesario para la actividad intercambiadora de Rho. También poseen un
dominio PH (homología Pleckstrina) adyacente al anterior, que está implicado en las
interacciones proteína-proteína y proteína-fosfolípidos.
Las proteínas Rho pertenecen a la superfamilia de proteínas Ras, y comparten un 50-60% de
identidad entre ellas y un 30% de identidad con Ras. Las GTPasas de la familia Rho más
estudiadas son Rho, Rac y Cdc42. La principal función de estas proteínas es la regulación del
ensamblaje del citoesqueleto de actina. De esta manera, ellas juegan un papel en una variedad
de procesos celulares dependientes del citoesqueleto de actina, tales como: migración,
citocinesis, secreción y morfogénesis, entre otros (Ridley 2001).
PI3-cinasa controla los cambios en el citoesqueleto de actina mediados por Rac, la activación
de esta cinasa aumenta los niveles de Rac-GTP (Leevers et al. 1999). El mecanismo por el
cual PI3-cinasa activa a Rac, no es aún muy claro, sin embargo la actividad GEF de Vav podría
estar directamente relacionada (Han et al. 1998, Sanchez-Martin et al. 2004).
1.2.5.3 Serina/Treonina cinasas
Los productos de PI3-cinasa reclutan a la membrana plasmática a serina treonina cinasas
citosólicas que incluyen PDK1, PDK2 y Akt. Akt, es activada en linfocitos T por citocinas, el
receptor de antígenos y la molécula coestimuladora CD28 (Leevers et al. 1999, Parry et al.
1997).
Akt posee un dominio PH en la región N-terminal involucrado en la unión a PI(3,4)P2 o
PI(3,4,5)P3 (Vanhaesebroeck & Alessi 2000). La expresión de PI3-cinasa es suficiente para
desencadenar la activación de Akt en linfocitos. Durante la señalización de citocinas, mediada
por PI3-cinasa, PKB y p70S6, se estimula la actividad de factores de transcripción E2F,
importantes en el control del ciclo celular (Brennan et al. 1999).
La unión de Akt a lípidos no permite la activación “in vitro” de esta cinasa. Sin embargo, la
acción de PDK1 y PDK2, las otras dos serina treonina cinasas dependientes de fosfolípidos,
permiten su activación mediante la fosforilación de los aminoácidos Tre308 por PDK1 y Ser473
por PDK2. Una vez Akt se encuentra fosforilada y activada puede autofosforilarse en otros
residuos y formar un complejo completamente activo e independiente de fosfolípidos que es
capaz de disociarse de la membrana plasmática y translocarse al núcleo (Downward 1998,
Vanhaesebroeck & Alessi 2000).
INTRODUCCIÓN
21
Al igual que Akt, PDK1 posee un dominio PH de unión a PI(3,4)P2 o PI(3,4,5)P3. A diferencia de
Akt, PDK1 parece existir en una conformación activa y aunque es fosforilada “in vivo”, su
actividad cinasa “in vitro” no se ve afectada (Alessi et al. 1997).
Akt juega un papel muy importante en la regulación de la supervivencia celular, su
sobreexpresión retrasa la muerte en diferentes tipos celulares. Se le ha atribuido un papel anti-
apoptótico por su acción sobre BAD y la caspasa-9 (Datta et al. 1999).
BAD se une a proteínas anti-apoptóticas como Bcl-2 y Bcl-XL, bloqueando su función. Cuando
BAD es fosforilada en los residuos de Ser112 o Ser136, no puede interactuar con estas
proteínas y como consecuencia se inhibe la apoptosis. Akt puede fosforilar a BAD en el residuo
de Ser136, y de esta manera contribuye a la supervivencia celular (Downward 1999). Sin
embargo, existen otras cinasas como PKA y MAP que pueden fosforilar a BAD, es por esto que
la inhibición de PI3-cinasa de clase IA no siempre induce apoptosis (Craddock et al. 1999).
La caspasa-9, una proteasa iniciadora capaz de activar caspasas efectoras como la caspasa-3,
puede ser fosforilada en el residuo de Ser196 e inhibida por Akt (Cardone et al. 1998)
Se ha descrito que Akt también interviene en la muerte celular por medio de mecanismos
basados en factores de transcripción. Akt fosforila los factores de transcripción de la familia
forkhead (FKHR, FKHRL y AFX), permitiendo su exportación desde el núcleo hasta el
citoplasma, donde quedan retenidos, formando complejos con las proteínas 14-3-3 (Medema et
al. 2000). La defosforilación de estos factores de transcripción produce su translocación al
núcleo y la expresión de genes pro-apoptóticos como el ligando de Fas (Biggs et al. 1999,
Brunet et al. 1999, Woods & Rena 2002).
Akt también activa el factor de transcripción NF-B; esto se inicia por la fosforilación y
consecuente activación de IKK (cinasa inhibidora de NF-B), que fosforila y marca a IB
(inhibidor de NFB) para ser degradado mediante el sistema ubiquitina-proteosoma, dejando
libre a NF-B y favoreciendo su translocación al núcleo y su actividad de transcriptor de genes
anti-apoptóticos.
Otro efecto de Akt, para favorecer la supervivencia celular, es la inactivación del gen supresor
de tumor p53; Akt puede fosforilar y activar a MDM2, una proteína que regula negativamente a
p53. MDM2 se encuentra usualmente en el citoplasma y cuando MDM2 es activado por Akt, se
transloca al núcleo para unirse a p53, impidiendo su actividad como factor de transcripción de
genes pro-apoptóticos (Carroll et al. 1999).
Akt media la transducción de señales de la insulina por fosforilación e inactivación de la
glucógeno sintasa cinasa (GSK3), una enzima reguladora de la cinasa mTOR y por lo tanto del
metabolismo (Beals et al. 1997, Marone et al. 2008). mTOR regula la traducción proteica, en
respuesta a nutrientes y factores de crecimiento, al fosforilar componentes de la maquinaria de
la síntesis de proteínas como son p70S6K y 4E-BP (Marone et al. 2008, Wendel et al. 2004).
INTRODUCCIÓN
22
1.3 LIGANDOS DE LA FAMILIA B7
Se han descrito siete miembros en esta familia, que son: B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), ICOS-L,
PD-L1, PD-L2, B7-H3 y B7-H4. Todos los miembros de esta familia son glicoproteínas
transmembrana de tipo I, e interaccionan con distintas moléculas de la familia de CD28. Se
caracterizan por presentar dos dominios extracelulares de tipo inmunoglobulina, uno variable
(IgV) y el otro constante (IgC), que están codificados por exones individuales; y exones
adicionales para los dominios citoplasmáticos y transmembrana. Los dominios de tipo
inmunoglobulina poseen aproximadamente 100 aminoácidos de longitud mientras, los dominios
citoplasmáticos son cortos (19-62 aminoácidos) y contienen residuos de serina y treonina que
podrían ser sitios de fosforilación en las vías de señalización.
Los genes que codifican para B7.1 y B7.2 están estrechamente relacionados, así como los
genes que codifican para PD-L1 y PD-L2, mientras que los genes que codifican para ICOS-L,
B7-H3 y B7-H4 no están ligados.
B7.1 y B7.2 se unen a CD28 y CTLA-4, pero sus funciones en la respuesta inmune no son
iguales, debido a sus diferentes interacciones con CD28 y CTLA-4 y su patrón de expresión. La
interacción B7.1-CTLA-4 es de mayor afinidad en comparación con la interacción B7.2-CTLA-4.
Mientras, CD28 se une de manera más eficaz a B7.2 que a B7.1 (Collins et al. 2002). Las
afinidades de unión de ICOS-L a su receptor son similares a las de B7.1-CD28 (Brodie et al.
2000). PD-L1 y PD-L2 se unen al mismo receptor PD-1, pero PD-L2 se une con mayor afinidad
(Youngnak et al. 2003).
Los ligandos B7 tienen diferentes funciones inmunes, la expresión de B7.1, B7.2 y PD-L2 se
limita a células linfoides mientras que ICOS-L, PD-L1, B7-H3 y B7-H4 tienen un patrón de
expresión más amplio.
Todos los ligandos B7 se expresan en células presentadoras de antígeno, incluyendo células
dendríticas, macrófagos y células B (Carreno & Collins 2002). Se detectan bajos niveles de
B7.2 en las células B en reposo, dendríticas y macrófagos, su activación resulta en un aumento
en la expresión de B7.2.
ICOS-L se puede expresar tanto en células hematopoyéticas como no hematopoyéticas; este
ligando se expresa de forma constitutiva en células B de ratón, en macrófagos de bazo y
peritoneo (Yoshinaga et al. 1999), y en una subpoblación de células de bazo CD3+ (Greenwald
et al. 2005). También se ha detectado la expresión de ICOS-L en áreas de los órganos linfoides
ricas en células B, incluyendo los folículos y la zona marginal del bazo, los folículos de las
placas de Peyer y la médula en el timo. Además se ha detectado en varios órganos no linfoides
como el cerebro, los riñones, los testículos, los pulmones y el músculo esquelético (Yoshinaga
et al. 1999).
La expresión de PD-L1 y PD-L2 está regulada por citocinas: IL-4 e IL-13 regulan PD-L2
mientras, el IFN-regula a PD-L1. B7-H3 y B7-H4 están expresados constitutivamente en
ratones, pero no en humanos (Carreno & Collins 2002).
INTRODUCCIÓN
23
Esta familia participa en la respuesta inmune, a través de la unión a los receptores de la familia
CD28, generando señales inhibidoras o coestimuladoras. Las señales coestimuladoras
complementan la activación de la célula T inducida por el receptor de antígeno. Un ejemplo de
señales coestimuladoras o coinhibidoras lo proporciona los ligandos B7.1 y B7.2 y sus
receptores CD28 y CTLA-4. La interacción entre los ligandos B7.1 y B7.2 con el receptor CD28
induce una mayor activación, expansión, diferenciación y supervivencia en las células T;
estudios con ratones deficientes en B7.1, B7.2 o CD28 demuestran su incapacidad para
generar una respuesta inmune eficaz (Borriello et al. 1997, Lenschow et al. 1996). Sin
embargo, ratones deficientes en CTLA-4 presentan un fenotipo autoinmune severo, la ausencia
de los ligando B7.1 y B7.2 en estos ratones elimina este fenotipo (Mandelbrot et al. 1999). Lo
anterior demuestra que la interacción B7/CTLA-4 contrarresta la interacción B7/CD28,
regulando de manera adecuada el receptor de células T y las señales coestimuladoras.
1.4 RECEPTORES DE LA FAMILIA CD28
Los miembros de la familia CD28 tienen un dominio extracelular similar al dominio de la región
variable de las inmunoglobulinas (IgV) por el que se unen a su ligando expresado en la célula
presentadora de antígeno, una región hidrofóbica transmembrana y una cola citoplasmática
corta con posibles sitios de unión a dominios SH2 y SH3 (Wang & Chen 2004). Los miembros
de esta familia incluyen CD28, ICOS, PD-1, CTLA-4 y BTLA-4. Son todas ellas moléculas con
importantes funciones en la amplificación (CD28, ICOS) o la inhibición (PD-1, CTLA-4, BTLA-4)
de las respuestas inmunitarias.
En cuanto al análisis filogenético de esta familia se puede decir que CD28, ICOS, y CTLA-4 se
agrupan en el cromosoma 2q33 y tienen una cisteína sin aparear que les permite
homodimerizar en la superficie de las células T. La cola citoplasmática de estos receptores
posee el motivo YxxM de unión a dominios SH2. Mientras que, PD-1 y BTLA se encuentran en
distintas localizaciones en el genoma (2q37 y 3q13, respectivamente) y son muy similares entre
sí. Es posible que PD-1 y BTLA-4 se encuentren como monómeros en la superficie celular, ya
que no poseen el residuo de cisteína sin aparear, necesario para homodimerizar (Riley & June
2005).
1.4.1 CD28 y CTLA-4
La glicoproteína CD28 de 44 kDa, se expresa constitutivamente en el 80% de la superficie de
células T humanas (en todas las células CD4 y aproximadamente en el 50% de las células
CD8) y en prácticamente el 100% de las células T murinas. CD28 y CTLA-4 se unen a los
mismos ligandos de la familia B7, comparten el motivo YxxM y el motivo MYPPPY en su región
citoplásmica (Peach et al. 1994, Rudd & Schneider 2003), este último motivo no está presente
en ICOS (Figura 6).
INTRODUCCIÓN
24
Los niveles de expresión de CD28 aumentan después de la activación de la célula T (June et
al. 1990b). En cambio, CTLA-4 no se expresa en células T en reposo, pero su expresión es
inducida luego de la activación de la célula T(Rudd & Schneider 2003).
Es probable que varias vías de señalización tengan un papel importante en el control de la
expresión de CTLA-4. Algunos estudios han comprobado que en células murinas T CD28-/-
no
se expresan cantidades significativas de CTLA-4 en la superficie celular y que la adición de IL-2
exógena aumenta la expresión de CTLA-4, lo que sugiere que CD28 regula la expresión de
CTLA-4 (Walunas et al. 1994). También se ha demostrado que las integrinas tienen un papel
importante en la regulación de la expresión de CTLA-4, ya que la adición de ligandos de
integrina como ICAM-1 o 1-VCAM produce un aumento en la expresión de CTLA-4 (Damle et
al. 1994).
En cuanto a la co-señalización mediada por CD28, es importante decir que el motivo YxxM de
la cola citoplasmática de CD28 permite la unión a proteínas de señalización intracelular como
PI3-cinasa y Grb-2; la fosforilación en tirosina de dicho motivo permite la unión a PI3-cinasa
(August & Dupont 1994) mientras que el residuo de asparagina permite la unión a Grb-2 y a
GADS (Watanabe et al. 2006). CD28 además se une a Itk, Tec y Lck ((Rudd & Schneider 2003,
Schneider et al. 1995) (Figura 6).
Como resultado de la unión de CD28 con su ligando, la tirosina del motivo YxxM es fosforilada,
posiblemente por las proteínas tirosina cinasa p56lck y p59fyn (Raab et al. 1995); este evento
induce la activación de PI3-cinasa, la cual fosforila lípidos que contienen inositol, generando
PIP2 y PIP3. Las numerosas intervenciones moleculares de esta enzima permiten la activación
eficiente de la vía Ras y de PLC-.
Finalmente se produce la activación de las proteínas cinasas activadas por mitógenos
(MAPKs), principalmente JNKs y ERKs, las cuales activan los factores de trascripción de la
familia AP-1, Jun y Fos. AP-1 forma parte del complejo de unión al elemento de respuesta al
CD28; AP-1, con NFAT y NF-B promueven la transcripción del gen de la IL-2. CD28 además
de incrementar la producción de IL-2 también incrementa la producción de IL-4, IL-5, IL-13,
IFN-, TNF- y GM-CSF. Dichas citocinas actúan como factores de crecimiento ejerciendo una
acción autocrina y paracrina.
CD28 previene la apoptosis y ayuda a mantener la supervivencia celular regulando
positivamente el gen BCL-XL (Boise et al. 2010). Además modula la diferenciación de los
linfocitos T hacia clones Th1/Th2. Ensayos “in vivo” e “in vitro” en los cuales se bloquea la
interacción B7/CD28 con la proteína de fusión hCTLA-4-Ig, muestran una desviación hacia la
producción de citocinas Th1, pues no se produce IL-4 (Seder et al. 1994).
A diferencia de CD28, CTLA-4 es un regulador negativo de la función de las células T; CTLA-4
regula la tolerancia periférica por diferentes mecanismos:
INTRODUCCIÓN
25
Primero, inhibe la activación de células T patogénicas por modulación de la señalización del
TCR, específicamente en la fosforilación de la cadena , compite con la molécula
coestimuladora CD28 por los ligandos B7.1 (CD80) y B7.2 (CD86) para inhibir su efecto
coestimulador. Además puede interactuar directamente con el complejo TCR-CD3 en la
sinapsis inmunológica para interrumpir la activación de célula T al unirse y bloquear el
immunoreceptor de tirosina basado en un motivo de activación (ITAM) (Harper et al. 1991).
Segundo, las células T reguladoras expresan constitutivamente CTLA-4 que se une a células
efectoras para alterar la transducción de señales y la posterior liberación de citocinas. La unión
de CTLA-4 con su ligando produce la liberación de TGF-β, lo cual ha sido propuesto como uno
de los mecanismos de acción de las T reguladoras.
Tercero, las cascadas de señalización de CTLA-4 afectan el patrón de expresión de citocinas.
También se ha propuesto otro mecanismo en el cual CTLA-4 podría usar el complejo LYP/Grb-
2 para inhibir la activación de las células T. Este complejo podría unirse con los dominios SH2 o
SH3 a CTLA-4 y así inhibir la activación de las células T (Thompson & Allison 1997).
Figura 6. Representación de los dominios citoplasmáticos de CD28, ICOS y CTLA-4.
El motivo YxxM presente en los tres receptores, una vez fosforilado en tirosina, permite la unión al
dominio SH2 de la subunidad reguladora p85 de PI3-cinasa. Este motivo en CD28 es YMNM, la
asparagina (N) permite además la unión al dominio SH2 de Grb-2 y posiblemente también a GADS. De
manera similar CTLA-4 tiene un motivo GVYVKM, que cuando no está fosforilado se une a los complejos
adaptadores tetraméricos AP1 y AP2. CD28, CTLA-4, pero no ICOS poseen motivos ricos en prolina.
CD28 tiene un motivo PRRP con el cual puede unirse a la cinasa ITK, y un motivo C-terminal PYAPP de
unión al dominio SH3 de Lck, Grb-2 o GADS (Figura obtenida de Rudds et al. Nature Reviews in
Immunology, 2003).
____________________________________________________________________________
INTRODUCCIÓN
26
1.4.2 ICOS
ICOS (Inducible Costimulator, CD278), es una molécula coestimuladora de la familia CD28,
relacionada estructuralmente con CD28 que fue descrita por primera vez en linfocitos T
activados. ICOS es una glicoproteína homodimérica de 50-65 kDa, formada por dos cadenas
polipéptidicas de tipo I unidas por puentes disulfuro (Redoglia et al. 1996), aunque existe una
fracción expresada de forma monomérica. La secuencia de ICOS humano consta de 199
aminoácidos y en ratón consta de 200 aminoácidos. ICOS humano presenta un 24% de
homología con CD28 y solo un 17% con CTLA-4 (Hutloff et al. 1999) (Beier et al. 2000). Sin
embargo, ICOS es incapaz de unirse a B7.1 y B7.2 y su ligando es la molécula: ICOS-L (B7h o
B7RP-1).
En ratón, ICOS posee un 19% de identidad con CD28 y un 72% de identidad con la secuencia
de ICOS humana (Mages et al. 2000). El gen de ICOS se encuentra localizado en el
cromosoma 2q33-34 humano y en el cromosoma 1 del ratón, próximo a los genes de CTLA-4 y
CD28 (Rojo et al. 2001).
1.4.2.1 Expresión y estructura de ICOS
ICOS se expresa típicamente en células T activadas, después de 4-6 horas de activación “in
vitro” con antígenos, mitógenos, anti-CD3, anti-TCR, ésteres de forbol con ionóforos de calcio,
entre otros. Alcanza su máximo de expresión los días 2-7 después de su activación (Rojo et al.
2001). La señal del TCR y citocinas como IL-2 e IL-4 en células T murinas, o IL-12 e IL-23 en
células T humanas puede aumentar aún más la expresión de ICOS (Wassink et al. 2004, Yagi
et al. 2003). Aunque la interacción B7/CD28 no es esencial para inducir la expresión de ICOS,
si puede promover un aumento en los niveles de ICOS (van Berkel et al. 2005, Villegas et al.
2002).
Aunque ICOS es una molécula inducible se puede encontrar en una fracción apreciable de las
células T de las placas de Peyer de ratón y las amígdalas humanas; y también se expresa de
manera estable en una baja proporción de linfocitos T de sangre periférica o de órganos
linfoides secundarios (bazo y ganglios linfáticos). ICOS no se expresa en células B, en
macrófagos ni en fibroblastos (Rojo et al. 2001). También se ha observado que, en condiciones
adecuadas, ICOS puede favorecer la diferenciación de linfocitos T con capacidad reguladora, el
mantenimiento de poblaciones de linfocitos T reguladores, o la capacidad T reguladora de la
pequeña población CD4+ ICOS
+ presente en los órganos linfoides secundarios, que tiene un
papel supresor en el desarrollo de Encefalomielitis Alérgica Experimental (EAE) (Mesturini et al.
2006, Rojo et al. 2008b).
ICOS es un marcador de diferentes funciones efectoras “in vivo”, ya que el patrón de expresión
de ICOS está relacionado con el patrón de expresión de citocinas; el análisis de la pequeña
población de células T CD4+ de ratón que expresan ICOS muestra que las células que
expresan niveles altos de ICOS producen principalmente IL-10; las células productoras de IL-4,
INTRODUCCIÓN
27
IL-5 e IL-13 presentan una expresión media de ICOS y las células productoras de IL-2, IL-3, IL-
6 e IFN- presentan una baja expresión de ICOS (Lohning et al. 2003).
El coestimulador inducible tiene una estructura similar a la de otros miembros de la familia
CD28 (Figura 7), formada por un péptido señal de 20 aminoácidos, un dominio de tipo Ig
variable con cuatro cisteínas conservadas (42, 63, 83, 109), un pequeño péptido conector que
incluye la cisteína 137, un dominio transmembrana (residuos 141 a 164 de ICOS humano) y un
dominio citoplasmático de 35 aminoácidos (Hutloff et al. 1999, Mages et al. 2000).
ICOS posee el motivo YxxM presente en CD28 y en CTLA-4, el cual media la asociación a la
subunidad reguladora de PI3-cinasa. A diferencia de CD28 y CTLA-4, el dominio extracelular
de ICOS carece del motivo MYPPPY necesario para la unión a B7.1 y B7.2. Además carece de
los dos motivos citoplasmáticos PxxP presentes en CD28 implicados en la unión a proteínas
con dominios SH3 como Grb-2 o Lck (Figura 6) (Hutloff et al. 1999, Peach et al. 1994,
Yoshinaga et al. 1999).
Figura 7. Alineación de la secuencia de ICOS y CD28.
Los residuos de aminoácidos idénticos se encuentran en color azul, los residuos de cisteínas en color
rojo, los residuos conservados se indican dentro de recuadros y los posibles sitios de N-glicosilación con
un asterisco. (Figura obtenida de Hutloff et al. Molecular Immunology, 1999).
____________________________________________________________________________
INTRODUCCIÓN
28
1.4.2.2 Señalización a través de ICOS.
La activación a través del TCR y una coestimulación adecuada inician una serie de eventos
moleculares en las cascadas de señalización que conducen a la transcripción de genes en el
núcleo. El coestímulo de ICOS genera un aumento en las señales mediadas por el complejo
TCR/CD3, como son la fosforilación en tirosina de la cadena del TCR, ZAP-70 y Vav (Feito et
al. 2003).
A pesar de las diferencias en las moléculas de asociación intracelular, ICOS y CD28 comparten
vías de señalización similares en células T periféricas. La fosforilación de ERK1/2, Akt, PDK1, y
p38 se produce después de la estimulación de CD28, así como después de la estimulación de
ICOS, posiblemente a través de la activación de PI3-cinasa (Arimura et al. 2002). Además,
ICOS mejora las cascadas de señalización esenciales para muchas funciones celulares
incluyendo la secreción de citocinas, principalmente la vía de la cinasa MAP Ras/Raf/MEK/ERK
y la vía JNK y p38 (Feito et al. 2003).
La cola citoplasmática de ICOS (21 aminoácidos) es más corta que la de CD28 (41
aminoácidos) y contiene dos residuos de tirosina de los cuales el residuo de tirosina 180 se
encuentra dentro del motivo YxxM (Y180MFM); como se ha dicho anteriormente la fosforilación
en el residuo de tirosina permite la unión a PI3-cinasa.
Se ha demostrado que ICOS co-precipita eficazmente con PI3-cinasa (Coyle et al. 2000, Feito
et al. 2003). La diferencia de aminoácidos entre ICOS y CD28 en la posición tres del motivo
YxxM está implicada en la falta de co-señalización de ICOS para inducir la secreción de IL-2
(Harada et al. 2003).
En comparación con CD28, ICOS es más eficiente en la activación de Akt a través de PI3-
cinasa (Arimura et al. 2002), por esto es posible que ICOS esté implicado en la prevención
eficiente de la apoptosis en las células que lo expresan.
1.4.2.3 Efecto de ICOS en la respuesta de las células T “in vitro”
CD28 es el principal activador de las células T “naive” aumentando su capacidad proliferativa
en respuesta a antígenos, la producción de IL-2 y la supervivencia celular. Estudios en células
T deficientes en CD28 demuestran una disminución en la proliferación en respuesta al antígeno
(Green et al. 1994, Noel et al. 1996).
Al igual que CD28, células T activadas con células presentadoras de antígenos deficientes en
ICOS-L tienen una reducción en la proliferación y la producción de IL-2, es decir, ICOS-L es
requerido para la activación, diferenciación y expresión de citocinas efectoras (Nurieva et al.
2003b).
Al igual, que en células murinas, las células T periféricas humanas pueden ser activadas “in
vitro” fácilmente y proliferar por señales mediadas por el TCR y por ICOS. El bloqueo de estas
INTRODUCCIÓN
29
señales resulta en una proliferación celular reducida; sin embargo el bloqueo de CD28 muestra
una mayor inhibición de la proliferación celular (Aicher et al. 2000).
Cuando la interacción ICOS-ICOS-L es bloqueada por ICOS-Ig, las células T CD4+ producen
más IFN- y menos IL-4 e IL-10. Esto demuestra que la coestimulación de ICOS es importante
en la activación de células T y en el desarrollo de las células Th2 (McAdam et al. 2000).
Además de la inducción de proliferación, ICOS también está implicado en la supervivencia de
las células T. Así, se ha observado una reducción en la muerte de células T estimuladas a
través del TCR y con ICOS (Riley et al. 2001).
En resumen, la inducción de la proliferación “in vitro”, la supervivencia celular y la
diferenciación son características compartidas por ICOS y por CD28. CD28 es crucial para la
producción de IL-2, mientras que ICOS es muy poco eficiente en la producción de IL-2 pero
muy eficiente en la producción de citocinas como IL-4 e IL-10.
1.4.2.4 Efecto de ICOS en la respuesta de las células T “in vivo”
Tanto ICOS como CD28 median la expansión de células T “in vitro”. También se ha
demostrado una disminución en la expansión de células T “in vivo” después del bloqueo de
ICOS en ratones CTLA-4-/-
(van Berkel et al. 2005). Además, la ligación de ICOS “in vivo”
induce la expansión de células T CD4+ en cuanto a número de células T y activación (Hutloff et
al. 1999, Yoshinaga et al. 1999). Tanto CD28 como ICOS desempeñan un papel en la
expansión de células T “in vivo”, que por consiguiente afecta la diferenciación y las funciones
efectoras de los linfocitos T CD4+.
ICOS y CD28 tienen un papel importante en la respuesta inmune de enfermedades
relacionadas con Th1 y Th2. Ratones deficientes en CD28 e ICOS presentan problemas con la
formación de centros germinales durante la infección con virus o bacterias. Los ratones que
son defectuosos para la vía B7/CD28 no forman centros germinales y no inducen niveles
significativos de IgG (Ferguson et al. 1996, Shahinian et al. 1993). Aunque se observan centros
germinales primarios en ratones ICOS-L-/-
o ICOS-/-
, estos son más pequeños y no se
desarrollan centros germinales secundarios grandes; esto va acompañado de una reducción en
el suero de anticuerpos de isotipo IgG1 e IgG2a (Dong et al. 2001).
Pacientes deficientes en ICOS padecen hipogammaglobulinemia severa y alteraciones en la
homeostasis celular B, que conduce a infecciones bacterianas recurrentes, siendo una de las
causas del síndrome de inmonudeficiencia común variable (Warnatz et al. 2006). Al parecer la
homeostasis de las células T no se ve afectada en estos pacientes, pero hay una disminución
en la producción de IL-10 que puede contribuir a una escasa formación de centros germinales.
Por lo tanto, ICOS juega un papel importante en la diferenciación de las células B, el cambio de
isotipo de las inmunoglobulinas, la formación de los centros germinales y el desarrollo de
células B de memoria. Así, ICOS tiene un papel crucial en la respuesta inmune humoral.
INTRODUCCIÓN
30
1.5 PAPEL DEL CITOESQUELETO EN LA ACTIVACIÓN DE LA CELULA T
Se ha descrito que CD28 actúa sobre dos aspectos muy importantes para la activación de los
linfocitos T por antígeno: La redistribución de los “rafts” lipídicos y la modificación del
citoesqueleto de actina. Estos efectos están poco estudiados en relación con ICOS, por lo que
uno de los objetivos de nuestro trabajo ha sido determinar su importancia en la coestimulación
por ICOS.
El citoesqueleto de actina está formado por microtúbulos y filamentos; está regulado por
proteínas de unión (ARPs) a actina globular (G-actina) o filamentosa (F-actina).
La red de filamentos puede unirse formando las fibras de estrés que determinan y mantienen la
estructura celular. Los filamentos participan en el movimiento celular proporcionando una
fuerza de locomoción que resulta de la polimerización de actina; por otro lado los
microfilamentos contribuyen al transporte intracelular. El sistema de microtúbulos regula la
secreción polarizada de moléculas efectoras y contribuye a la endocitosis del receptor así como
el mantenimiento de estructuras dependientes de F-actina.
Existen proteínas motoras de actina denominadas miosinas, con capacidad para desplazarse
por los microfilamentos, convirtiendo la energía química derivada de la hidrólisis de ATP en
movimiento mecánico. En la estructura de las miosinas se distingue el extremo N-terminal con
actividad ATPasa y su dominio de unión a la actina, la región central donde se localizan las
cadenas ligeras reguladoras y que en algunos casos tienen capacidad de unión a calmodulina,
y el extremo C-terminal muy variable que confiere a las distintas miosinas sus peculiaridades
funcionales (Baker & Titus 1998).
Varios procesos celulares como la adherencia, la formación de la sinapsis inmunológica y el
establecimiento de la polaridad celular, que son necesarios para iniciar y mantener la activación
de los linfocitos T; dependen del citoesqueleto de actina.
Como se ha comentado anteriormente, la activación a través del TCR genera una serie de
eventos de señalización que incluyen la fosforilación de tirosinas, la activación de PLC- y el
flujo del calcio, la activación de PKC, la activación de las vías de señalización SAK/JNK y
MAPK y la translocación al núcleo de factores de transcripción (Acuto & Cantrell 2000).
Del mismo modo, el TCR media procesos y cascadas de transducción de señales que
conducen a la reorganización del citoesqueleto, que es esencial para la propagación de las
diversas cascadas de activación de enzimas implicadas en la activación de la célula T. Estos
cambios en el citoesqueleto incluyen la polimerización de actina, reorganización dinámica de la
matriz de actina y la formación de lamelipodia y uropodos (Henning & Cleverley 1999).
