UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE … · titulado ―Influencia de la actividad...

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

CARRERA: QUÍMICA FARMACÉUTICA

TEMA: “INFLUENCIA DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DEL

EXTRACTO DE CHAMANA (Dodonaea viscosa) EN LA ESTABILIDAD DE

JARABE DE VITAMINA C”

Trabajo de investigación presentado como requisito previo para a la obtención del título

de

QUÍMICO FARMACÉUTICO

Autor: Mireya Elizabeth Medina Vela

Tutor: Dra. Dayana Paulina Borja Espín

DMQ, Febrero, 2017

ii

Influencia de la actividad antioxidante del extracto

de Chamana (Dodonaea vicosa) en la estabilidad

de jarabe de vitamina C,

Mireya Medina,

Quito, Febrero 2017

iii

DEDICATORIA

A mis padres, Verónica Vela y Roberto Medina puesto que este logro en mi vida es

debido a su apoyo incondicional, consejos y dignos ejemplos de superación, por haber

confiado en mí y brindarme la oportunidad de triunfar.

A mi ñaño, Josué por su cariño constante, travesuras y manera de ser que fueron un

pilar importante en este camino.

A toda mi familia materna y paterna que puso un granito de arena para que uno más de

mis propósitos se hiciera realidad.

iv

AGRADECIMIENTOS

A Dios, por llegar a mi vida y permitirme terminar una de mis metas.

A la Universidad Central del Ecuador y en especial a la Facultad de Ciencias Químicas

por hacer posible el aprendizaje continuo en sus aulas.

A mis padres, que pusieron toda la confianza y esperanza en mí, apoyándome en toda

circunstancia realizando el mayor esfuerzo para suplir mis necesidades.

A mi hermano, Anthony Josue, mi pequeño, por ser el motor para seguir con la lucha

diaria.

A mi tutora, Dra. Dayana Borja, por ser más que una maestra, una amiga

incondicional, quien me ha proporcionado su tiempo, paciencia y su sólido

conocimiento guiándome a lo largo de esta etapa de mi vida.

A la Dra. Liliana Naranjo por encaminar y dirigir el presente trabajo, con su

conocimiento acertado.

Al Dr. Javier Santamaría por apoyarme y guiarme con su conocimiento en el

desarrollo de este trabajo de investigación.

Al Dr. Pablo Bonilla por abrirme las puertas del laboratorio de Nano estructuras y

brindarme su conocimiento y apoyo a lo largo del proceso.

A mi tía Mery, que en paz descanse, quién se intervino, siempre que parecía que mi

camino ya no continuaba.

A toda mi familia, que siempre estuvieron allí aportando, para que un anhelo más se

lleve a cabo.

A tod@s mis amig@s, por su colaboración en todo momento.

v

AUTORIZACIÓN DE AUTORÍA INTELECTUAL

Yo, Mireya Elizabeth Medina Vela, en calidad de autora del trabajo de investigación:

―Influencia de la actividad antioxidante del extracto de Chamana (Dodonaea

viscosa) en la estabilidad de jarabe de vitamina C” autorizo a la Universidad Central

de Ecuador a hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o parte de los que

contiene esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.

Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente

autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los

artículos 5, 6, 8; 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su

Reglamento.

También autorizo a la Universidad Central de Ecuador a realizar la digitalización y

publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de conformidad a

lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.

Firma:

_______________________________

MIREYA ELIZABETH MEDINA VELA

CI: 1721526752

vi

CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TUTOR

Yo, Dayana Paulina Borja Espín en calidad de tutor del trabajo de investigación

titulado ―Influencia de la actividad antioxidante del extracto de Chamana

(Dodonaea viscosa) en la estabilidad de jarabe de vitamina C”, elaborado por la

estudiante Mireya Elizabeth Medina Vela de la Carrera de Química Farmacéutica,

Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador, considero que el

mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo metodológico y en el

campo epistemológico, por lo que lo APRUEBO, a fin de que sea sometido a la

evaluación por parte del tribunal calificador que se designe.

En la ciudad de Quito, a los 17 días del mes de Febrero de 2017

Dra. DAYANA PAULINA BORJA ESPÍN

CI. 1710993849

vii

CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TRABAJO FINAL POR TRIBUNAL

El tribunal constituido por: Dra. Liliana Naranjo, Dra. Dayana Borja y Dr. Javier

Santamaría, luego de revisar el trabajo de investigación titulado: ―Influencia de la

actividad antioxidante del extracto de Chamana (Dodonaea viscosa) en la

estabilidad de jarabe de vitamina C” previo a la obtención del título de Química

Farmacéutica presentado por la señorita Mireya Elizabeth Medina Vela APRUEBA el

trabajo presentado.

Para constancia de lo actuado firman:

viii

Índice de contenidos

CAPÍTULO I ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 1

EL PROBLEMA ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 1

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA -------------------------------------------------------------------------------------------------- 1

FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 2

PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 2

OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN -------------------------------------------------------------------------------------------------- 3

Objetivo general. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 3

Objetivos específicos. ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 3

JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA ----------------------------------------------------------------------------------------------- 3

CAPÍTULO II --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 5

MARCO REFERENCIAL O MARCO TEÓRICO --------------------------------------------------------------------------------- 5

ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACIÓN --------------------------------------------------------------------------------------------- 5

FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA --------------------------------------------------------------------------------------------------- 6

FUNDAMENTO BOTÁNICO Y TAXONÓMICO ---------------------------------------------------------------------------------------- 6 Familia. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 6

Nombre Científico. ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 6

Nombre Común. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 7

Sinonimia. --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 7

Distribución geográfica. --------------------------------------------------------------------------------------------------- 7

Descripción botánica. ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 7

Usos medicinales. ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 8

Composición química. ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 8

Etnofarmacología. ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 8

ESPECIES REACTIVAS DE OXIGENO Y RADICALES LIBRES --------------------------------------------------------------------------- 9

ANTIOXIDANTES --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 9

Definición. --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 9

Clasificación de Antioxidantes. ------------------------------------------------------------------------------------------ 9 Por la fuente. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 9 Por su función. --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 10 Por su mecanismo de acción. -------------------------------------------------------------------------------------------------- 10 Conforme su estructura química. --------------------------------------------------------------------------------------------- 11

Tipo de interacciones entre antioxidantes. ------------------------------------------------------------------------- 12 Sinergismo. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 12 Adición. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 12 Antagonismo. ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 12

VITAMINA C ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 13

Fuentes de Ácido Ascórbico. -------------------------------------------------------------------------------------------- 13

Requerimientos de Ácido Ascórbico. --------------------------------------------------------------------------------- 14 Nota: Tomada de (National Institutes of Health, 2016). ----------------------------------------------------------------- 14 Nota: Tomada de (National Institutes of Health, 2016). ----------------------------------------------------------------- 14

Estructura Química del Ácido Ascórbico.---------------------------------------------------------------------------- 15

Propiedades Químicas y Físicas. --------------------------------------------------------------------------------------- 15

Bioquímica del Ácido Ascórbico. -------------------------------------------------------------------------------------- 16

Degradación del Ácido Ascórbico. ------------------------------------------------------------------------------------ 16

ix

ESTABILIDAD ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 18

Estudios de Estabilidad. ------------------------------------------------------------------------------------------------- 18

Degradación forzada. ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 18

Estabilidad de Ácido ascórbico.---------------------------------------------------------------------------------------- 18 En soluciones acuosas. ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 18

ANTIOXIDANTES PARA VITAMINAS ----------------------------------------------------------------------------------------------- 19

METABISULFITO DE SODIO ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 20

Estructura química. ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 20

Propiedades químicas y físicas. ---------------------------------------------------------------------------------------- 20

Métodos analíticos para la determinación de ácido ascórbico. ---------------------------------------------- 21

DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE ---------------------------------------------------------------------------- 22

Ensayo del DPPH (1,1 – difenil-2-picril-hidrazilo). ---------------------------------------------------------------- 23

HIPÓTESIS -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 23

CAPÍTULO III ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 24

METODOLOGÍA DE INVESTIGACIÓN ---------------------------------------------------------------------------------------- 24

DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 24

MATERIALES Y MÉTODOS --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 24

Etapa I ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 24

Etapa II: ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 24

Etapa III ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 24 Valoración de ácido ascórbico. ------------------------------------------------------------------------------------------------ 24

Etapa IV ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 25 Adecuación del sistema. --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 26 Especificidad. ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 26 Exactitud.---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 26 Precisión. ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 26

Equipos. ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 27

Materiales. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 27

Reactivos. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 27

DISEÑO EXPERIMENTAL ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 28

Etapa IV. --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 28 Variables. ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 28 Diseño factorial modelo AXB. -------------------------------------------------------------------------------------------------- 28 Anova. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 29 Hipótesis para el diseño factorial AXB. -------------------------------------------------------------------------------------- 29

Etapa V. ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 30 Variables. ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 30 Diseño factorial modelo AXB. -------------------------------------------------------------------------------------------------- 31 Hipótesis para el análisis de varianza del diseño factorial AXB. ------------------------------------------------------- 31

MATRIZ DE OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES ------------------------------------------------------------------------------- 33

TÉCNICAS Y PROCESAMIENTO DE DATOS (ANÁLISIS ESTADÍSTICO) -------------------------------------------------------------- 33

CAPÍTULO IV ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 34

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ---------------------------------------------------------------------------------- 34

RESULTADOS----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 34

Etapa I ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 34 Determinación de la capacidad antioxidante.------------------------------------------------------------------------------ 34 Cálculo del Porcentaje de inhibición del radical DPPH. ------------------------------------------------------------------ 35

Etapa II ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 36 Cálculo de la concentración del extracto de Dodonaea viscosa. ------------------------------------------------------ 37

x

Etapa III ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 37 Valoración de ácido ascórbico. ------------------------------------------------------------------------------------------------ 37 Cálculo de la cantidad de ácido ascórbico en cada jarabe. ------------------------------------------------------------- 38 Corrección de ácido ascórbico en cada jarabe. ---------------------------------------------------------------------------- 38

Etapa IV ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 38 Corrección de pureza y humedad del estándar de ácido ascórbico. -------------------------------------------------- 38 Cálculo de la cantidad de ácido ascórbico presente en el jarabe ------------------------------------------------------ 38 Especificidad. ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 40 Exactitud y precisión.------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 47 Determinación Cuantitativa. --------------------------------------------------------------------------------------------------- 48 Análisis estadístico – contenido de vitamina C. ---------------------------------------------------------------------------- 52

Etapa V ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 54 Cálculo del volumen de jarabe. ------------------------------------------------------------------------------------------------ 54 Determinación de la capacidad antioxidante.------------------------------------------------------------------------------ 55 Cálculo del Porcentaje de inhibición del radical DPPH. ------------------------------------------------------------------ 57 Análisis estadístico - % de inhibición ----------------------------------------------------------------------------------------- 62

Etapa VI ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 64 Controles organolépticos y físicos de jarabe de vitamina C. ------------------------------------------------------------ 64 Control microbiológico del jarabe de vitamina C a días 1 y 90. -------------------------------------------------------- 65

CAPÍTULO V ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 66

CONCLUSIONES -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 66

RECOMENDACIONES -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 67

BIBLIOGRAFÍA---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 68

xi

Índice de Anexos

ANEXO 1 – DIAGRAMA CAUSA – EFECTO. ESPINA DE PESCADO ------------------------------------ 73

ANEXO 2 - PRUEBAS PRELIMINARES – CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DEL EXTRACTO

HIDROALCOHÓLICO DE DODONAEA VISCOSA EN RELACIÓN AL ÁCIDO ASCÓRBICO. ---- 74

ANEXO 3 – DIAGRAMA DE FLUJO DE OBTENCIÓN DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO

DE DODONAEA VISCOSA ------------------------------------------------------------------------------------------- 74

ANEXO 4 – DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO DE ELABORACIÓN DEL JARABE ---------- 76

ANEXO 5 – VALORACIÓN DE ÁCIDO ASCÓRBICO -------------------------------------------------------- 78

ANEXO 6 – DIAGRAMA DE FLUJO DE DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD

ANTIOXIDANTE – DPPH --------------------------------------------------------------------------------------------- 79

ANEXO 7 – CONTROL DE CALIDAD ---------------------------------------------------------------------------- 80

ANEXO 8 – VOUCHER ------------------------------------------------------------------------------------------------ 81

ANEXO 9 - AUTENTICACIÓN BOTÁNICA --------------------------------------------------------------------- 82

xii

Índice de Figuras

FIGURA 2.1: DODONAEA VISCOSA TOMADA POR MIREYA MEDINA, EN PARQUE NACIONAL Y BOSQUE PROTECTOR

JERUSALEM. --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 7

FIGURA 2.2: REACCIÓN DIRECTA DE VITAMINA E (TOH) CON RADICAL (*OH) (A) Y VITAMINA C (ASCH

-) CON ROO

* (B) Y

REGENERACIÓN DE VITAMINA E A PARTIR DE LA VITAMINA C (C)TOMADO DE(LÜ, LIN, YAO, & CHEN, 2010). -------- 10

FIGURA 2.3: ANTIOXIDANTES FENÓLICOS: BUTILHIDROXIANISOL (BHA), BUTILHIDROXITOLUENO (BHT) TOMADO DE (TSAO,

2015). ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 11

FIGURA 2.4: ESTRUCTURA DE UN CAROTENOIDE TOMADO DE (PAUL, 2016). --------------------------------------------------- 11

FIGURA 2.5: ESTRUCTURA DE EDTA TOMADO DE (PUBCHEM, 2016). ---------------------------------------------------------- 11

FIGURA 2.6: A) ESTRUCTURA DE DÍMERO DE CATALASA PEQUEÑA B) TETRÁMERO DE CATALASA TOMADO DE (DÍAZ, 2003). 12

FIGURA 2.7: ESTRUCTURA QUÍMICA DEL ÁCIDO ASCÓRBICO. TOMADA DE: (PUBCHEM, 2016). ------------------------------- 15

FIGURA 2.8: REACCIONES DE DEGRADACIÓN DEL ÁCIDO ASCÓRBICO. ABREVIACIONES: ÁCIDO ASCÓRBICO, H2A; MONOANIÓN

DE ÁCIDO ASCÓRBICO, HA-; TAUTOMEROCETO, H2A-KETO Y HA

-KETO; ACIDODEHIDROASCORBICO, A; ANION RADICAL

DEHIDROASCORBATO, A-.; CATALIZADOR ION METALICO, M

N+; ACIDO 2,3-DICETOGULONICO, DKG; 3-

DEOXIPENTOSANO, DP; XILOSANO, X; ACIDO 3,4-DIHIDRO-2-FURANCARBOXILICO, FA. TOMADO DE (GREGORY III,

PÁG. 386). -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 17

FIGURA 2.9: ESTRUCTURA QUÍMICA DEL METABISULFITO DE SODIO. TOMADA DE: (PUBCHEM, 2016). ----------------------- 20

FIGURA 2.10: PARTES DE UN EQUIPO CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN, TOMADO DE (TECNOFROM).-------- 22

FIGURA 2.11: ESTRUCTURA DEL DPPH ANTES Y DESPUÉS DE LA REACCIÓN CON EL ANTIOXIDANTE TOMADA DE (TOVAR DEL

RÍO, 2013). ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 23

FIGURA 4.1 CROMATOGRAMA DE SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE VITAMINA C .................................................................... 40

FIGURA 4.2: CROMATOGRAMA DE SOLUCIÓN DE MATERIA PRIMA DE VITAMINA C ....................................................... 40

FIGURA 4.3: CROMATOGRAMA DEL SOLVENTE ...................................................................................................... 40

FIGURA 4.4: CROMATOGRAMA DE PLACEBO......................................................................................................... 40

FIGURA 4.5: CROMATOGRAMA DE EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DE DODONAEA VISCOSA ............................................ 41

FIGURA 4.6: CROMATOGRAMA DE JARABE DE VITAMINA C – LIBRE DE ANTIOXIDANTE .................................................. 41

FIGURA 4.7: CROMATOGRAMA DE VITAMINA C + ANTIOXIDANTE NATURAL ............................................................... 41

FIGURA 4.8: CROMATOGRAMA DE JARABE DE VITAMINA C + ANTIOXIDANTE SINTÉTICO ............................................... 41

FIGURA 4.9: CROMATOGRAMA DE JARABE LIBRE DE ANTIOXIDANTE EN MEDIO ÁCIDO ................................................... 42

FIGURA 4.10: CROMATOGRAMA DE JARABE CON ANTIOXIDANTE NATURAK EN MEDIO ÁCIDO. ........................................ 42

FIGURA 4.11: CROMATOGRAMA DE JARABE CON ANTIOXIDANTE SINTÉTICO EN MEDIO ÁCIDO. ........................................ 42

FIGURA 4.12: CROMATOGRAMA DE JARABE LIBRE DE ANTIOXIDANTE EN MEDIO BÁSICO. ............................................... 43

FIGURA 4.13: CROMATOGRAMA DE JARABE CON ANTIOXIDANTE NATURAL EN MEDIO BÁSICO......................................... 43

FIGURA 4.14: CROMATOGRAMA DE JARABE CON ANTIOXIDANTE SINTÉTICO EN MEDIO BÁSICO. ...................................... 43

FIGURA 4.15: CROMATOGRAMA DE JARABE LIBRE DE ANTIOXIDANTE EN MEDIO H2O2 .................................................. 44

FIGURA 4.16: CROMATOGRAMA DE JARABE DE ANTIOXIDANTE NATURAL EN MEDIO H2O2. ............................................ 44

FIGURA 4.17: CROMATOGRAMA DE JARABE CON ANTIOXIDANTE SINTÉTICO EN MEDIO H2O2. ........................................ 44

FIGURA 4.18: CROMATOGRAMA DE JARABE LIBRE DE ANTIOXIDANTE – TEMPERATURA 60ºC ......................................... 45

