Universidad Central de Venezuela Facultad de Medicina ...Presencia o ausencia de una proteína y sus...
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ELISA y WesternBlot
Prof. Edwin [email protected]
Universidad Central de VenezuelaFacultad de Medicina
Escuela de Medicina “José María Vargas”Cátedra de Inmunología
Práctica 12018
Aplicaciones Diagnósticas de las InteraccionesAg/Ac
ELISA
ELISAEnsayo de Inmunadsorción Ligado a Enzima
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
• Mide la cantidad de complejo Ag/Ac formado• Utiliza reactivo detector conjugado a una enzima• Reacción colorimétrica en presencia de sustrato
cromógeno• Intensidad de color proporcional a cantidad de complejo
Ag/Ac
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/a9/ELISA.jpg
ELISA Indirecto•Detección de anticuerpos específicos en el suero del paciente•Aplicaciones:
•Diagnóstico de Infección o exposición a microorganismos•Detección de Autoanticuerpos•Respuesta a Inmunizaciones/Vacunas
Fase deCaptura
Ag de VIH-1Proteínas
Recombinantes
Diagnóstico de Infección por VIH-1
Fase deDetección
Anti-IgGConjugados a
Enzima
Lavado
Revelado
Reacción de ColorSustrato Cromógeno
Lavado
MarcadorIdentificado
IgG anti-VIH-1Anticuerpos en
Suero del Paciente
Agregar
Inmunología de Kuby
ELISA Tipo Sándwich
•Detección de antígenos específicos en el suero del paciente•Aplicaciones:
•Detección de Ag microbianos•Determinación de Hormonas, Citoquinas, Drogas, Marcadores Tumorales, etc.
Fase deCaptura
Ac Anti-HBsAg
Determinación de Antígeno de Superficie del Virus de Hepatitis B
Fase deDetección
Anti-HBsAgConjugados a
Enzima
Lavado
Revelado
Reacción de ColorSustrato Cromógeno
Lavado
MarcadorIdentificado
HBsAgAntígeno en
Suero del Paciente
Agregar
Inmunología de Kuby
Anti-h-CG
ELISA Competitivo•El antígenos específico en el suero del paciente compite con elantígeno unido a la fase sólida para unirse al anticuerpo. La intensidadde color es inversamente proporcional a la cantidad de Ag en la muestra•Aplicaciones:
•Determinación de Hormonas, Citoquinas, Drogas, Marcadores Tumorales, etc.
Determinación de Gonadotropina Coriónica Humana (h-CG)
Fase deCaptura
h-CGProteínas
Recombinantes
IgGFase de
Detección
Anti-IgGConjugados a
Enzima
Lavado
Revelado
Reacción de ColorSustrato Cromógeno
Lavado
MarcadorIdentificado
h-CGHormona en
Suero del Paciente
Agregar
Inmunología de Kuby
Técnica de
ELISA
Ventajas
Alta sensibilidad y altaespecificidad
Cuantitativa
Relativamente económica
Se pueden procesar hasta96 muestras por placa
Gran estabilidad.
Positividad Vs. Infecciónactiva: depende del tipo de
anticuerpo evaluado. Amenos que se evalúe
presencia de antígenos en lamuestra problema
Dificultad de detección deAcs en pacientes con alguna
inmunodeficiencia, enperíodo de ventana oinfectados por cepas
desconocidas.
