UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS ... · micosis en humanos, considero que dicho...

i

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

CARRERA DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AMBIENTALES

Extractos etanólicos de Ganoderma australe y Pycnoporus sanguineus como

inhibidores de crecimiento in vitro de Scopulariopsis brevicaulis y Aspergillus

terreus causales de micosis en humanos.

Trabajo de titulación (Proyecto de investigación) previo a la obtención del Título de

Licenciada en Ciencias Biológicas y Ambientales

Autor: Fiallos Barrionuevo Karen Mishelle

Tutor: Gamboa Trujillo Jhonathan Paúl, PhD.

Quito, 2019

ii

DERECHOS DE AUTOR

Yo, Karen Mishelle Fiallos Barrionuevo en calidad de autor y titular de los derechos

morales y patrimoniales del trabajo de titulación Extractos etanólicos de

Ganoderma australe y Pycnoporus sanguineus como inhibidores de crecimiento

in vitro de Scopulariopsis brevicaulis y Aspergillus terreus causales de micosis en

humanos, modalidad presencial , de conformidad con el Art. 114 del CÓDIGO

ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS,

CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedemos a favor de la Universidad Central

del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva para el uso no

comercial de la obra, con fines estrictamente académicos. Conservamos a mi favor

todos los derechos de autor sobre la obra, establecidos en la normativa citada.

Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la

digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de

conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.

El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma

de expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la

responsabilidad por cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y

liberando a la Universidad de toda responsabilidad.

__________________________

Karen Mishelle Fiallos Barrionuevo

C.C.:1805385901

Dirección electrónica: kami_fiallos96 @hotmail.com

iii

APROBACIÓN DEL TUTOR

Yo, Jhonathan Paúl Gamboa Trujillo, en mi calidad de Tutora del Trabajo de

Titulación, presentado por Karen Mishelle Fiallos Barrionuevo, para optar por el

Grado de Licenciada en Ciencias Biológicas y Ambientales; cuyo título es: Extractos

etanólicos de Ganoderma australe y Pycnoporus sanguineus como inhibidores de

crecimiento in vitro de Scopulariopsis brevicaulis y Aspergillus terreus causales de

micosis en humanos, considero que dicho trabajo reúne los requisitos y méritos

suficientes para ser sometido a la presentación pública y evaluación por parte del

tribunal examinador que se designe

En la ciudad de Quito a los 31 días del mes de mayo del año 2019

____________________

Jhonathan Paúl Gamboa Trujillo, PhD.

DOCENTE-TUTOR

C.C.: 1715316780

iv

APROBACIÓN DEL INFORME FINAL/TRIBUNAL

El Tribunal constituido por: Jessica Guarderas y Francisco Álvarez

Luego de Calificar el Informe Final de Investigación del trabajo de titulación

denominado: Extractos etanólicos de Ganoderma australe y Pycnoporus

sanguineus como inhibidores de crecimiento in vitro de Scopulariopsis brevicaulis

y Aspergillus terreus causales de micosis en humanos, previo a la obtención del

título de Licenciada en Ciencias Biológicas y Ambientales presentado por la señorita

Karen Mishelle Fiallos Barrionuevo.

Emite el siguiente veredicto: APROBADO

Fecha: 29 de Julio de 2019

Para constancia de lo actuado firman:

Nombre Apellido Calificación Firma

Vocal 1 Jessica Guarderas ___________ ____________

Vocal 2 Francisco Álvarez ____________ ____________

v

DEDICATORIA

El presente proyecto de investigación se lo dedico a Dios, por guiar mi camino y

ser fiel en todo momento; gracias a Él he aprendido a ser perseverante y

proseguir sin detenerme ante los problemas que se han presentado, sino más bien

mantenerme firme en mi meta, confiando en Dios y en su palabra: “Al que cree

todo le es posible”.

A mi familia, en especial a mis padres: Rosa Barrionuevo y Gonzalo Fiallos, por

siempre creer en mí, por brindarme su apoyo para el cumplimiento de todas mis

metas trazadas, por su amor incondicional y por ser los promotores de los

principios y valores que rigen mi vida. ¡Son los mejores, los amo! A mi

hermano: Diego Fiallos, por cuidarme y apoyarme en todo momento, y a mis

sobrinos: Johan y Gael Fiallos, por ser mi inspiración.

Con profundo agradecimiento, dedico también la presente, al equipo de trabajo

del Laboratorio de Micología Aplicada de la Universidad Central del Ecuador,

por su ayuda y motivación durante la realización del proyecto, y a todas las

personas que de alguna manera han contribuido en mi formación universitaria y

en la ejecución de la investigación.

vi

AGRADECIMIENTOS

Agradezco al Laboratorio de Micología Aplicada, por facilitarme las cepas fúngicas y

la prestación de las instalaciones. De manera especial al equipo de trabajo del

laboratorio por su apoyo técnico y moral.

A la Facultad de Ingeniería Química en especial al Ing. Pablo Londoño por

facilitarme el análisis químico de los extractos y toda la información referencia a

ellos.

Al equipo de trabajo del Laboratorio de Biología, en especial al docente Max Bonilla

por su colaboración en la obtención de los extractos y concentraciones de estudio.

Al PhD. Paúl Gamboa, Director del Laboratorio de Micología Aplicada, por abrirme

las puertas del Laboratorio, y confiar en mi persona para la ejecución del proyecto de

investigación, además de su guía en calidad de tutor.

Finalmente, mi gratitud a todos los docentes quienes con su digna labor han guiado

mi formación académica

vii

LISTA DE TABLAS viii

LISTA DE FIGURAS ix

LISTA DE ANEXOS x

RESUMEN xi

INTRODUCCIÓN

METODOLOGÍA

Diseño de estudio

Población y Muestra

Métodos

Preparación de cepas fúngicas patógenas

Prueba de rendimiento de los medios de cultivo

Preparación del material fúngico

Obtención de los extractos

Determinación de la biomasa disuelta y

rendimiento de los extractos

Identificación de compuestos químicos 11

Preparación de medios de cultivo experimentales 11

Ensayo de actividad anti fungica 11

Efecto fungicida o fungistático 13

Análisis estadístico 13

RESULTADOS

DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

RECOMENDACIONES

LITERATURA CITADA

ANEXOS

pág.

14

29

35

36

37

49

ÍNDICE GENERAL

9

9

10

10

10

1

9

9

9

9

viii

LISTA DE TABLAS

TABLA

1. Clasificación del extracto según el porcentaje de inhibición de crecimiento

2. Compuestos químicos identificados mediante cromatografía GC-MS

3. Prueba de muestras independientes entre la acción de los extractos de

Ganoderma australe y Pycnoporus sanguineus sobre el crecimiento de

Aspergillus terreus

4. Prueba de muestras independientes entre la acción de los extractos de

Ganoderma australe y Pycnoporus sobre el crecimiento de Scopulariopsis

brevicaulis

5. Prueba de muestras independientes entre la acción del extracto de

Ganoderma australe sobre el crecimiento de Aspergillus terreus y

Scopulariopsis brevicaulis

6. Prueba de muestras independientes entre la acción del extracto de

Pycnoporus sanguineus sobre el crecimiento de Aspergillus terreus y


pág.

12

14

22

23

23

24

ix

LISTA DE FIGURAS

FIGURA

1. Halos de crecimiento de Aspergillius terreus de acuerdo a la

concentración del extracto de Ganoderma australe

2. Media de los porcentajes de inhibición de A. terreus frente a la acción

del extracto de G. australe

3. Halos de crecimiento de Scopulariopsis brevicaulis de acuerdo

a la concentración del extracto de Ganoderma australe.

4. Media de los porcentajes de inhibición de S.brevicaulis frente a la

acción del extracto de G. australe

5. Halos de crecimiento de Scopulariopsis brevicaulis de acuerdo

a la concentración del extracto de Pycnoporus sanguineus

6. Media de los porcentajes de inhibición de S. brevicaulis frente a la

acción del extracto de P. sanguineus

7. Halos de crecimiento de Aspergillus terreus de acuerdo a la

concentración del extracto de Pycnoporus sanguineus

8. Media de los porcentajes de inhibición de A. terreus frente a la acción

del extracto de P. Sanguineus

9. Categorización del efecto del extracto de Ganoderma australe

sobre las cepas patógenas.

10. Categorización del efecto del extracto de Pycnoporus

sanguineus sobre las cepas patógenas.

pág.

15

16

17

18

18

19

20

21

25

27

x

LISTA DE ANEXOS

ANEXO

A. Fichas de descripción macroscópica y microscópica de los hongos

B. Composición de los medios de cultivo

C. Determinación de los compuestos químicos encontrados mediante

Cromatografía CM-GS.

C-1. Compuestos químicos detectados en el extracto de Ganoderma australe

C-2. Compuestos químicos detectados en el extracto de Pycnoporus sanguineus

D. Tabulación de datos

D-1. % de crecimiento e inhibición de crecimiento de las cepas fúngicas

D-2. Datos descriptivos

E. Análisis estadísticos

E-1. Prueba de normalidad

E-2. Prueba para muestras emparejadas

E-3. Prueba de ANOVA

pág.

49

53

54

54

63

77

77

79

81

81

82

86

xi

TÍTULO: Extractos etanólicos de Ganoderma australe y Pycnoporus sanguineus

como inhibidores de crecimiento in vitro de Scopulariopsis brevicaulis y Aspergillus

terreus causales de micosis en humanos

Autora: Karen Mishelle Fiallos Barrionuevo

Tutor: PhD. Jhonathan Paúl Gamboa Trujillo

RESUMEN

Los hongos producen metabolitos secundarios con importante actividad

antimicrobiana, por lo cual, el presente trabajo pretende evaluar la efectividad de los

extractos etanólicos de G. australe y P. sanguineus como inhibidores de crecimiento

in vitro de S. brevicaulis y A.terreus causales de micosis en humanos. Utilizando la

técnica de dilución en caldo, se determinó que el extracto de P. sanguineus presento

mayor actividad antifungica contra S. brevicaulis y A. terreus, siendo esta última la

cepa más sensible al inhibirse a concentraciones incluso del 15 y 10%; sin embargo,

ambos extractos resultaron ser tóxicos para las cepas a partir de una concentración al

20% equivalente a 6,8mg/ml; dosis menores fueron ligeramente toxicas con efecto

fungistático, existiendo diferencias estadísticamente significativas entre los

porcentajes de inhibición generados y finalmente al 0,5% no hubo inhibición. Al

analizar químicamente los extractos, se encontraron compuestos esteroles, terpenos,

ésteres y ácidos grasos a los que se les atribuye su potencial antifúngico.

PALABRAS CLAVE: EXTRACTOS ETANÓLICOS / INHIBICIÓN DE

CRECIMIENTO / ACTIVIDAD ANTIFUNGICA / HONGOS PATÓGENOS / G.

australe y P. sanguineus.

xii

TITLE: Ethanolic extracts of Ganoderma australe and Pycnoporus sanguineus as

inhibitors of in vitro growth of Scopulariopsis brevicaulis and Aspergillus terreus

causes of mycosis in humans

Author: Karen Mishelle Fiallos Barrionuevo

Tutor: PhD. Jhonathan Paúl Gamboa Trujillo

ABSTRACT

The fungi produce secondary metabolites with important antimicrobial activity, by

which, this current work wants to evaluate the effectiveness of the ethanol extracts of

G. australe and P. sanguineus as inhibitors of in vitro growth of S. brevicaulis and

A.terreus, causes of mycosis in humans. Using the dilution technique in broth, it was

determined that the extract of P. sanguineus had greater antifungal activity against S.

brevicaulis and A. terreus. The latter being the most sensitive strain to be inhibited at

concentrations even of 15 and 10%. However, both extracts were found to be toxic

for the strains from a concentration of 20% equivalent to 6.8mg / ml. Similarly, lower

doses were slightly toxic with fungistatic effect, there being statistically significant

differences among the percentages of inhibition generated and finally at 0.5% there

was no inhibition. When analyzing the extracts chemically, sterols, terpenes, esters

and fatty acids where found, so an antifungal potential is attributed to them.

KEYWORDS: ETHANOLIC EXTRACTS / GROWTH INHIBITION /

ANTIFUNGAL ACTIVITY / PATHOGENIC FUNGI, G. australe / P. sanguineus.

I CERTIFY that the above and foregoing is a true and correct translation of the original

document in Spanish

______________________

Name: Veronica Gavilanes

Certified Translator: 1010-11-1090755

ID: 1804080693

1

INTRODUCCIÓN

Las micosis son enfermedades generadas por hongos que invaden tejidos provocando

variadas manifestaciones clínicas a nivel cutáneo o profundo, sobretodo en uñas, piel,

cuero cabelludo, zona genital e incluso pueden llegar a afectar órganos internos

especialmente los pulmones, corazón, cerebro y riñones (Walsh y Dixon, 1996; Adam

et al. 2018).

Dependiendo de la zona de infección las micosis pueden ser superficiales,

subcutáneas o sistémicas (Walsh y Dixon, 1996). Las micosis superficiales también

denominadas dermatofitosis son causadas por hongos dermatofitos con más de 40

especies incluidas levaduras que se caracterizan por infectar la piel desencadenando

sobretodo daño estético; mientras que cuando los hongos infectan el tejido

subcutáneo y penetran estructuras subyacentes provocan una micosis subcutánea que

puede llegar a ser crónica; finalmente, cuando la infección fúngica se disemina a

varios órganos en especial pulmones, corazón, huesos y sistemas nervioso causando

afectaciones en todo el organismos se conoce como micosis sistémica lo cual

presenta graves complicaciones cuando el sistema inmune está debilitado por alguna

enfermedad (Walsh y Dixon, 1996; Adam et al. 2018).

En su mayoría, los hongos causales de micosis son hongos imperfectos o anamorfos

filamentosos ya que su micelio o aparato vegetativo que permite su nutrición está

constituido por filamentos o hifas, su reproducción es asexual y no presentan

basidiomas o ascomas (Quindós, 2002); además, estos hongos presentan una rápida

reproducción y crecimiento, lo que los hace abundantes en hábitats como agua, suelo,

animales, plantas y cualquier estructura orgánica en descomposición (Puga, 2014).

El hábitat donde se desarrollan los hongos es la principal fuente de infección, lo que

constituye la base para clasificar las enfermedades infecciosas en antroponosis,

zoonosis y sapronosis (Hubálek. 2003; Cabañes, 2008). Kuris et al. (2014) afirman

que la mayoría de micosis en humanos se encuentran en la categoría de sapronosis, ya

que el reservorio del microorganismo causal es un sustrato no animal, por lo cual

siguen un patrón de transmisión distinto al comúnmente aplicado para enfermedades

infecciosas transmitidas de un huésped a otro, lo que les convierte en un problema

latente en salud pública ya que los patógenos persisten en el ambiente con un alto

potencial de virulencia, generando nuevos brotes de infección por exposición a

sustratos contaminados independientemente del control y abundancia del huésped

homeotérmico, siendo así necesario no solo dar tratamiento a los pacientes, sino

también encontrar la fuente de infección.

Se han descrito 60 géneros y más de 120 especies de hongos involucrados con

enfermedades en humanos y aunque la transferencia interhumana de micosis no es tan

habitual en comparación con otras enfermedades infecciosas trasmitidas por virus y/o

bacterias, el cuadro clínico causado por ciertos hongos puede llegar a ser muy severo

cuando la persona está inmunocomprometida (Walsh et al. 2008).

2

Aunque la candidiasis es la principal micosis invasora que afecta al ser humano

(Fridkin, 1996; Pappas et al. 2004), en los últimos años se han incrementado

notablemente las micosis humanas causadas por Scopulariopsis sp. y Aspergillus sp.

La micosis producida por este último se denomina aspergilosis y es la más frecuente

después de la candidiasis, siendo así que juntas constituyen el 90% de las infecciones

fúngicas nosocomiales (Guarro, 2012).

Existen 180 especies del género Aspergillus de las cuales 33 se relacionan con

enfermedades en humano que provocan sobretodo lesiones pulmonares, las cuales se

identifican por la presencia de hifas septadas y ramificadas en los tejidos, llegándose

a presentar conidióforos cuando el tejido presenta elevada concentración de oxígeno

(Perez et al. 1996; Álvarez et al. 2010).

Las especies de Aspergillus frecuentemente relacionadas con micosis en humanos son

Aspergillus terreus, Aspergillus niger y Aspergillus flavus que afectan principalmente

al aparato respiratorio y en pacientes en estado de inmunosupresión también se les

relacionan con enfermedades digestivas, cutáneas y sistémicas, pudiendo presentar

incluso necrosis de tejido (Carrasco y Pérez, 2000).

Aspergillus terreus al infectar a un humano puede provocar cuadros alérgicos severos

que si no son tratadas adecuadamente pueden desencadenar aspergiloma y

aspergilosis invasiva con cuadros de aspergilosis broncopulmonar y aspergilosis

pulmonar severos que pueden causar la muerte del paciente en un corto tiempo (Lazo

y Sierra, 2008); también se le asocia con lesiones ungulares siendo el responsable de

30 a 60% de las patologías de las uñas causadas por hongos (Magalhães, 2008).