Adicionalmente, las células T polarizan sus microtúbulos (MTOCs), la producción de citocinas y
los mediadores citotóxicos hacia las células presentadoras de antígeno (Lowin-Kropf et al.
1998). En sentido contrario, la dinámica del citoesqueleto de actina es importante para los
eventos de señalización de la célula T, porque existe una correlación entre la inducción de la
INTRODUCCIÓN
31
reorganización del citoesqueleto y la fosforilación en tirosina (Beemiller & Krummel 2010,
Tskvitaria-Fuller et al. 2003, Viola et al. 1999).
La activación del receptor de células T provoca la asociación de F-actina con la cadena del
TCR (Rozdzial et al. 1995). Las cadenas asociadas a este receptor, después de la activación
del TCR presentan diferentes patrones de fosforilación.
Varias moléculas involucradas en el citoesqueleto como ezrina, talina, vinculina, paxilina,
fibrina, la cinasa FAK, Pyk2 y la cadena ligera de miosina son fosforiladas gracias a la
activación del TCR (Billadeau et al. 2007, Krawczyk & Penninger 2001, Rudd 1999). También
se ha observado que tubulina interacciona con ZAP-70 y co-precipita con Vav (Huby et al.
1995).
La activación del receptor de antígeno en la célula T también conduce al reclutamiento de
moléculas de señalización y del complejo TCR/CD3 a las balsas lipídicas de la membrana
(Xavier et al. 1998). En presencia de señales coestimuladoras se induce la formación de la
sinapsis inmunológica (SI o SMAC), la cual es una estructura compleja formada en la región de
contacto entre la célula presentadora de antígeno y la célula T, en la que se estructuran de un
modo ordenado los receptores para antígeno, co-receptores, moléculas de adhesión,
moléculas de señalización intracelular y balsas lipídicas. La formación de SMAC, el
reclutamiento de receptores y balsas lipídicas depende de la organización del citoesqueleto de
actina y miosina (Grakoui et al. 1999, Krawczyk & Penninger 2001).
1.5.1 Microdominios de membrana
La compartimentalización de las membranas depende de la composición lipídica y del
contenido de proteínas capaces de organizar los lípidos. La combinación de proteínas y lípidos
dentro de las membranas hace posible la existencia de regiones submicroscópicas. De esta
forma se originan microdominios de membrana en los que se concentran, según su afinidad,
determinados tipos de lípidos y proteínas.
Las balsas lipídicas o “rafts” son dominios de membrana de pequeño tamaño (10-200 nm),
enriquecidos en esteroles y esfingolípidos, muy dinámicos y heterogéneos en su composición
proteica y cuya función es la de compartimentalizar las membranas para distintos procesos
celulares como el tráfico intracelular de membranas, la formación de uniones celulares o el
desarrollo de subdominios polarizados en la célula necesarios durante la migración, la
organogénesis y la angiogénesis (Billadeau et al. 2007, Krawczyk & Penninger 2001).
Los microdominios de membrana también llamados, GEMs (dominios de membrana
enriquecidos en glicolípidos) o DIGs (dominios enriquecidos en glicolípidos insolubles en
detergentes) forman grandes complejos no covalentes resistentes a la disociación por
INTRODUCCIÓN
32
detergentes no iónicos a 4ºC (Billadeau et al. 2007, Cinek & Horejsi 1992). Esta característica
ha permitido su aislamiento en gradientes de sacarosa.
En los linfocitos T, los microdominios de membrana están implicados en la activación de
inmunorreceptores. El co-receptor CD4, y cinasas de la familia Src, como Lck y Fyn, se
encuentran en estos microdominios incluso antes de los eventos de activación inducidos por el
TCR. Después de la activación celular, las formas fosforiladas de ZAP-70, PLC- y las cadenas
del TCR de 21 y 23 kDa, o del adaptador LAT (Linker of Activated T cells) se distribuyen en
microdominios de membrana (Montixi et al. 1998, Xavier et al. 1998).
El reclutamiento de proteínas a microdominios de membrana implica la palmitoilación o la
miristoilación de proteínas. De hecho, la segregación constitutiva de Lck y Fyn en las balsas
depende de la acilación N-terminal (Rodgers et al. 1994). Además, la segregación de LAT en
las balsas está acompañada por palmitoilación de la cisteína 26 pero no de la cisteína 29. Esta
palmitoilación de LAT en cisteína 26 es necesaria para su fosforilación en tirosina (Zhang et al.
1998b).
El reclutamiento del TCR a “rafts” lipídicos está estrechamente relacionado con las
modificaciones en el citoesqueleto de actina: El 30-40% de la cadena del TCR se localiza en
la fracción insoluble en células T en reposo, pero alrededor del 90% de estas cadenas se
asocian con la fracción insoluble, “rafts”, y/o filamentos de actina polimerizados después de la
activación del TCR (Caplan & Baniyash 1995, Caplan et al. 1995). El reclutamiento
dependiente de actina del complejo TCR/CD3 a las balsas lipídicas es una estrategia utilizada
por las células T para asegurar la organización molecular de proteínas de señalización que
concentran segundos mensajeros y proteínas adaptadoras y excluyen a los reguladores
negativos como CD45, conduciendo a una señalización eficaz del TCR y a la activación del
linfocito T (Beemiller & Krummel 2010, Meiri 2005, Rodgers et al. 1994).
1.5.2 La familia de Rho-GTPasas como reguladores del citoesqueleto
La familia de Rho GTPasas está compuesta por proteínas monoméricas con un tamaño
aproximado de 20 kDa, representadas en la especie humana por al menos 23 miembros, de las
cuales Rho, Rac, y Cdc42 son las mejor caracterizadas. Las Rho GTPasas regulan la dinámica
de actina y microtúbulos, la adhesión celular, la morfología celular así como la formación de
lamelipodios y filopodios, y por lo tanto cualquier proceso que requiera motilidad (Ridley 2001)
La mayoría de las Rho GTPasas se encuentran entre una conformación activa unida a
nucleótidos de guanosina trifosfato (GTP) o una conformación inactiva unida a guanosina
difosfato (GDP) (Etienne-Manneville & Hall 2002).
Existen tres tipos de proteínas que regulan la actividad de las Rho GTPasas: Los factores de
intercambio de nucleótidos de guanosina (GEFs, Guanosine Exchange Factors), que activan
las Rho GTPasas; las proteínas GAPs (GTPase Activating Protein), que activan la hidrólisis del
INTRODUCCIÓN
33
GTP, lo que conlleva a la inactivación de las Rho GTPasas; y por último, las proteínas
reguladoras GDI, que inhiben el intercambio de GDP por GTP, manteniendo a la GTPasa en
una conformación inactiva (Burridge & Wennerberg 2004, Reif & Cantrell 1998).
Se ha encontrado que Vav1 actúa como intermediario entre la estimulación del TCR y la
activación de las Rho GTPasas Rac1, Cdc-42 y RhoA, funcionando como una proteína GEF
(Bustelo 2001, Crespo et al. 1997).
Rac1 está implicada en la formación de lamelipodios, mientras que Cdc42 y Rho G estimulan la
extensión de filopodios. La activación de Rho A promueve la formación de fibras de estrés y el
ensamblaje/desensamblaje de las adhesiones focales (Nobes & Hall 1995). Las Rho GTPasas
actúan normalmente en la membrana plasmática, donde pueden anclarse debido a que están
modificadas postraduccionalmente por prenilación. En algunos tipos celulares se ha descrito
que Rac1 y Rho se localizan en balsas lipídicas y/o caveolas (Gingras et al. 1998, Michaely et
al. 1999).
Una vez activada, las GTPasas Rho interactúan con proteínas efectoras para generar una
respuesta celular (Figura 8).
Los principales efectores de Rac y Cdc42 promueven cambios en el citoesqueleto de actina. La
serina treonina cinasa p65PAK es comúnmente activada por Rac y Cdc42, juega un papel
importante en la regulación de la dinámica de actina y la adhesión celular durante la migración.
p65PAK regula las adhesiones focales, con la ayuda de PIX y GIT1 (Obermeier et al. 1998).
Además, p65PAK fosforila y activa a la cinasa LIM, que a su vez fosforila e inactiva a cofilina,
una proteína de unión a actina que despolimeriza el extremo negativo de los filamentos,
regulando su longitud.(Arber et al. 1998).
Los miembros de la familia WASP/SCAR/WAVE son reguladores de la polimerización de la
actina (Takenawa & Miki 2001). En su estado activado, cada una de estas proteínas es capaz
de estimular a Arp2/3, que puede iniciar la polimerización de actina (Weaver et al. 2003).
Cdc42 activa a WASP y N-WASP directamente (Rohatgi et al. 1999) mientras que, Rac activa a
la familia Scar/WAVE de manera indirecta (Eden et al. 2002).
INTRODUCCIÓN
34
Figura 8. Mecanismo de regulación de los filamentos de actina por las Rho GTPasa.
Rho promueve el ensamblaje actina:miosina en los filamentos a través de mDia y p160ROCK. Mientras
que Rac y Cdc42 regulan la polimerización de actina a través de la familia WASP/Scar/WAVE y la cinasa
p65PAK (Figura obtenida de Raftopoulou & Hall. Developmental Biology, 2004).
____________________________________________________________________________
Un efector de Rho que participa en el ensamblaje de los filamentos actina:miosina es la serina
treonina cinasa p160ROCK. Rho y p160ROCK son esenciales para la migración en leucocitos
(Alblas et al. 2001). En su estado activo, p160ROCK, al igual que p65PAK, puede fosforilar y
activar a LIMK, la cinasa encargada de fosforilar e inactivar a cofilina, estabilizando los
filamentos de actina. Además, p160ROCK interactúa y fosforila la cadena ligera de miosina
(MLC) y a la subunidad reguladora (MBS) de la fosfatasa de la cadena ligera de miosina. Esta
fosforilación disminuye la actividad de la fosfatasa de MLC (Kawano et al. 1999). Finalmente,
se incrementa la fosforilación de un residuo critico en MLC, lo cual induce un cambio
conformacional en la miosina aumentando su unión a los filamentos de actina y
subsecuentemente la formación de fibras de estrés (Raftopoulou & Hall 2004).
Además, Rho activa es capaz de reclutar a la formina mDia a sitios específicos de la membrana
produciendo un incremento local de profilina, lo que conduce a la polimerización de actina
(Raftopoulou & Hall 2004, Watanabe et al. 1999). También se ha demostrado que Rac-GTP
inhibe la función de Rho en muchos tipos celulares (Sander et al. 1999).
OBJETIVOS
OBJETIVOS
36
2 OBJETIVOS
Los receptores ICOS y CD28 son moléculas de señalización intracelular en linfocitos T que
presentan semejanzas estructurales y funcionales. CD28 posee el motivo YMNM en su región
citoplasmática, que tras su fosforilación se une e induce la activación de PI3-cinasa. ICOS
presenta un motivo similar YMFM adecuado para la unión a la subunidad reguladora p85 de
PI3-cinasa. Es por esto que nuestro objetivo principal es estudiar la coestimulación por ICOS
de la activación por TCR/CD3; particularmente para detectar posibles señales exclusivas de
ICOS y no de otras moléculas de la familia de CD28. Esto nos ha llevado a estudiar la
asociación de las subunidades catalíticas de PI3-cinasa de clase IA a ICOS, desarrollando los
siguientes objetivos:
1. Identificar las moléculas que se unen al dominio citoplasmático de ICOS de ratón por
medio de péptidos fosforilados en el motivo de tirosina YMFM.
2. Determinar la abundancia relativa de las subunidades de PI3-cinasa en
inmunoprecipitados con ICOS.
3. Conocer el efecto del silenciamiento (siARN) y de la inhibición de las subunidades
catalíticas de PI3-cinasa de clase IA en la estimulación y la coestimulación por ICOS de
señales tempranas y tardías de activación de linfocitos T, incluyendo fosforilación de
cinasas como Akt y ERK, o secreción de citocinas.
4. Estudiar el papel de las subunidades catalíticas de PI3-cinasa de clase IA en la
supervivencia de linfocitos T.
5. Analizar los cambios en el citoesqueleto de actina inducidos por ICOS, las proteínas
implicadas en dicho proceso y su relación con la localización de ICOS en las balsas
lipídicas.
MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES Y MÉTODOS
38
3 MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 MATERIALES
3.1.1 Animales de laboratorio
Se utilizaron ratones machos BALB/CByJ1co (H-2d) y C57BL/6J1co (H-2
k) de diez a catorce
semanas de edad, criados en el animalario del Centro de Investigaciones Biológicas.
3.1.2 Líneas celulares
SR.D10
Es una línea celular murina derivada espontáneamente en los cultivos del clon D10.G4.1 de
células T CD4+ de ratones AKR/J (Ojeda et al. 1995), específica para la conalbúmina de clara
de huevo de gallina en el contexto de antígenos de histocompatibilidad IAk (Kaye et al. 1983). El
clon D10.G4.1 deriva del clon TAKR.D10 y este último de la línea celular D10. Estas líneas
fueron proporcionadas por el Dr. C.A. Janeway (Yale University School of Medicine, New
Haven, Connecticut, USA).
H4-.A5
Es un mutante negativo (ICOS-) de la línea SR.D10, generado por irradiación y selección
negativa (Diez-Orejas et al. 1994).
COS-7
Fibroblastos procedentes de riñón de mono africano (Cercopithecus aethiops), utilizada
frecuentemente para expresar concentraciones elevadas de una proteína de forma transitoria.
Líneas productoras de interleucinas
Se ha utilizado la línea X63Ag8-653 transfectada con los plásmidos BMGNeomIL-4 o
BMGNeomIL-2 (Karasuyama & Melchers 1988) para la producción de IL-4 o IL-2 recombinante
de ratón en los sobrenadantes del cultivo. Esta línea fue proporcionada por los Drs. C.A.
Janeway y F. Melchers.
Hibridomas productores de anticuerpos monoclonales
Se utilizaron diferentes hibridomas para obtener anticuerpos monoclonales. Las líneas fueron
proporcionadas por el Dr. C. A. Janeway. Los anticuerpos se purificaron a partir del
sobrenadante de cultivo por precipitación con sulfato amónico y cromatografía en columnas de
MATERIALES Y MÉTODOS
39
proteínas A-sefarosa o proteína G-sefarosa. A continuación se resumen los anticuerpos
monoclonales producidos y sus características.
Anticuerpo Especie Isotipo Especificidad (Referencia)
YCD3-1 Rata IgG2b CD3 de raton (Portolés y col., 1989)
GK 1.5 Rata IgG2b CD4 de ratón (Dialynas y col., 1983)
M1/70 Rata IgG2a CD11b de ratón (Springer y col., 1979)
37.51 Hámster Sirio IgG2 CD28 de ratón (Springer y col., 1979)
Y-19 Rata IgG2c CD90 (Thy-1) de ratón (Jones & Janeway, 1981)
C398.4A Hámster Armenio IgG ICOS humano/ratón (Redoglia y col., 1996; Buonfiglio y col., 2000)
11B11 Rata IgG1 IL-4 de ratón (Ohara y Paul, 1985)YCD3-1 Rata IgG2b
GK 1.5 Rata IgG2b CD4 de ratón (Dialynas y col., 1983)
M1/70 Rata IgG2a CD11b de ratón (Springer y col., 1979)
37.51 Hamster Sirio IgG2 CD28 de ratón (Springer y col., 1979)
Y-19 Rata IgG2c CD90 (Thy-1) de ratón (Jones y Janeway, 1981)
C398.4A Hámster Armenio IgG CD278 (ICOS) humano/ratón (Redoglia y col., 1996; Buonfiglio y col., 2000)
11B11 Rata IgG1 IL-4 de ratón (Ohara y Paul, 1985)
3.1.3 Estirpes bacterianas
DH5
Se ha utilizado para la amplificación y mantenimiento de ADN plasmídico: F- endA1 glnV44 thi-
1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ (lacZYA-argF) U169, hsdR17 (rK- mK+),
λ–.
TOP 10
Se ha utilizado para clonación: F- mcrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 nupG
recA1 araD139 Δ (ara-leu) 7697 galE15 galK16 rpsL (StrR) endA1 λ-.
3.1.4 Anticuerpos policlonales
Suero normal de ratón y rata. Inmunoglobulinas de suero de ratón
Se utilizaron sueros completos e inmunoglobulinas purificadas por cromatografía en columnas
de proteína A-sefarosa.
Anticuerpo anti-ZAP-70
Suero de conejo generado por inmunización repetida con la proteína de fusión de GST y los
residuos 266-344 de ZAP 70 murina. Presenta reactividad cruzada frente a ZAP-70 humano
(Feito et al. 2003).
Anticuerpo anti-Lck
Suero de conejo generado por inmunización con la proteína de fusión de GST y los residuos
22-51 de Lck humana (Jimenez-Perianez et al. 2005).
MATERIALES Y MÉTODOS
40
Anticuerpo anti-ICOS
Suero de conejo generado por inmunización con la proteína de fusión GST y los residuos de
Thr18 a Ser132 de la región citoplasmática de ICOS de ratón (Acosta et al. 2011).
Anticuerpo anti-Vav
Suero de conejo generado por inmunización con la proteína de fusión de GST y los residuos
738-845 de onco-Vav1 murina (Acosta et al. 2011).
Anticuerpo anti-CD3
Suero de conejo generado por inmunización con la proteína de fusión GST unida al segmento
extracelular de CD3 de ratón (Jimenez-Perianez et al. 2005).
Anticuerpo anti-CD4
Suero de conejo inmunizado con el péptido con los residuos Gly50 a Gly63 de CD4 acoplado a
ovoalbúmina (Bello et al. 2007).
MATERIALES Y MÉTODOS
41
3.1.5 Otros anticuerpos
Especie Isotipo Especificidad (Referencia)
Conejo Policlonal Akt 1/2/3 (H-136, sc8312, Santa Cruz Biotechnology)
Ratón IgG1 B7H2 (1017B-7, R&D Systems)
Conejo Policlonal Erk 2 (C-14, sc154, Santa Cruz Biotechnology)
Cabra Policlonal Ig de conejo (A0545, Sigma)
Conejo Policlonal Ig de ratón (A9309, Sigma)
Cabra IgG IgG de ratón (A11004, Molecular probes)
Rata IgG1 IFN- de ratón, captura ELISA ( R4-6A2, BD Biosciences)
Rata IgG1 IFN- de ratón-Biotina, captura ELISA ( XMG1,4, Nuestro laboratorio)
Rata IgG2a IL-2 de ratón, captura ELISA (18161D, BD Pharmingen)
Rata IgG2b IL-2 de ratón-Biotina, detección ELISA (18172D, BD Pharmingen)
Rata IgG1 IL-4 de ratón, captura ELISA (11B11, Nuestro laboratorio)
Rata IgG1 IL-4 de ratón-Biotina, detección ELISA (BVD6-24G2, 554390, BD Biosciences)
Rata IgG1 IL-10 de ratón, captura ELISA (JES5–2A5, 551215, BD Pharmingen)
Rata IgG2b IL-10 de ratón-Biotina, detección ELISA (JES5–16E3, 554465, BD Pharmingen)
Conejo Policlonal p38 (H-147, sc7149, Santa Cruz Biotechnology)
Cabra Policlonal p55 (N-13, sc48644, Santa Cruz Biotechnology)
Conejo Policlonal p85 (06195, Upstate Biotechnology)
Conejo Policlonal p110 (H-201,sc7174, Santa Cruz Biotechnology)
Ratón IgG1 p110 (611398, BD Biosciences)
Conejo IgG p110 (C73F8, 4249, Cell Signaling Technology)
Conejo Policlonal p110 (S-19, sc602, Santa Cruz Biotechnology)
Conejo Policlonal p110 (H-219, sc7176, Santa Cruz Biotechnology)
Conejo Policlonal p-Akt-Ser473 (9271, Cell Signaling Technology)
Conejo Monoclonal p-Akt-Thr308 (244F9, 4056S, Cell Signaling Technology)
Conejo Policlonal p-Thr-p-TyrErk (V6671, Promega)
Conejo Policlonal p-Thr-p-Tyr p38 (9211S, N.E.Biolabs)
Ratón IgG2b p-Tyr (558008, BD Biosciences)
Ratón IgG2b V5 (R96025, Invitrogen)
Ratón IgG1 Vinculina (V9131, Sigma)
3.1.6 Medios de cultivo
Medio Click
Se empleó para cultivo de hibridomas, COS-7 y linfocitos T CD4+. La base es el medio DMEM
(Eagle modificado por Dulbecco, Gibco) suplementado con: Suero fetal bovino inactivado al
10%, aminoácidos esenciales MEM 50x a 1,5x final (Gibco), aminoácidos no esenciales MEM
100x a 3x final (Gibco), 1 ml/100 ml de precursores de ácidos nucleicos 100x (adenosina,
citosina, guanosina, uridina) a 0,1 mg/ml final de cada uno de los precursores diluidos en agua
(Peck & Bach 1973), vitaminas MEM 100x a 1x final (Gibco), piruvato sódico 100 mM a 2,5 mM
final (Gibco), L-glutamina 200 mM a 2 mM final (Gibco), HBSS 10x (solución compensada de
sales de Hank) a 0,15x final (Gibco) para compensar el aumento de volumen de los aditivos, 2-
mercaptoetanol 0,1 M en agua a 40 M final, gentamicina a 40 g/ml final (Gibco) y ajustando
el pH (7,0-7,4) con NaOH (Peck & Bach 1973).
MATERIALES Y MÉTODOS
42
Medio con Interleucinas
Para el cultivo de la línea SR.D10 se utilizó el medio Click, suplementado adicionalmente con:
IL-1 de ratón (25 pg/ml, Peprotech), IL-2 de ratón (10 U/ml) e IL-4 de ratón (20 U/ml).
Medio LB
Para el cultivo de bacterias: Bactotripsina 10 g/L, extracto de levadura 5 g/L y NaCl 85 mM; pH
7,5. Para la preparación de LB sólido se le añadió agar al 1,5% (p/v).
Medio SOB completo
Bactotripsina 20 g/L, extracto de levadura 5 g/L, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM y MgCl2 10 mM.
Medio SOC
Medio SOB completo más glucosa al 0,37%.
3.1.7 Vectores
pEGFP-C2-RhoA, pEGFP-C2-Rac1, pEGFP-C2-Cdc42
GFP fusionado a las formas inactivas o dominantes negativos de las GTPasas (N19-RhoA,
N17-Rac-1 y N17-Cdc42). Las GTPasas codificadas presentan mutaciones puntuales que
alteran la tasa de intercambio GDP/GTP dando lugar a la proteína permanente inactiva (unida a
GDP) (Coso et al. 1995). Estas construcciones fueron proporcionadas por el Dr. J. Teixidó
(Centro de Investigaciones Biológicas, Madrid).
pEGFP-C2-Vav
Un fragmento de 1000 pb fue liberado de pKES18 (ADNc del extremo 3´de Vav) y ligado a
pEFGP-C2. Este vector codifica para la proteína GFP fusionado al dominio SH3-SH2-SH3 de
Vav (Zugaza et al. 2002). Esta construcción truncada fue proporcionada por el Dr. X. Bustelo
(Instituto de Biología Molecular y Celular del Cáncer, Salamanca).
pcDNA 3.1/V5-His Topo
Este vector lleva unido covalentemente una topoisomerasa (vector activado) que estabiliza el
complejo y, gracias a su actividad ligasa, puede insertar directamente el producto de la PCR.
Además, la zona en la que el plásmido aparece abierto contiene residuos T que son
complementarios a la adenina que añade la polimerasa en el extremo 3´ del producto de PCR.
De forma que la reacción de ligación se produce por apareamiento A-T, el inserto se une con
igual probabilidad en las dos orientaciones. El vector forma parte del kit de clonación pcDNA
3.1/V5-His TOPO TA (Invitrogen).
MATERIALES Y MÉTODOS
43
3.1.8 ARN de Interferencia o silenciamiento (siARN)
Se emplearon los siguientes ARN interferentes (20 nucleótidos, Ambion, Applied Biosystems)
específicos para la secuencia del ARNm de las subunidades catalíticas de PI3-cinasa p110 y
p110 de ratón:
PIKca: “Silencer® Select siRNA s71604”, 1 M
Secuencia sentido: GACACUACUGCGUAACUAUtt
Secuencia antisentido: AUAGUUACGCAGUAGUGUctg
PIKcd: “Silencer® Select siRNA s71605”, 2 M
Secuencia sentido: GGAUGAAGCUGGUUGUUCtt
Secuencia antisentido: UGAACAACCAGCUUCAUCCgc
Control negativo: “Silencer® Select Negative Control #1
3.1.9 Péptidos
Los péptidos usados fueron sintetizados por el Servicio de Química de Proteínas del Centro de
Investigaciones Biológicas. Los péptidos sintetizados corresponden a la cola citoplasmática de
ICOS y CD28 de ratón (fosforilados (pY) o no fosforilados (Y) en el residuo de tirosina del
motivo YxxM), según se indica a continuación. La secuencia de estos péptidos biotinilados es:
ICOS: GSSVHDPNSE Y181MFMAAVNTNKKSRLAGVT-Biotina
ICOSpTir: GSSVHDPNSEpY181MFMAAVNTNKKSRLAGVT-Biotina
sICOSpTir: VHDPNSEpY181MFMAAVNTNK-Biotina
CD28pTir: RLLQSDpY189MNMTPRRPGLTRKPYQPYAPAR-Biotina
3.1.10 Tampones
Tampones para manejo de células
PBS: Solución salina con tampón fosfato: NaCl (0,13 M), KCl (2,7 mM), HPO4Na2 (8 M) y
HPO4K (1,4 mM); en agua destilada; pH 7,2.
PBS/Hepes/Glucosa/Ca2+/
Mg2+
: Hepes (10 mM, pH 7,2), SO4Mg (1 mM), Cl2Ca (1 mM),
Glucosa (50 mM) y Rojo fenol en PBS.
PBS-EDTA para selección magnética: PBS pH 7,2, EDTA (2 mM), BSA (0,5%).
Tampones para transfección
Tampón CaCl2: CaCL2 (2,5 M, Sigma) en agua destilada.
Tampón HBS 2x: Hepes (50 mM), NaCl (280 mM), Na2HPO4 (1,5 mM); en agua destilada; pH
7,05 ajustado con NaOH 5 N.
MATERIALES Y MÉTODOS
44
Tampones para activación de células con pervanadato
Tampón pervanadato: Na3VO4 (5 mM) en medio Click; pH 7 ajustado con HCL (1 N), H2O2 (1
M) y reposo durante 20 min.
PBS/EDTA/OV: PBS, EDTA (0,5 mM) y Na3VO4 (1 mM).
Tampones para ELISA de citocinas
Tampón de bloqueo: PBS, FCS (10%).
Tampón de lavado: PBS, Tween 20 (0,05%).
Tampones para lisis celular e inmunoprecipitación
Tampón de lisis Tritón: Tris/HCl (50 mM), NaCl (300 mM), Tritón X-100 (1%, Sigma); pH 7,6.
Tampón de lisis CHAPS: Tris/HCl (50 mM), NaCl (300 mM), CHAPS (10 mM, Pierce); pH 7,6.
En los dos tampones se añadieron inhibidores de proteasas como: PMSF (1 mM), Aprotinina
(10 g/ml), Leupeptina (10 g/ml). Se añadió también MgCl2 (1 mM), EGTA (1 mM) y Na3VO4
(1 mM) como inhibidor de fosfatasas.
Tampón de lavado Tritón: Tris/HCl (50 mM), NaCl (300 mM), Tritón X-100 (0,1%, Sigma); pH
7,6.
Tampón de lavado CHAPS: Tris/HCl (50 mM), NaCl (300 mM), CHAPS (2 mM, Pierce); pH 7,6.
Tampones para electroforesis en gel de poliacrilamida e “inmunoblot”
Tampón gel inferior: Tris base (1,5 mM), SDS (0,4%); en agua destilada; pH 8,8.
Tampón gel superior: Tris base (0,5 M), SDS (0,4%); en agua destilada; pH 6,8.
Tampón para electrodos: Tris base (0,025 M), Glicina (0,192 M), SDS (1%); en agua destilada;
pH 8,3.
Tampón de muestra: Tris base (62,5 mM), Glicerol (10%), SDS (2,3%), 2-mercaptoetanol (5%)
y trazas de azul de bromofenol (0,05%); en condiciones reductoras pH 7,6.
Tampón de transferencia: CAPS (10 mM, Sigma) en agua; pH 11.
Tampón de lavado TBST: Tris/HCl (20 mM, pH 7,6), NaCl (150 mM) y Tween 20 (0,05%).
Tampón de lavado PBST: PBS, Tween 20 (1%).
Tampón de “stripping”: Tris/HCl (62,5 mM), SDS (70 mM), 2-mercaptoetanol (0,68%); pH 6,7.
Tampón de bloqueo PBSTL/TBSTL: PBST mas Leche desnatada (3%) o TBST mas Leche
desnatada (2%) y Gelatina tipo A (Sigma, G-6144) (0,5%).
Tampón anticuerpo primario: PBST o TBST con Gelatina (0,2%) y Azida sódica (0,1%)
Tampones para manejo de ADN
Tampón TAE 1x: Tris-acetato (40 mM), EDTA (2 mM); en agua destilada; pH 8,0.
Bromuro de Etidio: 0,5 mg/ml en Tampón TAE.
MATERIALES Y MÉTODOS
45
Tampón para tinción de actina y vinculina
Tampón de fijación: p-formaldehído 4% en Na2HPO4 (0,05 M), NaH2PO4 (0,05 M) en agua
destilada, disuelto por agitación a 60-70ºC; pH 7,0.
Tampón de permeabilización: PBS, Saponina (0,1%)
Tampón de bloqueo: PBS/ BSA (1%)
Tampón anticuerpos: PBS/BSA (4%)
Tampón para aislamiento de balsas lipídicas:
Tampón MBS: MES 25 mM, NaCl 150 mM, pH 6,5.
Tampón de lisis: MES 25 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Tritón X-100 0,5%, PMSF 1 mM,
Aprotinina 10 g/ml, Na3VO4 1 mM, pH 6,5.
3.1.11 Otros reactivos y productos
Se emplearon inhibidores específicos de distintas subunidades catalíticas de PI3-cinasa
incluyendo p110 (inhibidor IV (PI-103), inhibidor VIII (PIK-75)), p110 (inhibidor VI (TGX-221))
y p110 (inhibidor II); todos ellos de Calbiochem. El inhibidor de p110 (A66) fue suministrado
por Sellech Chemicals. El inhibidor de p110 (IC87114) fue proporcionado por Symansis Pty
(Nueva Zelanda). El inhibidor general de PI3-cinasa (LY294002) fue obtenido de Sigma.
Los inhibidores de Akt (Inhibidor IV e Inhibidor V (Triciribine)), el inhibidor de Lck (inhibidor II),
el inhibidor de calmodulina (W-7), el inhibidor de la cinasa de Rho (H-1152), el inhibidor de la
activación de NF-B (IKK inhibitor, Wedelolactone) y la citocalasina D fueron suministrados por
Calbiochem. El inhibidor de la actividad ATPasa de miosina (Blebbistatina), el inhibidor de
MLCK (ML-7), el inhibidor de caspasas (Z-VAD-fmk), el inhibidor de autofagia (3-MA) y el
inhibidor de la GTPasa dinamina (Dynasore) fueron suministrados por Sigma.
También se emplearon estreptavidina-sefarosa, proteína A acoplada a HRPO, faloidina-FITC y
toxina del cólera acoplada con fluoresceína (CBT-FITC) de Sigma. La proteína A-sefarosa y G-
sefarosa se obtuvo de GE Healthcare, y la IL-7 de Peprotech.
3.2 MÉTODOS
3.2.1 Aislamiento de linfocitos T CD4+ de ratón
Los bazos de ratones C57BL/6 fueron extraídos en condiciones de esterilidad y triturados
mediante presión suave con un émbolo de jeringa sobre una rejilla de acero, en una placa de
Petri con medio de cultivo. Los eritrocitos presentes fueron lisados por choque hipotónico con
agua, añadiendo inmediatamente un volumen de PBS 10x por cada 9 volúmenes de agua
añadidos. Después de lavar las células tres veces con medio, la suspensión se pasó por filtro
estéril de nylon (30 m) y se recontaron las células.
MATERIALES Y MÉTODOS
46
Tras resuspender las células en PBS-EDTA para selección magnética, el proceso de selección
de linfocitos T CD4+ se realizó por selección negativa (CD4
+ T Cell Isolation Kit II, 130-095-248,
Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células T no-CD4+, T-
CD8+, T/, células B, NK, células dendríticas, monocitos y eritrocitos, fueron indirectamente
marcados con un cocktail de anticuerpos monoclonales conjugados con biotina (contra CD8,
CD14, CD16, CD19, CD36, CD56, CD123, TCR/ y glicoporina A), utilizado como reactivo
primario y microbeads conjugadas con anticuerpos anti-biotina como reactivo secundario. Las
células T CD4- y no T quedaron retenidas en la columna magnética del separador, mientras las
células T CD4+ no marcadas pasaron a su través.
El rendimiento de células T CD4+ obtenido del bazo fue del 15-20% del total de células
iniciales.
3.2.2 Aislamiento de linfocitos T CD4+ Naive de ratón
Una vez preparada la suspensión de células del bazo de ratones C57BL/6, como se indicó
arriba, se realizó el proceso de selección magnética de linfocitos T CD4+ Naive con el kit “CD4
+
CD62L+ T Cell Isolation Kit II” (130-093-227, Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones
del fabricante. El proceso se realiza en dos etapas, la primera consiste en el aislamiento de
linfocitos T CD4+ por selección negativa como se describió anteriormente, y la segunda etapa
consiste en el aislamiento por selección positiva de la fracción de células T CD4+ CD62L
+ por
marcaje directo con microesferas anti-CD62L (L-selectina). El rendimiento de células T CD4+
CD62L+ obtenido del bazo fue del 60% del total de CD4
+.
3.2.3 Obtención de blastos a partir de linfocitos T CD4+
Los linfocitos T CD4+ purificados (10
6 células/ml) de ratones BALB/c se activan en medio con
concanavalina A (2,5 g/ml, Sigma) e IL-2 (10 U/ml), en presencia de células de bazo
singeneicas (5 x 105 células/ml) de las que se eliminan previamente las células T mediante
incubación con anticuerpos anti-CD90 (30 min a 4ºC), lavado y resuspensión en complemento
de conejo (suero de conejo joven, 15% final, 1 ml/bazo) y posteriormente en mitomicina C (40
g/ml final, Sigma) con incubación por 30 minutos a 37ºC, lavado y filtrado por nylon de 30 m.
Tras 48 horas de cultivo en estufa a 37ºC, 5% CO2, las células activadas se lavaron, se
resuspendieron en medio y se centrifugaron sobre Percoll (GE Healthcare) al 50%; los blastos
de la interfaz de Percoll (0-50%) se lavaron nuevamente y se expandieron por 48 horas más
(0,4 x 106 células/ml) en medio con IL-2 (20 U/ml). Transcurrido este periodo se midió la pureza
por citometría de flujo (≥ 90% de CD4+ y ≥ 80% de ICOS
+).
MATERIALES Y MÉTODOS
47
3.2.4 Activación celular por anticuerpos adsorbidos a esferas de poliestireno
Se incubaron esferas de poliestireno de 4,5 m de diámetro (Polibead® Polystyrene
microspheres, Polysciences Europe GmbH, Eppelheim, Germany) con anticuerpos (anti-CD3,
anti-ICOS, anti-CD3 mas anti-ICOS o un control sin anticuerpo). Para la activación de células
SR.D10 se utilizaron anticuerpos anti-CD3 a 0,5 g/ml, anti-ICOS a 5 g/ml y para la activación
de blastos se utilizaron anticuerpos anti-CD3 a 10 g/ml y anti-ICOS a 20 g/ml, durante toda la
noche en agitación constante y a 4ºC. Tras la incubación las esferas se lavaron dos veces con
medio de cultivo. Las células se resuspendieron en este medio con esferas en una relación 1:1.
Inmediatamente se incubaron en baño a 37ºC. Pasados 10 minutos de incubación, o el tiempo
indicado, se detuvo la activación con PBS/EDTA/OV muy frío. Finalmente las células se
centrifugaron y se lisaron para análisis por “inmunoblot”.
En su caso, se realizó la activación en presencia de distintos inhibidores farmacológicos con el
fin de analizar las señales tempranas de activación (p-Akt, p-Erk) por “inmunoblot”, o con
células nucleofectadas con siARN (ver apartado 3.2.7), o bien las células fueron activadas
durante 4 horas con el fin de analizar la producción de interleucinas en los sobrenadantes.
3.2.5 Activación celular por anticuerpos adsorbidos a placas de cultivo
El anticuerpo disuelto (anti-CD3) a una concentración adecuada en PBS (10 g/ml), se añadió
a una placa de cultivo de 24 pocillos fondo plano (Costar, 3524) en un volumen de 500 l. La
placa se incubó toda la noche a 4ºC, a continuación se lavo con PBS y se añadieron las células
a una concentración final de 2 x 106 células/ml en un volumen final de 1 ml de medio de cultivo.
La activación en algunos casos se realizó en presencia de inhibidores farmacológicos.
En los casos en los que se utilizó anti-CD28, éste se añadió en forma soluble a una
concentración final de 2,5 g/ml. Las células se incubaron a 37ºC, 5% CO2 y 95% de humedad
durante 72 horas, transcurrido este tiempo, se estudió la proliferación celular, y con los
sobrenadantes del cultivo se determinó la concentración de citocinas.
3.2.6 Medida de proliferación celular
Se utilizó el método colorimétrico descrito por Mosmann en 1983 (Mosmann, 1983). A 100 l de
cultivo se le añadieron 20 l de MTT (Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) 2,5-difeniltetrazolio;
Sigma, M-2128) a 0,4 mg/ml final en PBS. El anillo tetrazólico se rompe por enzimas
mitocondriales generando precipitados azul oscuro de formazán, que son disueltos por adición
de una solución de isopropanol conteniendo HCl 0,04 N (100 l/pocillo). Esta reacción se
produce solo en células vivas (2-4 horas a 37ºC) y se puede cuantificar midiendo la
absorbancia a 540 nm en un espectrofotómetro (Labsystems iEMS Reader MF).
MATERIALES Y MÉTODOS
48
3.2.7 Silenciamiento con siARN
Las células SR.D10 se resuspendieron (5 x 106 células/100 l) en la solución de nucleofección
recién preparada (Amaxa® Cell Line Nucleofector
® Kit V, VCA-1003, Lonza). Se añadieron los
siARN para las subunidades catalíticas de PI3-cinasa (siARN p110, ID: s71604, 1 M; siARN
p110, ID: s71605, 2 M; siARN control negativo 1-2 M) y se colocó la mezcla en una cubeta
de nucleofección siguiendo el protocolo del fabricante. Tras la nucleofección en el Nucleofector
Amaxa (programa T-20), se recogieron las células cuidadosamente y se diluyeron (3,3 x 106
células/ml) en medio Click con interleucinas precalentado a 37ºC y se distribuyeron en placas
de cultivo (24 pocillos, BD Falcon) para su incubación a 37ºC y 5% CO2.
Pasadas 40 horas de la nucleofección, las células fueron lavadas, pasadas por un filtro de 30
m para eliminar agregados, recontadas y activadas con esferas de poliestireno recubiertas de
anticuerpo.
Linfocitos T CD4+ CD62L
+ “naive” (6 x 10
6 células/100 l) fueron nucleofectados con el kit
(Amaxa mouse T Cell Nucleofector
TM Kit, VPA-1006, Lonza) y los siARN para las subunidades
catalíticas de PI3-cinasa (siARN p110, ID: s71604, 2 M; siARN p110, ID: s71605, 2 M;
siARN control negativo 2 M). La nucleofección se realizó con el Nucleofector Amaxa y el
programa X-01.
3.2.8 Transfección de COS-7 con fosfato cálcico
Este método se basa en la introducción de un coprecipitado de fosfato cálcico y DNA exógeno
en la célula. Este precipitado se forma al mezclar dos soluciones, una salina que contiene
cloruro cálcico y otra que contiene el fosfato. El ADN presente queda incorporado en los
cristales del precipitado formado, adhiriéndose a la superficie de las células y entrando en ellas
por endocitosis. Las células COS-7 se sembraron el día antes teniendo en cuenta que
alcanzaran una confluencia entre el 20-40% en el momento de transfección. El medio Click se
cambió 4 horas antes de la transfección de manera que estuviera fresco. Se preparó una
mezcla ADN/CaCl2 de 500 l: 450 l con el ADN a transfectar (pcDNA3.1/V5-His/TOPO/p110
o pcDNA3.1/V5-His/TOPO/p110, 40 g, ver apartado 3.2.24), mas 50 l de CaCl2 (250 mM). A
continuación se añadió la mezcla de ADN/CaCl2 sobre un volumen (500 l) de HBS 2x. Se
incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente, para que se formara el precitado de fosfato
cálcico/ADN. La solución anterior se añadió gota a gota sobre las células mientras que se
agitaba la placa. Transcurridas 4 horas de incubación de las células con el precipitado, se
realizó un choque con glicerol al 10% en medio Click (2 ml/placa) durante 3 minutos, después
se lavaron las células 3 veces con PBS y se les añadió medio Click fresco. Al cabo de 48 horas
de incubación, las células fueron tripsinizadas, lisadas y los lisados empleados en ensayos de
inmunoprecipitación con anticuerpos (p.e. anti-p85 PI3-K, anti-V5) para su análisis posterior por
“inmunoblot”.
MATERIALES Y MÉTODOS
49
3.2.9 Adhesión, elongación celular y tinción de F-Actina
Se colocaron cubreobjetos de vidrio de 10 mm de diámetro en placas de cultivo de 24 pocillos,
los cuales se incubaron durante toda la noche y a 4ºC con 0,3 ml de anticuerpo anti-ICOS o
poli-L-lisina (10 g/ml en PBS). Tras lavar los cristales con PBS, se añadieron las células
(250.000-300.000/muestra) en 0,5 ml de PBS/Hepes/Glucosa/Ca2+/
Mg2+
, pH 7,2 (en
presencia o
ausencia de inhibidores). Después de unos segundos de centrifugación se incubaron las
células a 37ºC durante 40 minutos o por el tiempo indicado, se lavaron las células con PBS
fijándolas a continuación 5 minutos con paraformaldehído al 4% precalentado a 37ºC y lavando
de nuevo con PBS. Para determinar la presencia y distribución de la actina polimerizada, las
células fijadas se permeabilizaron primero durante 5 minutos con PBS/Saponina 0,1%. A
continuación, las células fueron teñidas por 30 minutos con faloidina-FITC o faloidina-Texas
Red (50 nM). Finalmente se lavaron las células con PBS/Saponina 0,1% y se montaron con
Vectashield (Vector Laboratories) sobre un portaobjetos. Se tomaron imágenes celulares con
un microscopio Axioplan universal (Carl Zeiss, Jena, Germany) usando un objetivo de 40x y
una cámara digital Leica DFC 350 FX. Las imágenes fueron analizadas usando Adobe
PhotoShop 6.0 (Adobe). La cuantificación de la elongación y de la superficie de contacto (área
celular) se realizó con el software Image J 1.38x (National Institutes of Health). El índice de
elongación celular se midió para cada célula determinando la razón entre el valor de la longitud
máxima de la célula y el segmento mayor perpendicular al primero. Una célula no elongada,
con forma regular, tiene un índice de elongación de 1, éste valor se incrementa en las células
elongadas.
En células que expresan dominantes negativos de GTPasas y de Vav
Células SR. D10 (5 x 106 células/100 l) fueron nucleofectadas (Amaxa
® Cell Line
Nucleofector®
Kit V, VCA-1003, Lonza) usando el programa X-01 y con 5 g de plásmidos
control (pEGFP-C2), o de plásmidos codificando formas dominantes negativas de las GTPasas
RhoA (pEGFP-C2-RhoA (N19)), Rac1 (pEGFP-C2-Rac1 (N17)) y Cdc42 (pEGFP-C2-Cdc42
(N17)) o de Vav (pEGFP-C2-Vav (SH3-SH2-SH3)). Las células fueron incubadas en medio Click
con interleucinas durante 24 horas a 37ºC y 5% CO2. Una vez se comprobó la eficiencia de la
nucleofección por análisis de expresión de GFP en el citómetro, las células fueron incubadas
sobre cristales recubiertos con anti-ICOS, fijadas y analizadas al microscopio para determinar
la elongación tamaño celular y distribución de la actina como se ha descrito previamente.
3.2.10 Tinción de vinculina
Una vez adheridas las células a los cubreobjetos y teñidas con faloidina-FITC se realizaron dos
lavados con PBS y se bloquearon los cristales con PBS/BSA (1%) durante 1 hora a
temperatura ambiente. Después de bloquear se incubaron las células durante 1 hora y a
temperatura ambiente con 0,3 ml de anticuerpo anti-vinculina (1/400; anticuerpo primario)
MATERIALES Y MÉTODOS
50
diluido en PBS/BSA (4%). Tras la incubación se realizaron 2 lavados y se incubaron las células
durante 20 minutos y a 4ºC con anticuerpo secundario anti-IgG de ratón (anti-IgG Alexa Fluor
568, 1/1200) diluido en PBS/BSA (4%); finalmente se lavaron las células 3 veces con PBS y se
montaron con Vectashield (Vector Laboratories) sobre un portaobjetos. Se tomaron imágenes
celulares con el microscopio confocal ultraespectral Leica TCS-SP2-AOBS-UV, usando el
objetivo de 63x a intervalos de 1 m. Se realizaron controles para eliminar la señal de fondo. El
uso de cada fluororomo por separado permitió comprobar la ausencia de cruce de señales
entre los canales.
3.2.11 Detección de balsas lipídicas por fluorescencia
Para la visualización de balsas lipídicas o la polimerización de actina, las células fueron
estimuladas con microesferas de poliestireno (descrito anteriormente), o con el anticuerpo
adsorbido a cubreobjetos. Las esferas (20-40 x 106/ml en PBS) fueron incubadas con
anticuerpos (mAb anti-CD3, YCD3-1, 2 g/ml o M1/70, 2 g/ml como control negativo más el
anticuerpo anti-ICOS C398.4A o el anticuerpo control a 10 g/ml) durante toda la noche a 4°C.
Tras la incubación fueron lavadas con PBS y mezcladas con células T (proporción 1:1
célula:esfera, 108 células/ml), durante 20 minutos a 37ºC. Las células estimuladas fueron
colocadas sobre cristales recubiertos con poli-L-Lisina (10 g/ml en PBS, toda la noche, 4ºC).
Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, se realizaron dos lavados con
PBS, y se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 5 minutos a 37°C. Para detectar el
gangliósido GM-1, un marcador de balsas lipídicas, se tiñeron las células con la subunidad B
de la toxina colérica conjugada con fluoresceína (CTB-FITC, 5 g/ml en PBS/0,1% Suero fetal
Bovino) durante 30 minutos a 4ºC. Tras esta incubación las células fueron lavadas nuevamente
dos veces con PBS y montadas sobre portaobjetos con Vectashield. Para la tinción de F-Actina
se realizó el método descrito anteriormente.
En algunos ensayos, las células SR.D10 se incubaron con esferas recubiertas de anti-ICOS o
de Poli-L-Lisina (10 g/ml) a una proporción célula:esfera de 1:4 (108 células/ml), durante 5
minutos en hielo. Después las células (0,25-0,3 x 106 células) resuspendidas en 0,5 ml de
PBS/Hepes/Glucosa/Ca2+/
Mg2+
, fueron colocadas en placas de 24 pocillos con cubreobjetos
recubiertos con poli-L-Lisina (10 g/ml, toda la noche, 4ºC). Después de unos segundos de
centrifugación se incubaron las células durante 30 minutos a 37ºC, se lavaron, se fijaron y se
tiñeron como se describió anteriormente.
El análisis se realizó por microscopia confocal con el microscopio confocal ultraespectral Leica
TCS-SP2-AOBS-UV, usando el objetivo de 63x a intervalos 0,5 m. Las señales de sondas
diferentes fueron tomadas en paralelo. Cien células fueron analizadas para cada condición. El
procesamiento de imágenes fue realizado con Adobe Photoshop (Adobe Systems, Mountain
MATERIALES Y MÉTODOS
51
View, CA). Algunas imágenes fueron analizadas con el microscopio Axioplan Universal (Carl
Zeiss, Jena, Germany) usando el objetivo de 40x y la cámara digital Leica DFC 350 FX.
3.2.12 Muerte celular
Se analizó en células SR.D10 así como en linfocitos T CD4+. Las células una vez aisladas y
lavadas con medio Click, se colocaron (106
células/ml) en placas de 24 pocillos en presencia o
ausencia de diversos estímulos e inhibidores y se incubaron durante 24, 48 o 72 horas.
También se midió la muerte celular a tiempo 0. Tras la incubación se lavaron las células con
PBS y se realizó la detección de células apoptóticas por la unión de Anexina y de la integridad
de la membrana celular por la incorporación de ioduro de propidio con el kit Anexina V-
FITC/Ioduro de Propidio (Bender MedSystems) por el método descrito por el fabricante. Una
vez teñidas las células fueron analizadas en el citómetro FC500.
Las células con apoptosis tardía fueron las dobles positivas (Anexina V-FITC/Ioduro de
propidio) mientras que las células con apoptosis temprana fueron las positivas para Anexina V-
FITC pero negativas para ioduro de propidio. Como controles negativos se utilizaron células sin
Anexina V-FITC ni ioduro de propidio, con Anexina V-FITC sola o con ioduro de propidio sólo.
En algunos ensayos se utilizaron células activadas con IL-2, IL-7, anti-CD3 y anti-CD3 más
anti-CD28.
Para estudiar la apoptosis en células silenciadas para las subunidades catalíticas de PI3-cinasa
p110 y p110, linfocitos T CD4+ CD62L
+ “naive” fueron nucleofectados con los siARN como se
describe en el apartado 3.2.7. Una vez nucleofectadas, las células fueron resuspendidas en
medio Click (106 células vivas/200 l) y distribuidas en placas de cultivo (96 pocillos, Costar,
3799) para su incubación a 37ºC y 5% CO2 durante 24, 48 o 72 horas. Tras la incubación se
midió la apoptosis con el kit Anexina V-FITC/Ioduro de Propidio (Bender MedSystems).
3.2.13 Lisis celular
Las células se lavaron con PBS y se resuspendieron en tampón de lisis CHAPS (2 x 107
células/ml), se incubaron en hielo durante 20 minutos y centrifugaron a 1000 xg. Los lisados
sobrenadantes se pueden utilizar en el momento o almacenar a -20ºC para su análisis
posterior.
3.2.14 Ensayo de interacción y precipitación (“pull-down”)
Unión de péptidos biotinilados a esferas de estreptavidina sefarosa
Esferas de estreptavidina-sefarosa (100 l, lavadas previamente con tampón de lisis CHAPS)
se incubaron rotando durante 2 horas a 4ºC con 50 g de péptido (ICOS, ICOSpTir, sICOSpTir,
o CD28pTir) en un volumen de 0,5 ml. Posteriormente se centrifugaron (500 xg, 2 min) y se
lavaron tres veces con tampón de lisis CHAPS.
MATERIALES Y MÉTODOS
52
Preaclarado y “pull down”
Para los ensayos de proteómica, el lisado celular (4-8 x 108
células) fue preaclarado con
esferas de estreptavidina-sefarosa (100 l, lavadas previamente con tampón de lisis) por
rotación durante 1 hora a 4ºC; el lisado fue centrifugado a 1000 xg 5 min.
El sobrenadante (lisado preaclarado) fue incubado durante 4 horas con las esferas de
estreptavidina- sefarosa con péptidos asociados, con rotación y a 4ºC. Trascurrido este tiempo,
las esferas fueron lavadas 4 veces (500 xg, 2 min) con tampón de lavado CHAPS y extraídas
con tampón de muestra para electroforesis en gel. Para los ensayos de electroforesis
bidimensional, el último lavado se realizó con agua destilada, y la extracción se realizó con
tampón de rehidratación para electroforesis bidimensional.
Para los ensayos de “inmunoblot” con proteínas obtenidas por “pull-down” se utilizaron 2-4 x
107 células y 15-20 g del péptido unido a 15-20 l de esferas de estreptavidina-sefarosa.
3.2.15 Electroforesis bidimensional
Para la identificación de las proteínas que interaccionan con las secuencias citoplásmicas de
ICOS, la muestra resultante del “pull-down” con los péptidos se separó habitualmente por
electroforesis bidimensional. Esta técnica separa proteínas utilizando dos tipos de
electroforesis sucesivas sobre la misma muestra. En primer lugar se realiza un
isoelectroenfoque (IEE) que consiste en la separación de las proteínas en función de su punto
isoeléctrico (pI) en un gradiente de pH inmovilizado (IPG). Posteriormente se realiza la
separación de las proteínas en geles de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE)
atendiendo a su masa molecular. De esta forma se obtiene al final un mapa de puntos (spots)
que representan las proteínas distribuidas en dos dimensiones.
Para el isoelectroenfoque la muestra fue resuspendida en tampón con urea (7 M), tiourea (2
M), Tritón X-100 (4%), DTT (100 mM), anfolitos (Bio-Lyte 3-10, BioRad) y azul de bromofenol
(140 l/muestra). Se centrifugó y el sobrenadante (125 l) se utilizó para la rehidratación de la
tira de IPG (7 cm ReadyStripTM IPG strips, pH 3–10, Bio-Rad) durante 12 horas a temperatura
ambiente sobre cubetas con aceite mineral. Tras la rehidratación se enfocaron las tiras
utilizando un sistema de enfoque eléctrico (15 minutos, 250 V; 1 hora, 1000 V; 1 hora, 8000 V;
500 V hasta que se alcanzan los voltios/hora deseados, entre 8000-13000 voltios/hora). Una
vez terminado el isoelectroenfoque es necesario el equilibrado de las IPGs antes de la
separación de las proteínas en SDS-PAGE. Para ello las tiras fueron introducidas durante 10
minutos en una solución de equilibrado con urea (6 M), SDS (2%), Tris-HCl (375 mM, pH 8,8),
glicerol (20%), DTT (130 mM) y azul de bromofenol. Posteriormente, las tiras se introdujeron
durante otros 10 minutos en la misma solución, pero con iodoacetamida (135 mM). Tras
equilibrar las tiras se pasó a realizar la segunda dimensión en geles de poliacrilamida al 12%
en presencia de SDS (SDS-PAGE).
MATERIALES Y MÉTODOS
53
3.2.16 Identificación de proteínas mediante espectrometría de masas
Los puntos de interés encontrados en los geles fueron extraídos por “Proteome Works Plus
Spot Cutter System” (Bio-Rad, Hercules, USA) y depositados en placas de 96 pocillos donde
fueron digeridos con tripsina usando Digest Pro MS (Intavis AG, Cologne, Alemania).
Luego se realizaron los análisis mediante el espectrofotómetro Autoflex Smartbeam TOF/TOF
(Bruker Daltonics, Bremen, Alemania).
La identificación de proteínas se realizó combinando los espectros MS y sus correspondientes
MS/MS, recopilados a través del programa Bio Tools 3.0 (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania)
y usando MASCOT (Matrix Science, UK) como motor de búsqueda sobre las bases de datos
MSDB o NCBInr.
Todo el proceso se realizó en el Servicio de Proteómica del Centro de Investigaciones
Biológicas.
3.2.17 Aislamiento de balsas lipídicas
Se utilizaron entre 40-50 x 106 células activadas o no con anticuerpos (10 g/ml, durante 15
minutos, 37ºC). Después de dos lavados con PBS, las células fueron lisadas en 1 ml de
tampón (MES 25 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Tritón X-100 0,5%, PMSF 1 mM, Aprotinina
10 g/ml, Na3VO4 1 mM, pH 6,5). El lisado fue mezclado con igual volumen de sacarosa al 85%
en MBS (MES 25 mM, NaCl 150 mM, pH 6,5) y colocado en un tubo de ultracentrífuga donde
se realizó un gradiente con 5 ml de sacarosa al 35% en MBS y 4 ml de sacarosa al 5% en
MBS. Se centrifugó el tubo durante 16-19 horas a 4ºC y 200.000 xg. Después de la
centrifugación se recogieron fracciones de 1 ml cada una, empezando desde la parte superior.
La fracción insoluble (fracción derivada de las balsas lipídicas) corresponde a las fracciones 3-6
y la fracción soluble (fracción de proteínas no asociadas a balsas lipídicas) en las fracciones
10-12. Se realizó un pool de cada uno de estos dos tipos de fracciones, se precipitaron con
acetona fría y se resuspendieron en tampón de muestra para la posterior separación por SDS-
PAGE y análisis por “inmunoblot”.
3.2.18 Inmunoprecipitación
El lisado celular (107 células/20 l) fue preaclarado con esferas de inmunoglobulina normal de
ratón acoplada a sefarosa, por rotación durante 30 minutos a 4ºC. Después de centrifugar 5
minutos a 1000 xg, los lisados preaclarados se inmunoprecipitaron durante 1 hora a 4ºC con el
anticuerpo unido previamente (toda la noche, 4ºC) a esferas de sefarosa. Los
inmunoprecipitados se lavaron cuatro veces con tampón de lavado y se extrajeron con tampón
de muestra para electroforesis.
MATERIALES Y MÉTODOS
54
Para la inmunoprecipitación de las subunidades de PI3-cinasa, se utilizó tampón de lisis
CHAPS, proteína A-sefarosa y 5 g de anticuerpo. Para la inmunoprecipitación con el
anticuerpo V5, se utilizo tampón de lisis Tritón, proteína G-sefarosa y 3 g de anticuerpo.
Para la inmunoprecipitación de ICOS expresado en superficie, células SR.D10 (2 x 107
células/ml) fueron incubadas con anticuerpo anti-ICOS (10 g/ml) durante 15 minutos y
lavadas. Luego fueron tratadas o no con el inhibidor de fosfatasas pervanadato (10 l de
pervanadato/100 l con 107 células) durante 5 minutos a 37ºC. Después de la incubación la
reacción fue detenida con PBS/EDTA/OV frío (Bello et al. 2007). Finalmente las células fueron
lisadas en tampón de lisis CHAPS, preaclaradas y precipitadas con proteína A-sefarosa.
3.2.19 Electroforesis SDS-PAGE e “inmunoblot”
Las muestras procedentes de lisados celulares, ensayos de “pull down” o inmunoprecipitados
se separaron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 10 o 12% en presencia de
SDS (SDS-PAGE) usando el sistema de electroforesis “mini-PROTEAN3” y/o “mini-PROTEAN-
Tetra” (Bio-Rad) y aplicando una corriente constante de 25 mA por gel.
Tras la electroforesis, las proteínas fueron transferidas a membranas PVDF (Inmobilon P,
Millipore), empleando cubetas de transferencia Tran-Blot (Bio-Rad), en tampón de transferencia
CAPS a una corriente constante de 320 mA durante 1 hora. Las proteínas inmovilizadas en la
membrana fueron bloqueadas a temperatura ambiente y agitación con una solución de PBSTL
o TBSTL, dependiendo del antígeno a detectar. En los casos en los que se quería detectar
motivos fosforilados se añadió ortovanadato de sodio (1 mM final) al tampón TBSTL. Tras dos
horas de bloqueo las membranas fueron lavadas 2 veces (15 minutos cada vez) con TBST o
PBST y se incubaron durante toda la noche a 4ºC y en agitación con el anticuerpo de interés
diluido a la concentración adecuada para cada ensayo. Tras lavarse las membranas 4 veces
con TBST o PBST se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo
secundario conjugado con la enzima peroxidasa (anti-ratón HRPO, anti-conejo HRPO, Proteína
A HRPO), diluido en tampón TBSTL o PBSTL. Finalmente, se lavaron las membranas 4 veces
con TBST o PBST y se procedió a la detección de la señal por quimioluminiscencia
(Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate system, Pierce) y autoradiografía en
películas KODAK X-OMAT UV film ó AGFA Curix RP2 Plus Medical X-Ray Film reveladas en
un AGFA Curix RP-2. En algunos casos las membranas fueron utilizadas nuevamente, para
esto se eliminaron los anticuerpos ya unidos con un tampón reductor (tampón de “stripping”)
durante 30 minutos a 56ºC.
El análisis densitométrico de las bandas obtenidas fue realizado con el programa Image J
(Image J 1.38x; National Institutes of Health).
MATERIALES Y MÉTODOS
55
3.2.20 Tinción de plata
El gel obtenido tras la electroforesis se fijó durante 20 minutos con metanol al 50% y ácido
acético al 10% en agua. Después se realizaron dos lavados de 10 minutos cada uno, el primero
con una solución de metanol al 50% en agua y el segundo solo con agua. El gel se sensibilizó
por incubación de 1 minuto en una solución de tiosulfato sódico al 0,02% y se realizaron dos
lavados con agua destilada de un minuto cada uno. Posteriormente, el gel se colocó en una
solución de nitrato de plata al 0,1% en agua y se mantuvo a 4ºC durante 20 minutos. A
continuación se realizaron dos lavados de un minuto cada uno con agua. Por último, el gel se
reveló con una solución de carbonato sódico al 2% en formalina (Formaldehido al 35% en
agua) al 0,04%. En este paso se sustituyó varias veces la solución por una fresca hasta la
aparición de las diferentes bandas proteicas. Finalmente, el gel se fijó utilizando una solución
de ácido acético al 5% en agua y se conservó en una solución de ácido acético al 1% y a 4ºC
(Shevchenko et al. 1996).
3.2.21 Obtención y purificación de anticuerpos
Las proteínas de los sobrenadantes de los cultivos de hibridomas se precipitaron con sulfato
amónico al 45% de saturación (27,5 g/100ml) en agitación continua durante 1 hora. Los
precipitados se centrifugan (10.000 xg, 10 minutos), el sedimento se resuspende en sulfato
amónico al 45% de saturación y se vuelve a centrifugar. El sedimento se resuspende esta vez
en un pequeño volumen de agua y se dializa 4 veces frente a PBS. Se centrifuga nuevamente
y el sobrenadante se esteriliza por filtración y se almacena a 4ºC.
Los anticuerpos monoclonales se purificaron por cromatografía de afinidad con columnas de
Proteína A-sefarosa. Una vez equilibrada la columna con tampón de unión se pasa el
sobrenadante diluido v:v en tampón de unión, luego se lava la columna con tampón de unión
hasta que desciende la absorbancia del eluido. Entonces se extraen los anticuerpos con
tampón de elución, el anticuerpo eluído se dializa frente a tres cambios de PBS y se mide la
concentración en espectrofotómetro a 280 nm.
Los anticuerpos policlonales de conejo fueron purificados de la misma forma, pero sustituyendo
la proteína A-sefarosa por el antígeno correspondiente acoplado a CNBr-sefarosa, y
empleando tampón de elución conteniendo 10% de dioxano.
3.2.22 Cuantificación de interleucinas mediante ELISA de captura
Se realizaron ensayos de ELISA con anticuerpos anti-IL-2 de ratón (18161D, captura y 18172D,
detección, BD Pharmingen), anti-IL-4 de ratón (11B11, captura; y biotin-BVD6-24G2, detección,
BD Biosciences), anti-IL-10 de ratón (JES5–2A5, captura; y biotin-JES5–16E3, detección, BD
Pharmingen) y anti-IFN- de ratón (R4-6A2, captura y XMG1,4, detección, BD Biosciences) que
reconocen epítopos no solapantes en las interleucinas. El anticuerpo de captura (5 g/ml en
MATERIALES Y MÉTODOS
56
PBS) fue adsorbido en placas de 96 pocillos (Costar, 3590) durante toda la noche a 4ºC. Tras
la incubación se lavaron los pocillos con PBST y se realizó una incubación de 2 horas con una
solución bloqueante (PBS/FCS 10%). Se volvieron a lavar 4 veces los pocillos con PBST y se
les añadió los sobrenadantes objeto de estudio (50 l) con diluciones seriadas, y se incluyeron
controles negativos y positivos de concentraciones conocidas. Se incubaron las placas durante
16 horas a 4ºC, se lavaron nuevamente las placas con PBST y se incubaron con el anticuerpo
de detección biotinilado en solución de bloqueo (2 g/ml, 50 l/pocillo). Después de 1 hora de
incubación a temperatura ambiente, se realizó de nuevo un lavado. Los complejos formados se
detectaron incubando la placa 1 hora a temperatura ambiente con 50 l/pocillo de
estreptavidina-peroxidasa diluida 1/500 en solución de bloqueo. Se hizo el último lavado y se
cuantificó la interleucina detectada por colorimetría, utilizando el sustrato de peroxidasa orto-
fenilén-diamina (Sigma Fast OPD, 100 l/pocillo). La reacción se detuvo con H2SO4 (3 N, 100
l/pocillo) y mediante espectrometría se midió la densidad óptica de la placa a 492 nm.
Los datos de densidad óptica obtenidos para la muestras se interpolaron con los datos
obtenidos de las curvas patrón. Las diluciones se hicieron por triplicado. Los resultados son la
media de la concentración de interleucina deducida de la titulación de cada sobrenadante.
3.2.23 qRT-PCR
Extracción de ARN
Para llevar a cabo la extracción de ARN se utilizó el “mirVanaTM
miRNA Isolation Kit” (Ambion,
Applied Biosystems) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Síntesis de ADN
Se utilizó el kit “ThermoScriptTM
RT-PCR System” (Invitrogen), mediante el cual se amplifica
una primera hebra de ADNc a partir de ARN total. El protocolo consistió en mezclar 200 ng de
ARN con 1 l (50 ng) de cebador “random hexamers”, 2 l de mezcla de dNTPs (10 mM) y
agua libre de RNasa hasta un volumen de 12 l. La mezcla se incubó durante 5 minutos a 65ºC
y un minuto en hielo; paralelamente se realizó la mezcla de reacción para la síntesis de ADNc
que incluye, por cada reacción, 4 l de RT buffer 5x, 1 l de DTT 0,1 M, 1 l de RnasaOUTTM
, 1
l de ThermoScriptTM
y 1 l de agua libre de RNasa. Se añadieron 8 l de la mezcla a cada
tubo de ARN/primer/dNTP y se programó el termociclador con la siguiente secuencia: 25ºC 10
minutos, 50ºC 30 minutos, 85ºC 5 minutos. Finalmente se añadió 1 l de RNasa H a cada tubo
y se incubó por 20 minutos a 37ºC.
Una vez obtenido el ADNc y comprobada su integridad, se amplificó mediante PCR a tiempo
real, utilizando las parejas de cebadores, correspondientes a los genes codificadores de -
Actina, p85 p85p110 p110 p110y p110
MATERIALES Y MÉTODOS
57
Los cebadores utilizados fueron:
Actina de ratón
CTAAGGCCAACCGTGAAAAG (Sentido)
ACCAGAGGCATACAGGGACA (Antisentido)
PI3-cinasa p85
GAATGTTCGACTCTATACAGAACACAA (Sentido)
CATCTCCAAGTCCACTGACG (Antisentido)
PI3-cinasa p85
CCCTTGGATGGATCTTCTGA (Sentido)
GGGTCAGGTGGGGAGAAC (Antisentido)
PI3-cinasa p110
GACAAGAACAAGGGCGAGAT (Sentido)
CAGTACCCAGCGCAGGAC (Antisentido)
PI3-cinasa p110
AGAAGCTGGCTTGGACCTG (Sentido)
CAGAGCGATCTCCTGTTGCT (Antisentido)
PI3-cinasa p110
AACAATCTCCGCCCACAA (Sentido)
CACTCCAGACTTTCCTTTATCTTCTT (Antisentido)
PI3-cinasa p110
AGCTGCTCCAAAGATATCCAGT (Sentido)
TGCTTTAGCGCCTCTTCCT (Antisentido)
Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en el LightCycler (Roche), en una mezcla de
reacción de 2 l de ADNc, 2 μl de LightCycler Fast Start DNA Master SYBR Green I (Roche),
cebadores (500 nM), MgCl2 (1 mM) y agua hasta completar 20 l. Para cada muestra se
realizaron tres replicas técnicas.
Los datos obtenidos se analizaron por el método comparativo CT (“cycle threshold”) con un
software versión lightcycler (Roche Diagnostics Inc.) y normalizado con controles normales de
-actina de ratón.
MATERIALES Y MÉTODOS
58
3.2.24 Clonación de las subunidades catalíticas p110 y p110 de PI3-cinasa
El ARN total de las células fue extraído y utilizado como molde para obtener ADNc con el kit
“ThermoScriptTM
RT-PCR System” (Invitrogen), como se describió anteriormente, pero con 1 l
de cebador Oligo (dT)20 50 M.
PCR
Las secuencias de DNA codificantes de p110 y p110 de ratón se clonaron a partir del
producto de PCR. Los cebadores utilizados para la amplificación de un producto de tamaño
aproximado a 3180 pares de bases fueron los siguientes:
PI3-cinasa p110
5´ ATGCCTCCACGACCATCTTCG 3´ (Sentido)
5´ GGAGTTCAAAGCATGCTGCTT 3´ (Antisentido)
PI3-cinasa p110
5´ ATGCCCCCTGGGGTGGACT 3´ (Sentido)
5´ GGACTGTCGGTTATCCTTGGACAC 3´ (Antisentido)
La solución de PCR contiene ADNc (70 ng), buffer 10x, dNTPs (250 M), MgCl (2,5 M),
cebadores (100 ng), Taq polimerasa (2 U, Invitrogen) y agua hasta completar el volumen de
reacción a 50 l.Los ciclos fueron: uno de desnaturalización inicial de 94ºC durante dos
minutos y posteriormente 30 ciclos con 94ºC 1 minuto, 65ºC 1 minuto, 68ºC 2 minutos, y una
extensión final a 68ºC durante diez minutos.
Electroforesis en gel de agarosa
Antes de clonar, los productos obtenidos por PCR se analizaron por electroforesis en geles de
agarosa al 0,7% en tampón TAE 1x. Se utilizó un marcador de DNA (Lambda DNA/Hind III
Markers, Promega) como marcador del tamaño de las bandas. Para cada muestra se cargaron
5 l de producto de PCR y 1 l de Buffer de carga 6x (Blue orange 6x Loading Dye, Promega).
A continuación se procedió a la separación por electroforesis (BioRad Power Pak 3000)
durante 30 min a 90 V. La banda de ADN se visualizó en transiluminador GEL DOC XR, Bio-
Rad) utilizando el programa “Quantity One” de Bio- Rad.
Clonaje del producto de PCR
El kit utilizado para la clonación fue el pcDNA 3.1/V5-His TOPO TA (Invitrogen). Se mezcló el
plásmido pcDNA3.1/V5-His TOPO, con el producto de PCR directamente y una solución salina
suministrada en el kit siguiendo las recomendaciones del fabricante. La mezcla se incubó a
temperatura ambiente durante 5 minutos.
MATERIALES Y MÉTODOS
59
Transformación de bacterias competentes
Se realizó la transformación de bacterias competentes TOP10 (Invitrogen, EE.UU.) mediante
choque térmico. Para ello, se descongelaron las bacterias en hielo, se añadió la mezcla de
clonación (4 l) y se incubó durante 20 minutos en hielo. Seguidamente se mantuvieron 30
segundos a 42ºC e inmediatamente después, se pasaron a hielo durante 2 minutos. Tras
añadir a las bacterias el medio SOC, éstas se incubaron 1 hora a 37ºC en agitación. A
continuación se sembraron en placas de LB con ampicilina (50 g/ml) (Sigma) y se incubaron
durante 18 horas en una estufa a 37ºC.
Selección de colonias
Para seleccionar las bacterias que contenían el vector con el inserto correctamente orientado,
se aislaron varias colonias resultantes de la transformación por extracción de DNA plasmídico
mediante lisis alcalina estándar de “minipreps” (High Pure Plasmid Isolation kit, Roche
Diagnostics), siguiendo el protocolo descrito por el fabricante. A partir de cultivos de bacterias
de 4 ml en LB con 50 g/ml de ampicilina se obtuvieron 80 l de plásmido a una concentración
de 200 g/ml.
Se realizó análisis de restricción para definir la lectura del inserto clonado. Las construcciones
cuyo patrón de digestión coincidía con el deseado fueron analizadas por secuenciación en
Secugen S.L. (Centro de Investigaciones Biológicas, Madrid) con el fin de analizar la presencia
de mutaciones. Debido al gran tamaño de esta proteína (3180 pb), no puede ser determinada
la secuencia completa de nucleótidos en un solo proceso de secuenciación ya que
habitualmente se tienen lecturas de hasta 900 pb. Por esto se realizaron dos secuenciaciones
parciales, la primera con los cebadores T7 y BGH reverse, los cuales hibridan en el vector a
ambos lados del sitio de clonaje y la segunda secuenciación con cebadores diseñados a partir
del fin de la primera secuenciación:
PI3-cinasa p110
5´ CCAACTTGATGCTGATGGCCAA 3´ (Sentido)
5´ TCCATGATTCGGATGATCTGAA 3´ (Antisentido)
PI3-cinasa p110
5´ CTCATCTGACCATGGTCCACTC 3´ (Sentido)
5´ AGGCAGCCGTAGGGCGTCAT 3´ (Antisentido)
Las construcciones clonadas correctamente (pcDNA3.1/V5-His/TOPO/p110, pcDNA3.1/V5-
His/TOPO/p110) se purificaron usando el sistema Plasmid Purification MAXI kit JET star
(GENOMED Genycell Biotech España SL) y el protocolo descrito en el kit.
RESULTADOS
RESULTADOS
61
4 RESULTADOS
4.1 SEÑALES MEDIADAS POR ICOS: PROTEÍNAS ASOCIADAS AL DOMINIO
CITOPLASMÁTICO DE ICOS
4.1.1 Identificación de moléculas asociadas a motivos YMxM: Unión de PI3-cinasa de
clase IA al péptido de ICOS pYMFM
ICOS y CD28, actúan como moléculas de señalización intracelular en linfocitos T, con
semejanzas estructurales y funcionales.
CD28 posee el motivo YMNM en su región citoplasmática, que tras su fosforilación se une e
induce la activación de PI3-cinasa. ICOS presenta un motivo similar YMFM (residuos 181-184)
adecuado para la unión a la subunidad reguladora p85 de PI3-cinasa.
Con el fin de identificar las proteínas que se unen a este motivo de ICOS de ratón, se
sintetizaron péptidos biotinilados de 29 residuos correspondientes a los residuos Gly171 a
Thr199 de la secuencia de ICOS de ratón, fosforilados en el residuo Tyr181 del motivo YMFM
(ICOS pTir), o no fosforilados (ICOS). Estos péptidos, una vez unidos a esferas de
estreptavidina sefarosa, se utilizaron en ensayos de “pull down”. Para ello fueron incubados
con lisados celulares de líneas de linfocitos T CD4+
(SRD10, un mutante ICOS- de SR.D10 (H4
-
A5)) o de linfocitos T CD4+ normales de bazo de ratón, y las proteínas asociadas fueron
separadas e identificadas por métodos proteómicos estándar (Figura 9, Tabla 1).
Se detectaron en los ensayos de “pull-down” diferentes subunidades de PI3-cinasa de clase IA
unidas al péptido de ICOS fosforilado en el residuo de tirosina 181, en la tabla 1 se muestran
las diferentes subunidades detectadas, entre ellas están la subunidad catalítica p110 y tres
subunidades reguladoras (p85, p85 y p50-55). En los tres tipos celulares examinados se
encontraron resultados similares.
RESULTADOS
62
66
116
97.4
45
29
205
p110
p85
p195p175
p60
p38
p50/55
p28
Péptido
Figura 9. Separación de proteínas asociadas a péptidos de ICOS y CD28 por ensayos de “pull
down”.
Separación por SDS-PAGE y posterior tinción de plata de las proteínas asociadas a péptidos obtenidas
por ensayos de “pull down”. Péptido de ICOS no fosforilado (ICOS), péptido de ICOS fosforilado (ICOS
pTir) y péptido de CD28 fosforilado (CD28 pTir).
____________________________________________________________________________
Tabla 1. Proteínas unidas al péptido de ICOS fosforilado en ensayos de “pull-down”.
Peso molecular
aparente (kDa)Proteína
Número de
acceso
Mascot
Score
110 Subunidad catalítica de PI3-cinasa, p110 gi | 6679317 152
85 Subunidad reguladora de PI3-cinasa, p85 gi | 129388 164
83 Subunidad reguladora de PI3-cinasa,polipéptido 2, p85b gi | 6679321 164
55 Subunidad reguladora de PI3-cinasa,polipéptido 1, isoforma 1, p55 gi | 68299809 151
50 Subunidad reguladora de PI3-cinasa,polipéptido 1, isoforma 1, p55 gi | 68299809 209
La abundancia de las subunidades de PI3-cinasa asociada a péptidos fosforilados de ICOS, fue
comparada con la abundancia de cada subunidad en los diferentes tipos celulares,
determinada por medio de qRT-PCR (Figura 10).
RESULTADOS
63
0
Fo
ld
-acti
na A
RN
Subunidades de PI3-cinasa
0.04
0.08
0.12
0.16Células:
H4-.A5
T CD4+
SR.D10
Figura 10. Abundancia de las subunidades de PI3-cinasa de clase IA en diferentes tipos de células
T CD4+ de ratón.
Niveles relativos de ARNm de las subunidades reguladoras (Reg ; Reg ) y las subunidades catalíticas
(Cat p110; Cat p110; Cat p110) de PI3-cinasa, mediante qRT-PCR de las líneas celulares de linfocitos
T CD4+
SR.D10 y H4-.A5, y en linfocitos T CD4
+ de bazo de ratón. Media ± E.S de triplicados de un
experimento representativo realizado tres veces.
____________________________________________________________________________
Los resultados obtenidos muestran que el ARNm de la subunidad reguladora es más
abundante en todos los tipos celulares, en comparación con la subunidad reguladora ; los
oligonucleótidos empleados para la qRT-PCR no diferencian entre las isoformas de la
subunidad reguladora , por esto no es posible comparar el ARNm en los diferentes tipos
celulares con los resultados obtenidos en los ensayos de “pull-down” para las isoformas de las
subunidades reguladoras p50-55que representan cerca de un 30%. Las subunidades
catalíticas p110 y p110 son más abundantes en los tres tipos celulares en comparación con
la subunidad p110.
Para ampliar el análisis de las proteínas asociadas a los péptidos de ICOS por ensayos de
“pull-down”, se hicieron “inmunoblots”, con anticuerpos específicos para cada subunidad de
PI3-cinasa (Figura 11).
RESULTADOS
64
Blot: Catalítica p110
- 1.00.0 3.34DO
- 1.00.0 0.63DO
- 1.00.01 21.57DO
Blot: Reguladora p85
Lisado
Blot: Catalítica p110
Blot: Catalítica p110
112
92
6759
45
11292
11292
11292
ICOS
pTirICOS
p85
p50
p110
p110
p110
- 1.00.0 1.42DO p85
- 1.00.0 3.34DO p50
Figura 11. Abundancia relativa de las subunidades de PI3-cinasa de clase IA en ensayos de “pull-
down” con péptidos de ICOS.
Comparación de la abundancia relativa de las subunidades reguladoras (p85; p50-55) y las
subunidades catalíticas (Cat p110; Cat p110; Cat p110) de PI3-cinasa en lisados de células H4-.A5 o
en “pull-down” con péptidos de ICOS fosforilados (ICOS pTir) o no (ICOS), mediante “inmunoblot”. Los
datos son representativos de un experimento realizado 5 veces. El valor de la DO de las diferentes
subunidades de PI3-cinasa tiene como referencia la DO del lisado que es igual a 1.
____________________________________________________________________________
El anticuerpo utilizado para detectar la subunidad reguladora distinguía las diferentes isoformas
de la subunidad reguladora de PI3-cinasa (p85, p50-55También se utilizaron anticuerpos
específicos para las subunidades catalíticas de PI3-cinasa p110, p110 y p110Se comparó
la densidad óptica (DO) de cada banda, con la correspondiente a la DO del lisado (tomando
como referencia la DO del lisado =1).
Según estos resultados las isoformas p50-55 de la subunidad reguladora se unen
preferencialmente a los péptidos fosforilados (ICOS pTir).
Trabajos anteriores han demostrado que la subunidad catalítica p110 se expresa
exclusivamente en leucocitos (Vanhaesebroeck et al. 1997), pero en nuestros estudios de
proteómica sólo se había detectado la subunidad catalítica p110 unida a los péptidos de ICOS
fosforilados (Tabla 1). Sin embargo, los niveles de ARNm de las subunidades p110 y p110
en los diferentes tipos de linfocitos T analizados fueron muy similares (Figura 10), por lo que
teóricamente había una posibilidad alta de encontrar no solo subunidades p110 sino también
RESULTADOS
65
p110 en los ensayos de “pull-down” con los péptidos. Por tal razón se realizaron ensayos de
“inmunoblot” de las proteínas obtenidas mediante “pull-down”, utilizando anticuerpos
específicos para cada subunidad catalítica de PI3-cinasa (Figura 11). Al comparar la DO de los
lisados con lo esperado de acuerdo con los datos de qRT-PCR, se observó que los anticuerpos
frente a p110 y p110 eran mejores que el anticuerpo policlonal y monoclonal de p110 en
cuanto al tiempo necesario para detectar las proteínas en los lisados. Para compensar estas
diferencias utilizamos el valor de la DO correspondiente a los lisados como referencia para los
valores de la DO en el ensayo de “pull-down”. Una vez corregidos los datos con esta
referencia, se observó que el péptido de ICOS pTir co-precipita niveles más altos de la
subunidad p110 que de las subunidades p110 y p110. Los bajos niveles de p110 se
esperaban por los resultados de qRT-PCR, pero no así los bajos niveles de p110.
Se sintetizaron péptidos más cortos (18 residuos, Val174 a Lys191), fosforilados en el residuo
de tirosina del motivo YMFM (sICOS pTir) y un péptido de CD28 (29 residuos, Arg183 a
Arg211) fosforilado en el residuo de tirosina equivalente (CD28 pTir), para compararlos con el
péptido ICOS pTir y determinar si las diferencias en la asociación de las subunidades
catalíticas p110 y p110 era debido a alguna secuencia específica del péptido empleado. Con
las proteínas unidas a dichos péptidos (ICOS, ICOS pTir, sICOS pTir, CD28 pTir) por ensayos
de “pull-down”, se hicieron “inmunoblot” con anticuerpos específicos para cada subunidad de
PI3-cinasa (Figura 12).
Al comparar la DO de cada uno de los péptidos fosforilados con la DO del lisado, se demostró
que la subunidad catalítica p110 presenta una mayor unión a los péptidos fosforilados de
ICOS, estos resultados son similares a los obtenidos anteriormente.
RESULTADOS
66
92
67
59
p85
p50
Blot: PI3-K Reguladora
0.0 2.64- 1.0 3.43 3.42DO p85
0.0 4.56- 1.0 9.47 9.13DO p50
p110
Blot: Catalítica p110
112
0.0 17.81- 1.0 25.79 22.79DO
Blot: Catalítica p110
112 p110
0.0 0.01- 1.0 0.08 0.08DO
Blot: Catalítica p110
112 p110
0.0 1.95- 1.0 2.89 2.64DO
-
Figura 12. Comparación de las subunidades de PI3-cinasa de clase IA asociadas a péptidos
fosforilados (ICOS pTir, sICOS pTir) o no fosforilados (ICOS) y a un péptido de CD28 fosforilado
(CD28 pTir) por ensayos de “pull-down”.
Comparación de la abundancia relativa de las subunidades reguladoras (p85; p50-55) y las
subunidades catalíticas (Cat p110; Cat p110; Cat p110) de PI3-cinasa en lisados de células SR.D10 o
en “pull-down”, mediante “inmunoblot”. Los datos son representativos de un experimento realizado 3
veces. El valor de la DO de las diferentes subunidades de PI3-cinasa tiene como referencia la DO del
lisado que hacemos igual a 1.
____________________________________________________________________________
4.1.2 Abundancia relativa de las subunidades de PI3-cinasa de clase IA en
inmunoprecipitados de ICOS
Quisimos determinar si la asociación selectiva entre las subunidades catalíticas de PI3-cinasa y
los péptidos de ICOS pTir encontrada en los ensayos de “pull-down” también se observaba en
la molécula de ICOS expresada en la superficie de las células T. Para ello se trató la línea de
linfocitos T SR.D10 con un inhibidor de fosfatasas (pervanadato) durante 5 minutos para
fosforilar eficientemente todas las moléculas susceptibles, incluyendo ICOS (Figura 13 a). A
RESULTADOS
67
continuación se inmunoprecipitaron específicamente las moléculas de ICOS presentes en la
superficie celular y se analizaron por “inmunoblot” las isoformas de PI3-cinasa asociadas a
ICOS. Se obtuvieron resultados similares a los obtenidos en ensayos de “pull-down” con
péptidos, encontrándose una mayor co-precipitación relativa de la subunidad catalítica p110
con ICOS, al compararla con p110, basada en la abundancia relativa en los lisados. También
se pudo observar que las subunidades reguladoras p50-55 co-precipitan preferentemente con
ICOS (Figura 13 b), un fenómeno que también se observó en los ensayos de “pull-down” (ver
figura 11, panel superior).
148
98
64
50
36
a)
Pervanadato
- +
Blot: pTir
1.0 1.0 0.02 1.28DO p85
1.0 1.0 0.03 8.95DO p50
p85
p50
Blot: Reguladora
92
6759
1.0 1.0 0.13 13.37DO
p110
Blot: Catalítica p110
112
- + - +
b)
Lisado ICOS Precipitado
p110112
Blot: Catalítica p110
1.0 1.0 0.03 1.43DO
Figura 13. Asociación de las subunidades de PI3-cinasa a inmunoprecipitados de ICOS expresado
en la superficie celular antes y después de la inducción de la fosforilación de proteínas
intracelulares con pervanadato.
a) Comparación de la fosforilación en tirosinas de lisados de células SR.D10 tratadas (+) o no tratadas (-)
con pervanadato 5 min, determinado por “inmunoblot” con anticuerpo anti-fosfotirosina. b) Co-
precipitación de las subunidades de PI3-cinasa de clase IA en inmunoprecipitados con ICOS, en células
SR.D10 tratadas (+) o no (-) con pervanadato 5 min, determinada por “inmunoblot” con anticuerpos
específicos para cada subunidad. Los datos son representativos de un experimento realizado 4 veces. El
valor de la DO de las diferentes subunidades de PI3-cinasa tiene como referencia la DO del lisado que se
hace igual a 1.
____________________________________________________________________________
RESULTADOS
68
4.1.3 La unión diferencial de las subunidades catalíticas de PI3-cinasa a ICOS refleja
las diferencias en la unión de estas subunidades a la subunidad reguladora
Con los resultados obtenidos se ha demostrado una mayor asociación de la subunidad
catalítica de PI3-cinasa p110 a los péptidos de ICOSpTir (“pull-down”) y a inmunoprecipitados
de ICOS nativo fosforilado; tal vez porque existe una unión preferencial de esta subunidad con
la subunidad reguladora de PI3-cinasa. Para comprobar esta hipótesis se hicieron
inmunoprecipitaciones de la subunidad reguladora alfa (p85, p50-55) a partir de lisados de
células SR.D10 y se encontró que, efectivamente, la subunidad catalítica p110 co-precipita
mejor con la subunidad reguladora que la subunidad p110 (Figura 14 a).
Para comprobar que no era un fenómeno peculiar de una línea de células mantenida en cultivo
también se realizaron ensayos con linfocitos T CD4+ aislados de bazo, y con blastos de
linfocitos T CD4+ (Figura 14 b). Se encontró que al igual que en las células SR.D10, la
subunidad catalítica p110 tiene una unión preferencial a la subunidad reguladora en estas
células. La subunidad catalítica p110 es fácilmente detectable en los lisados celulares a
diferencia de las subunidad p110, demostrando el alto nivel de co-precipitación de p110;
estas diferencias se observan de igual modo realizando “inmunoblot” con anticuerpos anti-
p110 policlonales (Figura 14) o monoclonales (Figura 19).
Curiosamente, se detectaron bajos niveles de las subunidad reguladora p50-55 de PI3-cinasa
en blastos de linfocitos T CD4+ en comparación con linfocitos T CD4
+ sin activar (Figura 14 c), a
pesar de esto la asociación preferencial de la subunidad catalítica p110 a la subunidad
reguladora se mantuvo.
RESULTADOS
69
- 1.0DO 0.0 17.27
Blot: Catalítica p110
112
- 1.0DO 0.0 1.32
Blot: Catalítica p110
112
- 1.0DO p85 0.0 2.04
Blot: Reguladora
92
6759
p110
p110
p85
p50
- 1.0DO p50 0.0 8.36
Precipitado
ReguladoraLisado a)
1.0 -1.0 10.92 5.54DO
Blot: Catalítica p110
112 p110
1.0 -1.0 1.82 1.51DO
p110112
Blot: Catalítica p110
112
92 p85
Blot: Reguladora
Precipitado
ReguladoraLisado b)
1.01.0 - 1.93 1.53DO
90
69
59
p85
p50
Lisados
Blot: Reguladora
DO p85 1.00
0.78DO p50
0.83
0.16
c)
Figura 14. Abundancia de las subunidades catalíticas de PI3-cinasa de clase IA en
inmunoprecipitados de la subunidad reguladora alfa comparado con la abundancia en linfocitos T.
a) Lisados de células SR.D10. b) Lisados de linfocitos T CD4+ de bazo y blastos de linfocitos T CD4
+;
determinado por “inmunoblot” con anticuerpos específicos para cada subunidad. c) Bajos niveles de la
subunidad reguladora p50-55 en blastos de linfocitos T CD4+ en comparación con linfocitos T CD4
+ sin
activar. El inmunoprecipitado control (Control) se llevó a cabo con tampón de lisis en lugar de lisado. Los
datos son representativos de un experimento realizado 3 veces. El valor de la DO de las diferentes
subunidades de PI3-cinasa tiene como referencia la DO del lisado que es igual a 1.
____________________________________________________________________________
Las diferencias en la asociación de las subunidades catalíticas a la subunidad reguladora
pueden ser debidas a diversos factores. En primer lugar, podría haber bajos niveles de proteína
RESULTADOS
70
p110 a pesar de los resultados de la qRT-PCR, que indicaban niveles de ARNm similares de
las dos subunidades p110 y p110. En segundo lugar, quizás la asociación de p110 es más
lábil, por lo que una fracción de p110 podría actuar de manera independiente de la subunidad
reguladora, y por esto no co-precipita con ella. Para despejar algunas de estas dudas, se
comparó la presencia o no de p110 residual en lisados de células SR.D10 sometidos a tres
inmunoprecipitaciones sucesivas (1, 2, 3) con anticuerpos específicos frente a la subunidad
reguladora (para eliminar estas subunidades) o con anticuerpos frente a una proteína no
relacionada (ZAP-70; C) empleados como control (Figura 15 a).
p85
p50
92
67
59
112
Blot: Reguladora
Inmunoprecipitado:
1 2 3
C C Cp85 p85 p85
a)
92
11292
112
Blot: p110 Blot: p110
p110
Lisado: C p85
p110
C p85
1.0 0.19 1.0 0.66
Inmunoprecipitado:b)
p110p110
Blot: Reguladora
1.0 0.18
92p85
Figura 15. La depleción eficiente de la subunidad reguladora de PI3-cinasa elimina la subunidad
catalítica p110, pero no p110 en células SR.D10.
a) Lisado de células SR.D10 sometido a tres inmunoprecipitaciones sucesivas con anticuerpo control
(anti-ZAP70; C) o con anticuerpos específicos para la subunidad reguladora (p85) para eliminarla de los
lisados. b) Lisados control (C) o lisados a los que se ha eliminado la subunidad reguladora (p85), fueron
divididos e inmunoprecipitados con anticuerpos específicos para p110 y p110. Los datos son
representativos de un experimento realizado 3 veces. El valor de la DO de las diferentes subunidades de
PI3-cinasa tiene como referencia la DO del lisado que es igual a 1.