FIGURA 4.19: CROMATOGRAMA DE JARABE CON ANTIOXIDANTE NATURAL – TEMPERATURA 60ºC. ................................ 45

FIGURA 4.20: CROMATOGRAMA DE JARABE CON ANTIOXIDANTE SINTÉTICO – TEMPERATURA 60ºC. ............................... 45

FIGURA 4.21: CROMATOGRAMA DE JARABE LIBRE DE ANTIOXIDANTE – LUZ UV. ......................................................... 46

FIGURA 4.22: CROMATOGRAMA DE JARABE CON ANTIOXIDANTE NATURAL – LUZ UV. .................................................. 46

FIGURA 4.23: CROMATOGRAMA DE JARABE CON ANTIOXIDANTE SINTÉTICO – LUZ UV. ................................................. 46

xiii

Índice de Tablas

TABLA 2. 1 REQUERIMIENTO DIARIO DE VITAMINA C, ACORDE LA EDAD ----------------------- 14

TABLA 2. 2 LÍMITES MÁXIMOS DIARIOS RECOMENDADOS DE VITAMINA C ----------------------------- 14

TABLA 2. 3 PROPIEDADES QUÍMICAS Y FÍSICAS DEL ÁCIDO ASCÓRBICO -------------------------------- 15

TABLA 2. 4 ESTABILIZADORES DE ÁCIDO ASCÓRBICO EN SOLUCIONES ACUOSAS ------------------- 19

TABLA 2. 5 ANTIOXIDANTES PARA VITAMINAS ---------------------------------------------------------------------- 19

TABLA 2. 6 PROPIEDADES QUÍMICAS Y FÍSICAS DEL METABISULFITO DE SODIO --------------------- 20

TABLA 3. 1 FORMULACIÓN DE JARABE DE VITAMINA C ................................................................... 25

TABLA 3. 2 PARÁMETROS DE CUANTIFICACIÓN DE VITAMINA C, POR HPLC EN FASE REVERSA

.......................................................................................................................................................... 25

TABLA 3. 3 ESTUDIOS DE DEGRADACIÓN .............................................................................................. 26

TABLA 3. 4 CARACTERÍSTICAS DE DISEÑO ............................................................................................ 28

TABLA 3. 5 CARACTERÍSTICAS DE LOS FACTORES DE ESTUDIO ....................................................... 28

TABLA 3. 6 COMBINACIONES ENTRE FACTORES – CONCENTRACIÓN DE VITAMINA C ................ 29

TABLA 3. 7 TABLA DE ANOVA .............................................................................................................. 29

TABLA 3. 8 CARACTERÍSTICAS DE LOS FACTORES DE ESTUDIO ....................................................... 31

TABLA 3. 9 COMBINACIONES ENTRE FACTORES – PORCENTAJE DE INHIBICIÓN DE RADICALES

LIBRES (DPPH) ............................................................................................................................. 31

TABLA 3. 10 MATRIZ DE OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES ..................................................... 33

TABLA 4. 1 ABSORBANCIAS DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DE DODONAEA VISCOSA ------ 34

TABLA 4. 2 ABSORBANCIAS DEL BLANCO DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DE DODONAEA

VISCOSA -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 34

TABLA 4. 3 ABSORBANCIAS DE MUESTRAS DE VITAMINA C ------------------------------------------------- 35

TABLA 4. 4 ABSORBANCIAS DEL BLANCO DE MUESTRAS DE VITAMINA C ----------------------------- 35

TABLA 4. 5 ABSORBANCIAS DE LA SOLUCIÓN DEL REACTIVO 2,2-DIFENIL-1-1HIDRAZILO

/DPPH) -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 35

TABLA 4. 6 VALORES DE PORCENTAJE DE INHIBICIÓN DE RADICAL DPPH DEL EXTRACTO

HIDROALCOHÓLICO DE DODONAEA VISCOSA -------------------------------------------------------------- 36

TABLA 4. 7 VALORES DE PORCENTAJE DE INHIBICIÓN DE RADICAL DPPH DE VITAMINA C --- 36

TABLA 4. 8 DATOS DE RECOLECCIÓN------------------------------------------------------------------------------------- 36

TABLA 4. 9 DATOS DE LA OBTENCIÓN DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DE DODONAEA

VISCOSA. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 37

TABLA 4. 10 CONCENTRACIÓN DEL EXTRACTO DE LA PLANTA ---------------------------------------------- 37

TABLA 4. 11 DATOS DE VALORACIÓN DE ÁCIDO ASCÓRBICO ------------------------------------------------- 37

TABLA 4. 12 DATOS DEL ESTÁNDAR DE ÁCIDO ASCÓRBICO --------------------------------------------------- 38

TABLA 4. 13 PARÁMETROS DEL MÉTODO CROMATOGRÁFICO EMPLEADO ------------------------------ 47

TABLA 4. 14 VALORES DE CONCENTRACIÓN DE PRINCIPIO ACTIVO DEL JARABE DE VITAMINA

C A TIEMPO CERO (1 DÍA). ----------------------------------------------------------------------------------------- 48

xiv


C A 15 DÍAS -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 48


C A 30 DÍAS -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 49


C A 60 DÍAS -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 50


C A 90 DÍAS -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 50

TABLA 4. 19 RESUMEN DE CONTENIDO DE VITAMINA C (MG/5ML) EN EL JARABE ------------------ 51

TABLA 4. 20 ANÁLISIS DE VARIANZA PARA CONCENTRACIÓN DE VITAMINA C -------------------- 52

TABLA 4. 21 PRUEBAS DE MÚLTIPLE RANGOS PARA CONCENTRACIÓN DE VITAMINA C POR

TIPO DE ANTIOXIDANTE. ------------------------------------------------------------------------------------------- 53

TABLA 4. 22 ABSORBANCIAS DE LA SOLUCIÓN DEL REACTIVO 2,2-DIFENIL-1-1HIDRAZILO

/DPPH), A LOS TIEMPOS (1, 15, 30, 60 Y 90 DÍAS). --------------------------------------------------- 55

TABLA 4. 23 ABSORBANCIAS DEL JARABE DE VITAMINA C LIBRE DE ANTIOXIDANTE, A LOS

TIEMPOS (1, 15, 30, 60 Y 90 DÍAS). ---------------------------------------------------------------------------- 55

TABLA 4. 24 ABSORBANCIAS DEL BLANCO DEL JARABE DE VITAMINA C LIBRE DE

ANTIOXIDANTE, A LOS TIEMPOS (1, 15, 30, 60 Y 90 DÍAS). ---------------------------------------- 55

TABLA 4. 25 ABSORBANCIAS DEL JARABE DE VITAMINA C + ANTIOXIDANTE NATURAL, A LOS

TIEMPOS (1, 15, 30, 60 Y 90 DÍAS). ---------------------------------------------------------------------------- 56

TABLA 4. 26 ABSORBANCIAS DEL BLANCO DEL JARABE DE VITAMINA C + ANTIOXIDANTE

NATURAL, A 1OS TIEMPOS (1, 15, 30, 60 Y 90 DÍAS). ------------------------------------------------- 56

TABLA 4. 27 ABSORBANCIAS DE JARABE DE VITAMINA C + ANTIOXIDANTE SINTÉTICO, A LOS

TIEMPOS (1, 15, 30, 60 Y 90 DÍAS). ---------------------------------------------------------------------------- 56

TABLA 4. 28 ABSORBANCIAS DEL BLANCO DEL JARABE DE VITAMINA C + ANTIOXIDANTE

SINTÉTICO, A LOS TIEMPOS (1,15, 30, 60 Y 90 DÍAS).------------------------------------------------- 57

TABLA 4. 29 VALORES DE PORCENTAJE DE INHIBICIÓN DE RADICAL DPPH DEL JARABE DE

VITAMINA C LIBRE DE ANTIOXIDANTE, A LOS TIEMPOS (1, 15, 30, 60 Y 90 DÍAS). ---- 57

TABLA 4. 30 RESUMEN DE PORCENTAJE DE INHIBICIÓN DE RADICAL DPPH DEL JARABE DE

VITAMINA C LIBRE DE ANTIOXIDANTE, A LOS TIEMPOS (1, 15, 30, 60 Y 90 DÍAS). ----- 58


VITAMINA C + ANTIOXIDANTE NATURAL, A LOS TIEMPOS (1, 15, 30, 60 Y 90 DÍAS). - 58


VITAMINA C + ANTIOXIDANTE NATURAL, A LOS TIEMPOS (1, 15, 30, 60 Y 90 DÍAS). - 59


VITAMINA C + ANTIOXIDANTE SINTÉTICO (METABISULFITO DE SODIO), A LOS TIEMPOS

(1, 15, 30, 60 Y 90 DÍAS). ------------------------------------------------------------------------------------------ 59


VITAMINA C + ANTIOXIDANTE SINTÉTICO (METABISULFITO DE SODIO), A LOS TIEMPOS

(1, 15, 30, 60 Y 90 DÍAS). ------------------------------------------------------------------------------------------ 60


VITAMINA C: LIBRE DE ANTIOXIDANTE, CON ANTIOXIDANTE NATURAL Y CON

ANTIOXIDANTE SINTÉTICO A LOS TIEMPOS (1, 15, 30, 60 Y 90 DÍAS). ------------------------ 60

TABLA 4. 36 ANÁLISIS DE VARIANZA PARA INHIBICIÓN DE RADICALES LIBRES --------------------- 62

xv

TABLA 4. 37 PRUEBAS DE MÚLTIPLE RANGOS PARA INHIBICIÓN DE RADICALES LIBRES POR

TIPO DE ANTIOXIDANTE -------------------------------------------------------------------------------------------- 62

TABLA 4. 38 PARÁMETROS ORGANOLÉPTICOS Y FÍSICOS DEL JARABE DE VITAMINA C LIBRE DE

ANTIOXIDANTE A DÍAS: 1, 15, 30, 60 Y 90. ---------------------------------------------------------------- 64

TABLA 4. 39 PARÁMETROS ORGANOLÉPTICOS Y FÍSICOS DEL JARABE DE VITAMINA C +

ANTIOXIDANTE NATURAL A DÍAS: 1, 15, 30, 60 Y 90 ------------------------------------------------- 64

TABLA 4. 40 PARÁMETROS ORGANOLÉPTICOS Y FÍSICOS DEL JARABE DE VITAMINA C +

ANTIOXIDANTE SINTÉTICO A DÍAS: 1, 15, 30, 60 Y 90. ----------------------------------------------- 65

TABLA 4. 41 CONTROL MICROBIOLÓGICO ------------------------------------------------------------------------------ 65

xvi

Índice de Gráficos

GRÁFICO 4. 1: TIPO DE ANTIOXIDANTE VS CONCENTRACIÓN DE VITAMINA C TIEMPO CERO (DÍA 1) ---------------------------- 48

GRÁFICO 4. 2: TIPO DE ANTIOXIDANTE VS CONCENTRACIÓN DE VITAMINA C A 15DÍAS ----------------------------------------- 49

GRÁFICO 4. 3: TIPO DE ANTIOXIDANTE VS CONCENTRACIÓN DE VITAMINA C A 30 DÍAS ---------------------------------------- 49



GRÁFICO 4. 6: RELACIÓN TIPO DE ANTIOXIDANTE, TIEMPO Y CONCENTRACIÓN DE VITAMINA C. ------------------------------- 51

GRÁFICO 4. 7: GRÁFICA DE MEDIAS – PRUEBAS DE MÚLTIPLE RANGOS PARA CONCENTRACIÓN DE VITAMINA C POR TIPO DE

ANTIOXIDANTE. ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 53

GRÁFICO 4. 8: EFECTO DE LAS INTERACCIONES DE DOS FACTORES (TIPO DE ANTIOXIDANTE Y TIEMPO) SOBRE LA

CONCENTRACIÓN DE VITAMINA C (MG/5ML). ------------------------------------------------------------------------------ 54

GRÁFICO 4. 9: TIEMPO VS % INHIBICIÓN DE RADICAL DPPH – JARABE DE VITAMINA C LIBRE DE ANTIOXIDANTE -------------- 58

GRÁFICO 4. 10: TIEMPO VS % INHIBICIÓN DE RADICAL DPPH – JARABE DE VITAMINA C + ANTIOXIDANTE NATURAL. -------- 59

GRÁFICO 4. 11: TIEMPO VS % INHIBICIÓN DE RADICAL DPPH – JARABE DE VITAMINA C + ANTIOXIDANTE SINTÉTICO. ------- 60

GRÁFICO 4. 12: % INHIBICIÓN DE RADICAL DPPH EN FUNCIÓN DEL TIEMPO Y TIPO DE ANTIOXIDANTE. ----------------------- 61

GRÁFICO 4. 13: GRÁFICA DE MEDIAS – PRUEBAS DE MÚLTIPLE RANGOS PARA INHIBICIÓN DE RADICALES LIBRES POR TIPO DE

ANTIOXIDANTE. ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 63

GRÁFICO 4. 14: EFECTO DE LAS INTERACCIONES DE DOS FACTORES (TIPO DE ANTIOXIDANTE Y TIEMPO) SOBRE EL PORCENTAJE

DE INHIBICIÓN DE RADICALES LIBRES (DPPH). ------------------------------------------------------------------------------ 63

xvii

Lista de abreviaturas

HPLC: Cromatografía líquida de alta eficacia

DPPH: 2,2-difenil-picrilhidracilo

EDTA: ácido etilendiaminotetraacético

xviii

TÍTULO

“INFLUENCIA DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DEL EXTRACTO DE

CHAMANA (Dodonaea viscosa) EN LA ESTABILIDAD DE JARABE DE

VITAMINA C.”

AUTOR: Mireya Elizabeth Medina Vela

TUTOR: MSc. Dayana Paulina Borja Espín

Resumen

Hasta la fecha se conoce que Dodonaea viscosa tiene potencial biológico, gracias a

metabolitos como: flavonoides, saponinas, taninos, azúcares reductores y esteroides,

presentes principalmente en su raíz y hojas. Entre sus atributos resalta su actividad

antioxidante, motivo por el cual, en este trabajo se evaluó cómo influye la capacidad

antioxidante que presenta el extracto hidroalcohólico de Dodonaea viscosa en la

estabilidad del jarabe de vitamina C. En esta investigación se realizaron tres lotes piloto

de jarabe de ácido ascórbico: el primero libre de antioxidante, el segundo con

antioxidante natural y el tercero con antioxidante sintético, estos fueron sometidos a un

estudio de estabilidad acelerado, bajo los siguientes parámetros: 3 meses, T: 40±2ºC;

HR: 75±5% según la guía Q1A (R2) de la ICH. Se consiguió una referencia cuantitativa

de la estabilidad de los jarabes mediante la determinación del contenido de su activo a

través de Cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC), además de su capacidad

antioxidante empleando como indicador el radical α,α-difenil-ß-picrilhidrazilo

(DPPH*). Los datos obtenidos fueron analizados mediante el software estadístico

Statgraphics Centurion 17.1.12 empleando un modelo factorial AXB. Como resultado

se obtuvo que, los factores de estudio: tipo de antioxidante, tiempo y sus interacciones

ejercen un efecto estadísticamente significativo sobre las dos variables respuestas

(Concentración de activo en mg/5ml y porcentaje de inhibición de radical DPPH) con

un 95% de nivel de confianza. Esto indica que en el producto con metabisulfito de sodio

la concentración de activo se mantiene con el tiempo, mientras que el jarabe con

antioxidante natural fue el que presentó mayor actividad antioxidante.

PALABRAS CLAVE: Dodonaea viscosa, CAPACIDAD ANTIOXIDANTE,

VITAMINA C, ESTABILIDAD.

xix

"INFLUENCE OF THE ANTIOXIDANT ACTIVITY OF CHAMANA

EXTRACT (Dodonaea viscosa) IN VITAMIN C SYRUP STABILITY."

AUTHOR: Mireya Elizabeth Medina Vela

TUTOR: MSc. Dayana Paulina Borja Espín

Abstract

Currently, it is known that Dodonaea viscosa has biological potential due to

metabolites, such as flavonoids, saponins, tannins, reducing sugars and steroids,

observed mainly in their root and leaves. The main purpose of this research was to

evaluate how the antioxidant capacity presented in the hydroalcoholic extract Dodonaea

viscosa leaves, influences the stability of the vitamin C syrup. Three pilot batches of

ascorbic acid syrup were carried out: the first free of antioxidant, the second with

natural antioxidant and the third with synthetic antioxidant. These samples were

subjected to an accelerated stability study, under the following parameters: 3 months, T:

40 ± 2 ° C; RH: 75 ± 5% according to ICH`s guide Q1A (R2). A quantitative reference

of syrup`s stability was achieved by determining the API`s content by High

Performance Liquid Chromatography (HPLC). In addition, the syrup`s antioxidant

capacity was set using the α, α-diphenyl-β-picrylhydrazyl radical (DPPH *) as an

indicator. The data obtained were analyzed using statistical software Statgraphics

Centurion 17.1.12 using an AXB factorial model. As a result, the study`s factors were:

antioxidant type, time and their interactions exert a statistically significant effect on the

two variable responses (concentration of ascorbic acid in mg / 5ml and inhibition

percent of radical DPPH) with a 95% assurance. Therefore, the product with the highest

API concentration over time was the one containing sodium metabisulfite. On the other

hand, the one with the highest antioxidant capacity was the syrup with natural

antioxidant.

KEYWORDS: Dodonaea viscosa, ANTIOXIDANT CAPACITY, VITAMIN C,

STABILITY.

xx

Introducción

En este estudio se obtuvo un extracto hidroalcohólico de Dodonaea viscosa, el cual

se lo adicionó en el jarabe de vitamina C para evaluar cómo influye en la estabilidad del

mismo, además se utilizó el metabisulfito de sodio como antioxidante sintético para

comparar con el natural (extracto) y conseguir mayor referencia acerca de la capacidad

antioxidante del producto terminado. Para tales propósitos se determinó la

concentración de ácido ascórbico presente en el producto final durante tres meses

mediante el método de HPLC, además de la actividad antioxidante mediante el método

de Blois (DPPH).

Para realizar un estudio más profundo, el presente trabajo consta de cuatro capítulos.

En el capítulo I, El problema, se detalla: el planteamiento, formulación del problema,

preguntas de investigación las mismas que son la base para establecer objetivos, además

de justificación e importancia. El capítulo II, Marco referencial o teórico, contiene:

antecedentes, fundamento teórico, hipótesis y sistema de variables. Metodología que es

el capítulo III abarca: diseño de investigación, métodos y materiales, diseño

experimental, matriz de operacionalización de variables y técnicas de procesamiento de

datos. El capítulo IV, Análisis y discusión, engloba los resultados. Finalmente el

capítulo V incluye: conclusiones y recomendaciones.

1

Capítulo I

El Problema

Planteamiento del problema

La vitamina C o ácido ascórbico, es un micronutriente hidrosoluble que el ser

humano incluye en su dieta diaria porque es indispensable para una serie de procesos o

funciones biológicas, además de no poseer la capacidad de sintetizarlo por sí solo,

puesto que carece de la enzima L-gulono-γ-lactona oxidasa (GLO) (Basabe Tuero,

1999).

La dosis de vitamina C a consumir cambia acorde algunos factores entre ellos la edad

y el sexo. Las cantidades recomendadas son: 45mg/día; 75mg/día; y 90mg/día; niños

hasta de 13 años, adolescentes hasta 18 años y adultos de 19 años o más

respectivamente (Medline Plus, 2015). Adicionalmente, el consumo de altas dosis no es

tóxico, pero puede producir problemas gastrointestinales y su exceso se eliminaría a

través de la orina sin ejercer ningún efecto beneficioso para la salud.

La ingesta de productos de origen vegetal ricos en ácido ascórbico, hoy en día, ha

disminuido considerablemente. Para contrarrestar, existe una amplia variedad de formas

farmacéuticas de vitamina C: comprimidos, cápsulas, comprimidos masticables,

gránulos, efervescentes, formas líquidas y alimentos fortificados. El ácido ascórbico,

debido a su estructura química, presenta fácil degradación por diversos factores:

presencia de oxígeno, metales, cambios de pH, concentraciones de sales y azúcares,

enzimas, aminoácidos, oxidantes y reductores (Ocampo, Ríos, Ocampo, & Betancur,

2008).

Jesse F. Gregory III. citado por Serra & Cafaro (2007) afirma: La degradación del

ácido ascórbico (AA) se lleva a cabo mediante procesos oxidativos que resultan de

la transferencia de dos electrones. Primeramente se origina el monoanión ascorbato

(AH-), el cual, con la pérdida adicional de un segundo electrón, forma el ácido L-

de-hidroascórbico (ADA), altamente inestable y susceptible a la hidrólisis del

anillo lactona, que se hidroliza con gran facilidad para producir ácido 2,3-

dicetogulónico (DCG), que posteriormente se degrada por descarboxilación, con la

consiguiente pérdida del valor nutricional del ácido ascórbico (AA) (p. 527).

2

Lo citado en el párrafo anterior, advierte que se debe tener cuidado especial durante

todo el proceso de elaboración, almacenamiento y consumo de las distintas formas

farmacéuticas. El activo presente en formas farmacéuticas líquidas como el jarabe, es el

más susceptible a degradación, porque al ser una solución acuosa facilita la hidrólisis

del anillo lactónico del ácido L-de-hidroascórbico.

El jarabe, al ser multidosis se encuentra más propenso agentes ambientales que

facilitan su degradación, además que en ciertas ocasiones las condiciones de

almacenamiento no son las óptimas lo cual es dependiente del consumidor,

disminuyendo así la concentración del principio activo responsable de la actividad

antioxidante.

Lo expuesto, conlleva a buscar nuevas alternativas para que el jarabe mantenga por

un mayor tiempo su propiedad antioxidante, de esta manera prolongar el tiempo de

consumo y contrarrestar los efectos dañinos causados por factores fisicoquímicos antes

indicados.

Formulación del problema

Como se evidenció anteriormente, la forma farmacéutica que es más susceptible a ser

afectada por factores físicos y químicos, produciendo así la degradación de vitamina C,

es el jarabe. De ahí, que el problema que se pretende resolver es:

¿Cómo influye la capacidad antioxidante que presenta el extracto hidroalcohólico de

Dodonaea viscosa en la estabilidad del jarabe de vitamina C?

Preguntas de investigación

¿Cómo conseguir un extracto de Dodonaea viscosa?

¿Cómo formular y elaborar un jarabe de vitamina C, con un antioxidante natural y

otro con un antioxidante sintético?

¿Cómo relacionar el efecto de un antioxidante natural y sintético sobre la estabilidad

del jarabe de vitamina C?

¿Cuál es la capacidad antioxidante del producto terminado?

3

Objetivos de la investigación

Objetivo general.

Evaluar la influencia de la capacidad antioxidante del extracto hidroalcohólico

de Dodonaea viscosa en la estabilidad del jarabe de vitamina C.

Objetivos específicos.

Recolectar y obtener un extracto hidroalcohólico de Dodonaea viscosa.

Formular y elaborar lotes piloto de jarabe de vitamina C empleando un

antioxidante natural (extracto hidroalcohólico de Dodonaea viscosa) y un jarabe

utilizando un antioxidante sintético (metabisulfito de sodio).

Efectuar un estudio de estabilidad acelerado a 40o 2

oC y 75 5 % de HR

durante 3 meses, acorde la guía Q1A (R2) de la ICH.

Comparar el efecto de un antioxidante natural y sintético sobre la estabilidad del

jarabe de vitamina C.

Determinar la capacidad antioxidante del producto terminado, empleando como

indicador el radical α,α-difenil-ß-picrilhidrazilo (DPPH*).

Justificación e Importancia

En la actualidad, la población consume un sin número de vitaminas para mantener su

salud, entre ellas, el ácido ascórbico. Esta vitamina hidrosoluble presenta propiedades

benéficas, una de las más relevantes es su capacidad antioxidante. Lo indicado

evidencia el por qué la industria farmacéutica ha desarrollado varias formas

farmacéuticas, acorde a las necesidades y comodidad del usuario.

Diferentes factores tales como: presencia de oxígeno, metales, cambios de pH,

concentraciones de sales y azúcares, enzimas, aminoácidos, oxidantes y reductores

(Ocampo, Ríos, Ocampo, & Betancur, 2008), luz, dosificación multidosis, entre otros

afectan directamente a la estabilidad del jarabe de vitamina C, siendo éste una de las

formas farmacéuticas líquidas más sensibles a los agentes citados. Aquello conlleva a la

búsqueda de nuevas alternativas, factibles, económicas, reproducibles de aplicar para

que el producto en cuestión sea más perdurable.

4

Existen diversas propuestas para evitar que el ácido ascórbico se degrade

rápidamente en las diferentes formas farmacéuticas, considerando que las líquidas son

las más vulnerables. Aprovechar la gran biodiversidad natural que tiene Ecuador

representa una opción, ya varias especies vegetales gozan de actividad antioxidante,

propiedad que podría ser significativa en cuanto a estabilidad del principio activo.

La adición del extracto hidroalcohólico de Dodonaea viscosa, al jarabe de vitamina

C, se lo realizó con varios objetivos: evitar la sobredosificación del activo en la forma

farmacéutica líquida representando un ahorro económico a nivel industrial, mantener las

cantidades iniciales del API por un mayor periodo de tiempo asegurando así el efecto

farmacoterapéutico, lo cual influye de manera positiva en la salud y economía de la

población que lo adquiera, además que se esperaría un efecto de adición o sinergismo

que potencie la capacidad antioxidante del activo de la forma farmacéutica líquida.

5

CAPÍTULO II

Marco Referencial o Marco Teórico

Antecedentes de la investigación

En la publicación, ―Comparación de la actividad antioxidante del extracto de té verde

con antioxidantes comerciales en una crema de hidroquinona al 2%‖, editada por

Morteza Semnani, Saeedi, & Nozadi, Junio 2003, en Sari Irán. Al adicionar 2% del

extracto de té verde a la crema de hidroquinona al 2% sometida a 25ºC y 45ºC de

temperatura presenta un 81% y 62% del API después de tres meses de estudio. Estos

valores son superiores a los obtenidos con los antioxidantes sintéticos empleados:

metabisulfito de sodio y butilhidroxitolueno (BHT) (Morteza Semnani, Saeedi, &

Nozadi, 2003). Lo citado conlleva a considerar que existe una gran influencia de los

extractos naturales en evitar la degradación de los activos presentes en las distintas

formulaciones.

Conforme al estudio ―Influencia de metabisulfito de sodio (SMB) y glutatión (GLT)

en la estabilidad de la vitamina C en una emulsión O/W y un gel acuoso‖, desarrollado

por Adriana M. Maia, y otros, febrero 2006 en Sau Pablo Brazil. Las formulaciones

requieren de un antioxidante para que la sustancia activa sea más estable bajo diferentes

condiciones de temperatura. Así, la emulsión O/W con SMB y GLT a 5.0 0.5ºC y

24 2ºC muestra >90,38% del API a los 90 días, mientras que el gel sometido a las

mismas condiciones exhibe >94,03% de la vitamina C a los 26 días (Maia, y otros,

2006). Los datos de esta investigación permiten definir que existe diferencia

significativa entre las formulaciones con antioxidante y sin este, lo cual sugiere que la

estabilidad de la forma farmacéutica se ve directamente afectada por la adición de un

antioxidante.

Existen estudios sobre la capacidad antioxidante del arbusto en cuestión, según el

trabajo ―Dodonaea viscosa planta rica en flavonoides y su potencial biológico‖

presentado por Manjilstha Dhananjay Pujar, realizado en la India en Julio del 2012. La

cantidad de compuestos fenólicos y polifenólicos son los responsables de la actividad

antioxidante de Dodonaea viscosa. Mediante un método espectrofotométrico se

determinó la cantidad de fenoles y flavonoides totales. Se empleó el ensayo de DPPH

(Difenil-picrilhidrazilo), para determinar la capacidad antioxidante de varios extractos

de mismo arbusto. Se llegó a la conclusión que el extracto con la mejor capacidad

antioxidante fue aquel en el que se usó etilacetato y metanol como solventes, además

que la raíz y las hojas fueron las partes de Dodonaea viscosa con mayor actividad

(Dhananjay Pujar, 2012).

6

En el trabajo, ―Efecto de metabisulfito de sodio y ácido etilendiaminotetraacético

disódico (EDTA) sobre la estabilidad del jarabe de vitamina C‖ ejecutada por Adepoju,

Olasehinde & Aderibigbe, Septiembre 2014, en Ondo Nigeria. Se elaboró jarabes de

vitamina C con diferentes concentraciones del API: a) 10% b) 25% y c) 50%, además

otros con: d) 10% de activo + antioxidante sintético el metabisulfito de sodio al 0,5%; e)

10% activo + agente quelante el EDTA al 0,0025% y f) 10% activo + metabisulfito de

sodio y EDTA. Todos los productos fueron almacenados a temperatura ambiente y

evaluados a lo largo de 49 días en un intervalo de 7 días. Los datos obtenidos reflejan

que el exceso de ácido ascórbico en el jarabe no influye en la estabilidad del mismo,

pero la adición de metabisulfito de sodio y del EDTA en el mismo producto contribuye

significativamente en la estabilidad (Adepoju, Olasehinde, & Aderibigbe, 2014).

Acorde al trabajo ―Determinación de la Actividad antioxidante de cuatro plantas

nativas del Ecuador‖ elaborado por Paredes Mayra en Quito, Ecuador en Mayo 2013. El

extracto hidroalcohólico de Dodonaea viscosa, a concentraciones de 50, 100, 150 y

200ug/ml presenta un porcentaje de inhibición de radicales libres igual a: 17,91; 72,91;

106,14 y 138,43 % respectivamente (Paredes González, 2013). En base a ello, a

Dodonaea viscosa se le asigna capacidad antioxidante pudiendo actuar como un buen

agente reductor.

Finalmente el extracto hidroalcohólico de Dodonaea viscosa que presenta a la

concentración de 200ug/ml un porcentaje de actividad antioxidante de 138% (Paredes

González, 2013) y el metabisulfito de sodio empleado en formulaciones orales a

concentraciones de 0,01 – 1,0% w/v (Rowe, Sheskey, & Quinn, 2009), son

antioxidantes prometedores para la elaboración del jarabe de vitamina C y evitar que

esta se degrade tan fácilmente.

Fundamentación Teórica

Fundamento botánico y taxonómico

Familia.

SAPINDACEA

Nombre Científico.

Dodonaea viscosa.

7

Nombre Común.

Chamana

Chacatea

Chacataya

Chacatia

Chamisa

Chapana (Villarpando, Villarpando, & Villalobos, 2011, pág. 11)

Sinonimia.

Como menciona Alonso, J. (2004) en el Tratado de Fitofármacos y Nutracéuticos,

citado por Paredes M.

DodonaeaarabicaHochst. &Steud.

DodonaeaarboreaHerter

DodonaeabialataKunth

DodonaeacandolleanaBlume

DodonaeacuneataRudge

Dodonaea dioica Roxb. ex DC.

Distribución geográfica.

Dodonaea viscosa crece en los trópicos, subtrópicos y es ampliamente distribuida en

regiones templadas de Australia, África, México, Nueva Zelanda, India, Islas Marianas

del Norte, Islas Vírgenes, Florida, Arizona, Sur América entre otros lugares (Dhananjay

Pujar, 2012). Es originaria de Suramérica. A nivel Nacional se encuentra distribuida en

las provincias de: Azuay, Cañar, Chimborazo, Cotopaxi, Galápagos, Imbabura, Loja,

Pichincha y Tungurahua (Ministerio del Ambiente y Corporación de Promoción de

Exportaciones e Inversiones, 2014).

Descripción botánica.

Figura 2.1: Dodonaea viscosa tomada por Mireya Medina, en Parque Nacional y Bosque Protector

Jerusalem.

8

Arbusto: Perennifolio, muy ramificado con un rico follaje.

Hojas: Lanceoladas, alargadas de hasta 12cm de largo, con base atenuada en un

corto peciolo, ápice agudo y sésiles o casi sésiles con nervios secundarios regulares y

rectos.

Inflorescencia: Más corta que las hojas, con todas las flores más o menos a la misma

altura.

Flores: Pequeñas, unisexuales, amarillentas, de unos 5mm de diámetro, cáliz 4

sépalos libres, flores masculinas con cinco a ocho estambres de filamentos cortos y

anteras grandes y con el ovario rudimentario, elipsoide, con 2-3 lóculos y ápice

lobulado (Villarpando, Villarpando, & Villalobos, 2011).

Fruto y semilla: Cápsula, con 3 alas y contiene de 1 a 2 semillas de color negro

(Dhananjay Pujar, 2012).

Usos medicinales.

Dodonaea viscosa a nivel de medicina tradicional ha sido ampliamente utilizada. Sus

hojas han sido empleadas para tratar: la gota, el reumatismo, heridas, inflamaciones,

quemaduras, picazón, dolores de cabeza, agente antiespasmódico y sus infusiones han

sido utilizadas para dolores de garganta. Su corteza aprovechada para baños, fomentos.

Los tallos se han destinado como fungicidas y para tratar el reumatismo. La

administración oral de la decocción de hojas y raíces sirve para aliviar desordenes

digestivos, úlceras, diarrea, etc. Las raíces pulverizadas son aplicadas como

antihelmíntico (Dhananjay Pujar, 2012).

Composición química.

En un análisis fitoquímico de las hojas del arbusto conocido vulgarmente como

Chamana se encontró que alcaloides, triterpenos, aminoácidos y glucósidos

cardiotónicos estaban ausentes, mientras que flavonoides, saponinas, taninos, azúcares

reductores y esteroides estaban presentes en las mismas (Sathish Kumar, Selvakumar,

Rao, & Anbuselvi, 2013).

Etnofarmacología.

La especie vegetal que se utiliza como base de esta investigación presenta varios

efectos farmacológicos entre los cuales cabe mencionar: antidiabético, antioxidante,

antiinflamatorio, antiulceroso, antimicrobiano (Dhananjay Pujar, 2012).

9

Especies Reactivas de Oxigeno y Radicales libres

Los radicales libres son átomos, moléculas o iones muy inestables y altamente

reactivos, puesto que en su estructura atómica presentan un electrón desapareado. Estas

pertenecen a un importante grupo de moléculas conocidas como especies reactivas de

oxígeno (ROS). Dentro de estas podemos encontrar: anión superóxido (O2-.

), el radical

perhidroxilo (HO2.), radical hidroxilo (

.OH), peróxido de hidrógeno (H2O2), oxígeno

singlete (1O2), entre otros (Lü, Lin, Yao, & Chen, 2010).

Antioxidantes

Definición.

Los antioxidantes neutralizan a las especies reactivas donándoles un electrón para

completar su orbital, en base a ello se menciona que un antioxidante es ―…toda

sustancia que hallándose presente a bajas concentraciones, con respecto a las de un

sustrato oxidable (biomolécula), retarda o previene la oxidación de dicho sustrato

(Halliwel y Gutteridge, 1998)‖(Criado Dabrowska & Moya Mir, 2011, p. 10).

Clasificación de Antioxidantes.

Existen diversas sustancias que presentan acción antioxidante, por tal motivo hay

diferentes vías para su clasificación, estas pueden ser acuerdo a: su fuente, función,

mecanismo de acción y estructura química.

Por la fuente.

Dependiendo de la fuente de la cual provienen pueden ser: naturales y sintéticos. Los

naturales generalmente se encuentran en las plantas entre ellos: polifenoles,

carotenoides, ácido ascórbico, tocoferoles. Antioxidantes sintéticos como su nombre lo

indica son sintetizados químicamente y evaluados toxicológicamente para el consumo

humano, entre estos se encuentran el BHT (Butilhidroxitolueno), BHA

(butilhidroxianisol), etc (Tsao, 2015).

10

Por su función.

De acuerdo a su función se pueden clasificar:

1. Captadores de radicales libres (scavengers) o terminadores los cuales inhiben la

formación de radicales libres en la fase de iniciación o en la fase de propagación.

Interrumpen las reacciones en cadena.

2. Quelantes que consiguen que iones metálicos dejen de ser inestables por la

transferencia de uno o más electrones.

3. Desactivadores del oxígeno singlete que llevan al oxígeno a su estado fundamental.

4. Regeneradores o sinergistas logran regenerar a otros antioxidantes cuando estos se

encuentran en el mismo sistema (figura 2.2).

Figura 2.2: Reacción directa de vitamina E (TOH) con radical (*OH) (A) y vitamina C (AscH

-) con ROO

*

(B) y regeneración de vitamina E a partir de la vitamina C (C) tomado de(Lü, Lin, Yao, & Chen, 2010).

5. Agentes reductores, son capaces de donar uno o más electrones para la

estabilización de compuestos oxidables.

6. Enzimas inhibidoras que inactivan las enzimas oxidativas (Tsao, 2015).

Por su mecanismo de acción.

Según su mecanismo de acción pueden ser primarios y secundarios. Los primarios

interrumpen las reacciones en cadena, mientras que los secundarios también conocidos

como preventivos retardan la formación de especies reactivas (Tsao, 2015). Una

diferencia clave entre estos antioxidantes es que en relación a los primarios, los

secundarios no generan radicales libres después de actuar. Los antioxidantes pueden

ejercer su efecto con más de un mecanismo de acción sobre un mismo sustrato por el

cual posean afinidad (Criado Dabrowska & Moya Mir, 2011).

11

Conforme su estructura química.

Compuestos fitoquímicos con diferentes estructuras pueden actuar como

antioxidantes mediante mecanismos distintos. Así tenemos:

1) Antioxidantes fenólicos por ejemplo: butilhidroxianisol, butilhidroxitolueno,

propil galato (figura 2.3).

Figura 2.3: Antioxidantes fenólicos: butilhidroxianisol (BHA), butilhidroxitolueno (BHT) tomado de

(Tsao, 2015).

2) Carotenoides actúan principalmente como desactivadores de oxígeno singlete

(figura 2.4).

Figura 2.4: Estructura de un carotenoide tomado de (Paul, 2016).

3) Ácidos orgánicos débiles como el ácido cítrico y el EDTA son antioxidantes

secundarios que quelan metales (figura 2.5).

Figura 2.5: Estructura de EDTA tomado de (PubChem, 2016).

12

4) Enzimas antioxidantes intracelulares como superoxidodismutasa (SOD), catalasa

(figura 2.6), glutationperoxidasa (Tsao, 2015).

Figura 2.6: A) Estructura de dímero de catalasa pequeña B) tetrámero de catalasa tomado de (Díaz, 2003).

Tipo de interacciones entre antioxidantes.

Dos o más antioxidantes juntos en el mismo sistema pueden presentar algunas

interacciones produciendo así diversos efectos: sinergismo, adición y antagonismo.

Sinergismo.

Se habla de sinergismo cuando dos o más antioxidantes son colocados en un solo

sistema y estos presentan un mayor efecto total mayor a la suma de los efectos

individuales aplicados por separado. El papel sinergista puede consistir en potenciar la

actividad antioxidante o en regenerar al antioxidante que ejerció primero su función

(Criado Dabrowska & Moya Mir, 2011).

Adición.

Cuando dos o más antioxidantes colocados juntos muestran un efecto equivalente a

la suma de los efectos de cada uno.

Antagonismo.

Todo lo contrario a lo indicado anteriormente, el efecto total es menor que la suma

de los efectos individuales. (Tsao, 2015).

13

Vitamina C

El ácido ascórbico, conocido vulgarmente como vitamina C, es un micronutriente

indispensable para la salud, en el hombre se encuentra principalmente en algunos

órganos tales como: ojo, hígado, bazo, cerebro, glándulas suprarrenales y tiroideas. Esta

vitamina hidrosoluble no se sintetiza directamente por el ser humano, debido a que al

igual que otras especies como: cobayos, murciélagos, algunas aves y primates, carecen

de la última enzima que es involucrada en la síntesis la L-gulono-g-lactona oxidasa

(GLO), a partir de la glucosa, razón por la cual este micronutriente debe ser incluido en

la dieta diaria.

A pesar de ello, la mayoría de animales, incluidos los de granja, son capaces de

sintetizar ácido ascórbico, principalmente en: hígado, intestino y glándulas

suprarrenales (Serra & Cafaro, 2007). Las especies, que no fabrican la vitamina en

cuestión además de carecer de la GLO, conjuntamente con su no ingesta, pueden

presentar varios efectos no beneficiosos para la salud: cansancio, debilidad, encías

inflamadas, hemorragias, demora de cicatrización de heridas, anemia, entre otras

(Latham, 2002).

Este nutriente hidrosoluble se le atribuye algunas propiedades: actúa como

antioxidante ayudando a proteger a las células contra daños causados por radicales

libres, interviene en la síntesis de colágeno una proteína necesaria para la cicatrización

de heridas, mejora la absorción del hierro, etc.

Fuentes de Ácido Ascórbico.

Las principales fuentes de vitamina C, son frutas y verduras. Dentro de las frutas

podemos mencionar: melón, papaya, mango, piña, fresas, moras, arándanos, sandía,

frutas cítricas como naranjas, toronjas, etc. Las verduras con la mayor fuente de

vitamina C son: Brócoli, coliflor, pimientos rojos y verdes, espinaca, papa, camote,

tomate, etc. Algunos cereales y otros alimentos están fortificados con vitamina C, para

saber la cantidad es necesario revisar la etiqueta en el momento de adquirir el producto

(Medline Plus, 2016).

Lo recomendable es consumir siempre y cuando sea posible, frutas y verduras

crudas, ya que las cantidades de vitamina C pueden disminuir con: cocción,

almacenamiento de tiempo prolongado o por efecto de la luz.

14

Requerimientos de Ácido Ascórbico.

La cantidad de vitamina C que debe ser consumida diariamente depende de la edad.

Tabla 2. 1

Requerimiento diario de vitamina C, acorde la edad

Etapa de vida Cantidad

recomendada (mg)

Bebés hasta los 6 meses de edad 40

Bebés de 7 a 12 meses de edad 50

Niños de 1 a 3 años de edad 15



Adolescentes (varones) de 14 a 18 años de

edad

75

Adolescentes (niñas) de 14 a 18 años de

edad

65

Adultos (hombres) 90

Adultos mujeres 75

Adolescentes embarazadas 80

Mujeres embarazadas 85

Adolescentes en periodo de latencia 115

Mujeres en periodo de latencia 120

Nota: Tomada de (National Institutes of Health, 2016).

El consumo excesivo de vitamina C, puede provocar: diarrea, cólicos estomacales,

entre otros. A continuación se muestran los límites máximos recomendados.

Tabla 2. 2

Límites máximos diarios recomendados de vitamina C

Etapa de vida Límite máximo

recomendado (mg)

Bebés hasta los 12 meses de edad No determinado




Adolescentes de 14 a 18 años de edad 1800

Adultos 2000

Nota: Tomada de (National Institutes of Health, 2016).

15

Estructura Química del Ácido Ascórbico.

Figura 2.7: Estructura química del ácido ascórbico. Tomada de: (PubChem, 2016).

Propiedades Químicas y Físicas.

Tabla 2. 3

Propiedades químicas y físicas del ácido ascórbico

Descripción física Polvo seco. Bolitas de cristales grandes

Color Cristales blancos

Olor Inoloro

Sabor Ácido

Punto de fusión 191ºC

Solubilidad Soluble: *Agua (0,33g/ml)

*Etanol 95º: 0,033g/ml

*Etanol absoluto: 0,02g/ml

*Glicerina USP: 0,01g/ml

*Propilenglicol: 0,05g/ml

Insoluble: Éter, cloroformo, benceno, éter de

petróleo, aceites, grasas, disolventes

oleosos.

Densidad 1,65g/cm3 a 25ºC

Presión de vapor 9,28X10-11mmHg a 25ºC

Estabilidad *Estable frente al aire cuando este seco.

*En preparaciones y algunos productos naturales suele

oxidarse por exposición al aire y a la luz.

Autoignición 380ºC

Descomposición Cuando se calienta hasta descomposición, emite humo

acre y vapores irritantes.

Calor de vaporación 1,487X108 J/mol a 465,15ºK

pH * 3 a una concentración de 5mg/ml.

* 2 a una concentración de 50mg/ml.

Tensión Superficial 4,039X10-2 N/m

Constante de disociación *pK1 = 4,17

*pK2 = 11,57 Nota: Elaborado por Mireya Medina, tomado de (PubChem, 2016).

16

Bioquímica del Ácido Ascórbico.

El ácido ascórbico es una vitamina hidrosoluble con propiedades ácidas y

fuertemente reductoras. Como menciona Jesse F. Gregory III. citado por Serra&Cafaro

(2007): tales propiedades se deben a su estructura enediol y a la posibilidad de ionizar el

hidroxilo situado sobre el carbono 3, formando un anión que queda estabilizado por

resonancia. Eventualmente, puede disociarse el hidroxilo del carbono 2, formando un

dianión, aunque no adquiere la misma estabilidad que la del carbono 3. La forma natural

de la vitamina es el isómero L que posee propiedades nutricionales; el isómero óptico

del carbono 4 D- tiene alrededor de 10% de la actividad del isómero L- pero sin fines

vitamínicos, al igual que el isómero óptico del carbono5, el ácido iso-ascórbico.

Degradación del Ácido Ascórbico.

El ácido ascórbico (H2A), tiende a degradarse fácilmente debido a su estructura, por

diversos factores como: pH, concentración de oxígeno, enzimas, catalizadores

metálicos, concentración inicial del ácido y la relación de ácidos L-ascórbico y L-

dehidroascórbico (Serra & Cafaro, 2007).

El proceso degradativo se inicia cuando un electrón del ácido ascórbico (H2A)se

transfiere, formándose así el monoaniónascorbato (AH-), posteriormente se produce la

pérdida de un segundo electrón dando lugar a una forma muy inestable que es el ácido

L-dehidroascórbico (A), este aún mantiene actividad biológica pero es susceptible a la

hidrólisis de su anillo lactónico generando de esta manera el ácido 2,3-dicetogulónico

(DKG), el cual posteriormente se descarboxila perdiendo su efecto benéfico.

La vitamina C es susceptible a degradarse por diferentes vías (figura 2.8). Durante la

vía anaerobia, el ácido 2,3-dicetogulónico (DKG) es formado por la hidrólisis de la

forma ceto-tautomérica del ácido ascórbico (H2A-Keto) que está en equilibrio con su

anión (AH—

keto) (Gregory III).

Mientras que la vía aerobia puede ser catalizada o no. En el primer caso, cabe señalar

que la velocidad de reacción es acelerada por iones presentes como hierro (Fe3+

) y

cobre (Cu2+

), esta ruta se inicia cuando el ácido ascórbico (H2A) pierde un electrón

formando así su monoanión (HA-), este se combina con el ión metálico (M

n+) y

posteriormente con el oxígeno para formar un complejo metal-oxígeno-ligando

(MHAO2) (n-1)+

), que se descompone para dar lugar a: anión metálico, agua y anión

radical dehidroascorbato (A-.

). El último reacciona con oxígeno constituyendo el ácido

17

dehidroascórbico (A). Mediante la vía no catalizada el monoanión (HA-) es atacado

directamente por el oxígeno generando el anión radical dehidroascorbato (A-.

) que se

transformará en ácido dehidroascórbico (A).

Indistintamente del camino por el cual se de la degradación siempre se va a producir

la ruptura del anillo lactónico del ácido dehidroascórbico (A), obteniéndose así el ácido

2,3-dicetogulónico (DKG), mismo que genera diferentes productos tales como:

aminoácidos, ácidos carboxílicos insaturados de 5-6 carbonos, azúcares, entre otros,

contribuyendo así a los cambios de sabor, color asociados con las reacciones de

pardeamiento.

Nota: El grado de degradación generado por las reacciones catalizadas por metales

son a menudo de mayor magnitud que las no catalizadas.

Figura 2.8: Reacciones de degradación del ácido ascórbico. Abreviaciones: Ácido ascórbico, H2A;

monoanión de ácido ascórbico, HA-; tautomeroceto, H2A-Keto y HA

-keto; acidodehidroascorbico, A;

anion radical dehidroascorbato, A-.; catalizador ion metalico, M

n+; acido 2,3-dicetogulonico, DKG; 3-

deoxipentosano, DP; xilosano, X; acido 3,4-dihidro-2-furancarboxilico, FA. Tomado de (Gregory III,

pág. 386).

18

Estabilidad

Estudios de Estabilidad.

Los estudios de estabilidad generalmente se llevan a cabo con la finalidad de

proveer evidencia fiable acerca de cómo: la calidad, seguridad y eficacia del producto

se ven afectadas a lo largo del tiempo, por diversos factores. Para ello, se debe seguir

lineamientos establecidos en la guía Q1A (R2) de la ICH (International Conference on

Harmonization, 2003).

Degradación forzada.

En estas pruebas, se emplean condiciones más severas que en las pruebas de

estabilidad acelerada, con el fin de conseguir información muy valiosa acerca del

comportamiento del producto bajo condiciones de estrés, es decir, se facilitará conocer

cuáles son las probables vías de degradación, sus posibles productos de degradación,

además del desarrollo y validación de métodos analíticos utilizados (Blessy, Patel,

Prajapati, & Agrawal, 2013), que serán aplicados luego en un análisis de muestras

sometidas a estabilidad a largo plazo y acelerada.

Estabilidad de Ácido ascórbico.

En soluciones acuosas.

Las formas farmacéuticas líquidas de vitamina C, son ampliamente estudiadas, por lo

cual se conoce que son muy inestables. Para una mayor estabilidad hay que prestar

atención especial al pH, el mismo que debe encontrarse dentro de un rango de 3.0 – 4.5

(Ball, 2006). También es recomendable adicionar agentes quelantes que disminuyan la

acción catalítica de trazas de metales presentes, además que en soluciones de vitamina C

es posible adicionar agentes establizadores como: sacarosa, glucosa, fructuosa, ácido

etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico, propil galato, glicerol y propilenglicol

(Bühler, 2001) (Tabla 2.4).

19

Tabla 2. 4

Estabilizadores de ácido ascórbico en soluciones acuosas

Almacenamiento Estabilizador Proporción de ácido

ascórbico - estabilizador

Bajo aire

*Ácido etilendiaminotetraacético, 100:1

*Sulfito de sodio 100:1

*Ácido cítrico 10:1

*Glucosa 10:1

Bajo nitrógeno

*Sulfito de sodio 100:1

*Maltosa 10:1

*Propil galato 100:1 Nota: Tomado de (Bühler, 2001).

Antioxidantes para vitaminas

La mayoría de las vitaminas son propensas a oxidación, por ello es importante el uso

de antioxidante en los productos que las contienen.

Tabla 2. 5

Antioxidantes para vitaminas

VITAMINA ANTIOXIDANTE

Retinol, colecalciferol, ergocalciferol *Butilhidroxianisol ,

*Butilhidroxitolueno,

*Alfa-tocoferol y

*Propil galato.

Vitamina B (complejo) *Propil galato

Ácido ascórbico *Sulfito de sodio

*Propil galato

Beta-caroteno *Alfa-tocoferol

*Palmitato de ascorbilo

Ácido fólico *Butilhidroxianisol

*Ácido nordihidroguaiarético Nota: Tomada de(Bühler, 2001).

Como se indica en la Tabla 2.5, se recomienda el uso de sulfito de sodio como

antioxidante para el ácido ascórbico, pero éste ejerce su efecto en formulaciones que

presentan un pH de alrededor de 9, es decir, de carácter básico, su semejante, el

metabisulfito de sodio actúa en preparaciones de carácter ácido, en un rango de pH de

3.5 – 5.0 (Rowe, Sheskey, & Quinn, 2009), motivo por el cual se lo utilizó en el jarabe

de vitamina C.

20

Metabisulfito de Sodio

Es usado por la industria farmacéutica, como antioxidante y preservante, en

diferentes productos: orales, tópicos, parenterales, etc (Rowe, Sheskey, & Quinn, 2009).

Su concentración, depende de forma farmacéutica y del papel que éste desempeñe en la

misma. En este caso, para la elaboración de un jarabe de vitamina C, se lo usó al 0,1%

(Sarfaraz, 2009).

Estructura química.

Figura 2.9: Estructura química del metabisulfito de sodio. Tomada de: (PubChem, 2016).

Propiedades químicas y físicas.

Tabla 2. 6

Propiedades químicas y físicas del metabisulfito de sodio

Descripción física *Sólido en polvo, blanco con un leve olor a azufre.

*Cuando se somete a altas temperaturas emite

vapores de óxido de azufre.

Color Cristales blancos

Olor En presencia de agua, desarrolla un olor a azufre.

Punto de fusión Se descompone a temperaturas mayores de 150ºC

Solubilidad Soluble: *Agua (66,7g/100g) a 25ºC

*Etanol 95º

*Glicerina libremente soluble

Densidad 1,48g/cm3

Estabilidad *Presenta una baja oxidación a sulfato, frente a

exposición de aire y humedad.

Descomposición 150ºC

Frente a calentamiento: *Forma sulfato de sodio

*Emite vapores de óxido de azufre.

pH *Ácido en medio acuoso (3,5 – 5) Nota: Tomada de (Rowe, Sheskey, & Quinn, 2009, pág. 654) (PubChem, 2016).

21

Métodos analíticos para la determinación de ácido ascórbico.