Otro de los géneros de hongos implicados en micosis humanas es Scopulariopsis con

alrededor de 25 especies que generalmente son cosmopolitas encontrándose en una

amplia gama de hábitats como suelo, aire, detritus, excrementos y como patógenos de

insectos y mamíferos (Domsch et al. 2007; Sandoval-Denis et al. 2013).

Scopulariopsis brevicaulis es uno de los principales hongos imperfectos oportunistas

causantes de lesiones dérmicas sobre todo en piel y en el conducto auditivo externo

(otomicosis), y onicomicosis que afecta sobre todo a las uñas de los pies, sin

embargo, en cuadros más severos provoca similares a la aspergilosis causando

problemas pulmonares, abscesos subcutáneos, infecciones peritoneales, entre otras

(Carrillo-Muñoz, 2004).

Este hongo puede vivir en condiciones extremas gracias a su capacidad

queratonolítica que le permite emplear la queratina del huésped para nutrirse

provocando infecciones en el estrato córneo, siendo el causante del 1 al 11,5% de las

micosis dérmicas (Moreno y Arenas, 2010), y se caracteriza por su elevada

resistencia a los fármacos convencionales (Miossec et al. 2011; Sandoval-Denis et al.

2013).

Desde el punto de vista microbiológico un hongo es resistente cuando este sufre

cambios que hacen que los medicamentos empleados para su tratamiento pierdan su

efectividad, adquiriendo así la cepa la capacidad de sobrevivir en concentraciones del

3

antifúngicos que inhibiría el crecimiento de otras de la misma especie que no han

adquirido dicha resistencia (Kontoyiannis y Lewis, 2002).

La resistencia se determina mediante pruebas de susceptibilidad basadas en la técnica

de dilución en caldo para someter a las cepas a varias dosis del fármaco siguiendo los

estándares impuestos por “European Committee on Antimicrobial Susceptibilily

Testing” (EUCAST) y “Clinical and Laboratory Standars Institute” (CLSI), lo cual

permite determinar cepas con resistencia intrínseca o adquirida al tratamiento

comercial en prueba (Loeffler y Stevens, 2003).

Por el contrario, un microorganismo es susceptible a un compuesto antifúngico

cuando la dosis establecida para el tratamiento inhibe el crecimiento del patógeno

generando éxito terapéutico con una inhibición mayor al 75% (Casals, 1979;

EUCAST, 2018), además puede ser categorizada como susceptibilidad régimen de

dosificación estándar al emplear una dosis del agente que proyecta al éxito

terapéutico y la otra por susceptibilidad por incremento de exposición que para

obtener una probabilidad más alta de éxito terapéutico es necesario incrementar la

concentración del agente farmacológico (EUCAST, 2018).

Cabe mencionar que los hongos presentan diferente susceptibilidad a un mismo

fármaco debido a las características particulares de la especie sobre todo a nivel de la

pared celular que la hacen menos vulnerables al paso y acción antifungica de ciertos

compuestos del medicamento, no obstante, evaluar la susceptibilidad in vitro es un

requerimiento indispensable antes de aplicar tratamientos clínicos (Casals, 1979).

Los antifúngicos se formularon muchos años después de la expedición de los

medicamentos antibacterianos debido a la complejidad de los hongos ya que, al ser

organismos eucariotas, la mayoría de fármacos que se emplean para su control

afectan al huésped (Carazo et al. 1999), esto sumado a que los tratamientos

disponibles requieren un tiempo muy prolongado de acción, hace que los pacientes no

siempre lo terminan; aproximadamente el 51% de las personas que han presentado

una micosis por Scopulariopsis no cumplen con el tratamiento siguiendo todas las

especificaciones del médico, lo que dificulta aún más el control del patógeno y de sus

manifestaciones clínicas (Thappa, 2007).

En este contexto, las investigaciones se han enfocado en buscar nuevos compuestos

como alternativa al tratamiento de micosis para hacer frente a la elevada resistencia

de los patógenos fúngicos a las formulaciones existentes que surgen por mutaciones

en su genoma luego de que la cepa entre en contacto con los antifúngicos o por su

resistencia natural a ciertos compuestos del medicamento (Biedenbach, 2004),

pudiéndose convertir en microorganismos multirresistentes cuando no son

susceptibles a clases de antifúngicos de uso tradicional (Tapia, 2005).

Partiendo de la problemática existente, los extractos de plantas han sido

profundamente estudiados probando su efectividad frente a microorganismos

patógenos (Guerrero-Rodríguez et al. 2007); de manera similar, pero con pocos

4

estudios, dentro del reino fungi existen metabolitos secundarios con actividades

biológicas de gran interés farmacéutico (Kozarsk et al. 2011).

La primera fase de dichas investigaciones parte del desarrollo de métodos de

evaluación in vitro para determinar la susceptibilidad de los patógenos a extractos de

naturales (Reichardt y Welton, 2011). La metodología para elaborar extractos de

hongos es muy similar al utilizado en plantas, es así que para elaborar un extracto

natural obtenido a partir de biomasa requiere que esta sea percolada en un solvente

como metanol, etanol, acetona, entre otros (Reichardt y Welton, 2011).

Varios estudios reportan el uso de etanol como solvente para producir extractos

vegetales y fúngicos, cuyos resultados demuestran su efectividad para extraer

metabolitos secundarios ya que al ser polar tiene gran afinidad con el agua y

compuestos presentes en los organismos vivos (Lago et al. 1985; Brossard-González

et al. 2010) a más de ser un solvente seguro para trabajar pues presenta toxicidad baja

en relación a otros como el metanol y es renovable lo que reduce el impacto

ambiental (Lim et al. 2011).

La efectividad del extracto obtenido estará determinada por la capacidad que este

para inhibir más del 75% del crecimiento de su micelio y reducir las unidades

formadoras de colonia; esto solo pude ser medido en ensayos clínicos ya que al ser

suministrado la respuesta del paciente puede variar dependiendo de factores

genéticos, edad, grado de virulencia, estado de la enfermedad entre otras variables

(Dosari, 2010).

Los extractos varían en su efectividad de acuerdo a características propias de la

estructura del patógeno; para que sea considerado como activo el extracto debe logran

inhibir más del 20% del crecimiento de los hongos filamentosos (Viñuelas y Jacas,

1993). De acuerdo a la escala de clasificación sugerida por la Organización

Internacional de Lucha Biológica (OILB) los extractos pueden ser inocuo cuando el

porcentaje de inhibición de crecimiento es <30%, ligeramente tóxico de 30 a 79%,

moderadamente tóxico de 80 a 99% y tóxico cuando inhibe más del 99%, siendo a

partir de 50% una inhibición representativa para estudios y aplicaciones posteriores

(Viñuelas y Jacas, 1993; Cormican y Pfaller, 1996); por lo cual es importante

establecer la proporción adecuada entre la materia orgánica en estudio y el solvente

para extraer la mayor cantidad de compuestos presentes en los basidiomas (Márquez

et al. 2007).

Las concentraciones efectivas para la inhibición no siguen un patrón muy marcado,

puesto que su acción depende de varios factores como la naturaleza y composición

química del extracto y la resistencia del inóculo, sin embargo, para probar extractos

que no han sido utilizados previamente los estudios sugieren que se debe trabajar con

varias concentraciones no muy distantes entre sí para poder establecer la dosis

mínima a la que se inhibe el 50% (Smania et al. 2003, Moreno-Limón, 2011).

Los métodos más utilizados para evaluar la actividad antifúngica son los métodos de

dilución y el de difusión en agar de manera in vitro, los cuales varían de acuerdo al

5

tipo de organismo, la técnica de extracción y pH que esta estandarizada de acuerdo a

las condiciones del experimento, pero manteniendo los principios básicos del Manual

de Técnica de Investigación del Programa Iberoamericano de Ciencias y tecnología

para el desarrollo (Wanden-Berthe, 2008; Canel-Monterroso, 2012).

El método de difusión en agar es más empleado para realizar antibiogramas, en los

cuales se impregna discos de papel filtro con las sustancias que se pretenden probar

como antibacterianos evaluando posteriormente la formación de halos de inhibición

del crecimiento (Ríos y Recio, 1987). Para probar extractos de plantas u hongos,

cuando no hay investigaciones previas, es más recomendable utilizar el método de

dilución en agar en el cual se realiza diluciones de los extractos en volúmenes

determinados del medio de cultivo y la inhibición del crecimiento viene dado en

función del diámetro de crecimiento micelial que debe ser menor al control negativo

con agua destilada estéril (Cáceres, 1999; Lewis, 2002).

Un extracto inhibe el crecimiento fúngico cuando al ser colocado en un medio de

cultivo logra paralizar o impedir que la cepa colonice el medio generando una

reducción en la tasa de crecimiento respecto al control (Schlumbaum et al. 1986).

Mientras menor sea la dosis requerida para inhibir al microorganismo mayor será el

potencial antifúngico de los compuestos presentes en el extracto (Chang et al. 2007).

La inhibición del crecimiento puede deberse a la actividad fungicida o fungistática

del extracto; el efecto fungicida ocurre cuando un extracto logra eliminar por

completo al patógeno al actuar sobre sitios claves de la ruta metabólica afectando la

producción de enzimas y proteína indispensables para la vida del microorganismo

(Soliman y Badeaa, 2002). Esta actividad se puede evaluar in vitro cuando al quitar

un pequeño fragmento del micelio expuesto al extracto y colocarlo en un medio de

cultivo limpio no se evidencia ningún tipo de crecimiento micelial ya que las

funciones vitales fueron afectadas (Veloz-García et al. 2010); siendo este el más

relevante para su posterior aplicación en la industria farmacéutica (Veloz-García et

al. 2010).

El efecto fungistático a diferencia del anterior no mata al hongo solo lo paraliza

suspendiendo procesos como el crecimiento, desarrollo y germinación de esporas,

pero cuando es retirado del agente químico su micelio puede reactivarse, por lo cual

en el laboratorio basta con retirar un fragmento del micelio expuesto al extracto para

evidenciar un crecimiento luego de por lo menos 48 horas (Veloz-García et al. 2010;

Sánchez-León et al. 2015).

Se han reportado varios estudios que emplean el etanol como solvente para extraer

compuestos de potencial farmacológico, es así, que Vega et al. (2007) demostró el

potencial antifúngico de extractos etanólicos de Ganoderma que es uno de los

géneros de hongos más utilizados en la industria farmacéutica ya que se han

identificado cerca de 130 metabolitos en especial de naturaleza esteroidea como

esteroles y triterpenos que pueden controlar patógenos microbianos. Este género

perteneciente a la división Basidiomycota, clase Agaricomycetes y orden Polyporales

6

tiene una amplia distribución ya que se puede encontrar en casi todos los gradientes

latitudinales con clima cálido, siendo muy aprovechado en los países asiáticos por sus

propiedades medicinales (Lim et al. 2011).

Rodríguez (2010) demostró la efectividad de extractos etanólicos de Ganoderma

lucidum para controlar el crecimiento de dermatofitos y Aspergillus spp., aislados de

humanos y animales pudiendo ser una alternativa relevante para su tratamiento y

control. Estudios similares, destacan el potencial antibacteriano y antioxidante de esta

especie de macrohongo por sus compuestos aislados de naturaleza esteroidea, ácidos

grasos, terpenoides y compuestos nitrogenados (Ferreira et al. 2011; Kozarsk et al.

2011).

Cabe destacar que Ganoderma sp. también ha probado ser inhibidor de hongos

patógenos de interés agrícola como Curvularia clavata y Phytophthora nicotianae

logrando obtener resultados similares a los tratamientos químicos superando el 50%

de inhibición (Palacios et al. 2011).

Ganoderma australe es una especie perenne, sésil y leñosa de forma semicircular

cuyo basidioma solitario de color marrón rojizo puede alcanzar un diámetro de hasta

50cm, no presenta estípite y su himenio es blanquecino con poros de 4mm (Ojeda-

López, 1986); este hongo es cosmopolita y crece adpreso a trocos de árboles tanto

vivos como en proceso de pudrición por lo que constituye un problema sobre todo

para la industria de oleaginosas ya que parasita las palmas generando pérdidas en la

producción (Nieto y Valencia, 2002).

No existen suficientes estudios relacionados al potencial farmacológico de

Ganoderma australe por lo cual se conoce muy poco acerca de su composición

química y por ende de su actividad biológica. Nieto y Valencia (2002), estudiaron la

composición química de basidiomas de Ganoderma australe, encontrando un

porcentaje relevante de esteroles y ácidos grasos identificados como oleato de etilo,

palmitato de etilo, heptadecanoato de etilo, linoleato de etilo y estearato de etilo, que

son sustancias aprobadas por la industria médica; y que podrían ser utilizados para la

obtención de nuevas formas farmacéuticas contra hongos patógenos.

Gerber (2000), evaluó la actividad antibacteriana de extractos de Ganoderma australe

frente a cepas de Bacillus cereus y Staphylococcus aureus, logrando identificar

químicamente compuestos esteroles, triterpenos y ácidos aplanoxídicos los cuales son

responsables de la actividad biológica. De manera similar, Smania et al. (2003)

lograron inhibir el crecimiento de Trichophyton mentagrophytes y Microsporum

cannis usando metabolitos aislados de Ganoderma annulare. Este macrohongo

además ha cobrado gran relevancia en estudios relacionados con la obtención de

quitosano como una sustancia biodegradable de propiedades antimicrobianas y como

posible aplicación en procesos de obtención de biopolímeros de interés industrial

(Guerrón-Jaramillo, 2016; Lara-López, 2016).

Otro de los hongos con importancia farmacológica es Pycnoporus sanguineus de la

división Basidiomycota y familia Polyporaceae, común en países tropicales y

7

subtropicales, es un macrohongos sésil de podredumbre blanca con forma de repisa

semicircular, cuyos basidiomas son de color anaranjado intenso y tienen habito

solitario o gregario, con pseudoestípite e himeneo con poros de 5 a 6 mm mediante el

cual permanece adherido a troncos en descomposición ya que es una de las especies

de hongos ligninolíticos con mayor actividad degradadora (Ojeda-López, 1986),

además se le atribuye importantes actividades biológicas por los metabolitos

secundarios que presenta como cinnabarina, vainillina y enzimas ligninolíticas, los

que le dan el potencial antiviral, antioxidante, anti-fúngico, antibacteriano y

antiparasitario (Cruz-Muñoz, 2012).

En investigaciones realizadas por Acosta-Urdapilleta et al. (2010) se ha reportado la

importancia médica de Pycnoporus sanguineus ya que presenta metabolitos capaces

de inhibir el crecimiento de Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae y Streptococcus.

Aunque no se han realizado estudios que evalúen diferentes concentraciones de los

extractos etanólicos de Ganoderma australe (Fr.) Pat. 1889 y Pycnoporus sanguineus

(L.) Murrill 1904 como inhibidores del crecimiento de in vitro de Scopulariopsis

brevicaulis Bainier 1907 y Aspergillus terreus Thom 1918, hongos causales de

micosis en humanos, existe la evidencia suficiente para generar la hipótesis de su

efectividad, lo cual abrirá el paso al desarrollo de nuevos tratamientos que puedan

hacer frente a la múltiple resistencia de estos patógenos fúngicos a los métodos de

control convencionales.

Cabe resaltar que Ecuador presenta una gran diversidad de hongos, siendo las

especies Ganoderma australe y Pycnoporus sanguineus abundantes y ampliamente

distribuidas (Subramanian, 1995; Lodge, 2001), sin embargo, son muy pocas las

investigaciones relacionadas a evaluar su actividad antifúngica como mecanismo para

el control de hongos patógenos pese a su reconocida importancia en la industria

farmacéutica, siendo este el punto de partida para la revalorización de los productos

naturales como potencial controlador de patógenos.

En base a la información reportada y al potencial antimicrobiano de macrohongos,

surge la necesidad de aprovechar la diversidad fúngica del Ecuador como posibles

nuevos fármacos por lo cual, la presente investigación se planteó con el objetivo de

evaluar la efectividad de los extractos etanólicos de Ganoderma australe y

Pycnoporus sanguineus como inhibidores de crecimiento in vitro de Scopulariopsis

brevicaulis y Aspergillus terreus causales de micosis en humanos.

Para lo mencionado se desarrollaron los siguientes objetivos específicos: determinar

cuál de los dos extractos obtenidos y a que concentraciones presenta mayor efecto

inhibidor frente al crecimiento de Scopulariopsis brevicaulis y Aspergillus terreus

patógenos fúngicos de interés clínico, comparando a la vez la susceptibilidad de las

cepas patógenas frente a los extractos etanólicos; categorizar el efecto de los extractos

como fungicida o fungistático y finalmente identificar mediante cromatografía de

8

gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) compuestos químicos presentes

en los extractos etanólicos, lo cual se realizó en el Laboratorio de Micología Aplicada

de la Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Central del Ecuador.

9

METODOLOGÍA

Las especies fueron identificadas en el Laboratorio de Micología Aplicada de la

Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Central del Ecuador mediante

claves dicotómicas de guías especializadas y la colaboración de un especialista del

Laboratorio mencionado, además se revisó su nomenclatura actualizada en el sitio

web: index fungorum para su correcta clasificación taxonómica (ANEXO A).

DISEÑO DE ESTUDIO

Para establecer el efecto de los extractos etanólicos a diferentes concentraciones de

Ganoderma australe y Pycnoporus sanguineus en el crecimiento in vitro de

Scopulariopsis brevicaulis y Aspergillus terreus se utilizó el diseño de bloques al

azar, siendo el factor de bloque los extractos etanólicos sobre cada hongo patógeno y

el factor de variabilidad las diferentes concentraciones de los tratamientos.

POBLACIÓN Y MUESTRA

Población:

La población estuvo conformada por las cepas de S. brevicaulis y A. terreus, las

cuales fueron donadas por el Laboratorio de Micología Aplicada de la Facultad de

Ingeniería Química de la Universidad Central del Ecuador.

Muestra:

Tres cepas de S. brevicaulis y tres de A. terreus, con 15 ensayos de cada hongo

patógeno sobre cada concentración de los extractos, teniendo un total 45 unidades de

análisis.

MÉTODOS

Preparación de cepas fúngicas patógenas

Los hongos S. brevicaulis y A. terreus causales de micosis en humanos se obtuvieron

de cepas aisladas previamente en el laboratorio de Micología Aplicada de la Facultad

de Ciencias Químicas; las cuales fueron conservadas en medio Agar Papa Dextrosa a

21°C y refrescadas trimestralmente para mantenerlas activas.

Se refrescaron las cepas para posteriormente inocular fragmentos de 5mm de

diámetro de edad de 15 días.

Prueba de rendimiento de los medios de cultivo

Se realizó ensayos comparativos entre los tres medios de cultivo que se manejan en el

laboratorio (Agar PDA, Agar extracto de Malta y Agar Sabouraud) (ANEXO B), con

el fin de determinar cuál fue el más favorable para el crecimiento de las cepas objeto

de análisis, en función de los días requeridos para que los patógenos colonicen el

10

medio bajo condiciones de temperatura y humedad estandarizadas y contraladas en el

laboratorio.

Preparación del material fúngico para la obtención de los extractos

Se seleccionaron basidiomas de G. australe y P. sanguineus en perfecto estado sin

ningún tipo de contaminación y se procedió a lavarlos con agua destilada para

posteriormente dejarlos secar a temperatura ambiente durante 3 días.

En el caso de G. australe se fragmentó el basidioma para facilitar posteriormente la

trituración.

Obtención de los extractos

Los basidiomas secos de cada hongo se sometieron a trituración mecánica con ayuda

de un molino para obtener fragmentos entre 0.5-1 mm pesando un total de 50g de

cada uno, a los cuales posteriormente se les añadió 500ml del solvente (etanol al

96%). Luego el material resultante se llevó a agitación mecánica utilizando un

agitador magnético DLAB MS7-H550-Pro realizando un ciclo de agitación de 15 min

por día durante 48 horas manteniendo el extracto en condiciones de oscuridad, para lo

cual fueron envueltos en papel aluminio y se lo dejó macerar por 10 días para extraer

la mayor cantidad de compuestos posibles.

El sobrenadante se filtró empleando papel Whatman grado 5 y luego fue

almacenando a 4°C en completa oscuridad por 24 horas, para luego dejar en reposo

por 5 días con el fin que el etanol se evapore completamente para su posterior

utilización en los tratamientos; la biomasa fue resuspendida en el solvente para

concentrar el extracto en una cámara de extracción Soxhlet (Domínguez, 1973;

Harborne, 1984; Koc et al. 2005).

Determinación de la biomasa disuelta y rendimiento de los extractos

Para calcular la biomasa disuelta se pesó la cantidad de muestra inicial y la cantidad

de muestra obtenida al final del proceso de extracción (Arévalo, 1996; Moreno-

Limón, 2011), realizando una diferencia matemática entre ellas, basadas en la

siguiente fórmula:

𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑖𝑠𝑢𝑒𝑙𝑡𝑎 = 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙(𝑔) − 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙(𝑔)

Para determinar el rendimiento de los extractos se utilizó la siguiente fórmula:

% 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑖𝑠𝑢𝑒𝑙𝑡𝑎 ∗ 100

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑎

Con los datos obtenidos se establecieron las concentraciones de los extractos en

mg/ml correspondientes al 100%, 80%, 60%, 40% y 20%, adicionalmente para

11

enriquecer la investigación se probaron cinco concentraciones más equivalentes al

15%, 10%, 5%, 1% y 0,5%.

Se estableció la concentración al 100% considerando la cantidad de biomasa disuelta

en los 250ml del extracto líquido, lo cual corresponde a 34mg/ml y a partir de ella por

regla de tres se determinó las diferentes dosis.

Identificación de compuestos químicos

Se colectaron 1,5ml de cada extracto, cuyas muestras fueron transportadas al

Laboratorio de Química de la Facultad de Ingeniería Química para identificar los

compuestos químicos presentes mediante cromatografía de gases-espectrometría de

masas (GC-MS) usando el equipo Agilent GCMS con la colaboración del analista

encargado.

Preparación de los ensayos

Para la evaluación de los extractos etanólicos frente a los hongos S. brevicaulis y A.

terreus se midió el halo de crecimiento micelial de los hongos imperfectos

mencionados respecto al control negativo; para lo cual se empleó el método de

dilución en caldo (Tequida-Meneses et al. 2002; Moreno-Limón, 2011).

Se prepararon medios de cultivo con Agar Sabouraud (ANEXO B), con pH 5,6 y

temperatura de 25°C siguiendo las indicaciones de fabricante (39g del medio en

1000ml de agua destilada); esta mezcla se esterilizo en autoclave (marca Tuttnauer

mod. 3870M NB 199613) a 121°C por 45min. Las distintas concentraciones de los

extractos previamente establecidas fueron mezcladas con el medio de cultivo

formando una mezcla homogénea cuando el agar se encontraba a una temperatura de

50°C (Moreno-Limón, 2011). Cada mezcla se vertió en cajas petri de 60x15mm;

luego se dejó solidificar y se selló con papel parafilm para llevarlas a refrigeración a

4°C durante 72h antes de su utilización (Bragulat et al. 1991; Ramirez, 1998).

Ensayo de actividad antifúngica

Para evaluar la actividad antifúngica de los extractos etanólicos sobre S. brevicaulis y

A. terreus, se utilizó la técnica de crecimiento radial midiendo el diámetro de la

colonia cuando los hongos del control negativo colonizaron todo el medio de cultivo

(Martínez, 1999).

Con un sacabocados estéril se colectó 5mm de diámetro del micelio de las colonias de

los hongos mencionados de siete días de edad; para colocar el micelio se utilizó

palillos de madera esterilizados en seco. Las cajas fueron etiquetadas e incubadas a

30°C hasta que los hongos colonizaron todo el medio en el control negativo, que de

acuerdo a la bibliografía es a partir del día séptimo (Martínez, 1999). Se utilizó

Anfotericina B como control positivo que fue adicionado al medio de cultivo antes de

que solidificara como indica la casa comercial (2mg/L) (Donnelly et al. 2012); como

control negativo se utilizó 1ml de etanol al 96% con Agar Sabouraud dejándole en

12

refrigeración durante 72h con el fin de que el etanol se evapore y demostrar que los

resultados de inhibición no son a causa del solvente.

Para el control positivo, negativo y todas las concentraciones se realizó tres

repeticiones para que los datos obtenidos sean estadísticamente representativos.

El diámetro de las colonias se midió en milímetros (mm) en cuatro diferentes

direcciones siendo el resultado el promedio de dichas medidas para determinar el

porcentaje de crecimiento y con ellos calcular el porcentaje de inhibición de

crecimiento de los hongos utilizando las siguientes ecuaciones propuestas por

Sztejnberg et al. (1987).

% de creci𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜

=𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑑𝑒𝑙 ℎ𝑜𝑛𝑔𝑜 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 ∗ 100

𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜

% 𝑑𝑒 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 = (1 − 𝐶𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 (𝑚𝑚)

𝐶𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑡𝑒𝑠𝑡𝑖𝑔𝑜 (𝑚𝑚) ) ∗ 100

% 𝑑𝑒 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 = 100 − % 𝑑𝑒 𝑐𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜

Tabla 1. Clasificación del extracto según el porcentaje de inhibición de

crecimiento generado sobre el crecimiento de los hongos patógenos

Porcentaje de inhibición

del crecimiento micelial

Clasificación del

extracto según la

OILB

<30%, Inocuo

30 a 79%, Ligeramente tóxico

80 a 99% Moderadamente tóxico

>del 99%, Tóxico

Fuente: Cormican y Pfaller (1996)

Las cepas fueron susceptibles a la acción de los extractos cuando este generó una

inhibición mayor al 75% del crecimiento del patógeno.

13

Efecto fungicida o fungistático

Para determinar si el efecto de los extractos sobre la cepa fue fungicida o fungistático

se tomó 5mm de diámetro de los bordes de las colonias que crecieron en los

tratamientos previos y se inocularon sobre medios de cultivo Agar Sabouraud

(Sánchez-León et al. 2015). Las cajas fueron selladas y etiquetadas para ser

incubadas a 30°C durante 7 días luego del cual se evaluará si hay crecimiento

micelial o no.

Las cajas que presentaron crecimiento, evidenciaron efecto fungistático del extracto

sobre la cepa, mientras que, si no hubo crecimiento micelial se concluyó que el efecto

de las concentraciones del extracto fue fungicida (Soliman y Badeaa, 2002; Veloz-

García et al. 2010; Sánchez-León et al. 2015).

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Con la finalidad de proceder al análisis estadístico de la información, se levantó una

base de datos en Excel 2016; una vez levantada la base, se obtuvo los promedios de

los porcentajes para establecer el grado de inhibición de los micelios (ANEXO D-1).

Para determinar la normalidad se aplicó Shapiro-Wilk, ya que las muestras de las

variables fueron menores a 50.

De acuerdo a estos resultados, se evidenció que el valor de significancia fue P>0,05,

por aquello, se aceptó la hipótesis nula, que se dispone que los datos provienen de

una distribución normal (Anexo E-1). Razón por la cual posteriormente se aplicó la

prueba T Student para muestras relacionadas (para probar si existe o no diferencia

entre las concentraciones de un mismo extracto sobre cada una de las cepas fúngicas)

y la prueba T Student para muestras independientes para comparar entre grupos, con

sus respectivos intervalos de confianza (95%).

Se considera que los porcentajes de inhibición obtenidos con las concentraciones

desde el 20% al 100% son constantes y no van a tener resultados diferentes, por lo

que para el análisis estadístico solo se tomaron las concentraciones a partir del 20%

hasta al 0,5% y establecer la comparación de las medias.

14

RESULTADOS

En relación a los ensayos de rendimiento realizados se obtuvo que, el medio de

cultivo óptimo para mezclar con los extractos es Agar Sabouraud, ya que con este las

cepas colonizaron el medio en 10 días en el caso de A. terreus y en 12 días S.

brevicaulis con un diámetro de crecimiento total de 60mm, ambos a 30°C, mientras

que con Agar PDA y Agar extracto de Malta bajo las mismas condiciones de

temperatura y humedad, el crecimiento fue muy lento teniendo un diámetro de

crecimiento máximo de 30mm al cabo de 15 días.

Biomasa disuelta y rendimiento de los extractos

Se obtuvo un volumen final de los extractos crudos correspondiente a 250ml de cada

uno, con una biomasa disuelta de 8,6 g ya que de los 50g de biomasa al final se

recuperó 41,4 g de cada hongo.

Mediante estos resultados, se determinó que el rendimiento de ambos extractos fue de

17,2%.

Determinación de compuestos químicos

Mediante el análisis de cromatografía GC-MS se identificó varios compuestos

químicos presentes en los extractos (Tabla 2), encontrándose seis en el extracto de G.

australe (Anexo C-1) y diez en el extracto de P. sanguineus (Anexo C-2).

Tabla 2. Compuestos químicos identificados mediante cromatografía GC-MS

Nombre

Porcentaje

(%)

Sinónimos

Extracto de

Ganoderma

australe

Ácido oleico 1,8 Ácido-cis-Oleico

Éster etílico del ácido linoleico

29,2 Linoleato de etilo

Mandenol

(E)-9Éster etílico del ácido

octadecenoico

45,8 Elaidato de etilo

9(11)-Dehidroergosterol benzoate

26,3 Ergosta-5,7,9(11),22-

tetraen-3-

Ergosterol

7,2 Ergosterin

Provitamina D

5,6- Dehidroergosterol 27,1

Extracto de

Pycnoporus

sanguineus

ácido n-hexadecanoico

7,8 Ácido cetilico

Ácido palmítico

ácido trans-13-octadecenoico 18,3

Ácido octadecanoico 5,9 Vanicol

15

9,12-ácido octadecadienoico (Z, Z) -,

octil éste

6,5 Octyl (9E,12E)-9,12-

octadecadienoate

2,2,4-trimetil-3- (3,8,12,16-

tetrametil-heptadeca-3,7,11,15-

tetraenil) -ciclohexanol

15,9

Octadecano, 3-etil-5- (2-etilbutil) 6,3

Estigmastan-3,5-dieno 22,7

17-Pentatriacontene 17,2

γ-Sitosterol 30,5 Clionasterol

Ácido colestan-26-oico, 3,7,12-

trihidroxi, (3α, 5β, 7α, 12α)

23,8 Colestan

Análisis de actividad antifúngica

En base a los datos obtenidos, se expresan los resultados de los ensayos por cada

tratamiento.

Actividad del Extracto de Ganoderma australe sobre el crecimiento de

Aspergillius terreus

El extracto de G. australe a una concentración desde 15% hasta 100% inhibió

totalmente el crecimiento de la cepa patógena; con el 10, 5 y 1% se evidenció

crecimiento micelial pero con una notable reducción de su halo (Figura 1).

Finalmente, el extracto al 0,5% fue inocuo ya que A. terreus colonizó todo el medio

de cultivo.

Efecto del extracto de Ganoderma australe frente a Aspergillus

terreus

Control Positivo (Halo de crecimiento 0%)

Control negativo (Halo de crecimiento 100%)

Extracto al 100% Extracto al 80%

16

Extracto al 60% Extracto al 40% Extracto al 20% Extracto al 15%

Extracto al 10% Extracto al 5% Extracto al 1% Extracto al 0,5%

*Halos de crecimiento enmarcados en color verde

Figura 1. Halos de crecimiento de Aspergillius terreus de acuerdo a la concentración

del extracto de Ganoderma australe

Los porcentajes de inhibición fueron similares a partir de la concentración al 15%

hasta 100% con una inhibición total del hongo (100%). Con las concentraciones al

10%, 5% y 1% las medias fueron diferentes variando en función en la concentración.

Finalmente, al 0,5% no presentó inhibición (Figura 2).

Figura 2. Media de los porcentajes de inhibición de A. terreus frente a la acción del

extracto de G. australe

Al clasificar la acción del extracto sobre la cepa fúngica en función del porcentaje de

inhibición, según la Organización Internacional de Lucha Biológica (OILB) se obtuvo

100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00

76,75

42,88

10,150,00

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

Porc

enta

je d

e in

hib

ició

n

Concentraciones del extracto de G. australe

17

que el extracto de G. australe al 0,5% y 1% fue inocuo sobre A. terreus al inhibir

menos del 30% de su crecimiento; mientras que al 5% y 10% fue ligeramente tóxico

inhibiendo al patógeno entre el 30 y 79%; y finalmente con una concentración desde

15% al 100% el efecto fue tóxico al inhibir más del 99% del crecimiento (Tabla 5).

Actividad del Extracto de Ganoderma australe sobre el crecimiento de


Concentraciones del extracto de G. australe a partir del 20% al 100% inhibieron

totalmente el crecimiento de S. brevicaulis (Figura 3), mientras que dosis menores

presentaron variación en los halos de crecimiento.

Efecto del extracto de Ganoderma australe frente a Scopulariopsis brevicaulis







Figura 3. Halos de crecimiento de Scopulariopsis brevicaulis de acuerdo a la

concentración del extracto de Ganoderma australe.

18

Los porcentajes de inhibición fueron similares (100%) a partir de la concentración al

20% hasta 100% con una inhibición total del hongo. Con las concentraciones al 15%,

10%, 5% y 1% las medias fueron muy diferentes variando en función en la

concentración, sin tener efecto inhibitorio con la concentración al 0,5% (Figura 4).

Figura 4. Media de los porcentajes de inhibición de S. brevicaulis frente a la acción

del extracto de G. australe

Al clasificar la acción del extracto sobre la cepa fúngica en función del porcentaje de

inhibición generado, se determinó que el extracto de G. australe fue tóxico sobre S.

brevicaulis a partir del 20% de concentración inhibiendo más del 99% de su

crecimiento; ligeramente tóxico con el 5%, 10% y 15% al inhibir entre el 30 a 79%; e

inocuo con el 1% y 0,5.

Actividad del Extracto de Pycnoporus sanguineus sobre el crecimiento de


De acuerdo a los datos obtenidos, con el extracto de P. sanguineus sobre el

crecimiento de S. brevicaulis se evidenció inhibición total de la cepa con las

concentraciones desde el 20% hasta el 100% (Figura 5); mientras que con las demás

concentraciones presentaron diferentes halos de crecimiento.

