UNIVERSIDAD CENTRAL DE ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS … · 2019-09-25 · Yo, Adriana Estefanía...

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UNIVERSIDAD CENTRAL DE ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA DE QUÍMICA Evaluación de estabilidad de la oleorresina de pimiento (Capsicum annuum), encapsulada en β-ciclodextrina; para uso como colorante. Trabajo de investigación presentado como requisito previo a la obtención del título de: QUÍMICO AUTORA: Chamba Figueroa Adriana Estefanía TUTORA: PhD. Martha Azucena Suárez Heredia Quito, 2019

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UNIVERSIDAD CENTRAL DE ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

CARRERA DE QUÍMICA

Evaluación de estabilidad de la oleorresina de pimiento (Capsicum annuum),

encapsulada en β-ciclodextrina; para uso como colorante.

Trabajo de investigación presentado como requisito previo a la obtención del título de:

QUÍMICO

AUTORA: Chamba Figueroa Adriana Estefanía

TUTORA: PhD. Martha Azucena Suárez Heredia

Quito, 2019

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

Derechos de Autor

Yo, Adriana Estefanía Chamba Figueroa en calidad de autor y titular de los derechos

morales y patrimoniales del trabajo de titulación “Evaluación de estabilidad de la

oleorresina de pimiento (Capsicum annuum), encapsulada en β-ciclodextrina; para

uso como colorante”, modalidad proyecto de investigación, de conformidad con el Art.

114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS

CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedo a favor de la

Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva para

el uso no comercial de la obra, con fines estrictamente académicos. Conservo a mi favor

todos los derechos de autor sobre la obra, establecidos en la normativa citada.

Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la

digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de

conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.

El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de

expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad por

cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la Universidad

de toda responsabilidad.

Firma:

Adriana Estefanía Chamba Figueroa

CC: 1723252993

Dirección electrónica: [email protected]

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

Constancia de Aprobación del tutor

Yo, Martha Azucena Suárez Heredia, en calidad de tutor del trabajo de investigación

titulado: “Evaluación de estabilidad de la oleorresina de pimiento (Capsicum

annuum), encapsulada en β-ciclodextrina; para uso como colorante” elaborado por

la estudiante Adriana Estefanía Chamba Figueroa con C.C. 1723252993 de la Carrera de

Química, Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador,

considero que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo

metodológico y en el campo epistemológico, por lo que lo APRUEBO, a fin de que sea

sometido a la evaluación por parte del tribunal calificador que se designe.

En la ciudad de Quito, a los 7 días del mes de agosto de 2019

______________________________

PhD. Martha Azucena Suárez Heredia

C.C. 1707242838

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

Constancia de Aprobación del Trabajo Final por el Tribunal

El Tribunal constituido por: MSc. Susana López, Dra. Consuelo Andrade y PhD. Martha

Suárez, luego de revisar el trabajo de investigación titulado: “Evaluación de estabilidad

de la oleorresina de pimiento (Capsicum annuum), encapsulada en β-ciclodextrina;

para uso como colorante”, previo a la obtención del título (o grado académico) de

Químico presentado por la señorita Adriana Estefanía Chamba Figueroa APRUEBA el

trabajo presentado.

Para constancia de lo actuado firman:

_______________________

MSc. Susana López

CC: 1704814373

_______________________

Dra. Consuelo Andrade

CC: 1001057650

_______________________

PhD. Martha Suárez Heredia

C.C. 1707242838

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

Lugar donde se realizó la investigación

La presente investigación que tiene como título “Evaluación de estabilidad de la

oleorresina de pimiento (Capsicum annuum), encapsulada en β-ciclodextrina; para

uso como colorante”, se ejecutó en el Laboratorio de Productos Naturales y Laboratorio

de Nanoestructuras del Instituto de Posgrado de la Facultad de Ciencias Químicas de la

Universidad Central del Ecuador. Los laboratorios facilitaron reactivos, equipos,

estándares e insumos necesarios para el desarrollo de la investigación. El trabajo de

titulación es parte del proyecto de Investigación Avanzado “Estudio de colorantes

naturales y desarrollo de formas estables con aplicación en la industria alimenticia y

cosmética”

vi

Dedicatoria

A mis padres Iván y Guadalupe que

me enseñaron que con esfuerzo

puedo lograr mis metas.

A mis hermanas Diana y Gabriela

por su apoyo y cariño incondicional.

A mis queridos abuelitos que se

encuentran a lado de Dios, Neptalí y

Carlos siempre serán mi fuente de

inspiración.

vii

Agradecimientos

Agradezco a Dios por darme la fuerza para llegar a culminar esta etapa de mi

vida, además por permitirme encontrar personas maravillosas.

A mi padre Iván por ser esa persona que llena de alegría mi vida, gracias por

apoyarme en mis sueños y enseñarme el camino de Dios.

A mi madre Guadalupe gracias por guiarme en cada paso de mi vida, por ser más

que una madre una amiga que me brinda su confianza y amor.

A mis queridas hermanas Diana y Gabriela por cada travesura compartida, por su

apoyo sobre todo en los momentos más difíciles.

A toda mi familia por ser personas incondicionales conmigo y acompañarme en

cada momento de mi vida especialmente a mí querida abuelita Luisa por ser mi segunda

madre y mostrarte que el verdadero amor existe.