Algunas técnicas analíticas incluyendo sensores y biosensores han sido sugeridas

para la detección de ácido ascórbico en varios tipos de muestras. Métodos integrados,

cromatografía líquida de alta resolución, electroforesis, volumetría, voltametría,

amperometría, conductimetría, potenciometría, fluorometría, espectrofotometría,

turbidimetría, análisis de inyección de flujo(FIA), han sido empleados con este fin

(Rebwar & Azad, 2011). Sin embargo, algunas de éstas herramientas presentan ciertas

desventajas: demandan demasiado tiempo, son costosas, tratamiento especial para

operación del equipo o son poco sensibles y selectivas(Mitic, Kostic, Naskovic-Dokic,

& Mitic, 2010).

El ácido ascórbico ha sido destinado para la elaboración de preparaciones

farmacéuticas y cosméticas para ejercer un efecto antioxidante. Pero al momento de su

determinación hay que tener presente: su matriz o excipientes, productos de

degradación, antioxidantes empleados para su estabilidad, etc. Por lo señalado y otros

factores se debe contar con un método adecuado.

Cromatografía Líquida de alta resolución (HPLC), es una herramienta esencial en la

evaluación de la estabilidad de un producto, puesto que presenta la capacidad de

separar, identificar y cuantificar los compuestos presentes en una muestra (Varsha Rao,

Naga Sowjanya, Ajitha, & Uma Maheshwara Rao, 2015). Existen parámetros muy

importantes a considerar, para el desarrollo de éste método tales como: exactitud,

precisión, especificidad, límite de detección, límite de cuantificación, linealidad, rango

y robustez, los mismos que deben cumplirse siempre y cuando el ensayo lo amerite.

Para llevar a cabo la cuantificación de vitamina C, en el jarabe se empleó esta

herramienta (HPLC), estudiando sus partes (Fig. 2.10), funcionamiento y factores

como: fase móvil, flujo del solvente, columna cromatográfica, temperatura de columna,

naturaleza de la muestra, entre otros, para una óptima determinación.

22

Figura 2.10: Partes de un equipo cromatografía líquida de alta resolución, tomado de (Tecnofrom).

Para la cuantificación de vitamina C por HPLC, se debe estimar su estabilidad en

soluciones orgánicas. Generalmente las soluciones de vitamina C son más estables en

ácido metafosfórico, que en medio de otros ácidos como: cítrico, acético, perclórico y

ortofosfórico. Por otro lado hay que tener en cuenta las desventajas que muestra el ácido

metafosfórico: se disuelve lentamente en agua, es higroscópico (Iwase & Ono, 1998),

durante un proceso analítico puede reaccionar químicamente con la fase estacionaria de

la columna, cuyas interacciones podrían afectar la línea base y al tiempo de retención

(Kall & Andersen, 1999) . Enfatizar que la estabilidad de una solución de ácido

ascórbico depende más de la acidez de la solución que del ácido agregado (Golubitskii,

Budko, Basova, Kostarnoi, & Ivanov, 2007).

Determinación de la Capacidad Antioxidante

Existe una gran variedad de métodos para determinar la capacidad antioxidante, estos

se los puede clasificar dentro de tres grupos: (I) Métodos indirectos: fenoles totales,

reducción de Fe3+, poder antioxidante de reducción férrica (FRAP), reacción de

Briggs–Rauscher (BRR), metil linoleato. (II) Métodos que emplean metabolitos de

oxidación lipídica: Rancimat, productos volátiles, ácido tiobarbitúrico (TBA). (III)

Métodos basados en la capacidad de capturar radicales: potencial antioxidante total

(TRAP), capacidad de absorción de radicales oxígeno (ORAC), (2,2-azinobis-[3

etilbenzotiazolin-6-sulfónico]) (ABTS), α,α-difenil-ß-picrilhidrazilo (DPPH). (Almela,

Sánchez Muñoz, Fernández López, Roca, & Rabe, 2006).

23

Ensayo del DPPH (1,1 – difenil-2-picril-hidrazilo).

Este método fue propuesto por Blois (1958), en el cual se emplea el radical DPPH*,

para determinar parámetros que representen capacidad antioxidante. El DPPH*, es un

radical libre estable, puesto que su electrón es deslocalizado en su estructura, este

comportamiento hace que presente una coloración violeta que puede ser monitoreado

espectrofotométricamente a una longitud de onda de 517nm en medio metanólico,

cambiando a amarillenta cuando éste reacciona con un sustrato siendo neutralizado

(Tovar del Río, 2013).

Figura 2.11: Estructura del DPPH antes y después de la reacción con el antioxidante tomada de (Tovar

del Río, 2013).

Hipótesis

Hi: La capacidad antioxidante que presenta el extracto hidroalcohólico de Dodonaea

viscosa influye en la estabilidad del jarabe de vitamina C.

Ho: La capacidad antioxidante que presenta el extracto hidroalcohólico de Dodonaea

viscosa no influye en la estabilidad del jarabe de vitamina C.

24

CAPÍTULO III

Metodología de Investigación

Diseño de la investigación

El proyecto de investigación se apoya en el paradigma cuantitativo, porque se

encuentra orientado al descubrimiento, basado en la realidad, la misma que es

considerada como no estática, identificando las diferentes variables que pueden afectar

las hipótesis planteadas, es decir, si el extracto hidroalcohólico de Dodonaea viscosa

influye en la estabilidad de jarabe de vitamina C.

El nivel de investigación es explicativo, puesto que pretende no solo conocer al

problema sino encontrar sus posibles causas.

El tipo de investigación según el alcance de los objetivos es aplicada, por la fuente

de datos es de campo, por el lugar es experimental, por el tiempo es longitudinal y por

la fuente de información es prospectiva.

Materiales y métodos

La investigación ejecutada se realizó en varias etapas:

Etapa I: Pruebas preliminares – Se verificó la capacidad antioxidante que presenta el

extracto hidroalcohólico de Dodonaea viscosa en relación al ácido ascórbico y con ello

se determinó la concentración del extracto en el jarabe de vitamina C (Anexo 2).

Etapa II: Se recolectó y obtuvo el extracto hidroalcohólico de Dodonaea viscosa

(procedimiento - Anexo 3).

Etapa III: Se formuló y elaboró tres lotes piloto de 16 muestras de jarabe de vitamina

C de 30ml a una concentración de 100mg/5ml. El primer lote libre de antioxidante,

segundo lote con antioxidante natural (extracto hidroalcohólico de Dodonaea viscosa) y

tercer lote con antioxidante sintético (metabisulfito de sodio) (Anexo 4).

Valoración de ácido ascórbico.

Se valoró el principio activo (materia prima) empleando el método analítico

recomendado por USP 39 NF34 (Anexo 5).

1ml de yodo 0,1N equivale a 8,81mg de ácido ascórbico

*N=Normalidad de la solución de yodo

*V=Volumen de yodo consumido en la titulación

25

Tabla 3. 1

Formulación de jarabe de Vitamina C

Materia

prima

Fórmula

Porcentual

Fórmula

manufactura

Fórmula

Unitaria

(%) (g) (g/30ml)

Ácido

ascórbico 1,54 9,6096 0,6006

Glicerina 10,00 62,4000 3,9000

Propilenglicol 5,00 31,2000 1,9500

EDTA 0,10 0,6240 0,0390

Sacarina

sódica 0,15 0,9360 0,0585

Agua 31,07 193,8768 12,1173

Sacarosa 51,54 321,6096 20,1006

Saborizante 0,60 3,7440 0,2340

TOTAL 100,00 624,0000 39,0000

Nota: Se aplicó la misma formulación para el jarabe con antioxidantes. **Antioxidante natural (extracto

hidroalcohólico de Dodonaea viscosa) 1,54% y *Antioxidante sintético (SMB) 0,1%. Elaborado por

Mireya Medina.

Etapa IV: Se cuantificó el contenido de ácido ascórbico presente en el jarabe, a los

tiempos (1, 15, 30, 60 y 90 días) mediante cromatografía líquida de alta eficacia

(HPLC).

Tabla 3. 2

Parámetros de cuantificación de Vitamina C, por HPLC en fase reversa.

Parámetro Condición de operación

Estándar Ácido ascórbico

Tipo de columna C18

Tamaño de partícula 3um

Longitud 150mm

Diámetro interno 4,6mm

Temperatura de columna 24.0 2.0oC

Fase móvil Ácido fosfórico al 0,01%/metanol/acetonitrilo (90:8:2,

v/v/v;)

pH fase móvil 2,84 0,03

Velocidad de flujo 1.0ml/min

Volumen de inyección 20,0ul

Temperatura de muestras 24.0 2.0oC

Detector UV (254nm)

Tiempo de retención 2,15 0,30 min Nota: Elaborado por Mireya Medina.

26

Adecuación del sistema.

Para la adecuación del sistema se siguió el siguiente procedimiento:

1. Se inyectó 5 veces consecutivas de la solución estándar 1.

*Estándar 1: Solución A de estándar primario de vitamina C a una

concentración de 0,060 mg/ml.

2. Se inyectó 2 veces la solución estándar 2.

*Estándar 2: Solución B de estándar primario de vitamina C a una

concentración de 0,060 mg/ml.

3. Al terminar la secuencia se inyectó 2 veces la solución estándar 1. (RSD ≤ 2%).

Especificidad.

Pruebas de identificación.

Bajo los parámetros cromatográficos mencionados anteriormente se realizaron

corridas de: solución estándar de vitamina C, solvente y/o fase móvil, placebo, extracto

hidroalcohólico de Dodonaea viscosa, solución muestra.


Las pruebas de degradación forzada son llevadas a cabo para demostrar la

especificidad del método y medir los cambios de la concentración del activo, después de

haber sido sometido a parámetros de estrés.

Tabla 3. 3

Estudios de degradación

Parámetros de estrés Degradación forzada

Medio ácido *0,5ml HCl 0,1N – 2h

Medio básico *0,5ml NaOH 0,1N – 2h

Oxidación / H2O2 *0,5ml H2O2 al 3% - 2h

Calor *60ºC – 1h

Luz *UV 365nm – 3h Nota: Elaborado por Mireya Medina tomado de (Blessy, Patel, Prajapati, & Agrawal, 2013).

Exactitud.

1. Preparar 6 muestras con activo al 100%.

2. Inyectar bajo parámetros de operación preestablecidos.

Precisión.

1. Preparar 6 soluciones muestra con activo al 100%.

2. Inyectar bajo parámetros de operación preestablecidos.

27

Etapa V: Se Determinó la capacidad antioxidante del producto terminado empleando

el método de Blois (radical DPPH) a los tiempos (1, 15, 30, 60 y 90 días) (Anexo 6).

Etapa VI: Control de calidad de jarabe de vitamina C, acorde lineamientos para formas

farmacéuticas líquidas (inspección visual, densidad, pH) (U.S. Food and Drug

Administration, 2014) (World Health Organization, 2006). El ensayo microbiológico se

realizó acorde la (USP 39 NF34, 2016), solo a los tiempos 1 y 90 días (Anexo 7).

Equipos.

Estufa, THELCO

Balanza analítica, METTLER TOLEDO

Bomba de vacío

Espectrofotómetro, FISHER SCIENTIFIC

Cámara climática BINDER

Equipo de HPLC, DIONEX

Materiales.

Tijeras de podar Fundas Piola

Tijera Papel comercio Papel empaque

Papel aluminio Papel film Guantes de nitrilo

Guantes de calor Mascarilla Cofia

Bureta

Matraz erlenmeyer

Probetas

Embudos de

vidrio

Kitasato

Cajas petri

Asa de digralsky

Embudo Büchner Papel filtro Balones aforados (5,

10, 50 y 100ml)

Gradillas Tubos de ensayo Micropipeta (20-

200ul)

Puntas de

micropipetas

Celdas Pipetas

Vidrios reloj Frascos ambar,

color café de 30ml

Columna

cromatográfica, C18

Viales

Reactivos.

Agua destilada Cloro Etanol 70º

Ácido ascórbico Propilenglicol Glicerina

Metabisulfito de

sodio

EDTA Sacarina sódica

Saborizante Sacarosa Metanol calidad

HPLC

Acetonitrilo calidad

HPLC

Agua tipo 1

Yodo

Radical DPPH

Metanol

28

Diseño Experimental

Para las etapas: II y III del presente trabajo de investigación no se realizó un diseño

experimental formal, puesto que se partió de información ya conocida.

Etapa IV.

Variables.

Independientes.

*Tipo de antioxidante y tiempo.

Dependientes.

*Concentración de ácido ascórbico, en el producto final.

Diseño factorial modelo AXB.

El tipo de diseño es factorial modelo AXB, con su respectivo análisis de varianza

(ANOVA MULTIFACTORIAL).

Tabla 3. 4

Características de diseño

Características del diseño:

Factor A Tipo de antioxidante

Factor B Tiempo

Número de tratamientos (AXB) 3X5= 15

Número de muestras por punto temporal (n) 3

Número de corridas n(AXB) 3(3X5)= 45

Variable respuesta Concentración de Vitamina C (mg/5ml) Nota: Elaborado por Mireya Medina.

Tabla 3. 5

Características de los factores de estudio

Factores de estudio

Tiempo

(días)

Representación Tipo de

antioxidante

Representación

1 T1 Libre L

15 T2 Natural N

30 T3 Sintético S

60 T4

90 T5

Nota: Elaborado por Mireya Medina.

29

Tabla 3. 6

Combinaciones entre factores – concentración de vitamina C.

Tipo de

antioxidante

Concentración de Vitamina C

(mg/5ml)

T1 T2 T3 T4 T5

L

Rep

etic

ion

es

L1T1 L1T2 L1T3 L1T4 L1T5



N

N1T1 N1T2 N1T3 N1T4 N1T5



S

S1T1 S1T2 S1T3 S1T4 S1T5




Anova.

El ANOVA para un diseño factorial A x B con n réplicas resulta de descomponer la

variación total como:

SST=SSA+SSB+SSAB+SSE

Tabla 3. 7

Tabla de ANOVA

Nota: Tomada de (Romero Mares, 2012).

Hipótesis para el diseño factorial AXB.

*Para el Factor A (Tipo de antioxidante)

Fuente de Suma de Grados de Cuadrados Estadístico

Variación cuadrados libertad medios F

Efecto A SSA a-1 CMA=SSA/(a-1) CMA/CME

Efecto B SSB b-1 CMB=SSB/(b-1) CMB/CME

Efecto AB SSAB (a-1)(b-1) CMAB=SSAB/((a-1)(b-1)) CMAB/CME

Error SSE ab(n-1) CME=SSE/(ab(n-1))

Total SST abn-1

30

El tipo de antioxidante no ejerce ningún efecto sobre el contenido de ácido

ascórbico de los jarabes de vitamina C.

El tipo de antioxidante ejerce efecto significativo sobre el contenido de ácido


*Para el Factor B (Tiempo)

El tiempo no ejerce ningún efecto sobre el contenido de ácido ascórbico de los

jarabes de vitamina C.

El tiempo ejerce efecto significativo sobre el contenido de ácido ascórbico de los


*Para la interacción AB (Tipo de antioxidante – tiempo)

La interacción tipo de antioxidante – tiempo ejerce efecto sobre el contenido de

ácido ascórbico de los jarabes.

La interacción tipo de antioxidante – tiempo no ejerce efecto sobre el contenido de


Etapa V.

Variables.

Independientes.

* Tipo de antioxidante y tiempo.

Dependientes.

*Porcentaje de inhibición del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH), en el

producto final.

31

Diseño factorial modelo AXB.

El diseño empleado en la quinta etapa de investigación es equivalente al empleado en

la cuarta etapa, con su respectiva ANOVA.

Tabla 3. 8

Características de diseño

Características del diseño:

Factor A Tipo de antioxidante

Factor B Tiempo

Número de tratamientos (AXB) 3X5= 15

Número de muestras por punto temporal (n) 3

Número de corridas n(AXB) 3(3X5)= 45

Variable respuesta Porcentaje de inhibición de radicales

libres (DPPH) Nota: Elaborado por Mireya Medina.

Tabla 3. 9

Combinaciones entre factores – Porcentaje de inhibición de radicales libres (DPPH)

Tipo de

antioxidante

Porcentaje de inhibición de radicales

libres (DPPH)

T1 T2 T3 T4 T5

L

Rep

etic

ion

es




N




S





Hipótesis para el análisis de varianza del diseño factorial AXB.

*Para el Factor A (Tipo de antioxidante)

32

El tipo de antioxidante no ejerce ningún efecto significativo sobre el porcentaje de

inhibición del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH).

El tipo de antioxidante ejerce ningún efecto significativo sobre el porcentaje de


*Para el Factor B (Tiempo)

No existe diferencia significativa en el porcentaje de inhibición del radical 2,2-

difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) entre los jarabes de vitamina C debido a los diferentes

periodos de tiempo.

Existe diferencia significativa en el porcentaje de inhibición del radical 2,2-difenil-1-

picrilhidrazilo (DPPH) entre los jarabes de vitamina C debido a los diferentes periodos

de tiempo.

*Para la interacción AB (Tipo de antioxidante – tiempo)

La interacción tipo de antioxidante – tiempo ejerce efecto sobre el porcentaje de

inhibición del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) entre los jarabes.

La interacción tipo de antioxidante – tiempo no ejerce efecto sobre el porcentaje de

inhibición del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) entre los jarabes.

33

Matriz de operacionalización de variables

Tabla 3. 10

Matriz de operacionalización de variables

VARIABLE DIMENSIONES INDICADORES

Características de

estabilidad

Concentración de ácido ascórbico

en el jarabe de vitamina C.

*Porcentaje de ácido

ascórbico en jarabe

(Método HPLC).


en el jarabe de vitamina C, con

antioxidante natural.


en el jarabe de vitamina C, con

antioxidante sintético.

Capacidad Antioxidante del jarabe

de vitamina C.

*Porcentaje de Inhibición

de radicales libres (Método

de Blois). Capacidad Antioxidante del jarabe

de vitamina C con antioxidante

natural.

Capacidad Antioxidante del jarabe

de vitamina C con antioxidante

sintético. Nota: Elaborado por Mireya Medina.

Técnicas y Procesamiento de datos (análisis estadístico)

Los valores recopilados obtenidos en las etapas cuatro y cinco de la investigación

fueron examinados a través de un diseño factorial modelo A X B, con k= 2 (factores).

En los dos diseños el factor A es el tipo de antioxidante y el factor B es el tiempo, con

tres y cinco niveles respectivamente, pudiendo construir 3X5 combinaciones que dan

lugar a un diseño factorial 3X5. La diferencia entre los diseños planteados es la variable

respuesta. Para el primer caso es la concentración de vitamina C en el jarabe (mg/5ml),

mientras que para el segundo es el porcentaje de inhibición del radical DPPH,

empleando un software de análisis de datos, estadístico y gráfico que es el Statgraphics

Centurion versión 17.1.12 en base a ello se realizó tablas y gráficos que permitieron

comprobar una de las hipótesis planteadas.

34

CAPÍTULO IV

Análisis y discusión de resultados

Resultados

La investigación ejecutada se realizó en varias etapas:

Etapa I: Pruebas preliminares – Se verificó la capacidad antioxidante que presenta el

extracto hidroalcohólico de Dodonaea viscosa en relación al ácido ascórbico y con ello

se determinó la concentración del extracto presente en el jarabe de vitamina C.

Determinación de la capacidad antioxidante.

Tabla 4. 1

Absorbancias del extracto hidroalcohólico de Dodonaea viscosa

Concentraciones

(ug/ml)

Absorbancias del Extracto de

Dodonaea viscosa

Media

del grupo

200 0,019 0,021 0,019 0,020

150 0,041 0,042 0,041 0,041

100 0,108 0,107 0,108 0,108

50 0,175 0,176 0,176 0,176

Nota: Valores de absorbancias obtenidas espectrofotométricamente, después de 30 min, de añadir el

reactivo DPPH a las soluciones metanólicas del extracto hidroalcohólico de Dodonaea viscosa. Elaborado

por Mireya Medina.

Tabla 4. 2

Absorbancias del blanco del extracto hidroalcohólico de Dodonaea viscosa

Concentraciones

(ug/ml)

Absorbancias del blanco del

extracto

Media

del grupo

200 0,006 0,007 0,007 0,007

150 0,003 0,003 0,004 0,003

100 0,002 0,002 0,002 0,002

50 0,001 0,001 0,001 0,001

Nota: Valores de absorbancias obtenidas espectrofotométricamente, de las soluciones metanólicas de

extracto hidroalcohólico de Dodonaea viscosa. Elaborado por Mireya Medina.

35

Tabla 4. 3

Absorbancias de muestras de Vitamina C

Concentraciones

(ug/ml)

Absorbancias de la vitamina C Media

del grupo

200 0,014 0,014 0,015 0,014

150 0,046 0,047 0,048 0,047

100 0,105 0,105 0,105 0,105

50 0,186 0,184 0,186 0,185


reactivo DPPH a las soluciones metanólicas de Vitamina C. Elaborado por Mireya Medina.

Tabla 4. 4

Absorbancias del blanco de muestras de Vitamina C

Concentraciones

(ug/ml)

Absorbancias del blanco de la

vitamina C

Media

del grupo

200 0,000 0,000 0,000 0,000

150 0,000 0,000 0,000 0,000

100 0,000 0,000 0,000 0,000

50 0,000 0,000 0,000 0,000

Nota: Valores de absorbancias obtenidas espectrofotométricamente, de las soluciones metanólicas del

blanco de vitamina C. Elaborado por Mireya Medina.

Tabla 4. 5

Absorbancias de la solución del reactivo 2,2-difenil-1-1hidrazilo /DPPH)

Concentración

(ug/ml)

Absorbancias de DPPH Media

20 0,365 0,365 0,365 0,365

Nota: Elaborado por Mireya Medina

Cálculo del Porcentaje de inhibición del radical DPPH.

(

)

Ejemplo:

*Para muestra extracto hidroalcohólico de Dodonaea viscosa a 200ug/ml

(

)

36

Tabla 4. 6

Valores de Porcentaje de inhibición de radical DPPH del extracto hidroalcohólico de

Dodonaea viscosa.

Concentraciones % Inhibición de radicales libres Media grupo

200 (ug/ml) 96,44 96,16 96,71 96,44

150 (ug/ml) 89,59 89,32 89,86 89,59

100 (ug/ml) 70,96 71,23 70,96 71,05

50 (ug/ml) 52,33 52,05 52,05 52,15


Tabla 4. 7

Valores de Porcentaje de inhibición de radical DPPH de vitamina C

Concentraciones % Inhibición de radicales libres Media del

grupo

200 (ug/ml) 96,16 96,16 95,89 96,07

150 (ug/ml) 87,40 87,12 86,85 87,12

100 (ug/ml) 71,23 71,23 71,23 71,23

50 (ug/ml) 49,04 49,59 49,04 49,22


En las tablas 4.6 y 4.7 se observa que a una concentración de 200ug/ml del extracto

hidroalcohólico de Dodonaea viscosa y de vitamina C presentan un porcentaje de

inhibición de radicales libres (DPPH) de 96,44% y 96,07% respectivamente, lo cual

indica que ambos presentan similar capacidad, motivo por el cual en la elaboración de

jarabe de Vitamina C, se colocaron tanto el ácido ascórbico como el extracto

hidroalcohólico de Dodonaea viscosa al mismo porcentaje.

Etapa II: Recolección del material vegetal y su posterior obtención del extracto

hidroalcohólico de Dodonaea viscosa.

Tabla 4. 8

Datos de recolección

Localidad

País Ecuador

Provincia Pichincha

Cantón Quito

Parroquia Guayllabamba

Coordenadas

geográficas

*Altitud: 2000-2500 m.s.n.m.

*Latitud: 01º04`00``S

*Longitud: 77º31`00`W

Aspectos ecológicos Abundancia Moderada

Autenticación

botánica

(Anexo 8y9)

Familia SAPINDACEAE

Nombre científico Dodonaea viscosa

Nombre común Chamana


37

Tabla 4. 9

Datos de la obtención del extracto hidroalcohólico de Dodonaea viscosa.

DATOS Dodonaea viscosa

(chamana)

Peso de planta seca y molida 100,075g

Volumen de etanol (macerado) 400ml

Tiempo de maceración 48 horas

Volumen obtenido del macerado 275ml

Volumen de etanol (percolado) 450ml

Tiempo de percolación 24 horas

Volumen obtenido del percolado 360ml

Volumen obtenido del concentrado (sirope) 100ml


Cálculo de la concentración del extracto de Dodonaea viscosa.

Colocar 1ml del extracto en un vidrio reloj tarado, secar y pesar.

Tabla 4. 10

Concentración del extracto de la planta

Peso de vidrio

reloj (g)

Peso de vidrio

reloj + extracto (g)

Peso de

extracto (g)

Concentración de

extracto (g/ml)

14,4495 14,6433 0,1937 0,1937 Nota: Elaborado por Mireya Medina

Etapa III: Formulación y elaboración del jarabe.

Valoración de ácido ascórbico.

Tabla 4. 11

Datos de valoración

Normalidad yodo (N) 0,0983

Equivalente (Eq) 88,1

Peso de principio activo (mg) 50,13

Volumen yodo consumido (ml) 5,8 5,7 5,8

Porcentaje de principio activo (%) 100,20 98,47 100,20

Media 99,62 Nota: Elaborado por Mireya Medina

*Ejemplo con 5,8ml de yodo

(

)

38

(

)

Cálculo de la cantidad de ácido ascórbico en cada jarabe.

5,0 ml 100 mg de ácido ascórbico

30,0 ml X = 600 mg de ácido ascórbico

Corrección de ácido ascórbico en cada jarabe.

99,62 % 600 mg ácido ascórbico

100,00 % X = 602,28 mg ácido ascórbico

Etapa IV: Cuantificación del contenido de ácido ascórbico en el jarabe mediante

cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC).

Corrección de pureza y humedad del estándar de ácido ascórbico.

Tabla 4. 12

Datos del estándar de ácido ascórbico

Pureza 99,68%

Humedad 0,27% Peso teórico 3,00mg

Peso experimental 3,01mg Nota: Elaborado por Mireya Medina

99,41 % 3,00 mg ácido ascórbico

100,00 % X = 3,01 mg ácido ascórbico

Cálculo de la cantidad de ácido ascórbico presente en el jarabe

Ejemplo: Muestra 3 de jarabe libre de antioxidante a 60 días.

Área de estándar de Vit. C 37,1773 mAU*min 0,0600 mg de Vit.C/ml

Área de muestra 32,4477 mAU*min X= 0,0523 mg de Vit.C/ml

39

Donde:

C1: Concentración de vitamina C presente en el jarabe.

m: Masa de jarabe empleada para la solución.

ɗ: Densidad del jarabe.

C2: Concentración de vitamina C en la solución diluida.

V2: Volumen al cual se aforó, para la obtención de la solución de vitamina C.

*Concentración de vitamina C en el jarabe por cada 5ml

1ml de jarabe 16,8029 mg de Vit. C

5ml de jarabe X = 84,0145 mg de Vit. C/5ml de jarabe

40

Especificidad.

Pruebas de identificación.

Figura 4.1 Cromatograma de solución estándar de Vitamina C

Figura 4.2: Cromatograma de Solución de materia prima de

Vitamina C

Figura 4.3: Cromatograma del solvente

Figura 4.4: Cromatograma de Placebo

mg/ml

mg/ml mg/ml

mg/ml

41

En las figuras 4.1 – 4.8 se puede observar que, el solvente y/o fase móvil y

constituyentes de la formulación (placebo), no coeluyen con la vitamina C que es el

activo de interés, la misma que muestra un tiempo de retención de 2,15 0,30 min. Sin

embargo en la figura 4.5 correspondiente al extracto hidroalcohólico de Dodonaea

viscosa se puede observar un pico al minuto 2,26min, el cual a pesar de estar dentro del

rango de determinación de ácido ascórbico, no es significante puesto que equivale a

0,18% del área estándar de Vitamina C (Kazakevich Yuri, 2007). Lo mencionado indica

que el método empleado es selectivo para el API en cuestión.

Figura 4.5: Cromatograma de extracto hidroalcohólico de

Dodonaea viscosa

Figura 4.6: Cromatograma de Jarabe de Vitamina C – libre de

antioxidante

Figura 4.7: Cromatograma de Vitamina C + Antioxidante natural

Figura 4.8: Cromatograma de Jarabe de Vitamina C +

Antioxidante sintético

mg/ml mg/ml

mg/ml

mg/ml

42


Figura 4.9: Cromatograma de jarabe libre de antioxidante en medio ácido

Figura 4.10: Cromatograma de jarabe con antioxidante

naturak en medio ácido.


sintético en medio ácido.

Interpretación: En las figuras 4.9 – 4.11 se puede observar que la concentración de ácido ascórbico

disminuye en un 30,60%; 14,72% y 16,75% en los jarabes libre de antioxidante, con antioxidante natural y

sintético respectivamente lo cual sugiere que en este medio se generan productos de degradación en todos

los casos. Se cree que uno de los productos de degradación en medio ácido es el ácido monodehidro-

ascórbico como resultado de la disociación del grupo hidroxilo del C-3 (pka=4,04).

mg/ml

mg/ml

mg/ml

43

Figura 4.12: Cromatograma de jarabe libre de antioxidante en medio básico.

Figura 4.13: Cromatograma de jarabe con antioxidante natural

en medio básico.


sintético en medio básico.

Interpretación: En las figuras 4.12 – 4.14 se aprecia que en medio básico (NaOH 0,1N), el API del

producto en cuestión sufre degradación total. Los productos de degradación que se forman no pueden ser

detectados ni cuantificados mediante el sistema empleado, pero se cree que dentro de ellos se encuentran

el ácido dehidro-ascórbico como resultado de la ionización del hidrógeno del grupo hidroxilo del carbono

2 (pka=11,6), el último por ruptura del anillo lactónico genera el ácido 2,3-dicetogulónico el cual

finalmente se degrada en ácido treónico y oxálico (Szultka-Mlynska, Kaliszan, Buszewska-Forajta, &

Buszewski, 2014).

44

Figura 4.15: Cromatograma de jarabe libre de antioxidante en medio H2O2

Figura 4.16: Cromatograma de jarabe de antioxidante natural en

medio H2O2.

Figura 4.17: Cromatograma de jarabe con antioxidante sintético

en medio H2O2.

Interpretación: En las figuras 4.15 – 4-17 se puede contemplar que existe degradación total de ácido

ascórbico en el jarabe libre de antioxidante, con antioxidante natural y con el sintético, en medio de H2O2. Se

observa un pico relevante al minuto 1,91 que no corresponde a vitamina C puesto que el tiempo de retención

es menor. Cómo el método empleado no permite conocer de qué producto se trata, se sugiere que los radicales

peróxido reaccionan con enlaces C-H o C=C presentes en la molécula de ácido ascórbico, destacando de ello

que los dobles enlaces son susceptibles a oxidación usando peróxido de hidrógeno generando epóxidos

(Kazakevich Yuri, 2007).

mg/ml

mg/ml mg/ml

45

Figura 4.18: Cromatograma de jarabe libre de antioxidante – Temperatura 60ºC

Figura 4.19: Cromatograma de Jarabe con antioxidante natural –

Temperatura 60ºC.


– Temperatura 60ºC.

Interpretación: En las figuras 4.18 – 4.20 se destaca que el ácido ascórbico presente en el jarabe muestra una

degradación de 61,95% (jarabe libre de antioxidante); 33,38% (con antioxidante natural) y 39,78% (con

antioxidante sintético) con respecto a su contenido inicial (20mg/ml) en el jarabe.

mg/ml

mg/ml

mg/ml

46

Figura 4.21: Cromatograma de jarabe libre de antioxidante – Luz UV.

Figura 4.22: Cromatograma de jarabe con antioxidante natural

– Luz UV.


– Luz UV.

Interpretación: En las figuras 4.21 – 4.23 se aprecia que al igual que la temperatura, la luz UV produce la

degradación parcial del activo con 34,09%; 43,42% y 38,24% de productos degradación para jarabe libre de

antioxidante, con antioxidante natural, con antioxidante sintético respectivamente.

mg/ml

mg/ml

mg/ml

47

En las figuras 4.9 – 4.23 la cantidad de vitamina C + sus productos de degradación,

no suman el 100% del activo inicial, lo cual indica que el sistema cromatográfico

empleado, no es capaz de detectar algunos productos generados durante las pruebas de

estrés. Para conseguirlo se debería cambiar los parámetros cromatográficos o incluso

utilizar otro equipo.

Además se debe tener en consideración que la degradación del ácido ascórbico

depende de algunos factores, en este estudio se evaluaron: pH, presencia de oxígeno,

temperatura y luz. De ahí, se destaca que al activo es menos susceptible a variaciones de

temperatura y luz que a presencia de oxígeno y cambios de pH, especialmente en medio

básico puesto que allí se produce la degradación total del API.

Exactitud y precisión.

El método empleado es exacto y preciso puesto que presenta con un coeficiente de

variación de: 0,8% y 0,3% respectivamente.

Tabla 4. 13

Parámetros del método cromatográfico empleado

Parámetro Variable Criterio de aceptación

Especificidad

Solvente Ausencia de picos en el mismo tiempo de

retención

Placebo Ausencia de picos en el mismo tiempo de

retención

Extracto Ausencia de picos en el mismo tiempo de

retención

Degradación - medio ácido Picos de productos de degradación

detectados, no deben interferir con el

pico del analito (no igual tiempo de

retención).

Degradación - medio básico

Degradación por oxidación

Degradación por calor

Degradación por luz

Exactitud Coeficiente de variación Máximo 2,0%

Precisión Coeficiente de variación Máximo 2,0%


48

Determinación Cuantitativa.

Tabla 4. 14

Valores de concentración de principio activo del jarabe de vitamina C a tiempo cero (1

día).

MUESTRAS mg/5ml Media

Libre de antioxidante 99,4410 98,2040 99,9805 99,2085

Con antioxidante natural 102,2755 99,3125 100,7265 100,7715

Con antioxidante sintético 100,5765 96,3130 103,1630 100,0175


Gráfico 4. 1: Tipo de antioxidante vs Concentración de Vitamina C tiempo cero (día 1)

En la gráfica 4.1 se puede apreciar que el jarabe libre de antioxidantes ya muestra una

disminución en aproximadamente 0,8% de la concentración inicial de su activo, pudo

ser porque la cuantificación del ácido ascórbico de los jarabes se realizó un día después

de su elaboración.

Tabla 4. 15

Valores de concentración de principio activo del jarabe de vitamina C a 15 días



Antioxidante natural 98,5635 100,0739 99,9741 99,5371

Antioxidante sintético 100,3231 99,3589 100,0280 99,9034


70,0075,0080,0085,0090,0095,00

100,00

Libre de

antioxidante

Con

antioxidante

natural

Con

antioxidante

sintético

99,2085 100,7715 100,0175

Con

cen

traci

ón

Vit

. C

(mg/5

ml)

Tipo de antioxidante

Tipo de antioxidante vs Concentración Vit. C

49

Gráfico 4. 2: Tipo de antioxidante vs Concentración de vitamina C a 15días

En la gráfica 4.2 se observa que el jarabe de vitamina C libre de antioxidantes ya

presenta decremento de su API en un 5,76% en referencia de su concentración inicial.

El jarabe que contiene antioxidante natural disminuye solo en un 0,47% la cantidad de

ácido ascórbico, mientras que el producto con antioxidante sintético un 0,1%.

Tabla 4. 16







Gráfico 4. 3: Tipo de antioxidante vs Concentración de Vitamina C a 30 días

70,0075,0080,0085,0090,0095,00

100,00

Libre de

antioxidante

Antioxidante

natural

Antioxidante

sintético

94,2334 99,5371 99,9034

Co

nce

ntr

aci

ón

de

Vit

. C

(mg

/5m

l)

Tipo de Antioxidante


70,0075,0080,0085,0090,0095,00

100,00

Libre de

antioxidante

Antioxidante

natural

Antioxidante

sintético

91,4962 92,5332

99,8656

Co

nce

ntr

aci

ón

Vit

. C

(mg

/5m

l)



50

En la gráfica 4.3 muestra que el ácido ascórbico disminuye en una 8,50% y 7,46% en el

jarabe libre de antioxidante y el que contiene antioxidante natural respectivamente. El

jarabe que contiene antioxidante sintético se reduce un 0,13% del API.

Tabla 4. 17








En la gráfica 4.4 se observa que existe un decremento del API de: 15,63%; 11,51%;

6,01% en los jarabes libre de antioxidante, con antioxidante natural, con antioxidante

sintético respectivamente.

Tabla 4. 18







70,00

80,00

90,00

100,00

Libre de

antioxidante

Antioxidante

natural

Antioxidante

sintético

84,3689 88,4912

93,9915

Con

cen

traci

ón

V

it. C

(mg/5

ml)


Tipo antioxidante vs Concentración Vit. C

51


En la figura 4.5 se observa que la vitamina C disminuye 24,47% en el jarabe libre de

antioxidante, en el jarabe natural decrece en un 23,29%, mientras que en el producto

con antioxidante sintético presenta una disminución de solo 9,66%.

Tabla 4. 19

Resumen de contenido de vitamina C (mg/5ml) en el jarabe

Tiempo

(días)

concentración (mg/5ml)

Libre Natural Sintético

1 99,21 100,77 100,02

15 94,23 99,54 99,90

30 91,50 92,53 99,87

60 84,37 88,49 93,99

90 75,53 76,70 90,33


Gráfico 4. 6: Relación tipo de antioxidante, tiempo y concentración de Vitamina C.

70,0075,0080,0085,0090,0095,00

100,00

Libre de

antioxidante

Antioxidante

natural

Antioxidante

sintético

75,5269 76,7024

90,3349

Co

nce

ntr

aci

ón

V

it.C

(mg

/5m

l)


Tipo de antioxidante vs Concentración Vit.C

70,00

75,00

80,00

85,00

90,00

95,00

100,00

1 15 30 60 90

99,21 94,23

91,50

84,37

75,53

100,77 99,54

92,53

88,49

76,70

100,02 99,90 99,87

93,99

90,33

Con

cen

traci

ón

de

Vit

. C

(m

g/5

ml)

Tiempo (días)

Tiempo vs Concentración de Vit.C (mg/5ml)

Libre antioxidante Antioxidante natural Antioxidante sintético

52

En la gráfica 4.6 se observa que a medida que avanza el tiempo (1 – 90 días) la

concentración de vitamina C va disminuyendo en los diferentes jarabes. En el jarabe

libre de antioxidante la reducción de activo es notoria hasta llegar a 24,47% menos de

su concentración inicial. La adición de antioxidante natural parece ayudar los primeros

30 días, pero en el día 90 ya muestra un decremento de 23,3% similar al producto que

no contiene antioxidante. El jarabe que contiene antioxidante sintético es aquel que

presenta el mejor resultado puesto que el último día de cuantificación presenta un 9,67%

menos de su cantidad original.

Análisis estadístico – contenido de vitamina C.

Tabla 4. 20

Análisis de Varianza para Concentración de Vitamina C

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado Medio Razón-

F

Valor-

P

EFECTOS PRINCIPALES

A:Tipo de antioxidante 489,496 2 244,748 47,59 0,0000

B:Tiempo 2127,18 4 531,796 103,40 0,0000

INTERACCIONES

AB 256,693 8 32,0867 6,24 0,0001

RESIDUOS 154,288 30 5,14294

TOTAL (CORREGIDO) 3027,66 44

En la tabla 4.20 se observa que los factores principales: tipo de antioxidante y tiempo,

además de la interacción entre ellos, tienen un efecto estadísticamente significativo

sobre Concentración de Vitamina C con un 95,0% de nivel de confianza, debido a que

los valores de P son menores a 0,05. Esto conlleva a comprobar las siguientes hipótesis

de trabajo:

El tipo de antioxidante ejerce efecto significativo sobre el contenido de ácido


El tiempo ejerce efecto significativo sobre el contenido de ácido ascórbico de los


La interacción tipo de antioxidante – tiempo ejerce efecto sobre el contenido de


53

Tabla 4. 21

Pruebas de Múltiple Rangos para Concentración de Vitamina C por Tipo de

antioxidante

Tipo de

antioxidante

Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos

Libre antioxidante 15 88,8717 0,585545 X

Ant. natural 15 91,6071 0,585545 X

Ant. sintético 15 96,8226 0,585545 X

La tabla 4.21 indica los resultados obtenidos al aplicar un procedimiento de

comparación múltiple (Tukey) para determinar qué medias con respecto al tipo de

antioxidante son significativamente diferentes de otras. La alineación de las X's no es

homogénea, muestra que existe diferencias estadísticamente significativas entre las tres

medias en cuestión con un nivel del 95% de confianza. Siendo el jarabe con

antioxidante sintético el que muestra la mayor media por ende el que mejor actúa para

mantener la concentración del ácido ascórbico.

Gráfico 4. 7: Gráfica de medias – pruebas de múltiple rangos para concentración de vitamina C por tipo

de antioxidante.

De acuerdo a la gráfica 4.7, se observa que el jarabe de vitamina C libre de antioxidante

posee la media más baja, seguido del jarabe con antioxidante natural y finalmente por

aquel que contiene antioxidante sintético, esto significa que el antioxidante que provee

una mejor protección al API es el metabisulfito de sodio, puesto que se observa una

mayor concentración de ácido ascórbico.

Ant. natural Ant. sintético Libre antioxid

Medias y 95,0% de Tukey HSD


87

89

91

93

95

97

99

Co

nce

ntr

ació

n d

e V

itam

ina

C

54

Gráfico 4. 8: Efecto de las interacciones de dos factores (tipo de antioxidante y tiempo) sobre la

concentración de vitamina C (mg/5ml).

En la gráfica 4.8 se muestra que en el día uno las concentraciones de vitamina C son

equivalentes, en el día 15 el jarabe libre de antioxidante disminuye notoriamente la

cantidad de activo mientras que en los productos que contienen antioxidantes el API se

mantiene. En el día 30 el único jarabe que mantiene la concentración inicial de ácido

ascórbico es aquel que contiene el antioxidante sintético, los otros dos casos continúa

mostrando un decremento. A partir del día 60 en los productos con los tres tipos de

antioxidantes se observa una reducción del ácido ascórbico. Finalmente el jarabe con

metabisulfito de sodio que estuvo sometido a T: 40±2ºC; HR: 75±5% durante 90 días

fue el que tuvo mayor cantidad de vitamina C.

Etapa V: Determinación de la capacidad antioxidante del producto terminado

empleando el método de Blois (Anexo 5).

Cálculo del volumen de jarabe.

Se prepararon soluciones metanólicas del jarabe sin y con antioxidantes, a una

concentración de 200ug de vitamina C/ml.

30,0ml de jarabe 602288ug Vitamina C

1,0ml de jarabe X = 20076ug de Vitamina C

Gráfico de Interacciones


75

80

85

90

95

100

105

Co

ncen

tració

n d

e V

itam

ina C


Tiempo115306090

55

Determinación de la capacidad antioxidante.

Tabla 4. 22

Absorbancias de la solución del reactivo 2,2-difenil-1-1hidrazilo /DPPH), a los tiempos

(1, 15, 30, 60 y 90 días).

Tiempo

(días)

Absorbancias de DPPH Media

1 0,240 0,241 0,240 0,240

15 0,338 0,337 0,338 0,338

30 0,269 0,269 0,269 0,269

60 0,269 0,268 0,268 0,268

90 0,267 0,266 0,267 0,267


Tabla 4. 23

Absorbancias del jarabe de Vitamina C libre de antioxidante, a los tiempos (1, 15, 30,

60 y 90 días).

Concentración

teórica de

Vitamina C

200ug/mL

Tiempo

(días)

Jarabe de Vitamina C

Absorbancias de la muestra Media

1 0,011 0,010 0,011 0,011

15 0,018 0,019 0,019 0,019

30 0,023 0,022 0,022 0,022

60 0,039 0,038 0,038 0,038

90 0,066 0,060 0,062 0,063


reactivo DPPH a las soluciones metanólicas de Vitamina C. Elaborado por Mireya Medina.

Tabla 4. 24

Absorbancias del blanco del jarabe de Vitamina C libre de antioxidante, a los tiempos

(1, 15, 30, 60 y 90 días).

Concentración

teórica de

Vitamina C

200ug/mL

Tiempo

(días)



muestra

Media

1 0,003 0,003 0,003 0,003

15 0,003 0,003 0,003 0,003

30 0,003 0,003 0,003 0,003

60 0,003 0,003 0,003 0,003

90 0,003 0,003 0,003 0,003


Vitamina C. Elaborado por Mireya Medina.

56

Tabla 4. 25

Absorbancias del jarabe de Vitamina C + Antioxidante natural, a los tiempos (1, 15,

30, 60 y 90 días).

Concentración

teórica de

Vitamina C

200ug/mL

Tiempo

(días)

Jarabe de Vitamina C + Antioxidante natural


1 0,011 0,012 0,011 0,011

15 0,012 0,011 0,010 0,011

30 0,007 0,006 0,006 0,006

60 0,006 0,006 0,006 0,006

90 0,014 0,013 0,013 0,013


reactivo DPPH a las soluciones metanólicas de Vitamina C + antioxidante natural. Elaborado por Mireya

Medina.

Tabla 4. 26

Absorbancias del blanco del jarabe de Vitamina C + Antioxidante natural, a 1os

tiempos (1, 15, 30, 60 y 90 días).

Concentración

teórica de

Vitamina C

200ug/mL

Tiempo

(días)

Jarabe de Vitamina C + Antioxidante natural


muestra

Media

1 0,006 0,005 0,006 0,006

15 0,006 0,006 0,005 0,006

30 0,000 0,000 0,000 0,000

60 0,000 0,000 0,000 0,000

90 0,004 0,005 0,005 0,013


Vitamina C+ antioxidante natural. Elaborado por Mireya Medina.

Tabla 4. 27

Absorbancias de jarabe de Vitamina C + Antioxidante sintético, a los tiempos (1, 15,

30, 60 y 90 días).

Concentración

teórica de

Vitamina C

200ug/mL

Tiempo

(días)

Jarabe de Vitamina C + Antioxidante sintético


1 0,010 0,010 0,010 0,010

15 0,008 0,010 0,009 0,009

30 0,006 0,008 0,007 0,007

60 0,006 0,008 0,007 0,007

90 0,013 0,012 0,011 0,012


reactivo DPPH a las soluciones metanólicas de Vitamina C + antioxidante sintético. Elaborado por

Mireya Medina.

57

Tabla 4. 28

Absorbancias del blanco del jarabe de Vitamina C + Antioxidante sintético, a los

tiempos (1,15, 30, 60 y 90 días).

Concentración

teórica de

Vitamina C

200ug/mL

Tiempo

(días)

Jarabe de Vitamina C + Antioxidante sintético


muestra

Media

1 0,003 0,002 0,002 0,002

15 0,000 0,000 0,000 0,000

30 0,000 0,000 0,000 0,000

60 0,000 0,000 0,000 0,000

90 0,003 0,003 0,003 0,003


Vitamina C + antioxidante sintético. Elaborado por Mireya Medina.

Cálculo del Porcentaje de inhibición del radical DPPH.

(

)

Ejemplo:

*Para muestra (jarabe de Vitamina C), tiempo cero (1 día).

(

)

Tabla 4. 29

Valores de Porcentaje de inhibición de radical DPPH del jarabe de Vitamina C libre de

antioxidante, a los tiempos (1, 15, 30, 60 y 90 días).

Concentración

teórica de

Vitamina C

200ug/mL

Tiempo

(días)

% Inhibición de radical DPPH -


Media

96,67 97,08 96,67 96,81

15 95,56 95,27 95,27 95,36

30 92,57 92,94 92,94 92,81

60 86,62 86,99 86,99 86,86

90 76,40 78,65 77,90 77,65


58

Tabla 4. 30

Resumen de porcentaje de inhibición de radical DPPH del jarabe de vitamina C libre

de antioxidante, a los tiempos (1, 15, 30, 60 y 90 días).

Tiempo

(días)

% Inhibición DPPH - Jarabe

Vit. C libre de antioxidante

1 96,81

15 95,36

30 92,81

60 86,86

90 77,65


Gráfico 4. 9: Tiempo vs % Inhibición de radical DPPH – jarabe de vitamina C libre de antioxidante

En la gráfica 4.9 se observa que a medida transcurre el tiempo, el porcentaje de

inhibición del radical DPPH va disminuyendo, lo cual indica que la capacidad

antioxidante del jarabe de vitamina C libre de antioxidante se reduce.

Tabla 4. 31

Valores de Porcentaje de inhibición de radical DPPH del jarabe de vitamina C +

antioxidante natural, a los tiempos (1, 15, 30, 60 y 90 días).

Concentración

teórica de

Vitamina C

200ug/mL

Tiempo

(días)


Jarabe Vit. C + Antioxidante

natural

Media

1 97,92 97,08 97,92 97,64

15 98,22 98,52 98,52 98,42

30 97,40 97,77 97,77 97,65

60 97,77 97,77 97,77 97,77

90 96,25 97,00 97,00 96,75


96,81 95,36

92,81

86,86

77,65

70,00

75,00

80,00

85,00

90,00

95,00

100,00

0 20 40 60 80 100

% I

nh

ibic

ión

DP

PH

Jara

be

de

Vit

. C

Tiempo (días)

Tiempo vs % Inhibición DPPH

59

Tabla 4. 32

Resumen de porcentaje de inhibición de radical DPPH del jarabe de vitamina C +

antioxidante natural, a los tiempos (1, 15, 30, 60 y 90 días).

Tiempo

(días)

% Inhibición DPPH -

Jarabe Vit. C+ antioxidante

natural

1 97,64

15 98,42

30 97,65

60 97,77

90 96,75


Gráfico 4. 10: Tiempo vs % Inhibición de radical DPPH – Jarabe de vitamina C + antioxidante natural.

En la gráfica 4.10 se muestra que a medida pasa el tiempo el % de inhibición de radical

DPPH del jarabe de vitamina C que contiene el antioxidante natural (extracto

hidroalcohólico de Dodonaea viscosa) se mantiene. Lo cual sugiere que la capacidad

antioxidante del producto final no cambia gracias a la presencia del extracto natural.

Tabla 4. 33

Valores de Porcentaje de inhibición de radical DPPH del jarabe de vitamina C +

antioxidante sintético (metabisulfito de sodio), a los tiempos (1, 15, 30, 60 y 90 días).

Concentración

teórica de

Vitamina C

200ug/mL

Tiempo

(días)


Jarabe Vit. C+ Antioxidante

sintético

Media

1 97,08 96,67 96,67 96,81

15 97,63 97,04 97,34 97,34

30 97,77 97,03 97,40 97,40

60 97,77 97,03 97,40 97,40

90 96,25 96,63 97,00 96,63


97,64 98,42 97,65 97,77 96,75

70,00

75,00

80,00

85,00

90,00

95,00

100,00

0 20 40 60 80 100

% I

nh

ibic

ión

DP

PH

-

Jara

be

Vit

.C +

An

tioxid

an

te n

atu

ral

Tiempo (días)


60

Tabla 4. 34

Resumen de porcentaje de inhibición de radical DPPH del jarabe de vitamina C +

antioxidante sintético (metabisulfito de sodio), a los tiempos (1, 15, 30, 60 y 90 días).

Tiempo

(días)

% Inhibición DPPH -

Jarabe Vit. C+ antioxidante

sintético

1 96,81

15 97,34

30 97,40

60 97,40

90 96,63


Gráfico 4. 11: Tiempo vs % Inhibición de radical DPPH – jarabe de vitamina C + antioxidante sintético.

En la gráfica 4.11 se expone cómo el porcentaje de inhibición del radical DPPH del

jarabe de vitamina C que en su formulación contiene un antioxidante sintético

(metabisulfito de sodio) se conserva. Aquello señala que la capacidad antioxidante del

producto terminado no varía en la presencia del antioxidante sintético.

Tabla 4. 35

Resumen de porcentaje de inhibición de radical DPPH del jarabe de vitamina C: libre

de antioxidante, con antioxidante natural y con antioxidante sintético a los tiempos (1,

15, 30, 60 y 90 días).

Tiempo

(días)

% Inhibición DPPH

Libre Natural Sintético

1 96,81 97,64 96,81

15 95,36 98,42 97,34

30 92,81 97,65 97,40

60 86,86 97,77 97,40

90 77,65 96,75 96,63

96,81 97,34 97,40

97,40 96,63

70,00

75,00

80,00

85,00

90,00

95,00

100,00

0 20 40 60 80 100

% I

nh

ibic

ión

DP

PH

-

Jara

be

Vit

.C +

An

tioxid

an

te s

inté

tico

Tiempo (días)


61

En la tabla 4.35 se aprecia que el porcentaje de inhibición de radicales libres en

tiempo cero (1 día), es similar para el jarabe libre de antioxidante, con antioxidante

natural y antioxidante sintético, pero en los días posteriores (15, 30, 60 y 90) el jarabe

libre de antioxidante presenta un decremento en el porcentaje de inhibición de radicales

libres en comparación con los productos con antioxidante natural y sintético.

Al considerar que tanto el jarabe con antioxidante natural como el que contiene

antioxidante sintético constan de dos antioxidantes:

*Jarabe con antioxidante natural: Extracto natural + ácido ascórbico.

*Jarabe con antioxidante sintético: Metabisulfito de sodio + ácido ascórbico.

Se determinó que ni el extracto hidroalcohólico de Dodonaea viscosa, ni el

metabisulfito de sodio muestran los siguientes tipos de interacción.