Efecto del extracto de Pycnoporus sanguineus frente a Scopulariopsis brevicaulis

100,00 100,00 100,00 100,00 100,00

65,9133

47,333334,6200

10,81330,00

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

Po

rcen

taje

de

inh

ibic

ión

Concentraciones del extracto de G. australe

19


Control negativo (Halo de crecimiento

100%)





Figura 5. Halos de crecimiento de Scopulariopsis brevicaulis de acuerdo a la

concentración del extracto de Pycnoporus sanguineus

Concentraciones a partir del 20% hasta 100% generaron una inhibición total de la

cepa correspondiente al 100%; con las concentraciones al 15%, 10%, 5% y 1% las

medias fueron muy diferentes variando en función en la concentración (Figura 6).

Figura 6. Media de los porcentajes de inhibición de S. brevicaulis frente a la acción

del extracto de P. sanguineus

100,00 100,00 100,00 100,00 100,00

68,77

53,69

38,92

21,22

0,270,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

Po

rcen

taje

de

inh

ibic

ión

Concentraciones del extracto de P. sanguineus

20

De acuerdo a los porcentajes de inhibición registrados, el extracto de P. sanguineus a

una concentración de 0,5 y 1% fue inocuo sobre S. brevicaulis al inhibir menos del

30% de su halo de crecimiento; ligeramente tóxico con el 5, 10 y 15%; y finalmente

con una concentración desde 20% en adelante fue tóxico para la cepa al inhibir más

del 99% del crecimiento del hongo patógeno (inhibición total, 100%).

Actividad del Extracto de Pycnoporus sanguineus sobre el crecimiento de

Aspergillus terreus

Con el extracto de P. sanguineus sobre el crecimiento de A. terreus a una

concentración a partir del 10% se evidenció una media de porcentaje de inhibición

constante de 100% (Figura 7); mientras que con las demás concentraciones el

crecimiento fue significativamente diferente.

Efecto del extracto de Pycnoporus sanguineus frente a Aspergillus terreus







Figura 7. Halos de crecimiento de Aspergillus terreus de acuerdo a la concentración

del extracto de Pycnoporus sanguineus

21

Los porcentajes de inhibición fueron iguales a partir de la concentración al 10% hasta

100% con una inhibición total del hongo. Con las concentraciones al 5% y 1% las

medias fueron muy diferentes variando en función en la concentración, siendo

mínima con el 0,5% (Figura 8).

Figura 8. Media de los porcentajes de inhibición de A. terreus frente a la acción del

extracto de P. sanguineus

En base a los porcentajes de inhibición registrados, el extracto de P. sanguineus fue

tóxico para A. terreus a una concentración desde el 10% al 100% inhibiendo más del

99% del crecimiento del patógeno; ligeramente tóxico al 5% al inhibir entre el 30 y

79% del crecimiento; e inocuo con el 1% y 0,5%, inhibiendo menos del 30%.

Comparación entre concentraciones de un mismo extracto

Al aplicar la prueba estadística para muestras relacionadas, se determinó que el

promedio de los halos de crecimiento entre las concentraciones al 20% hasta el 0,5%

fueron estadísticamente diferentes considerando un P<0,05, donde a mayor

concentración de los extractos se obtuvo mayor efecto inhibitorio; por el contrario,

con las concentraciones superiores al 20% no existió diferencia significativa ya que

dichas concentraciones generaron el mismo porcentaje de inhibición al inhibir el

100% del crecimiento de las cepas patógenas con un P>0,05(Anexo E-2).

Comparación entre grupos

Efecto del extracto de Ganoderma australe versus el efecto del extracto de

Pycnoporus sanguineus sobre el crecimiento de Aspergillus terreus

En el análisis comparativo del efecto de los extractos de G. australe y P. sanguineus

sobre el crecimiento de A. terreus (Tabla 3), se evidencia una variación en el

porcentaje de inhibición en concentraciones al 15%, 10%, 5% y 1%, considerando el

100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00

78,08

17,85

0,080,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

Po

rcen

taje

de

inh

ibic

ión

Concentración del extracto de P. sanguineus

22

valor P<0,05; siendo el extracto de P. sanguineus el que generó los porcentajes más

altos de inhibición.

Excepto con la concentración al 0,5%, cuyo porcentaje de inhibición es similar en

ambos casos por lo que no tiene variación significante (P (0,15)>0,05). Entre el 15%

y el 20% no existen diferencias significativas ya que en ambos casos se generó el

mismo porcentaje de inhibición (100%).

Tabla 3. Prueba de muestras independientes entre la acción de los extractos de

Ganoderma australe y Pycnoporus sanguineus sobre el crecimiento de Aspergillus

terreus

Prueba de muestras independientes

Dosis de

los

extractos

%Inhibición prueba t para la igualdad de medias

E1

(X ± DE)

E2

(X ± DE) t Sig.

(bilateral)

Diferencia

de medias

95% de intervalo de

confianza de la

diferencia

Inferior Superior

10% 76,74±2,05 100±0 44,01 <0,001 23,25 22,17 24,34

5% 42,89±2,92 78,07±1,4

6

41,79 <0,001 35,20 33,47 36,93

1% 10,15±1,06 17,85±2,6

1

10,58 <0,001 7,70 6,21 9,19

0,5% 0 0,08±0,21 1,47 0,15 0,08 0,03 0,19

* X ± DE indican el promedio y desviación estándar del porcentaje de inhibición del

crecimiento en función de cada extracto. E1: se entiende como extracto de

Ganoderma australe y E2 como extracto de Pycnoporus sanguineus. No se

consideraron las concentraciones a partir del 15% al 100%, ya que los resultados

fueron constantes (100% de inhibición).

Efecto del extracto de Ganoderma australe versus el extracto de Pycnoporus

sanguineus sobre el crecimiento de Scopulariopsis brevicaulis

De forma similar al anterior, entre los extractos de G. australe y P. sanguineus sobre

el crecimiento de S. brevicaulis se evidenció una variación de las medias entre los

extractos con las concentraciones al 20%, 15%, 10%, 5% y 1%, al determinar que el

valor P<0,05. Mientras que con la concentración al 0,5% no existe diferencia

estadísticamente entre ambos extractos (P (0,65)>0,05) (Tabla 4).

23

Tabla 4. Prueba de muestras independientes entre la acción de los extractos de

Ganoderma australe y Pycnoporus sobre el crecimiento de Scopulariopsis

brevicaulis Prueba de muestras independientes

Dosis

de los

extractos

%Inhibición prueba t para la igualdad de medias

E1

(X ± DE)

E2

(X ± DE)

T Sig.

(bilateral)

Diferencia

de medias

95% de intervalo

de confianza de la

diferencia

Inferior Superior

15% 65,93±2,17 68,78±2,65 3,23 <0,001 2,85 1,04 4,66

10% 47,33±1,36 53,7±1,65 11,48 <0,001 6,35 5,22 7,49

5% 34,63±2,40 38,93±1,56 5,81 <0,001 4,30 2,78 5,82

1% 10,81±2,01 21,22±3,09 10,94 <0,001 10,41 8,46 12,36

0,5% 0,15 0,26±0,52 0,45 0,65 0,07 0,26 0,40


crecimiento en función de cada extracto. E1: se entiende como extracto de

Ganoderma australe y E2 como extracto de Pycnoporus sanguineus. No se

consideraron las concentraciones a partir del 20% al 100%, ya que los resultados

fueron constantes (100% de inhibición).

Efecto del extracto de Ganoderma australe sobre el crecimiento de los patógenos

Aspergillus terreus y Scopulariopsis brevicaulis

Al realizar las comparaciones, se determinó que existe una variación de crecimiento

de las cepas fúngicas entre las concentraciones 20%, 15%, 10%, 5% y 0,5% del

extracto de G. australe; mientras que con el 1% del extracto, estadísticamente se

obtuvo el mismo efecto sobre las cepas de A. terreus y S. brevicaulis al considerar la

similitud de las medias y el valor de P (0,27)>0,05 (Tabla 5).

Tabla 5. Prueba de muestras independientes entre la acción del extracto de

Ganoderma australe sobre el crecimiento de Aspergillus terreus y Scopulariopsis


Dosis

de los

extractos

%Inhibición de los

patógenos

prueba t para la igualdad de medias

Sp1

(X ± DE)

Sp2

(X ± DE)

t Sig.

(bilateral)

Diferencia

de medias

95% de intervalo

de confianza de la

diferencia

Inferior Superior

15% 100 65,93±2,17 60,82 <0,001 34,09 32,94 35,23

10% 76,74±2,05 47,33±1,36 46,33 <0,001 29,41 28,11 30,71

5% 42,89±2,92 34,63±2,40 8,46 <0,001 8,26 6,26 10,26

1% 10,15±1,96 10,81±2,01 -1,12 0,27 -0,66 -1,86 0,54

0,5% 0 0,15 -2,13 0,04 -0,19 -0,38 -0,01


crecimiento de cada patógeno. Sp1 se entiendo como Aspergillus terreus y Sp2 como

24

Scopulariopsis brevicaulis. No se consideraron las concentraciones a partir del 20%

al 100%, ya que los resultados fueron constantes (100% de inhibición).

A. terreus fue la cepa más sensible a la acción del extracto ya que su crecimiento se

inhibió totalmente a partir de la concentración al 15%.

Efecto del extracto de Pycnoporus sanguineus sobre el crecimiento de

Scopulariopsis brevicaulis y Aspergillus terreus

Las cepas reaccionaron de manera estadísticamente diferente a las concentraciones al

20%, 15%, 10%, 5% y 1% del extracto de P. sanguineus; mientras que con la

concentración al 0,5%, el extracto tuvo el mismo efecto sobre las cepas de A. terreus

y S. brevicaulis al considerar valor de P (0,21)>0,05 (Tabla 6).

Tabla 6. Prueba de muestras independientes entre la acción del extracto de

Pycnoporus sanguineus sobre el crecimiento de Aspergillus terreus y Scopulariopsis


Dosis

de los

extractos

%Inhibición de los

patógenos

prueba t para la igualdad de medias

Sp1

(X ± DE)

Sp2

(X ± DE)

t Sig.

(bilateral

)

Diferenci

a de

medias

95% de intervalo de

confianza de la

diferencia

Inferior Superior

15% 100 68,78±2,6

5

-45,68 <0,001 -31,23 -32,63 -29,83

10% 100 53,7±1,65 -108,42 <0,001 -46,31 -47,19 -45,44

5% 78,07±1,46 38,93±1,5

6

-71,05 <0,001 -39,16 -40,29 -38,03

1% 17,85±2,61 21,22±3,0

9

3,23 <0,001 3,37 1,23 5,50

0,5% 0,08±0,21 0,27±0,52 1,29 0,21 0,19 -0,11 0,48


crecimiento de cada patógeno. Sp1 se entiendo como Aspergillus terreus y Sp2 como

Scopulariopsis brevicaulis. No se consideraron las concentraciones a partir del 20%

al 100%, ya que los resultados fueron constantes (100% de inhibición).

En base a lo mencionada, A. terreus fue la cepa más sensible a la acción del extracto

ya que se inhibió totalmente su crecimiento a partir de la concentración al 10%.

Para corroborar los resultados se realizó el Test de ANOVA, evidenciando la similitud

de resultados (ANEXO E-3).

Categorización del efecto de los extractos etanólicos

Ambos extractos presentaron efectos fungicidas y fungistático sobre el crecimiento

micelial de los hongos patógenos cuyo efecto varió en función de la concentración de

los mismos.

25

El extracto de G. australe a partir de la concentración equivalente al 20% resultó ser

fungicida para la cepa S. brevicaulis ya que no se evidencio crecimiento micelial; en

el caso de A. terreus, el extracto fue fungicida incluso a una concentración del 15%

(Figura 9).

Dosis menores a las mencionadas resultaron generar un efecto fungistático sobre las

cepas ya que al ser re-inoculadas en un medio de cultivo convencional, el micelio se

reactivó.

Efecto del extracto de Ganoderma australe sobre las cepas fúngicas

Efecto del extracto de Ganoderma australe sobre Aspergillus terreus



Extracto al 1% Extracto al 0,5%

Efecto del extracto de Ganoderma australe sobre Scopulariopsis brevicaulis

26





Figura 9. Categorización del efecto del extracto de Ganoderma australe sobre las

cepas patógenas.

Por otro lado, el extracto de P. sanguineus mostro una importante actividad fungicida

en concentraciones desde el 20% para S. brevicaulis; sin embargo, para la cepa de A.

terreus fue fungicida incluso con el 10% del extracto (Figura 10).

Dosis menores a las mencionadas resultaron generar un efecto fungistático sobre las

cepas ya que al ser re-inoculadas en un medio de cultivo convencional, el micelio se

reactivó.

27

Efecto del extracto de Pycnoporus sanguineus sobre las cepas fúngicas

Efecto del extracto de Pycnoporus sanguineus sobre Aspergillus terreus




Efecto del extracto de Pycnoporus sanguineus sobre Scopulariopsis brevicaulis

Extracto al 100% Extracto al 80% Extracto al 60% Extracto al

40%

28



Figura 10. Categorización del efecto del extracto de Pycnoporus sanguineus sobre

las cepas fúngicas.

29

DISCUSIÓN

Tras realizar las pruebas de rendimiento de los medios de cultivo, se determinó que el

medio de cultivo Agar Sabouraud es el idóneo para el crecimiento de las cepas

fúngicas de trabajo, lo cual se contrapone a la gran cantidad de estudios que reportan

al medio de cultivo PDA como el estándar para el análisis de crecimiento micelial.

Esto se debe a que en análisis de crecimiento micelial se suele enriquecer el medio

PDA con aditivos que favorezcan las fuentes de nitrógeno y carbono, lo cual no se

realizó en la presente investigación (Moreno-Limón et al. 2011). Considerando lo

mencionado, Guillén-Navarro (1998), apoya el uso del medio de cultivo Agar

Sabouraud ya que su composición de glucosa es de 40 g/l. lo que favorece el

crecimiento de microorganismos.

Aunque se logró estandarizar el tiempo de incubación necesario para que las cepas

colonicen el medio, este fue mucho mayor al que señala la teoría (10 días de

incubación para A. terreus y 12 días para S. brevicaulis); lo cual puede deberse a que

las cepas estuvieron almacenadas a 5°C volviéndose inactiva, por lo que se realizaron

procesos simultáneos de incubación de 25 a 30°C para reactivarlas.

Cabe mencionar que el requerimiento de más días de incubación pudo estar

influenciado por los intervalos óptimos de temperatura que necesita cada organismo,

los cuales suelen variar ligeramente incluso entre cepas de una misma especie

(Atkinson y Mavituna, 1991); en el proyecto se trabajó a 30°C para ambas cepas

fúngicas, la cual se encuentra entre los rangos óptimos mencionados en la literatura.

Por otro lado, el rendimiento de los extractos obtenidos fue de 17,2%; y pese a que se

obtuvo buenos resultados en la inhibición de los patógenos, este fue inferior en

comparación con otros estudios. Lo cual puede deberse al solvente empleado para la

obtención de los mismos, ya que García et al. (2016) al utilizar solventes como éter y

acetonas obtuvieron mejor rendimiento (rendimiento >50%) y mayor cantidad de

metabolitos encontrados que al usar etanol. A más de la influencia del solvente, la

técnica mediante la cual se obtuvieron los extractos también puede haber influido en

el rendimiento, ya que Mazzutti et al. (2012), en su investigación concluyen que con

la técnica de extracción por cámara Soxhlet se obtuvo mejor rendimiento de los

extractos de Agaricus brasiliensis en comparación con el obtenido por medio de

maceración.

No se han registrado estudios en los que se emplee el extracto de G. australe y P.

sanguineus como inhibidores de crecimiento in vitro de Scopulariopsis brevicaulis y

A. terreus; sin embargo, varios autores han demostrado la actividad antimicrobiana de

dichos macrohongos (Smania et al. 2003; Cruz-Muñoz, 2012; Ojeda-Gutiérrez et al.

30

2012; Guerrón-Jaramillo, 2016 y Lara-López, 2016); corroborando dicha actividad

antifungica con los resultados obtenidos en la presente.

En el caso de G. australe, Smania et al. (2003) demostró el potencial de este hongo

para inhibir el crecimiento de Trichophyton mentagrophytes y Microsporum cannis,

cepas fúngicas relacionados con cuadros micóticos en humanos: requiriendo una

concentración del extracto a 0,5 y 1 mg/ml respectivamente. Es importante mencionar

que la concentración requerida para inhibir patógenos es diferente de acuerdo a las

características propias de los microorganismos, del anfitrión y de la farmacocinética.

(Walsh et al. 2008); en función a lo mencionado, en el presente estudio, para inhibir

completamente a A. terreus y S. brevicaulis utilizando el extracto de la misma especie

de macrohongo se necesitó de concentraciones al 5,1mg/ml y 6,8mg/ml

respectivamente, dosis mayores a las requeridas contra los patógenos mencionados

anteriormente. Además, se observó que a medida que la concentración bajaba, el

extracto se tornada inocuo para los organismos.

De manera similar Palacios et al. (2011) emplearon el extracto de Ganoderma sp.

para el control de los hongos Curvularia clavata y Phytophthora nicotianae

generando una inhibición de 48,8% y 53,3% respectivamente, y aunque es bajo en

comparación con los porcentajes registrados para otras cepas, es muy similar a los

resultados que se tiene con el uso del tratamiento convencional con tebuconazol el

cual inhibe un 57,4%. De igual forma su efectividad como antifúngico se apoyó con

la presente investigación en la cual con una dosis del 20% y 15% del extracto se logró

inhibir el 100% del crecimiento de S. brevicaulis y A. terreus respectivamente.

Para P. sanguineus la mayoría de estudios resaltan su potencial antibacteriano,

antiparasitaria, antioxidante e incluso antiviral, pero son muy pocos los estudios que

avalan su actividad antifungica; sin embargo, en el presente estudio sobresale su

actividad fungicida.

Ojeda-Gutiérrez (2012) evaluó la actividad de este hongo para el control de Mycena

citricolor, logrando inhibir el crecimiento in vitro de la colonia e in vivo provocó lisis

de las hifas, sin embargo, su acción fue mucho menor que con Trichoderma

harzianum Rifai, hongo probado efectivamente como fungicida. En contraste con

estos resultados, en el presente estudio resalta P. sanguineus como el extracto que

genero los mayores porcentajes de inhibición sobre ambas cepas fúngicas, resaltando

que fue más efectivo en el control de A. terreus en el cual con una concentración de

3,4mg/ml equivalente al 10% logro inhibir el 100%. Este extracto fue toxico para la

cepa de S. brevicaulis a partir de una concentración al 20% equivalente a (6,8 mg/ml).

Los resultados obtenidos demuestran la efectividad de P. sanguineus para el

tratamiento de los patógenos mencionados, además superan a los resultados obtenidos

por Cruz-Muñoz (2012) el cual utilizo el extracto de P. sanguineus a concentraciones

de 10, y 20 mg/mL para inhibir a B. cinérea, logrando inhibir solo el 70% y 60% del

crecimiento del patógeno.

31

La mayoría de investigaciones mencionan que la efectividad del extracto de P.

sanguineus como antifúngico puede variar de acuerdo a la producción de cinnabarina

ya que es el principal responsable de su actividad antifungica, siendo más efectivo

cuando se utilizan cuerpos fructíferos de menor tamaño ya que según Smânia et al.

(1995) en los cuerpos fructíferos de menor dimensión existe más producción de este

compuesto. Lo mencionado no se consideró en la elección de los cuerpos fructíferos

para la obtención del extracto.

Es importante también considerar que la efectividad del extracto puede variar de

acuerdo al patógeno, pues un estudio realizado por Viecelli et al. (2010) siguiendo la

misma metodología descrita, probó inhibir el crecimiento de Colletotrichum fragarie

al 50% y C. gloeosporioides solo un 40%; mientras que sobre el hongo

Pseudocercospora griseola mostro ser un efectivo fungicida ya que logro inhibir el

100% del crecimiento micelial con apenas una concentración a partir del 5% (Cruz-

Muñoz (2012). Esto explica la variación en la respuesta de las cepas estudiadas a la

acción de un mismo extracto.

De manera general, con ambos extractos se logró inhibir efectivamente el crecimiento

de las cepas fúngicas analizadas; las concentraciones de 20, 40, 60, 80 y 100% no

presentaron diferencia significativa entre si ya que generaron una inhibición total del

crecimiento de S. brevicaulis y A. terreus; a medida que la concentración disminuyo,

el porcentaje de inhibición fue menor teniendo que en ambos cosas una dosis al 0,5%

ya no es efectiva para ninguno de los hongos patógenos; sin embargo, de manera

general, la actividad antifungica registrada en este estudio es mayor en comparación

con otros extractos sobre las cepas fúngicas de estudio.

En cuanto a la actividad fungicida y fungistática; las concentraciones del 20, 40, 60,

80 y 100% e incluso al 15% y 10% en el caso de A. terreus generaron un efecto

fungicida sobre las cepas, lo cual puede deberse a la elevada concentración de

compuestos químicos que actúan sobre sitios claves de la ruta metabólica afectando la

producción de enzimas y proteína indispensables para la vida del microorganismo, así

como el ingreso de nutrientes desde el medio (Cochrane, 1963).

Respecto a las concentraciones al 15%, 10%, 5% y 1%, estas probaron ser menos

efectivas ya que se observó crecimiento micelial; no obstante, en el caso de A. terreus

la inhibición del crecimiento fue mayor al 50% a partir de la concentración al 10%

del extracto de G. australe y a partir de la concentración al 5% del extracto de P.

sanguineus, que continúan siendo efectivos al comparar con las resultados que se

obtienen con antifúngicos convencionales como el fluconazol, sobre los cuales

Aspergillus sp. ha probado ser resistente (Potón, 2006).

De acuerdo a los resultados, dichas concentraciones además generaron un efecto

fungistático lo cual puede deberse a que las concentraciones de los compuestos

fueron menores por lo cual no afecto drásticamente los procesos enzimáticos, sino

32

más bien los procesos relacionados con el crecimiento, desarrollo y germinación de

esporas (Veloz-García et al. 2010); este proceso es reversible ya que al re inocular el

micelio este se reactivó (Sánchez-León et al. 2015).

El potencial antifúngico de un extracto es mayor cuando menos dosificación requiere

para inhibir el crecimiento del patógeno (Chang et al. 2007), en base a los expuesto,

al comparar la efectividad de ambos extractos, el obtenido a partir de los basidiomas

de P. sanguineus fue mejor, ya que logro inhibir totalmente a A. terreus con una

concentración de 10%, mientras que con el extracto de G. australe se requirió una

concentración mayor (15%) para generar el mismo porcentaje de inhibición; en

cambio, sobre S. brevicaulis ambos extractos son igual de efectivos ya que para

inhibir el 100% de la cepa fue necesario dosis a partir del 20% en ambos casos.

S. brevicaulis, fue la especie más resistente a la acción de los extractos ya que

requirió de dosis mayores para que la inhibición de su crecimiento sea mayor al 50%

(desde 15 % del extracto de G. australe y a partir del 10% del extracto de P.

sanguineus). Esto se debe a la conocida resistencia de S. brevicaulis a los

antifúngicos, varios estudios han reportado la resistencia de la cepa patógenas al

fluconazol, caspofungina, fluorocitosina y anidulafungina, representando así un grave

inconveniente en su tratamiento (Odero et al. 2004 y Guerrero et al. 2014).

A. terreus fue la cepa más sensible a la acción de los extractos; sin embargo, es

importante mencionar factores que pudieron influenciar en los resultados obtenidos;

un estudio realizado por Nierman et al. (2005), sobre una especie del mismo género,

el cual sugiere que la temperatura influye de gran manera en las respuestas de los

patógenos; esto luego de analizar la adaptación metabólica de A. fumigatus a tres

diferentes temperaturas: a 30°C que es la temperatura óptima en el ambiente y a 37

y 48°C que correspondería a la temperatura en el cuerpo humano. La investigación

revelo que los genes se expresan de manera diferente a cada temperatura, 323

genes tuvieron niveles de expresión más alta a las 48°C y solo 135 genes se

expresaron a un mayor nivel a los 37°C lo que indica que la temperatura de 30 y

37°C no son suficientes para activar genes relacionados a la virulencia; lo que

sugiere que las cepas estudiadas no lograron expresar muchos de los genes que

influyen en su patogenicidad por lo que fueron vulnerables a la acción de los

extractos.

Ambos hongos patógenos han probado ser sensibles frente al itraconazol, anfotericina

B y voriconazol, siendo estos los principales antifúngicos empleados para su

tratamiento (Odero et al. 2004); a pesar de ello, su efectividad se reduce a medida que

los hongos adquieren resistencia; por lo que los resultados obtenidos en el estudio

constituyen una posible estrategia terapéutica mediante el diseño de moléculas

potentes para su control.

33

Por otro lado, al comparar los resultados obtenidos con otros estudios se observa

ligeras diferencias entre los compuestos encontrados y su concentración, ya que esto

varía en función de las técnicas interlaboratorio, los métodos de colección, transporte

y almacenamiento, y sobre todo de la composición propia de los hongos,

convirtiéndose en un obstáculo para realizar comparaciones entre investigaciones

(Moro-Lagares, 2015).

En la presente investigación la mayor cantidad de compuestos se encontró en el

extracto de P. sanguineus. Estudios realizados sobre la misma especie muestran la

variabilidad en las unidades químicas encontradas, sin embargo, resalta la

cinnabarina, la cual es característica de la especie, como el principal responsable de la

actividad antimicrobiana ya que ha sido probada con éxito en el control de bacterias

Gram positivas y negativas, e incluso en virus (Pineda-Insuasti et al. 2017).

La mayoría de estudios sobre P. sanguineus se enfocan en el aislamiento de lacasa y

cinnabarina como principales responsables de su potencial bioactivo (Acosta-

Urdapilleta et al. 2010; Cruz-Muñoz, 2015); a más de esto, en el presente estudio se

encontraron hidrocarburos, ácidos esteáricos y esteroles.

Respecto a los ácidos se encontraron ácido n-hexadecanoico o ácido palmítico, ácido

octadecanoico y ácido trans-13-octadecenoico, de los cuales existe evidencia de sus

propiedades antiarterioescleróticas, antidiabéticas, inmunomoduladoras,

anticancerígenas y con alto potencial antimicrobiano (León-Sánchez, 2014); también

se encontraron hidrocarburos terpénicos como 17-Pentatriacontene y esteroles como

γ-Sitosterol, el cual actúa sobre las células cancerosas disminuyendo su crecimiento y

contribuyendo a su eliminación, además, mediante bioprocesos de trasformación se

usa para la producción de hormonas útiles en la industria farmacéutica (Acosta-

Urdapilleta et al. 2010).

Cabe resaltar la presencia de estigmastan-3,5-dieno el cual es un importante mediador

de la lacasa asociado con el potencial biotecnológico y terapéutico de P. sanguineus

(Madhavi y Lele, 2009; Rico-Campos, 2010). En base a la investigación realizada

por Cruz Muñoz (2012) este compuesto tiene un gran potencial para tratar

enfermedades causadas por hongos sobre todo a nivel dérmico.

Respecto a los compuestos químicos identificados en el extracto de G. australe,

aunque con una ligera variación, los resultados son muy similares a los obtenidos por

Nieto y Valencia (2002), el cual identifico compuestos esteroles, ésteres, ácidos

grasos e incluso hidrocarburos. Dentro de los compuestos comunes en ambos estudios

están el ergosterol, 5,6- dehidroergosterol y éster etílico del ácido linoleico. Es

importante mencionar que en el extracto obtenido en la investigación no se

encontraron hidrocarburos ni otros ácidos grasos como ácidos aplanoxídicos, el cual

es común en los estudios realizados por Valencia (2002 y Smania et al. (2003).

Algunos compuestos como 9(11)-dehidroergosterol benzoate, ácido oleico (E)-9éster

34

etílico del ácido octadecenoico no se han hallado en los artículos analizados. Estas

ligeras variaciones pueden deberse a que para la determinación de los compuestos

químicos solo se consideraron aquellos con mayor longitud de onda por su mayor

probabilidad de identificación.

Los estudios realizados por Guerrón-Jaramillo (2016) y Lara-López (2016), resaltan

el potencial antimicrobiano del quitosano obtenido de los cuerpos fructíferos de G.

australe compuesto por β-(1-4) D-glucosamina y N-acetil-D-glucosamina; sin

embargo en el presente estudio no se detectaron ninguno de los compuestos

mencionados. Lo cual, según lo señalado por Guerrón-Jaramillo (2016), se debe a que

el procedimiento para la obtención de los compuestos del quitosano requiere la

preparación de soluciones acuosas con agentes plastificantes y reticulantes.

Es importante resaltar que en el control negativo ambas cepas fúngicas colonizaron

todo el medio de cultivo por lo que se descarta que la actividad inhibitoria se debe a

la acción del solvente utilizado.

Las limitaciones de la presente investigación fueron: dificultades técnicas para la

adquisición de otras cepas causales de micosis en humanos para la realización de

las pruebas de actividad antifungica; el no otorgamiento de los permisos requeridos

para la obtención de otros tipos de solventes como acetona, cloroformo y éter; que

no se determinó la concentración mínima inhibitoria; la falta de equipos en el

laboratorio que permitan simular de mejor manera las condiciones in vivo sobre

todo en cuanto a variación de temperatura y humedad; no contar con equipos ni

personal técnico especializado para la realización de pruebas toxicológicas,

ecotoxicólogicas y de análisis de residuos de los extractos; así como para el

aislamiento de compuestos específicos de interés farmacológico.

https://es.wikipedia.org/wiki/Glucosamina

https://es.wikipedia.org/wiki/N-Acetilglucosamina

35

CONCLUSIONES

G. australe como P. sanguineus poseen propiedades antifúngicas, pudiendo

así constituir una fuente importante de compuestos químicos para el desarrollo

de antifúngicos de origen natural; exceptuando con las concentraciones al 1 y

0,5% las cuales resultaron ser inocuas para las cepas de estudio.

Como tratamiento contra S. brevicaulis se pueden emplear tanto el extracto de

G. australe como el de P. sanguineus ya que ambos a una concentración de

20%, resultaron ser tóxicos para el patógeno generando un efecto fungicida

sobre ellos. Para A. terreus, el extracto recomendado en base a los resultados

es el de P. sanguineus ya que este fue toxico para la cepa con una

concentración al 10%.

El extracto etanólico de P. sanguineus mostro mayor actividad fungicida

sobre S. brevicaulis y A. terreus, siendo esta última la cepa más sensible a la

acción de las diferentes concentraciones del extracto. En el caso de A. terreus

presentó actividad fungistática a concentraciones menores al 10%.

Los extractos obtenidos poseen compuestos esteroles, terpenos, ésteres y

ácidos grasos como los responsables de la actividad antifúngica detectada en

el estudio, muchos de ellos con propiedades antioxidantes que apoyan el uso

de estos extractos para tratamientos médicos en humanos.

36

RECOMENDACIONES

Son muy pocos los estudios realizados en Ecuador respecto al potencial

biológico de extractos de macrohongos, por lo que se recomienda ejecutar

estudios posteriores del efecto de G. australe y P. sanguineus sobre otros

hongos de interés clínico, para valorar de mejor manera su actividad

antifungica.

Realizar ensayos comparativos utilizando diferentes solventes de extracción

como acetona, cloroformo y éter, para determinar con cual se obtiene un

mayor rendimiento de los extractos.

Se recomienda realizar más ensayos, sobre todo probar concentraciones entre

15 y 20%, para determinar la concentración mínima inhibitoria para ambos

hongos patógenos.

Evaluar la efectividad de los extractos a diferentes temperaturas de incubación

para determinar su acción en concisiones similares a las del cuerpo humano

antes de realizar estudios in vivo.

Realizar pruebas toxicológicas, ecotoxicológicas, así como análisis de

residuos, con la finalidad de predecir o descartar riesgos en la aplicación

clínica y conocer la relación costo beneficio para futuras aplicaciones

terapéuticas.

Se recomienda aislar los compuestos específicos de interés farmacológico

presentes en los extractos que son responsables de la actividad antifúngica

para determinar su estabilidad e identificar agentes físico-químicos que

pueden interferir en la actividad biológica.

37

LITERATURA CITADA:

Acosta-Urdapilleta L., G.A. Paz, A. Rodríguez, M. Adame, D. Salgado, M. Montiel-

Peña, F. Medrano-Vega y Villegas-Villareal. 2010. Pycnoporus sanguineus, un

hongo de potencial biotecnológico. Universidad Autónoma del Estado de Morelos.

Hongos comestibles y medicinales: Producción, desarrollo y consumo. ISBN 970-

9752-01-4.

Adam A., P. Bauer, B. Duignan, A. Eldridge, J.E. Luebering, M. Petruzzello, J.

Rafferty, M. Ray, K. Rogers, A. Tikkanen, J. Wallenfeldt and Zelazko A. 2018.

Mycosis Pathology. Encyclopaedia Britannica.

Adgamov, R. R., Timchenko, N. F., Zaitseva, E. A., Pushkareva, V. I., Kolbasov, D.

V., Egorova, I. y Ermolaeva, S. A. 2013. Ecological and genetic mechanisms of

development of epidemiologically significant strains of sapronosis causative agents.

Biology Bulletin Reviews 3(2), 125-138.

Alarcón, A., y Irney, D. 2006. Evaluación de técnicas de conservación para hongos

filamentosos y levaduriformes en el cepario de la Pontificia Universidad

Javeriana (Bachelor's thesis, Facultad de Ciencias).

Alós, J. I. 2015. Resistencia bacteriana a los antibióticos: una crisis

global. Enfermedades infecciosas y microbiologia clinica, 33(10), 692-699.

Álvarez, S., Salazar, J., Salazar, E., y Vivar, N. 2010. Aspergillosis, diagnóstico

histopatológico de dos casos. Revista Latinoamericana de Patología Clínica y

Medicina de Laboratorio, 57(4), 205-208.