____________________________________________________________________________
RESULTADOS
71
Como se observa en la figura 15, las inmunoprecipitaciones sucesivas con anticuerpos frente a
la subunidad reguladora son efectivas en su eliminación, ya que en la tercera
inmunoprecipitación la presencia de esta subunidad es residual en comparación con la primera
inmunoprecipitación. Los lisados obtenidos tras la depleción fueron divididos e
inmunoprecipitados con anticuerpos específicos para las subunidades catalíticas y (Figura
15 b). Los bajos niveles de p110 detectados tras la depleción indican que gran parte de la
subunidad catalítica p110 se elimina junto con la subunidad reguladora, mientras que una
fracción apreciable de p110 es fácilmente inmunoprecipitable, pero apenas tiene asociadas
subunidades reguladoras.
También analizamos si la unión preferencial de p110 a la subunidad reguladora se mantiene
cuando las células expresan las proteínas p110 y p110 de manera exógena y con un epítopo
marcador asociado. De este modo se eliminan posibles diferencias en los niveles endógenos y
sobre todo, en la calidad de los anticuerpos frente a cada subunidad. Para esto se clonaron las
subunidades catalíticas de p110 y p110 en el vector pcDNA 3.1/V5-His Topo y se
transfectaron células COS-7. Los lisados celulares de las células transfectadas se
inmunoprecipitaron con anticuerpos frente a la subunidad reguladora p85 (Figura 16) y frente al
epítopo V5 (Figura 17). Finalmente se analizó por “inmunoblot” y con anticuerpos anti-V5, anti-
p85, anti-p110y anti-p110 la abundancia de las subunidades en los lisados
inmunoprecipitados. La inmunoprecipitación con p85 y posterior “inmunoblot” con anti-p85
indica un ligero aumento en la abundancia de la subunidad reguladora en las células
transfectadas con pcDNA 3.1/V5-His p110 (Figura 16), a pesar de esto al hacer el
“inmunoblot” con anti-V5 se observa una mayor abundancia relativa de la subunidad catalítica
exógena p110 a la subunidad reguladora p85, al comparar la DO de cada banda, con la
correspondiente al lisado (tomando como referencia la DO del lisado =1) (Figura 16). En el
“inmunoblot” para p110 y p110 se observan dos bandas muy cercanas correspondientes a la
subunidad catalítica endógena y a la exógena (mayor peso).
En la inmunoprecipitación con anti-V5 y el “inmunoblot con anti-p85 se observa un pequeño
aumento no significativo en la abundancia de la subunidad reguladora en las células
transfectadas con pcDNA 3.1/V5-His p110. Al comparar la DO del precipitado con la DO del
lisado se observa una mayor precipitación de la subunidad catalítica p110 exógena en
comparación con p110. En el “inmunoblot” para p110 y p110 se observa en los precipitados
una banda de mayor peso correspondiente a la subunidad catalítica exógena (Figura 17). En
conjunto, estos resultados sugieren que en la precipitación de las subunidades catalíticas no es
evidente la diferencia en la asociación p85/p110 y p85/p110 que sí se observa al analizar los
precipitados o los “pull down” con subunidades reguladoras p85.
RESULTADOS
72
p110
p110
p110
p85
Blot: p85
Blot: V5
Blot: p110
Blot: p110
1.0 1.63 1.0 1.01.39 2.04
0 0 1.0 1.00.35 0.12
1.0 2.98 1.0 1.03.33 8.53
1.0 1.68 1.0 1.03.48 1.86
Lisado Precipitadop85
Lisado Precipitadop85
Lisado Precipitadop85
Control sin DNA
pcDNA 3.1/V5-His
p110
pcDNA 3.1/V5-His
p110
Figura 16. Abundancia de las subunidades catalíticas de PI3-cinasa de clase IA exógena en
inmunoprecipitados de la subunidad reguladora alfa.
Células COS-7 fueron transfectadas con 40 g de pcDNA 3.1/V5-His p110, pcDNA 3.1/V5-His p110 y
células COS-7 transfectadas sin ADN. Los lisados fueron inmunoprecipitados con anticuerpos frente a la
subunidad reguladora y luego analizados por “inmunoblot” con anticuerpos específicos frente a cada
subunidad y frente al epítopo V5, presente en el vector de clonación. El valor de la DO de las diferentes
subunidades de PI3-cinasa tiene como referencia la DO del lisado que es igual a 1.
____________________________________________________________________________
RESULTADOS
73
Lisado PrecipitadoV5
Lisado PrecipitadoV5
Lisado PrecipitadoV5
Control sin DNA
pcDNA 3.1/V5-His
p110
1.0 0 1.0 1.00.12 0.09
Blot: p85
Blot: V5
Blot: p110
Blot: p110
0 0 1.0 1.017.50 3.60
1.0 0 1.0 1.02.28 0.00
1.0 0 1.0 1.00 1.14
p110
p110
p110
p85
pcDNA 3.1/V5-His
p110
Figura 17. Abundancia de las subunidades catalíticas de PI3-cinasa de clase IA exógena en
inmunoprecipitados del epítopo V5 presente en el vector de clonación.
Células COS-7 fueron transfectadas con 40 g de pcDNA 3.1/V5-His p110, pcDNA 3.1/V5-His p110 y
células COS-7 transfectadas sin ADN. Los lisados fueron inmunoprecipitados con anticuerpo anti-V5 y
luego analizados por “inmunoblot” con anticuerpos específicos frente a cada subunidad de PI3-cinasa y
frente al epítope V5. El valor de la DO de las diferentes subunidades de PI3-cinasa tiene como referencia
la DO del lisado que es igual a 1.
____________________________________________________________________________
RESULTADOS
74
4.2 IMPORTANCIA DE LAS SUBUNIDADES CATALÍTICAS DE PI3-CINASA DE CLASE
IA EN LA ESTIMULACIÓN Y COESTIMULACIÓN DE LINFOCITOS T
4.2.1 Efecto del silenciamiento (siARN) de las subunidades catalíticas de PI3-cinasa de
clase IA en la estimulación y la coestimulación por ICOS
Para conocer el papel funcional que desempeñan las subunidades catalíticas de PI3-cinasa
(p110, p110) se evaluó el efecto que tiene el silenciamiento específico con siARN y el uso de
inhibidores específicos de isoformas en la activación de TCR y la coestimulación con ICOS.
Para esto, células SR.D10 fueron tratadas con siARN específicos para p110 y con siARN
control, y el silenciamiento fue seguido por “inmunoblot” con anticuerpos específicos para cada
subunidad. Las células transfectadas con siARN para p110, presentaron una clara inhibición
en los niveles de p110, al compararlas con las células transfectadas con el siARN control (C);
los niveles de p110 cambiaron significativamente, para compensar la pérdida de p110
mientras que los niveles de p110 no cambiaron (Figura 18 a). Después de comprobar el
silenciamiento de la subunidad, se estudio el efecto de este en señales tempranas como Akt y
Erk, blanco en la coestimulación por ICOS. Para esto, las células fueron activadas durante diez
minutos con anticuerpo anti-CD3, o con anti-CD3 mas anti-ICOS, o sin activar (N) (Figura 18 b).
Estos resultados demuestran que el silenciamiento de p110 inhibe la fosforilación temprana
de Akt, inducida por anti-CD3/anti-ICOS, confirmando la importancia de p110 en la
coestimulación. La fosforilación de Erk no se vio inhibida, por el contrario se observó un
incremento al silenciar p110; estos datos son exclusivos de Erk, porque la fosforilación de
otras cinasas como p38 también fue inhibida.
RESULTADOS
75
a)
1.0 1.34 1.0 0.911.0 0.25
siARN: C p110 C p110
Blot: p110 Blot: p110
C p110
p110
Blot: p110
Erk
C p110
Blot: p85 Reguladora
1.0 1.04
p85
1.0 1.220.31 0.270.16 0.12
P-Vav
1.0 0.400.37 0.250.37 0.36
P-p38
p38
b)
1.0 0.510.07 0.040.13 0.01
siARN: C p110 C p110 C p110
P-Akt(Ser473)
Activación: N CD3 CD3+ICOS
P-Erk
1.0 4.500.13 0.790.11 0.10
Akt
Figura 18. Efecto del silenciamiento de la subunidad catalítica p110 de PI3-cinasa en la
coestimulación por ICOS.
a) Lisado de células SR.D10 transfectadas con siARN control (C) o siARN especifico para p110,
probadas por “inmunoblot” con anticuerpos específicos para cada subunidad. La DO del lisado celular
control fue tomada como referencia, con un valor igual a 1. Los datos son representativos de un
experimento realizado dos veces. b) Células SR.D10 transfectadas con siARN control o siARN de p110,
fueron activadas 10 min a 37ºC con esferas de poliestireno recubiertas con anti-CD3 (0,5 g/ml) (CD3) o
anti-CD3 mas anti-ICOS (5g/ml) (CD3+ICOS) o sin activar (N). Las células fueron lisadas y se realizó
“inmunoblot” con anticuerpos específicos para Akt fosforilado (P-Akt Ser473) o Erk fosforilado (P-Erk). La
carga de las proteínas fue corregida usando anticuerpo anti-Akt como referencia.
____________________________________________________________________________
RESULTADOS
76
Las células SR.D10 con siARN para p110 (p110) o con siARN control (C), fueron tratadas
(+) o no (-) con pervanadato durante 5 min (Figura 19 a), permitiendo la fosforilación de algunos
sustratos como ICOS, que posteriormente fueron inmunoprecipitados y analizados por
“inmunoblot” con anticuerpos específicos para cada una de las subunidades de PI3-cinasa. El
silenciamiento de p110 produce una inhibición parcial en la unión de esta subunidad a ICOS
fosforilado (Figura 19 b). Estos resultados explican la inhibición parcial de la activación de Akt
observada en la figura 18 b.
148
98
64
50
36
- +Pervanadato: + +
siARN: - C p110
a)
Blot: pTir
-
Lisados ICOS Precipitado
- +Pervanadato: + +
siARN: - C p110
b)
-
- + + +
- C p110-
1.0 0.84 0.77 0.84 0.00 0.11 0.19 0.27DO
Blot: Reguladora p85
p85
1.0 0.68 0.72 0.80 0.00 0.20 0.07 0.37DO
Blot: Catalítica p110
p110
1.0 1.21 0.58 0.06 0.00 1.35 1.58 0.67DO
Blot: Catalítica p110
p110
1.0 0.98 0.82 0.77 1.0 1.10 0.93 0.88DO
Blot: Erk Blot: ICOS
ICOS
ICOSErk
1.0 0.93 1.04 1.08 0.00 0.07 0.02 0.18DO
Blot: Catalítica p110
p110
Figura 19. Asociación de las subunidades de PI3-cinasa a inmunoprecipitados de ICOS expresado
en la superficie de células tratadas con siARN para la subunidad catalítica p110
Antes y después de la inducción de la fosforilación de proteínas intracelulares con pervanadato. a)
Comparación de la fosforilación en tirosinas de lisados de células SR.D10 con siARN de p110, tratadas
(+) o no tratadas (-) con pervanadato 5 min, determinado por “inmunoblot” con anticuerpo anti-
fosfotirosina. b) Co-precipitación de las subunidades de PI3-cinasa de clase IA en inmunoprecipitados con
ICOS, en células SR.D10 con siARN de p110, tratadas (+) o no (-) con pervanadato 5 min, determinado
por “inmunoblot” con anticuerpos específicos para cada subunidad. El valor de la DO de las diferentes
subunidades de PI3-cinasa tiene como referencia la DO del lisado que es igual a 1.
____________________________________________________________________________
También se estudió el efecto del silenciamiento de la subunidad catalítica p110, ya que
estudios previos habían determinado su importancia en la activación de los linfocitos T. Se
observó una clara inhibición en la expresión de p110 en las células tratadas con siARN p110
RESULTADOS
77
(Figura 20 a), mientras p10 y p110 cambiaron moderadamente. Cuando las células
transfectadas con siARN para p110 fueron activadas con anti-CD3 y anti-ICOS, la fosforilación
temprana de Akt fue inhibida y, en contraste con el silenciamiento de p110, la fosforilación de
Erk sí es inhibida (Figura 20 b). La subunidad reguladora no se ve afectada con el
silenciamiento de las subunidades catalíticas de PI3-cinasa p110 y p110.
a) siARN:
1.0 0.35
C p110
p110
Blot: p110
Erk
1.0 1.57
Blot: Erk
C p110
Blot: p110
1.0 1.43
C p110
Blot: p110
C p110
Blot: p85 Reguladora
p85
1.0 1.02
1.0 0.460.08 0.040.14 0.01
siARN: C p110 C p110 C p110
P-Akt(Ser473)
Activación: N CD3 CD3+ICOSb)
P-Erk
1.0 0.450.21 0.020.00 0.00
Akt
Figura 20. Efecto del silenciamiento de la subunidad catalítica p110 de PI3-cinasa en la
coestimulación por ICOS.
a) Lisado de células SR.D10 transfectadas con siARN control (C) o siARN especifico para p110,
probadas por “inmunoblot” con anticuerpos específicos para cada subunidad. La DO del lisado celular
control fue tomada como referencia, con un valor igual a 1. Los datos son representativos de un
experimento realizado dos veces. b) Células SR.D10 transfectadas con siARN control o siARN de p110,
fueron activadas 10 min a 37ºC con esferas de poliestireno recubiertas con anti-CD3 (0,5 g/ml) (CD3) o
anti-CD3 mas anti-ICOS (5g/ml) (CD3+ICOS) o sin activar (N). Los lisados celulares fueron analizados
mediante “inmunoblot” con anticuerpos específicos para Akt fosforilado (P-Akt Ser473) o Erk fosforilado (P-
Erk). La carga de las proteínas fue corregida usando anticuerpo anti-Akt como referencia.
____________________________________________________________________________
También se estudio el efecto del silenciamiento de ambas subunidades catalíticas
(p110+p110) de PI3-cinasa en las señales tempranas de Akt y Erk. Para esto, las células
SR.D10 transfectadas con siARN control (C) y con ambos siARN (p110), fueron activadas
RESULTADOS
78
con anti-CD3 y anti-CD3 mas anti-ICOS. Se observó por “inmunoblot” la disminución clara en
los niveles de expresión de las dos subunidades catalíticas p110 y p110, mientras los niveles
de la subunidad reguladora p85 y p50 no se vieron alterados, los niveles de p110 aumentaron
(Figura 21 a).
La activación temprana de Akt y Erk (P-Akt, P-Erk) por anti-CD3 o anti-CD3 mas anti-ICOS en
las células silenciadas para las dos subunidades fue inhibida, esto indica que el efecto del
silenciamiento de p110 en la inhibición de P-Erk es dominante frente al de p110 (Figura 21
b).
b)
siARN: C p110 C p110 C p110
P-Akt(Ser473)
Activación: N CD3 CD3+ICOS
P-Erk
1.0 0.270.1 0.050.0 0.0
Erk
1.0 0.290.23 0.060.20 0.02
a)
DO p50
DO p85
Erk
1.0 0.38
p110
p110
1.0 2.02
1.0 0.39
p110
92
67
59
p85
p50
1.0 0.97
1.0 1.12
siARN: C p110
siARN: C p110
siARN: C p110
siARN: C p110
siARN: C p110
1.0 1.09
Figura 21. Efecto del silenciamiento de ambas subunidades catalíticas p110y p110 de PI3-cinasa
en la coestimulación por ICOS.
a) Lisado de células SR.D10 transfectadas con siARN control (C) o con los dos siARN (p110, probadas
por “inmunoblot” con anticuerpos específicos para cada subunidad. La DO del lisado celular control fue
tomada como referencia, con un valor igual a 1. b) Células SR.D10 transfectadas con siARN control o con
los dos siARN de p110y p110, fueron activadas 10 min a 37ºC con esferas de poliestireno recubiertas
con anti-CD3 (0,5 g/ml) (CD3) o anti-CD3 mas anti-ICOS (5g/ml) (CD3+ICOS) o sin activar (N). Las
células fueron lisadas y analizadas mediante “inmunoblot” con anticuerpos específicos para Akt fosforilado
(P-Akt Ser473) o Erk fosforilado (P-Erk). La carga de las proteínas fue corregida usando anticuerpo anti-
Erk como referencia.
____________________________________________________________________________
RESULTADOS
79
4.2.2 Papel de las subunidad catalítica p110 en la coestimulación por ICOS
Para evaluar más a fondo el efecto de las subunidades catalíticas de PI3-cinasa en la
coestimulación por ICOS se utilizaron inhibidores farmacológicos frente a cada una de las
subunidades. Células SR.D10 fueron activadas durante 4-5 h con esferas de poliestireno
recubiertas con anti-CD3 (1 g/ml) mas anti-ICOS (5 g/ml) o con un anticuerpo control en
presencia o ausencia de inhibidores específicos para PI3-cinasa. Posteriormente en los
sobrenadantes de cultivo se determinó por ELISA la producción de IL-4 e IL-10 (Figura 22).
Anti-CD3
Anti-CD3+Anti-ICOS
IL-4
n
g/m
l
0
20
40
60
80
100
120SR.D10
Inhibidor
(M)
b)a)
Inhibidor
IL-4
ng
/ml
0
10
20
30
40
* ** * * *
SR.D10
Blastos T CD4+
IL-4
ng
/ml
0
20
40
60
80
100
120
Inhibidor
(M)
c) d)
IL-1
0 n
g/m
l
0
4
8
12
16
20
(M)
Blastos T CD4+
Inhibidor
Figura 22. Efecto de inhibidores farmacológicos en la secreción de IL-4 o IL-10 inducida por la
coestimulación con ICOS en SR.D10 y blastos de linfocitos T CD4+.
a) Sobrenadantes de células SRD.10 activadas con esferas de poliestireno recubiertas de anticuerpos
anti-CD3 (barras amarillas) o anti-CD3 más anti-ICOS (barras azules); en presencia de inhibidores
específicos para las subunidades catalíticas p110 (PIK-75) p110 (TGX-221), p110 (Inh II), p110
(IC87114) o en ausencia (DMSO) fueron analizados por ELISA para la producción de IL-4. b)
Sobrenadantes de células SRD.10 activadas con esferas de poliestireno recubiertas de anticuerpos anti-
CD3 (barras amarillas) o anti-CD3 más anti-ICOS (barras azules); en presencia de inhibidores específicos
para las subunidades catalíticas de PI3-cinasa y para la cinasa Akt (Inh IV, V) o sin inhibidores (DMSO)
RESULTADOS
80
fueron analizados para producción de IL-4 por ELISA. c) y d) Sobrenadantes de blastos ICOS+ de
linfocitos T CD4+ de ratón activados con esferas de poliestireno recubiertas de anticuerpos anti-CD3
(barras amarillas) o anti-CD3 más anti-ICOS (barras azules); en presencia de inhibidores específicos para
las subunidades catalíticas y para la cinasa Akt (Inh IV, V) o en ausencia de inhibidores (DMSO) fueron
analizados por ELISA para producción de IL-4 (c) o de IL-10 (d). Los niveles de IL-4 o IL-10 de células sin
activar estaban por debajo del límite de detección y no se representan en la figura. Media ± ES de
triplicados de un experimento realizado dos veces con resultados similares.
____________________________________________________________________________
EL inhibidor general de PI3-cinasa LY294002, inhibió la secreción de IL-4 inducida por la
activación TCR/CD3 y por la coestimulación con ICOS. También los inhibidores específicos
para la subunidades catalíticas p110 (PIK-75) y p110 (IC87114) inhibieron la secreción de IL-
4 en este sistema, a diferencia de los inhibidores de p110 (TGX221) y de p110, que no
causaron un efecto significativo en la producción de IL-4 en células SR.D10 (Figura 22 b) o de
IL4 e IL-10 en blastos ICOS+ de linfocitos T CD4
+ de bazo (Figura 21 c.d). Inhibidores de la
cinasa Akt, inhibieron claramente la secreción de IL-4 e IL-10 (Figura 22 b.c.d).
El efecto de inhibidores farmacológicos específicos para las subunidades catalíticas p110 y
p110 de PI3-cinasa en las señales tempranas de fosforilación de Akt y Erk también fueron
analizados. Para esto, células SR.D10 fueron activadas con anticuerpos anti-CD3 o anti-CD3
más anti-ICOS en presencia o ausencia de inhibidores (Figura 23). El inhibidor de p110
IC87114 inhibe eficazmente la fosforilación de Akt inducida por CD3 o CD3 más ICOS,
mientras que la fosforilación de Erk fue más resistente al efecto del inhibidor. Al igual que el
inhibidor de p110, el inhibidor de p110 PIK-75 inhibe la fosforilación de Akt y la fosforilación
de Erk, resultado contrario al observado con células silenciadas en la subunidad p110, donde
la fosforilación de Erk aumentó. Esto demuestra que la pérdida de la expresión de la subunidad
catalítica p110 o p110 de PI3-cinasa en las células silenciadas genera un desequilibrio en
PI3-cinasa y en las señales diana de la coestimulación por ICOS. En cambio, el uso de
inhibidores provoca un efecto en la actividad de la subunidad, no en su abundancia.
RESULTADOS
81
0 5 10 20 5 10 20 5 10 20
- p110 p110Inhibidor:
CD3 Activación:
P-Erk
Akt
P-Akt
0 5 10 20 5 10 20 5 10 20 min
- p110 p110
CD3+ICOS
P-Akt
0 5 10 15 20 25
0
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
Tiempo (min)
Den
sid
ad
Óp
tica (
UA
)
P-Erk
0 5 10 15 20 25
0
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
Tiempo (min)
Den
sid
ad
óp
tica (
UA
)
Figura 23. Efecto de inhibidores farmacológicos en las señales tempranas de Akt y Erk inducidas
por la coestimulación con ICOS en células SR.D10.
Células SR.D10 fueron activadas con anticuerpo anti-CD3 (0,5 g/ml) (CD3) o anti-CD3 mas anti-ICOS
(5g/ml) (CD3+ICOS) a diferentes tiempos ( 0, 5, 10 y 20 min); en ausencia (-) o presencia de inhibidores
para las subunidades catalíticas p110 (PIK-75, 1 M) o p110 (IC87114, 5 M) de PI3-cinasa y
analizados mediante “inmunoblot” con anticuerpos específicos para Akt (P-Akt) o Erk (P-Erk). La carga de
las proteínas fue corregida usando anticuerpo anti-Akt como referencia. Se representa el valor de la
densidad óptica de P-Akt y P-Erk en la parte inferior de la figura, las células activadas con anti-CD3 con
símbolos abiertos y las células activadas con anti-CD3 mas anti-ICOS con símbolos cerrados; en
presencia del inhibidor para p110 (círculos), o para p110 (cuadrados) o en ausencia de inhibidores
(triángulos). UA: unidades arbitrarias. Los datos son representativos de un experimento realizado 2 veces.
____________________________________________________________________________
4.2.2.1 Efecto diferencial de inhibidores de p110 en la producción de IFN- y la
fosforilación de Akt
Estudiamos la producción de citocinas y la fosforilación de AKT y Erk en blastos de células T
CD4+. Para observar mejor en estas células la producción de citocinas tras de un estímulo por
anticuerpos anti-CD3 o anti-CD3 más anti-ICOS, realizamos activaciones de 20-24h. Sin
embargo, como se verá más adelante, a estos tiempos se veía comprometida la viabilidad de
las células con las concentraciones de inhibidores de p110 usadas previamente. Por ello
empleamos concentraciones menores de inhibidor que en los ensayos de activación para
RESULTADOS
82
“inmunoblot”. A las concentraciones empleadas, dos inhibidores de p110 (PIK-75 y A66) no
tuvieron efecto significativo sobre la producción de IL-4 o IL-10 inducida por anti-CD3 y anti-
ICOS, pero inhibieron significativamente la producción de IFN-, y ligeramente la producción de
IL-2 (Figura 24). El inhibidor de p110 (IC87114) se empleó a la misma concentración usada en
ensayos anteriores, y suprimió la producción de todas las citocinas excepto IL-10. Por tanto,
parece que la síntesis de IFN- es especialmente sensible a la inhibición de la subunidad
catalítica de PI3-cinasa p110.
IL-2
0
50
100
150
200
250
ng
/ml
CD3
ICOS
-
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
IL-10
0
2000
4000
6000
CD3
ICOS
-
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
a)
c)
IL-4
0
50
100
150
200
250
300
CD3
ICOS
-
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
ng
/ml
IFN-
0
200
400
600
800
1000
1200
CD3
ICOS
-
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
ng
/ml
b)
d)
Figura 24. Efecto de la inhibición de las subunidades catalíticas p110 y p110 en la secreción de
IL-2, IL-4, IL-10 o IFN- inducida por la coestimulación con ICOS en blastos de linfocitos T CD4+.
Sobrenadantes de blastos de linfocitos T CD4+ activados en placa con anticuerpos anti-CD3 (10 g/ml) o
anti-CD3 mas anti-ICOS (20 g/ml); en presencia de inhibidores específicos para las subunidades
catalíticas p110 (PIK-75, 0,01 M; A66, 1 M) y p110 (IC87114, 5 M) fueron analizados por ELISA
para la producción de citocinas. a) IL-2. b) IL-4. c) IL-10. d) IFN-. Media ± ES de triplicados de un
experimento realizado dos veces con resultados similares.
____________________________________________________________________________
RESULTADOS
83
Ensayamos también el efecto en blastos de inhibidores de PI3-cinasa sobre vías de activación
temprana que son dianas muy directas (Akt/PKB) o indirectas (Erk) de la actividad de PI3-
cinasa (Figura 25).
P-Akt (Thr308)
P-Akt (Ser473)
Akt
CD3
ICOS
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
P-Erk
Erk
Activación:
Inhibidor: ---
Figura 25. Efecto de la inhibición de PI3-cinasa en las señales tempranas de Akt y Erk inducidas
por la coestimulación con ICOS en blastos de linfocitos T CD4+.
Blastos de linfocitos T CD4+ fueron activados durante 20 minutos con esferas recubiertas con anticuerpo
anti-CD3 (10 g/ml) o anti-CD3 mas anti-ICOS (20 g/ml) en ausencia (-) o presencia de inhibidores para
las subunidades catalíticas de PI3-cinasa p110 (A66, 1 M) o p110 (IC87114, 5 M) o para todas las
subunidades (LY294002, 10 M) y analizados mediante “inmunoblot” con anticuerpos específicos para Akt
(P-Akt Ser473 y P-Akt Thr308) o Erk (P-Erk). La carga de las proteínas fue corregida usando anticuerpo
anti-Akt o anti-ERK como referencia. Los datos son representativos de un experimento realizado 2 veces.
____________________________________________________________________________
La fosforilación de la Treonina 308 de Akt es dependiente de la cinasa PDK1, cuya activación a
su vez es directamente dependiente de la actividad PI3-cinasa. Esta fosforilación es inhibida
eficientemente por inhibidores de p110 (A66), p110 (IC87114), o de todas las isoformas
(LY294002). La fosforilación de Akt en la Serina 473 depende del complejo mTORC2 y también
es iniciado por las PI3-cinasas(Chi 2012). A las concentraciones usadas, la fosforilación de Akt
inducida por anti-CD3 y anti-ICOS es inhibida parcialmente por el inhibidor de p110 (A66), y
totalmente por el de p110, o por LY294002. La producción de IFN- parece en gran medida
dependiente de la activación de Akt en la Serina 473 (Chi 2012), y en nuestro caso el grado de
inhibición de la síntesis de IFN- se correlaciona bien con la inhibición de la fosforilación de Akt
RESULTADOS
84
en esta Serina. En el caso de la fosforilación de Erk, ni la inhibición de p110 ni la de p110
tienen efecto aisladamente. Estos resultados están de acuerdo con la resistencia a la inhibición
de Erk que habíamos observado para los inhibidores de p110 y p110 en la línea SR.D10 (ver
figura 23). Sin embargo, la inhibición por LY294002 muestra que, a pesar de todo, la activación
de Erk es dependiente de PI3-cinasas, como habíamos mostrado previamente en la
coestimulación por ICOS en células de la línea SR.D10 (Feito et al. 2003).
4.2.3 Papel de la subunidad catalítica p110 en la coestimulación por CD28 y en la
viabilidad celular
Los datos existentes empleando mutantes o inhibidores de p110 muestran claramente la
importancia de esta subunidad en la activación antigénica de linfocitos T y en la coestimulación
por CD28 o ICOS (ver (Acosta et al. 2011, Ji et al. 2007, Soond et al. 2010), y las figuras
anteriores). Sin embargo, como se ha mostrado anteriormente, la asociación preferente de las
subunidades catalíticas p110 a las subunidades reguladoras de PI3-cinasa no es específica
de la región citoplasmática de ICOS, y también pudimos observarla asociada a un péptido de
CD28 fosforilado en su motivo YxxM. Por ello nos propusimos analizar el papel de p110 en la
activación de linfocitos T y en la coestimulación por CD28. Nos centramos en la activación de
linfocitos T “naive”, CD4+ CD62L
+, ya que su activación es fuertemente dependiente de CD28.
Los resultados iniciales mostraron que, a concentraciones de 1-0,1 M, el inhibidor de p110
PIK-75 inhibía completamente la proliferación a tres días y la producción de citocinas como IL-2
o IFN- de estos linfocitos inducida por anti-CD3 y anti-CD28 (Figura 26). Sin embargo,
observamos que esta inhibición estaba acompañada por una fuerte pérdida de viabilidad en las
células a partir de las 24 horas de cultivo.
RESULTADOS
85
a)
CD3
CD3+CD28
CD3+CD28 + p110 Inhibidor
CD3+CD28 + p110 Inhibidor
0 1 10
0
20
40
60
80
Anti-CD3 (g/ml)
Célu
las/m
l x 1
0-4
Anti-CD3:Anti-CD28:
p110 Inhibidor:p110 Inhibidor:
0
10
20
30
40
50
60
70IL-2
ng
/ml
- + ++ +
- - -- +- - ++ +
- - +- -
0
20
40
60
80
100
120IFN-
ng
/ml
- + ++ +
- - -- +- - ++ +
- - +- -
b)
Figura 26. Efecto de la inhibición de la subunidad p110 en la coestimulación por CD28 y en la
viabilidad celular.
Linfocitos T CD4+ “naive” activados con anticuerpo anti-CD3 o anti-CD3 más anti-CD28 soluble (2,5 g/ml)
en presencia de inhibidores de las subunidades catalíticas de PI3-cinasa p110 (PIK-75, 1 M) y p110
(IC87114, 5 M). a) Viabilidad celular determinada por exclusión con azul de Tripán. b) Producción de
citocinas (IL-2, IFN-). Media ± ES de triplicados de un experimento realizado dos veces con resultados
similares.
____________________________________________________________________________
Para conocer más a fondo el papel de la subunidad catalítica p110 en la viabilidad y la muerte
celular de linfocitos T mediada por CD28, se aislaron linfocitos T CD4+ “naive” de ratón, y se
activaron con anti-CD3 mas anti-CD28 o con anti-CD3 mas IL-7, durante 24 horas en presencia
de inhibidores farmacológicos de las subunidades catalíticas p110 y p110. Transcurrido este
periodo, se observó la apoptosis con Anexina FITC/Ioduro de Propidio. En la figura 27, se
observa una disminución notable en el porcentaje de células vivas al usar el inhibidor de p110
(PIK-75), en comparación con el inhibidor de p110.
RESULTADOS
86
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
0.5 16.830.352.3
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
6.0 39.551.82.6
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
0.8 17.835.346.0
Iod
uro
de p
rop
idio
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
1.6 6.010.581.7
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
8.4 29.152.310.0
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
1.1 13.119.965.9
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
1.5 6.714.377.4
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
1.7 30.561.16.7
Anexina V-FITC
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
1.0 8.918.072.1
DMSO p110 (PIK-75, 0,1 M) p110 (IC87114, 5 M
DMSO p110 (PIK-75, 0,1 M) p110 (IC87114, 5 M)
DMSO p110 (PIK-75, 0,1 M) p110 (IC87114, 5 Ma)
Anexina V-FITC Anexina V-FITC
Iod
uro
de p
rop
idio
Iod
uro
de p
rop
idio
Iod
uro
de p
rop
idio
Anexina V-FITC Anexina V-FITC Anexina V-FITC
Iod
uro
de p
rop
idio
Iod
uro
de p
rop
idio
Iod
uro
de p
rop
idio
Anexina V-FITC Anexina V-FITC Anexina V-FITC
Iod
uro
de p
rop
idio
Iod
uro
de p
rop
idio
b)
c)
Figura 27. Apoptosis de linfocitos T CD4+ inducida por inhibidores de PI3-cinasa.
Linfocitos T CD4+ a) Sin activar. b) Activados con anti-CD3 (20 g/ml) mas Anti-CD28 (2,5 g/ml). c)
Activados con anti-CD3 (20 g/ml) mas IL-7 (1 ng/ml) en presencia de inhibidores de p110 (PIK-75, 0,1
M) y de p110 (IC87114, 5 M) o sin inhibidores (DMSO), fueron incubados 24h y posteriormente
teñidos con Anexina FITC/Ioduro de Propidio.
____________________________________________________________________________
El papel de PI3-cinasa p110 fue examinado de nuevo empleando concentraciones más bajas
de PIK-75, y otro inhibidor disponible recientemente (A66) altamente selectivo para p110. En
la figura 28 se muestra la inhibición de la proliferación de linfocitos T CD4+ “naive” inducida por
anti-CD3 y anti-CD28. Se observa también que la inhibición es aún más profunda en la
RESULTADOS
87
producción de citocinas como IFN-. Inhibidores específicos de p110 (IC87114) y generales de
PI3-cinasas (LY294002) (Figura 28) también inhibieron efectivamente la proliferación y la
producción de IFN- de estas células, mientras que inhibidores de p110 no tuvieron efecto (no
mostrado).
O
.D. 540 n
m
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
CD3
CD28
-
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
0
2
4
6
8
10
IFN
-, n
g/m
l
CD3
CD28
-
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
a) b)
Figura 28. Efecto de la inhibición de la subunidad p110 en la proliferación celular y en la
producción de IFN-.
Los linfocitos T CD4+ “naive” fueron activados con anticuerpo anti-CD3 (10 g/ml) adsorbido a placa y
anti-CD28 soluble (2,5 g/ml) en presencia de inhibidores para las subunidades catalíticas p110 (PIK-75
0,01 M; A66, 1 M), p110 (IC87114, 5 M) o todas las subunidades (LY294001, 10 M). a) Proliferación
celular medida por un ensayo colorimétrico con MTT. b) Producción de IFN-
____________________________________________________________________________
4.2.4 Importancia de la subunidad catalítica p110 de PI3-cinasa en la supervivencia de
linfocitos T
La inhibición de p110 demuestra la importancia de esta subunidad en la supervivencia de
linfocitos T CD4+, por lo que decidimos comprobar si este efecto se mantenía al silenciar esta
subunidad. Para esto, linfocitos T CD4+ “naive” fueron nucleofectados con siARN control,
siARN para p110 y siARN para p110, e incubados a diferentes tiempos (24, 48, 72 horas),
analizando la viabilidad celular después de este periodo.
En la figura 29a, se observa que las células con siARN para p110 tienen una menor viabilidad
en comparación con los otros grupos.
También se analizó la apoptosis por tinción con Anexina FITC/Ioduro de Propidio (Figura 29 b).
A las 24 horas de incubación, se observó diferencia en el porcentaje de células vivas (A-/IP-):
las células control y las “knockdown” para la subunidad p110 representaron un 43-45%, frente
a un 35% de células vivas “knockdown” para la subunidad p110. El uso de inhibidores y el
RESULTADOS
88
silenciamiento de la subunidad catalítica p110 demuestran la importancia de esta subunidad
en la supervivencia de linfocitos T.
b)
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
0.5 29.2
27.143.1
Control
Iod
uro
de P
rop
idio
Anexina-FITC
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
1.1 39.6
24.135.1
siARN: p110
Iod
uro
de P
rop
idio
Anexina-FITC10
010
110
210
310
4
100
101
102
103
104
1.2 32.0
21.745.1
siARN: p110
Iod
uro
de P
rop
idio
Anexina-FITC
12 24 36 48 60 72 84
0.00
0.25
0.50 siARN Control
siARN p110
siARN p110
Tiempo (horas)
Célu
las/C
ult
ivo
x 1
06
a)
Figura 29. Papel del silenciamiento de las subunidades catalíticas p110 y p110 de PI3-cinasa en
la supervivencia de linfocitos T.
Los linfocitos T CD4+ fueron nucleofectados con siARN (2 M) para p110, p110 y un siARN control, se
incubaron durante 24, 48 y 72 horas. Se analizó: a) Viabilidad celular por exclusión con azul de Tripán. b)
Apoptosis a las 24 horas por tinción con Anexina FITC/Ioduro de Propidio.
___________________________________________________________________________
Para saber si la importancia de la subunidad p110 en la supervivencia de linfocitos T CD4+
encontrada hasta el momento, se mantenía en las células SR.D10 y además si Akt, NFB y
otras subunidades de PI3-cinasa estaban implicadas, se incubaron células SR.D10 activadas
con IL-2 (Figura 30) o sin activar (Figura 31), en presencia de inhibidores de las diferentes
subunidades catalíticas de PI3-cinasa (p110, p110, p110, p110), inhibidores de Akt o
inhibidores de NFB durante 24 horas, para ser teñidas posteriormente con Anexina
FITC/Ioduro de Propidio y analizadas por citometría de flujo.
RESULTADOS
89
Tanto en las células activadas como en las células no activadas, se observa una muerte celular
significativa inducida por los inhibidores de p110, Akt y NFB, al compararlas con las células
control (DMSO); la viabilidad celular medida por la exclusión con azul de Tripán comprueba
este efecto (Figuras 30 h, 31 h).
Iod
uro
de P
rop
idio
DMSO
Anexina-FITC
Iod
uro
de P
rop
idio
100
101
102
103
10
100
101
102
103
104
1.5 0.40.597.6
a)
p110
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
21.940.09.128.9
4
Anexina-FITC
Iod
uro
de P
rop
idio
b)
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
2.9 4.87.384.9
p110
Anexina-FITC
Iod
uro
de P
rop
idio
c)
d)
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
3.2 4.16.086.7
Anexina-FITC
Iod
uro
de P
rop
idio
e)
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
10.420.7
6.762.1
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
3.6 2.63.490.2
p110
Anexina-FITC
p110 Akt
Anexina-FITC
Iod
uro
de P
rop
idio
f)
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
27.748.7
6.716.8
IKK
Anexina-FITC
Iod
uro
de P
rop
idio
g) h)
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Célu
las/C
ult
ivo
x 1
0-6
Inhibidor
Figura 30. La supervivencia de células SR.D10 activadas con IL-2 es dependiente de p110, Akt y
NFB.
Células SR.D10 fueron activadas con IL-2 durante 24 horas, en presencia o ausencia de inhibidores: a)
DMSO. b) Inhibidor p110 (PIK-75, 0,1 M). c) Inhibidor p110 (TG221, 1 M). d) Inhibidor p110
(Inhibidor II, 12 M). e) Inhibidor p110 (IC87114, 5 M). f) Inhibidor Akt (Triciribine, 5 M). g) Inhibidor
NFB (Wedelactone IKK, 60 M). La apoptosis fue medida por citometría de flujo con la tinción de
Anexina FITC/Ioduro de Propidio. h) Viabilidad celular medida por exclusión con azul de Tripán.
____________________________________________________________________________
RESULTADOS
90
Anexina-FITC
DMSO
Iod
uro
de P
rop
idio
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
3.9 6.02.687.4
a)p110
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
25.7 31.18.334.8
Iod
uro
de P
rop
idio
Anexina-FITC
b)
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
3.1 6.64.186.1
p110
Iod
uro
de P
rop
idio
Anexina-FITC
c)
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
4.9 2.62.390.0
p110
Iod
uro
de P
rop
idio
Anexina-FITC
d)
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
4.1 4.03.588.3
Anexina-FITC
p110
Iod
uro
de P
rop
idio
e)
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
37.7 27.3
8.626.3
Akt
Anexina-FITC
Iod
uro
de P
rop
idio
f)
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
35.6 42.1
4.917.3
IKK
Anexina-FITC
Iod
uro
de P
rop
idio
g)
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Célu
las/C
ult
ivo
x 1
0-6
Inhibidor
h)
Figura 31. La supervivencia de células SR.D10 sin activar es dependiente de p110, Akt y NFB.
Células SR.D10 sin activar fueron incubadas durante 24 horas, en presencia o ausencia de inhibidores: a)
DMSO. b) Inhibidor p110 (PIK-75, 0,1 M). c) Inhibidor p110 (TG221, 1 M). d) Inhibidor p110
(Inhibidor II, 12 M). e) Inhibidor p110 (IC87114, 5 M). f) Inhibidor Akt (Triciribine, 5 M). g) Inhibidor
NFB (Wedelactone IKK, 60 M). La apoptosis fue medida por citometría de flujo con la tinción de
Anexina FITC/Ioduro de Propidio. h) Viabilidad celular medida por exclusión con azul de Tripán.
____________________________________________________________________________
RESULTADOS
91
4.2.4.1 La muerte celular inducida por el inhibidor de p110 es dependiente de caspasas
en linfocitos T CD4+
En el mecanismo molecular que controla la apoptosis intervienen caspasas y como se ha
dicho, el inhibidor de p110 induce apoptosis en linfocitos T. Para saber si este efecto es
dependiente de caspasas, linfocitos T CD4+ se incubaron durante 20 horas con el inhibidor de
p110 (PIK-75) en presencia o ausencia del inhibidor general de caspasas (Z-VAD-fmk) (Figura
32).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
DMSO ZVAD-fmk PIK-75 p110
PIK-75 ZVAD-fmk
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
DMSO ZVAD-fmk PIK-75 p110
PIK-75 ZVAD-fmk
DMSO
Z-VAD-fmk
0 20 20
0
20
40
60
80
100
- - +
Tiempo (h)
PIK-75
% C
élu
las v
ivas
d)
0 20 20
0
20
40
60
80
100
- - +PIK-75
% C
élu
las v
ivas
c)
A- / PI+
A+ / PI+
A+ / PI-
A- / PI-
Linfocitos T CD4+ Células SR.D10
% C
élu
las
% C
élu
las
a) b)
Figura 32. Efecto de la inhibición de la subunidad p110 en la apoptosis y la viabilidad de
linfocitos T CD4+ y células SR.D10.
Las células se incubaron durante 20 horas con DMSO o con el inhibidor de p110 (PIK-75, 0,1 M) o el
inhibidor de caspasas (Z-VAD-fmk, 50 M) o los dos inhibidores Z-VAD-fmk + PIK-75. a) % de linfocitos T
CD4+ en las distintas fases del proceso de apoptosis. b) Apoptosis en SR.D10. c) Viabilidad celular en
linfocitos T CD4+. d) Viabilidad celular en SR.D10. La apoptosis fue medida por citometría de flujo con la
tinción de Anexina FITC/Ioduro de Propidio y la viabilidad celular por exclusión con azul de Tripán.
____________________________________________________________________________
Se puede observar la apoptosis inducida por PIK-75 y cómo se revierte este efecto al inhibir la
actividad de las caspasas con Z-VAD-fmk (Figura 32 a); la viabilidad celular aumenta al añadir
el inhibidor de caspasas a las células tratadas con PIK-75 (Figura 32 c). Pero, al inducir la
muerte con PIK-75 en células SR.D10 y tratarlas con el inhibidor de caspasas durante 20h, no
RESULTADOS
92
se revierte la apoptosis (Figura 32 b) en comparación con la apoptosis inducida en los linfocitos
T CD4+; tampoco aumenta la viabilidad celular al añadir Z-VAD-fmk en las células SR.D10
(Figura 32 d). Esto indica que la muerte celular inducida por PIK-75 es dependiente de
caspasas en linfocitos T CD4+ pero no en la línea celular Th2 SR.D10.
También encontramos que la apoptosis de linfocitos T CD4+ inducida por el inhibidor de Akt y el
inhibidor de NFB es dependiente de caspasas (Figura 33). Como se puede observar la
apoptosis de linfocitos T CD4+ disminuye al añadir Z-VAD-fmk, cuando ha sido inducida por el
inhibidor de Akt o por el inhibidor de NFB.
% C
élu
las
a) b)
% C
élu
las
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
DMSO ZVAD-fmk Triciribine Akt
Akt ZVAD-fmk
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
DMSO ZVAD-fmk IKK NFkB IKK ZVAD-fmk
A- / PI+
A+ / PI-
A- / PI-
A+ / PI+
Figura 33. La apoptosis inducida por el inhibidor de NFB y de Akt en linfocitos T CD4+ es
dependiente de caspasas.
Los linfocitos T CD4+ se incubaron durante 20 horas con DMSO o inhibidores, en presencia o ausencia
del inhibidor de caspasas Z-VAD-fmk. a) Inhibidor de Akt (Triciribine, 5 M). b) Inhibidor NFB
(Wedelactone IKK, 60 M). La apoptosis fue medida por citometría de flujo con la tinción de Anexina
FITC/Ioduro de Propidio.
____________________________________________________________________________
Como encontramos que en células SR.D10 la apoptosis inducida por el inhibidor de la
subunidad catalítica p110 es un proceso independiente de caspasas, decidimos comprobar si
este proceso de muerte celular era debido a autofagia (muerte celular de tipo II). Para esto,
células SR.D10 se incubaron durante 24 horas con el inhibidor de p110 (PIK-75) en presencia
o ausencia del inhibidor de autofagia (3-MA). Se pudo observar que la muerte celular inducida
por PIK-75 no es por autofagia, ya que la adición del inhibidor 3-MA a las células tratadas con
PIK-75 no mejoró la viabilidad de los cultivos tratados con dicho inhibidor de p110 (Figura 34).
RESULTADOS
93
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5DMSO
3-MA
Inhibidor
Célu
las/C
ult
ivo
x10 6
Figura 34. La muerte celular inducida por el inhibidor de p110en células SR.D10 no es un
proceso autofágico.
Las células SR.D10 se incubaron durante 24 horas con DMSO, con el inhibidor general de PI3-cinasa
(LY294002, 10 M) o con el inhibidor de p110 (PIK-75, 0,1 M) en presencia (barras azules) o ausencia
(barras verdes) del inhibidor de autofagia (3-MA, 100 M). Posteriormente se analizó la viabilidad celular
por exclusión con azul de Tripán.
____________________________________________________________________________
4.3 CAMBIOS MORFOLÓGICOS EN LINFOCITOS T INDUCIDOS POR ICOS
Se ha demostrado que la ligación de CD28, CTLA-4, o ICOS induce cambios en el
citoesqueleto de actina en células T. CD28 induce acumulación de actina en el sitio de contacto
célula/APC dependiente de la GTPasa Cdc42 (Tskvitaria-Fuller et al. 2006), elongación celular
acompañada de la formación de estructuras lamelipodia y “microspikes” que requieren de la
actividad de la familia Src cinasa, la localización en membrana Vav GEF, el adaptador de SLP-
76, la activación de GTPasas, la polimerización de actina y la formación de adhesiones focales
dependientes de las GTPasas Rac1 y Cdc42 (Kaga et al. 1998).
La ligación de CTLA-4 o CD3/CTLA-4 aumenta la polarización celular y la formación de
estructuras lamelipodia, urópodo y filopodia dependiente de PI3-cinasa, de Vav1, de la GTPasa
Cdc42, y de la cinasa de la cadena ligera de la miosina (MLCK), pero no de Akt, de la GTPasa
RhoA, o de la cinasa Rho (Rock) (Wei et al. 2007). La reorganización y elongación del
citoesqueleto de actina y la formación de estructuras filopodia y “microspikes” inducidas por
ICOS depende de Vav, Rac, Cdc42, Rock y la cinasa activada por p21 (PAK); mientras que hay
datos a favor y en contra de la participación de la cinasa Akt (Franko & Levine 2009, Nukada et
al. 2006).
RESULTADOS
94
4.3.1 Elongación celular inducida por ICOS
Para conocer el mecanismo mediante el cual ICOS induce elongación y cambios en el
citoesqueleto de actina en células T, se estudió el papel de las diferentes PI3-cinasas de clase
IA, ya que los resultados obtenidos hasta el momento demuestran que estas cinasas son
esenciales en la coestimulación por ICOS.
La ligación de ICOS con anticuerpos anti-ICOS o con la proteína recombinante del ligando de
ICOS de ratón (B7-H2 Fc) induce elongación y cambios en el citoesqueleto de actina en células
SR.D10 (Figura 35).
PLL Anti-ICOS B7-H2/Fc
Anti-CD3 PLL+PMA
10 m
0 10 20 30 40
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
Tiempo (min)
Índ
ice d
e e
lon
gació
n
PLL
Anti-ICOS
0 10 20 30 40
0
10
20
30
40
Tiempo (min)Su
perf
icie
de c
on
tacto
(U
.A.)b)
a)
Figura 35. Elongación y cambios en el citoesqueleto de actina en células SR.D10.
a) Células SR.D10 incubadas durante 40 min en cubreobjetos recubiertos con anticuerpo anti-ICOS (10
g/ml), proteína de fusión del receptor de ICOS e inmunoglobulina (B7-H2/Fc, 10 g/ml), anticuerpos anti-
CD3 (10 g/ml), ésteres de forbol (PMA, 10 ng/ml) o con Poli-L-Lisina (PLL, 10 g/ml) según se indica en
la figura, y teñidas con faloidina-FITC. b) Tiempo de inducción de elongación (panel izquierdo) y aumento
de la superficie de contacto (panel derecho) en células SR.D10. Los asteriscos indican diferencias
significativas (p<0,05) determinadas por la prueba t de Student.
____________________________________________________________________________
RESULTADOS
95
Estos cambios celulares no se observaron al activar las células con otros estímulos como anti-
CD3 o PMA (Figura 35 a). El alargamiento celular es un proceso rápido, con un máximo a los
30-40 minutos de incubación, en comparación con un control de Poli-L-Lisina (Figura 35 b).
El efecto de elongación inducido solo por ICOS, se bloquea con el inhibidor de la subunidad
catalítica p110 PIK75 (Figura 36 a) o con un inhibidor general de PI3-cinasa (LY294002,). En
cambio, inhibidores específicos de otras subunidades de PI3-cinasa, incluyendo el inhibidor
específico de p110 que inhibía eficazmente la activación por TCR/CD3, no muestran efecto
significativo en este ensayo de elongación celular. El inhibidor de Lck también bloquea la
elongación, siendo Lck en las células usadas, el principal miembro de la familia Src-cinasa
(Figura 36 a). Por tanto, en este ensayo que depende únicamente de la ligación de ICOS con
anticuerpos anti-ICOS o con la proteína recombinante B7-H2/Fc (Figura 36 b), se observa una
dependencia de la subunidad catalítica p110, de acuerdo con su asociación preferente a
ICOS. También se observa que Akt no es esencial en la elongación inducida por ICOS, ya que
al usar inhibidores de Akt no se inhibe la elongación en las células SR.D10.
a)
1.0
1.5
2.0
2.5
**
Inhibidor
Índ
ice d
e e
lon
gació
n
PLL
Anti-ICOS
Inhibidor
Índ
ice d
e e
lon
gació
n
**
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
b)
Inhibidor
Ïnd
ice
de e
lon
gació
n
*
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
PLL
mB7-H2/Fc
Figura 36. Papel de PI3-cinasa, Lck y Akt en la elongación celular inducida por ICOS.
a) Elongación inducida con anticuerpo anti-ICOS o Poli-L-Lisina (PLL), en presencia de inhibidores de
PI3-cinasa (LY294002, 20 M) o de cada una de las subunidades catalíticas de PI3-cinasa (p110: PIK-
75, 1 M; p110: TGX-221, 1 M; p110: Inhibidor II, 12 M; o p110: IC87114, 5 M), de un inhibidor de
Akt (Triciribine, 5 M), de un inhibidor de Lck (inhibidor II, 200 nM) o en ausencia de estos, DMSO (---). b)
Elongación inducida por la proteína recombinante B7-H2/Fc o Poli-L-Lisina (PLL). La media ± ES del
índice de elongación es de un experimento realizado dos veces con resultados similares. Las diferencias
significativas en las células coestimuladas con ICOS (p≤0,05) fueron determinadas con la prueba t de
Student.
____________________________________________________________________________
RESULTADOS
96
Los resultados obtenidos demuestran que PI3-cinasa, en especial la subunidad catalítica
p110, es necesaria para inducir cambios morfológicos inducidos por ICOS, que son
independientes de la cinasa Akt. Para continuar determinando el mecanismo por el cual ICOS
induce elongación en las células estudiadas, decidimos evaluar el papel de Vav-1, ya que
estudios anteriores habían demostrado que la activación de PI3-cinasa dependiente de CD28,
permitía la unión de PIP3 al dominio PH de Vav-1 involucrado en la localización de Vav-1 en la
membrana, reclutando a su vez a miembros de la familia de las Rho GTPasas como Rac1 y
Cdc42 importantes en los cambios del citoesqueleto de actina. Para esto se transfectaron
células SR.D10 con el plásmido pEGFP-C2 (control) y el plásmido pEGFP-C2-Vav con un
mutante de Vav-1 que carece del dominio PH de unión a PI3-cinasa que actúa como dominante
negativo en linfocitos T (Zugaza y cols., 2002); posteriormente se estudio la elongación
inducida por ICOS (Figura 37). Tanto el índice de elongación como la superficie de contacto de
las células activadas por ICOS disminuyen significativamente al ser transfectadas con el
mutante de Vav-1 que carece del dominio PH en comparación con las células transfectadas
con el plásmido control, indicando la importancia de la unión de Vav-1 a los productos de la
PI3-cinasa para generar elongación celular inducida por ICOS.
a)
0,0001
1
2
3
*
Índ
ice d
e e
lon
gació
n
Anti-ICOS
PLL b)
Su
perf
icie
de c
on
tacto
(U
.A.)
0,0001
0
5000
10000
*
Anti-ICOS
PLL
Figura 37. Papel de Vav-1 en la elongación celular inducida por ICOS.
Las células SR.D10 fueron transfectadas con los plásmidos pEGFP-C2 (control) y pEGFP-C2-Vav
(mutante que carece del dominio PH de Vav-1) y posteriormente se incubaron sobre cristales recubiertos
con PLL o anti-ICOS (10 g/ml). Las células que expresan GFP fueron analizadas para: a) El índice de
elongación. b) La superficie de contacto celular. La media ± ES del índice de elongación y la superficie de
contacto es de un experimento realizado dos veces con resultados similares. Las diferencias significativas
en las células coestimuladas con ICOS (p≤0,05) fueron determinadas con la prueba t de Student. U.A.:
Unidades arbitrarias.
____________________________________________________________________________
Un gran número de proteínas de la familia Rho están involucradas en la regulación de la
organización del citoesqueleto de actina. Para saber si Vav-1, por medio de su actividad GEF,
RESULTADOS
97
esta activando a las Rho GTPasas involucrándolas en este cambio inducido por ICOS, se
transfectaron células SR.D10 con plásmidos dominantes negativos (DN) para cada uno de los
miembros de esta familia: pEGFP-RhoA DN, pEGFP-Cdc42 DN, pEGFP-Rac-1 DN y un
plásmido control (pEGFP). En las células transfectadas, con los DN para Rac-1 y Cdc42, se
observó una disminución significativa de la elongación inducida por anti-ICOS, en comparación
con las células transfectadas con el DN para RhoA (Figura 38 a) o con el plásmido control
pEGFP. Por lo tanto, la elongación celular inducida solamente por ICOS es independiente de
RhoA y dependiente de Rac-1 y Cdc42. Se observó una disminución no significativa en la
superficie de contacto celular de las células transfectadas con el DN para Cdc42 (Figura 38 b).
0,0007
1
2
3
*
Índ
ice d
e e
lon
gació
n
4
0,0004
*
Anti-ICOS
PLL
0
5000
10000
15000
20000
25000
Anti-ICOS
PLL
Su
perf
icie
de c
on
tacto
(U
.A.)
a) b)
Figura 38. Papel de las Rho GTPasas en la elongación celular inducida por ICOS.
Las células SR.D10 fueron transfectadas con un plásmido pEGFP-C2 (control) y plásmidos dominantes
negativos (pEGFP-RhoA DN, pEGFP-Cdc42 DN, pEGFP-Rac-1 DN), posteriormente se incubaron
sobre cristales recubiertos con PLL o anti-ICOS (10 g/ml). En las células que expresan GFP se analizó
a) índice de elongación. b) superficie de contacto. Las diferencias significativas en las células
coestimuladas con ICOS (p≤0,05) fueron determinadas con la prueba t de Student.
____________________________________________________________________________
La actina filamentosa se encuentra organizada y anclada a los diferentes complejos de
adhesión gracias a la activación de la miosina, producida por la fosforilación de su cadena
ligera MLC; las cinasas involucradas en este proceso son, la cinasa dependiente de Rho
(ROCK) activada por RhoA y la cinasa de cadena ligera de miosina (MLCK), activada por calcio
y calmodulina (CaM).
Para conocer la importancia de estas cinasas en la elongación celular inducida por ICOS, se
emplearon inhibidores específicos como el inhibidor de ROCK, H-1152 (1 M, 10 M); el
inhibidor de MLCK, ML-7 (2 M, 10 M); el inhibidor de la actividad ATPasa de la miosina que
permite la unión a actina, Blebbistatina (10 M50M); y el inhibidor de calmodulina, W-7 (50
M, 100 M). Las células tratadas con el inhibidor de ROCK H-1152 no presentaron inhibición
RESULTADOS
98
de la superficie de contacto celular ni de la elongación inducida por ICOS (Figura 39), esto
concuerda con los resultados encontrados al usar dominantes negativos de RhoA.
a)
1
b)
Anti-ICOS
PLL
2
3
Índ
ice d
e e
lon
gació
n
Inhibidor
0
5000
25000
Su
perf
icie
de c
on
tacto
(U
.A.)
20000
15000
10000
Inhibidor
Anti-ICOS
PLL
Figura 39. Papel de ROCK en la elongación celular inducida por ICOS.
Elongación inducida con anticuerpo anti-ICOS o Poli-L-Lisina (PLL), en presencia del inhibidor de ROCK
(H-1152, 1 M; 10 M) o en ausencia de este, DMSO (---). a) Índice de elongación. b) Superficie de
contacto celular. La media ± ES del índice de elongación y la superficie de contacto es de un experimento
realizado dos veces con resultados similares. Las diferencias significativas en las células coestimuladas
con ICOS (p≤0,05) fueron determinadas con la prueba t de Student.
____________________________________________________________________________
Al usar el inhibidor de MLCK, ML-7 se observa una disminución significativa en la elongación
celular inducida por ICOS; en la superficie de contacto celular se encuentra una pequeña
disminución que no es significativa al compararla con las células no tratadas. No se observó
inhibición de la superficie de contacto ni de la elongación en las células tratadas con
Blebbistatina, un inhibidor de actividad ATPasa de miosina (Figura 40).
El inhibidor de calmodulina, W-7, produce una disminución significativa de la elongación y de la
superficie de contacto celular en las células estudiadas, sugiriendo que algunos de estos
cambios morfológicos inducidos por ICOS son dependientes de la cinasa MLCK activada por
calmodulina (Figura 41).
RESULTADOS
99
a) b)Anti-ICOS
PLL
Anti-ICOS
PLL
0
5000
25000
Su
perf
icie
de c
on
tacto
(U
.A.)
20000
15000
10000
Inhibidor
1
2
4
Índ
ice d
e e
lon
gació
n
30,009
0,0001
**
Inhibidor
Figura 40. Papel de MLCK en la elongación celular inducida por ICOS.
Elongación inducida con anticuerpo anti-ICOS o Poli-L-Lisina (PLL), en presencia de un inhibidor de
MLCK (ML-7, 2 M; 10 M) y un inhibidor de la actividad ATPasa de miosina (Blebbistatina, 10 M; 50
M) o en ausencia de éstos (DMSO, (---)). a) Índice de elongación. b) Superficie de contacto celular.
Media ± ES del índice de elongación y la superficie de contacto es de un experimento realizado dos veces
con resultados similares. Las diferencias significativas en las células coestimuladas con ICOS (p≤0,05)
fueron determinadas con la prueba t de Student.
____________________________________________________________________________
1
a) b)
Anti-ICOS
PLL
Inhibidor
Anti-ICOS
PLL
Inhibidor
2
4
3
Índ
ice d
e e
lon
gació
n
0,0002
0,0001
*
*
0
5000
15000
Su
perf
icie
de c
on
tacto
(U
.A.)
10000
0,0001
0,0001
* *
Figura 41. Papel de calmodulina en la elongación celular inducida por ICOS.
Elongación inducida con anticuerpo anti-ICOS o Poli-L-Lisina (PLL), en presencia del inhibidor de
calmodulina (W-7, 50 M; 100 M) o en ausencia de éste (DMSO, (---)). a) Índice de elongación. b)
RESULTADOS
100
Superficie de contacto celular. Media ± ES del índice de elongación y la superficie de contacto es de un
experimento realizado dos veces con resultados similares. Las diferencias significativas en las células
coestimuladas con ICOS (p≤0,05) fueron determinadas con la prueba t de Student.
____________________________________________________________________________
También se encontró una clara disminución de la elongación y de la superficie de contacto
celular al usar Dynasore, un inhibidor de la GTPasa dinamina que regula la dinámica de actina
y la endocitosis (Figura 42).
a) b)
Su
perf
icie
de c
on
tacto
(U
.A.)
