UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE … · la elaboración del anteproyecto. Al Dr. Ullrich...
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE ODONTOLOGÍA CARRERA DE ODONTOLOGÍA Evaluación in vitro del efecto inhibitorio del chocolate de dos genotipos (nacional y CCN-51) edulcorado con eritritol frente a Streptococcus mutans (ATCC 25175) Proyecto de investigación presentado como requisito previo a la obtención del título de Odontóloga Autora: Velasco Núñez Josselyn Estefanía Tutor: Dr. Roberto Xavier Romero Cazares Quito, junio 2017
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
CARRERA DE ODONTOLOGÍA
Evaluación in vitro del efecto inhibitorio del chocolate de dos genotipos
(nacional y CCN-51) edulcorado con eritritol frente a Streptococcus
mutans (ATCC 25175)
Proyecto de investigación presentado como requisito previo a la obtención del
título de Odontóloga
Autora: Velasco Núñez Josselyn Estefanía
Tutor: Dr. Roberto Xavier Romero Cazares
Quito, junio 2017
II
© DERECHOS DE AUTOR
Josselyn Estefanía Velasco Núñez, en calidad de autor del trabajo de
investigación: “Evaluación in vitro del efecto inhibitorio del chocolate de dos
genotipos (nacional y CCN-51) edulcorado con eritritol frente a Streptococcus
mutans (ATCC 25175)” autorizo a la UniversidadCentral del Ecuador a hacer uso
del contenido total parcial que me pertenece, con fines estrictamente
académicos o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente
autorización,seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en
los artículos 5, 6, 8; 19 ydemás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y
su Reglamento.
También, autorizo a la Universidad Central del Ecuador realizar la digitación y
publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de
conformidad a lo dispuesto en el Art.144 de la Ley Orgánica de Educación
Superior.
Firma:
………………………………..
Josselyn Estefanía Velasco Núñez
CC. 1724571797
III
APROBACIÓN DEL TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
Yo, Roberto Xavier Romero Cazares con C.I. 171433238-2, en carácter de tutor
del trabajo de Grado, presentado por la señorita, Josselyn Estefanía Velasco
Núñez, para optar por el título de Odontóloga, cuyo título es: “EVALUACIÓN IN
VITRO DEL EFECTO INHIBITORIO DEL CHOCOLATE DE DOS GENOTIPOS
(NACIONAL, CCN51) EDULCORADO CON ERITRITOL FRENTE A
Streptococcus mutans (ATCC 25175)”, previo a la obtención de Grado de
Odontólogo; considero que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios
en el campo metodológico y epistemológico, para ser sometido a la evaluación
por parte del tribunal examinador que se designe, por lo que APRUEBO, a fin de
que el trabajo sea habilitado para continuar con el proceso de titulación
determinado por la Universidad Central del Ecuador.
En la ciudad de Quito, a los 16 días del mes de mayo de 2017.
………………………………………………..
Dr. Roberto Xavier Romero Cazares
DOCENTE-TUTOR
C.I. 1714332382
IV
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL
El Tribunal constituido por: la Dra. Maritza del Carmen Quezada Conde, Dra.
María Fernanda Caicedo Breedy y el Dr. Emilio Antonio Jalkh Rodríguez.
Luego de receptar la presentación oral del trabajo de titulación previo a la
obtención del título de Odontóloga presentado por la señorita Josselyn Estefanía
Velasco Núñez.
Con el título:
“Evaluación in vitro del efecto inhibitorio del chocolate de dos genotipos
(nacional y CCN-51) edulcorado con eritritol frente a Streptococcus
mutans (ATCC 25175)”
Emite el siguiente veredicto: ………………………….
Fecha: ……………………………
Para constancia de lo actuado firman:
Nombre Calificación Firma
Presidente Dra. Maritza Quezada …………….. ……………...
Vocal 1 Dra. María Fernanda Caicedo …………….. ……………..
Vocal 2 Dr. Emilio Jalkh …………….. ……………..
V
DEDICATORIA
A Jehová, Rey de reyes, quien a mis 8 años puso el deseo y la pasión por esta
cautivante profesión.
A mis padres, Susana y Franklin por impulsarme, respaldarme y guiarme en
cada paso a lo largo de mi carrera.
A mi papá Segundo, por apoyarme durante mi carrera.
A mis abuelitos José y Alicia, por ser un pilar muy importante en mi vida, a
quienes quiero y admiro mucho.
A mis hermanos Bryan, Daniel, Emily y Katherine por la admiración y confianza
que depositaron en mí.
A mis tías Raquel, Ruth y Catalina, que en diferentes etapas de la carrera me
han brindado su generosa ayuda.
A toda mi familia.
VI
AGRADECIMIENTO
Un reconocimiento especial a cada uno de los profesionales que aportaron con
sus conocimientos para la realización de este proyecto, ya que, sin su guía,
esto no se habría hecho realidad.
A mi mejor amiga Carolina Bedón, por su amistad sincera, y todos sus
conocimientos puestos al servicio de esta investigación.
Al Dr. Wilfrido Palacios, mentor del tema propuesto, por su orientación durante
la elaboración del anteproyecto.
Al Dr. Ullrich Stahl, docente de la Facultad de Ingeniería Química, quien
colaboró en la suministración del eritritol, a fin de llevar a cabo la investigación.
A la MSc. Martha Vargas, junto con el MSc. Gabriel Larrea, docentes de la
ESPE, por su acertada orientación y apoyo incondicional, en la
elaboración de los chocolates.
A la BQ. Carolina Satán, junto con el BQ. Rafael Tamayo, analistas del Instituto
Nacional de Investigación en Salud Pública, por su paciencia y ayuda, en cada
paso de los análisis microbiológicos.
Al Dr. Jorge Reyes, Director del Centro de Referencia Nacional de Resistencia
a los Antimicrobianos, por su guía, colaboración y disposición en el transcurso
de la investigación.
Al Dr. Daniel Garzón, docente de la Universidad San Francisco de Quito, quien
colaboró en el análisis estadístico de esta investigación.
A mi tutor, Dr. Roberto Romero, por su oportuna asistencia en la estructuración
y desarrollo del presente trabajo de investigación.
A todos mis maestros, a quienes recuerdo con mucha admiración y cariño, ya
que, en el curso de mi carrera supieron instruirme y darme las herramientas
para poder culminar con éxito esta hermosa etapa de mi vida.
VII
ÍNDICE DE CONTENIDOS
© DERECHOS DE AUTOR ................................................................................ II
APROBACIÓN DEL TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN ..................... III
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL .......................... IV
DEDICATORIA .................................................................................................. V
AGRADECIMIENTO ......................................................................................... VI
ÍNDICE DE CONTENIDOS .............................................................................. VII
LISTA DE TABLAS .......................................................................................... XI
LISTA DE GRAFICOS ..................................................................................... XII
lISTA DE FIGURAS ......................................................................................... XII
lista DE ANEXOS ........................................................................................... XIV
RESUMEN ....................................................................................................... XV
ABSTRACT .................................................................................................... XVI
INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 1
CAPÍTULO I ..................................................................................................... 2
EL PROBLEMA ............................................................................................... 2
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ...................................................... 2
1.2 OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN ..................................................... 4
1.2.1 OBJETIVO GENERAL ....................................................................... 4
1.2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................. 4
1.3 JUSTIFICACIÓN ....................................................................................... 5
1.4 HIPÓTESIS DE TRABAJO ....................................................................... 6
CAPÍTULO II ................................................................................................... 7
2. MARCO TEÓRICO ..................................................................................... 7
2.1 Biofilm dental .......................................................................................... 7
2.1.1 Formación del Biofilm ...................................................................... 7
2.1.2 Adherencia ........................................................................................ 8
2.1.2.1 Ligandos del huésped ................................................................ 9
2.1.2.2 Adhesinas bacterianas ............................................................... 9
2.2 Grupo Streptococcus mutans .............................................................. 10
2.2.1 Estructura ........................................................................................ 10
2.2.2 Clasificación del grupo Streptococcus mutans ........................... 12
2.2.3 Fisiopatología.................................................................................. 13
2.2.3.1 Metabolismo de la sacarosa .................................................... 13
2.2.3.1.1 Producción de ácidos ........................................................ 13
2.2.3.1.2 Síntesis de polisacáridos extracelulares ......................... 13
VIII
2.2.3.1.3 Síntesis de polisacáridos intracelulares .......................... 14
2.2.3.2 Factores metabólicos de cariogenicidad ............................... 14
2.2.4 Características ................................................................................ 14
2.2.4.1 Streptococcus Mutans ............................................................. 14
2.2.4.2 Streptococcus sobrinus ........................................................... 16
2.2.4.3 Streptococcus cricetus ............................................................ 16
2.2.4.4 Streptococcus rattus ................................................................ 16
2.2.4.5 Streptococcus ferus ................................................................. 16
2.2.4.6 Streptococcus downei ............................................................. 16
2.2.4.7 Streptococcus macacae ........................................................... 16
2.3 Cacao (Theobroma cacao L.) ............................................................... 18
2.3.1 Tipos de cacao ................................................................................ 18
2.3.1.1 Cacao Criollo ............................................................................ 18
2.3.1.2 Cacao Forastero Amazónico ................................................... 18
2.3.1.3 Cacao Trinitario ........................................................................ 18
2.3.1.4 Cacao Nacional ......................................................................... 19
2.3.1.4.1 Clones ..................................................................................... 19
2.3.2 Descripción botánica ...................................................................... 20
2.3.2.1 Raíz ............................................................................................ 20
2.3.2.2 Tallo y ramas ............................................................................. 20
2.3.2.3 Hojas .......................................................................................... 20
2.3.2.4 Flores ......................................................................................... 20
2.3.2.5 Fruto .......................................................................................... 20
2.3.2.6 Semillas ..................................................................................... 21
2.3.2.6.1 Composición química del grano de cacao ....................... 21
2.3.2.6.1.1 Compuestos grasos ..................................................... 21
2.3.2.6.1.2 Compuestos fenólicos ................................................. 21
2.3.2.6.1.2.1 Flavoniodes .......................................................... 22
2.3.2.6.1.3 Alcaloides del cacao .................................................... 22
2.3.2.6.2 Mecanismo de acción de los polifenoles sobre el Streptococcus mutans. ..................................................................... 23
2.3.3 Beneficiado del cacao .................................................................... 24
2.3.3.1 Cosecha ..................................................................................... 24
2.3.3.2 Extracción de Almendras ......................................................... 24
2.3.3.3 Fermentación ............................................................................ 24
2.3.3.4 Secado ....................................................................................... 25
2.3.4 Subproductos del cacao ................................................................ 25
IX
2.3.4.1 Licor o pasta de Cacao ............................................................ 25
2.3.4.2 Manteca de Cacao .................................................................... 25
2.3.4.3 Polvo de Cacao ......................................................................... 26
2.3.5 Chocolate ........................................................................................ 26
2.3.5.1 Elaboración de chocolate ........................................................ 26
2.3.5.1.1 Tostado ............................................................................... 26
2.3.5.1.2 Molienda .............................................................................. 26
2.3.5.1.3 Prensado ............................................................................. 27
2.3.5.1.4 Mezclado ............................................................................. 27
2.3.5.1.5 Refinado .............................................................................. 27
2.3.5.1.6 Conchado ............................................................................ 27
2.3.5.1.7 Templado ............................................................................ 28
2.3.5.1.8 Moldeado............................................................................. 28
2.3.5.1.9 Envasado ............................................................................ 28
2.3.5.2 Beneficios del chocolate .......................................................... 29
2.4 Sustitutos del azúcar ............................................................................ 29
2.4.1 Aplicaciones clínicas ...................................................................... 30
2.4.2 Endulzantes utilizados como sustitutos de la sacarosa ............. 31
2.4.2.1 Polialcoholes ............................................................................ 31
2.4.2.1.1 Eritritol ................................................................................ 32
2.4.2.1.1.1 Propiedades .................................................................. 32
2.4.2.1.1.2 Aplicaciones clínicas ................................................... 32
2.4.2.1.1.3 Efectos adversos ......................................................... 33
2.4.2.1.1.4 Mecanismo de acción .................................................. 33
CAPÍTULO III ................................................................................................ 35
3. METODOLOGÍA ....................................................................................... 35
3.1 Tipo y diseño de la investigación ........................................................ 35
3.2 Universo de estudio .............................................................................. 35
3.2.1 Criterios de inclusión ..................................................................... 35
3.2.2 Criterios de exclusión: ................................................................... 35
3.3 Operacionalización de variables .......................................................... 37
3.4 Materiales y equipos ............................................................................. 39
3.5 Lugar de la investigación ..................................................................... 41
3.6 Procedimiento ....................................................................................... 41
3.6.1 Elaboración del chocolate ............................................................. 41
3.6.1.1 Selección de la materia prima ................................................. 41
3.6.1.2 Fermentación ............................................................................ 41
X
3.6.1.3 Secado ....................................................................................... 41
3.6.1.4 Tostado ...................................................................................... 42
3.6.1.5 Molienda .................................................................................... 42
3.6.1.6 Mezcla ........................................................................................ 42
3.6.1.7 Templado ................................................................................... 43
3.6.1.8 Almacenamiento y descontaminación .................................... 43
3.6.2 Análisis microbiológico ................................................................. 44
3.6.2.1. Preparación de los medios de cultivo ................................... 44
3.6.2.1.1 Agar sangre ........................................................................ 44
3.6.2.1.2 Agar Mitis Salivarius MSB ................................................. 44
3.6.2.1.3 Infusión cerebro – corazón (BHI) ...................................... 44
3.6.2.2 Recuperación, activación e inoculación del Streptococcus mutans (ATCC 25175) .......................................................................... 45
3.6.2.3 Preparación de las diluciones de los diferentes tratamientos ............................................................................................................... 45
3.6.2.4 Preparación de una suspensión de Streptococcus mutans a una escala de 0.5 Mc. Farland ............................................................. 45
3.6.2.5 Preparación de una macrodilución en caldo ......................... 45
3.6.2.6 Dilución seriada 1:10 ................................................................ 46
3.6.2.7 Siembra de la dilución 10-8 en Agar Mitis Salivarius MSB .... 46
3.6.2.8 Recuento de colonias ............................................................... 47
3.7 Aspectos bioéticos. .............................................................................. 48
CAPÍTULO IV ................................................................................................ 49
4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ...................................................................... 49
4.1 Resultados estadísticos ....................................................................... 49
CAPÍTULO V ................................................................................................. 55
5. RESULTADOS .......................................................................................... 55
5.1. Discusión .............................................................................................. 56
5.2 Conclusiones......................................................................................... 58
5.3 Recomendaciones ................................................................................ 59
6. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................... 60
XI
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Características del grupo Streptococcus mutans .................................... 14
Tabla 2. Composición nutritiva del chocolate ........................................................ 29
Tabla 3. Sustitutos de la sacarosa ........................................................................ 31
Tabla 4. Composición de los ingredientes de los chocolates de cacao nacional ... 42
Tabla 5. Composición de los ingredientes de los chocolates de cacao CCN51 .... 43
Tabla 6. Dosificación empleada en la macrodilución en caldo para chocolates de
cacao nacional ....................................................................................................... 46
Tabla 7. Dosificación empleada en la macrodilución en caldo para chocolates de
cacao CCN-51 ....................................................................................................... 46
Tabla 8. Medianas ± desviación estándar de las unidades formadoras de colonias
por ml de muestra de chocolate de cacao nacional edulcorado con eritritol .......... 49
Tabla 9. Medianas ± desviación estándar de las unidades formadoras de colonias
por ml de muestra de chocolate de cacao CCN-51 edulcorado con eritritol .......... 51
XII
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Diagrama de barras de error del número de Unidades Formadoras de
Colonias por ml (UFC/ml) de los chocolates con cacao nacional. ......................... 50
Gráfico 2. Diagrama de barras de error del número de Unidades Formadoras de
Colonias por ml (UFC/ml) de los chocolates con cacao CCN-51. .......................... 52
Gráfico 3. Diagrama de barras de error con las medianas de Unidades
Formadoras de Colonias por ml (UFC/ml) de cada genotipo de cacao. ................. 53
Gráfico 4. Diagrama de barras de error con las medianas de Unidades
Formadoras de Colonias por ml (UFC/ml) de cada tratamiento por genotipo de
cacao. .................................................................................................................... 54
XIII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Etapas de la formación del biofilm ...................................................... 8
Figura 2. Representación esquemática de la estructura de los estreptococos 11
XIV
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Certificado de viabilidad ética ........................................................... 69
Anexo 2. Reglamento “Manejo de los desechos infecciosos para la red de
servicios de salud en el ECUADOR” ................................................................ 71
Anexo 3. Acuerdo de entendimiento para la dirección de tesis por parte del
INSPI ................................................................................................................ 76
Anexo 4. Ficha metodológica de tesis - INSPI................................................. 83
Anexo 5. Certificado del análisis microbiológico en el Instituto Nacional de
Investigación en Salud Pública Dr. Leopoldo Izquieta Pérez - INSPI LIP. ....... 86
Anexo 6. Certificado de elaboración de chocolates en la Universidad de las
Fuerzas Armadas-ESPE, IASA-I ...................................................................... 87
Anexo 7. Fotografías del procedimiento de la investigación ............................ 88
XV
Título: Evaluación in vitro del efecto inhibitorio del chocolate de dos genotipos
(nacional y CCN-51) edulcorado con eritritol frente a Streptococcus mutans
(ATCC 25175)
Autora: Josselyn Estefanía Velasco Núñez
Tutor: Roberto Xavier Romero Cazares
RESUMEN
La caries dental es una de las enfermedades bucales, con alta prevalencia en el
mundo afectando del 95% al 99% de la población. La colonización del
Streptococcus mutans, una deficiente higiene oral y un alto consumo de
alimentos ricos en sacarosa contribuyen a su desarrollo, por ello es necesario
buscar alternativas que nos permitan disminuir los factores de riesgo asociados
con la caries. El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto inhibitorio in
vitro de chocolates obtenidos de dos genotipos de cacao (nacional y CCN51)
edulcorados con eritritol al 10%, 20%, 30% y 40%, sobre el crecimiento de
Streptococcus mutans. Esta investigación se realizó en dos fases: la primera,
consistió en elaboración de los chocolates con dos genotipos de cacao: nacional
y CCN-51, edulcorados con eritritol al 10%, 20% ,30% y 40%; en la segunda se
realizaron macrodiluciones a partir BHI (Infusión Cerebro - Corazón), las
diluciones al 10% de los diferentes chocolates, más una suspensión 0.5 Mc
Farland de S. mutans; las mismas que fueron incubadas por 24 horas y a partir
de esta se ejecutó un recuento en placa de las Unidades Formadoras de
Colonias (UFC). Se obtuvieron diferencias inhibitorias tanto en los distintos
porcentajes de eritritol, como en los genotipos de cacao; concluyendo que los
componentes del cacao y el eritritol producen un efecto de inhibición en cuanto
al crecimiento bacteriano del S. mutans.
Términos Descriptivos: EFECTO BACTERIOSTÁTICO, CHOCOLATE,
POLIALCOHOLES, BACTERIAS CARIOGÉNICAS.
XVI
Subject: In vitro evaluation of the inhibitory effect of chocolate of two genotypes
(national and CCN-51) sweetened with erythritol against Streptococcus mutans
(ATCC 25175)
Author: Josselyn Estefania Velasco Nuñez
Tutor: Roberto Xavier Romero Cazares
ABSTRACT
Dental caries is one of the oral diseases, with high prevalence in the world
affecting from 95% to 99% of the population. The colonization of Streptococcus
mutans, poor oral hygiene and high consumption of foods rich in sucrose
contribute to its development, therefore it is necessary to look for alternatives that
allow reducing the risk factors associated with caries. The objective of this
research was to evaluate the in vitro inhibitory effect of chocolates obtained from
two cocoa genotypes (national and CCN51) sweetened with 10%, 20%, 30% and
40% erythritol on the growth of Streptococcus mutans. This research was done
in two phases: the first consisted of the elaboration of chocolates with two
genotypes of cocoa: national and CCN-51, sweetened with 10%, 20%, 30% and
40% erythritol; in the second, macrodilutions were performed from BHI (Brain-
Heart Infusion), 10% dilutions of the different chocolates, plus a 0.5 Mc Farland
suspension of S. mutans; the same ones that were incubated for 24 hours and
from that, was perform a counting on plate of the Colony Forming Units (CFU).
Inhibitory differences were obtained both in the different percentages of erythritol
and in the cocoa genotypes; concluding that cocoa components and erythritol
produce an inhibitory effect on bacterial growth of S. mutans.
Descriptive Terms: BACTERIOSTATIC EFFECT, CHOCOLATE,
POLYALCOHOLS, CARIOGENIC BACTERIA.
1
INTRODUCCIÓN
La caries es la enfermedad más común del ser humano, convirtiéndose en un
problema de salud mundial. (1) Es considerada como multifactorial en la cual
existe una interacción entre los microorganismos, la dieta y el huésped, durante
un tiempo determinado, convirtiéndose en una enfermedad infecciosa y
transmisible. (2) (3)
El biofilm comprende la comunidad bacteriana residente en la cavidad bucal,
constituyendo un sistema ecológico complejo, adherido a la superficie dentaria,
donde los microrganismos por mecanismos específicos realizan su actividad
metabólica. (4) La presencia de microorganismos presentes en la cavidad oral
favorecen el desarrollo de caries provocando una desintegración progresiva de
los tejidos calcificados, como resultado de la capacidad de los microorganismos
de producir ácidos a partir de hidratos de carbono, provenientes de la dieta. (5)
En las últimas décadas se ha citado al Streptococcus mutans como el principal
microorganismo productor de caries. (6)
A lo largo de los años se han investigado sustancias de origen natural con
actividad antimicrobiana para la prevención de caries, como es el caso del cacao
que además de ser utilizado como materia prima para la elaboración de
chocolate también se ha demostrado que inhibe el crecimiento y desarrollo de
microrganismos cariogénicos (7). Por otra parte, durante muchos años se ha
investigado a varios sustitutos del azúcar que poseen cualidades
anticariogénicas, entre ellos el eritritol ya que no puede ser metabolizado por las
bacterias orales, por lo tanto, no contribuye al desarrollo de la caries. (8)
En vista de la importancia que juegan los microorganismos en el desarrollo de la
caries, se realizó el presente trabajo investigativo a fin de buscar alternativas
para la disminución del riesgo de caries, mediante la evaluación in vitro del efecto
inhibitorio del chocolate edulcorado con eritritol frente a Streptococcus mutans,
ya que existen diversos estudios que demuestran que tanto el cacao como el
eritritol inhiben al S. mutans. (9) (10)
2
CAPÍTULO I
EL PROBLEMA
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Con el transcurso de los años, han sido estructuradas diversas investigaciones
enfocadas al estudio de la actividad de la esencia de semillas y polvo de cacao
sobre el biofilm dental, concluyendo la actividad inhibitoria de dichos elementos.
El extracto de cáscara de semillas de cacao disminuye la producción de ácidos
y síntesis de glucanos por acción del Streptococcus mutans, por lo tanto se
puede deducir que este producto posee cualidades bacteriostáticas sobre el
crecimiento de bacterias cariogénicas. (7) Gran parte de los profesionales
odontólogos no conocen las propiedades que nos brindan los productos
naturales entre ellas sus características inhibitorias.
Se conoce que la caries es una enfermedad multifactorial, provocada por ácidos
que resultan de la acción de microorganismos sobre los hidratos de carbono,
favoreciendo la adherencia de la película adquirida, el Streptococcus mutans se
relaciona con la biopelícula cariogénica. Por esto es importante buscar
alternativas que disminuyan este factor de riesgo. (3)
Mediante un estudio in vitro se demostró que el eritritol disminuye la adherencia
mediada por polisacáridos que contribuyen a la acumulación de placa, (11) esta
teoría fue apoyada mediante un estudio in vivo que señala una reducción
significativa en la cantidad de placa y una disminución en el número de
Streptococcus mutans presentes en la saliva. (12) Pese a todas las bondades que
este edulcorante nos brinda es poco utilizado.
Por ello se aspira utilizar el rédito del chocolate con el eritritol en bien de la salud
pública, puesto que, en nuestro país existen muchos estudios de productos
inhibitorios de diversos microorganismos productores de alguna afección, pero
el inconveniente es que no existen estudios secuenciales hasta llegar a un
producto, que pueda ser consumible.
3
Nuestro país es productor de los dos genotipos de cacao: Nacional y CCN-51,
que se comercializa como materia prima a otros países, sin embargo, no los
utilizamos en beneficio de la salud.
Ante estas investigaciones surge el cuestionamiento ¿El chocolate obtenido de
las semillas de cacao edulcorado con eritritol tiene efecto inhibidor frente al
Streptococcus mutans?
4
1.2 OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN
1.2.1 OBJETIVO GENERAL
Evaluar el efecto inhibitorio del chocolate obtenido de dos genotipos de
cacao: nacional y CCN-51, edulcorados con eritritol sobre Streptococcus
mutans (ATCC 25175), mediante recuento en placa de las Unidades
Formadoras de Colonias (UFC).
1.2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Elaborar chocolates con dos genotipos de cacao: nacional y CCN-51,
edulcorados con diferentes porcentajes de eritritol (10%, 20%, 30% y
40%).
2. Evaluar el efecto inhibitorio del chocolate de cacao nacional endulzado
con 10%, 20%, 30% y 40% de eritritol, evaluado sobre el crecimiento de
Streptococcus mutans (ATCC 25175).
3. Valorar el efecto inhibitorio del chocolate de cacao CCN-51 endulzado con
10%, 20%, 30% y 40% de eritritol, evaluado sobre el crecimiento de
Streptococcus mutans (ATCC 25175).
4. Comparar diferencias inhibitorias entre los chocolates edulcorados con
eritritol al 10%, 20%, 30% y 40% del cacao nacional y los chocolates del
cacao CCN-51.
5
1.3 JUSTIFICACIÓN
La presente investigación buscaba conocer el efecto antibacteriano del chocolate
obtenido del genotipo de cacao nacional y del genotipo CCN-51 edulcorado con
eritritol frente a Streptococcus mutans (ATCC 25175), mediante un estudio in
vitro. Uno de los retos de la Odontología actual es el descubrimiento o síntesis
de sustancias que contribuyan a la inhibición o disminución de la manifestación,
persistencia y recurrencia de microorganismos patógenos con influencia
negativa en los tejidos de la cavidad bucal. Por ello se busca reemplazar la
sacarosa por otros edulcorantes. (7)
El presente estudio sirvió para observar los efectos inhibitorios del chocolate y el
eritritol sobre el Streptococcus mutans (ATCC 25175), esta investigación es de
gran trascendencia para la sociedad, profesionales odontólogos, ingenieros en
alimentos, entre otros; ya que se encontró una disyuntiva para disminuir los
factores de riesgo asociados con la caries, mediante la elaboración de un
chocolate que ayude a atenuar los microorganismos asociados con caries y tener
una alternativa de los sabores azucarados.
En vista de la necesidad constante de nuevos y efectivos agentes terapéuticos,
los productos de origen natural deberían jugar un rol importante en el futuro de
la higiene oral, así como en la fabricación de enjuagues, pastas dentales o
productos dedicados a la prevención de caries; con el objetivo de mejorar en la
población su calidad de vida. (7)
Los resultados que se encontraron en el presente estudio reafirmaron los
hallazgos de otras investigaciones similares y relacionadas con la determinación
de extractos o compuestos puros antimicrobianos, para la prevención de caries
y disminución de la formación de placa bacteriana. (9)
En concordancia con anteriormente expuesto es pertinente recomendar la
profundización de este tipo de investigaciones en Ecuador, por ser nuestro país
uno de los principales productores de cacao en Latinoamérica, a fin de
6
desarrollar nuevas líneas de investigación, y crear nuevos productos con utilidad
terapéutica que ofrecen beneficios para los pacientes odontológicos.
La importancia de este estudio se basa en la investigación de un tema relevante
en el área odontológica, brindando datos importantes para posteriores
investigaciones en nuestro País, en el cual se han encontrado pocas
investigaciones y publicaciones científicas sobre este tema, por ello este estudio
investigativo nos ofrece una proyección social, educativa y científica de alta
credibilidad.
1.4 HIPÓTESIS DE TRABAJO
HI1: El chocolate obtenido del cacao nacional edulcorado con eritritol al 10%,
20%, 30% y 40% inhibe el crecimiento bacteriano frente a cepas de
Streptococcus mutans (ATCC 25175)
HI2: El chocolate obtenido del cacao CCN-51 edulcorado con eritritol al 10%,
20%, 30% y 40% inhibe el crecimiento bacteriano frente a cepas de
Streptococcus mutans (ATCC 25175)
7
CAPÍTULO II
2. MARCO TEÓRICO
2.1 Biofilm dental
Es la acumulación de microorganismos que se localizan en la superficie de un
diente, embebidos en una matriz de polímeros provenientes del hospedero de
origen salival y de las bacterias. (13) (14) Los microorganismos se encuentran en
interacción, constituyendo un ecosistema cuyo balance puede modificarse por
condiciones ambientales como: la disminución del pH, ingesta de alimentos
azucarados, alteraciones en el flujo salival, entre otros. Esto puede favorecer el
incremento en la proporción de bacterias cariogénicas, por consiguiente, el inicio
de la caries dental. (14)
El biofilm puede clasificarse como:
Biofilm supragingival predominan microorganismos Gram positivos, es
adherente, características de organismos cariogénicos. (13)
Biofilm subgingival compuesta por microorganismos Gram negativos,
es menos adherente y es periodontopatogénica. (13)
2.1.1 Formación del Biofilm
La formación del biofilm se lleva a cabo como resultado de una serie de
complejos procesos que involucran componentes del huésped y de los
microorganismos. Su desarrollo se lleva a cabo de la siguiente manera (Figura1):
1. Formación de la película adquirida. Se origina a partir de la precipitación de
proteínas de origen salival y del fluido crevicular formándose una película
acelular. En el proceso de formación de la película también son incorporadas
enzimas extracelulares de origen bacteriano. (13) (15)
2. Colonización bacteriana, que incluye 2 tipos de interacciones:
8
- Adhesión bacteriana reversible. Involucra interacciones físico-químicas débiles
de largo alcance entre los microorganismos y la superficie de la película
adquirida. (15)
- Adhesión bacteriana irreversible. Implica interacciones fuertes de corto alcance,
mediadas por la unión entre los receptores de la película adquirida y las
adhesinas de la superficie bacteriana. (15)
3. Co-adhesión: unión de colonizadores secundarios a las células bacterianas ya
adheridas. (15)
4. Multiplicación y formación del biofilm. Comprende la síntesis de polisacáridos
extracelulares. (15)
5. Maduración de la placa. Implica la muerte o el desprendimiento de
microorganismos que van a colonizar otros sitios, y la preminencia de
microorganismos anaerobios. (15)
Figura 1. Etapas de la formación del biofilm Fuente: Lindhe, Periodontología clínica e implantología odontológica, 2009
2.1.2 Adherencia
La adherencia es un factor esencial para la colonización; la primera fase de la
adherencia envuelve las interacciones iniciales entre los microorganismos y sus
substratos. Esto comprende las superficies externas de ambos organismos y el
substrato, que puede ser influenciado por el medio en el cual está suspendido.
(13)
9
Se denominan a los componentes bacterianos que intervienen en el proceso de
adherencia como “adhesinas”, y los agentes derivados del huésped “ligandos”,
es decir, las adhesinas del microorganismo se adhieren a los ligandos del
huésped. (16)
2.1.2.1 Ligandos del huésped
Las células del epitelio bucal poseen ácido siálico expuesto en sus
superficies, el cual puede interactuar con receptores a nivel bacteriano. Las
fibras de colágeno que son los componentes estructurales principales del
tejido conjuntivo, pueden actuar como receptores para algunos grupos
bacterianos como los Streptococcus. Sin embargo, el principal grupo de
receptores a nivel del huésped se encuentra la saliva. Estos receptores
cuando son absorbidos a la mucosa bucal o a la superficie del esmalte,
pueden influir sobre la adherencia bacteriana. Dentro de la película, las
proteínas ricas en prolina y la estaterina pueden promover la adherencia de
microorganismos. De igual forma, algunos componentes bacterianos han
sido identificados tales como glucosiltransferasas, glucanos y fructanos.
Muchos de estos componentes pueden actuar como ligandos para las
bacterias. (13) (15)
2.1.2.2 Adhesinas bacterianas
Muchas adhesinas bacterianas son lectinas (proteínas unidas a
carbohidratos), las cuales se unen a carbohidratos que funcionan como
receptores en la superficie dentaria. Dentro de estas adhesinas
describiremos brevemente las del Streptococcus mutans, por ser ésta la
bacteria más estrechamente vinculada con el proceso de la caries dental.
Estas incluyen P1, Glucosiltransferasa y las fimbrias. (13)
La adhesina P1, es una proteína mayor de superficie, que juega un papel
determinante en la adherencia de los Streptococcus a la superficie dentaria.
(13)
La enzima Glucosiltransferasa, puede actuar como una adhesina
bacteriana, interactuando con receptores a nivel de la película. Esta enzima,
10
que permite la síntesis de glucanos extracelulares de la dieta, contribuye a
la virulencia del S. mutans. La adhesión a la superficie del huésped es un
paso indispensable en la patogenicidad de los microorganismos asociados
al desarrollo de muchas enfermedades entre ellas la caries dental. (16) (13)
Los microorganismos bucales, pueden utilizar simultáneamente una
variedad de adhesinas para unirse entre ellos, y a la superficie de la película
salival. (13)
Las fimbrias, apéndices de naturaleza proteica, filamentosas que emanan
de la superficie celular bacteriana. Las interacciones mediadas por fimbrias,
han sido postuladas como el mecanismo inicial de adherencia a la superficie
del huésped. (13)
Es importante destacar que aun cuando existen y han sido realizados
muchos estudios tendientes a obtener una vacuna ideal contra la caries
dental, esto es realmente difícil de lograr si consideramos por una parte la
naturaleza multifactorial de la enfermedad, además el gran número de
microorganismos que participan en su desarrollo y dentro de éstos el gran
número de especies mutantes asociados a la misma. (13)
2.2 Grupo Streptococcus mutans
En 1924, Kilian Clarke aisló ciertos organismos a partir de lesiones cariosas que
él denominó Streptococcus mutans debido a que con la coloración Gram, ellos
se observaban de forma ovalada, no siendo de forma redondeada característico
de los Streptococcus, por lo que él consideró que estos microorganismos eran
mutantes de este género. (17) Esta bacteria es redescubierta en 1960 cuando se
reconoce a este microorganismo como causante de una infección transmisible
en ratones. (18)
2.2.1 Estructura
Las células de los S. mutans se caracterizan por ser cocos Gram positivos,
diámetro de 0,5 a 0,75 µm, por disponerse en forma de cadenas y ser anaerobio
facultativo. (13)
11
Estructuralmente se compone de ADN cromosómico, citoplasma,
peptidoglucano, membrana citoplasmática y otros elementos de gran interés,
descritos a continuación. (Figura 2)
Figura 2. Representación esquemática de la estructura de los estreptococos Fuente: Liébana, Microbiología oral, 2002
1. Ácidos teicoicos y lipoteicoicos. Están ligados al peptidoglucano, tienen
naturaleza antigénica y participan en procesos de adhesión. (19)
2. Polisacáridos de la pared celular. Por su diferente composición permiten
distinguir los serotipos a, b, c, d, e, f, g y h que están presentes de forma variable
en las diversas especies. Es posible que estos polisacáridos igualmente
intervengan en fenómenos de adhesión interbacteriana. (19)
3. Proteínas de la pared celular. Proteínas frecuentemente antigénicas y
también involucradas en diversos fenómenos: fijación de glucanos, adhesión a
la película adquirida y adhesión interbacteriana por interacciones proteína-
proteína o lectina-carbohidratos que a veces se ve favorecida por la saliva
gracias a la mediación conjunta de cationes y glucoproteínas salivales. (19) (20)
4. Fimbrias. Intervienen en procesos de adhesión bacteriana, son poco
prominentes. (19)
12
5. Capa mucosa. Constituido por glucanos, que poseen glucosiltransferasas;
estas enzimas, localizadas primitivamente en la membrana citoplasmática,
emergen sobrepasando la pared celular e incluso se excretan al medio
favoreciendo los fenómenos de agregación por afinidad con los compuestos que
originan. (19) (4)
2.2.2 Clasificación del grupo Streptococcus mutans
De acuerdo a la estructura de los polisacáridos de la pared celular, se pueden
clasificar en los siguientes serotipos:
Streptococcus mutans (serotipos c, e, f y k).
Streptococcus sobrinus (serotipos d y g).
Streptococcus cricetus (serotipo a).
Streptococcus rattus (serotipo b).
Streptococcus ferus (serotipo c).
Streptococcus downei (serotipo h)
Streptococcus macacae (serotipo c). (14)
Los polisacáridos de la pared celular son importantes en la colonización. Las
diferencias en las relaciones de unión de los antígenos de los polisacáridos a los
tejidos, pueden ser la causa de esta distribución tan diversa. (14)
Se conoce que el serotipo c del S. mutans es el serotipo predominante en la
cavidad oral humana más que los serotipos e, d, f y k. (21) Por otra parte, se cree
que el progenitor del S. mutans haya sido el serotipo c y que los serotipos f y e
se hayan originado por mutaciones del serotipo c. (22)
El Streptococcus mutans es conocido como patógeno dental, responsable de
bacteriemia y endocarditis infecciosa. (23) Se había clasificado en tres serotipos
c, e y f por la diferente estructura química de los polisacáridos específicos de
cada serotipo. Actualmente se denominó a una cepa de S. mutans como serotipo
k el cual se caracteriza por su bajo grado de cariogenicidad, debido a las
alteraciones de los antígenos proteicos de superficie, estas cepas por su leve
antigenicidad pueden sobrevivir mayor tiempo en la sangre. Algunos estudios
muestran la intervención de este serotipo en la patogénesis de enfermedades
cardiovasculares, en la cuales se ha descubierto su alta frecuencia. (24)
13
2.2.3 Fisiopatología
Hay que destacar que no todas las especies poseen las mismas características,
unas son más patógenas que otras; su poder cariogénico está ligado a la
sacarosa, dado que tienen la capacidad de metabolizarla más rápido que
cualquier otro microorganismo de la cavidad oral. (19)
2.2.3.1 Metabolismo de la sacarosa
El consumo de alimentos proporciona azúcares a los microorganismos, que
éstos fermentan, generando energía, expulsando desechos metabólicos en
forma de ácidos orgánicos o almacenando productos de reserva como
polisacáridos extra o intracelulares. (13)
2.2.3.1.1 Producción de ácidos
Estos microorganismos a partir del metabolismo de la sacarosa, producen ácido
láctico, que es elemental en el desarrollo de la caries; ya que, aparentemente es
el ácido más potente que contribuye en la desmineralización del diente. (19)
Los estreptococos del grupo mutans son tolerantes al ácido, que es necesario
para sobrevivir y desarrollarse con un pH bajo, y acidúricos o capaces de seguir
elaborando ácido a un pH bajo. Otra característica es su corto efecto post-pH,
es decir, el tiempo necesario para restablecer su crecimiento normal cuando, tras
estar expuesto a un pH bajo, vuelve a su naturalidad. (25) Los estreptococos del
grupo mutans son capaces de conseguir rápidamente el pH 4,0 necesario para
originar el proceso de desmineralización. (26)
2.2.3.1.2 Síntesis de polisacáridos extracelulares
A partir de la sacarosa se sintetizan polisacáridos extracelulares, precisamente
glucanos insolubles, que ejercen un papel elemental en la colonización y
conservación de estreptococos del grupo mutans sobre el diente. Esta gran
afinidad por las superficies dentales se debe a fenómenos de adhesión,
agregación y coagregación. (19)
14
2.2.3.1.3 Síntesis de polisacáridos intracelulares
La producción de polisacáridos intracelulares por S. mutans, su capacidad de
metabolizarlos son factores de virulencia, ya que proveen a la célula un sustrato
de donde obtener la energía y conservar la producción de ácido durante largos
periodos de tiempo, en los que no hay aporte de carbohidratos a la dieta. (19) (27)
2.2.3.2 Factores metabólicos de cariogenicidad
Desde el punto de vista metabólico, se muestran factores relacionados con la
cariogenicidad:
Poder acidógeno. Producen ácidos
Poder acidófilo. Son muy tolerantes a los ácidos
Poder acidúrico. Siguen produciendo ácidos a pH ácido
Rápido metabolismo de los azucares a ácido láctico y otros ácidos
orgánicos.
Pueden conseguir el pH crítico para la desmineralización del esmalte más
rápidamente que cualquier otro microorganismo de la placa.
Efecto post-pH corto.
Producción de polisacáridos extracelulares a partir de la sacarosa.
Producción y metabolización de polisacáridos intracelulares
Producción de dextranasas y fructanasas. (19) (25)
2.2.4 Características
El grupo de los Streptococcus mutans se subdivide basándose en características
biológicas, inmunológicas y genéticas, en las siguientes especies (Tabla 1):
Tabla 1. Características del grupo Streptococcus mutans
2.2.4.1 Streptococcus Mutans
(polisacáridos parietales c, e , f, y k) (21)
Se aísla en el 70-90% de la población no desdentada y sin caries. En
personas con caries activa o predispuestas a ella, su número incrementa
15
relevantemente. Es considerado el microorganismo cariógeno. Además es la
especie más habitual del grupo. (19)
También poseen proteínas asociadas a la mureína conocidas como
antígenos I/II (o también como B,P1 ó Pac).Estas proteínas intervienen en
procesos adhesivos:
a) como adhesinas interactuando con receptores de la película adquirida,
tales como proteínas ricas en prolina
b) como glucosiltransferasas y receptoras de glucanos en fenómenos
agregativos y coagregativos entre bacterias que colonizan los dientes.
Estos antígenos (proteínas, polisacáridos y glucosiltransferasas) se han
utilizado para elaborar vacunas anticaries. (19)
La relación con la caries se basa en las siguientes características:
Aumento cuantitativo en personas predispuestas o con caries activa.
Elementos de cariogenicidad:
a) Síntesis de polisacáridos intracelulares
b) Síntesis de polisacáridos extra-celulares de tipo glucanos insolubles y
solubles y fructanos (posee GTF-I (mutanos), GTF-S (dextranos) y
FTF (fructanos))
c) Movilización de polisacáridos intracelulares y extracelulares solubles
por dextranasas y fructanasas.
d) Poder acidógeno, acidófilo y acidúrico, inicio de crecimiento a pH 4,0 y
corto efecto post-pH (26)
e) Capacidad adhesiva por las proteínas parietales, que posibilitan su
adhesión a superficies duras en ausencia de glucanos, y agregativa y
coagregativa a través de mutanos, glucosiltransferasas y proteínas
receptoras de glucanos (19)
Sus colonias en agar sangre son α y γ-hemolíticas, e inusualmente,
β-hemolíticas. (19)
De igual manera, su labor es significativa en las enfermedades cardíacas,
como en la endocarditis subaguda, representando entre el 7-14% de las
generadas por estreptococos. (19)
2.2.4.2 Streptococcus sobrinus 2.2.4.3 Streptococcus cricetus
2.2.4.4 Streptococcus rattus
2.2.4.5 Streptococcus ferus
2.2.4.6 Streptococcus downei
2.2.4.7 Streptococcus macacae
(polisacáridos parietales d y g o
carece de ellos) (14)
(polisacárido
parietal a) (14)
(polisacárido
parietal b) (14)
(polisacárido
parietal c) (14)
(polisacárido
parietal h) (14)
(polisacárido
parietal c) (14)
Se presenta en el 10-30% de las
personas dentadas y no
vulnerables a la caries.
Es menos habitual que el S.
mutans en la cavidad bucal
humana. (19)
Menos
frecuente que
el S. mutans y
S. sobrinus, en
la cavidad oral
humana; tiene
menor
importancia
patógena. (19)
Es casi
inexistente en
la cavidad oral
humana. (19)
a) Poder acidógeno, acidúrico y acidófilo.
b) Desmineralización del esmalte por los ácidos.
c) Efecto de la sacarosa en la síntesis depolisacáridos
intracelulares.
d) Poder adhesivo de los polisacáridos extracelulares. (19)
También posee ambos tipos de
glucosiltransferasas (GTF-I, GTF-
S) y proteínas parietales
igualmente antigénicas (SpaA y
Pag). Estas proteínas entervienen
en la adhesión a la película
adquirida vinculándose a glucanos
preliminarmente adsorbidos, ya
que no pueden adherirse, como el
S. mutans, en ausencia de dichos
polisacáridos; otra forma de
Sus factores de
virulencia son
similares a los
de
S. mutans (19)
Sus factores de
virulencia son
semejantes a
los de
S. mutans (19)
17
adhesión podría darse través de
glucosiltransferasas adsorbidas a
la película. (19)
De igual manera que el S. mutans,
es de similar importancia en el
desarrollo de la caries, se
diferencian en algunos factores de
cariogenicidad:
a) No sintetiza fructanos, porque
carece de fructosiltransferasa
b) No sintetiza polisacáridos
intracelulares; es principalmente
acidúrico
c) Produce peróxido de hidrógeno
que puede actuar como
componente selectivo de la
microbiota próxima, debido a su
efecto antibacteriano.
Los procesos agregativos y
coagregativos son semejantes a
los del S. mutans. (19)
Sus colonias
son α o γ -
hemolíticas. (19)
Produce α o γ -
hemólisis (19)
Sus colonias en agar sangre son α
o γ-hemolíticas. (19)
Fuente: Liébana, Microbiología oral, 2002
Elaboración: Josselyn Velasco
18
2.3 Cacao (Theobroma cacao L.)
Es un árbol nativo de la cuenca del Amazonas, Theobroma significa en griego
“alimento de los dioses” (28), su nombre cacao proviene de la palabra maya
“Kakaw”. Del género Theobroma existen 22 especies, de las cuales Theobroma
cacao es el de más relevancia económica, debido a que de sus mazorcas se
elaboran productos como: cacao en polvo, manteca de cacao y chocolate. (29) (30)
El cultivo del cacao, es de gran importancia dentro de la economía ecuatoriana,
por tratarse de un producto de exportación y materia prima para industrias de
fabricación de chocolate y sus derivados. (31)
2.3.1 Tipos de cacao
Por su origen y características genéticas, se clasifica en cuatro tipos:
2.3.1.1 Cacao Criollo
Es un cacao de calidad, se distingue por su árbol bajo, de escasa productividad
y por tener mazorcas alargadas, de colores verde y rojizo en estado inmaduro; y
de color rojo o amarillo cuando están maduras, las almendras son de color blanco
marfil. El chocolate obtenido de este cacao es apetecido por el sabor a nuez y
fruta. Comercialmente se encuentra dentro de los cacaos finos. (31) (32)
2.3.1.2 Cacao Forastero Amazónico
Se denomina Amazónico por encontrarse dispuesto en la cuenca del Río
Amazonas y sus afluentes. Las mazorcas son verdes (en estado inmaduro) y
amarillas (cuando están maduras), con una forma de pequeño cuello de botella
en la base. Las almendras son de color morado, cortas y aplanadas. De este
cacao se adquiere un chocolate con sabor básico de cacao. (32)
2.3.1.3 Cacao Trinitario
Este cacao resulta del cruce entre el cacao Criollo de Trinidad y Forastero,
desarrollado en la cuenca del río Orinoco. Sus características morfológicas,
genéticas y de calidad son compartidas entre criollos y forasteros, estableciendo
diversas variedades de cacao. Su calidad es intermedia. Es el cacao que más
19
se siembra en América. Presentan sabor a cacao de medio a alto, usualmente
con sabor a frutas y nueces. (32) (31)
2.3.1.4 Cacao Nacional
También es conocido como Sabor Arriba o Fino de Aroma, es un producto
tradicional y emblemático del Ecuador. Se lo consideraba del grupo forastero,
pero se ha denominado como un grupo aparte, porque sus características de
calidad y aroma se asemejan a los criollos. (31) Este tipo de cacao es utilizado en
todos los chocolates refinados. (32)
Ecuador, posee las condiciones necesarias tanto geográficas, como recursos
biológicos para producirlo; su sabor ha sido reconocido durante siglos en el
mercado internacional. De este tipo de cacao se obtiene uno de los mejores
chocolates del mundo, por su sabor, pureza y fragancia; que tiene el cacao. (33)
2.3.1.4.1 Clones
También se pueden encontrar Clones, es decir, variedades producidas por el
hombre, como es el caso del CCN-51, su nombre significa Colección Castro
Naranjal denominado así, ya que Castro investigó desde 1952 las diversas
variedades del grano y finalmente obtuvo la del tipo 51, que es tolerante a las
enfermedades, de alta productividad y calidad; declarada en el 2005 como un
bien ecuatoriano de alta productividad. Es considerado cacao ordinario, corriente
o común. (32) (33)
Sus mazorcas son rojizas-moradas en estado inmaduro y de color rojizo
anaranjadas cuando están maduras. Presentan sabor a cacao de medio a bajo.
Su potencial se encuentra en la producción de manteca de cacao, que lo hace
cotizado por las industrias. (32) (34) La relación existente en la participación del
Clon y el Cacao Nacional Fino en las exportaciones ecuatorianas hasta al
momento es de: 75 % Cacao Nacional y 25 % CCN-51 (33).
20
2.3.2 Descripción botánica
2.3.2.1 Raíz
Presentan una raíz primaria, en condiciones favorables pueden alcanzar los 3
metros. También posee raíces secundarias que se dividen frecuentemente
según los obstáculos presentes en el suelo, se localizan bajo la unión del tallo
con la raíz, distribuyéndose de manera horizontal. (31)
2.3.2.2 Tallo y ramas
La planta de cacao es procedente de una semilla, el tallo es leñoso, crece
perpendicularmente, de los 12 - 18 meses puede crecer de 1 a 2 m de alto. En
esta etapa se detiene su desarrollo y del tallo germinan de 3 a 5 ramas de
crecimiento horizontal. (31)
2.3.2.3 Hojas
Las hojas son delgadas de color verde oscuro, de forma lanceolada u ovalada,
de tamaño mediano, miden de 10 a 20 cm de largo por 5 a 12 cm de ancho. Las
hojas nuevas son flácidas y blandas de color verde claro también pueden tener
tonalidades rojizas. (31)
2.3.2.4 Flores
Las flores de cacao son hermafroditas, es decir, que tienen los dos sexos al
mismo tiempo. Tienen diez estambres en dos verticilos de los que solo uno es
fértil, posee cinco pétalos y sépalos; únicamente el 10% de las flores polinizadas,
llegan a convertirse en fruto. La planta de cacao es caulífera, es decir, que florece
de los troncos maduros o ramas sin hojas de la planta. (35)
2.3.2.5 Fruto
El fruto es botánicamente conocido como una drupa, generalmente conocido
como mazorca; sus con colores, formas y tamaños difieren dependiendo de la
variedad. Puede medir de 7-10 cm de ancho y de 15-30 cm de largo, sus
extremos son puntiagudos y con grietas longitudinales a lo largo del fruto.
Generalmente cada fruto posee aproximadamente de 30-40 almendras,
envueltas de pulpa. (36)
21
2.3.2.6 Semillas
Las semillas o almendras del cacao están envueltas por una pulpa con sabor
ácido y dulce denominada mucílago, en el Ecuador es conocido como “baba”.
Su forma, color y tamaño, cambia según el genotipo de cacao. La cáscara de las
semillas es gruesa, dentro de ella se encuentran dos cotiledones. Los
cotiledones poseen sustancias minerales y orgánicas de utilidad mercantil de los
cuales proviene el polvo, la manteca y el licor de cacao. (31)
2.3.2.6.1 Composición química del grano de cacao
La composición química varía según el genotipo de cacao, el grado de madurez,
los procedimientos de secado y fermentación a los que han sido expuestos (37).
En general, los granos de cacao poseen componentes químicos como: agua,
grasa, materia nitrogenada, compuestos fenólicos, almidón y otros
carbohidratos. (38) El cacao es rico en elementos minerales, los más destacados
son: magnesio, fósforo, calcio y potasio. El cacao y sus derivados son ricos en
vitaminas B1, B2 y ácido fólico (39)
Los carbohidratos que se encuentran en el cacao, se componen en su mayor
parte de almidón, también se puede encontrar estaquinosa, rafinosa, sacarosa,
glucosa y fructosa (40).
2.3.2.6.1.1 Compuestos grasos
Las semillas de cacao poseen entre 50-55% de elementos grasos, después de
la etapa de tostado y cuando estas se convierten en licor de cacao, su contenido
graso cambia entre 48 y 52%. La materia grasa de las semillas de cacao está
compuesta especialmente por ácidos grasos como: el palmítico, esteárico y
láurico; pequeñas cantidades de linoleico, acético y butírico (41).
2.3.2.6.1.2 Compuestos fenólicos
Estos compuestos forman un conjunto muy amplio de sustancias, son
estructuras moleculares diversas que contienen grupos hidroxilos (OH), los
mismos que ayudan a controlar los microorganismos que pretendan invadirlas.
Las semillas de cacao tienen una gran cantidad de polifenoles,
aproximadamente el 10% del peso de las semillas secas. (40) (41).
22
2.3.2.6.1.2.1 Flavoniodes
Los flavonoides son los polifenoles más importantes y abundantes en el cacao,
los principales compuestos fenólicos de tipo flavonoides son: las catequinas,
epicatequina y procianidinas, entre los más importantes. (42)
Se ha demostrado que los productos del grano del cacao son ricos en
antioxidantes específicos, con la estructura básica de las catequinas y
epicatequinas; polifenoles similares a los encontrados en los vegetales y el té,
que le confieren a la grasa del chocolate una particular resistencia a la
peroxidación. En algunas poblaciones, donde su consumo es alto, el chocolate
provee de una porción considerable de la carga total de antioxidantes. (42) Por
otra parte, al exponer las semillas de cacao a altas temperaturas, se efectúa un
proceso de epimerización, el cual consiste en la conversión de epicatequinas en
catequinas. (43)
Las catequinas y procianidinas separadas de las semillas del cacao poseen
potentes propiedades antioxidantes; como se ha comprobado mediante
valoraciones in vitro al comparar las catequinas del chocolate con respecto a las
catequinas del té, las mismas que muestran un efecto antioxidante 4 veces
mayor respectivamente. (44)
El chocolate y los productos de cacao poseen un contenido variable de
flavonoides, existen varios productos que casi no los contienen (0,09 mg de
procianidinas/g) y otros productos que poseen un alto contenido (4 mg de
procianidinas/g), es por ello que para obtener un rápido efecto antioxidante en
las personas se precisa por lo menos de 38 g de chocolate con alto contenido de
flavonoides, y para un efecto prolongado hasta 125 g. (42)
2.3.2.6.1.3 Alcaloides del cacao
Más del 99% de los alcaloides que contiene el cacao están constituidos por la
cafeína y la teobromina. La cafeína es conocida por poseer efectos estimulantes
en el sistema nervioso neurovegetativo o autónomo, dado que produce oposición
a la fatiga y eliminación de la somnolencia; en el corazón produce dilatación de
los vasos sanguíneos. La teobromina, es el alcaloide más importante del cacao,
posee un efecto vasodilatador sobre el corazón; similar al de la cafeína pero en
23
menor proporción, además incrementa el volumen de orina, es decir, que actúa
como diurético. (45)
2.3.2.6.2 Mecanismo de acción de los polifenoles sobre el Streptococcus
mutans.
En la corteza del cacao se han encontrado componentes con propiedades
cariostáticas como la epicatequina polimérica, que inhibe el desarrollo de la
caries en ratas, ya que posee actividad antiglucosiltransferasa, provocando una
acción cariostática y antibacteriana. (46)
Diversas investigaciones han comprobado que los polifenoles como las
epicatequinas del cacao poseen la acción “anti-glucosiltransferasa”, es decir que
inhiben la producción de GTF, por parte de los estreptococos. (47)
La propiedad bacteriostática del cacao obtenida por la presencia de dos
sustancias cariostáticas, una con actividad anti-glucosiltransferasa y otra con
actividad antibacterial ha revelado la existencia de ácidos grasos insaturados y
compuestos polifenólicos de alto peso molecular químicamente, activos y a
través de los cuales se evidencia, que los polímeros de tipo epicatequinas son
los responsables de la actividad anti-glucosiltransferasa. (47) Porcentualmente,
las epicatequinas son el principal componente fenólico de las semillas de cacao,
con el 35% (48)
Se estudia la inhibición de glucosiltransferasa, adhesión microbiana y la
proliferación de microorganismos patógenos usando extractos de Theobroma
cacao, estas propiedades benéficas se atribuyen a los polifenoles contenidos en
la cáscara de dicha semilla, que también, se encuentran en las uvas, un té verde
y los granos del café. Además, disminuye la producción de ácidos y síntesis de
glucanos por parte del Streptococcus mutans principal agente causal de la
caries. (49)
24
2.3.3 Beneficiado del cacao
El beneficiado o pre-procesamiento del cacao hace referencia a los procesos
que son sometidas las semillas del cacao; los cuales comprenden una serie de
etapas anteriores a su comercialización o industrialización. Básicamente dentro
de los procesos mencionados se encuentra: la recolección, extracción,
fermentación y secado de las semillas; la calidad de los productos depende
especialmente de cada uno de estos procesos (50).
2.3.3.1 Cosecha
En esta etapa se realiza la recolección de los frutos maduros y sanos. Para
verificar el estado de las mazorcas aptas para la cosecha existen diversas
maneras para su selección como el color amarillento de las mazorcas
dependiendo de la variedad de cacao o el ruido al golpearla levemente, indicando
algo suelto en el interior (50).
2.3.3.2 Extracción de Almendras
La extracción de las semillas puede efectuarse de forma manual dividiendo la
mazorca con un machete o un mazo de madera. Los granos se extraen con
ayuda de los dedos, evitando en lo posible su contacto con superficies metálicas
(50).
2.3.3.3 Fermentación
El proceso de fermentación del cacao se basa en una serie de cambios físicos y
bioquímicos como la conversión de los azúcares presentes en el mucílago en
alcohol etílico gracias a la actividad de las levaduras y factores como la
humedad, acidez y temperatura. Mediante la participación de bacterias lácticas
y acéticas, el alcohol se transforma en ácido acético, el cual penetra el interior
de los cotiledones ocasionando su muerte, mediante este proceso se produce la
liberación de los polifenoles. Esta etapa es responsable de desarrollar el sabor y
aroma característico de un cacao de buena calidad. (50).
Existen diferentes sistemas de fermentación, generalmente se lleva a cabo
mediante sacos o cajas, recubriendo con hojas de plátano a las almendras. En
los primeros días la masa de cacao adquiere temperaturas superiores a los 30°C,
25
ascendiendo progresivamente a 45°C hasta alcanzar los 50°C (35). El proceso de
fermentación dura dependiendo de la proporción de pulpa y el genotipo de cacao
(50).
2.3.3.4 Secado
El objetivo del secado es eliminar la humedad intrínseca, ya que después de la
fermentación la humedad de los granos va desde el 40-50%, la cual debe
disminuir a un 7% de humedad; evitando de esta manera la acción de elementos
patógenos, como el moho; que pueden dañar la calidad de los granos. El método
más adecuado para este proceso es de manera natural aprovechando los rayos
y el calor del sol, también se puede realizar de forma artificial mediante una
secadora mecanizada. El secado puede durar de 2 a 3 días, de acuerdo a
condiciones climáticas del lugar de secado. (51)
2.3.4 Subproductos del cacao
2.3.4.1 Licor o pasta de Cacao
Esta pasta se consigue moliendo los cotiledones del cacao, es de color marrón
oscuro y de consistencia pastosa, posee un sabor y olor y característico.
Dependiendo del propósito existen dos tipos de licor: licor para chocolate y licor
para prensado. El licor para prensado, es utilizado para lograr la separación de
la manteca y la torta de cacao, mediante la ayuda de una prensa hidráulica; de
la torta se deriva el polvo de cacao, el cual es empaquetado y almacenado de la
misma manera que la manteca. (52)
2.3.4.2 Manteca de Cacao
Este subproducto es considerado como el componente más preciado del
chocolate y se encuentra presente en las semillas de cacao en un 50%
aproximadamente (52).
El licor de cacao está compuesto por materia grasa conocida como manteca de
cacao y otras partículas sólidas que constituyen la torta de cacao, las mismas
que se encuentran en forma de suspensión en el licor de cacao; con el fin de
separar la grasa de los sólidos, mediante el proceso de prensado se separa la
manteca del licor de cacao. (53)
26
2.3.4.3 Polvo de Cacao
El polvo de cacao es el resultado obtenido de la pulverización de la torta de cacao
obtenida en el prensado; se obtiene mediante el uso de diferentes técnicas en la
molienda de la torta de cacao. El polvo de cacao se usa en repostería y en la
elaboración de bebidas chocolatadas. (53)
2.3.5 Chocolate
El chocolate es un alimento preparado a partir del cacao en grano; es de
consistencia semisólida constituido por partículas finas de azúcar y licor de
cacao; sus componentes principales y secundarios dependen del tipo de
chocolate que se pretende fabricar. Se puede encontrar principalmente tres tipos
de chocolate: blanco, leche y dark; los cuales se diferencian por su composición
de leche, licor y manteca de cacao (34).
El chocolate es considerado nutricionalmente completo, ya que contiene 6% de
proteínas, 61% de carbohidratos, aproximadamente un 30% de grasa, 3% de
humedad y minerales como el calcio, fósforo y hierro, además destaca la
presencia de ácido fólico, vitamina A y complejo B. La porción grasa del
chocolate contiene ácido esteárico, ácido palmítico y ácido oleico, que benefician
a la salud cardiovascular. (54)
2.3.5.1 Elaboración de chocolate
2.3.5.1.1 Tostado
El tostado tiene la finalidad de desarrollar el sabor y el aroma de las semillas de
cacao. El tostado tiene una duración de 20-40 minutos, se lleva a cabo a una
temperatura entre 100 y 150°C. En esta etapa se efectúa una reducción del
grado de humedad de las semillas, así como, la evaporación de los ácidos
volátiles, y la desinfección microbiana de las semillas; simplificando el
descascarillado de los granos. (55)
2.3.5.1.2 Molienda
Los granos de cacao son introducidos en molinos de alta velocidad que
disminuyen el volumen de las partículas, cambiando su estructura. En este
27
proceso se origina calor por la fricción aproximadamente 32°C, que permite que
la manteca de cacao se derrita, dando origen al licor o pasta de cacao. La pasta
o licor de cacao es una masa líquida, espesa de textura suave, color café oscuro,
de sabor y aroma potente; la cual sirve para fabricar chocolate o para hacer
cacao en polvo. (55) (56)
2.3.5.1.3 Prensado
En esta etapa el licor de cacao atraviesa un proceso para separar la manteca de
la torta de cacao, para llevar a cabo dicho proceso se emplean prensas
hidráulicas. El prensado se basa en aplastar el licor de cacao poco a poco hasta
que se separe la manteca de cacao, posteriormente se extrae la torta de cacao
a manera de pastilla, la misma que podrá ser empleada para la elaboración de
subproductos de cacao. (52)
2.3.5.1.4 Mezclado
Es un proceso fundamental que consiste en homogenizar los ingredientes:
azúcar, pasta y manteca de cacao; también se puede adicionar leche si se desea
elaborar chocolate con leche; bajo condiciones apropiadas de temperatura y
tiempo con movimientos continuos; durante 12 -15 min a 40–50°C.
Posteriormente se consigue una pasta homogénea, dispuesta a pasar
nuevamente por el molino. (56) (57)
2.3.5.1.5 Refinado
El refinado se lleva a cabo en la refinadora, en la cual, empleando elevadas
presiones provocadas por refinadores de dos a cincos rodillos de acero,
disminuyen el volumen de las partículas sólidas, especialmente del cacao y el
azúcar; hasta alcanzar un tamaño de partículas inferior a 30 ɥm. El refinado
permite obtener una textura suave en el chocolate. (34) (56)
2.3.5.1.6 Conchado
En las máquinas denominadas conchas a una temperatura de 80ºC se calienta
la pasta de chocolate. En este proceso se mezcla y remueve la pasta de
chocolate con potentes agitadores mecánicos, a fin de conseguir una
consistencia fluida. En esta fase se origina una ventilación de la pasta con el
objetivo de evaporar la humedad y los ácidos volátiles, también se mejora su
28
aroma, se va eliminando el sabor amargo, también ayuda a homogeneizar su
textura. Este proceso tiene una duración de 1-3 días, la pasta de chocolate es
refinada en las conchas, a una temperatura entre 50-60ºC. (34) (55) (56)
2.3.5.1.7 Templado
En este proceso se consigue la cristalización de la manteca de cacao; se basa
en la disminución de la temperatura que alcanzó el chocolate en el proceso de
conchado. El templado consiste en fundir el chocolate a 50 °C para que se
rompan las estructuras cristalinas de la manteca de cacao, enfriarlo para
devolverle la estructura, y, finalmente, aumentar ligeramente la temperatura para
que los cristales se agrupen de nuevo en pequeñas cadenas. Este proceso
consiste en 4 etapas que son: derretimiento de la pasta a 50°C, descenso de la
temperatura a 32°C, cristalización a 27°C y transformación de algún cristal
inestable a 29-32°C. En esta etapa el chocolate adquiere untuosidad y brillo,
además de permitir una adecuada preservación del mismo. (34) (56)
2.3.5.1.8 Moldeado
En esta etapa la masa líquida de cacao se vierte en moldes, los mismos que son
incorporados en un túnel a una temperatura baja, para lograr el endurecimiento
del chocolate, el cual se solidifica adoptando la forma del molde con la cual será
distribuido una vez envasado. Cuando la masa de chocolate es refrigerada, los
cristales del tipo grasa son cristalizados; de esta manera se obtiene las tabletas
de chocolate en una consistencia sólida. Por último se gira los moldes y para que
las tabletas caigan en el transportador. (56)
2.3.5.1.9 Envasado
En el envasado los chocolates son cubiertos con papel aluminio y transportados
a las máquinas de embalaje o también llamadas empaquetadoras. Por último, se
realiza el envasado individual y se introducen los productos en cajas. (56)
29
2.3.5.2 Beneficios del chocolate
El chocolate es un producto que ofrece beneficios para la salud, los cuales a
continuación se detallan (Tabla 2): (57) (39)
Tabla 2. Composición nutritiva del chocolate
Triptófano
Este aminoácido favorece la producción
de serotonina, un neurotransmisor que
lleva a una señal nerviosa que produce
felicidad.
Fenilalanina
Este aminoácido ayuda a mejorar el estado
de ánimo y a controlar los cambios de humor
Anandamida
Es un compuesto que activa receptores
cerebrales que producen placer, bienestar y
lucidez mental.
Fibra dietética
El chocolate negro contiene un 6%; es
beneficiosa para favorecer el movimiento
intestinal.
Polifenoles
Sustancias antioxidantes relacionadas con la
prevención de enfermedades
cardiovasculares y cáncer.
Minerales
Son muy valiosos para nuestra salud. Aporte
de potasio, fósforo y magnesio. A este último
se atribuye la facultad de ayuda a combatir
las contracciones musculares y dolores
premenstruales
Fuente: Gil, Tratado de nutrición, 2010
Elaboración: Josselyn Velasco
2.4 Sustitutos del azúcar
El uso de endulzantes no cariogénicos ha sido investigado e implementado en
diversos países como una alternativa para la prevención de la caries dental, el
uso se justifica en la medida en que las investigaciones adquieran más validez
mediante su investigación a través de los años y se confirmen efectos
terapéuticos activos sobre la estructura dental. (58)
30
Los sustitutos del azúcar han sido introducidos y ampliamente investigados en la
limitación de la fuente dietética para el riesgo de caries. De éstos, los
polialcoholes son los más populares hoy en día son agregados en muchos
alimentos y bebidas. Se han utilizado notablemente en las gomas de mascar y
caramelos, así como en los refrescos y bebidas deportivas.
Para ser aceptados como sustitutos del azúcar deben tener poder endulzante,
no ser tóxicos, termoestables y no ser costosos; deben superar rigurosos
experimentos microbiológicos in vitro, investigaciones en animales de laboratorio
antes de ser probados en el hombre. El éxito de un producto depende de sus
propiedades físicas y químicas. (58)
2.4.1 Aplicaciones clínicas
Los sustitutos del azúcar son una alternativa que se impone en la actualidad en
individuos con diabetes, obesidad, caries dental, entre otras enfermedades; la
recomendación de los sustitutos del azúcar como agentes terapéuticos activos
para el control y la prevención de la caries dental no debe hacerse con ligereza,
ya que la población infantil sería la primera en recibir estas medidas preventivas.
Se requiere mayor investigación y validación en estudios clínicos controlados
antes de ser recomendado a la comunidad. Sin embargo no está muy claro que
cada comunidad reciba educación e información acerca de la oferta de sustitutos
de azúcar, basados en la evidencia actual. (58) (59)
La elección de sustitutos de sacarosa en endulzantes de las gomas de mascar
es una alternativa preventiva útil; el desarrollo de sustitutos del azúcar podría ser
utilizado en el manejo de la salud bucal de los pacientes con discapacidades,
pacientes hospitalizados y otros grupos de alto riesgo de desarrollar la
enfermedad. (60)
Sin embargo, la salud bucal no sólo concierne al control de la caries dental;
problemas como: xerostomía, manejo de lesiones en las mucosas, control de
inflamación gingival, erosión dental, entre otros podrán ser beneficiados debido
a las características antibacterianas que se están investigando en algunos de los
sustitutos del azúcar. (58)
31
2.4.2 Endulzantes utilizados como sustitutos de la sacarosa
Los sustitutos del azúcar pueden dividirse en dos grandes grupos: endulzantes
intensos (no calóricos) y endulzantes de grano (calóricos) (Tabla 3). (58)
Tabla 3. Sustitutos de la sacarosa
Endulzantes intensos Endulzantes nutritivos de grano o
miel
Sacarina
No
nu
tritivo
s
Azúcar Dex
trina
s
Aspartame Miel
Ciclamato Molasas
Suclosa (HFCS) Miel de maíz alta en fructosa
Acesulfame-K Levulosa
Alitame Miel de agave
Neotame
Taumatina
Nu
tritivo
s
Sorbitol Azú
ca
res a
lco
ho
les
Monelina Xilitol
Mabinlina Manitol
Pentadina Maltitol
Brazeína Lycasin
Curculina Palatinit
Glicirricina Isomalt
Stevioside Eritritol
Lo Han
Miraculina
Fuente: Bordoni, Odontología Pediátrica, 2010
Elaboración: Josselyn Velasco
2.4.2.1 Polialcoholes
Los polialcoholes representan el grupo más importante de sustitutos del azúcar.
Los más utilizados en productos para la salud dental son (58):
• Polioles tipo monosacarido: sorbitol, manitol (hexosas), xilitol
(pentosa), eritritol.
• Polioles tipo disacarido: maltitol, lactitol (alcoholes de 12 carbonos)
e (Isomalt® (mezcla de 12 carbonos pololes).
• Polioles tipo oligosacárido: jarabes de maltitol, Lycasin®
(hidrolizados de almidón hidrogenado).
• Polioles tipo polisacárido: polidextrosa (58).
32
2.4.2.1.1 Eritritol
El eritritol es un azúcar alcohol (poliol) natural; se encuentra naturalmente en
frutas, champiñones y productos derivados del proceso de fermentación como el
queso, el vino y la salsa de soja. Su poder endulzante es el 70% al 80% del poder
endulzante del azúcar. (61) Se considera no calórico debido a su escaso valor
energético (0.2 kcal/g); es asimilado rápidamente en el intestino delgado, no es
metabolizado en el ser humano, por esta razón, se elimina a través de la orina.
(58)
Su consumo ha sido aprobado en varios países, en los Estados Unidos se
reconoció como GRAS (generalmente reconocido como seguro); la OMS ha
otorgado un consumo cotidiano “no especificado”, mediante el comité de
expertos en aditivos alimenticios de la organización de alimentos y agricultura.
(58)
2.4.2.1.1.1 Propiedades
Es el primer poliol manufacturado industrialmente por proceso de fermentación;
así, la glucosa, obtenida de la hidrólisis del almidón, es fermentada por el
Aureobasidium sp, hasta producir eritritol, el cual es cristalizado. Resulta muy
estable porque no reacciona con la mayoría de los ingredientes activos, tolera el
almacenamiento y se mantiene integro a cambios intensos de temperatura
(160°C), estable en pH de 2-10,2; manifiesta sinergismo con edulcorantes de
elevada potencia. (58)
2.4.2.1.1.2 Aplicaciones clínicas
Se usan en farmacología, confitería, productos de higiene oral (enjuagues
bucales, pastas dentales, entre otros). No cambia los niveles de insulina o
glucosa en la sangre, por lo que se considera apto para diabéticos como sustituto
del azúcar. No es higroscópico. Parece tener propiedades similares a las
atribuidas al xilitol; sin embargo, sus efectos sobre el metabolismo bacteriano
aún permanecen sin investigar. (58)
33
También se ha comprobado que el eritritol es un poliol que tiene la capacidad de
eliminar radicales libres, porque puede actuar como captador de radicales en
sistemas biológicos y experimentales. (62) (63)
2.4.2.1.1.3 Efectos adversos
No se ha encontrado ningún efecto fetotóxico, embriotóxico o teratógeno al
alimentar ratas de laboratorio (9). La tolerancia del eritritol en seres humanos a
repetidas y diferentes dosis desde 0,3 g/kg hasta 1 g/kg fue analizada en 12
hombres adultos, sin obtener indicios de intolerancia gastrointestinal, y mostró
alta tolerancia digestiva. (64)
2.4.2.1.1.4 Mecanismo de acción
La incubación de S. mutans (serotipos a-h) y otros microorganismos bucales en
ratones de laboratorio han mostrado que el eritritol no es metabolizado por las
bacterias bucales para la producción de ácidos o síntesis de glucanos
extracelulares. A su vez, los índices de caries dental fueron estadísticamente
menores en el grupo alimentado con 26% de eritritol; comparado con el grupo
alimentado con 26% de sacarosa; mientras que una dieta que contenía 56% de
chocolate con sacarosa y 56% de chocolate con eritritol fueron (82,8 ± 2,8) y
(6,7±0,8) respectivamente (9).
El consumo durante tres años de caramelos que contenían eritritol en los niños
de 7 a 8 años está asociado con un menor crecimiento de la placa, niveles más
bajos de ácido acético y ácido propiónico y una reducción del recuento oral de
Streptococcus mutans en comparación con el consumo de caramelos con xilitol
o de sorbitol. (65)
Un estudio muestra que en presencia del eritritol, existe una disminución en la
expresión de los genes de glucosiltransferasa (GTF) y fructosiltransferasa (FTF)
en S. mutans; sus efectos anti cariogénicos se categorizan en: reducción
numérica de bacterias cariogénicas, disminución en la producción de ácido, e
inhibición de polisacáridos extracelulares; con esto se ha demostrado una amplia
gama de mecanismos anti cariogénicos del eritritol. (66)
34
En un estudio sobre el mecanismo del eritritol sobre el Streptococcus mutans se
utilizó un microscopio electrónico de barrido (SEM) para investigar el cambio de
la pared celular del S. mutans; se concluyó que el eritritol tiene un efecto
antibacteriano sobre S. mutans, pero ningún efecto sobre la estructura normal
de la pared celular de S. mutans. (67)
En un estudio en 136 adolescentes se investigaron los efectos de consumo de
eritritol, xilitol y sorbitol; durante 6 meses, en el que se determinó que el eritritol
y el xilitol pueden ejercer efectos similares en algunos factores de riesgo de la
caries dental; el xilitol, y especialmente el eritritol, inhibieron el crecimiento de
varias cepas de Streptococcus mutans. (12)
Varios estudios demuestran que el eritritol inhibe el crecimiento y la adherencia
de S. mutans a las superficies dentales, en comparación con la sacarosa y otros
edulcorantes. (68) (66) (69)
35
CAPÍTULO III
3. METODOLOGÍA
3.1 Tipo y diseño de la investigación
Estudio experimental – in vitro de tipo microbiológico desarrollado en dos etapas:
la primera se desarrolló en la Universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE, la
misma que consistió en la elaboración de los chocolates obtenidos mediante
procesos de recolección, fermentación, secado, tostado, molienda, mezcla y
enfriamiento de dos genotipos de cacao (nacional y CCN-51) con diferentes
porcentajes de eritritol (10%, 20%, 30%, 40%) y la segunda etapa en el Instituto
Nacional de Investigación en Salud Pública (INSPI), la cual se basó en una
técnica de macrodilución en caldo descrita posteriormente a fin de realizar un
recuento final de las colonias para determinar la inhibición.
3.2 Universo de estudio
Universo: Infinito
Tipo de muestra: Se aplicó selección aleatoria no probabilística por
conveniencia.
Muestra: 100 cajas Petri Agar Mitis Salivarius MSB
3.2.1 Criterios de inclusión
Primera etapa: elaboración de los chocolates
• Mazorcas de cacao nacional y CCN-51 maduras aptas para la
fermentación.
Segunda etapa: análisis microbiológico
• Cepas purificadas de Streptococcus mutans (ATCC 25175).
3.2.2 Criterios de exclusión:
Primera etapa: elaboración de los chocolates
• Mazorcas de cacao de genotipos distintos al nacional y CCN-51.
• No se tomaron en cuenta los granos de cacao en mal estado, para
los procesos de fermentación y tostado
36
Segunda etapa: análisis microbiológico
• Cepas de Streptococcus mutans que presenten algún tipo
contaminación
37
3.3 Operacionalización de variables
VARIABLE DEFINICIÓN OPERACIONAL TIPO CLASIFICACIÓN INDICADOR
CATEGORICO
ESCALAS
DE
MEDICIÓN
Chocolate con cacao
nacional amargo
Es el producto obtenido mediante procesos de recolección,
fermentación, secado, tostado, molienda, mezcla y templado
del cacao.
INDEPENDIENTE Cualitativa
El licor de cacao en un
96% y 4% de manteca
de cacao. Obtenidos
del genotipo nacional
Nominal
Chocolate con cacao
nacional + eritritol 10%
Es el producto obtenido mediante procesos de recolección,
fermentación, secado, tostado, molienda, mezcla y templado
del cacao.
INDEPENDIENTE Cualitativa
El licor de cacao en un
86% + 4% de manteca
de cacao + 10% de
eritritol. Obtenidos del
genotipo nacional
Nominal
Chocolate con cacao
nacional + eritritol 20%
Es el producto obtenido mediante procesos de recolección,
fermentación, secado, tostado, molienda, mezcla y templado
del cacao. INDEPENDIENTE Cualitativa
El licor de cacao en un
76% + 4% de manteca
de cacao + 20% de
eritritol. Obtenidos del
genotipo nacional
Nominal
Chocolate con cacao
nacional + eritritol 30%
Es el producto obtenido mediante procesos de recolección,
fermentación, secado, tostado, molienda, mezcla y templado
del cacao. INDEPENDIENTE Cualitativa
El licor de cacao en un
66% + 4% de manteca
de cacao + 30% de
eritritol. Obtenidos del
genotipo nacional
Nominal
Chocolate con cacao
nacional + eritritol 40%
Es el producto obtenido mediante procesos de recolección,
fermentación, secado, tostado, molienda, mezcla y templado
del cacao.
INDEPENDIENTE Cualitativa
El licor de cacao en un
56% + 4% de manteca
de cacao + 40% de
eritritol. Obtenidos del
genotipo nacional
Nominal
38
Chocolate con cacao
CCN51 amargo
Es el producto obtenido mediante procesos de recolección,
fermentación, secado, tostado, molienda, mezcla y templado
del cacao.
INDEPENDIENTE Cualitativa
El licor de cacao en un
96% y 4% de manteca
de cacao. Obtenidos
del genotipo CCN51
Nominal
Chocolate con cacao
CCN51 + eritritol 10%
Es el producto obtenido mediante procesos de recolección,
fermentación, secado, tostado, molienda, mezcla y templado
del cacao.
INDEPENDIENTE Cualitativa
El licor de cacao en un
86% + 4% de manteca
de cacao + 10% de
eritritol. Obtenidos del
genotipo CCN51
Nominal
Chocolate con cacao
CCN51 + eritritol 20%
Es el producto obtenido mediante procesos de recolección,
fermentación, secado, tostado, molienda, mezcla y templado
del cacao.
INDEPENDIENTE Cualitativa
El licor de cacao en un
76% + 4% de manteca
de cacao + 20% de
eritritol. Obtenidos del
genotipo CCN51
Nominal
Chocolate con cacao
CCN51 + eritritol 30%
Es el producto obtenido mediante procesos de recolección,
fermentación, secado, tostado, molienda, mezcla y templado
del cacao.
INDEPENDIENTE Cualitativa
El licor de cacao en un
66% + 4% de manteca
de cacao + 30% de
eritritol. Obtenidos del
genotipo CCN51
Nominal
Chocolate con cacao
CCN51 + eritritol 40%
Es el producto obtenido mediante procesos de recolección,
fermentación, secado, tostado, molienda, mezcla y templado
del cacao.
INDEPENDIENTE Cualitativa
El licor de cacao en un
56% + 4% de manteca
de cacao + 40% de
eritritol. Obtenidos del
genotipo CCN51
Nominal
Efecto inhibitorio del
chocolate sobre
Streptococcus mutans
(ATCC 25175)
Capacidad de una sustancia de inhibir el desarrollo y
crecimiento de determinada bacteria DEPENDIENTE Cuantitativa
Método de
macrodilución en caldo,
recuento en placa para
medir la inhibición del
crecimiento bacteriano
Discreta
Streptococcus mutans
(ATCC 25175)
Es el principal microorganismo cariogénico, se caracteriza por
ser coco, Gram positivo, por disponerse en forma de cadenas
diámetro de 0,5 a 0,75 µm, y ser anaerobio facultativo.
INTERVINIENTE Cualitativa
Cepas puras de
Streptococcus mutans
(ATCC 25175)
Nominal
39
3.4 Materiales y equipos
Para llevar a cabo esta investigación fue necesario adquirir materiales
importados debido a que en el país no disponen de los mismos; en cuanto a los
equipos de laboratorio para el análisis microbiológico el Instituto Nacional de
Investigación en Salud Pública (INSPI) contaba con todo el equipamiento
necesario para el desarrollo del proyecto.
Utensilios para la preparación de chocolate
1) Termómetro digital para alimentos
2) Espátulas de acero inoxidable
3) Tazones de vidrio
4) Tabla de mármol
5) Moldes plásticos
6) Espátulas de silicona
7) Tazones metálicos
Equipos:
a. Molino eléctrico de disco
b. Balanza digital
c. Cocina
Materiales de Laboratorio
1) Guantes
2) Mascarilla tipo N95
3) Tijeras
4) Alcohol
5) Asas microbiológicas
6) Solución salina
7) Hisopos
8) Botellas pyrex de 100ml
9) Pipetas
10) Cajas Petri 60x15mm
11) Agua destilada
40
12) Puntas descartables (100)
13) Gradillas
14) Tubos de ensayo 10ml
15) Matraz 500ml
16) Agua destilada estéril
17) Cubetas
18) Frascos plásticos estériles
Equipos
1) Micropipetas automáticas (10-100 µL)
2) Autoclave Ttutnauer 3870
3) Jarra de Anaerobiosis de 2.5L
4) Incubadora microbiológica BINDER
5) Mechero de Bunsen
6) Balanza de precisión analítica Mettler PJ 400-F
7) Agitador Vórtex Mixer
8) Estereomicroscopio OLYMPUS SZ61
9) Turbidimetro
10) Cámara de flujo LABCONCO Purifier
11) Lupa para contaje PROCED
12) Calefactor con agitador magnético
Reactivos
1) Eritritol
2) Bacitracina
3) Glicerol
4) Telurito de potasio
5) Agar Sangre
6) Agar Mitis Salivarius
7) Cepa de Streptococcus mutans (ATCC 25175)
8) Sacarosa (azúcar)
9) Caldo BHI (Infusión Cerebro - Corazón)
41
3.5 Lugar de la investigación
En el presente estudio la etapa de elaboración del chocolate se llevó a cabo en
los laboratorios de Agroindustrias de la Carrera de Ingeniería Agropecuaria-IASA
I, ubicado en la Hacienda El Prado, Sangolquí - Ecuador; y la fase microbiológica
del proyecto se ejecutó en el Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública
(INSPI), en la ciudad de Quito.
3.6 Procedimiento
3.6.1 Elaboración del chocolate
3.6.1.1 Selección de la materia prima
Para este estudio se adquirió alrededor 3 kg de semillas frescas de cacao
nacional y 3 kg de cacao CCN-5 provenientes de la parroquia Unión Milagreña
del cantón La Joya de Los Sachas, correspondiente a la provincia de Orellana,
Ecuador.
3.6.1.2 Fermentación
En esta etapa se desarrolla el sabor y el aroma de los granos de cacao, por ello
es muy importante realizarlo de manera óptima, existen diferentes sistemas de
fermentación de cacao sin embargo, en este caso se realizó la fermentación en
2 cajas de madera en donde se colocaron los granos de cacao seleccionados,
posteriormente se cubrió con hojas de banano, después de 48 horas de reposo,
con el fin de lograr una fermentación uniforme los granos de cacao fueron
revueltos, finalmente se dejó reposar por 48 horas más hasta completar el
proceso. Este proceso se realizó con cada tipo de cacao por separado.
3.6.1.3 Secado
El método que se utilizó fue el secado natural, mediante la disposición de las
semillas de cacao sobre una superficie plana en un tendal de plástico, en el cual
recibieron calor directo del sol por 3 días, el objetivo del secado fue eliminar el
exceso de humedad. Este proceso se realizó con cada tipo de cacao por
separado.
42
3.6.1.4 Tostado
El objetivo de este proceso fue desarrollar todas sus cualidades aromáticas y de
sabor del cacao, además de realizar la descontaminación microbiana de los
granos. El proceso se llevó a cabo colocando las almendras a fuego lento, a una
temperatura de 100 a 150° C, durante 20 minutos. Las cáscaras de las semillas
fueron retiradas a fin de obtener los granos desnudos. Este proceso se realizó
con cada tipo de cacao por separado.
3.6.1.5 Molienda
Las semillas de cacao fueron trituradas en un molino eléctrico de disco para
reducir su tamaño, este proceso se repitió 3 veces a fin de lograr una mezcla
líquida espesa conocida como licor de cacao; durante la molienda gracias a la
presión y la fricción que se produce se genera calor, fundiendo la manteca del
cacao (a los 32° C). Este proceso se realizó con cada tipo de cacao por
separado.
3.6.1.6 Mezcla
Durante esta etapa se realiza la mezcla de los ingredientes con una espátula de
silicona conocida como lengua de gato, a una temperatura de 45-55°C, hasta
conformar una masa viscosa, la temperatura se controló con un termómetro para
alimentos. Con base a porcentajes en peso más usados, las formulaciones a
utilizar serán las siguientes (Tabla 4 y 5):
Tabla 4. Composición de los ingredientes de los chocolates de cacao nacional
CACAO NACIONAL
Fórmula Nº
Pasta de cacao Manteca de cacao Eritritol
% g % g % g
0 96 19.2 4 0.8 - -
1 86 17.2 4 0.8 10 2
2 76 15.2 4 0.8 20 4
3 66 13.2 4 0.8 30 6
4 56 11.2 4 0.8 40 8
Fuente: Investigación
Elaboración: Josselyn Velasco
43
Tabla 5. Composición de los ingredientes de los chocolates de cacao CCN51
CACAO CCN-51
Fórmula Nº
Pasta de cacao Manteca de cacao Eritritol
% g % g % g
0 96 19.2 4 0.8 - -
1 86 17.2 4 0.8 10 2
2 76 15.2 4 0.8 20 4
3 66 13.2 4 0.8 30 6
4 56 11.2 4 0.8 40 8
Fuente: Investigación
Elaboración: Josselyn Velasco
Se decidió como un porcentaje máximo de 40% de eritritol debido a que en
algunos estudios realizados se recomienda hacerlo ya que el eritritol modifica la
textura de los alimentos debido a su alta velocidad de cristalización. (70)
3.6.1.7 Templado
El templado consistió en enfriar la mezcla en una placa de mármol con ayuda de
la espátula de acero inoxidable, para que los cristales de la manteca logren
estabilidad creando una masa de chocolate homogénea, viscosa y con brillo. La
mezcla de chocolate fue enfriada a 28°C, luego se volvió a calentar, hasta llegar
a los 32°C. Este proceso es muy importante, porque facilita el moldaje y garantiza
la adecuada conservación del chocolate.
3.6.1.8 Almacenamiento y descontaminación
El chocolate líquido fue dosificado en frascos plásticos estériles, con el fin de
evitar la contaminación del mismo y facilitar su transporte, el enfriamiento se
realizó a temperatura ambiente, posteriormente se procedió a disponer los
frascos plásticos estériles con chocolate en la cámara de flujo, exponiéndolos a
descontaminación ultravioleta de onda corta (540nm) por 10 minutos, para
controlar la carga microbiana.
44
3.6.2 Análisis microbiológico
3.6.2.1. Preparación de los medios de cultivo
3.6.2.1.1 Agar sangre
En un matraz se colocó 12 g de medio Agar sangre base con 300 ml de agua
destilada, se mezcló hasta diluir por completo el medio y se llevó a ebullición a
90°C durante 1 minuto. Posteriormente se procedió al autoclavado del medio de
cultivo a 121°C – 1.1 atm, se dejó enfriar por 15 minutos y se trasladó a una
cámara de flujo laminar para adicionar 3% de sangre de cordero a una
temperatura de 45°C. Una vez lograda una mezcla homogénea, se dispensó el
medio en cajas Petri las cuales fueron llevadas a refrigeración a 4°C para su uso
posterior. (71)
3.6.2.1.2 Agar Mitis Salivarius MSB
Se partió pesando 45 g de Agar Mitis Salivarius MSB y 100 g de sacarosa (20%),
los cuales se disolvieron en 500 ml de agua destilada, la mezcla homogenizada
se llevó a ebullición a 90°C por 1 minuto. El medio de cultivo fue autoclavado
durante 15 minutos a 121°C y 1.1 atm., se dejó enfriar y se adicionó 500 µL de
bacitracina (0.2 u/ml) y 500 µL de telurito de potasio al 1%. A continuación, dentro
de una cámara de flujo laminar, se dispensó el medio en cajas Petri, se dejaron
enfriar y se llevaron a refrigeración a 4°C. (72)
3.6.2.1.3 Infusión cerebro – corazón (BHI)
En 300 ml de agua destilada se diluyó 11.1 g de caldo BHI, la mezcla
homogenizada se llevó a ebullición a 90°C por un 1 minuto. A continuación, se
dispensaron en tubos de ensayo 5ml del caldo, los cuales se esterilizaron a
121°C – 1.1 atm por 15 minutos. Una vez cumplido el tiempo de enfriamiento, los
tubos fueron conservados en refrigeración a 4°C. (72)
45
3.6.2.2 Recuperación, activación e inoculación del Streptococcus mutans
(ATCC 25175)
Para esta investigación se utilizó una cepa de Streptococcus mutans (ATCC
25175) obtenida en el cepario del Instituto Nacional de Investigación en Salud
Pública (INSPI), la cepa se encontraba almacenada en glicerol + BHI (Infusión
Cerebro – Corazón), mediante crioconservación; para activarla se realizó su
inoculación en Agar sangre y su incubación en condiciones de anaerobiosis a
35±2°C por 48 horas.
3.6.2.3 Preparación de las diluciones de los diferentes tratamientos
Este procedimiento se llevó a cabo de la siguiente manera: se pesó 1g de cada
uno de los tratamientos y se disolvió en 9ml de agua destilada estéril; obteniendo
así una solución al 10% en cada tratamiento; se calentó en una estufa a baño
María a fin de homogenizar la solución. Finalmente se colocaron las diluciones
en la cámara de flujo exponiéndolas a desinfección ultravioleta de onda corta
(540nm) por 5 minutos, para eliminar patógenos adquiridos en el proceso de
dilución, sin desnaturalizar las propiedades de la misma.
3.6.2.4 Preparación de una suspensión de Streptococcus mutans a una
escala de 0.5 Mc. Farland
Con las colonias recuperadas en Agar Sangre se preparó una suspensión en
solución salina, a una escala de turbidez de 0.5 Mc. Farland (1.5 ×10-8 UFC/ml)
el procedimiento se realizó tomando las colonias del Agar Sangre con la ayuda
de un hisopo estéril e inoculándolas en un tubo de ensayo con solución salina,
seguidamente se procedió a homogenizar la suspensión en el agitador vórtex
mixer, la suspensión bacteriana fue medida con ayuda de un turbidimetro.
3.6.2.5 Preparación de una macrodilución en caldo
En tubos de ensayo con caldo BHI (Infusión Cerebro-Corazón) se colocaron con
micropipeta los diferentes componentes de la macrodilución distribuidos de la
siguiente manera (Tabla 6 y 7):
46
Tabla 6. Dosificación empleada en la macrodilución en caldo para chocolates de cacao nacional
Chocolates con cacao nacional
Tubo de
ensayo
BHI Suspensión S.
mutans
Dilución de chocolate al
10%
1 5ml 100 μL 100 μL tratamiento 0
2 5ml 100 μL 100 μL tratamiento 1
3 5ml 100 μL 100 μL tratamiento 2
4 5ml 100 μL 100 μL tratamiento 3
5 5ml 100 μL 100 μL tratamiento 4
Fuente: Investigación
Elaboración: Josselyn Velasco
Tabla 7. Dosificación empleada en la macrodilución en caldo para chocolates
de cacao CCN-51
Chocolates con cacao CCN-51
Tubo de
ensayo
BHI Suspensión S.
mutans
Dilución de chocolate al
10%
1 5ml 100 μL 100 μL tratamiento 0
2 5ml 100 μL 100 μL tratamiento 1
3 5ml 100 μL 100 μL tratamiento 2
4 5ml 100 μL 100 μL tratamiento 3
5 5ml 100 μL 100 μL tratamiento 4
Fuente: Investigación
Elaboración: Josselyn Velasco
Estas diluciones fueron homogenizadas en el agitador vórtex mixer y colocadas
en la incubadora a 35±2°C durante 24 horas.
3.6.2.6 Dilución seriada 1:10
Tras las 24 horas de incubación de la macrodilución se realizaron diluciones
sucesivas en agua destilada estéril, a partir, de la macrodilución en caldo, hasta
alcanzar el factor de dilución 10-8. Este procedimiento se realizó por duplicado.
3.6.2.7 Siembra de la dilución 10-8 en Agar Mitis Salivarius MSB
De la última serie de la dilución seriada 10-8 se sembró 100 µL de cada
tratamiento, en cajas petri con Agar Mitis Salivarius MSB, con un asa se inoculó
mediante estriamiento cuantitativo; se realizaron cinco repeticiones por cada
47
tratamiento. Posteriormente las cajas inoculadas fueron incubadas bajo
condiciones de anaerobiosis a 35±2ºC por 48 horas para luego realizar el
recuento en placa.
3.6.2.8 Recuento de colonias
Se observó el crecimiento bacteriano y se identificó las colonias de
Streptococcus mutans mediante observación directa a través del
estereomicroscopio, se pudo observar la morfología típica de las colonias;
encontrándose colonias azules, convexas, adherentes, superficie rugosa con
aspecto de vidrio esmerilado. (73) Finalmente se procedió a realizar el conteo de
las colonias mediante una lupa con 10x de ampliación.
Para conocer la cantidad de Unidades Formadoras de Colonias presentes en 1
ml de la macrodilución se aplicó la siguiente fórmula:
Unidades Formadoras de Colonias por ml
UFC/ml= 𝑪 ∗𝑫
𝑽
C: número de colonias en placa
D: factor inverso de la dilución (10-8)
V: volumen de siembra (100 µl)
48
3.7 Aspectos bioéticos.
Al ser un estudio in vitro, fue necesario la revisión del comité de investigación de
la facultad y la aprobación del comité de ética de la Facultad de Odontología de
la Universidad Central del Ecuador (Anexo 1). Los aportes de esta investigación
son el conocimiento del nivel inhibitorio de un producto elaborado a partir del
cacao y de una nueva opción de edulcorante como es el eritritol, siendo de
importancia para todos los ecuatorianos ya que permite conocer los beneficios
de nuestros productos, y ampliar las investigaciones acerca de este tema, las
cuales son limitadas en nuestro país.
Esta investigación respeta la integridad de las personas; en la etapa
microbiológica se utilizó medidas de bioseguridad como gafas, mascarilla tipo
N95, gorro desechable, guantes y uniforme para proteger los derechos, la
seguridad y el bienestar de los participantes de la investigación. Sin existir un
riesgo biológico ya que los microrganismos utilizados no atentan a la salud en
general; la evaluación del estudio se llevó a cabo en laboratorios idóneos para la
realización de cada una de sus fases.
Se contó con la experiencia de profesionales en cada uno de los campos
investigados tanto en la elaboración del chocolate como en la evaluación
microbiológica.
Cabe destacar que el manejo de desechos fue realizado por parte del personal
del Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública (INSPI), en el cual el
material descartable utilizado en el laboratorio fue esterilizado en el autoclave a
1.1 atmosferas, para posteriormente ser desechado. (Anexo 2)
49
CAPÍTULO IV
4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
4.1 Resultados estadísticos
A partir de un estudio in vitro, se evaluó el efecto inhibitorio de chocolate de dos
genotipos de cacao (Theobroma cacao L.) edulcorados con eritritol al 10%, 20%,
30 y 40% sobre el crecimiento de Streptococcus mutans.
CHOCOLATE ELABORADO A PARTIR DE CACAO NACIONAL O FINO DE
AROMA
Los datos obtenidos a partir del recuento en placa de las unidades formadoras
de colonias fueron analizados utilizando el paquete estadístico IBM SPSS v. 22,
y sometidos a pruebas de normalidad de Shapiro - Wilk. Al no cumplir con los
parámetros de normalidad se optó por el uso de pruebas no paramétricas
aplicando el test de Kruskal - Wallis.
Tabla 8. Medianas ± desviación estándar de las unidades formadoras de
colonias por ml de muestra de chocolate de cacao nacional edulcorado con eritritol
Tratamiento UFC/ml
T0 Chocolate con cacao nacional
amargo 8.0000E+009
T1 Chocolate con cacao nacional +
eritritol 10% 7.0000E+009
T2 Chocolate con cacao nacional +
eritritol 20% 1.4000E+010
T3 Chocolate con cacao nacional +
eritritol 30% 1.0000E+009
T4 Chocolate con cacao nacional +
eritritol 40% 8.5000E+009
P-valor <0.0001
X2(4,N=50) 39.938
Fuente: Investigación
Elaboración: Dr. Daniel Garzón
50
Gráfico 1. Diagrama de barras de error del número de Unidades Formadoras de Colonias por ml (UFC/ml) de los chocolates con cacao nacional.
*Medianas de valores similares y presencia de intervalos de confianza sobrepuestos indican que no existen diferencias
estadísticamente significativas
Fuente: Investigación
Elaboración: Dr. Daniel Garzón
Con la aplicación de la prueba no paramétrica Kruskal Wallis H (X2(4, N=50)
=39.938, p=<0.0001), se identificó diferencias estadísticamente significativas
entre las medianas de la variable UFC/ml con respecto a las categorías de
tratamientos en los que se incluyó chocolate de cacao nacional (Tabla 8).
En el gráfico 1 se puede observar que el tratamiento 2 tiene una diferencia
estadísticamente significativa con los tratamientos 0, 1, 3 y 4. De igual manera
el tratamiento 3 tiene una diferencia estadísticamente significativa con los
tratamientos 0, 1, 2 y 4, mientras que no existe diferencia estadísticamente
significativa entre los tratamientos: 0 y 1, 0 y 4, 1 y 4. El tratamiento 2 (chocolate
+ 20% eritritol) mostró el mayor crecimiento bacteriano frente a todos los demás
tratamientos, mientras que el tratamiento 3 (chocolate + 30% eritritol) desarrolló
51
el menor número de UFC/ml, presentando el mayor grado de inhibición del
crecimiento de S. mutans.
CHOCOLATE ELABORADO A PARTIR DE CACAO CCN-51
Para el análisis estadístico de los datos obtenidos del recuento en placa se aplicó
la prueba de normalidad de Shapiro - Wilk. Al no cumplir con los parámetros de
normalidad se decidió la utilización de pruebas no paramétricas, donde se
empleó la prueba Kruskal - Wallis para muestras independientes.
Tabla 9. Medianas ± desviación estándar de las unidades formadoras de colonias por ml de muestra de chocolate de cacao CCN-51 edulcorado con
eritritol
Tratamiento UFC/ml
T0 Chocolate con cacao
CCN51 amargo 7.0000E+009
T1 Chocolate con cacao
CCN51 + eritritol 10% 1.0000E+009
T2 Chocolate con cacao
CCN51 + eritritol 20% 2.0000E+009
T3 Chocolate con cacao
CCN51 + eritritol 30% 1.0000E+009
T4 Chocolate con cacao
CCN51 + eritritol 40% 1.0000E+009
P-valor <0.0001
X2(4,N=50) 27.275
Fuente: Investigación
Elaboración: Dr. Daniel Garzón
52
Gráfico 2. Diagrama de barras de error del número de Unidades Formadoras de Colonias por ml (UFC/ml) de los chocolates con cacao CCN-51.
*Medianas de valores similares y presencia de intervalos de confianza sobrepuestos indican que no existen diferencias
estadísticamente significativas
Fuente: Investigación
Elaboración: Dr. Daniel Garzón
Se aplicó la prueba no paramétrica Kruskal Wallis H (X2(4, N=50) =27,275, p=
<0,0001) encontrándose diferencias estadísticamente significativas entre los
tratamientos en los que se incluyó chocolate CCN-51 (Tabla 9). El tratamiento 0
tiene una diferencia estadísticamente significativa con los tratamientos 1, 2, 3 y
4. No existe una diferencia estadísticamente significativa entre los tratamientos
1, 2, 3 y 4.
Como se muestra en el gráfico 2, el tratamiento 0 (0% eritritol) presenta el índice
más alto de crecimiento de S. mutans con 7.0000E+009 UFC/ml. Mientras que
los demás tratamientos que contenían eritritol presentaron un índice similar de
crecimiento bacteriano por debajo de los 2.0000E+009 UFC/ml, con una
diferencia altamente significativa con respecto al tratamiento 0.
53
COMPARACIÓN ENTRE LOS DOS GENOTIPOS DE CACAO (CACAO
NACIONAL Y CCN-51)
Una vez aplicadas las pruebas de normalidad los resultados de Shapiro Wilks
(para muestras iguales o inferiores a 50 datos) e histogramas, permitieron
identificar una distribución anormal para los datos, por lo que se procedió a la
utilización de pruebas no paramétricas. En este caso la prueba Mann-Whitney
no pareada, contraparte de la prueba T no pareada.
Gráfico 3. Diagrama de barras de error con las medianas de Unidades Formadoras de Colonias por ml (UFC/ml) de cada genotipo de cacao.
*Medianas de valores similares y presencia de intervalos de confianza sobrepuestos indican que no existen diferencias
estadísticamente significativas
Fuente: Investigación
Elaboración: Dr. Daniel Garzón
Se aplicó la prueba no paramétrica Mann - Whitney U, encontrándose Z=493,5
p= <0,0001 lo que nos indica una diferencia entre los resultados de los
tratamientos con caco nacional y con cacao CCN-51. Se identificaron las
54
medianas de los grupos obtenidos con caco nacional en 8,0000E+009 UFC/ml
y, con el índice de crecimiento más bajo en el caso de los chocolates elaborados
con cacao CCN-51 una mediana de 2,0000E+009 UFC/ml (Gráfico 3).
Gráfico 4. Diagrama de barras de error con las medianas de Unidades
Formadoras de Colonias por ml (UFC/ml) de cada tratamiento por genotipo de cacao.
*Medianas de valores similares y presencia de intervalos de confianza sobrepuestos indican que no existen diferencias estadísticamente significativas
Fuente: Investigación
Elaboración: Dr. Daniel Garzón
Como se puede observar en el gráfico 4 en el tratamiento 0 (0% de eritritol) y 3
(30% eritritol) no se observan diferencias significativas entre ambos genotipos.
Se encontraron diferencias estadísticas para los tratamientos 1 (10% eritritol), 2
(20% eritritol) y 4 (40% eritritol) donde el chocolate con eritritol de cacao CCN-
55
51 tuvo el índice de crecimiento bacteriano más bajo. El porcentaje de eritritol
que demostró el mayor efecto de inhibición fue el 30% en ambos genotipos sin
diferencias estadísticamente significativas entre ellos.
CAPÍTULO V
5. RESULTADOS
56
5.1. Discusión
La sacarosa ha sido señalada como uno de los principales factores causantes
de la caries. El S. mutans y otros microorganismos de la cavidad oral, producen
rápidamente grandes cantidades de ácidos a partir de sacarosa, (9) que destruyen
la estructura dental por ello el uso de edulcorantes alternativos ha sido sugerido
como una medida eficaz para la prevención de la caries. (58)
El eritritol, es un polialcohol (azúcar alcohol) que se utiliza como edulcorante en
los alimentos. Se diferencia en muchos aspectos de todos los otros
polialcoholes; ya que se produce comercialmente mediante alimentos
fermentados. (70) El eritritol es absorbido desde el intestino delgado de forma
rápida y casi completamente, no produce cambios en la orina. (74) Según
Boesten y cols., en el 2015 (75) mencionan que su alta biodisponibilidad sistémica
se ha relacionado con beneficios de salud adicionales para las personas con
diabetes.
En Odontología se conoce que tanto los extractos de cacao, como el eritritol
tienen poder inhibitorio frente al S. mutans. Según Mariani y col. (7), en su estudio
de extracto de cáscara de cacao demostró una significativa inhibición in vitro del
crecimiento de Streptococcus mutans. Flores y col. (49) indican que el cacao
inhibe la formación de biofilm.
Según Kawanabe y col. (9) en una evaluación en ratones de laboratorio
demostraron que el eritritol no es metabolizado por las bacterias bucales para la
producción de ácidos o síntesis de glucanos extracelulares. A su vez, los índices
de caries dental fueron estadísticamente menores en el grupo alimentado con
26% de eritritol; comparado con el grupo alimentado con 26% de sacarosa;
mientras que una dieta que contenía 56% de chocolate con sacarosa y 56% de
chocolate con eritritol fueron (82,8 ± 2,8) y (6,7±0,8) respectivamente.
Varios estudios relacionados al efecto inhibitorio del eritritol sobre bacterias
cariogénicas (9) (12) (65) (76) (77) (78) mostraron que el eritritol tiene una actividad que
previene la caries con una eficacia más alta en comparación con el sorbitol y
57
xilitol. En todos los casos se encontró inhibición del crecimiento y disminución de
la producción de ácido de las principales especies bacterianas asociadas con el
desarrollo de caries como S. mutans, disminución en la adherencia de las
bacterias orales a las superficies dentales, debido, en parte, a una disminución
en la expresión de genes bacterianos implicados en el metabolismo del azúcar,
resultando en una producción reducida de glucanos y fructanos; disminución de
la formación in vitro de biofilm y peso in vivo de la placa dental.
Para llevar a cabo esta investigación se desarrollaron numerosas pruebas piloto
en el Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública (INSPI), que nos
ayudaron a establecer un protocolo que nos permita llegar a valorar la inhibición
in vitro de los objetos de estudio, ya que no se encontró un protocolo establecido
para medir la acción inhibitoria in vitro de los alimentos sólidos sobre
Streptococcus mutans.
En un estudio similar realizado por Arias en el 2016 (79),donde se evaluó la
efectividad inhibitoria in vitro del eritritol al 1%, 8% y 16% de concentración en
caldo BHI sobre el crecimiento de S. mutans, se encontró la mayor inhibición
bacteriana al 16%. El autor concluye que el eritritol por su nulo aporte calórico,
no es metabolizado por la bacteria evitando la generación de ácidos que
desgastan el esmalte y creando un medio no propicio para su proliferación,
confiriéndole una capacidad bacteriostática y no bactericida. Los resultados de
este proyecto de investigación mostraron que el chocolate con 30% de eritritol
obtuvo el mayor índice de inhibición, ocurriendo lo contrario con el chocolate con
20% de eritritol, el cual presentó el mayor número de UFC/ml. En el caso de los
chocolates de cacao CCN-51, el tratamiento con 0% eritritol presenta el índice
más alto de crecimiento de S. mutans, mientras que al 20%, 30% y 40% de
eritritol existe un grado de inhibición estadísticamente similar, con bajo
crecimiento bacteriano. Estas variaciones pueden deberse a la utilización de este
polialcohol en un producto alimenticio, y el uso de dos genotipos de cacao con
distinta concentración de polifenoles (46) (37)
Las propiedades inhibitorias del cacao se deben gracias a sus compuestos
fenólicos, presentes en sus granos. Según Osawa y col. (46) uno de los
58
compuestos es la epicatequina que posee acción “anti-glucosiltransferasa” es
decir que inhiben la producción de GTF (glucosiltransferasa), por parte de los
estreptococos de la cual depende su acción antibacteriana y cariostática. Esta
teoría también fue respaldada por Kim y cols., en el 2004. (47) Arlorio y col. (48)
manifiestan que las epicatequinas son el principal componente fenólico de las
semillas de cacao, con el 35%. Dichas diferencias se pueden encontrar debido
a que la composición química de los granos de cacao varía de acuerdo al
genotipo (37), se conoce que los polifenoles presentes en el cacao son
mayormente responsables de la astringencia y amargor, (34) encontrándose estas
características mayormente en el cacao CCN-51 (40) es por ello que se presume
que las diferencias en cuanto al crecimiento bacteriano en los distintos genotipos
de cacao varía por la composición fenólica de los mismos, siendo el cacao CCN-
51 más amargo y astringente que el nacional. Del mismo modo en este estudio,
se pudo observar que según el genotipo de cacao utilizado se encontró una
diferencia en la inhibición bacteriana; existiendo mayor crecimiento de
Streptococcus mutans en los tratamientos con cacao nacional y un crecimiento
más bajo en el caso de los chocolates elaborados con cacao CCN-51, siendo
este último el cacao con mayor capacidad inhibitoria.
Es necesario destacar que los autores citados anteriormente desarrollaron sus
investigaciones usando extractos de semilla de cacao y eritritol por separado, sin
embargo, no se han elaborado investigaciones en las que se relacione el efecto
de los dos en conjunto; así como tampoco, diferencias entre genotipos de cacao,
como se realizó en este estudio, convirtiéndolo en un estudio multidisciplinar.
5.2 Conclusiones
El chocolate elaborado a base de cacao nacional presentó el mayor grado
de inhibición sobre el crecimiento de Streptococcus mutans en el
tratamiento con 30% de eritritol, mientras que en aquel que contenía el
40% de eritritol se encontró el índice más bajo de inhibición, con la mayor
población de bacterias.
59
El chocolate proveniente de cacao CCN-51 presentó un índice inhibitorio
similar sobre S. mutans en los tratamientos que contenían 10%, 20%, 30%
y 40% de eritritol, mientras que en el tratamiento con 0% de eritritol se
generó el mayor crecimiento bacteriano.
Se identificó el mayor índice de inhibición en los chocolates elaborados
con cacao CCN-51 frente a los chocolates de cacao nacional, lo cual
puede deberse a las distintas concentraciones de compuestos fenólicos y
amargor que contiene cada genotipo de cacao.
Los chocolates edulcorados con eritritol sobre Streptococcus mutans, no
tienen propiedades bactericidas sino bacteriostáticas, ya que el eritritol al
no ser metabolizado por la bacteria no constituye un sustrato para su
crecimiento.
El eritritol al igual que los productos provenientes del cacao tienen gran
potencial como compuestos antimicrobianos; en este estudio ambos
presentaron propiedades inhibitorias del crecimiento de S. mutans,
exhibiendo sinergismo al ser combinados en los porcentajes mencionados
para cada genotipo de cacao.
5.3 Recomendaciones
Se recomienda la continuidad de esta investigación realizando una
evaluación in vitro sobre otras bacterias del biofilm, así como también una
posterior evaluación in vivo incluyendo cepas de S. mutans.
60
Así mismo, se recomienda la realización de estudios empleando cacao y
sus productos derivados que permitan respaldar su capacidad
bacteriostática.
En vista de la necesidad constante de nuevos y efectivos agentes
terapéuticos, se sugiere realizar otros estudios para comprobar su eficacia
bacteriostática, incorporando eritritol a otros productos como en gomas de
mascar que promuevan la higiene oral.
En base a toda la literatura estudiada se recomienda en consumo de
eritritol y productos derivados del cacao, al ser de bajo costo y eficientes
como tratamientos preventivos de la caries.
6. BIBLIOGRAFÍA
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enfermedades bucodentales. [Online].; 2004 [cited 2017 01 03. Available
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68
ANEXOS
69
Anexo 1. Certificado de viabilidad ética
70
71
Anexo 2. Reglamento “Manejo de los desechos infecciosos para la red de
servicios de salud en el ECUADOR”
72
73
74
75
76
Anexo 3. Acuerdo de entendimiento para la dirección de tesis por parte del INSPI
77
78
79
80
81
82
83
Anexo 4. Ficha metodológica de tesis - INSPI
84
85
86
Anexo 5. Certificado del análisis microbiológico en el Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública Dr. Leopoldo Izquieta Pérez - INSPI LIP.
87
Anexo 6. Certificado de elaboración de chocolates en la Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE, IASA-I
88
Anexo 7. Fotografías del procedimiento de la investigación
Elaboración de los chocolates con cacao nacional y CCN-51
Selección de la materia prima
Semillas frescas de cacao
Fuente: Investigación
Fermentación
Proceso de fermentación
Fuente: Investigación
Secado
Secado de semillas de cacao
Fuente: Investigación
89
Tostado
Tostado de las semillas de cacao
Fuente: Investigación
Molienda
Proceso de molienda de las semillas decorticadas
Fuente: Investigación
Mezcla
Porcentaje de cada uno de los ingredientes
Fuente: Investigación
90
Incorporación de los ingredientes
Fuente: Investigación
Templado
Proceso de templado del chocolate
Fuente: Investigación
Almacenamiento y descontaminación
Almacenamiento de los chocolates
Fuente: Investigación
91
Descontaminación de los chocolates
Fuente: Investigación
Análisis microbiológico
Preparación de los medios de cultivo
o Agar sangre
Preparación del medio Agar Sangre
Fuente: Investigación
Dispensación y almacenamiento del Agar sangre
Fuente: Investigación
92
o Agar Mitis Salivarius MSB
Preparación de Agar Mitis Salivarius
Fuente: Investigación
Preparación y adición de bacitracina y telurito de potasio al 1%
Fuente: Investigación
Dispensación y almacenamiento del Agar Mitis Salivarius MSB
Fuente: Investigación
93
o Infusión cerebro – corazón (BHI)
Preparación de Infusión cerebro – corazón (BHI)
Fuente: Investigación
Recuperación, activación e inoculación del Streptococcus mutans (ATCC 25175)
A) Cepario del INSPI. B) Cepas de Streptococcus mutans
Fuente: Investigación
Activación del Streptococcus mutans en Agar sangre
Fuente: Investigación
A B
94
Preparación de las diluciones de los diferentes tratamientos
Fuente: Investigación
Dilución en baño maría y colocacion en la cámara de flujo
Fuente: Investigación
Preparación de una suspensión de Streptococcus mutans a una escala de 0.5 Mc. Farland
Elaboración de suspensión de S. mutans a 0.5 Mc. Farland
Fuente: Investigación
Preparación de una macrodilución en caldo
Preparación de la macrodilución
Fuente: Investigación
95
Dilución seriada 1:10
Elaboración de la dilución seriada
Fuente: Investigación
Siembra de la dilución 10-8 en Agar Mitis Salivarius MSB
Inoculación de la dilución en Agar Mitis Salivarius MSB e incubación en jarras de anaerobiosis
Fuente: Investigación
96
Recuento de colonias
Identificación de colonias de S. mutans en estereomicroscopio A) Colonias S. mutans un aumento de
0,67x. B) Aumento 2,00x Fuente: Investigación
Recuento de colonias mediante lupa
Fuente: Investigación
A B