Arévalo A. y Enciso R. 1996. Determinación de la actividad antimicrobiana

(bacterias, hongos y levaduras) de algunas especies de Espeletias encontradas en el

páramo de Guasca. Carrera Bacteriología. Facultad Ciencias Básicas. Departamento

Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana. Trabajo de Pregado. Bogotá D.C.

Pág. 14,16, 17, 18, 21, 22, 23, 24, 25

Arista, M. (2013). Aktivitas antioksidan ekstrak etanol 80% dan 96% daun katuk

(Sauropus androgynus (L.) Merr.). Calyptra, 2(2), 1-16.

Atkinson B. y Mavituna F. 1991. Biochemical engineering and biotechnology

handbook. New York, Stockton Press 224-226

Biedenbach, D. J., Moet, G. J., y Jones, R. N. 2004. Occurrence and antimicrobial

resistance pattern comparisons among bloodstream infection isolates from the

https://www.britannica.com/editor/Melissa-Petruzzello/9400228

https://www.britannica.com/editor/John-P-Rafferty/6747

https://www.britannica.com/editor/John-P-Rafferty/6747

https://www.britannica.com/editor/Michael-Ray/6392

https://www.britannica.com/editor/Kara-Rogers/6713

https://www.britannica.com/editor/Amy-Tikkanen/6393

https://www.britannica.com/editor/Jeff-Wallenfeldt/6749

https://www.britannica.com/editor/Alicja-Zelazko/9823860

https://www.britannica.com/editor/The-Editors-of-Encyclopaedia-Britannica/4419

38

SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (1997–2002). Diagnostic

microbiology and infectious disease, 50(1), 59-69.

Bragulat, M. R., Abarca, M. L., Bruguera, M. T., y Cabanes, F. J. 1991. Dyes as

fungal inhibitors: effect on colony diameter. Applied and environmental

microbiology, 57(9), 2777-2780.

Brossard-González, C. O., Ferrari, R. A., Pighinelli, A. L., y Park, K. J. 2010.

Evaluación preliminar del etanol anhidro como solvente en la extracción de aceite de

semillas de jatrofa (Jatropha curcas L.). Grasas y aceites, 61(3), 295-302.

Cabañes, F. 2008. Micosis y zoonosis: Cryptococcus spp.Rev Iberoam Micol, vol. 25,

p. S1-S3.

Cáceres, A. 1999. Manual de procedimientos del proyecto biodiversidad tropical

centroamericana. OEA. Guatemala. Universidad de San Carlos de Guatemala. 17

Canel-Monterroso, L. Y. 2012. Actividad antimicrobiana y antimicótica de los

extractos de cinco especies de plantas del género Vernonia nativas del sur-occidente

de Guatemala.

Carrillo-Muñoz, AJ., Quindós, G., y López-Ribot., J.L. 2004. Current developments

in antifungical agents: Present and future, Curr Med Chem Anti-Infect Agents; 3: in

press.

Casals, J. B. 1979. Tablet sensitivity testing on pathogenic fungi. Journal of clinical

pathology, 32(7), 719-722.

Cáceres Rueda de León, I., Colorado Vargas, R., Salas Muñoz, E., Muñoz

Castellanos, L. N., y Hernández Ochoa, L. 2013. Actividad Antifúngica in vitro de

Extractos Acuosos de Especias contra Fusarium oxysporum, Alternaría alternata,

Geotrichum candidum, Trichoderma spp., Penicillum digitatum y Aspergillus

niger. Revista mexicana de fitopatología, 31(2), 105-112.

Castaño, P., 2010. Actividad bactericida del extracto etanólico y del aceite esencial de

hojas de Rosmarinus officinalis L. sobre algunas bacterias de interés

alimentario.Universidad de Antioquia, Colombia

Carrasco, L., y Pérez, J. 2000. Histopathological diagnosis of mycoses in veterinary

pathology. Revista iberoamericana de micologia, 17(1), S18-22.

39

Chang, W. T., Chen, Y. C., y Jao, C. L. 2007. Antifungal activity and enhancement of

plant growth by Bacillus cereus grown on shellfish chitin wastes. Bioresource

technology, 98(6), 1224-1230.

Comité Nacional de Estándares de Laboratorio Clínico. 1995. Método de referencia

para la prueba de susceptibilidad antifúngica de dilución en caldo de

levaduras; Norma aprobada M27-A. NCCLS, Wayne, PA.

Comité Nacional de Estándares de Laboratorio Clínico. 1999. Método de referencia

para la prueba de sensibilidad antifúngica a la dilución en caldo de hongos

filamentosos formadores de conidio: norma propuesta M38-P. NCCLS, Wayne, PA.

Cormican, MG y Pfaller, MA. 1996. Estandarización de las pruebas de

susceptibilidad antifúngica. Diario de la quimioterapia antimicrobiana

38, 561–78.

Correa, E., Cardona, D., Quiñones, W., Torres, F., Franco, A. E., Vélez, I. D., y

Echeverri, F. 2006. Leishmanicidal activity of Pycnoporus sanguineus. Phytotherapy

Research: An International Journal Devoted to Pharmacological and Toxicological

Evaluation of Natural Product Derivatives, 20(6), 497-499.

Cerón, C. 2018. Efecto antibacteriano del extracto de ajenjo (Artemisia absinthium

L.) sobre la cepa de Streptococcus mutans. Estudio in vitro (Bachelor's thesis, Quito:

UCE).

Cochrane, V. 1963. Physiology of Fungi. John Wiley & Sons, Inc. Nueva York.

https://archive.org/details/physiologyoffung00coch/page/n7

Cruz Muñoz, R. (2012). Producción de extractos de Pycnoporus sanguineus con

actividad antimicrobiana en hongos y bacterias fitopatógenas (Doctoral dissertation).

Cruz-Munoz, R., Pina-Guzman, A. B., Yanez-Fernandez, J., Valencia-Del Toro, G.,

Bautista-Banos, S., y Villanueva Arce, R. 2015. Pycnoporus sanguineus pigment

production on solid media. Agrociencia, 49(4), 347-359.

Cuenca-Estrella, M., Gomez-Lopez, A., Mellado, E., Buitrago, M. J., Monzón, A., y

Rodriguez-Tudela, J. L. 2003. Scopulariopsis brevicaulis, a fungal pathogen resistant

to broad-spectrum antifungal agents. Antimicrobial agents and chemotherapy, 47(7),

2339-2341.

Davicino, R., Mattar, M. A., Casali, Y. A., Correa, S. G., Pettenati, E. M., y

Micalizzi, B. 2007. Actividad antifúngica de extractos de plantas usadas en medicina

popular en Argentina. Revista peruana de biología, 14(2), 247-252.

Davel, G., y Canteros, C. E. 2007. Situación de las micosis en la República

Argentina. Revista argentina de microbiología, 39(1), 28-33.

40

Domínguez, A. 1973. Métodos de investigación Fitoquímica. Distrito Federal de

Mexico.

Domsch, K.H.; Gams, W.; Anderson, T, H. 2007. Compendium of soil fungi ed 2.

Eching, IHW Verlag.

Donnelly, W., Lass-Flörl11, C., Moore, C., Richardson12, M., Gaustad13, P.,

Schmalreck14, A., y Verweij, P. 2012. Método de dilución en caldo para la

determinación de las concentraciones mínimas inhibitorias de antifúngicos para

hongos filamentosos formadores de conidias.

Dosari, M. S. 2010. The effectiveness of ethanolic extract of Amaranthus tricolor L.:

A natural hepatoprotective agent. The American journal of Chinese medicine, 38(06),

1051-1064.

Eliopoulos, G. M., Perea, S., y Patterson, T. F. 2002. Antifungal resistance in

pathogenic fungi. Clinical Infectious Diseases, 35(9), 1073-1080.

EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibilily Testing). 2018. New

definitions of S, I and R. Disponible en: http://www.eucast.org/newsiandr/.

Consultado el: 05 de diciembre de 2018).

Esteban, A., Abarca, M. L., y Cabanes, F. J. 2005. Comparison of disk diffusion

method and broth microdilution method for antifungal susceptibility testing of

dermatophytes. Medical mycology, 43(1), 61-66.

Fauci, A. S., Touchette, N. A., y Folkers, G. K. 2005. Emerging infectious diseases: a

10-year perspective from the National Institute of Allergy and Infectious

Diseases. International Journal of Risk y Safety in Medicine, 17(3, 4), 157-167.

Ferreira, I. C., Heleno, S. A., Reis, F. S., Stojkovic, D., Queiroz, M. J. R.,

Vasconcelos, M. H., y Sokovic, M. 2015. Chemical features of Ganoderma

polysaccharides with antioxidant, antitumor and antimicrobial

activities. Phytochemistry, 114, 38-55.

Fiori, A. C. G., Schwan‐ Estrada, K. R. F., Stangarlin, J. R., Vida, J. B., Scapim, C.

A., Cruz, M. E. S., y Pascholati, S. F. 2000. Antifungal activity of leaf extracts and

essential oils of some medicinal plants against Didymella bryoniae. Journal of

Phytopathology, 148(7-8), 483-487.

Fridkin S.K y Jarvis W.R. 1996. Epidemiology of nosocomial fungal infection, Clin

Microbiol Rev, vol. 9 (page 499-511

41

García, T. E., García, A. U., Ramos, S. G. D., y López, P. M. G. 2016. Evaluación del

rendimiento de extractos en hojas de Ricinus communis L. Conciencia Tecnológica,

(52), 12-18.

Gerber, A. L. 2000. Esteróis e triterpenos de Ganoderma australe (Fr.) Pat. com

perspectivas de uso medicinal.

Girois, S. B., Chapuis, F., Decullier, E., y Revol, B. G. P. 2005. Adverse effects of

antifungal therapies in invasive fungal infections: review and meta-

analysis. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 24(2),

119-130.

Gómez, Y., Gil, K., González, E., y Farías, L. M. 2007. Actividad antifúngica de

extractos orgánicos del árbol Fagara monophylla (Rutaceae) en Venezuela. Revista de

biología tropical.

Guarro, J. 2012. Taxonomía y biología de los hongos causantes de infección en

humanos. Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica, 30(1), 33-39.

Guerrón-Jaramillo, M. A. 2016. Evaluación del procedimiento de obtención de un

biopolimero a partir del hongo Ganoderma Australe (Bachelor's thesis, Quito: UCE).

Grau, C., Sanchez, D., Zerpa, A., y Garcia, N. 2007. Influence of water activity, pH,

and temperature on growth of Aspergillus penicillioides and A. terreus, isolated from

dry and salted skipjack tuna (Katsuwonus pelamis) meat. Revista Cientifica-Facultad

De Ciencias Veterinarias, 17(2), 193-199.

Guerrero, I., Aznar, P., García-Martos, P., & Rodríguez-Iglesias, M. 2014.

Sensibilidad a antifúngicos de especies de Scopulariopsis de origen clínico. Rev Esp

Quimioter, 27(1), 17-21

Guerrero-Rodríguez, E., Solis-Gaona, S., Hernández-Castillo, F. D., Flores-Olivas,

A., Sándoval-López, V., y Jasso-Cantú, D. 2007. In vitro biological activity of

extracts of Flourensia cernua DC on postharvest pathogens: Alternaria alternata (Fr.:

Fr.) Keissl. Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz and Sacc., and Penicillium

digitatum (Pers.: Fr.) Sacc. Revista mexicana de fitopatología, 25(1), 48-53.

Guillén-Navarro, G. K., Márquez-Rocha, F. J., y Sanchez-Vázquez, J. E. 1998.

Producción de biomasa y enzimas ligninolíticas por Pleurotus ostreatus en cultivo

sumergido. Rev. Iberoam. Micol, 15, 302-306

Harborne, J. 1984. Methods of plant analysis. In Phytochemical methods (pp. 1-36).

Springer, Dordrecht.

42

Hubálek, Z., y Rudolf, I. 2010. Microbial zoonoses and sapronoses. Springer Science

y Business Media.

Hubálek, Z. 2003. Emerging human infectious diseases: anthroponoses, zoonoses,

and sapronoses. Emerging infectious diseases, 9(3), 403.

Iwen, PC, Schutte, SD, Florescu, DF, Noel-Hurst, RK y Sigler, L. 2012. Infección

invasiva por Scopulariopsis brevicaulis en un paciente inmunocomprometido y

revisión de casos anteriores causados por especies de Scopulariopsis y

Microascus. Micología Médica, 50 (6), 561-569.

Jarvis, W. R. 1996. Selected aspects of the socioeconomic impact of nosocomial

infections: morbidity, mortality, cost, and prevention. Infection Control & Hospital

Epidemiology, 17(8), 552-557.

Kontoyiannis, D. P., y Lewis, R. E. 2002. Antifungal drug resistance of pathogenic

fungi. The Lancet, 359(9312), 1135-1144.

Koc, A. N., Silici, S., Ayangil, D., Ferahbaş, A., y Cankaya, S. 2005. Comparison of

in vitro activities of antifungal drugs and ethanolic extract of propolis against

Trichophyton rubrum and T. mentagrophytes by using a microdilution

assay. Mycoses, 48(3), 205-210.

Kozarski, M., Klaus, A., Niksic, M., Jakovljevic, D., Helsper, J. P., y Van Griensven,

L. J. 2011. Antioxidative and immunomodulating activities of polysaccharide extracts

of the medicinal mushrooms Agaricus bisporus, Agaricus brasiliensis, Ganoderma

lucidum and Phellinus linteus. Food Chemistry, 129(4), 1667-1675.

Kuris, A. M., Lafferty, K. D., y Sokolow, S. H. 2014. Sapronosis: a distinctive type

of infectious agent. Trends in parasitology, 30(8), 386-393.

Lago R.C.A, Szpiz R.R, Jablonka F.H, Pereira D.A y Hartman L. 1985. Extraction

and transesterification of vegetable oils with ethanol. Oleagineux, 40, 147-151

Lara-López, M. A. 2016. Obtención y caracterización de quitosano procedente del

hongo ganoderma australe para aplicación en biopolímeros. Trabajo de Grado para la

obtención del Título de Ingeniera Química. Carrera de Ingeniería Química. Quito:

UCE. 85 p.

43

Lim, D. K., Choi, U., y Shin, D. H. 1996. Antioxidative activity of ethanol extract

from Korean medicinal plants. Korean Journal of Food Science and

Technology, 28(1), 83-89.

León-Sánchez, José R, Salgado-Cruz, María de la Paz, Sánchez-Mundo, María de la

Luz, y Cortés-Sánchez, Alejandro de Jesús. 2014. Ácido linoleico conjugado: de la

naturaleza al uso de la biotecnología. Revista Cubana de Química, 26(3), 235-258.

Levy, S. B. 2002. Active efflux, a common mechanism for biocide and antibiotic

resistance. Journal Applied Microbiology, 92, 65-71

Lodge, D. J. 2001. Diversidad mundial y regional de hongos. Enfoques

contemporáneos para el estudio de la biodiversidad. Instituto de Biología, UNAM,

México, 291-304.

Loeffler, J., y Stevens, D. A. 2003. Antifungal drug resistance. Clinical infectious

diseases, 36(Supplement1), S31-S41.

López Hernández, O. D., Muñoz Cernada, A., Carmona Fernández, R., Torres

Amaro, L., y González Sanabria, L. 2006. Influencia del uso de aditivos sobre el

rendimiento del proceso de secado por aspersión de extracto acuoso de Calendula

officinalis L. Revista Cubana de Plantas Medicinales, 11(1), 0-0.

Madhavi, V., y Lele, S. S. 2009. Laccase: properties and

applications. BioResources, 4(4), 1694-1717.

Márquez, R., De La Rosa y Mercado, A. 2007. Actividad antifúngica del extracto

total en etanol de las hojas frescas de Pedilanthus tithymaloides. Scientia et Técnica.

Mayo. Nº 33

Martínez. M, 1999. Manual de laboratorio introducción a la biotecnología industrial.

CEJA. Bogotá

Mazzutti, S., Ferreira, S. R., Riehl, C. A., Smania Jr, A., Smania, F. A., y Martínez, J.

2012. Supercritical fluid extraction of Agaricus brasiliensis: antioxidant and

antimicrobial activities. The Journal of Supercritical Fluids, 70, 48-56.

Miossec, C. et al, 2011. Fatal Invasive Infection with Fungemia Due to Microascus

cirrosus after Heart and Lung Transplantation in a Patient with Cystic Fibrosis. J.

Clin. Microbiol. 49:2743-2747

44

Moreno y Arenas. 2010. Other fungi causing onychomycosis. Clin Dermatol 28:160-

3

Moreno-Limón, S., González-Solís, L. N., Salcedo-Martínez, S. M., Cárdenas-Ávila,

M. L., y Perales-Ramírez, A. 2011. Efecto antifúngico de extractos de gobernadora

(Larrea tridentata L.) sobre la inhibición in vitro de Aspergillus flavus y Penicillium

sp. Polibotánica, (32), 193-205.

Moore, CB, Sayers, N., Mosquera, J., Slaven, J., y Denning, DW. 2000. Resistencia a

fármacos antifúngicos en el Aspergillus. Diario de la infección, 41 (3), 203-220.

Moro-Lagares, C. 2015. Obtención de extractos metanólicos ricos en compuestos

fenólicos a partir de hongos comestibles: valoración in vitro de la actividad

antioxidante y antiinflamatoria de los extractos. Universidad de Valladolid. Facultad

de Fisioterapia. 10324-16686.

Moussa, T. A., Kadasa, N. M., Al Zahrani, H. S., Ahmed, S. A., Feng, P., Zhang, y

Dong, B. 2017. Origin and distribution of Sporothrix globosa causing sapronoses in

Asia. Journal of medical microbiology, 66(5), 560-569.

Nierman, W. C., Pain, A., Anderson, M. J., Wortman, J. R., Kim, H. S., Arroyo, J., y

Bennett, J. 2005. Genomic sequence of the pathogenic and allergenic filamentous

fungus Aspergillus fumigatus. Nature, 438(7071), 1151.

Nieto, I. J., y Valencia, M. A. 2002. Esteroles, ácidos grasos e hidrocarburos de los

cuerpos fructíferos de Ganoderma australe. Boletín de la Sociedad Chilena de

Química, 47(4), 511-516.

Odero, V., Agudo, L. G., Guerrero, I., Aznar, P., Martos, P. G., e Iglesias, M. R.

2014. Antifungal susceptibility of clinical isolates of Scopulariopsis species. Revista

Española de Quimioterapia, 27(1), 1

Ojeda-López, S., Sandoval, M. D. L. L., & Valenzuela, R. (1986). Los Poliporáceos

de México I. Descripción de algunas especies del noreste de Guanajuato. Revista

Mexicana de Micología, 2, 367-436.

Ojeda-Gutiérrez KE, Suescum Jaramillo JA. Evaluación de cinco cepas de hongos

nativos como controladores biológicos de la enfermedad "Ojo de pollo" (Mycena

citricolor) en café (Coffea arabica) en condiciones in vitro. Universidad Técnica

Particular de Loja; 2012.

45

Olaechea, P. M., Insausti, J., Blanco, A., y Luque, P. 2010. Epidemiología e impacto

de las infecciones nosocomiales. Medicina intensiva, 34(4), 256-267.

OMS. 2005. Clasificación de microorganismos según Grupos de Riesgo. Manual de

Bioseguridad en Laboratorios. Ginebra 3era Edición.

Palacios Atencio, J. R., Romeu Carballo, C. R., Ramírez Ochoa, R., Leliebre Lara,

V., y Ortiz Medina, J. L. 2011. Actividad antifúngica in vitro de extractos de

Navisporus floccosus y Ganoderma sp. contra hongos

fitopatógenos. Fitosanidad, 15(2).

Pappas, P. G., Rex, J. H., Sobel, J. D., Filler, S. G., Dismukes, W. E., Walsh, T. J., y

Edwards, J. E. 2004. Guidelines for treatment of candidiasis. Clinical Infectious

Diseases, 38(2), 161-189.

Paterson, R. R. M. 2006. Ganoderma therapeutic fungal

biofactory. Phytochemistry, 67(18), 1985-2001.

Pérez, J., Mozos, E., de Lara, F. C. M., Paniagüa, J., y Day, M. J. 1996. Disseminated

aspergillosis in a dog: an immunohistochemical study. Journal of comparative

pathology, 115(2), 191-196.

Pineda-Insuasti, J. A., Gómez-Andrade, W. E., Duarte-Trujillo, A. S., Soto-Arroyave,

C. P., Pineda-Soto, C. A., Fierro-Ramos, F. J., y Álvarez-Ramos, S. E. 2017.

Producción de Pycnoporus spp. y sus metabolitos secundarios: Una

revisión. ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña de Azúcar, 51(2), 60-69.

Portillo, A., Vila, R., Freixa, B., Adzet, T., y Cañigueral, S. 2001. Antifungal activity

of Paraguayan plants used in traditional medicine. Journal of

Ethnopharmacology, 76(1), 93-98.

Pontón, J., y Quindós, G. 2006. Mecanismos de resistencia a la terapéutica

antifúngica. Medicina Clínica, 126, 56-60.

Puga Ll. D. 2014. Micosis: Prevención y tratamiento. Revista Acofar. Distribución

Farmaceútica Cooperativista. (Disponible en:

http://www.revistaacofar.com/revista/prescripcion/5665-micosis-prevencion-y-

tratamiento. Consultado el: 20 de octubre de 2018).

Quindós, G. 2002. Las micosis en el amanecer del siglo XXI. Rev Iberoam Micol, 19,

1-4.

46

Rambali, B., Fernandez, J. A., Van Nuffel, L., Woestenborghs, F., Baert, L., Massart,

D. L., y Odds, F. C. 2001. Susceptibility testing of pathogenic fungi with

itraconazole: a process analysis of test variables. Journal of Antimicrobial

Chemotherapy, 48(2), 163-177.

Ramirez, Nelson. 1998. Methodology and investigations. Memoriais del Instituto de

Biologia Experimental, 1, 181-184.

Reichardt, C., y Welton, T. 2011. Solvents and solvent effects in organic chemistry.

John Wiley & Sons.

Rico Campos, A. 2010. Tratamientos enzimáticos con lacasas y mediadores naturales

para la eliminación de lignina y lípidos presentes en pastas de celulosa. Instituto de

recursos Naturales y Agrobiología. IRNAS, CSIC.

Ríos, J. L., y Recio, M. C. 1987. Screening methods for natural products with

antimicrobial activity; a review of the literature. Journal of Ethnopharmacology,

23(2-3), 127-148.

Sandoval-Denis, M.; Sutton, D.A.; Fothergill, A.W, et al. 2013. Scopulariopsis,

apoorly known opportunistic fungus: spectrum of species in clinical samples and in

vitro responses to antifungal drugs. Journal of Clinical Microbiology 51: 3937-3943

Sánchez-León, G., Vargas-Rincón, A., y Jiménez, P. 2015. Evaluación de la actividad

antifúngica de extractos etanólicos de dos morfotipos de Raphanus raphanistrum L.

sobre tres hongos fitopatógenos. Bioagro, 27(1), 2-10.

Schlumbaum, A., Mauch, F., Vögeli, U., y Boller, T. 1986. Plant chitinases are potent

inhibitors of fungal growth. Nature, 324(6095), 365.

Soliman, K.M. y R.I. Badeaa. 2002. Effect of soil extracted from some medicinal

plants on different mycotoxigenic fungi. Food and Chemical Toxicology. 40(11):

1669-1675.

Smania, A., Delle Monache, F., Smania, E. F. A., Gil, M. L., Benchetrit, L. C., y

Cruz, F. S. 1995. Antibacterial activity of a substance produced by the fungus

Pycnoporus sanguineus (Fr.) Murr. Journal of Ethnopharmacology, 45(3), 177-181.

47

Smania, E. F. A., Delle Monache, F., Smania Jr, A., Yunes, R. A., y Cuneo, R. S.

2003. Antifungal activity of sterols and triterpenes isolated from Ganoderma

annulare. Fitoterapia, 74(4), 375-377.

Subramanian, C. V. 1995. Mushrooms: Beauty, diversity, relevance. Current

Science, 69(12), 986-998.

Sztejnberg, A.; Freeman, S.; Chet, I.; y Katan, J. 1987. Control of Rosellinia necatrix

in soil and in apple orchard by solarization and Trichoderma harzianum. Plant

Disease 71:365 - 369

Tan JS, Joseph WS. 2004. Common fungal infections of the feet in patients with

diabetes mellitus. Drugs Agingfica; 21:101-12.

Tapia C. 2005. Antifungal resistance. Medwave 2005 Abr; 5(4): e3549 doi:

10.5867/medwave.2005.04.3549.

Tequida-Meneses, M., Cortez-Rocha, M., Rosas-Burgos, E. C., López-Sandoval, S., y

Corrales-Maldonado, C. (2002). Efecto de extractos alcohólicos de plantas silvestres

sobre la inhibición de crecimiento de Aspergillus flavus, Aspergillus niger,

Penicillium chrysogenum, Penicillium expansum, Fusarium moniliforme y Fusarium

poae. Revista iberoamericana de micología, 19, 84-88.

Thappa, D. M. 2007. Current treatment of onychomycosis. Indian Journal of

Dermatology, Venereology, and Leprology, 73(6), 373.

Vega, J. Z., Pérez, C., Angulo, A., Torres, O.,y Santafé, G. 2007. Química y

actividades antioxidante y bactericida del extracto etanólico del hongo Ganoderma

lucidum. Scientia et technica, 1(33).

Veloz-García, R., R. Marín-Martínez, R. Veloz-Rodríguez, R. Rodríguez-Guerra, I.

Torres-Pacheco, M.M. González-Chavira, J.L. Anaya-López, L. Guevara-Olvera,

A.A. Feregrino-Pérez, G. Loarca-Piña y R.G. Guevara-González. 2010.

Antimicrobial activities of cascalote (Caesalpinia cacalaco) phenolics-containing

extract against fungus Colletotrichum lindemuthianum. Industrial Crops and Products

31(1): 134-138.

Viecelli, C. A., Stangarlin, J. R., Kuhn, O. J., y Schwan-Estrada, K. R. F. 2010.

Resistance induction in bean plants against angular leaf spot by extracts from

Pycnoporus sanguineus mycelium. Summa Phytopathologica, 36(1), 73-80.

48

Viñuela, E., y J. Jacas. 1993. Los enemigos naturales de las plagas y los plaguicidas.

Ministerio de Agricultura. H.D. 2-93. Madrid, ESP. 24 p.

Wanden-Berthe, C., Dos, M. R., Llerena, A., y Miguel, L. J. 2008. Ibero-American

Program of Science and Technology for Development. Revista panamericana de

salud publica. Pan American journal of public health, 23(3), 218-219.

Walsh, T. J., Anaissie, E. J., Denning, D. W., Herbrecht, R., Kontoyiannis, D. P.,

Marr, K. A. y Van Burik, J. A. 2008. Treatment of aspergillosis: clinical practice

guidelines of the Infectious Diseases Society of America. Clinical infectious

diseases, 46(3), 327-360.

Walsh, TJ, Petraitis, V., Petraitiene, R., Field-Ridley, A., Sutton, D., Ghannoum, M.,

y Casler, H. 2003. Aspergilosis pulmonar experimental debida a Aspergillus terreus:

patogénesis y tratamiento de un patógeno fúngico emergente resistente a la

anfotericina B. The Journal of infeccious disease, 188 (2), 305-319.

Walsh, T. J., y Dixon, D. M. 1996. Spectrum of mycoses. Medical Microbiology,

919-925.

49

ANEXOS A

Anexo A. Fichas de descripción macroscópica y microscópica de los hongos

COLECCIÓN DE HONGOS PATÓGENOS-LABORATORIO DE MICOLOGÍA APLICADA-UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

Responsable PhD. Paúl Gamboa

Especie Aspergillus terreus

Fuente Donado por Universidad Católica del Ecuador

Almacenamiento Agar PDA, 5°C

Condiciones de crecimiento Aerobio estricto; 25°C - 30°C de 5-14 días de incubación

Identificación

Características Microscópicas Características Macroscópicas

AGAR PDA y SABOURAUD

-Hifas hialinas amplias Colonia de color verde y posteriormente de color marrón

-Esporangioforos se origina en una hifa aérea bifurcado Textura algodonosa, plana, con surcos radiales

-Esporangiósporos elipsoidales

estipes depared lisa

-Vesículas de forma variable, esféricao subglobosa

-Métulas ocupando la mitad o dos tercios dela vesícula

-Conidios lisos, globosos o subglobosos

Observaciones

Nivel de seguridad 2

Forma de Transmisión Corrientes de aire / aerosoles

Periodo de Incubación Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente

Medidas de Protección

Usar equipo de protección (bata, guantes, tapabocas, gorro)

Higiene personal: lavado de manos

50

COLECCIÓN DE HONGOS PATÓGENOS-LABORATORIO DE MICOLOGÍA APLICADA-UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR


Especie Scopulariopsis brevicaulis

Fuente Dra. María del Carmen Salvador

Almacenamiento Agar PDA, 5°C

Condiciones de crecimiento Aerobio estricto; 25°C - 30°C desde 5 días de incubación

Identificación

Características Microscópicas Características Macroscópicas

-Conidióforos hialinos, erguidos, cortos, ramificados,

simples o bifurcados AGAR PDA y SABOURAUD

-Anélidos solitarios, en racimos, cilíndricos,

abultados Colonias de color blanco que posteriormente se tornan marrón

-Conidias globosas a piriformes, lisas, forman

cadenas basipetalas Pliegues interrumpidos

Textura granulares y pulverulentas

Observaciones

Nivel de seguridad 2

Forma de Transmisión Fómites y traumas

Periodo de Incubación Depende de la carga fúngica, del estado inmunológico del paciente y del tejido infectado

Eliminación y tratamiento apropiado de desechos

Capacitaciones

51

Medidas de Protección

Usar equipo de protección (bata, guantes, tapabocas, gorro)

Higiene personal: lavado de manos;

Eliminación y tratamiento apropiado de desechos

Capacitaciones

MICOTECA-LABORATORIO DE MICOLOGÍA APLICADA-UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR


Especie Ganoderma australe

Fuente PhD. Paúl Gamboa

Familia GANODERMATACEAE

Subclase APHYLLOPHOROMYCETES

Orden GANODERMATALES

Clase BASIDIOMYCOTINA

N°Colección:

Lugar de colecta: Pastaza

Descripción

Basidioma grande de 30-50 diámetro x 14-18 grueso, en forma semicircular de ménsula invertida. El pileo (parte

superior), se aplana de adulto, es muy duro, presenta un corte vertical rojizo con líneas negruzcas y su carne es marrón-

rojizo. Margen grueso redondeado y blanquecino. Carece de pie. Himenio (parte inferior) blanquecino, pequeñísimos

poros blanquecinos y tubos rojizos que suelen desarrollar hifas blanquecinas. Esporas color marrón, ovoides, con ápice

truncado, rodeadas por verrugas.

Hábitat Degrada madera de árboles vivos o muertos. Tanto en parques-jardines de zonas bajas, como hayedos de alta montaña.

52

MICOTECA-LABORATORIO DE MICOLOGÍA APLICADA-UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR


Especie Pycnoporus sanguineus

Fuente PhD. Paúl Gamboa

Division BASIDIOMYCOTA

Familia POLYPORACEAE

Orden POLYPORALES

Clase AGARICOMYCETES

N°Colección:

Lugar de colecta: Pastaza

Descripción

Cuerpos fructíferos con forma de repisa, semicirculares y de consistencia parecida al corcho cuando está fresco. El píleo tiene

1,5-4,5 cm de ancho y 1-4 cm de largo. La superficie es aterciopelada cuando muy joven y lisa cuando adulto, algunas veces

rugosa, rojo anaranjado brillante cuando está húmedo y anaranjado rojizo a anaranjado amarillento cuando está muy seco. El

relleno (contexto) tiene 0,2-0,8 cm de ancho y es rojo anaranjado. La superficie inferior o fértil está formada por tubos de 0,1-

0,2 cm de longitud, anaranjado rojizo brillante, con 5-6 poros por milímetro, del mismo color que los tubos. No posee pie o

estípite, ya que se adhiere lateralmente a la madera. Las esporas son blancas cuando están agrupadas

Hábitat Sobre troncos caídos, principalmente en zonas expuestas (soleadas) y alteradas, incluso sobre troncos quemados.

53

ANEXO B

ANEXO B. Composición de los medios de cultivo

MEDIO DE

CULTIVO

COMPOSICIÓN g/L OBSERVACIÓN

Agar papa

dextrosa (PDA)

Papa 400

Glucosa 20

Sulfato de amonio 3 Agar

agar 15

Agua destilada 1000ml pH

5,6

Permite el crecimiento micelial

de un gran rango de hongos, es

un medio apropiado para el

aislamiento, cultivo y

mantenimiento de una gran

variedad de hongos.

Agar Extracto de

Malta

Extracto de malta 2.0-20.0

Extracto de levadura

(opcional) 0.2-2.0

Agar 20

Água 1000mL

pH 5,61

Este medio se usa para el

aislamiento de hongos del suelo

y de hojas en descomposición.

Agar Sabouraud Peptona 10

Glucosa 40

Agar 20

Agua destilada 1000mL pH

6,0

El medio es usado para la

caracterización de hongos

filamentosos y levaduras.

54

ANEXO C

Anexo C. Determinación de los compuestos químicos encontrados mediante

Cromatografía CM-GS.

Anexo C-1. Compuestos químicos detectados en el extracto de Ganoderma

australe

63

Anexo C-2. Compuestos químicos detectados en el extracto de Pycnoporus

sanguineus

77

ANEXO D

Anexo D. Tabulación de datos

Anexo D-1. % de crecimiento e inhibición de crecimiento de las cepas fúngicas

Efecto del extracto de G.australe sobre S. brevicaulis

Diámetro de crecimiento (mm) % crecimiento %inhibición

100% 0 0 100

80% 0 0 100

60% 0 0 100

40% 0 0 100

20% 0 0 100

15% 20,44 34,07 65,93

10% 31,6 52,67 47,33

5% 39,22 65,37 34,63

1% 53,51 89,19 10,81

0,50% 59,91 99,85 0,15

Efecto del extracto de G.australe sobre A. terreus


100% 0 0 100

80% 0 0 100

60% 0 0 100

40% 0 0 100

20% 0 0 100

15% 0,00 0,00 100

10% 13,96 23,26 76,74

5% 34,27 57,11 42,89

1% 53,91 89,85 10,15

0,50% 60 100 0

Efecto del extracto de P.sanguineus sobre S. brevicaulis


100% 0 0 100

80% 0 0 100

60% 0 0 100

40% 0 0 100

20% 0 0 100

15% 18,73 31,22 68,78

78

10% 27,78 46,3 53,7

5% 36,64 61,07 38,93

1% 47,27 78,78 21,22

0,50% 59,84 99,74 0,26

Efecto del extracto de P.sanguineus sobre A. terreus


100% 0 0 100

80% 0 0 100

60% 0 0 100

40% 0 0 100

20% 0 0 100

15% 0 0 100

10% 0 0 100

5% 13,16 21,93 78,07

1% 49,29 82,15 17,85

0,50% 59,96 99,93 0,08

79

Anexo D-2. Datos descriptivos

Datos descriptivos de la acción del extracto de Ganoderma australe sobre el

crecimiento de Aspergillius terreus

%Inhibición de

Aspergillus

terreus

Media 95% de intervalo de

confianza para la

media

Mediana Desv.

Desviación

Mínimo Máximo

Límite

inferior

Límite

superior

100% (34

mg/ml)

100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00

80% (27,2

mg/ml)

100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00

60% (20,4

mg/ml)

100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00

40% (13,6

mg/ml)

100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00

20% (6,8 mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00

15% (5,1 mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00

10% (3,4 mg/ml) 76,75 75,61 77,88 77,80 2,05 72,80 79,40

5% (1,7 mg/ml) 42,88 41,26 44,50 43,30 2,92 38,30 47,20

1% (0,34 mg/ml) 10,15 9,57 10,74 10,00 1,06 8,30 12,20

0,5% (0,17

mg/ml)

0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Datos descriptivos del efecto del extracto de Ganoderma australe sobre el

crecimiento de Scopulariopsis brevicaulis

%Inhibición de

Aspergillus

terreus

Media 95% de intervalo de

confianza para la

media

Mediana Desv.

Desviación

Mínimo Máximo

Límite

inferior

Límite

superior

100% (34mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00

80% (27,2mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00

60% (20,4mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00

40% (13,6mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00

20% (6,8mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00

15% (5,1mg/ml) 65,9133 64,7113 67,1153 66,1000 2,17054 62,20 69,40

10% (3,4mg/ml) 47,3333 46,5785 48,0882 47,2000 1,36312 45,00 49,40

5% (1,7mg/ml) 34,6200 33,2864 35,9536 34,4000 2,40808 30,60 39,40

1% (0,34mg/ml) 10,8133 9,6977 11,9289 10,6000 2,01454 7,20 15,00

0,5%

(0,17mg/ml)

0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

80

Datos descriptivos del efecto del extracto de Pycnoporus sanguineus sobre el

crecimiento de Scopulariopsis brevicaulis %Inhibición de

Aspergillus terreus

Media 95% de intervalo

de confianza para

la media

Mediana Desv.

Desviación

Mínimo Máximo

Límite

inferior

Límite

superior

100% (34 mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00

80% (27,2 mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00

60% (20,4 mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00

40% (13,6 mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00

20% (6,8 mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00

15% (5,1 mg/ml) 68,77 67,30 70,23 67,80 2,65 65,60 73,30

10% (3,4 mg/ml) 53,69 52,77 54,60 54,40 1,65 49,40 55,60

5% (1,7 mg/ml) 38,92 38,06 39,78 38,30 1,56 37,20 41,10

1% (0,34 mg/ml) 21,22 19,51 22,93 21,10 3,09 17,20 26,70

0,5% (0,17mg/ml) 0,27 -0,02 0,55 0,00 0,52 0,00 1,70

Datos descriptivos del efecto del Extracto de Pycnoporus sanguineus sobre el

crecimiento de Aspergillus terreus %Inhibición de

Aspergillus terreus

Media 95% de intervalo

de confianza para

la media

Mediana Desv.

Desviación

Mínimo Máximo

Límite

inferior

Límite

superior

100% (34 mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00

80%(27,2 mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00

60% (20,4mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00

40% (13,6mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00

20% (6,8 mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00

15% (5,1 mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00

10% (3,4 mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00

5% (1,7 mg/ml) 78,08 77,27 78,89 77,80 1,46 75,00 80,60

1% (0,34 mg/ml) 17,85 16,41 19,30 17,80 2,61 13,30 21,10

0,5%(0,17mg/ml) 0,08 -0,04 0,20 0,00 0,21 0,00 0,60

81

ANEXO E

Anexo E. Análisis estadísticos

Anexo E-1. Prueba de normalidad

Pruebas de normalidad: efecto del extracto de Ganoderma australe sobre el

crecimiento de Aspergillus terreus

Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

Estadístico gl Sig. Estadístico gl Sig.

20% (6,8mg/ml) 0,00 15 - 0,00 15 -

15% (5,1mg/ml) 0,00 15 <0,001 0,00 15 <0,001

10% (3,4mg/ml) 0,230 15 0,032 0,917 15 0,176

5% (1,7 mg/ml) 0,156 15 0,200* 0,919 15 0,185

1% (0,34mg/ml) 0,203 15 0,097 0,930 15 0,271

0,5%(0,17mg/ml) 15 15

Pruebas de normalidad: efecto del extracto de Ganoderma australe sobre el




20% (6,8mg/ml) 0,00 15 - 0,00 15 -

15% (5,1 mg/ml) 0,199 15 0,113 0,928 15 0,255

10% (3,4 mg/ml) 0,161 15 0,200* 0,952 15 0,558

5% (1,7 mg/ml) 0,136 15 0,200* 0,972 15 0,888

1% (0,34 mg/ml) 0,130 15 0,200* 0,965 15 0,786

0,5% (0,17 mg/ml) 0,442 15 <0,001 0,610 15 <0,001

Pruebas de normalidad: efecto del extracto de Pycnoporus sanguineus sobre el




20% (6,8mg/ml) 0,00 15 - 0,00 15 -

15% (5,1 mg/ml) 0,205 15 0,088 0,851 15 0,018

10% (3,4 mg/ml) 0,267 15 0,005 0,845 15 0,015

5% (1,7 mg/ml) 0,255 15 0,010 0,833 15 0,010

1% (0,34 mg/ml) 0,143 15 0,200* 0,909 15 0,133

0,5% (0,17 mg/ml) 0,430 15 <0,001 0,601 15 <0,001

Pruebas de normalidad: efecto del extracto de Pycnoporus sanguineus sobre el




20% (6,8mg/ml) 0,00 15 - 0,00 15 -

15% (5,1 mg/ml) 0,00 15 - 0,00 15 -

10% (3,4 mg/ml) 0,00 15 - 0,00 15 -

5% (1,7 mg/ml) 0,176 15 0,200* 0,946 15 0,468

1% (0,34 mg/ml) 0,122 15 0,200* 0,934 15 0,316

0,5% (0,17 mg/ml) 0,514 15 <0,001 0,413 15 <0,001

82

Anexo E-2. Prueba para muestras emparejadas

Prueba de muestras emparejadas: extracto de Ganoderma australe sobre el


Concentracione

s

Diferencias emparejadas t gl Sig.

(bilateral

) Medi

a

Desv.

Desviació

n

95% de intervalo de

confianza de la

diferencia

Inferio

r

Superio

r

20% (6,8mg/ml) -

15% (5,1 mg/ml)

- - - - - - -

20% (6,8mg/ml) -

10% (3,4mg/ml)

23,25 2,05 22,12 24,39 44,01 14,0

0

<0,001

20% (6,8mg/ml) -

5% (1,7mg/ml)

57,12 2,92 55,50 58,74 75,85 14,0

0

<0,001

20% (6,8mg/ml) -

1% (0,34mg/ml)

89,85 1,06 89,26 90,43 328,83 14,0

0

<0,001

20% (6,8mg/ml) -

0,5% (0,17

mg/ml)

23,25 2,05 22,12 24,39 44,01 14,0

0

<0,001

15% (5,1 mg/ml)

- 10% (3,4mg/ml)

23,25 2,05 22,12 24,39 44,01 14,0

0

<0,001

15% (5,1 mg/ml)

- 5% (1,7mg/ml)

57,12 2,92 55,50 58,74 75,85 14,0

0

<0,001

15% (5,1 mg/ml)

- 1% (0,34mg/ml)

89,85 1,06 89,26 90,43 328,83 14,0

0

<0,001

15% (5,1 mg/ml)

- 0,5% (0,17

mg/ml)

- - - - - - <0,001

10% (3,4mg/ml) -

5% (1,7mg/ml)

33,86 2,75 32,34 35,39 47,64 14 <0,001

10% (3,4mg/ml) -

1% (0,34mg/ml)

66,59 2,33 65,30 67,88 110,4

5

14 <0,001

10% (3,4mg/ml) -

0,5%

(0,17mg/ml)

76,75 2,05 75,61 77,88 145,26 14,0

0

<0,001

5% (1,7mg/ml) -

1% (0,34mg/ml)

32,73 2,92 31,11 34,34 43,48 14,0

0

<0,001

5% (1,7mg/ml) -

0,5%

(0,17mg/ml)

42,88 2,92 41,26 44,50 56,94 14,0

0

<0,001

1% (0,34mg/ml) -

0,5%

(0,17mg/ml)

10,15 1,06 9,57 10,74 37,16 14,0

0

<0,001

Prueba de muestras emparejadas: Extracto de Ganoderma australe sobre el


Concentraciones Diferencias emparejadas t Gl Sig.

(bilateral) Media Desv. 95% de intervalo de

83

Desviación

confianza de la

diferencia

Inferior Superior

20% (6,8mg/ml) -

15% (5,1 mg/ml)

34,09 0,56 32,88 35,29 60,82 14,00 <0,001

20% (6,8mg/ml) -

10% (3,4mg/ml)

52,67 0,35 51,91 53,42 149,64 14,00 <0,001

20% (6,8mg/ml) -

5% (1,7mg/ml)

65,38 0,62 64,05 66,71 105,15 14,00 <0,001

20% (6,8mg/ml) -

1% (0,34mg/ml)

89,19 0,52 88,07 90,30 171,46 14,00 <0,001

20% (6,8mg/ml) -

0,5% (0,17

mg/ml)

99,81 0,09 99,61 100,00 1.099,84 14,00 <0,001

15% (5,1mg/ml) -

10% (3,4mg/ml)

18,58 2,78 17,04 20,12 25,86 14,00 <0,001

15% (5,1mg/ml) -

5% (1,7mg/ml)

31,29 2,54 29,89 32,70 47,79 14,00 <0,001

15% (5,1mg/ml) -

1% (0,34mg/ml)

55,10 2,58 53,67 56,53 82,79 14,00 <0,001

15% (5,1mg/ml) -

0,5% (0,17mg/ml)

65,72 2,23 64,49 66,95 114,35 14,00 <0,001

10% (3,4mg/ml) -

5% (1,7mg/ml)

12,71 2,82 11,15 14,27 17,49 14,00 <0,001

10% (3,4mg/ml) -

1% (0,34mg/ml)

36,52 2,24 35,28 37,76 63,22 14,00 <0,001

10% (3,4mg/ml) -

0,5% (0,17mg/ml)

47,14 1,36 46,39 47,89 134,29 14,00 <0,001

5% (1,7mg/ml) -

1% (0,34mg/ml)

23,81 3,65 21,78 25,83 25,25 14,00 <0,001

5% (1,7mg/ml) -

0,5% (0,17mg/ml)

34,43 2,47 33,06 35,80 53,94 14,00 <0,001

1% (0,34mg/ml) -

0,5% (0,17mg/ml)

10,62 2,00 9,51 11,73 20,54 14,00 <0,001

Prueba de muestras emparejadas: extracto de Pycnoporus sanguineus sobre el



(bilateral) Media Desv.

Desviación

95% de intervalo de

confianza de la

diferencia

Inferior Superior

20% (6,8mg/ml) -

15% (5,1 mg/ml)

31,23 2,65 29,77 32,70 45,68 14,00 <0,001

20% (6,8mg/ml) -

10% (3,4mg/ml)

46,31 1,65 45,40 47,23 108,42 14,00 <0,001

20% (6,8mg/ml) -

5% (1,7mg/ml)

61,08 1,56 60,22 61,94 151,97 14,00 <0,001

20% (6,8mg/ml) -

1% (0,34mg/ml)

78,78 3,09 77,07 80,49 98,87 14,00 <0,001

20% (6,8mg/ml) - 99,73 0,52 99,45 100,02 746,00 14,00 <0,001

84

0,5% (0,17 mg/ml)

15% (5,1mg/ml) -

10% (3,4mg/ml)

15,08 2,95 13,45 16,71 19,81 14,00 <0,001

15% (5,1mg/ml) -

5% (1,7mg/ml)

29,85 2,60 28,41 31,29 44,49 14,00 <0,001

15% (5,1mg/ml) -

1% (0,34mg/ml)

47,55 3,83 45,43 49,67 48,10 14,00 <0,001

15% (5,1mg/ml) -

0,5% (0,17mg/ml)

68,50 2,51 67,11 69,89 105,55 14,00 <0,001

10% (3,4mg/ml) -

5% (1,7mg/ml)

14,77 1,98 13,67 15,86 28,93 14,00 <0,001

10% (3,4mg/ml) -

1% (0,34mg/ml)

32,47 3,40 30,58 34,35 36,97 14,00 <0,001

10% (3,4mg/ml) -

0,5% (0,17mg/ml)

53,42 1,88 52,38 54,46 110,03 14,00 <0,001

5% (1,7mg/ml) - 1%

(0,34mg/ml)

17,70 3,16 15,95 19,45 21,70 14,00 <0,001

5% (1,7mg/ml) -

0,5% (0,17mg/ml)

38,65 1,78 37,67 39,64 84,12 14,00 <0,001

1% (0,34mg/ml) -

0,5% (0,17mg/ml)

20,95 3,03 19,27 22,63 26,77 14,00 <0,001

Prueba de muestras emparejadas: de extracto de Pycnoporus sanguineus sobre el



(bilateral) Media Desv.

Desviación

95% de intervalo de

confianza de la

diferencia

Inferior Superior

20% (6,8mg/ml) -

15% (5,1 mg/ml)

- - - - - - -

20% (6,8mg/ml) -

10% (3,4mg/ml)

- - - - - - -

20% (6,8mg/ml) -

5% (1,7mg/ml)

21,92 1,46 21,11 22,73 58,13 14,00 <0,001

20% (6,8mg/ml) -

1% (0,34mg/ml)

82,15 2,61 80,70 83,59 121,80 14,00 <0,001

20% (6,8mg/ml) -

0,5% (0,17 mg/ml)

99,92 0,21 99,80 100,04 1.833,03 14,00 <0,001

15% (5,1mg/ml) -

10% (3,4mg/ml)

- - - - - - <0,001

15% (5,1mg/ml) - 21,92 1,46 21,11 22,73 58,13 14,00 <0,001

85

5% (1,7mg/ml)

15% (5,1mg/ml) -

1% (0,34mg/ml)

82,15 2,61 80,70 83,59 121,80 14,00 <0,001

15% (5,1mg/ml) -

0,5% (0,17mg/ml)

99,92 0,21 99,80 100,04 1.833,03 14,00 <0,001

10% (3,4mg/ml) -

5% (1,7mg/ml)

21,92 1,46 21,11 22,73 58,13 14,00 <0,001

10% (3,4mg/ml) -

1% (0,34mg/ml)

82,15 2,61 80,70 83,59 121,80 14,00 <0,001

10% (3,4mg/ml) -

0,5% (0,17mg/ml)

99,92 0,21 99,80 100,04 1.833,03 14,00 <0,001

5% (1,7mg/ml) -

1% (0,34mg/ml)

60,22 3,23 58,43 62,02 71,9 14 <0,001

5% (1,7mg/ml) -

0,5% (0,17mg/ml)

78,00 1,44 77,19 78,80 209,0 14 <0,001

1%(0,34mg/ml) -

0,5% (0,17mg/ml)

17,77 2,61 16,32 19,22 26,3 14 <0,001

86

Anexo E-3. Prueba de ANOVA

ANOVA

Suma de

cuadrados gl

Media

cuadrática F Sig.

20% (6,8mg/ml) - 3,00 -

15% (5,1mg/ml) 16.061,20 3,00 5.353,73 1.826,65 0,00

10% (3,4mg/ml) 25.862,60 3,00 8.620,87 3.926,61 0,00

5% (1,7mg/ml) 17.863,94 3,00 5.954,65 1.262,74 0,00

1% (0,34mg/ml) 1.317,72 3,00 439,24 81,63 0,00

0,5% (0,17mg/ml) 0,63 3,00 0,21 1,93 0,14

.

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS ... · micosis en humanos, considero que dicho...

Documents

Transcript of UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS ... · micosis en humanos, considero que dicho...