0,0001
*
Índ
ice d
e e
lon
gació
n
1
2
4
3
0,0001
0
5000
20000
*
15000
10000
Anti-ICOS
PLL
Anti-ICOS
PLL
Figura 42. Papel de la GTPasa dinamina en la elongación celular inducida por ICOS.
Elongación inducida con anticuerpo anti-ICOS o Poli-L-Lisina (PLL), en presencia del inhibidor (Dynasore,
80 M) o en ausencia de éste (DMSO, (---)). a) Índice de elongación. b) Superficie de contacto celular.
Media ± ES del índice de elongación y la superficie de contacto es de un experimento realizado dos veces
con resultados similares. Las diferencias significativas en las células coestimuladas con ICOS (p≤0,05)
fueron determinadas con la prueba t de Student.
____________________________________________________________________________
En resumen, la actividad de PI3-cinasa y en especial de la subunidad catalítica p110, de Vav-
1, de las GTPasas Rac-1, Cdc42 y dinamina, y de la cinasa MLCK activada a través de CaM
son importantes en la polarización y de células T inducida por ICOS.
4.3.2 Gránulos de Actina inducidos por ICOS
Además de inducir elongación celular, la unión de ICOS con sus ligandos también induce la
formación de gránulos densos o puntos de actina polimerizada que se encuentran muy cerca
de la superficie de contacto célula-cristal. Para conocer si estos gránulos eran dependientes de
PI3-cinasa, se utilizaron inhibidores específicos de cada subunidad y citocalasina D, capaz de
unirse a filamentos de actina e inhibir su polimerización. Los granos de actina disminuyen en
las células tratadas con citocalasina D y con el inhibidor general de PI3-cinasa, LY294002.
RESULTADOS
101
También el inhibidor específico de la subunidad catalítica p110 de PI3-cinasa genera una
disminución significativa en el número de gránulos por célula, al comparar con los inhibidores
de las otras subunidades (Figura 43), esto concuerda con la inhibición de la elongación
encontrada al usar el inhibidor de p110.
Grá
nu
los d
e A
cti
na / C
élu
la
ES
0
PLL
Anti-ICOS
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
10 m
a) b)
c) d)
e)
*
* *
Figura 43. Gránulos de actina inducidos por ICOS.
Células SR.D10 incubadas durante 40 minutos en cubreobjetos recubiertos con anticuerpo Anti-ICOS (10
g/ml) y teñidas con faloidina TRITC. a) DIC. b) Superposición “Overlay”. c) Imagen a 1 micra de la
superficie de contacto. d) Imagen a 4 micras de la superficie de contacto. e) Incubación en presencia de
citocalasina D (10 M), un inhibidor general de PI3-cinasa LY294002 (20 M), un inhibidor de p110 (PIK-
75, 1 M), un inhibidor de p110 (TGX-221, 1 M), un inhibidor de p110 (PI3-K Inhibidor II, 12 M), un
RESULTADOS
102
inhibidor de p110 (IC87114, 5 M) o en ausencia de estos inhibidores (DMSO, (---). Las diferencias
significativas fueron determinadas con la prueba t de Student.
____________________________________________________________________________
Con el fin de conocer si estos gránulos de actina podían tener una estructura semejante a los
podosomas descritos en otras células, y que están implicados en procesos de adhesión, se
estudió el papel de vinculina, una proteína de citoesqueleto que en los podosomas forma un
anillo característico alrededor de un núcleo central de actina polimerizada. Para esto las células
SR.D10 fueron incubadas sobre cristales recubiertos de anti-ICOS, y teñidas para F-Actina y
vinculina (Figura 44). Como se puede observar, los anticuerpos empleados tiñen débilmente las
células; la actina y la vinculina no colocalizan en estos gránulos inducidos por ICOS, y la
vinculina no forma anillos alrededor de los acúmulos de F-actina.
a) b)
c) d)
Figura 44. Distribución de vinculina y actina en células incubadas con ligandos de ICOS.
Células SR.D10 fueron incubadas sobre cristales recubiertos con anti-ICOS, posteriormente fueron
teñidas para actina con faloidina-FITC (verde) y para vinculina con un anticuerpo monoclonal de ratón
unido a Alexa 568 (Rojo). a) Tinción con faloidina-FITC. b) Tinción con vinculina. c) Doble tinción. d) DIC.
____________________________________________________________________________
RESULTADOS
103
4.3.3 Disociación de la polimerización de actina y acumulación de “balsas” lipídicas
por ligandos de ICOS
La activación de células T genera cambios drásticos en la morfología de la célula T, como
reordenamientos del citoesqueleto de actina, necesarios para la producción de una sinapsis
madura; se ve favorecida por una compartimentación funcional de lípidos en la membrana en
microdominios de membrana enriquecidos en glicoesfingolípidos (GEMs) o “balsas lipídicas”
resistentes a determinados detergentes, que están enriquecidos en proteínas de señalización.
Hasta el momento hemos comprobado que la ligación de ICOS induce reorganización del
citoesqueleto de actina y alargamiento de la célula T acompañado de un incremento de la
superficie de contacto con el sustrato. Para comprobar si estos cambios son debidos a o están
acompañados de la redistribución y localización de ICOS en las balsas lipídicas, células
SR.D10 se incubaron con esferas recubiertas con anticuerpos específicos para ICOS, para
CD4 (presente en balsas) o para CD45 (ausente en balsas) y posteriormente se tiñeron con
faloidina-FITC y con la subunidad B de la toxina del cólera (CTB) que se une a gangliósido
GM1 característico de las balsas lipídicas. Las células incubadas con esferas recubiertas con
anti-CD45, no presentaron en el sitio de contacto célula-esfera un aumento en la polimerización
de actina ni acumulación de balsas lipídicas (Figura 45 a); las células incubadas con esferas
recubiertas con anti-CD4, no presentaron en el sitio de contacto célula-esfera un aumento en la
polimerización de actina pero si una clara acumulación de balsas lipídicas (Figura 45 b); las
células incubadas con esferas recubiertas con anti-CD3, presentaron en el sitio de contacto
célula-esfera una gran acumulación de actina polimerizada, acompañado por una pequeña
fracción de balsas lipídicas (Figura 45 c); finalmente las células incubadas con anti-ICOS,
presentaron en el sitio de contacto célula-esfera polimerización de actina pero no acumulación
de balsas lipídicas (Figura 45 d).
RESULTADOS
104
Contraste de Fase
ICOS
CD3
CD45
a)
b)
c)
d)
CD4
Faloidina-FITC Contraste de Fase
ICOS
CD3
CD45
CD4
CTB-FITC
Figura 45. Efecto de la ligación de ICOS y de otras moléculas en la polimerización de actina y la
acumulación de “balsas” lipídicas.
Células SR.D10 incubadas durante 40 min con esferas recubiertas con anticuerpos a una concentración
de 10 g/ml a) anti-CD45. b) anti-CD4. c) anti-CD3. d) anti-ICOS; posteriormente fijadas y teñidas con
faloidina-FITC y CTB-FITC. Las células se analizaron por contraste de fases y microscopía de
fluorescencia. Barra: 10 m.
____________________________________________________________________________
Para confirmar la ausencia de ICOS en las balsas lipídicas, las células SR.D10 fueron lisadas
con el detergente Tritón X-100 y los lisados fueron separados por ultracentrifugación en dos
fracciones, la soluble y la insoluble: esta última corresponde a la fracción que contiene las
balsas lipídicas. Éstas fracciones fueron analizadas por “inmunoblot”, donde se observó
claramente la presencia de la tirosincinasa Lck en la fracción insoluble correspondiente a las
balsas lipídicas, a diferencia de ICOS que no se detectó en esta fracción pero si en la fracción
soluble; Vav se determino como una proteína control ausente en las balsas (Figura 46 a).
RESULTADOS
105
La posibilidad de una transferencia de ICOS a las balsas lipídicas al coestimular con el ligando
de ICOS o activando a través del TCR fue descartada, ya que ICOS no pudo ser detectado en
las balsas mediante “inmunoblot” incluso tras del cruzamiento de estas moléculas con
anticuerpos específicos (Figura 46 b).
Lck
ICOS
Vav
Balsas No-Balsas
a)
CD3
Lck
ICOS
CD4
Balsas
- TCR ICOS
b)No-Balsas
- TCR ICOSActivación:
Figura 46. ICOS no está presente en las balsas lipídicas de lisados celulares.
a) Células SR.D10 fueron lisadas con Tritón X-100 y los lisados fueron separados por ultracentrifugación.
Las proteínas de las fracciones se separaron por SDS-PAGE y se analizaron mediante “inmunoblot” con
anticuerpos específicos para ICOS, para Lck (control positivo, presente en balsas) y para Vav (control
negativo, ausente en balsas). b) Células SR.D10 fueron incubadas durante 15 min a 37°C con 10 g/ml
de anti-TCR (CD3) o anti-ICOS. Las células fueron lisadas, ultracentrifugadas y analizadas mediante
“inmunoblot”.
____________________________________________________________________________
Con el fin de comprobar un posible efecto sinérgico de ICOS con las señales del TCR/CD3 en
la acumulación de balsas lipídicas, células SR.D10 fueron incubadas con esferas recubiertas
con anti-CD3, que inducen acumulación de balsas lipídicas en el sitio de contacto célula-esfera
(Figura 45 c) junto con anti-ICOS, que no indujo acumulación de balsas en el sitio de contacto
(Figura 45 d). Se observó una clara acumulación de balsas lipídicas en el sitio de contacto al
incubar las células con esferas recubiertas con los dos anticuerpos (Figura 47), comprobando
que ICOS colabora con las señales del TCR/CD3 para la acumulación de balsas lipídicas en el
sitio de contacto.
RESULTADOS
106
Control
Anti-CD3
Anti-ICOS
Anti-CD3 +
Anti-ICOS
-
Contraste de Fase CTB-FITC
Figura 47. La ligación de CD3 más ICOS induce acumulación de balsas lipídicas en el sitio de
contacto celular.
Células SR.D10 se incubaron con esferas de poliestireno recubiertas con anticuerpos monoclonales para
CD3 (2 g/ml), ICOS (10 g/ml), o CD3 más ICOS. Las células se colocaron sobre cristales recubiertos
con PLL y se incubaron durante 20 min a 37°C, posteriormente se fijaron y se tiñeron con CTB-FITC. Las
células se analizaron por contraste de fases y microscopía de fluorescencia confocal.
____________________________________________________________________________
DISCUSIÓN
DISCUSIÓN
108
5 DISCUSIÓN
El objetivo inicial de este trabajo fue la identificación por métodos proteómicos de moléculas
susceptibles de asociarse específicamente al dominio citoplasmático de ICOS, como una vía
para comprender mejor sus mecanismos de coestimulación. Los resultados obtenidos por estos
métodos identificaron a las PI3-cinasas de clase IA como las únicas moléculas susceptibles de
asociarse al dominio citoplasmático de ICOS.
5.1 UNIÓN DE LAS SUBUNIDADES DE PI3-CINASA DE CLASE IA A ICOS
Observamos que las subunidades de PI3-cinasa de clase IA (p110p85, p85 y p50-55) se
unían específicamente a la cola citoplasmática de ICOS por medio de ensayos de pull down
con péptidos fosforilados e inmunoprecipitados de ICOS. Está demostrado que la fosforilación
en tirosina del motivo YMFM de ICOS permite su unión con el dominio SH2 de la subunidad
reguladora p85 de PI3-cinasa de manera similar al motivo YMNM de CD28 (Coyle et al. 2000,
Harada et al. 2003, Zang et al. 2006). Sin embargo la coestimulación de ICOS muestra una
mayor actividad de PI3-cinasa en células T en comparación con CD28 (Arimura et al. 2002).
Estudios en linfocitos T humanos demuestran que la expresión de ICOS conduce a la
localización de la subunidad reguladora p50 en la sinapsis inmunológica a través del motivo
YxxM (Fos et al. 2008). Nosotros encontramos una mayor unión relativa de las isoformas p50-
55 a péptidos de ICOS fosforilado e inmunoprecipitados con ICOS en comparación con p85.
Sin embargo, detectamos bajos niveles de la subunidad reguladora p50 de PI3-cinasa en
blastos de linfocitos T CD4+ en comparación con linfocitos T CD4
+ sin activar (ver figura 14 c).
Estos datos confirman estudios en linfocitos humanos que han demostrado que células T sin
activar presentan cantidades similares de la subunidad reguladora p85 y p50, pero al
activarlas con fitohemaglutinina e IL-2 la cantidad de p50disminuye, sin afectar la cantidad de
p85 (Conley et al. 2012). El significado exacto y las consecuencias funcionales de estas
diferencias en la expresión de las subunidades reguladoras, su asociación a motivos
fosforilados YxxM, o su reclutamiento a la sinapsis están por determinar. Por ejemplo, hay
datos de que la forma p85, (pero no p55 o p50) activa la PI(3,4,5)P3 fosfatasa PTEN
(“phosphatase and tensin homologue deleted on chromososme 10”) y, por tanto, una mayor
proporción de p55 o p50 favorecería el mantenimiento de los niveles de PI(3,4,5)P3 (Barber
et al. 2006). Sin embargo, esto contrasta con la mayor dificultad de activación de los linfocitos T
en reposo frente a los blastos.
En cuanto a las subunidades catalíticas, fue sorprendente detectar una mayor unión de p110
a péptidos de ICOSpTir y a inmunoprecipitados de ICOS nativo fosforilado, en comparación
DISCUSIÓN
109
con p110 y p110 (ver figuras 12 y 13). Los bajos niveles de p110 eran esperables, debido a
los bajos niveles de ARNm encontrados en las células estudiadas, pero los bajos niveles
relativos de p110 no eran esperables, siendo esta subunidad una de las más abundantes en
linfocitos T (Chantry et al. 1997, Vanhaesebroeck et al. 1997).
La subunidad reguladora p85 ejerce una función dual sobre la subunidad catalítica p110, le
proporciona estabilidad -ya que es térmicamente lábil- e inhibe su actividad lípido-cinasa (Yu et
al. 1998). La unión de p85 a secuencias fosforiladas específicas aumenta la actividad catalítica
de las subunidades p110 (Yu et al. 1998), igual que la interacción con proteínas de la familia
Ras (Rodriguez-Viciana et al. 2004). Los datos existentes, en ensayos de inmunoprecipitación
de subunidades catalíticas, sugieren que cada isoforma catalítica p110 se une a la isoforma
reguladora p85 sin preferencias aparentes (Vanhaesebroeck et al. 1997, Yu et al. 1998). Sin
embargo, la inmuprecipitación de la subunidad reguladora nos demostró una unión preferencial
de la subunidad catalítica p110 por la subunidad reguladora, explicando la abundancia de
p110 asociada a ICOS. También la inmunodepleción de la subunidad reguladora provocó la
pérdida de la subunidad catalítica p110, sin afectar los niveles de la subunidad catalítica
p110. Es poco probable que estos resultados se deban a que el anticuerpo utilizado para la
depleción de la subunidad reguladora no reconoce las isoformas p85 y p55, ya que el
anticuerpo utilizado no es específico de isoforma, y además las subunidades reguladoras p85
y p55 se expresan en células linfoides en pequeñas cantidades en comparación con las
isoformas (Alcazar et al. 2009, Pons et al. 1995) y no se ha descrito hasta el momento una
asociación preferencial en la formación del dímero p110/p85 o p110/p55.
Al comprobar si la unión preferencial de p110 a la subunidad reguladora se mantenía cuando
las células expresan cantidades similares de las proteínas p110 y p110 de manera exógena,
eliminando las diferencias en los niveles endógenos, volvimos a encontrar una mayor
abundancia de la subunidad catalítica exógena p110 en inmunoprecipitados de la subunidad
reguladora (ver figura 16). Sin embargo, al inmunoprecipitar las subunidades catalíticas
exógenas no observamos una diferencia marcada en los niveles de la subunidad reguladora
asociada (ver figura 17). Este resultado sí estaba en consonancia con trabajos previos que
muestran que al inmunoprecipitar las subunidades catalíticas p110 y p110 no se presentan
asociaciones diferenciales de la subunidad reguladora (Papakonstanti et al. 2008,
Vanhaesebroeck et al. 1997). Por tanto, creemos que hay diferencias en la fuerza de la
interacción de p110 y p110 con las subunidades reguladoras p85, pero que éstas diferencias
sólo se manifiestan claramente cuando se precipitan éstas últimas. Esto es posiblemente
debido a que en estas condiciones hay una competencia más libre entre las subunidades
p110 y p110 por su unión a p85 que cuando se precipitan subunidades catalíticas.
DISCUSIÓN
110
La posibilidad de que exista una interacción más débil entre p110 y la subunidad reguladora
en comparación con p110 se ve apoyada por un estudio de propiedades bioquímicas y
diferencias cinéticas de las isoformas de PI-3 cinasa de clase IA usando como sustrato PIP2 en
un liposoma PIP2/PS. En él se demuestra que la actividad específica del dímero p85/p110 es
tres a cuatro veces mayor que la observada con las isoformas p110, p110 y p110 (Meier et
al. 2004).
También, al silenciar las subunidades catalíticas p110 (ver figura 18), p110 (ver figura 20), o
las dos subunidades (ver figura 21) no observamos cambios significativos en la subunidad
reguladora p85. Datos similares se encontraron en células endoteliales donde al silenciar las
subunidades catalíticas no se observaron cambios en los niveles de expresión de la subunidad
reguladora (Cain et al. 2010). Pero sí observamos un aumento de la subunidad catalítica
p110, probablemente para compensar, al menos parcialmente, la pérdida de las subunidades
p110 y p110. La subunidad catalítica p110 ha demostrado un papel importante en la
proliferación “in vitro” de leucocitos deficientes en p110/ en comparación con células
normales (Foukas et al. 2010).
Otra posibilidad es sugerida por los resultados de qRT-PCR donde los niveles de ARNm de las
de cada una de las subunidades catalíticas p110 y p110 son similares entre sí y con los de la
subunidad reguladora (ver figura 10). Esto generaría un exceso de ARNm de las
subunidades catalíticas (+) sobre la subunidad reguladora , y produciría una fracción de
estas subunidades catalíticas en forma libre como monómeros. Dada la unión preferencial de
p110 a la subunidad reguladora, la subunidad libre sería mayoritariamente p110. Además, se
ha descrito que polipéptidos de las subunidades catalíticas p110 y p110 son reclutados a la
membrana por receptores acoplados a proteínas G (Guillermet-Guibert et al. 2008) o por la
GTPasa TC21 respectivamente (Delgado et al. 2009) sin que en esta unión intervenga
directamente la subunidad reguladora. Es interesante señalar que la GTPasa TC21 a la que se
asocia p110 se asocia constitutivamente con el TCR en células T (Delgado et al. 2009) y está
directamente involucrada en sus señales, lo cual explicaría el importante papel de p110 en la
activación por antígeno.
5.2 PAPEL DE LA SUBUNIDAD CATALÍTICA p110 EN LA ACTIVACIÓN DEL TCR Y LA
COESTIMULACIÓN
A pesar de la importancia de CD28 en la señalización, ratones deficientes en esta molécula son
capaces de generar una respuesta eficaz ante infecciones virales (Whitmire & Ahmed 2000);
además la secreción de citocinas efectoras como IFN- e IL-4 es normal cuando la estimulación
se da por células presentadoras de antígeno carentes de B7.1/B7.2 (Schweitzer & Sharpe
1998). Lo anterior sugiere que otra molécula coestimuladora puede compensar la ausencia de
CD28 y actuar eficientemente, como es el caso de ICOS. En efecto, su señal coestimuladora
DISCUSIÓN
111
aumenta la proliferación de células T y contribuye a la secreción de citocinas como IFN-, TNF-
, IL-4, IL-5, IL-10, e IL-21.
La señalización de CD28 se inicia por la activación de dos cascadas de señalización, la primera
es iniciada por una región distal rica en prolinas, en la cual el motivo PYAP se une y activa a la
cinasa Lck; este motivo se une además a Fyn, GADS, GRB-2 y filamina-A (Boomer & Green
2010). La segunda cascada, requiere la fosforilación en tirosina del motivo citoplasmático
YMNM (YMFM en ICOS) de unión a diferentes proteínas adaptadoras como GRB-2 y GADS o
a la subunidad reguladora p85 de PI3-cinasa. Además CD28 posee un motivo C-terminal
AAYRP ausente en ICOS, con el cual se une a la subunidad reguladora p85 de PI3-cinasa
(Alcazar et al. 2009). Estas diferencias generan implicaciones funcionales en las señales
coestimuladoras medidas por CD28 o por ICOS (Harada et al. 2003)
Este trabajo, junto con trabajos previos, muestran que ICOS asocia solamente o principalmente
PI3-cinasa (Coyle et al. 2000, Feito et al. 2003, Zang et al. 2006), siendo un importante
activador de la vías de señalización dependientes de PI3-cinasa en células activadas. La
ligación de ICOS genera una fuerte fosforilación en las moléculas efectoras de esta cinasa
como PDK1 y Akt, y en cierta medida MAPKs (ERK, JNK y p38) (Arimura et al. 2004, Fos et al.
2008, Okamoto et al. 2003).
En nuestro estudio se observó una fuerte fosforilación de Akt (Ser473) en células de la línea
SR.D10 activadas con anti-CD3 y anti-ICOS. Esta activación temprana de Akt fue bloqueada
parcialmente al inhibir las subunidades catalíticas p110 y p110 de PI3-cinasa con siARN o
con inhibidores farmacológicos, confirmando la importancia de estas subunidades en la
activación de Akt. La inhibición de la fosforilación de Akt al silenciar la subunidad catalítica
p110 se puede explicar por la inhibición parcial de la unión de esta subunidad a ICOS (ver
figura 11), comprobando una vez más la unión preferencial de p110 a ICOS.
Ensayamos también el efecto de inhibidores sobre la fosforilación de Akt inducida por anti-CD3
y anti-ICOS en blastos de linfocitos T CD4+. La fosforilación en la Treonina 308 de Akt fue
inhibida eficientemente por inhibidores de p110 (A66), p110 (IC87114), o de todas las
isoformas (LY294002); mientras que la fosforilación en la Serina 473 fue inhibida parcialmente
por el inhibidor de p110 (A66), y totalmente por el de p110, o por LY294002. Se ha descrito
que la fosforilación en la Treonina 308 es dependiente de la cinasa PDK1, cuya activación a su
vez es directamente dependiente de la actividad PI3-cinasa. La fosforilación de Akt en la Serina
473 depende del complejo mTORC2 y también es iniciado por las PI3-cinasas (Chi 2012).
La fosforilación de Erk aumenta moderadamente en las células SR.D10 activadas con anti-CD3
y anti-ICOS, y disminuye al usar el inhibidor de p110. En contraste, en las células
“knockdown” para p110 observamos un ligero incremento. La fosforilación de Erk fue más
resistente al efecto del inhibidor de p110, pero en las células “knockdown” para p110 la
fosforilación de Erk fue inhibida. Esto demuestra que la pérdida de la expresión de la subunidad
catalítica p110 o p110 de PI3-cinasa en las células silenciadas genera un desequilibrio en
DISCUSIÓN
112
PI3-cinasa y en las señales diana de la coestimulación por ICOS. En cambio, el uso de
inhibidores provoca un efecto en la actividad de la subunidad, no en su abundancia. Así, la
subunidad catalítica p110 puede ser requerida en la activación eficaz de Akt, pero no lo
suficiente en la activación de Erk. Esta resistencia a la inhibición de Erk concuerda con el
trabajo de Okkenhaug donde la fosforilación de Erk mediada por CD28 no se ve afectada en
ratones transgénicos para una forma mutante de p110 (p110D910A/D910A
) sin actividad
cinasa(Okkenhaug et al. 2006). En el caso de la fosforilación de Erk en blastos, se observa un
efecto similar: ni la inhibición de p110 ni la de p110 tienen efecto aisladamente. Sin embargo,
al inhibir con LY294002 se observa que la activación de Erk es dependiente de PI3-cinasas y
que necesita de la inhibición de todas las subunidades para verse afectada, como se ha
descrito previamente en la coestimulación por ICOS en células de la línea SR.D10 (Feito et al.
2003).
ICOS participa en la formación de centros germinales y en la interacción entre la célula B y T, a
través de la vía CD40/CD40L (McAdam et al. 2001, Tafuri et al. 2001). Además, Ia señalización
mediante el TCR y moléculas coestimuladoras como ICOS y CD28 regulan la expresión de
CD40L en las células T (Kaminski et al. 2009). Es por esto que ICOS es fundamental para el
cambio de isotipo en la respuesta primaria y secundaria de células B-dependiente de células T.
Se ha descrito que la subunidad catalítica p110 tiene un papel importante en la señalización
mediada por ICOS, ya que blastos de células T p110-/-
presentan una disminución en la
fosforilación de la isoforma GSK3, que es fosforilada e inhibida por p-Akt después de la
coestimulación con ICOS (Rolf et al. 2010). La PI3-cinasa es fundamental en la formación de
las células Th foliculares (TFH), y particularmente la actividad catalítica de p110 es necesaria
para que las células T proporcionen una ayuda eficiente a las células B; siendo requerida esta
subunidad p110 en la generación de reacción de los centros germinales (CG) y en la
inducción del linaje TFH “in vivo” (Rolf et al. 2010).
Algunos estudios con ratones deficientes en p110-/-
han demostrado daños en las señales del
receptor de células B pero no en el receptor de células T (Jou et al. 2002). Sin embargo,
estudios en ratones con una mutación puntual (D910A) en la subunidad catalítica p110,
demuestran la importancia de esta subunidad en la expansión clonal, en la diferenciación de
células T y en la secreción de citocinas Th1 y Th2 (Okkenhaug et al. 2006). Además el inhibidor
de p110 bloquea la proliferación de linfocitos T y la secreción de citocinas inducidas tras la
activación con anti-CD3 más anti-CD28 (Ji et al. 2007).
Según nuestros resultados la secreción de IL-4 e IL1-10 es dependiente de la vía PI3-
cinasa/Akt, ya que el inhibidor general de PI3-cinasa (LY294002) y de las subunidades
catalíticas p110 y p110 inhiben la secreción de citocinas (IL-4, IL-10) inducida por la
activación TCR/CD3 y por la coestimulación con ICOS en células SR.D10. En blastos de
células T CD4+ tratados con concentraciones más bajas de los dos inhibidores de p110 (PIK-
75, 0,01 M; A66, 1 M), no se observó un efecto significativo sobre la producción de IL-4 o IL-10,
DISCUSIÓN
113
pero si sobre la producción de IFN-, y ligeramente la producción de IL-2 (ver figura 24). La
síntesis de IFN- es especialmente sensible a la inhibición de la subunidad catalítica de p110.
Se ha visto que la producción de IFN- parece en gran medida dependiente de la activación de
Akt en la Serina 473 (Chi 2012), y en nuestro caso el grado de inhibición de la síntesis de IFN-
se correlaciona bien con la inhibición de la fosforilación de Akt en esta Serina.
Es claro que la ligación de ICOS induce una fuerte activación de Akt y estudios previos han
demostrado que la inactivación de GSK3 mediada por Akt incrementa la producción de IL-10
(Fos et al. 2008); además Akt1 promueve la activación de NF-AT a través de la fosforilación de
proteínas Homer que se unen a NF-AT (Huang et al. 2008). La activación de NF-AT es esencial
para la secreción de IL-4 en células D10, en donde la ciclosporina A bloquea la secreción de
esta citocina (Feito et al. 2003) y la inhibición de PKA afecta la activación del promotor de IL-4
generada por PDK1-PH (Nirula et al. 2006). También se ha demostrado que ICOS, regula la
diferenciación Th2 a través de la inducción del factor de transcripción c-Maf, ya que células T
ICOS-/-
presentan un defecto en la expresión de IL-4 asociado a una deficiencia funcional en el
factor de transcripción c-Maf (Nurieva et al. 2003a).
Nuestros resultados demuestran la importancia de la subunidad catalítica p110de PI3-cinasa,
por su unión preferencial a la subunidad reguladora y como consecuencia de ello a ICOS.
También muestran el papel de esta subunidad en la activación de TCR y la coestimulación con
ICOS, por el efecto que tiene el silenciamiento de la subunidad en las vías de señalización
mediadas por ICOS, y el efecto de inhibidores específicos de la subunidad en la producción de
citocinas.
Una observación sorprendente es que ratones con mutaciones en el motivo YMNM capaces de
eliminar la asociación de PI3-cinasa y la fosforilación de Akt dependiente de CD28 no tienen un
efecto claro sobre la secreción de IL-2, la inducción de la proteína anti-apoptótica Bcl-XL, o
numerosas funciones de los linfocitos T “in vivo” (Dodson et al. 2009). En contraste, un motivo
rico en prolinas C-terminal (PYAP) es necesario para la fosforilación en tirosinas de la cinasas
PDK1, PKC-θ, y GSK3 y la fosforilación en treonina de Akt (Boomer & Green 2010, Dodson et
al. 2009, Friend et al. 2006).
PKC-θ, que es esencial para la proliferación y la producción de IL-2, se asocia indirectamente a
CD28 al unirse al dominio SH3 de Lck, que posiblemente por su dominio SH2 se une al motivo
rico en prolinas PYAP fosforilado (Kong et al. 2011). Este motivo PYAP y Lck, y no el motivo
YMNM, es también importante para la diferenciación de linfocitos T reguladores (Lio et al. 2010,
Vang et al. 2010).
Puesto que no es esencial para el desarrollo de linfocitos y de respuestas “in vivo”, cabe
preguntarse entonces cuál es la función del motivo YMNM y de la asociación de PI3-cinasas de
clase IA a este motivo en la función de CD28. Los estudios que se mencionan anteriormente
muestran que este motivo no es esencial “in vivo”, pero esto no significa que, en condiciones
normales, no tenga una función importante. Numerosos estudios indican la importancia de PI3-
DISCUSIÓN
114
cinasas y los fosfolípidos de inositol en la activación de linfocitos T y en la coestimulación por
CD28. Está bien establecido que CD28 recluta PI3-cinasas, y aunque la actividad PI3-cinasa
asociada no es tan alta como en ICOS no significa que sea despreciable o innecesaria (Parry
et al. 2003). Así, p.e., la eliminación en linfocitos T de la fosfatasa PTEN también elimina la
necesidad de coestímulo por CD28 (Buckler et al. 2006). Es muy posible que en ausencia de
los motivos YMNM de CD28, las PI3-cinasas empleen modos de reclutamiento a membranas y
de activación alternativos (Deane & Fruman 2004, Parry et al. 2003), incluyendo de modo
destacado el reclutamiento de p110 al receptor de antígeno mediado por ciertas proteínas de
la familia Ras (Delgado et al. 2009). Tanto p110 como p110 intervienen en la activación por el
TCR (Alcazar et al. 2007, Okkenhaug et al. 2006, Soond et al. 2010); el inhibidor de p110
IC87114 inhibe tanto la proliferación como la producción de citocinas en linfocitos T CD4+
activados por antígeno “in vitro”. Hemos podido confirmar esta inhibición, pero también la
inhibición por inhibidores de p110 de la proliferación de linfocitos T CD4+ “naive” activados
con anti-CD3 y CD28.
5.3 CAMBIOS MORFOLÓGICOS EN LINFOCITOS T INDUCIDOS POR ICOS
ICOS y otras moléculas como CD28 y CTLA-4 son capaces de generar señales intracelulares
responsables de los cambios en el citoesqueleto de actina en células T. Nuestros resultados
indican que, en células T, la interacción de ICOS con sus ligandos produce un aumento de la
superficie de contacto con el sustrato, elongación celular y polimerización de actina inducida
que es independiente de las señales del TCR/CD3 (ver figura 35).
Publicaciones previas han descrito que la inducción de la elongación celular mediada por la
ligación con ICOS depende de PI3-cinasa (Franko & Levine 2009, Nukada et al. 2006). Nuestro
trabajo confirma que el fenotipo de células T elongadas inducido por ICOS requiere de la
actividad de PI3-cinasa de clase IA; así mismo, la subunidad catalítica p110 es indispensable
en la elongación celular, en comparación con la subunidad catalítica p110.
Además de inducir elongación celular, la unión de ICOS con sus ligandos también induce la
formación de gránulos densos o puntos de actina polimerizada que se encuentran muy cerca
de la superficie de contacto célula-cristal. Al igual que en la elongación celular inducida por
ICOS, estos gránulos también son dependientes de PI3-cinasa y específicamente de la
subunidad catalítica p110.
Las tirosina-cinasas de la familia Src Fyn y Lck están implicadas en la fosforilación de las
tirosinas que reclutan PI3-cinasas en moléculas de la familia CD28 como CTLA-4 (Hu et al.
2001). Esto está posiblemente facilitado por la interacción de estas tirosina-cinasas con PI3-
cinasas por medio de sus dominios SH3 (Prasad et al. 1993a, Prasad et al. 1993b). De acuerdo
con estos datos, la elongación y la reorganización del citoesqueleto de actina inducidos por
ICOS son bloqueados por un inhibidor de la tirosina-cinasa Lck (ver figura 36). La activación de
PI3-cinasa produce el reclutamiento de proteínas de señalización celular que contienen
DISCUSIÓN
115
dominios de homología pleckstrina (PH) a la membrana plasmática, incluyendo Akt y Vav.
Existen datos que demuestran que la extensión del citoplasma, la reorganización del
citoesqueleto de actina y las formaciones filopodia y “microspikes” inducidas por ICOS no se
ven afectadas con la inhibición de la vía de señalización Akt (Franko & Levine 2009). En otra
molécula de la familia de CD28, como CTLA-4, la polarización celular y los cambios
morfológicos requieren de la actividad de Vav-1, y no de la activación de Akt (Wei et al. 2007).
Del mismo modo, la ausencia de Vav reduce la polimerización de actina inducida por el TCR
(Fischer et al. 1998). Los resultados expuestos en este trabajo muestran que los cambios en el
citoesqueleto de actina inducidos por ICOS son independientes de la vía de Akt y dependientes
de Vav.
Vav posee un dominio DH de actividad GEF que le permite promover el intercambio de GDP
por GTP en proteínas G, lo que conduce a la activación de proteínas como Rho, Rac y Cdc42,
las cuales controlan una variedad de eventos celulares como la supervivencia de linfocitos, la
proliferación, la diferenciación y además, tienen un papel importante en la adhesión, forma y
movilidad celular, a través de cambios en el citoesqueleto de actina (Sanchez-Madrid & del
Pozo 1999). Rho A regula la formación de fibras de estrés y adhesiones focales, Rac-1 controla
la formación de lamelipodia y Cdc42 regula la formación de filopodia y “microspikes” (Acuto &
Cantrell 2000).
En este trabajo encontramos que algunos miembros de la familia de las Rho GTPasas son
esenciales para la elongación celular mediada por ICOS. La expresión de formas dominantes
negativas para Rac-1 y Cdc42 muestran la disminución de la elongación inducida por ICOS
(ver figura 38). Mientras que, la expresión de la forma dominante negativa para RhoA y el uso
del inhibidor de ROCK, efector de RhoA, no afectan la elongación ni la superficie de contacto
celular. Lo anterior sugiere que la elongación celular inducida por ICOS requiere la actividad
GTPasa de Rac-1 y Cdc42, pero no de RhoA. Estos resultados no concuerdan con los datos de
Nukada y cols., que muestran que tanto las vías de señalización Rac/Cdc42/PAK como la de
RhoA/ROCK son importantes en la elongación celular inducida por ICOS (Nukada et al. 2006).
En cambio, Franko y Levine han reportado que la inhibición de Rho o ROCK no afecta a los
cambios en el citoesqueleto de actina inducido por ICOS, o incluso puede aumentar su
magnitud (Franko & Levine 2009, Nukada et al. 2006). Esto concordaría con estudios previos
con otra molécula coestimuladora como CD28, que demuestran que su señalización estimula
mecanismos de adhesión celular en el sitio de contacto célula T/CPA dependientes de Rac-1 y
Cdc42 pero no de RhoA (Kaga et al. 1998), o los estudios sobre la elongación inducida por
CTLA-4, que es dependiente de Cdc42 e independiente de RhoA, ROCK, y Akt (Wei et al.
2007).
La familia de cinasas PAKs son activadas por Rac y Cdc42 (Chong et al. 2001); la vía
Rac/Cdc42/PAK tiene un papel fundamental en la regulación del citoesqueleto de actina porque
interactúa y fosforila numerosas proteínas implicadas en los cambios en el citoesqueleto de
actina (Szczepanowska 2009). PAK3 es inducida tras la activación de células T, mientras que
DISCUSIÓN
116
PAK1 está expresada constitutivamente en células T “naive” o activadas; estas dos cinasas
(PAK1/PAK3) están involucradas en la elongación de células T inducida por ICOS (Nukada et
al. 2006). Existen evidencias que demuestran que Rac puede unirse directamente con la
subunidad reguladora p85 de PI3-cinasa; esta interacción es a través del dominio de homología
BCR de p85 y el dominio efector de Rac-GTP. Es posible que exista una retroalimentación
positiva en la que Rac, una vez activado por PI3-cinasa, puede activar más PI3-cinasa. Este
ciclo de retroalimentación positiva puede desempeñar un papel crucial en el establecimiento de
la polaridad celular (Welch et al. 2003).
Los cambios dinámicos del citoesqueleto dependen de la red de actina-miosina. La forma
polimerizada de actina se une a la miosina, por medio de su cadena ligera de miosina (MLC), la
cual es activada por MLCK o por ROCK. Se ha demostrado que CTLA-4 requiere de la
actividad de Vav-1, Cdc42 para inducir polarización celular con incremento en la formación de
filopodia y lamelipodia, sin necesitar la actividad de RhoA o de ROCK, pero sí la actividad de
MLCK (Wei et al. 2007). Nuestros datos concuerdan con el trabajo de Wei, ya que al usar el
inhibidor de MLCK se inhibe la elongación celular.
Un regulador de la actividad de MLCK es calmodulina, la cual activa MLCK mediante la unión a
su dominio regulador (Lukas et al. 1986). El tratamiento con el inhibidor de calmodulina W-7,
disminuye la extensión del citoplasma en células Jurkat (Smith et al. 2003), y también inhibe
eficazmente la elongación y la superficie de contacto de linfocitos T mediada por ICOS,
reflejando su efecto del inhibidor de MLCK. El hecho de que inhibidores de calmodulina y de
MLCK pero no de ROCK, afecten la elongación celular evidencia que la actividad cinasa de
MLCK es importante en los cambios morfológicos inducidos por ICOS. Sorprendentemente,
encontramos que Blebbistatina, un inhibidor de la actividad ATPasa de miosina (Straight et al.
2003), no tenía efecto sobre la elongación celular o el aumento de la superficie de contacto
inducida por ICOS. Es posible que ello sea debido a que sean miosinas no convencionales de
tipo I las implicadas en el efecto de ICOS. Hay que tener en cuenta que estas miosinas no son
inhibidas por Blebbistatina (Straight et al. 2003), pero en cambio mantienen los motivos de
unión a calmodulina. Además, es muy interesante que estas miosinas se asocian a las
membranas por medio de dominios de pleckstrina que se unen a fosfatidilinositol trifosfatos (los
productos de PI3-cinasa) (Maravillas-Montero et al. 2011, Patino-Lopez et al. 2010). Por último,
datos recientes muestran que miosinas de tipo 1 están implicadas en el control del
citoesqueleto de linfocitos, y de hecho en linfocitos B participan en la elongación celular
inducida por ligandos de CD44 (Maravillas-Montero et al. 2011).
También encontramos una clara disminución de la elongación y de la superficie de contacto
celular al usar Dynasore, un inhibidor de la GTPasa dinamina. Estudios previos han descrito
que el inhibidor de dinamina, reduce la estabilidad de F-actina y la formación de lamelipodia en
células cancerosas (Yamada et al. 2009). Dinamina está implicada en la formación de
DISCUSIÓN
117
estructuras ricas en actina e interactúa con una variedad de proteínas relacionadas con la
dinámica de actina; es por estas interacciones que dinamina, se une la membrana celular
modulando la forma de la célula, la adherencia, la fagocitosis y el movimiento vesicular (Gomez
et al. 2005). El efecto causado en la elongación celular inducida por ICOS puede ser debido a
que dinamina-2 probablemente ejerce sus efectos sobre el citoesqueleto de actina, por su
interacción con Vav1 (Gomez et al. 2005) o por su interacción con los dominios SH3/SH2 de la
subunidad reguladora p85de PI3-cinasa (Booker et al. 1993). Otra posibilidad es que
dinamina-2 y miosina interactúan y están relacionadas con la vía se señalización de PI3-cinasa;
este complejo dinamina-2/miosina interactúa con actina durante la formación del citoesqueleto
de actina en células NIH3T3 y está implicado en la migración celular (Jeong et al. 2006, Lim et
al. 2012).
Se ha descrito que CTLA-4, pero no CD28, actúa como un activador selectivo de la integrina
LFA-1 en linfocitos T humanos y de ratón, regulando la adhesión mediada por esta integrina y
aumentando el “capping de LFA-1 (Schneider et al. 2005). Analizamos si la ligación de ICOS
inducía un aumento en el “capping” de la integrina LFA-1, con resultados negativos (datos no
mostrados).
En resumen, utilizando inhibidores y dominantes negativos para las diferentes moléculas
involucradas en la ruta de señalización, logramos dilucidar el mecanismo por el cual ICOS
induce la reorganización y cambios en el citoesqueleto de actina en linfocitos T, la siguiente
figura representa dicho mecanismo:
DISCUSIÓN
118
CPA
ICO
S-L
PIK-75
Célula T
PIP2
P P
Y
M
F
M
ICO
S
p85 p110
H-1152 ROCK
P
PH
PIP3
P P
P
VAV
GDP
GTP
Rac-1
Rac-1
GDP
GTP
RhoA
RhoA
Cdc42GDP
GTP Cdc42
WAVE2
Arp2/3
WASP
Arp2/3
PAK
Actina
Miosina MLC
P
MLCKW-7 CaM
MLCP
ML-7
Triciribine
Vav
TruncadoDynasore
Dinamina2
Elongación celular y cambios en
el citoesqueleto de actina
DN
Figura 48. Representación esquemática de la potencial vía de señalización involucrada en los
cambios en el citoesqueleto de actina inducidos por la coestimulación con ICOS en linfocitos T.
ICOS posee el motivo YMFM en su región citoplasmática; tras su fosforilación se une a los dominios SH2
de la subunidad reguladora p85 de PI3-cinasa; está a su vez forma un dímero con la subunidad catalítica
p110 que cataliza la fosforilación de PIP2 en la posición D3 para formar el segundo mensajero (PIP3).
La fosforilación en el sitio D3 es necesaria para su unión al dominio de homología con pleckstrina (PH) de
Vav. Vav facilita el intercambio GDP a GTP de las GTPasas Rac1 y Cdc42. Cdc42 unido a GTP activa a
WASP; esta unión permite la formación de ramificaciones de actina a través de la asociación con el
complejo ARP2/3, y Cdc42 unido a GTP activa el complejo. GTP unido a Rac-1 interactúa con WAVE2
para activar el complejo ARP2/3. Además Cdc42 y Rac son capaces de activar a PAK1/PAK3 implicadas
en la elongación de células T. Rac puede unirse directamente a la subunidad reguladora p85. La cadena
de miosina MLC es fosforilada por MLCK y regulada por calmodulina. Dinamina-2 puede actuar de tres
maneras, se puede unir a Vav1, a la subunidad reguladora p85 de PI3-cinasa o formar un complejo con
miosina.
____________________________________________________________________________
DISCUSIÓN
119
5.4 DISOCIACIÓN DE LA POLIMERIZACIÓN DE ACTINA Y LA ACUMULACIÓN DE
“BALSAS” LIPÍDICAS POR LIGANDOS DE ICOS
La activación de células T genera cambios drásticos en la morfología de la célula T, como
reordenamientos del citoesqueleto de actina, necesarios para la producción de una sinapsis
madura, y además, presenta una compartimentación funcional de microdominios de membrana
enriquecidos en glicoesfingolípidos (GEMs) o “balsas lipídicas”. Estas balsas lipídicas amplían
la respuesta de la célula T frente al antígeno (Meiri 2005). Frente a una respuesta de
activación, el receptor de antígeno es dirigido a las balsas lipídicas y es allí donde interacciona
con moléculas adaptadoras y cinasas (Acuto & Cantrell 2000). Aunque no se conoce con
exactitud el mecanismo de señalización que coordina la reorganización de las balsas, si se
conocen algunas proteínas asociadas a ellas.
Nuestros datos muestran que la polimerización de actina falló en la inducción de balsas
lipídicas ya que la ligación con ICOS generó polimerización de actina en el sitio de contacto
célula T/esfera, pero ICOS no fue detectado en las balsas lipídicas. Sin embargo, encontramos
un efecto sinérgico de ICOS con las señales del TCR/CD3 en la acumulación de balsas
lipídicas en el sitio de contacto.
En el caso de CD28, la redistribución de las balsas lipídicas y del citoesqueleto de actina
permiten una coestimulación eficaz de linfocitos T “Naive”, que dependen de la interacción de
CD28 con filamina-A (Tavano et al. 2006). En el caso de ICOS, no existe una conexión directa
con el citoesqueleto de actina, ya que no presenta el motivo PYAPP necesario para la
interacción con filamina-A; a pesar de esto puede promover la acumulación de balsas en el sitio
de interacción con ligandos TCR/CD3. Además, nuestros resultados indican que ICOS produce
cambios morfológicos en linfocitos T mediados por la activación de la subunidad catalítica
p110 de PI3-cinasa. Algunos trabajos han demostrado que la polimerización de actina y la
formación de balsas lipídicas son procesos diferentes, ya que en células T con sobreexpresión
de Vav-1 se induce polimerización de actina sin formación de balsas lipídicas (Villalba et al.
2001). Por lo anterior se puede decir que, ICOS induce polimerización de actina a través de
Src, PI3-cinasa y Vav, pero necesita de mecanismos adicionales como la unión a filamina-A
(Tavano et al. 2006) o a otras moléculas (Round et al. 2005) para asociarse a las balsas
lipídicas. Es por esto que las diferencias en los motivos citoplasmáticos y en los patrones de
expresión de ICOS y CD28 producen papeles no redundantes en la respuesta inmune.
5.5 PAPEL DE PI3-CINASA EN LA SUPERVIVENCIA DE LINFOCITOS T
La inhibición individual de isoformas de PI3-cinasa demuestra que las subunidades catalíticas
p110 y p110 no tienen un papel tan importante en la supervivencia de linfocitos T, como si lo
tiene la subunidad catalítica p110. El uso de dos inhibidores de esta subunidad (A66, PIK-75)
DISCUSIÓN
120
a concentraciones muy bajas disminuye significativamente la viabilidad celular y bloquea la
proliferación celular por inducción de apoptosis dependiente de caspasas en linfocitos T CD4+.
De igual forma, el silenciamiento de la subunidad p110 afecta la supervivencia celular.
Se ha visto en células Jurkat que las especies reactivas de oxigeno (ROS) intervienen en
procesos apoptóticos independientes de la cascada de señalización de caspasas, que puede
prevenirse con el uso de antioxidantes como N-acetil-L-cisteina (NAC), y la transición del
estado apoptótico a necrótico está acompañado por la depleción de ATP (Eguchi et al. 1997,
Sato et al. 2008). Nosotros observamos que ROS no está implicada en la muerte de las células
SR.D10, ya que al tratarlas con el inhibidor de p110 en presencia de NAC o ATP, no hay un
efecto protector (no mostrado).
La muerte celular inducida por el inhibidor de la subunidad catalítica p110 en las células
SR.D10 es insensible al inhibidor de caspasas, y como pudimos comprobar esta muerte celular
no se debe a un proceso autofágico. Podemos inferir que la muerte celular encontrada en esta
línea celular puede ser un mecanismo similar a la apoptosis pero independiente de caspasas.
Aunque en células T la apoptosis es un proceso típicamente dependiente de caspasas, se ha
demostrado que la muerte en células Jurkat puede ser un fenómeno independiente de
caspasas, ya que el uso del inhibidor general de caspasas ZVAD-fmk no tiene ningún efecto en
la apoptosis (Lu et al. 2007). Al parecer el inhibidor PIK-75 genera una respuesta alternativa o
vías alternas de muerte celular en función de la célula afectada.
Hemos demostrado que el inhibidor de la subunidad catalítica p110, bloquea la señalización
de PI3-cinasa, produciendo una disminución de la fosforilación de Akt y de otros efectores. La
apoptosis inducida en linfocitos T es dependiente de PI3-cinasa (p110), de Akt y de NFB. La
activación de la vía PI3K/Akt tiene un efecto anti-apoptótico, Akt fosforila e inhibe la caspasa-9,
una proteasa clave en la iniciación de la cascada de la apoptosis (Cardone et al. 1998). Akt
también fosforila el promotor BAD en Ser136, y por lo tanto libera las proteínas anti-apoptóticas
Bcl-2 y Bcl-XL (Datta et al. 1997, del Peso et al. 1997). Akt además puede activar y fosforilar la
cinasa I-kB. Esta cinasa, a su vez fosforila e inactiva el inhibidor I-kB, luego libera el factor de
transcripción NF-kB. Como consecuencia, se transloca al núcleo y activa la transcripción de
proteínas anti-apoptóticas como Bcl-2 y Bcl-XL (Ozes et al. 1999).
En conjunto, en este trabajo resaltamos la importancia de PI3-cinasa de clase IA en la
coestimulación por ICOS. No solo destacamos la función primordial de la subunidad catalítica
p110, sino que también atribuimos un papel dominante a la subunidad catalítica p110; esta
subunidad demostró unirse preferencialmente a la subunidad reguladora y por tal razón a
ICOS, siendo necesaria en la activación de efectores de PI3-cinasa como Akt, en la secreción
de citocinas, en la elongación celular y en los cambios en el citoesqueleto de actina inducidos
por ICOS. Además, la señalización de PI3-cinasa mediada por p110, tiene un papel
DISCUSIÓN
121
importante en los mecanismos de supervivencia celular. El uso de inhibidores generales de
PI3-cinasa está asociado a una gran toxicidad; no solo bloquean PI3-cinasa, también inhiben
mTOR y otras cinasas (Marone et al. 2008). Es por esto que el uso de inhibidores selectivos
para la subunidad catalítica p110 podría proporcionar un beneficio como diana terapéutica
para el control de la respuesta inmune. La investigación adicional de modelos de ratones
transgénicos seguirá aportando pistas sobre los posibles beneficios y retos de una terapia
dirigida a p110 de PI3-cinasa.
CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
123
6 CONCLUSIONES
1. Las PI3-cinasas de clase IA son las únicas moléculas que se han identificado
asociadas a secuencias fosforiladas del dominio citoplasmático de ICOS de ratón.
2. La subunidad catalítica p110 de PI3-cinasa se une preferencialmente a péptidos
fosforilados en el residuo de tirosina del motivo YMFM presente en el tallo
citoplasmático de ICOS y a inmunoprecipitados de ICOS nativo fosforilado. Esto es
debido a una unión preferencial de esta subunidad con la subunidad reguladora de PI3-
cinasa.
3. La unión relativa de las isoformas reguladoras p50-55 a péptidos de ICOS fosforilado,
o a inmunoprecipitados de ICOS es mayor que la de las isoformas reguladoras p85.
4. La pérdida de expresión de las subunidades catalíticas p110 o p110 de PI3-cinasa
genera un desequilibrio en la actividad PI3-cinasa y en las señales diana de la
coestimulación por ICOS.
5. La activación temprana de Akt fue bloqueada parcialmente al inhibir las subunidades
catalíticas p110 y p110 de PI3-cinasa con siARN o con inhibidores farmacológicos,
confirmando la importancia de estas subunidades en la activación de Akt.
6. La secreción de citocinas como IL-4 e IL1-10, es dependiente de la vía PI3-cinasa-Akt,
ya que el inhibidor general de PI3-cinasa y de las subunidades catalíticas p110 y
p110 inhiben la secreción de estas citocinas inducida por la activación TCR/CD3 y por
la coestimulación con ICOS en células SR.D10.
7. La síntesis de IFN- es especialmente sensible a la inhibición de la subunidad catalítica
de p110 en blastos de células T CD4+.
8. La inhibición de la subunidad catalítica p110 disminuye significativamente la viabilidad
celular y bloquea la proliferación celular por inducción de apoptosis dependiente de
caspasas en linfocitos T CD4+ activados con anti-CD3 y CD28.
9. La interacción de ICOS con sus ligandos produce, por sí misma, un aumento de la
superficie de contacto con el sustrato, elongación celular y polimerización de actina
inducida que es independiente de las señales del TCR/CD3.
CONCLUSIONES
124
10. La elongación de células T inducida por ICOS requiere de la actividad de PI3-cinasa de
clase IA, en especial de la subunidad catalítica p110.
11. La unión de ICOS con sus ligandos induce la formación de gránulos densos o puntos
de actina polimerizada que se encuentran muy cerca de la superficie de contacto
célula-cristal. Estos gránulos son dependientes de PI3-cinasa y específicamente de la
subunidad catalítica p110.
12. Los cambios en el citoesqueleto de actina inducidos por ICOS son dependientes de
Vav, de las GTPasas Rac-1 y Cdc42, y de la cinasa de la cadena ligera de miosina
(MLCK), pero independientes de la vía de Akt o de ROCK.
13. Existe un efecto sinérgico de ICOS con las señales del TCR/CD3 en la acumulación de
balsas lipídicas en el sitio de contacto. Sin embargo, la polimerización de actina falló en
la inducción de balsas lipídicas ya que la ligación con ICOS generó polimerización de
actina en el sitio de contacto, pero ICOS no fue detectado en las balsas lipídicas.
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ANEXOS
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ANEXOS
RELACIÓN DE ARTÍCULOS PUBLICADOS
Yenny Y. Acosta, Gloria Ojeda, Maria Paz Zafra, Ilaria Seren Bernardonea, Alejandra Sánchez,
Umberto Dianzani, Pilar Portolés, and Jose M. Rojo (2012): Dissociation of actin polymerization
and lipid raft accumulation by ligation of the Inducible Costimulator (ICOS, CD278). Inmunología
31 (1), 4–12
Acosta YY, Zafra MP, Ojeda G, Bernardone IS, Dianzani U, Portoles P & Rojo JM (2011):
Biased binding of class IA phosphatidyl inositol 3-kinase subunits to inducible costimulator
(CD278). Cell Mol Life Sci 68, 3065-3079.
RESEARCH ARTICLE
Biased binding of class IA phosphatidyl inositol 3-kinase subunitsto inducible costimulator (CD278)
Yenny Y. Acosta • Maria Paz Zafra • Gloria Ojeda •
Ilaria Seren Bernardone • Umberto Dianzani •
Pilar Portoles • Jose M. Rojo
Received: 15 April 2010 / Revised: 12 November 2010 / Accepted: 26 November 2010
� Springer Basel AG 2010
Abstract To better understand T lymphocyte costimula-
tion by inducible costimulator (ICOS; H4; CD278), we
analyzed proteins binding to ICOS peptides phosphorylated
at the Y191MFM motif. Phosphorylated ICOS binds class
IA phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3-K) p85a, p50-55aand p85b regulatory subunits and p110a, p110d and p110bcatalytic subunits. Intriguingly, T cells expressed high
levels of both p110a or p110d catalytic subunits, yet ICOS
peptides, cell surface ICOS or PI3-kinase class IA regula-
tory subunits preferentially coprecipitated p110a catalytic
subunits. Silencing p110a or p110d partially inhibited Akt/
PKB activation induced by anti-CD3 plus anti-ICOS anti-
bodies. However, silencing p110a enhanced and silencing
p110d inhibited Erk activation. Both p110a- and p110d-
specific inhibitors blocked cytokine secretion induced by
TCR/CD3 activation with or without ICOS costimulus, but
only p110a inhibitors blocked ICOS-induced cell elonga-
tion. Thus, p110a and p110d are essential to optimal T cell
activation, but their abundance and activity differentially
tune up distinct ICOS signaling pathways.
Keywords PI3-Kinase � Inducible costimulator �ICOS � T lymphocyte
Introduction
The inducible costimulator (ICOS, CD278) is a costimu-
latory molecule of T lymphocytes with sequence and
functional homology to CD28. Whereas CD28 is expressed
by most resting CD4? T cells and is considered the main
costimulatory molecule for these cells to initiate immune
responses [1, 2], ICOS is typically expressed at high levels
by activated T lymphocytes [3–6], contributing to the dif-
ferentiation and effector functions of CD4? T cells in
normal and pathological conditions. Neither CD28 nor
ICOS encodes intrinsic enzymatic activity, so that their
functional distinctions in terms of signaling derive from
their ability to bind enzymes or adaptor proteins in the
cytoplasm.
Both CD28 and ICOS have intracytoplasmic sequence
motifs (YxxM) able to bind the regulatory subunits of class
IA PI3-kinases upon Tyr phosphorylation [7–13]. How-
ever, CD28 and ICOS costimulation has different signaling
outcomes [13–15]. This is due, on one hand, to the ability
of the YMNM motif in CD28, but not the YMFM motif in
ICOS, to bind the adaptor Grb2. Besides, additional pro-
line-rich and Tyr-containing motifs present in CD28 can
bind the Grb-2/GADS adaptor proteins, the Itk and Lck
kinases [16–18], or PI3-kinase complexes having p85bregulatory subunits [19]. On the other hand, it has been
Y. Y. Acosta and M. P. Zafra contributed equally to this work.
Electronic supplementary material The online version of thisarticle (doi:10.1007/s00018-010-0606-1) contains supplementarymaterial, which is available to authorized users.
Y. Y. Acosta � M. P. Zafra � I. S. Bernardone � J. M. Rojo (&)
Departamento de Medicina Celular y Molecular,
Centro de Investigaciones Biologicas, CSIC, Ramiro de Maeztu,
9, 28040 Madrid, Spain
e-mail: [email protected]
G. Ojeda � P. Portoles
Centro Nacional de Microbiologıa, Instituto de Salud Carlos III,
Majadahonda, 28220 Madrid, Spain
I. S. Bernardone � U. Dianzani
Department of Medical Sciences, Interdisciplinary Research
Center of Autoimmune Diseases (IRCAD), ‘‘A. Avogadro’’
University of Eastern Piedmont, 28100 Novara, Italy
Cell. Mol. Life Sci.
DOI 10.1007/s00018-010-0606-1 Cellular and Molecular Life Sciences
123
i n m u n o l o g í a . 2 0 1 2;3 1(1):4–12
Inmunologíaw ww.elsev ier .es / inmunologia
Original article
Dissociation of actin polymerization and lipid raftaccumulation by ligation of the Inducible Costimulator(ICOS, CD278)
Yenny Y. Acostaa, Gloria Ojedab, Maria Paz Zafraa, Ilaria Seren Bernardonea,c,Alejandra Sáncheza, Umberto Dianzani c, Pilar Portolésb, Jose M. Rojoa,∗
a Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Departamento de Medicina Celular y Molecular, Madrid, Spainb Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, Madrid, Spainc “Amedeo Avogadro” University of Eastern Piedmont, Interdisciplinary Research Center of Autoimmune Diseases (IRCAD) andDepartment of Medical Sciences, Novara, Italy
a r t i c l e i n f o
Article history:
Received 23 April 2011
Accepted 29 June 2011
Available online 2 October 2011
Keywords:
ICOS
Costimulation
Actin cytoskeleton
Lipid rafts
a b s t r a c t
T lymphocyte antigen activation is facilitated by clustering of membrane glycosphingolipid-
enriched microdomains (GEMs, lipid “rafts”) at the T cell/APC contact that is linked to
changes in actin cytoskeleton and is one major mechanism of CD28 costimulation. Liga-
tion of CD28 alone, or ligation of the CD28-like molecules CTLA-4 (CD152) and ICOS (CD278)
induces actin polymerization with cell elongation and generation of lamellipodia and filopo-
dia in T cells. These changes are dependent on Src, PI3-kinase, Vav, and Rho family GTPases.
Whereas CD28 and CTLA-4 have been shown to be functional and physically associated with
lipid rafts, the presence of ICOS in lipid rafts or its effect in raft clustering is not known. In
this work, we have activated the T cell line D10 with anti-ICOS antibodies, alone or combined
with anti-CD3 antibodies, bound or unbound to polystyrene microbeads or glass coverslips.
The possible relationship of ICOS-induced changes in actin cytoskeleton to the ICOS local-
ization in membrane rafts was then analyzed by fluorescence microscopy, or by immunoblot
of detergent insoluble (“raft”) or soluble (“non-raft”) fractions of cell lysates. Our data show
that ICOS promotes TCR/CD3 induction of raft clustering at the site of activation. However,
ICOS, which, on its own, can induce accumulations of polymerized actin, is undetectable in
membrane rafts, even when using CD3 or ICOS, ligands capable of inducing clear changes
in the actin cytoskeleton.
© 2011 Sociedad Española de Inmunología. Published by Elsevier España, S.L. All rights
reserved.
∗ Corresponding author at: Departamento de Medicina Molecular y Celular, Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Ramiro de Maeztu,9. 28040 Madrid, Spain. Tel.: +34 91 837 3112x4217; fax: +34 91 536 0432.
E-mail address: [email protected] (J.M. Rojo).0213-9626/$ – see front matter © 2011 Sociedad Española de Inmunología. Published by Elsevier España, S.L. All rights reserved.doi:10.1016/j.inmuno.2011.06.002