Limitaciones
Técnica de ELISA
ELISADiagnóstico de la Infección por VIH-1
Infección por VIH-1
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf
Infecciónpor VIH-1
p24 de VIH-1
ARN de VIH-1 Anticuerpos anti-VIH-1
Díasde Infección
Infección Aguda Infección Crónica
Ventana de Seroconversión
Período de Eclipse
Diagnóstico de Infección por VIH-1
ELISA de 1ra. Generación
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf
Sensibilidad LimitadaProteínas Celulares Contaminantes
Reactividad Cruzada
Fase deCaptura
Ag de VIH-1Lisado Viral
(Cultivo Celular)
MarcadorIdentificado
IgG anti-VIH-1Anticuerpos en
Sangre del Paciente
Fase deDetección
Anti-IgGConjugados a
Enzima
Revelado
Reacción de ColorSustrato Apropiado
ARN de VIH-1 Anticuerpos anti-VIH-1
Infecciónpor VIH-1
p24 de VIH-1
ARN de VIH-1 Anticuerpos anti-VIH-1
Díasde Infección
Infección Aguda Infección Crónica
Ventana de Seroconversión
Período de Eclipse
Diagnóstico de la Infección por VIH-1
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf
Diagnóstico de Infección por VIH-1
ELISA de 2da. Generación
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf
Fase deCaptura
Ag de VIH-1/VIH-2Péptidos Sintéticos
Proteínas Recombinantes
MarcadorIdentificado
IgG anti-VIH-1/VIH-2Anticuerpos en
Sangre del Paciente
Fase deDetección
Anti-IgGProteína A
Conjugados aEnzima
Revelado
Reacción de ColorSustrato Apropiado
VIH-1, VIH-2Mejora Sensibilidad
No Proteínas Celulares ContaminantesMejora Especificidad
ARN de VIH-1 Anticuerpos anti-VIH-1
Infecciónpor VIH-1
p24 de VIH-1
ARN de VIH-1 Anticuerpos anti-VIH-1
Díasde Infección
Infección Aguda Infección Crónica
Ventana de Seroconversión
Período de Eclipse
Diagnóstico de la Infección por VIH-1
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf
Diagnóstico de Infección por VIH-1
ELISA de 3ra. Generación
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf
Fase deCaptura
Ag de VIH-1/VIH-2Péptidos Sintéticos
Proteínas Recombinantes
MarcadorIdentificado
IgM e IgG anti-VIH-1/VIH-2
Anticuerpos enSangre del Paciente
Fase deDetección
Ag ViralesConjugados a
Enzima
Revelado
Reacción de ColorSustrato Apropiado
VIH-1, VIH-2Detecta IgM e IgG
Detección más Temprana
ARN de VIH-1 Anticuerpos anti-VIH-1
Infecciónpor VIH-1
p24 de VIH-1
ARN de VIH-1 Anticuerpos anti-VIH-1
Díasde Infección
Infección Aguda Infección Crónica
Ventana de Seroconversión
Período de Eclipse
Diagnóstico de la Infección por VIH-1
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf
Diagnóstico de Infección por VIH-1
ELISA de 4ta. Generación
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf
Revelado
Reacción de ColorSustrato Apropiado
Fase deCaptura
Anti-p24Ag de VIH-1/VIH-2Péptidos Sintéticos
Proteínas Recombinantes
MarcadorIdentificado
Ag p24IgM e IgG
anti-VIH-1/VIH-2Ac y Ag en
Sangre del Paciente
VIH-1, VIH-2Detecta Antígeno Viral (p24)
Detecta IgM e IgGDetección más Temprana
Fase deDetección
Anti-p24Ag Virales
Conjugados a Enzima
E
ARN de VIH-1 Anticuerpos anti-VIH-1
Infecciónpor VIH-1
p24 de VIH-1
ARN de VIH-1 Anticuerpos anti-VIH-1
Díasde Infección
Infección Aguda Infección Crónica
Ventana de Seroconversión
Período de Eclipse
Diagnóstico de la Infección por VIH-1
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdfNeonatos
de madres infectadas
WESTERN BLOTDiagnóstico de la Infección por VIH-1
Western Blot
Western blot, inmunoblot o electrotransferencia, técnica analíticaaltamente específica utilizada para identificar proteínas específicasen una mezcla compleja de proteínas, presente en extractoscelulares o de tejidos.
Etapas:1. Preparación de la muestra
2. Separación de la muestra por tamaño (Electroforesis en gel depoliacrilamida)
3. Transferencia a un soporte sólido (membrana de nitrocelulosa )
4. Visualización mediante marcaje de proteínas con el uso deanticuerpos primarios o secundarios apropiados.
Western blot
Aplicaciones:
Investigación: Es una de las técnicas más usadas en el estudio de labiología molecularPermite identificar antígenos inmuno-dominantes para vacunas.Estudiar perfil de citocinas.Presencia o ausencia de una proteína y sus niveles en una muestra.Factores de crecimientoNiveles de fosforilación, modificaciones post-traduccionales, etc.
Diagnóstico:Prueba confirmatoria de VIH
Prueba de la encefalopatía espongiforme bovina, comúnmentellamada “enfermedad de las vacas locas”
Enfermedad de Lyme.
http://images.slideplayer.es/1/121053/slides/slide_53.jpg
Diagnóstico de la Infección por VIH-1Algoritmo Recomendado – CDC 2014
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf