UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE …en países de Sudamérica como Argentina, Bolivia,...

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS DE

Leishmania mexicana (IgG1 e IgG2) PRODUCIDOS POR

PERROS INFECTADOS NATURALMENTE UTILIZANDO

WESTERN BLOT.

Trabajo de Grado Presentado como requisito para obtener el

Título de Médico Veterinario Zootecnista

AUTORA:

DIANA GABRIELA JARAMILLO CHERRES

TUTOR:

Dr. Richar Ivan Rodriguez Hidalgo

Quito, Abril 2017

ii

DEDICATORIA

A quienes llenan de luz y amor mis días, mis amados padres y

hermanos, quienes son apoyo e inspiración en cada paso.

Diana Gabriela Jaramillo

AGRADECIMIENTO

iii

Agradezco a Dios por los regalos maravillosos de cada día, la vida, la

familia, la salud, el amor. Por iluminar mi camino con sus bendiciones y

darme fortaleza hasta cumplir mis anhelos.

A mis padres y hermanos por todo su amor, sabiduría y apoyo. Quienes

son mi inspiración, mi pilar, a ellos les debo quien soy.

Al Instituto de Investigación en Salud Pública y Zoonosis por permitir la

elaboración de este proyecto, y brindar el apoyo con sus instalaciones

para la realización del trabajo de laboratorio. A la Dra. Graciela Uzcanga

quien facilitó los procesos para la realización de esta investigación. A la

Lcda. Maritza Celi, por su grata amistad y la apertura a compartir su

conocimiento.

A mi querida facultad, a mis maestros por permitirme aprender de la

profesión y de la vida, por la amistad, porque cada persona con la que

he compartido, ha dejado valiosas lecciones y grandes experiencias.

Especialmente a mi estimado tutor, Dr. Richar Rodríguez, quien ha sido

ejemplo y apoyo desde el comienzo y en cada paso dado.

iv

AUTORIZACIÓN DE AUTORÍA INTELECTUAL

Yo, DIANA GABRIELA JARAMILLO CHERRES, en mi calidad de una

de los autores del trabajo de investigación realizado sobre

“EVALUACIÓN LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS DE Leishmania

mexicana (IgG1 e IgG2) PRODUCIDOS POR PERROS INFECTADOS

NATURALMENTE UTILIZANDO WESTERN BLOT”, por la presente

autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de

todos los contenidos que me pertenecen o de parte de los que contiene

esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.

Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la

presente autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con

lo establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la Ley

intelectual y su Reglamento.

Quito, 20 de marzo de 2017.

____________________________________

Diana Gabriela Jaramillo Cherres

C.I. 180328237-3

[email protected]

v

INFORME DEL TUTOR

En mi carácter de Tutor del Trabajo de Grado presentado por la Srta.

DIANA GABRIELA JARAMILLO CHERRES para obtener el Título o

Grado de MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA, cuyo título es

“EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS DE Leishmania


NATURALMENTE UTILIZANDO WESTERN BLOT”, considero que dicho

trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes para ser sometido a la

presentación pública y evaluación por parte del jurado examinador que

se designe.

En la ciudad de Quito, a los 16 días del mes de marzo de 2017.

______________________________

Dr. Richar Rodríguez. Ph. D.

CI: 171205178-6

[email protected]

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CALIFICACIÓN DEL TRABAJO FINAL

ix

INDICE GENERAL EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS DE Leishmania mexicana (IgG1 e IgG2) PRODUCIDOS POR PERROS INFECTADOS NATURALMENTE UTILIZANDO WESTERN BLOT...............................................i

DEDICATORIA.................................................................................................................ii

AGRADECIMIENTO.........................................................................................................ii

AUTORIZACIÓNDEAUTORÍAINTELECTUAL..................................................................iv

INFORMEDELTUTOR.....................................................................................................v

CALIFICACIÓNDELTRABAJOFINAL...............................................................................vi

INDICEGENERAL.............................................................................................................ix

LISTADEANEXOS...........................................................................................................xi

RESUMEN.....................................................................................................................xiii

CAPÍTULOI.....................................................................................................................1

INTRODUCCIÓN..........................................................................................................1

OBJETIVOS..................................................................................................................2

ObjetivoGeneral........................................................................................................2

ObjetivosEspecíficos..................................................................................................2

CAPITULOII....................................................................................................................3

MARCOTEÓRICO........................................................................................................3

2.1.Antecedentes..................................................................................................3

2.2.Etiología...........................................................................................................4

2.3.Transmisión.....................................................................................................5

2.4.SignosClínicos.................................................................................................7

2.5RespuestaInmunitaria.....................................................................................7

2.6.Diagnóstico......................................................................................................8

2.7.Medidaspreventivasydecontrol...................................................................9

CAPITULOIII.................................................................................................................10

METODOLOGÍA.........................................................................................................10

3.1.Ubicacióndezonasdeestudio......................................................................10

3.2.Diseñodelainvestigación.............................................................................10

3.3.PoblacióndeEstudioyUnidadesdeMuestreo.............................................10

3.4.Materiales.....................................................................................................11

3.5.Método..........................................................................................................12

3.5.1.Extractodeantígenos.................................................................................12

3.5.2.DeteccióndeanticuerposIgG1eIgG2porWesternBlot...........................12

x

3.5.3.DeteccióndeanticuerposIgG1eIgG2porELISAindirecto........................15

3.6.Análisismatemáticosyestadísticos..............................................................16

CAPITULOIV.................................................................................................................18

RESULTADOSYDISCUSIÓN.......................................................................................18

4.1.ExtractodeLeishmaniamexicana.....................................................................18

4.2.IdentificacióndelasbandasreveladasenWesternBlotconisotipoIgG1yevaluacióndelarespuestainmunemedianteELISAindirecto................................18

4.3.IdentificacióndelasbandasreveladasenWesternBlotconisotipoIgG2yevaluacióndelarespuestainmunemedianteELISAindirecto................................23

CAPITULOV..................................................................................................................29

CONCLUSIONES........................................................................................................29

ANEXOS........................................................................................................................30

Anexo1........................................................................................................................30

Anexo2........................................................................................................................32

Anexo3........................................................................................................................33

Anexo4........................................................................................................................35

Anexo5........................................................................................................................35

Anexo6........................................................................................................................36

Anexo7........................................................................................................................36

Anexo8........................................................................................................................37

Anexo9........................................................................................................................37

Anexo10......................................................................................................................37

Anexo11......................................................................................................................38

Anexo12......................................................................................................................38

Anexo14......................................................................................................................40

Anexo15......................................................................................................................41

Anexo16......................................................................................................................42

Anexo17......................................................................................................................43

Anexo18......................................................................................................................45

Anexo19......................................................................................................................46

Anexo20......................................................................................................................47

REFERENCIASBIBLIOGRÁFICAS....................................................................................48

xi

LISTA DE ANEXOS Anexo 1. Lista de materiales utilizados en el ensayo

Anexo 2. Códigos Sueros Caninos utilizados en Western Blot para

detección de inmunoglobulinas IgG1 e IgG2.

Anexo 3. Registro de los sueros utilizados para la evaluación

Anexo 4. Preparación de geles de acrilamida cámara para Western Blot

Anexo 5. Preparación de transferencia – Blotting

Anexo 6. Transferencia de proteínas a papel de nitrocelulosa

Anexo 7. Preparación de tiras de nitrocelulosa marcadas

Anexo 8. Sueros a evaluar

Anexo 9. Incubación de sueros

Anexo 10. Revelado de de bandas mediante sustrato

Anexo 11. Lectura de tiras de nitrocelulosa

Anexo 12. Cálculo del peso molecular de bandas reveladas por Western

Blot Anexo 13. Electroforesis – desplazamiento de proteínas

Anexo 14. Bandas observadas entre los grupos de sueros problema

Anexo 15. Bandas observadas entre los grupos de sueros problema

Anexo 16. Resultados de densidades ópticas en ELISA indirecto

Anexo 17. Correspondencia Kappa Resultados de IgG1 por (Western

Blot )

Anexo 18. Correspondencia Kappa Resultados de IgG2 por (Western

Blot )

xii

Anexo 19. Correspondencia Kappa (ELISA y Western Blot) Resultados

IgG1

xiii

EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS DE Leishmania


NATURALMENTE UTILIZANDO WESTERN BLOT.

AUTORA: Diana Gabriela Jaramillo Cherres

TUTOR: Dr. Richar Rodriguez Ph. D.

RESUMEN La Leishmaniasis es una enfermedad zoonósica de origen parasitario, causado por Leishmania spp., descrita en el ser humano y otros mamíferos como el canino. Es una enfermedad de amplia distribución reportada en 98 territorios y se transmite por medio de mosquitos vectores Phlebotomus y Lutzomia. El canino doméstico forma parte importante del ciclo de transmisión de la presentación visceral. El objetivo de esta investigación fue evaluar la presencia de anticuerpos de Leishmania mexicana IgG1 y IgG2 producidos por perros infectados naturalmente mediante la técnica de Western Blot. Para lo cual, se analizaron 42 muestras de suero canino: un grupo de 14 muestras positivas, otro de 14 muestras negativas procedentes del banco de sueros del Instituto de Investigación en Salud Pública y Zoonosis. También se considero un tercer grupo de 14 muestras de perros identificados como negativos y con antecedentes de no haber visitado zonas endémicas de la enfermedad, los cuales fueron recolectados en la clínica veterinaria de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central. Las 42 muestras fueron evaluadas con la prueba de Western Blot y se revelaron varios polipéptidos con masas moleculares entre 113 kDa y 12 kDa reconocidos por los anticuerpos de los isotipos IgG1 e IgG2. Donde se identificó una banda de 34 kDa con frecuencia significativa entre los sueros positivos evaluados. En el estudio, también se sometieron las muestras a un ELISA indirecto con el parásito completo como fuente de antígenos y se valoró el tipo de respuesta inmune que presentaban los animales (Th1 o Th2). Con lo cual, se observó mayor respuesta de tipo Th1 entre las muestras. Finalmente, la investigación reveló marcadores polipeptídicos de la presencia de la enfermedad en caninos y también se observó el estatus inmunológico de los perros en las zonas endémicas a la leishmaniasis en el Ecuador. Palabras clave: Leishmaniasis canina, respuesta inmune, IgG1/IgG2, Western Blot, perros.

xiv

EVALUATION OF THE PRESENCE OF Leishmania mexicana

ANTIBODIES (IgG1 and IgG2) PRODUCED BY NATURALLY INFECTED

DOGS USING WESTERN BLOT

AUTHOR: Diana Gabriela Jaramillo Cherres

TUTOR: Dr. Richar Rodriguez Ph. D.

SUMMARY

Leishmaniasis is a zoonotic disease of parasitic origin, caused by Leishmania spp., It has been described in humans and other mammals such as canines. It is a widespread disease reported in 98 territories and is transmitted by vectors Phlebotomus and Lutzomia. The domestic canine plays an important role in the transmission cycle of the visceral presentation. The objective of this research was to evaluate the presence of Leishmania mexicana antibodies IgG1 and IgG2 produced by naturally infected dogs using the Western Blot technique. For this, 42 samples of canine serum were analyzed: a group of 14 positive samples, another of 14 negative samples from the sera bank of the Instituto de Investigación en Salud Pública y Zoonosis. It was also considered a third group of 14 samples of dogs identified as negatives, with a history of not having visited endemic areas of the disease, these samples were collected in the veterinary clinic of the Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador. The 42 samples were evaluated with the Western Blot test and several polypeptides with molecular masses between 113 kDa and 12 kDa were recognized by the antibodies isotypes IgG1 and IgG2. A band of 34 kDa was identified with significant frequency among the positive sera evaluated. The samples were also subjected to an indirect ELISA with the complete parasite as the source of antigens and the immune response (Th1 or Th2) was also evaluated. Thus, a higher Th1 response was observed among the samples. Finally, the research revealed polypeptide markers for the presence of the disease in canines and also the immunological status of dogs was observed in the endemic areas of leishmaniasis in Ecuador. Key words: Canine leishmaniasis, immune response, IgG1 / IgG2, Western Blot, dogs.

1

CAPÍTULO I

INTRODUCCIÓN

La Leishmaniasis es una enfermedad de origen parasitario, causado

Leishmania spp. (Desjeux et al., 2004). Tiene una amplia distribución, descrita

en 98 territorios (López-Céspedes et al., 2012) con más de doce millones de

personas infectadas por Leishmania spp. y con aproximadamente 350 millones

de personas en riesgo de contraer la enfermedad de acuerdo a datos de la

Organización Mundial de la Salud (Iowa State University/College of Veterinary

Medicine, 2009). Anualmente existen casos de leishmaniasis cutánea y

visceral en todos los continentes, entre los principales países afectados están:

India, Brasil, Bangladesh, Nepal y Sudán. También, se han identificado casos

en países de Sudamérica como Argentina, Bolivia, Colombia, Ecuador y

Venezuela (Dantas-Torres y Otranto, 2016).

La Leishmaniasis también afecta a otros mamíferos como los caninos, lo cual

ha sido descrito en varios poblados de países de Sudamérica como Brasil,

Venezuela, Colombia, México entre otros (Sacks y Perkins, 1984; Reguera et

al., 2016; Oliveira et al., 2016). A pesar de los reportes de infestación en perros

con diferentes especies de Leishmania en el continente americano (Esparta et

al., 2000; López-Céspedes et al., 2012; Oliveira et al., 2016), se desconoce

aún, cual es el papel epidemiológico que juegan estos animales en los ciclos

de transmisión de la leishmaniasis y los mecanismos de la respuesta inmune

que ocurren tras la infección. Del mismo modo, existe muy poca información

sobre la epidemiología y respuesta inmune de los perros infectados con

leishmania en el Ecuador, aunque, por estudios del instituto de Investigación

en Salud Pública y Zoonosis (CIZ) se ha determinado su presencia en áreas

endémicas del Ecuador (datos no publicados). Cruz-Chan y colaboradores

2

(2014) indicaron que la sintomatología de la infección no conduce a un

diagnóstico certero de la leishmaniasis americana en perros. Finalmente,

debido a la relación existente entre seres humanos y caninos, la leishmaniasis

americana, al igual que la leishmaniasis visceral causada por Leishmania

infantum representa una zoonosis importante. Por lo tanto, su estudio es de

gran importancia por los problemas que puede estar generando tanto para la

salud animal como para la salud pública de la población americana (Cruz-Chan

et al., 2014).

OBJETIVOS

Objetivo General

Evaluar la presencia de anticuerpos de Leishmania mexicana IgG1 y IgG2

producidos por perros infectados naturalmente mediante la técnica de Western

Blot.

Objetivos Específicos

• Evaluar el extracto de los antígenos de Leishmania mexicana a partir

del cultivo de promastigotes en la detección de anticuerpos (IgG1 e

IgG2) en perros naturalmente infectados con Leishmania spp. utilizando

Western Blot.

• Correlacionar los resultados del Western Blot y el ELISA indirecto en la

evaluación de la respuesta de anticuerpo anti leishmania (IgG1 e IgG2)

en perros infectados naturalmente.

3

CAPITULO II

MARCO TEÓRICO

2.1. Antecedentes

La Leishmaniasis es una enfermedad que afecta a seres humanos y a otros

mamíferos como el perro (Alvar et al., 2004; Dantas-Torres et al., 2010; Sacks

and Perkins, 1984). Varios casos de Leishmaniasis en caninos y equinos

fueron encontrados por Manoel Oliveira Neto y colaboradores (1988) mediante

un ensayo de inmunofluorescencia indirecta, localizados en las zonas

periurbanas de la ciudad de Rio de Janeiro. Asimismo, se evidenció la

presencia de caninos positivos a Leishmania spp. mediante un ensayo

inmunológico ligado a enzimas (ELISA), en Bahía, Brasil entre los años 1971

y 1980 (López-Céspedes, 2012).

La Leishmaniasis canina es considerada como una enfermedad importante

puesto que afecta principalmente a caninos domésticos tanto en el continente

Europeo y Asiático como en el continente Americano, provocando que

animales infectados mueran por falta de tratamiento (Reguera, 2016).

En el Ecuador, se ha identificado casos de leishmaniasis en humanos, en

veinte provincias del país, distribuidos en las tres regiones continentales del

Ecuador (Calvopina et al., 2004; Kato et al., 2016, 2005; Olalla et al., 2015).

Entre las especies encontradas se mencionan: Leishmania mexicana,

Leishmania braziliensis, Leishmania major-like, Leishmania guyanensis, y

Leishmania panamensis. Aunque no existe reportes de Leishmaniasis en

caninos, Calvopiña et al., (2004) reportan la presencia de la enfermedad en el

oso hormiguero (Tamandua tetradactila) y el perro de monte (Potos flavus).

4

2.2. Etiología

La Leishmaniasis es causada un protozoario denominado Leishmania spp.

perteneciente a la familia Trypanosomatidae del orden Kinetoplastida, del cual

se han descrito cerca de treinta especies diferentes (Cabral et al., 1998;

Reguera et al., 2016).

La transmisión del parásito se produce por medio de insectos vectores de los

géneros Phlebotomus en el Viejo mundo y Lutzomyia en el Nuevo mundo

(Esparta et al., 2000; Reguera et al., 2016). Alrededor de treinta especies de

flebótomos han sido incriminados como vectores (Otranto and Dantas-Torres,

2013). Una vez que ingresa el parásito al vector, éste llega a ser infectivo entre

los ocho y veinte días posteriores a la ingesta. La multiplicación de la

Leishmania se da en el aparato bucal del vector (Desjeux et al., 2004). Por otro

lado, varios autores (Dantas-Torres and Otranto, 2016; Reguera et al., 2016)

han reportado que otros artrópodos como Dermacentor variailis y

Rhipicephalus sanguineus pueden ser también transmisores de la

enfermedad.

Las diferentes especies de Leishmania han sido divididas en dos subgéneros:

Leishmania leishmania y Leishmania viannia, (Alvar et al., 2004; Desjeux et

al., 2004).

De acuerdo al Centro de Control y Prevención de Enfermedades de los

Estados Unidos CDC (2015), este protozoario puede generar la enfermedad

con diferentes manifestaciones clínicas. El tipo de presentación clínica que se

observa está asociada a la especie de Leishmania que infectó al individuo

(Alvar et al., 2004). De esta manera se puede presentar: 1) Leishmaniasis

cutánea, observada en humanos y caninos, causada principalmente por las

especies: Leishmania amazonensis, L. tropica; también la presentación 2)

5

Leishmaniasis mucocutánea, observada en humanos y causada

principalmente por L. braziliensis (Alvar et al., 2004; Cabral et al., 1998; Iowa

State University/College of Veterinary Medicine, 2009; Kaszak et al., 2015;

Sasani et al., 2016); finalmente, 3) la Leishmaniasis visceral, observada en

humanos y caninos, es causada en la mayoría de los casos por L. donovani.

La Leishmaniasis visceral ha causado grandes pérdidas humanas y en la

actualidad genera los mayores problemas para su control (Desjeux et al.,

2004).

2.3. Transmisión

La Leishmaniasis es una enfermedad de mucha importancia en los seres

humanos aunque también afecta a los animales silvestres y domésticos (Alvar

et al., 2004; Desjeux, 2004; Oryan and Akbari, 2016; Reguera et al., 2016).

Epidemiológicamente, se han establecido dos formas de transmisión de la

enfermedad al ser humano; primero, la enfermedad es de tipo zoonósico, en

donde el canino es el origen de la parasitosis siendo considerado como un

hospedador accidental la ser humano (Esparta et al., 2000; Sasani et al.,

2016); y segundo, en donde se establece al ser humano como hospedador

directo de la enfermedad (Desjeux et al., 2004).

El ciclo de vida de Leishmania spp. inicia con la picadura del mosquito, cuando

absorbe los amastigotes de un individuo infectado; éstos migran hasta la

válvula estomodeal del mosquito madurando a promastigotes (estado

infectivo). Cuando el mosquito vuelve a picar al hospedador, inocula los

promastigotes que ingresan en el flujo sanguíneo del hospedador. En el

organismo del hospedador, el parásito es fagocitado principalmente por los

macrófagos; en su interior, los promastigotes se transforman a su estadio

intracelular aflagelado (fase amastigote), los cuales se multiplican

intracelularmente hasta romper la célula y liberar los amastigotes al torrente

6

sanguíneo (Esparta et al., 2000; Iowa State University/College of Veterinary

Medicine, 2009; Kaszak et al., 2015; Loría-Cervera and Andrade-Narváez,

2014); el ciclo finaliza y continua cuando el mosquito vuelva a picar y absorber

los amastigotes.

La Leishmaniasis ha sido ampliamente estudiada en los seres humanos

(Buxbaum, 2013; Chang and Dwyer, 1976; Oryan and Akbari, 2016; Torrecilha

et al., 2016) y muy poca importancia se le ha dado a la parasitosis en otras

especies como los caninos (Iowa State University/College of Veterinary

Medicine, 2009; Oliveira et al., 2016; Reguera et al., 2016). El perro es

considerado como uno de los principales animales de sangre caliente

afectados por este parásito (Cruz-Chan et al., 2014; Esparta et al., 2000;

López-Céspedes et al., 2012; Sasani et al., 2016); aunque, también han sido

reportadas otras especies animales como gatos, equinos, y algunas especies

de mamíferos silvestres; mientras que, en porcinos, ovinos y ganado se ha

detectado la presencia de anticuerpos contra Leishmania spp. (Dantas-Torres

et al., 2010).

Varios autores identifican a los caninos domésticos como una especie

importante dentro del ciclo de Leishmania spp. (Dantas-Torres et al., 2010;

Esparta et al., 2000), ya que es considerado como un reservorio adecuado

para Leishmaniasis (Trevisan et al., 2015), a pesar de esto, no ha sido

totalmente esclarecido el papel de los perros ya que su infestación podría ser

meramente accidental (Figueredo et al., 2012). De acuerdo a Otranto y

Dantas-Torres, (2013), el perro es un elemento importante en la epidemiologia

de la Leishmaniasis visceral por su estrecha relación con la naturaleza donde

habita el vector y el hombre.

7

2.4. Signos Clínicos

Los signos que se identifican en los animales con Leishmaniasis visceral no

son patognomónicos de la enfermedad, sin embargo, se puede observar

letargia, pérdida de peso, esplenomegalia, alteraciones en la coagulación

sanguínea con hematuria, epistaxis y melena (Iowa State University/College of

Veterinary Medicine, 2009). También se pueden presentar infestaciones

asintomáticas en periodos largos de tiempo (Cruz-Chan et al., 2014). En la

evaluación clínico patológica de perros infectados con L. infantum se ha

observado trombocitopenia, anemia, pancitopenia, leucopenia, azotemia,

hipoalbuminemia, hiperproteinemia y en algunos casos proteinuria (Silvestrini

et al., 2016).

En el caso de la Leishmaniasis americana, los caninos tienen una presentación

clínica de la enfermedad caracterizada principalmente por el aparecimiento

inicial de nódulos en la zona donde ocurrió la picadura con despigmentación y

áreas alopécicas; también se identifica eritema en las zonas de inoculación del

parásito y, el animal puede presentar cuadros de pirexia (Cruz-Chan et al.,

2014; Iowa State University/College of Veterinary Medicine, 2009)

2.5 Respuesta Inmunitaria

La respuesta inmunitaria que presentan los caninos ante la infestación del

parásito puede ser variable (Alvar et al., 2004). Leishmania spp. son parásitos

obligados, por lo cual infectan macrófagos, neutrófilos del individuo (Iowa State

University/College of Veterinary Medicine, 2009). Los niveles de las diferentes

inmunoglobulinas pueden ser valoradas en el canino para poder establecer la

respuesta inmune en base a su estado de salud (Cruz-Chan et al., 2014).

Estudios realizados en animales naturalmente infectados han demostrado que

la producción de inmunoglobulinas IgG1 e IgG2 es variable entre los individuos

enfermos (Alvar et al., 2004), también animales naturalmente infectados y

8

animales vacunados contra Leishmania spp. presentan diferentes niveles de

estas inmunoglobulinas (De Oliveira Mendes et al., 2003). Estos dos isotipos

podrían ser dos indicadores de estatus clínico del animal en presencia de

leishmaniasis canina (Cardoso et al., 2007). Varios ensayos experimentales

han demostrado la presencia de una respuesta Th2 (IgG2) ante la presencia

del parásito en el animal, presentándose en mayor cantidad durante el período

de incubación y presentación o no de signos clínicos (Alvar et al., 2004;

Fernández-Pérez et al., 2003). Del mismo modo, se ha reportado el

aparecimiento de la inmunoglobulina IgG2 anti-leishmania en mayor cantidad

en animales asintomáticos, mientras que la inmunoglobulina tipo IgG1 ha sido

relacionada con la respuesta protectiva ante la enfermedad (Alvar et al., 2004).

2.6. Diagnóstico

El diagnóstico de la leishmaniasis en animales se ejecuta a través de estudios

clínicos, inmunológicos y moleculares. Los diferentes métodos de laboratorio

incluyen procesos de inmunodiagnóstico como Western Blot, Ensayo

inmunológico ligado a enzimas (ELISA) de respuesta a antígenos o

anticuerpos, inmunofluorescencia directa, aglutinación indirecta,

hemaglutinación indirecta, inmunodifusión (Trevisan et al., 2015). También

existen métodos de diagnóstico clínico-patológicos, como la aspiración del

material en lesiones cutáneas, la observación directa del parásito por tinción

de Giemsa o con tinción Wrigth; la cual, es usada ampliamente para la

detección de los amastigotes observados en el núcleo de macrófagos (Iowa

State University/College of Veterinary Medicine, 2009). Se han desarrollado

varios tipos de diagnóstico moleculares como PCR en tiempo real, PCR-RFLP

y secuenciamiento de los espaciadores ribosomales (Dantas-Torres et al.,

2010; Esparta et al., 2000; Francino et al., 2006; Montalvo et al., 2010), para

la confirmación de la enfermedad y la identificación de la especie de

Leishmania spp. Este tipo de pruebas son consideradas como las más

9

sensibles y utilizan muestras de sangre, biopsias de piel o de linfonodos, pero

al ser procedimientos con alta sensibilidad y especificidad tienen costos altos

y requieren mayor tiempo para la obtención de resultados (Ferroglio et al.,

2007; Trevisan et al., 2015). Sin embargo, para la evaluación de la enfermedad

en zonas endémicas, la detección de anticuerpos de Leishmania por medio de

pruebas de serodiagnóstico han dado buenos resultados citando como

apropiadas las técnicas de Western Blot y ELISA (López-Céspedes et al.,

2012).

2.7. Medidas preventivas y de control

Existen diferentes medidas de control de la enfermedad en caninos, por

ejemplo, se pueden encontrar en el mercado vacunas que se han desarrollado

para la prevención de la enfermedad, como lo reportadas en zonas endémicas

de Brasil (De Oliveira Mendes et al., 2003; Reguera et al., 2016);

desafortunadamente, este tipo de prevención no evita que el animal sea picado

por los mosquitos vectores (Dantas-Torres and Otranto, 2016). Por otro lado,

también existen diferentes tipos de insecticidas como piretroides (Bray and

Hamilton, 2013; David et al., 2001; Oryan and Akbari, 2016), que se aplican a

los caninos para evitar la picadura de insectos, estos se los encuentra en

diferentes presentaciones como pipetas, collares o spray (Figueredo et al.,

2012). También en zonas endémicas a Leishmaniasis visceral como en Brasil,

se manejan políticas de eutanasias a aquellos animales que han dado como

positivos a la enfermedad (Trevisan et al., 2015; Dantas-Torres et al., 2010).

10

CAPITULO III

METODOLOGÍA

3.1. Ubicación de zonas de estudio

La investigación fue desarrollada en el Instituto de Investigación en Salud

Pública y Zoonosis (CIZ) en los laboratorios de Inmunodiagnóstico, ubicado

en el edificio del Hospital del Día de la Universidad Central del Ecuador.

3.2. Diseño de la investigación

La investigación es de tipo experimental, donde se evaluó la respuesta inmune

humoral de los caninos frente a los antígenos de Leishmania spp. Con este fin,

se emplearon sueros caninos en pruebas de ELISA indirecto y ensayo de

Western Blot para la evaluación de la presencia de anticuerpos anti-

Leishmania mexicana de los isotipos IgG1 e IgG2; en el cuál se determinó como

variable dependiente la presencia de las inmunoglobulinas y como variable

independiente la enfermedad en perros infectados naturalmente con

Leishmania spp.

3.3. Población de Estudio y Unidades de Muestreo

En total, se analizaron 42 sueros procedentes de caninos divididos en 3 grupos

(Tabla 1):

Grupo Positivo Endémico.- la población estudiada fueron 14 sueros

sanguíneos, procedentes de 14 caninos machos y hembras diagnosticados

positivos por frotis sanguíneo y confirmados mediante la técnica de PCR.

11

Grupo Negativo Endémico.- incluyeron 14 sueros caninos diagnosticados

como negativos mediante las técnicas de frotis sanguíneo y PCR. Estos dos

grupos de sueros proceden de las siguientes zonas endémicas: provincia de

Sucumbíos, parroquia de Aguas Negras (total 8 sueros); provincia de

Pichincha, parroquia Pedro Vicente Maldonado (total 7 sueros); provincia de

Orellana, parroquia García Moreno (total 9 sueros) y provincia de Napo,

parroquia de Gonzalo Díaz de Pineda (total 4 sueros). Los sueros fueron

analizados con la técnica de frotis sanguíneo donde se identificó la presencia

de amastigotes y todas las muestras identificadas como positivas fueron

sometidas a PCR-del espaciador interno del transcrito ribosómico (ITS) para

confirmar su positividad, información obtenida de los registros del CIZ (Anexos

2 y 3).

Grupo Negativo No Endémico.- un grupo de 14 sueros provenientes de perros

sin antecedentes de haber viajado a zonas endémicas, obtenidos en la ciudad

de Quito, área no endémica a la parasitosis. Las muestras fueron colectados

en la clínica de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la

Universidad Central del Ecuador (Anexos 2 y 3).

Tabla 1. Cantidad de sueros caninos totales y clasificación

PCR Total Muestras Observaciones

+ 14 Zona Endémica

- 14 Zona Endémica

- 14 Zona No Endémica

Total 42

Elaborado por: La Autora

3.4. Materiales

Los materiales utilizados son detallados en Anexo 1.

12

3.5. Método

3.5.1. Extracto de antígenos

Para la obtención del extracto de antígenos se empleó un cultivo de

Leishmania mexicana (MHOM/BZ/82/Bel 21), proporcionado por La Fundación

Instituto de Estudios Avanzados (IDEA), (Caracas-Venezuela). Una alícuota

conteniendo 107 parásitos/ml crio preservados a -70 ºC, fueron cultivados en

medio Schneider más 10 % de suero fetal bovino inactivado por calor. Luego

de cuatro días se valoró la viabilidad del cultivo. Posteriormente, los parásitos

fueron colocados en tubos eppendorf, se centrifugaron a 15.000 r.p.m. por un

minuto con el fin de concentrar los parásitos.

Más tarde, se procedió a preparar el extracto de L. mexicana. Los parásitos

fueron lavados con una solución de NaCl, Na2PO4, NaH2PO4 y Glucosa; y se

retiró todo residuo del medio de cultivo. Los parásitos fueron lisados por

sonicación a 4 ºC en una solución 10 mM Tris-HCl pH 8 más 0.5M EDTA, SC-

29131 y agua ultra destilada. El SC-29131 es un compuesto de inhibidores de

proteasas; al estar presentes en la Leishmania por sonicación son liberadas y

podrían destruir las proteínas del extracto. Luego con la ayuda de Qubit® se

midió la cantidad de proteína. Posteriormente, éste material se lo llevó a una

concentración de 300 µg de proteína y se añadió dodecilsulfato sódico (SDS)

para desnaturalizar las proteínas y se lo calentó durante cinco minutos a 100

ºC obteniendo proteínas lineales.

3.5.2. Detección de anticuerpos IgG1 e IgG2 por Western Blot

Para el ensayo de Western Blot, se preparó un gel de poliacrilamida para

electroforesis (SDS-PAGE) descrita por Laemmli (1970).

En la preparación del gel para la electroforesis se utilizaron placas de 1.5 mm

de grosor. Se prepararon los geles con las siguientes especificaciones: se

13

realizó el gel de resolución al 10 % de acrilamida con 1 % de sodio dodecil

sulfato (SDS), en buffer 10 mM Tris-HCl pH 8.8 y polimerizado con 5 µg

UltraPureTM Temed (invitrogen Lote No. 031101360) en presencia de 5 µg

amonio per sulfato (APS) como catalizador. El gel de apilamiento fue

elaborado al 5 % de acrilamida con 0,5 % de SDS, en buffer 1 M Tris-HCl pH

6,8 y polimerizado con 5 µg UltraPureTM Temed (invitrogen Lote No.

031101360) en presencia de 5 µg APS como catalizador.

Se ensamblaron los geles en las placas de vidrio de la cámara de

electroforesis, vertiendo cuidadosamente, primero el gel de resolución por los

bordes de las placas de vidrio. Luego se procedió a ensamblar el gel de

apilamiento sobre el gel de resolución. Se colocó una peinilla con un pocillo de

10 µl. Se vertió la solución sobre el molde evitando la formación de burbujas.

Se dejó reposar hasta la polimerización del gel; más tarde, se retiró la peinilla,

y montó la placa en el equipo de electroforesis conjuntamente con buffer de

corrido preparado con 25 mM de Tris, 190 mM de glicina y 0,1 % SDS con pH

8,3 (Anexo 4). Posteriormente, se cargó el marcador de peso molecular en el

pocillo formado en el gel de apilamiento; se utilizó 5 µl del marcador SeeBlueR

Plus2 Prestained Estándar (invitrogen Lote No. 1024679) y se adicionó la

misma cantidad de buffer de muestra conformado por una solución de 250 mM

Tris-HCl pH 6,8 con 30 % de glicerol y 5x103 % de azul de bromofenol.

Luego se preparó el extracto de antígenos: se tomó 300 µg del extracto de

Leishmania mexicana en un tubo eppendorf de 1 ml. Se calentó la muestra

durante un minuto a 100 °C, y se lo vertió en el segundo pocillo del gel de

apilamiento. Se realizó el corrido de las proteínas a 50 V durante 5 min hasta

que las proteínas y el marcador se alineasen en el gel de apilamiento. Luego,

se incrementó el voltaje a 180 V hasta que las proteínas recorran el gel de

resolución. Para la visualización de las proteínas se utilizó Coomassie blue R-

250 o se transfirieron a papel de nitrocelulosa para la inmuno detección.

14

Transferencia: Se realizó la transferencia según el método descrito por Towbin

et al., (1979), las proteínas fueron transferidas desde el gel a papel de

nitrocelulosa (Invitrogen Lote No. 11373551), para lo cual se ensambló el gel

con el papel de nitrocelulosa a manera de sándwich. Primero, se colocó una

esponja, luego el papel filtro (Invitrogen Lote No. 11373551) sobre el cual se

colocó el papel de nitrocelulosa, después se colocó el gel con las proteínas y

sobre el gel un segundo papel filtro y otra esponja. Se retiró todas las burbujas

entre las diferentes capas para evitar problemas durante la transferencia. Las

proteínas fueron atrapadas en el papel de nitrocelulosa mediante cambios de

carga, el movimiento fue de zona positiva a zona negativa. Posteriormente, se

procedió a cortar tiras de 2 mm de espesor, del papel, cuidando de no

manipular la superficie donde se encontraban las proteínas. Cada tira con las

proteínas fue marcada con un número de referencia para la identificación de

la muestra (Anexo 5 y 6). Bloqueo: Se colocó cada tira en un tubo de vidrio

con tapa y se bloqueó cada una con la solución de buffer 20 mM Tris pH 7,5

con 150 mM de NaCl y 0,1 % Tween20 (TBS-T) adicionado con 5 % de leche

descremada. Incubación: se dejó en incubación cada tira, durante una hora en

agitación constante. Lavado: Se lavó cada tira de nitrocelulosa tres veces con

la solución de TBS-T previamente preparada, durante cinco minutos en

agitación constante para retirar los residuos de la solución de bloqueo (Anexo

7 y 8). Incubación primaria: Se incubó durante una hora en agitación constante

cada tira con cada uno de los 42 sueros a una concentración de 1:100 en buffer

TBS-T (Anexo 9). Lavado: Luego del proceso de incubación, las tiras fueron

lavadas tres veces con la solución de TBS-T durante cinco minutos en

agitación constate para retirar los residuos del suero. Incubación secundaria:

Finalmente, se incubó los anticuerpos caninos Antidog IgG1 (Bethyl

laboratorios inc. Lote No. A40-120P-20) disuelto 1:10,000 en buffer TBS-T ó

Antidog IgG2 (Bethyl laboratorios inc. Lote No. A40-121P-21) disuelto 1:10,000

en buffer TBS-T; cada isotipo fue evaluado por separado. Se realizó la

incubación toda la noche a temperatura ambiente. Lavado: Luego del proceso

15

de incubación, las tiras fueron lavadas tres veces con la solución de TBS-T

durante cinco minutos en agitación constate para retirar el exceso de

anticuerpo. Lectura de resultados: Para la observación de las bandas se

adicionó Tris-HCl, y el sustrato ClarityTM Western ECL Substrate (Lote

No.102030454) que permitió observar las bandas reveladas (Anexos 10 y 11).

Luego se procedió a determinar el peso molecular de cada una de las bandas

reconocidas mediante la técnica descrita por Garfin (2009) (Anexo 12) .

3.5.3. Detección de anticuerpos IgG1 e IgG2 por ELISA indirecto

Las 42 muestras de suero sanguíneo canino también fueron analizadas con la

técnica serológica ELISA indirecto descrito por Carson y colaboradores (2010)

y Solano-Gallego y colaboradores (2003) que se detalla a continuación:

Sensibilización de placas: Cada pocillo de las placas de ELISA fue

sensibilizado con una concentración de 2x107 parásitos/ml. Los parásitos

previamente fueron lavados con una solución de buffer fosfato salino (PBS

OXOID BR0014G), más glucosa al 2 % y formaldehído al 1 %. Posteriormente,

la solución fue centrifugada a 2500 r.p.m. durante 10 min y re-suspendidos en

un buffer de carbonato bicarbonato (Sigma C3041). Se colocó 2x106 parásitos

(100 µl) por pozo en los 96 pozos de la placa de polipropileno y, se incubó

durante una hora a 37 ºC en una cámara húmeda. Lavado: Se preparó la

solución de lavado (PBS + 0.05 % de Tween20) en concentración 1X; se lavó

tres veces por cinco minutos en agitación para retirar el exceso de antígeno.

Bloqueo: las placas fueron bloqueadas con 200 µl de PBS más Tween20

(PBS-T) con 5 % de leche descremada como agente de bloqueo. Se incubó

en cámara húmeda durante toda la noche a temperatura ambiente. Lavado:

Con la solución de lavado PBS-T 1X, se lavó tres veces por cinco minutos en

agitación para retirar el exceso de solución de bloqueo. Sueros: los sueros

contienen los anticuerpos contra leishmania. Los sueros fueron disueltos a una

16

concentración de 1:100 en solución de PBS-T más 150 mM de cloruro de sodio

para evitar uniones inespecíficas. Lavado: Se lavó tres veces cada uno por

cinco minutos en agitación constante para retirar el exceso de suero.

Conjugado: Se agregaron 100 µl de la solución conjugado, Antidog IgG1

(Bethyl laboratorios inc. Lote No. A40-120P-20) a concentración 1:40,000 o

Antidog IgG2 (Bethyl laboratorios inc. Lote No. A40-121P-21) a concentración

1:80,000, en solución de PBS-T de acuerdo a las especificaciones del

fabricante. En cada pocillo se colocó 100 µl de esta solución y se incubó en

cámara húmeda, durante 1 hora a 37 °C. Lavado: Se retiró el exceso de

conjugado mediante tres lavados de cinco minutos en agitación constante.

Revelado y Lectura: Se dispensó 200µl, de solución sustrato de peroxidasa, o-

fenilenidiamina dihidrocloro (OPD) (Lote No. 080M8204) más peróxido de

hidrógeno, a cada pocillo. Posteriormente, la placa se incubó durante 30 min

a temperatura ambiente. Se realizó la medición mediante el lector de ELISA a

450 nm.

Para analizar los resultados de la prueba ELISA se estableció el punto de corte

entre los valores positivos y negativos de los sueros de la zona endémica. Se

calculó el promedio y la desviación estándar (DS) entre las densidades ópticas

del grupo de sueros negativos no endémicos (De Savigny y Voller, 1980) como

se muestra en la siguiente formula:

!" = $%&'.)*+, + 3)/+,

PC: punto de corte, DO: densidad óptica, DS: desviación estándar, Sn: sueros negativos no endémicos.

3.6. Análisis matemáticos y estadísticos

Los resultados del ensayo de Western Blot permitieron el reconocimiento de

bandas que se revelaron en las tiras del papel de nitrocelulosa, mediante la

17

valoración de la frecuencia de repetición de estas bandas se identificaron los

antígenos relevantes característicos de la respuesta inmune Th1 y Th2.

Además, se analizaron los resultados obtenidos de los sueros positivos de

zona endémica (PE-PCR positivos) y negativos de zona endémica (NE-PCR

negativos), mediante pruebas de correspondencia Kappa, entre los valores de

absorbancia obtenidos en el ELISA indirecto y los sueros con bandas

reveladas en el Western Blot.

18

CAPITULO IV

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. Extracto de Leishmania mexicana

Para la valoración del extracto de Leishmania mexicana (MHOM/BZ/82/Bel

21), se observó mediante el microscopio, motilidad de los parásitos a las 24

horas, 48 horas y 72 horas de crecimiento del cultivo. También, con una

cámara de Neubauer se calculó la concentración de los parásitos

obteniéndose 2,6 x 107 parásitos/ml. Posteriormente, los parásitos fueron

colocados en tubos eppendorf, se centrifugaron a 3.000 r.p.m. por un minuto

con el fin de concentrarlos.

Finalmente, los parásitos lisados por sonicación, llegaron a una concentración

de proteína de 3,1 mg/ml. Las proteínas desnaturalizadas se separaron

mediante la electroforesis en el gel de poliacrilamida (Anexo 13).

El extracto de parásitos y los parásitos formolizados fueron utilizados en los

ensayos de Western Blot y de ELISA indirecto, respectivamente.

4.2. Identificación de las bandas reveladas en Western Blot con isotipo

IgG1 y evaluación de la respuesta inmune mediante ELISA indirecto.

La evaluación de los niveles de inmunoglobulinas IgG1 e IgG2 en los estudios

de respuesta inmune de los caninos ante la leishmaniasis ha sido descrita

anteriormente en investigaciones realizadas por Ulrich y colaboradores,

(1995); Iniesta y colaboradores, (2007) y Neto y colaboradores, (2010), en los

cuales observaron una variación de la respuesta inmunológica entre IgG1

(Th1) e IgG2 (Th2) en grupos de caninos expuestos al parásito Leishmania sp.

de manera natural y experimental.

19

En la prueba de Western Blot realizada en este estudio, se lograron develar

bandas del isotipo IgG1 entre los sueros de la zona endémica. La inmuno-

tinción de la electro-transferencia de las proteínas del extracto (homogenato)

de Leishmania mexicana reveló varios polipéptidos con masas moleculares

calculadas entre los 113 kDa a 6 kDa. De las cuales se observó la frecuencia

de repetición; se obtuvieron veintiuno (21) de los veintiocho (28) sueros de la

zona endémica con polipéptidos inmuno-reconocidos de Leishmania

mexicana, lo cual correspondió al 75 %.

De los veintiuno sueros, 13 pertenecen al grupo positivos endémicos (PE-PCR

positivos) el 93 %; y 8 sueros pertenecen al grupo de negativos endémicos

(NE-PCR negativos) que corresponde al 57%.

Las bandas reveladas con mayor frecuencia tienen los siguientes pesos

moleculares: 58 kDa (6 sueros), 53 kDa (6 sueros), 43 kDa (10sueros), 10 kDa

(10 sueros), 7,3 kDa (8 sueros), 6 kDa (9 sueros), 5 kDa (10 sueros), 4,3 kDa

(7 sueros). También se pudieron identificar las otras bandas polipeptídicas con

los siguientes pesos moleculares: 113 kDa,104 kDa, 95 kDa, 83 kDa, 80 kDa,

73 kDa, 51 kDa, 47 kDa, 36 kDa, 33 kDa, 30 kDa, 20 kDa, 17 kDa, 15,5 kDa,

14 kDa, 12 kDa, 11 kDa, 9 kDa, 8 kDa, 7 kDa, 6,4 kDa, 4,5 kDa, 4,2 kDa como

se muestra en las Tabla 2 y Figura 1. Previamente, Fernández-Pérez (2003)

en su estudio sobre leishmaniasis visceral, reportó la presencia de

polipéptidos reconocidos identificando el antígeno de 67 kDa de peso

molecular, utilizando la inmunoglobulina anti-leishmania IgG1, como la banda

de mayor frecuencia de reconocimiento y mencionó el aparecimiento de

bandas con pesos moleculares entre 10 y 67 kDa (Anexo 14).

También, en este estudio se observó diferencia de reactividad entre las bandas

reconocidas. Se observó mayor reactividad entre los polipéptidos identificados

en las muestras positivas endémicas a diferencia de las bandas reveladas en

las muestras negativas endémicas. Esta variación de reactividad indica

diferencias de concentración de anticuerpos en los sueros de los animales, lo

cual puede estar asociado a la etapa de la infección en la que se encuentra el

20

animal, o a la reacción inmunológica de los animales expuestos al parásito

(Fernández-Pérez et al., 2003; Zaragoza et al., 2003).

De acuerdo a los resultados de correlación por la prueba Kappa entre los

polipéptidos de mayor frecuencia revelados y los verdaderos positivos

endémicos considerados en el estudio, se puede observar una correlación

discreta para las masas moleculares de 43 kDa, 10 kDa, 6 kDa y 5 kDa (Tabla

2). Mientras que para la banda de 7,3 kDa revelada no se presentó correlación

(Anexo 17).

Tabla 2. Frecuencia de inmunoreconocimiento de polipéptidos de Leishmania mexicana por anticuerpos de perros del isotipo IgG1

Ref PM(kDa)

Frecuencia

Ref. PM(kDa)

Frecuencia

Ref PM(kDa)

Frecuencia

PCR+ PCR- PCR+ PCR- PCR+ PCR-

1 113 4/14 1/14 12 36 5/14 0/14 23 8 1/14 0/14

2 104 2/14 0/14 13 33 2/14 3/14 24 7,3 5/14 3/14

3 95 2/14 1/14 14 30 2/14 0/14 25 7 2/14 0/14

4 83 4/14 1/14 15 20 3/14 0/14 26 6,4 1/14 1/14

5 80 5/14 0/14 16 17 1/14 0/14 27 6 6/14 3/14

6 73 0/14 3/14 17 15,5 3/14 0/14 28 5 7/14 3/14

7 58 6/14 0/14 18 14 2/14 0/14 29 4,5 5/14 0/14

8 53 6/14 0/14 19 12 2/14 0/14 30 4,3 4/14 3/14

9 51 1/14 0/14 20 11 3/14 0/14 31 4,2 5/14 1/14

10 47 1/14 0/14 21 10 7/14 3/14

11 43 7/14 3/14 22 9 1/14 0/14

Identificación de bandas: Ref. Referencia de banda en la fig. 1.; PM: peso molecular (kDa).


21

Figura 1. Identificación de los polipéptidos que generan respuesta del isotipo IgG1 en perros frente a antígenos de leishmania. Muestras: sueros positivos endémicos (1-14), sueros negativos endémica (15-28) y sueros negativos no endémica (29- 42).


22

En este estudio también se aplicó un ELISA indirecto como prueba adjunta a

la valoración de la respuesta inmune. En este ensayo el punto de corte (PC)

para el isotipo IgG1 fue calculado con el promedio de los sueros negativos de

zonas no endémicas y el valor obtenido fue 0,120 nm.

De los 28 sueros sometidos a ELISA indirecto, 14 sueros se localizaron con

valores de absorbancia superiores al punto de corte, correspondientes al 50

%. De estas 14 muestras, 8 pertenecen al grupo de sueros positivos

endémicos (67 % del grupo PE-PCR positivo) y 6 pertenecen al grupo de

sueros negativos endémicos (43 % del grupo NE-PCR negativo) (Anexo 16).

Esta variación de respuesta inmunológica para el isotipo IgG1, indica que el 50

% de caninos tienen valores de absorbancia >0,120 nm (PC) presentando así

la respuesta inmunológica humoral de tipo Th1. Esta clase de respuesta se

presenta ante una reacción de tipo protectiva del animal (Fernández-Pérez et

al., 2003; Cruz-Chan et al., 2014). También, De Oliveira Mendes y

colaboradores (2003), evidenció la presencia de inmunoglobulinas IgG1 en

animales naturalmente infectados y asintomáticos, e identificó la capacidad

para contener la enfermedad. También un estudio previo realizado por

Fernández-Pérez y colaboradores (2003), obtuvieron niveles superiores de la

inmunoglobulina IgG1 en perros infectados naturalmente con leishmaniasis sin

presencia de signos clínicos. Por otro lado, Iniesta (2003) reportó la presencia

de respuesta inmune de tipo Th1, en perros diagnosticados como negativos,

en donde mencionó la presencia de animales asintomáticos con mayor

cantidad de inmunoglobulinas del tipo IgG1, en animales diagnosticados como

negativos por pruebas de PCR.

Mientras tanto, se obtuvo 14 sueros con valores de absorbancia por debajo del

punto de corte correspondientes al 50 %, los cuales no presentan una

respuesta inmune aparente por la técnica de ELISA indirecto.

23

El valor de coeficiente Kappa calculado fue de 0,140 obtenido entre los

resultados del Western Blot y ELISA indirecto para la inmunoglobulina tipo IgG1

(anexo 19) Lo cual indica correlación insignificante entre ambos resultados.

Esto puede deberse a los diferentes antígenos utilizados para cada una de las

pruebas realizadas; en la prueba de Western Blot se realizó el análisis de las

bandas de polipéptidos utilizando como antígeno el extracto completo del

parásito, mientras que en la prueba de ELISA indirecto se utilizaron los

antígenos de superficie GP-63 (parásito completo formolizado). Por lo cual, no

se puede esperar una relación directa de los resultados de cada uno.

4.3. Identificación de las bandas reveladas en Western Blot con isotipo IgG2 y evaluación de la respuesta inmune mediante ELISA indirecto.

Los 28 sueros también fueron evaluados por Western Blot con el isotipo IgG2,

en donde se revelaron bandas de polipéptidos específicos para Leishmania

mexicana en 28 sueros y correspondió al 100 % de sueros de la zona

endémica (14 PE-PCR positivos y 14 NE-PCR negativos).

Como muestra en la Figura 2, se identifica menor reactividad en las bandas

reveladas pero mayor número de polipéptidos reconocidos. Las bandas

reveladas con mayor frecuencia tienen las siguientes masas moleculares: 91

kDa (8 sueros), 70 kDa (6 sueros), 51 kDa (6 sueros), 39 kDa (10 sueros), 38

kDa (9 sueros), 34 kDa (9 sueros), 21 kDa (6 sueros) y 11 kDa (6 sueros).

Entre las bandas reconocidas también se presentó mayor reactividad entre los

polipéptidos identificados en las muestras positivas endémicas a diferencia de

las bandas reveladas en las muestras negativas endémicas. Esta menor

reactividad puede sugerir que los animales mantienen niveles de respuesta

inmune bajos, pero constantes ante la presencia del parásito (Solano-Gallego

et al., 2003). En estudios anteriores, Fernández-Pérez (2003) analizó los

anticuerpos de tipo IgG en perros con Leishmaniasis visceral, y reportó la

24

presencia de polipéptidos entre las masas moleculares de 26, 29, 34, 42, 45,

50-57 kDa mayormente reconocidos con inmunoglobulina anti-leishmania

IgG2. En este trabajo también se identificó la banda de 34 kDa, la cual se

presentó solamente entre las muestras positivas de zona endémica. La

presencia de bandas de polipéptidos con repeticiones en la mayoría de

muestras evaluadas sugieren la presencia de polipéptidos específicos en el

extracto que podrían servir de referencia para el diagnóstico de la

Leishmaniasis canina.

En los resultados, también se lograron identificar bandas de: 83 kDa, 61 kDa,

53 kDa, 47 kDa, 43 kDa, 30 kDa, 29 kDa, 24 kDa, 23 kDa, 20 kDa, 19 kDa, 17

kDa, 16 kDa, 15 kDa, 14 kDa, 12 kDa, 10,4 kDa, 10 kDa, 9 kDa, 8 kDa, 7 kDa,

6,7 kDa con menor frecuencia de repetición entre los sueros (Anexo 15).

De acuerdo a los resultados de correlación por la prueba Kappa entre los

polipéptidos de mayor frecuencia revelados y los verdaderos positivos

endémicos considerados en el estudio se puede observar una correlación

discreta para la masa molecular de 91 kDa, mientras que no existió correlación

con las masas moleculares de 39 kDa y 38 kDa (Tabla 3). Sin embargo, se

observó que la banda de polipéptido de 34 kDa tuvo correlación sustancial con

un valor de coeficiente kappa de 0,6429 (Anexo 18).

25

Tabla 3. Frecuencia de inmunoreconocimiento de polipéptidos de Leishmania

mexicana por anticuerpos de perros del isotipo IgG2

Ref. PM(kDa)Frecuencia

Ref. PM(kDa)Frecuencia

PCR+ PCR- PCR- PCR+

1 91 6/14 2/14 17 20 0/14 1/14

2 83 2/14 0/14 18 19 5/14 0/14

3 70 3/14 3/14 19 17 1/14 0/14

4 61 1/14 3/14 20 16 1/14 0/14

5 53 2/14 2/14 21 15 2/14 2/14

6 51 5/14 1/14 22 14 0/14 1/14

7 47 2/14 2/14 23 12 2/14 1/14

8 43 1/14 0/14 24 11 3/14 3/14

9 39 7/14 7/14 25 10,4 1/14 0/14

10 38 3/14 6/14 26 10 4/14 0/14

11** 34 9/14 0/14 27 9 2/14 0/14

12 30 1/14 2/14 28 8 1/14 0/14

13 29 4/14 0/14 29 7 3/14 0/14

14 24 2/14 2/14 30 6,7 1/14 1/14

15 23 4/14 0/14

16 21 4/14 2/14

Identificación de bandas: Ref. Referencia de banda en fig. 4.2.; PM: peso molecular (kDa).


26

Figura 2. Identificación de los polipéptidos que generan respuesta del isotipo IgG2 en perros frente a antígenos de leishmania Muestras: sueros positivos endémicos (1-14), sueros negativos endémica (15-28) y sueros negativos no

endémica (29-42) + banda de mayor frecuencia (34 kDa). Elaborado por: La Autora

27

Para el isotipo IgG2, también se aplicó a las 28 muestras una prueba ELISA

indirecto como complemento de estudio. Con lo cual permitió evaluar si se

presentó una respuesta inmune de tipo Th2. El valor calculado del punto de

corte fue de 0,935nm que fue calculado con el promedio de los valores de

absorbancia obtenidos de los sueros negativos de zona no endémica.

De los 28 sueros de zona endémica, se obtuvo como resultado un (1) suero,

del grupo de positivos endémicos (PE-PCR positivos), con valor de

absorbancia por encima del punto de corte (anexo 16). Este suero representó

el 5% y evidenció una reacción inmune de tipo Th2, evidenciando la presencia

de infección activa (Fernández-Pérez et al., 2003). De acuerdo a estudios

previos realizados por Reis y colaboradores (2006) y Cruz-Chan y

colaboradores (2014) la presencia de la respuesta Th2 ante la leishmaniasis

canina es un indicador de infección activa y esta relacionada con la mayor

susceptibilidad del animal a la enfermedad (Fernández-Pérez et al., 2003;

Solano-Gallego et al., 2001). También se ha observado este tipo de repuesta

Th2 en animales con altas cargas del parásito circulante (Reis et al., 2006).

Los sueros restantes (41) tuvieron valores de absorbancia menores al punto

de corte, lo cual muestra que no existió respuesta ante los antígenos. De

acuerdo al estudio realizado por Iniesta y colaboradores (2007) y Solano-

Gallego y colaboradores (2001) se menciona que el uso del extracto purificado

de los parásitos en el ensayo de ELISA indirecto presenta mejores resultados

para identificar las diferentes inmunoglobulinas IgG.

El coeficiente kappa calculado entre los resultados obtenidos de las pruebas

Western Blot y ELISA indirecto para la inmunoglobulina IgG2 fue insignificante.

Este resultado se debe a la diferencia entre los antígenos utilizados para cada

28

una de las pruebas, similar a los resultados obtenidos con la inmunoglobulina

IgG1 (Anexo 20).

Finalmente, en este trabajo de investigación, se logró identificar la presencia

de una banda polipeptídica de 34 kDa con la inmunoglobulina IgG2 mediante

la prueba de Western Blot con alto grado de correlación con el grupo de

muestras positivas endémicas. Este polipéptido ya fue descrito anteriormente

en un estudio en caninos infectados con Leishmania infantum utilizando el anti-

anticuerpo IgG2 (Fernández-Pérez et. al. 2003). Es así que, se podría llegar a

considerar a este polipéptido como un posible marcador de la presencia del

parásito en caninos, para lo cual se deberian plantear trabajos posteriores para

evaluar esta proteína y purificarla. También con la evaluación mediante la

prueba ELISA indirecto se observó principalmente una respuesta de tipo

protectiva IgG1 (Th1) en los caninos de zonas endémicas. Este tipo de

respuesta se presenta en animales sin presencia de sintomatología clínica y

procedentes de zonas endémicas a la leishmaniasis. Con lo cual, se sugiere

proponer que los caninos procedentes de estas zonas en el Ecuador están

logrando controlar la enfermedad o la superan en etapas tempranas de

infección evitando así el aparecimiento de signos clínicos.

Para poder establecer la Leishmaniasis canina como una potencial zoonosis

en el Ecuador se deben considerar varios factores referentes a la enfermedad,

como la preferencia alimentaria del vector; la capacidad de los caninos para

superar la enfermedad y valorar el estatus clínico e inmunológico de los

animales asintomáticos identificando si mantienen al parásito o si lo eliminan.

Se plantea como hipótesis: si los caninos de zonas endémicas en el Ecuador

tienen la capacidad de superar la infección con Leishmania sp., para lo cual se

debería evaluar también la presencia de citoquinas Th1 y realizar un estudio

de la evolución de los animales infectados.

29

CAPITULO V

CONCLUSIONES

• Se identificaron varias bandas polipeptídicas que generaron una

respuesta de anticuerpos de los isotipos IgG1 e IgG2 mediante la

aplicación de la prueba de Western Blot. Entre las bandas reveladas

destaca el polipéptido de 34 kDa inmuno-reconocidos por anticuerpos

del isotipo IgG2 con alto grado de correlación con las muestras positivas

endémicas.

• Se evaluó los extractos del parásito Leishmania, con lo cual se detectó

la presencia de anticuerpos del isotipo IgG1 asociado a una respuesta

de tipo protectiva mediante la prueba de ELISA. Se requiere evaluar

otros compuestos como citoquinas Th1 para corroborar la presencia de

una respuesta inmune del tipo Th1 en los caninos evaluados.

• Los resultados de las pruebas de Western Blot y ELISA en la evaluación

de la Leishmaniasis en perros infectados naturalmente no generaron

correlación significante.

30

ANEXOS

Anexo 1.

Lista de materiales utilizados en el ensayo

MATERIALES FÍSICOS

− Acrilamida − Agua destilada − Artículos de escritorio − Azul de Coomassie R-250 − Bromofenol Azul Fisher Scietific Lote 100651 - Buffer Carbonato- Bicarbonato Laboratorio SIGMA Lote C3041-

100CAP − Butanol − Canaletas de plástico − ClarityTM Western ECL Substrato Lote102030454 − Cloruro de sodio − Esponjas para cámara de electroforesis − Glicina − Guantes de nitrilo − Laminas de nitrocelulosa Invitrogen Lote. 11373551 − Leche descremada − Medio Schneider de cultivo - Micro placas para ELISA marca gagner de 96 pocillos − Papel filtro Invitrogen Lote. 11373551 - Peróxido de Hidrogeno − Persulfato de amonio − Pipeta Eppendorf de 10 ul (serie 359711Z) − Pipeta Eppendorf de 100 ul (serie 2541907) − Pipeta Eppendorf multicanal 200 ul (Serie P36854C) − Puntas 10 ul para pipeta Eppendorf − Puntas 100 ul para pipeta Eppendorf − SeeBlueR Plus2 Prestained Estándar invitrogen Lote 1024679 - Solución de Conjugado IgG1 (Peróxido de rábano con conjugado

de anticuerpo monoclonal IgG1 anti-Dog) Lote No. A40-120P-20 de los Laboratorios Bethyl

- Solución de Conjugado IgG2 (Peróxido de rábano con conjugado de anticuerpo monoclonal IgG2 anti-Dog) Lote No. A40-121P-21 de los Laboratorios Bethyl

- Solución de Lavado PBS (OXOID P4809) - Solución de revelado-Sustrato O-Phenylenediamine

31

dihydrochloride Laboratorio SIGMA − Solución SDS 10 % − Suero Fetal Bovino SIGMA − Toallas desechables absorbentes − Tris-HCl Lote 0000121534 − Tubos de vidrio 10 ml − Tubos Eppendorf de 2 ml y 5 ml − Tubos Fálcon 10 ml y 50 ml - Tween al 20% − UltraPureTM Temed invitrogen Lote 031101360 MATERIALES BIOLÓGICOS

- Cultivo de parásitos Leishmania mexicana (MHOM/BZ/82/Bel 21) - Extracto de proteínas de Leishmania mexicana (MHOM/BZ/82/Bel

21) - Muestras de suero sanguíneo canino conservadas a 4°C EQUIPOS

- Balanza - Cámara de electroforesis C.B.S. - Computador HP - Equipo para Blotting C.B.S. - Impresora HP - Incubadora Marca Memmert Serie I3267540 - Lector de luminiscencia - Lector de placa ELISA, Thermo Fisher Scientific Tipo 355 Serie

511181177 - Lector Multiparametros pH HACH Serie 8508850 Lot 12048 - QubitR2.0 Fluorometro invitrogen Seri Q32866 - Temporizador LabAlert, Serie C01Q

32

Anexo 2.

Códigos Sueros Caninos utilizados en Western Blot para detección de inmunoglobulinas IgG1 e IgG2.

Positivos endémico Negativos endémico

Negativos no endémico

SC1 178 SC15 322 SC29 001

SC2 179 SC16 323 SC30 002

SC3 196 SC17 320 SC31 003

SC4 199 SC18 331 SC32 004

SC5 334 SC19 318 SC33 005

SC6 347 SC20 589 SC34 006

SC7 551 SC21 590 SC35 007

SC8 500 SC22 591 SC36 008

SC9 497 SC23 592 SC37 009

SC10 629 SC24 593 SC38 010

SC11 120 SC25 180 SC39 011

SC12 129 SC26 186 SC40 012

SC13 132 SC27 187 SC41 013

SC14 146 SC28 195 SC42 014

Elaborado por: Autora

33

Anexo 3.

Registro de los sueros utilizados para la evaluación

No. RAZA EDAD CLINIC

O FROTI

S

IgG1 ELIS

A

IgG2 ELIS

A

IgG1 WB

IgG2 WB PCR Provincia Cantón

1 Mestiza 1año Pos Pos Pos Neg Pos Neg Pos Pichincha Pedro Vicente

Maldonado

2 Mestiza NA Neg Pos Pos Neg Pos Pos Pos Pichincha Pedro Vicente Maldonado

3 Mestiza 2 años Neg Pos Pos Neg Neg

Neg Pos Napo Gonzalo Díaz

de Pineda

4 Mestiza NA Neg Pos Neg Neg Neg

Neg Pos Pichincha Pedro Vicente

Maldonado

5 Mestizo 5 años Neg Pos Neg Neg Neg Pos Pos Orellana García Moreno

6 Dálmata NA Neg Pos Pos Neg Neg Pos Pos Orellana García Moreno

7 Mestizo 8 meses Neg Pos Neg Neg Neg Pos Pos Orellana García Moreno

8 Mestiza 8 años Neg Pos Neg Pos Pos Pos Pos Napo Gonzalo Díaz de Pineda

9 Mestiza 1 año Neg Pos Neg Neg Neg Pos Pos Napo Gonzalo Díaz de Pineda

10 Mestizo 6 meses Neg Pos Neg Neg Neg

Neg Pos Orellana García Moreno

11 Mestizo 1 Neg Pos Neg Neg Neg

Neg Pos Sucumbío

s Aguas Negras

12 Mestizo 10meses Neg Pos Pos Neg Neg

Neg Pos Sucumbío

s Aguas Negras

13 Mestiza 1 año Neg Pos Neg Neg Pos Pos Pos Napo Gonzalo Díaz de Pineda

14 Mestiza NA Neg Pos Neg Neg Neg Pos Pos Pichincha Pedro Vicente

Maldonado

15 Mestizo 3 Neg Neg Pos Neg Neg Pos Ne

g Sucumbio

s Aguas Negras

16 Mestizo 1 Neg Neg Pos Neg Neg Pos Ne

g Sucumbio

s Aguas Negras

17 Mestizo 2 Neg Neg Neg Neg Neg Pos Ne

g Sucumbio

s Aguas Negras

18 Mestizo 2 Neg Neg Neg Neg Neg Pos Ne

g Sucumbio

s Aguas Negras

19 Mestizo 6 meses Neg Neg Pos Neg Neg

Neg

Neg

Sucumbios Aguas Negras

20 Mestizo 5 Neg Neg Pos Neg Neg

Neg

Neg

Sucumbios Aguas Negras

21 Mestizo 1,5 Neg Neg Neg Neg Neg

Neg

Neg Orellana Garcia Moreno

22 Mestizo NA Neg Neg Neg Neg Neg

Neg

Neg Pichincha Pedro Vicente

Maldonado

23 Mestizo 6meses Neg Neg Neg Neg Neg

Neg


24 Mestizo 3 años Neg Neg Pos Neg Neg

Neg


25 Mestizo 2 años Neg Neg Pos Neg Neg

Neg


26 Mestizo 2 años Neg Neg Neg Neg Neg

Neg


27 Mestizo NA NA Neg Pos Neg Neg

Neg

Neg Pichincha Pedro Vicente

Maldonado

28 Mestizo NA NA Neg Pos Neg Neg Pos Ne

g Pichincha Pedro Vicente Maldonado

34

29 French P 2 años Neg Neg Neg Neg Neg

Neg NA Pichincha Quito

30 Mestiza 1,5 año Neg Neg Neg Neg Neg


31 French P 1 año Neg Neg Neg Neg Neg


32 Bulldog 7 meses Neg Neg Neg Neg Neg


33 Mestiza 3 años Neg Neg Neg Neg Neg


34 Mestizo 1 año Neg Neg Neg Neg Neg


35 French P 2 años Neg Neg Neg Neg Neg


36 Mestiza 10 meses Neg Neg Neg Neg Ne

g Neg NA Pichincha Quito



38 Weimaraner 2 años Neg Neg Neg Neg Ne

g Neg NA Pichincha Quito

39 Mestiza 9 meses Neg Neg Neg Neg Neg




41 Labrador 4 años Neg Neg Neg Neg Neg


42 Labrador 2 años Neg Neg Neg Neg Neg


**Datos obtenidos del banco de sueros del Instituto de Investigación en Salud Publica y Zoonosis.


35

Anexo 4.

Preparación de geles de acrilamida cámara para Western Blot.

Elaborado por: La Autora Anexo 5.

Preparación de transferencia – Blotting


36

Anexo 6.

Transferencia de proteínas a papel de nitrocelulosa

Elaborado por: La Autora Anexo 7.

Preparación de tiras de nitrocelulosa marcadas


37

Anexo 8. Sueros a evaluar


Anexo 9. Incubación de sueros


Anexo 10. Revelado de de bandas mediante sustrato


38

Anexo 11.

Lectura de tiras de nitrocelulosa


Anexo 12. Cálculo del peso molecular de bandas reveladas por Western Blot

RF: distancia de migración; PM: peso molecular

PMmarcador LogPM RF RFMuestraProblema LogPMbandaproblema PM

198 5,288267031 0,133 0,36 3,75784 42,962 4,127134385 0,213 0,386666667 3,66948 39,249 3,891820298 0,307 0,16 4,42054 83,138 3,63758616 0,400 0,4 3,6253 37,528 3,33220451 0,507 0,333333333 3,8462 46,817 2,833213344 0,627 0,213333333 4,24382 69,714 2,63905733 0,787 0,306666667 3,93456 51,16 1,791759469 0,880 0,12 4,55308 94,9


y=-3,7996x+5,2728R²=0,92458

0123456

0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000

LOGPM

RF

LogPM

39

Anexo 13.

Electroforesis – desplazamiento de proteínas

Elaborado por: La Autor

40

Anexo 14.

Bandas observadas entre los grupos de sueros problema

BANDASIDENTIFICADAS–IgG1 SUERO PCR 43kDa 10kDa 7,3kDa 6kDa 5kDa

1 P X 2 P 3 P 4 P 5 P X X X 6 P X X X7 P X X X X X8 P X X X9 P X X X X X10 P 11 P X X X X X12 P X X X X X13 P 14 P X X X15 N X X X X X16 N X X X X X17 N 18 N 19 N 20 N 21 N 22 N 23 N 24 N 25 N 26 N 27 N X X X X X28 N


41

Anexo 15.

Bandas observadas entre los grupos de sueros problema

BANDASIDENTIFICADAS–IgG2SUERO PCR 91kDa 39kDa 38kDa 34kDa

1 P X2 P X X3 P X X4 P X X5 P X6 P X X7 P X X8 P x X9 P X10 P x 11 P X x 12 P x 13 P X x 14 P x 15 N X x 16 N x 17 N x 18 N 19 N X x 20 N 21 N x 22 N x 23 N x 24 N x 25 N x 26 N x 27 N 28 N x

Elaboradopor:LaAutora

42

Anexo 16.

Resultados de densidades ópticas en ELISA indirecto

POSITIVOSENDEMICOS NEGATIVOSENDEMICOS NEGATIVOSNOENDEMICOS

No IgG1 IgG2 No IgG1 IgG2 No IgG1 IgG2

1 0,124 0,120 0,624 0,971 15 0,193 0,120 0,635 0,971 29 0,059 0,120 0,660 0,971

2 0,153 0,575 16 0,147 0,921 30 0,074 0,401

3 0,133 0,721 17 0,112 0,470 31 0,064 0,794

4 0,065 0,326 18 0,109 0,562 32 0,082 0,419

5 0,139 0,497 19 0,226 0,469 33 0,059 0,543

6 0,141 0,921 20 0,156 0,583 34 0,064 0,657

7 0,061 0,210 21 0,107 0,463 35 0,062 0,358

8 0,088 1,573 22 0,069 0,160 36 0,104 0,668

9 0,106 0,295 23 0,102 0,582 37 0,100 0,536

10 0,117 0,482 24 0,244 0,577 38 0,050 0,470

11 0,102 0,569 25 0,130 0,419 39 0,034 0,345

12 0,145 0,408 26 0,106 0,793 40 0,036 0,559

13 0,083 0,559 27 0,133 0,733 41 0,037 0,462

14 0,103 0,658 28 0,135 0,637 42 0,034 0,608

Elaboradopor:LaAutora

43

Anexo 17.

Tabla 4. Correspondencia Kappa Resultados de IgG1 por (Western Blot ) Bandas Reveladas con mayor frecuencia PM

43kDa 10kDa 7,3kDa 6kDa 5kDa

WESTERNBLOT

43kDa POS NEG Total

PCRPOS 7 7 14NEG 3 11 14Total 10 18 28

Po 0,642857143 Pe 0,5

Coeficientek 0,2857 DISCRETO

WESTERNBLOT

10kDa POS NEG Total

PCRPOS 8 6 14NEG 3 11 14Total 11 17 28

Po 0,678571429 Pe 0,5


WESTERNBLOT

7,3kDa POS NEG Total

PCRPOS 5 9 14NEG 3 11 14Total 8 20 28

Po 0,571428571

Pe 0,5

Coeficientek 0,1429 INSIGNIFICANTE

44

WESTERNBLOT

6kDa POS NEG Total

PCRPOS 6 8 14NEG 3 11 14Total 9 19 28

Po 0,607142857

Pe 0,5


WESTERNBLOT5kDa POS NEG Total

PCRPOS 7 7 14NEG 3 11 14Total 10 18 28

Po 0,642857143

Pe 0,5



45

Anexo 18.

Tabla 5. Correspondencia Kappa Resultados de IgG2 por (Western Blot ) Bandas Reveladas con mayor frecuencia (PM)

91kDa 39kDa 38kDa 34kDa

WESTERNBLOT

91kDa POS NEG TotalPCR POS 6 8 14

NEG 2 12 14Total 8 20 28

Po 0,642857143

Pe 0,5


WESTERNBLOT


NEG 7 7 14Total 10 18 28

Po 0,357142857

Pe 0,5

Coeficientek -0,2857 SINACUERDO

WESTERNBLOT


NEG 4 10 14Total 8 20 28

Po 0,5

Pe 0,5

Coeficientek 0 SINACUERDO

46

WESTERNBLOT


NEG 0 14 14Total 9 19 28

Po 0,821428571

Pe 0,5

Coeficientek 0,6429 SUSTANCIAL**


Anexo 19.

Tabla 6. Correspondencia Kappa (ELISA y Western Blot) Resultados IgG1

ELISA

POS NEG TOTALWB POS 11 11 22

NEG 3 3 6TOTAL 14 14 28

Po 0,5

Pe 0,418367347

Coeficientek 0,1401 INSIGNIFICANTE


47

Anexo 20

Tabla 7. Correspondencia Kappa (ELISA y Western Blot) Resultados IgG2

ELISA POS NEG TOTAL

WB POS 1 27 28NEG 0 0 0TOTAL 1 27 28

Po 0,035714286

Pe 0,035714286

Coeficientek 0 INSIGNIFICANTE


48

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Alvar, J., Cañavate, C., Molina, R., Moreno, J., Nieto, J., 2004. Canine

leishmaniasis. Adv. Parasitol. 57, 1–88. doi:10.1016/S0065-

308X(04)57001-X

Bray, D.P., Hamilton, J.G., 2013. Insecticide-impregnated netting as a

potential tool for long-lasting control of the leishmaniasis vector

Lutzomyia longipalpis in animal shelters. Parasit. Vectors 6, 133.

doi:10.1186/1756-3305-6-133

Buxbaum, L.U., 2013. Leishmania mexicana Infection Induces IgG to Parasite

Surface Glycoinositol Phospholipids that Can Induce IL-10 in Mice and

Humans. PLoS Negl. Trop. Dis. 7. doi:10.1371/journal.pntd.0002224

Cabral, M., O’Grady, J.E., Gomes, S., Sousa, J.C., Thompson, H., Alexander,

J., 1998. The immunology of canine leishmaniosis: Strong evidence for a

developing disease spectrum from asymptomatic dogs. Vet. Parasitol.

76, 173–180. doi:10.1016/S0304-4017(97)00208-2

Calvopina, M., Armijos, R.X., Hashiguchi, Y., 2004. Epidemiology of

leishmaniasis in Ecuador: current status of knowledge - A review. Mem.

Inst. Oswaldo Cruz 99, 663–672. doi:10.1590/S0074-

02762004000700001

49

Cardoso, L., Schallig, H.D.F.H., Cordeiro-da-Silva, A., Cabral, M., Alunda,

J.M., Rodrigues, M., 2007. Anti-Leishmania humoral and cellular immune

responses in naturally infected symptomatic and asymptomatic dogs.

Vet. Immunol. Immunopathol. 117, 35–41.

doi:10.1016/j.vetimm.2007.01.014

Carson, C., Quinnell, R.J., Day, M.J., Courtenay, O., 2010. Comparison of

monoclonal and polyclonal antibodies for the detection of canine IgG1

and IgG2, and associations with infection outcome in Leishmania

infantum naturally infected dogs. Vet. Immunol. Immunopathol. 133,

264–268. doi:10.1016/j.vetimm.2009.07.017

Chang, K.P., Dwyer, D.M., 1976. Multiplication of a human parasite

(Leishmania donovani) in phagolysosomes of hamster macrophages in

vitro. Science (80-. ). 193, 678–680. doi:10.1126/science.948742

Cruz-Chan, J.V., Aguilar-Cetina, A.D.C., Villanueva-Lizama, L.E., Martínez-

Vega, P.P., Ramírez-Sierra, M.J., Rosado-Vallado, M.E., Guillermo-

Cordero, J.L., Dumonteil, E., 2014. A canine model of experimental

infection with Leishmania (L.) mexicana. Parasit. Vectors 7, 361.

doi:10.1186/1756-3305-7-361

Dantas-Torres, F., de Paiva-Cavalcanti, M., Figueredo, L.A., Melo, M.F., da

Silva, F.J., da Silva, A.L., Almeida, E.L., Brandão-Filho, S.P., 2010.

50

Cutaneous and visceral leishmaniosis in dogs from a rural community in

northeastern Brazil. Vet. Parasitol. 170, 313–317.

doi:10.1016/j.vetpar.2010.02.019

Dantas-Torres, F., Otranto, D., 2016. Best Practices for Preventing Vector-

Borne Diseases in Dogs and Humans. Trends Parasitol. 32, 43–55.

doi:10.1016/j.pt.2015.09.004

David, J.R., Stamm, L.M., Bezerra, H.S., Souza, R.N., Killick-Kendrick, R.,

Lima, J.W.O., 2001. Deltamethrin-impregnated dog collars have a potent

anti-feeding and insecticidal effect on Lutzomyia longipalpis and

Lutzomyia migonei. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 96, 839–847.

doi:10.1590/S0074-02762001000600018

De Oliveira Mendes, C., Paraguai De Souza, E., Borja-Cabrera, G.P., Melo

Batista, L.M., Aparecida Dos Santos, M., Parra, L.E., Menz, I., Palatnik,

M., Palatnik De Sousa, C.B., 2003. IgG1/IgG2 antibody dichotomy in

sera of vaccinated or naturally infected dogs with visceral leishmaniosis.

Vaccine 21, 2589–2597. doi:10.1016/S0264-410X(03)00046-X

de Savigny, D., Voller, A., 1980. The communication of ELISA data from

laboratory to clinician. J. Immunoassay 1, 105–128.

doi:10.1080/01971528008055779

51

Desjeux, P., 2004. Leishmaniasis: Current situation and new perspectives.

Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 27, 305–318.

doi:10.1016/j.cimid.2004.03.004

Esparta, I.N., Negrbn, E., Rodriguez, N., I, O.Z., Ulrich, M., Centeno, M.,

Rodriguez, V., Barrios, R.M., Belizario, D., Reed, S., Convit, J., 2000.

Canine visceral leishmaniasis on Margarita 484–487.

Fernández-Pérez, F.J., Gómez-Muñoz, M.T., Méndez, S., Alunda, J.M., 2003.

Leishmania-specific lymphoproliferative responses and IgG1/IgG2

immunodetection patterns by Western blot in asymptomatic, symptomatic

and treated dogs. Acta Trop. 86, 83–91. doi:10.1016/S0001-

706X(03)00004-4

Ferroglio, E., Centaro, E., Mignone, W., Trisciuoglio, A., 2007. Evaluation of

an ELISA rapid device for the serological diagnosis of Leishmania

infantum infection in dog as compared with immunofluorescence assay

and Western blot. Vet. Parasitol. 144, 162–166.

doi:10.1016/j.vetpar.2006.09.017

Figueredo, L.A., Paiva-Cavalcanti, M. de, Almeida, E.L., Brandão-Filho, S.P.,

Dantas-Torres, F., 2012. Clinical and hematological findings in

Leishmania braziliensis-infected dogs from Pernambuco, Brazil. Rev.

Bras. Parasitol. Veterinária 21, 418–420.

52

Francino, O., Altet, L., Sánchez-Robert, E., Rodriguez, A., Solano-Gallego, L.,

Alberola, J., Ferrer, L., Sánchez, A., Roura, X., 2006. Advantages of real-

time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis.

Vet. Parasitol. 137, 214–221. doi:10.1016/j.vetpar.2006.01.011

Garfin, D.E., 2009. Chapter 29 One-Dimensional Gel Electrophoresis1.

Methods Enzymol. 463, 497–513. doi:10.1016/S0076-6879(09)63029-9

Iniesta, L., Gállego, M., Portús, M., 2007. Idiotype expression of IgG1 and

IgG2 in dogs naturally infected with Leishmania infantum. Vet. Immunol.

Immunopathol. 119, 189–197. doi:10.1016/j.vetimm.2007.05.006

Iowa State University/College of Veterinary Medicine, 2009. Leishmaniasis

(Cutaneous and Visceral). Iowa State Univ. 1–11.

Kaszak, I., Planellas, M., Dworecka-Kaszak, B., 2015. Canine leishmaniosis -

an emerging disease. Ann. Parasitol. 61, 69–76.

Kato, H., Gomez, E.A., Martini-Robles, L., Muzzio, J., Velez, L., Calvopiña,

M., Romero-Alvarez, D., Mimori, T., Uezato, H., Hashiguchi, Y., 2016.

Geographic Distribution of Leishmania Species in Ecuador Based on the

Cytochrome B Gene Sequence Analysis. PLoS Negl. Trop. Dis. 10, 1–

10. doi:10.1371/journal.pntd.0004844

Kato, H., Uezato, H., Katakura, K., Calvopiña, M., Marco, J.D., Barroso, P.A.,

53

Gomez, E.A., Mimori, T., Korenaga, M., Iwata, H., Nonaka, S.,

Hashiguchi, Y., 2005. Detection and identification of Leishmania species

within naturally infected sand flies in the andean areas of ecuador by a

polymerase chain reaction. Am. J. Trop. Med. Hyg. 72, 87–93.

doi:72/1/87 [pii]

Laemmli, U.K., K., U., 1970. Cleavage of Structural Proteins during the

Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature 227, 680–685.

doi:10.1038/227680a0

López-Céspedes, A., Longoni, S.S., Sauri-Arceo, C.H., Sánchez-Moreno, M.,

Rodríguez-Vivas, R.I., Escobedo-Ortegón, F.J., Barrera-Pérez, M. a.,

Bolio-González, M.E., Marín, C., 2012. Leishmania spp. Epidemiology of

Canine Leishmaniasis in the Yucatan Peninsula. Sci. World J. 2012, 1–

10. doi:10.1100/2012/945871

Loría-Cervera, E.N., Andrade-Narváez, F.J., 2014. Modelos animales para el

estudio de la inmunología de la leishmaniosis. Rev. Inst. Med. Trop. Sao

Paulo 56, 1–11. doi:10.1590/S0036-46652014000100001

Montalvo, a M., Fraga, J., Monzote, L., Montano, I., De Doncker, S.,

Dujardin, J.C., Van der Auwera, G., 2010. Heat-shock protein 70 PCR-

RFLP: a universal simple tool for Leishmania species discrimination in

the New and Old World. Parasitology 137, 1159–1168.

54

doi:10.1017/S0031182010000089

Neto, R.G.T., Giunchetti, R.C., Carneiro, C.M., Vitor, R.W. de A., Coura-Vital,

W., Quaresma, P.F., Ker, H.G., Melo, L.A. de, Gontijo, C.M.F., Reis,

A.B., 2010. Relationship of Leishmania-specific IgG levels and IgG

avidity with parasite density and clinical signs in canine leishmaniasis.

Vet. Parasitol. 169, 248–257. doi:10.1016/j.vetpar.2010.01.023

Olalla, H.R., Velez, L.N., Kato, H., Hashiguchi, K., Caceres, A.G., Gomez,

E.A., Zambrano, F.C., Romero-Álvarez, D.A., Guevara, A.G., Hashiguchi,

Y., 2015. An analysis of reported cases of leishmaniasis in the southern

Ecuadorian Amazon region, 1986-2012. Acta Trop. 146, 119–126.

doi:10.1016/j.actatropica.2015.03.015

Oliveira, T.N.A., Guedes, P.E.B., Souza, G.B., Carvalho, F.S., Alberto Carlos,

R.S., Albuquerque, G.R., Munhoz, A.D., Silva, F.L., 2016. Diagnosis and

epidemiology of canine leishmaniasis in southeastern Bahia, Brazil.

Genet. Mol. Res. 15, 1–10. doi:10.4238/gmr.15038684

Oryan, A., Akbari, M., 2016. Worldwide risk factors in leishmaniasis. Asian

Pac. J. Trop. Med. 9, 925–932. doi:10.1016/j.apjtm.2016.06.021

Otranto, D., Dantas-Torres, F., 2013. The prevention of canine leishmaniasis

and its impact on public health. Trends Parasitol. 29, 339–345.

55

doi:10.1016/j.pt.2013.05.003

Reguera, R.M., Mor??n, M., P??rez-Pertejo, Y., Garc??a-Estrada, C.,

Bala??a-Fouce, R., 2016. Current status on prevention and treatment of

canine leishmaniasis. Vet. Parasitol. 227, 98–114.

doi:10.1016/j.vetpar.2016.07.011

Reis, A.B., Teixeira-Carvalho, A., Vale, A.M., Marques, M.J., Giunchetti, R.C.,

Mayrink, W., Guerra, L.L., Andrade, R.A., Corrêa-Oliveira, R., Martins-

Filho, O.A., 2006. Isotype patterns of immunoglobulins: Hallmarks for

clinical status and tissue parasite density in brazilian dogs naturally

infected by Leishmania (Leishmania) chagasi. Vet. Immunol.

Immunopathol. 112, 102–116. doi:10.1016/j.vetimm.2006.02.001

Sacks, D.L., Perkins, P. V, 1984. Identification of an infective stage of

Leishmania promastigotes. Science 223, 1417–9.

doi:10.1126/science.6701528

Sasani, F., Javanbakht, J., Samani, R., Shirani, D., 2016. Canine cutaneous

leishmaniasis. J. Parasit. Dis. 40, 57–60. doi:10.1007/s12639-014-0444-

4

Silvestrini, P., Batchelor, D., Allenspach, K., Maunder, C., Seth, M., Mas, A.,

Hill, T., Serrano, G., Roura, X., Planellas, M., German, A.J., Pastor, J.,

56

2016. Clinical leishmaniasis in dogs living in the UK. J. Small Anim.

Pract. 2008, 1–6. doi:10.1111/jsap.12503

Solano-Gallego, L., Riera, C., Roura, X., Iniesta, L., Gallego, M., Valladares,

J.E., Fisa, R., Castillejo, S., Alberola, J., Ferrer, L., Arboix, M., Portús,

M., 2001. Leishmania infantum-specific IgG, IgG1 and IgG2 antibody

responses in healthy and ill dogs from endemic areas: Evolution in the

course of infection and after treatment. Vet. Parasitol. 96, 265–276.

doi:10.1016/S0304-4017(00)00446-5

Solano-Gallego, L., Rodriguez, A., Iniesta, L., Arboix, M., Portus, M., Alberola,

J., 2003. Detection of Anti-Leishmania Immunoglobulin G Antibodies in

Urine Specimens of Dogs with Leishmaniasis. Clin. Vaccine Immunol. 10,

849–855. doi:10.1128/CDLI.10.5.849-855.2003

Torrecilha, R.B.P., Utsunomiya, Y.T., Bosco, A.M., Almeida, B.F., Pereira,

P.P., Narciso, L.G., Pereira, D.C.M., Baptistiolli, L., Calvo-Bado, L.,

Courtenay, O., Nunes, C.M., Ciarlini, P.C., 2016. Correlations between

peripheral parasite load and common clinical and laboratory alterations in

dogs with visceral leishmaniasis. Prev. Vet. Med. 132, 83–87.

doi:10.1016/j.prevetmed.2016.08.006

Towbin, H., Staehelint, T., Gordon, J., 1979. Electrophoretic transfer of

proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and

57

some applications (ribosomal proteins/radioimmunoassay/fluorescent

antibody assay/peroxidase-conjugated antibody/autoradiography) 76,

4350–4354.

Trevisan, D.A.C., Lonardoni, M.V.C., Demarchi, I.G., 2015. Diagnostic

methods to cutaneous leishmaniasis detection in domestic dogs and

cats. An. Bras. Dermatol. 90, 868–872. doi:10.1590/abd1806-

4841.20153716

Ulrich, M., Rodriguez, V., Centeno, M., Convit, J., 1995. Differing antibody

IgG isotypes in the polar forms of leprosy and cutaneous leishmaniasis

characterized by antigen-specific T cell anergy. Clin. Exp. Immunol. 100,

54–8.

Zaragoza, C., Barrera, R., Centeno, F., Tapia, J.A., Durán, E., González, M.,

Mañé, M.C., 2003. SDS-PAGE and Western blot of urinary proteins in

dogs with leishmaniasis. Vet. Res. 34, 137–51.

doi:10.1051/vetres:2002061

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