*Sinergismo: No existe, porque el efecto total de los 2 antioxidantes no es mayor a la

suma de los efectos individuales.

*Adición: No presenta, porque el efecto total de los 2 antioxidantes no es equivalente

a la suma de los efectos individuales.

*Antagonismo: Tampoco muestra, porque el efecto total de los dos antioxidantes no

es menor a la suma de los efectos por parte de cada antioxidante.

Considerando lo anterior, se desconoce el mecanismo de interacción con el cual

actúan los antioxidantes empleados.

Gráfico 4. 12: % Inhibición de radical DPPH en función del tiempo y tipo de antioxidante.

La gráfica 4.12 indica, que sí influye la incorporación de antioxidantes en la

formulación del jarabe de vitamina C. Se puede notar que el producto terminado que

contiene antioxidantes ya sea el extracto hidroalcohólico de Dodonaea viscosa o el

metabisulfito de sodio, mantiene su actividad a los 90 días, mientras que el jarabe que

no, su propiedad antioxidante disminuye a medida transcurre el tiempo.

85,00

90,00

95,00

100,00

1 15 30 60 90

96,81 95,36

92,81

86,86 77,65

97,64 98,42 97,65 97,77

96,75 96,81 97,34 97,40 97,40 96,63

% In

hib

ició

n D

PP

H

Tiempo (días)


Libre de antioxidante Antioxidante natural Antioxidante sintético

62

Análisis estadístico - % de inhibición.

Tabla 4. 36

Análisis de Varianza para Inhibición de radicales libres

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P

EFECTOS

PRINCIPALES

A:Tipo de antioxidante 561,372 2 280,686 1655,21 0,0000

B:Tiempo 288,258 4 72,0644 424,96 0,0000

INTERACCIONES

AB 453,701 8 56,7126 334,43 0,0000

RESIDUOS 5,08733 30 0,169578

TOTAL (CORREGIDO) 1308,42 44

En la tabla 4.36 se aprecia que los factores principales: tipo de antioxidante y tiempo,

además de la interacción entre ellos, tienen un efecto estadísticamente significativo

sobre el porcentaje de inhibición de radicales libres con un 95,0% de nivel de confianza,

debido a que los valores de P son menores a 0,05. Esto conlleva a comprobar las

siguientes hipótesis de trabajo:

El tipo de antioxidante ejerce efecto significativo sobre el porcentaje de inhibición

del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH).

Existe diferencia significativa en el porcentaje de inhibición del radical 2,2-difenil-1-

picrilhidrazilo (DPPH) entre los jarabes de vitamina C debido a los diferentes periodos

de tiempo.

La interacción tipo de antioxidante – tiempo ejerce efecto sobre el porcentaje de


Tabla 4. 37

Pruebas de Múltiple Rangos para Inhibición de radicales libres por Tipo de

antioxidante

Tipo de antioxidante Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos

Libre antioxidante 15 89,9013 0,106326 X

Ant. sintético 15 97,114 0,106326 X

Ant. natural 15 97,6453 0,106326 X

La tabla 4.37 indica los resultados obtenidos al aplicar un procedimiento de

comparación múltiple (Tukey) para determinar qué medias de porcentaje de inhibición

de radicales libres (DPPH) son significativamente diferentes entre sí. La alineación de

las X's no es homogénea, esto indica que existe diferencias estadísticamente

significativas entre las tres medias en cuestión con un nivel del 95% de confianza.

Siendo el jarabe con antioxidante natural el que muestra la mayor media por ende el

producto con mejor capacidad antioxidante, caso contrario ocurre con el producto libre

de antioxidante que exhibe la media más baja.

63

Gráfico 4. 13: Gráfica de medias – pruebas de múltiple rangos para inhibición de radicales libres por Tipo

de antioxidante.

De acuerdo a la gráfica 4.13, se observa que el jarabe de vitamina C libre de

antioxidante posee la media más baja, seguido del jarabe con antioxidante sintético y

finalmente por aquel que contiene antioxidante natural, esto significa que el

antioxidante natural es aquel que proporciona mayor capacidad antioxidante.

Gráfico 4. 14: Efecto de las interacciones de dos factores (tipo de antioxidante y tiempo) sobre el

porcentaje de inhibición de radicales libres (DPPH).

En la gráfica 4.14 se muestra que el porcentaje de inhibición en el jarabe libre de

antioxidante va en decremento a medida transcurren los días, mientras que los productos

que contienen el antioxidante natural y el sintético la variable respuesta se mantiene a lo

largo del tiempo (del día 1 al 90), lo cual confirma el efecto sinérgico que estos exhiben.


Medias y 95,0% de Tukey HSD


89

91

93

95

97

99

Inh

ibic

ión

de r

ad

icale

s l

ibre

s

Gráfico de Interacciones


77

81

85

89

93

97

101

Inh

ibic

ión

de r

ad

icale

s l

ibre

s


Tiempo115306090

64

Etapa VI: Control de calidad de jarabe de vitamina C, (U.S. Food and Drug

Administration, 2014) (World Health Organization, 2006).

Controles organolépticos y físicos de jarabe de vitamina C.

Tabla 4. 38

Parámetros organolépticos y físicos del jarabe de vitamina C libre de antioxidante a

días: 1, 15, 30, 60 y 90.


Parámetros Tiempo (días)

0 15 30 60 90

Org

an

olé

pti

cos Olor Fresa Fresa Fresa Fresa Fresa

Color Amarillo ++ Amarillo ++ Amarillo ++ Amarillo ++ Amarillo

+++

Sabor Fresa Fresa Fresa Fresa Fresa

Aspecto Homogéneo Homogéneo Homogéneo Homogéneo Homogéneo

Físicos pH 3,25 3,22 3,20 3,30 3,20

Densidad 1,2928 1,2929 1,2931 1,2931 1,2935


En tabla 4.38 se aprecia que las características organolépticas se mantienen a medida

transcurre el tiempo, excepto que el color del producto al día 90 presenta un amarillo

levemente intenso. Los parámetros físicos como pH y densidad no cambian, se

mantienen.

Tabla 4. 39

Parámetros organolépticos y físicos del jarabe de vitamina C + antioxidante natural a

días: 1, 15, 30, 60 y 90.

Jarabe de Vitamina C + Antioxidante Natural


0 15 30 60 90

Org

an

olé

pti

cos Olor Miel Fresa/Durazno/

miel

Fresa/Durazno/

miel

Fresa/Durazno/

miel

Fresa/Durazno

/miel

Color Amarillo

++++

Amarillo ++++ Amarillo ++++ Amarillo ++++ Amarillo

+++++

Sabor Miel Miel

/Fresa/Durazno Fresa/Durazno Fresa/Durazno Fresa/Durazno


Físicos pH 3,46 3,47 3,47 3,48 3,53

Densidad 1,2612 1,2685 1,2687 1,2684 1,2692


En tabla 4.39 se aprecia que en lo referente a las características organolépticas el olor y

el sabor cambian a partir del día 15, considerando que el sabor ni el olor son

desagradables al gusto. El color al día 90 se hace un poco más intenso comparado con el

inicial. Con respecto al pH y densidad los valores se conservan.

65

Tabla 4. 40

Parámetros organolépticos y físicos del jarabe de vitamina C + antioxidante sintético.

Jarabe de Vitamina C + Antioxidante Sintético


0 15 30 60 90

Org

an

olé

pti

cos Olor Fresa Fresa Ligero a

fresa

Ligero a

fresa

Ligero a fresa

Color Amarillo + Amarillo + Amarillo + Amarillo + Amarillo ++

Sabor Fresa Fresa Fresa Fresa Fresa/levemente

amargo


Físicos pH 3,37 3,33 3,30 3,34 3,36

Densidad 1,2941 1,2931 1,2960 1,2948 1,2968


En la tabla 4.40 el olor cambia ligeramente a partir del día 30, al día 90 el color se hace

más intenso y el sabor se hace levemente amargo al final, su aspecto se conserva

homogéneo al igual que su pH y densidad.

De las tablas 4.38 – 4.40 se nota que al día 90 el color de los jarabes: libre de

antioxidante, con antioxidante natural y con sintético se hace más intenso (amarillo)

quizá sea por efecto de un producto de degradación del ácido ascórbico o de uno de los

excipientes, además el sabor del producto con antioxidante sintético se vuelve

ligeramente amargo probablemente por la generación de óxido de azufre a partir del

metabisulfito como producto de la alta temperatura a la cual fue sometido el jarabe.

Control microbiológico del jarabe de vitamina C a días 1 y 90.

Tabla 4. 41

Control microbiológico

Microorganismos Especificación Resultado

Libre antioxidante Ant. Natural Ant. Sintético

0 días 90 días 0 días 90 días 0 días 90 días

Aerobios totales < 100 ufc/ml < 100

ufc/ml

< 100

ufc/ml

< 100

ufc/ml

< 100

ufc/ml

< 100

ufc/ml

< 100

ufc/ml

Hongos y

levaduras

< 10 ufc/ml < 10

ufc/ml

< 10

ufc/ml

< 10

ufc/ml

< 10

ufc/ml

< 10

ufc/ml

< 10

ufc/ml

Escherichia coli Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia


Según la tabla 4.41 los productos elaborados cumplen con las especificaciones

microbiológicas para formas farmacéuticas acuosas no estériles.

66

CAPÍTULO V

Conclusiones

El extracto hidroalcohólico de Dodonaea viscosa se obtuvo a partir de las hojas

que fueron recolectadas en el Parque Nacional y Bosque Protector Jerusalem.

Se formuló y elaboró tres lotes piloto de 16 muestras de jarabe de vitamina C de

30ml a una concentración de 100mg/5ml. El primer lote libre de antioxidante,

segundo lote se empleó antioxidante natural (extracto hidroalcohólico de

Dodonaea viscosa) y tercer lote se utilizó antioxidante sintético (metabisulfito de

sodio).

Se determinó que los factores de estudio: tipo de antioxidante, tiempo y sus

interacciones ejercen un efecto estadísticamente significativo sobre las variables

respuesta: concentración de vitamina C (tabla 4.20) y porcentaje de inhibición del

activo (tabla 4.36).

Todos los lotes elaborados fueron sometidos a estudios de estabilidad acelerada a

40o 2

oC y 75 5 % de HR durante 3 meses, acorde la guía Q1A (R2) de la

ICH.

En el jarabe las concentraciones de ácido ascórbico obtenidas a los 90 días

después de ser sometido a 40o 2

oC y 75 5 % de HR fueron: 75,53%;

76,70%, 90,33% para el producto libre de antioxidante, con antioxidante natural

y con antioxidante sintético respectivamente, lo cual indica que el metabisulfito

de sodio es el antioxidante que mejor preserva al activo.

Los valores de la tabla (4.35) y el tratamiento estadístico (4.37) indican que el

producto con mejor capacidad antioxidante es aquel que contiene el extracto

hidroalcohólico de Dodonaea viscosa mostrando un 96,75% de inhibición de

radical DPPH a pesar que su diferencia es mínima en comparación con el jarabe

que contiene metabisulfito de sodio que muestra un 96,63% de inhibición de

radical DPPH.

67

No es posible con la adición del extracto hidroalcohólico de Dodonaea viscosa

evitar la sobredosificación de la forma farmacéutica líquida a prueba, a pesar de

ello se podría considerar su actividad antioxidante como un atributo beneficioso

para la salud.

Los controles microbiológicos fueron exitosos, cumplieron con las

especificaciones USP 39 NF 34.

Recomendaciones

Se recomienda se realicen estudios de toxicidad del extracto hidroalcohólico de

Dodonaea viscosa, para conocer cuál es la máxima concentración que se podría

colocar en una fórmula farmacéutica ya que a más de la propiedad antioxidante

que se mantiene a lo largo del tiempo, ésta posee otras propiedades benéficas

como: antidiabético, antiulceroso, antiinflamatorio, etc.

El extracto natural de Dodonaea viscosa no evita la degradación del ácido

ascórbico, pero mantiene la propiedad antioxidante del producto a lo largo del

tiempo bajo condiciones aceleradas, T: 40±2ºC; HR: 75±5%, por lo cual se

sugiere que se elabore un jarabe empleando como activo el extracto.

En base al estudio realizado se desconoce cuál es el mecanismo de interacción

de antioxidantes que presenta el extracto hidroalcohólico de Dodonaea viscosa,

motivo por el cual se sugiere ejecutar una investigación direccionada a conocer

el mismo.

Para la determinación de vitamina C se recomienda emplear un método

indicativo de estabilidad que sea capaz de identificar y cuantificar las

degradaciones, de esa manera el trabajo presentará una mejor justificación de

que ocurre con su API.

68

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73

Anexo 1 – Diagrama causa – efecto. Espina de pescado


Por qué la Vitamina C es

inestable en formas

farmacéuticas líquidas

(jarabe)

Materiales Proceso

Producto terminado Personal

Mal cálculo de

presupuesto

Falta de información

Material no cumple con

especificaciones

No control de factores

que influyen durante la

elaboración

pH del medio

Condiciones

ambientales

Oxígeno Condiciones no

favorables para su

almacenamiento.

Estación

climática

Almacenamient

o no acorde a su

presentación

Interacciones

Características físico-

químicas de la vitamina

C.

Luz

Poco aceptado

Equipos

Uso no acertado

del equipo No existe un lugar

adecuado para cada

proceso

Humedad

Composición

del jarabe

Carencia de conocimiento

sobre factores que influyen

en la degradación de la

Vitamina C en el jarabe

Poco interés

Falta de revisión

bibliográfica.

Información mal

interpretada.

Información errónea.

Temperatura

elevada

Propiedades organolépticas, no

tolerables

74

Pesar 100g Planta seca y

molida

400ml -Etanol 70o

Filtrado

Filtrar

Residuo + 450ml

Etanol 70o

Macerar

Reservar

Filtrado + Percolado

Percolar

Añadir

Concentrar

Recipiente 1

48h, agitación constante

Recipiente 1

Recipiente 1

Al vacío

48h, 5gotas/min

Rotavapor 30ºC- consistencia

sirope

Recipiente 2

Recipiente 3

Recipiente 3

Anexo 2 - Pruebas preliminares – Capacidad antioxidante del extracto

hidroalcohólico de Dodonaea viscosa en relación al ácido ascórbico.

Inhibición de radical DPPH

Extracto hidroalcohólico Dodonaea

viscosa

Ácido ascórbico

200ug/ml 150ug/ml 100ug/ml 50ug/ml 200ug/ml 150ug/ml 100ug/ml 50ug/ml

Anexo 3 – Diagrama de flujo de Obtención del extracto hidroalcohólico de

Dodonaea viscosa

Nota: Elaborado por Mireya Medina, tomado de (Paredes González, 2013).

75

Obtención del extracto hidroalcohólico de Dodonaea viscosa

Molienda Filtración

Percolación Concentración

76

Pesar Ingredientes

Agua + sacarina +

EDTA *

PPG + Glicerina Mezclar

Disolver

Recipiente 1

Recipiente 2

Saborizante ** Agregar

Ensayos

Agitación constante,

hasta homogenizar.

Envasar

Control de calidad.

Rotular

Agitación manual

Sacarosa + agua

Agitar

Añadir

Disolver Baño maría 80ºC, agitación

mecánica, recipiente de vidrio Recipiente 3

Recipiente 3

Recipiente 3

Ácido ascórbico Agitación mecánica -

Hasta solubilización

total del ácido ascórbico.

Mezclar

Recipiente 3

Mezclar

Anexo 4 – Diagrama de flujo del proceso de elaboración del jarabe

Nota: *Agregar el metabisulfito de sodio (SMB) y ** añadir el extracto hidroalcohólico de Dodonaea

viscosa cuando lo amerite. Elaborado por Mireya Medina.

77

Elaboración del jarabe de Vitamina C

Jarabe simple Mezcla de ingredientes

Envasado Lotes de jarabe

78

Pesar 0,5g Ác. ascórbico

10ml de solución de

ác, ascórbico

Agua destilada Aforar

Tomar

Recipiente 1

Recipiente 2

A 100ml

*10ml ác. Acético

*1ml almidón (1%)

*50ml Agua destilada

Valorar

Mezclar

Añadir Recipiente 2

Recipiente 2

Recipiente 2

Volumétricamente con

solución de yodo 0,1N.

Hasta viraje azul intenso

Calcular %p.a

*1ml de yodo 0,1N equivale a 8,81mg de ác. Ascórbico

*N=Normalidad de la solución de yodo

V=Volumen de yodo consumido en la titulación

𝑝 𝑎 𝑁 𝑉 𝐸𝑞

𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑝 𝑎

Anexo 5 – Valoración de ácido ascórbico

Nota: Elaborado por Mireya Medina, tomado de USP39, NF 34

79

Anexo 6 – Diagrama de flujo de determinación de la capacidad antioxidante –

DPPH

Nota: Elaborado por Mireya Medina, tomado de (Recalde Armas, 2014)

Capacidad antioxidante

Preparación de soluciones Lectura espectrofotométrica

Mezclar Soln. (DPPH* + metanol)

Diferentes tubos rosca con:

1,5ml metOH + 3ml Soln. (DPPH*/metOH)

1,5ml Jarabe (200 ug de Vit. C/ml) + 3ml

Soln. ( DPPH*/metOH)

1,5ml Metanol + 3ml jarabe (200ug de Vit.

C/ml) (blanco de la muestra)

Blanco: 2:1 metOH: agua

Reposar

Leer

% de inhibición de radicales libres.

Tomar datos

Preparar

Calcular

Reacción- 30min, oscuridad

Espectrofotómetro, 517nm

20mg/L

𝐴𝑏𝑠𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝐴𝑏𝑠 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

𝐴𝑏𝑠𝐷𝑃𝑃𝐻

80

Anexo 7 – Control de calidad

pH Control microbiológico

Determinación – peso específico

81

Anexo 8 – Voucher

ETIQUETA

82

Anexo 9 - Autenticación botánica

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