Un agradecimiento especial a la PhD. Martha Suárez por su apoyo incondicional

en el desarrollo de este trabajo de investigación, además por ser fuente de inspiración en

el avance de la Química.

A mis amigos María Judith, Liliana, Kevin, David, Martín por cada risa

compartida, noches de desvelo, momentos difíciles durante la carrera, gracias por

demostrar una amistad sincera.

viii

Índice de contenidos

Derechos de Autor ................................................................................................ii

Constancia de Aprobación del tutor ................................................................... iii

Constancia de Aprobación del Trabajo Final por el Tribunal ............................. iv

Lugar donde se realizó la investigación................................................................ v

Dedicatoria ........................................................................................................... vi

Agradecimientos .................................................................................................vii

Índice de contenidos ......................................................................................... viii

Índice de tablas ..................................................................................................... x

Índice de gráficos ................................................................................................. xi

Índice de figuras .................................................................................................xii

Índice de ecuaciones ......................................................................................... xiii

Índice de anexos ................................................................................................ xiv

Glosario............................................................................................................... xv

Resumen ............................................................................................................ xvi

Abstract .............................................................................................................xvii

Introducción .......................................................................................................... 1

Capítulo I .............................................................................................................. 2

El problema ....................................................................................................... 2

Planteamiento del problema. ........................................................................ 2

Formulación del problema. ........................................................................... 3

Preguntas directrices. .................................................................................... 3

Objetivos. ...................................................................................................... 3

Objetivo general.................................................................................................... 3

Objetivos específicos. ........................................................................................... 3

Importancia y Justificación. .......................................................................... 4

Capítulo II ............................................................................................................. 6

Marco referencial .............................................................................................. 6

Oleorresina de pimiento (Capsicum annuum). ..................................................... 7

Carotenoides. ........................................................................................................ 9

Encapsulación. .................................................................................................... 14

Estabilidad por almacenamiento. ........................................................................ 17

ix

Cinética de degradación para estudio de estabilidad. ......................................... 17

Tratamiento a la muestra. ................................................................................... 18

Extracción Söxhlet. ............................................................................................. 19

Espectrofotometría Ultravioleta-visible.............................................................. 20

Solubilidad. ......................................................................................................... 20

Calorimetría de barrido diferencial (DSC). ........................................................ 20

Espectroscopia infrarroja con transformadas de Fourier. ................................... 20

Dispersión dinámica de la luz (DLS).................................................................. 21

Índice de polidispersión. ..................................................................................... 21

Potencial Z. ......................................................................................................... 21

Hipótesis alternativa (Hi). ................................................................................... 22

Hipótesis Nula (Ho). ........................................................................................... 22

Variable dependiente o respuesta. ...................................................................... 22

Variables independientes. ................................................................................... 22

Capítulo III.......................................................................................................... 23

Marco metodológico ....................................................................................... 23

Muestra. .............................................................................................................. 23

Métodos y materiales. ......................................................................................... 23

Método. ............................................................................................................... 24

Capítulo IV ......................................................................................................... 31

Análisis y discusión de resultados .................................................................. 31

Muestra. .............................................................................................................. 31

Encapsulación de la oleorresina.......................................................................... 31

Solubilidad del complejo oleorresina-β-ciclodextrina. ....................................... 37

Análisis térmico. ................................................................................................. 38

Análisis por espectroscopia infrarroja con transformadas de Fourier. ............... 40

Tamaño de partícula, polidispersión. .................................................................. 41

Potencial Z. ......................................................................................................... 41

Estabilidad de almacenamiento. ......................................................................... 42

Validez de la hipótesis de trabajo. ...................................................................... 48

Capítulo V ........................................................................................................... 49

Conclusiones y recomendaciones ................................................................... 49

Bibliografía ......................................................................................................... 51

x

Anexos ................................................................................................................ 57

Índice de tablas

Tabla 1 Composición química de la oleorresina de pimiento .............................. 8

Tabla 2 Distribución del contenido de carotenoides en alimentos representativos

expresados en µg/100g ....................................................................................... 11

Tabla 3 Métodos de encapsulación ..................................................................... 15

Tabla 4 Materiales encapsulantes ....................................................................... 16

Tabla 5 Ecuaciones cinéticas de reacción. .......................................................... 18

Tabla 6 Ecuaciones de tiempo de vida media. .................................................... 18

Tabla 7. Materiales y equipos ............................................................................. 24

Tabla 8. Reactivos .............................................................................................. 24

Tabla 9 Factores experimentales del proceso de encapsulación. ........................ 25

Tabla 10 Condiciones de almacenamiento ......................................................... 27

Tabla 11 Codificación de niveles por factor ...................................................... 28

Tabla 12 Matriz de experimentos aleatorizada ................................................... 29

Tabla 13 Matriz Operacionalización de variables .............................................. 29

Tabla 14 Algoritmo de Yates .............................................................................. 30

Tabla 15 Resultados de la eficiencia de encapsulación del diseño factorial 23 .. 32

Tabla 16 Estimación de los efectos por algoritmo de Yates ............................... 32

Tabla 17 Efectos que se produce en la eficiencia de encapsulación ................... 33

Tabla 18 Significancia estadística de los efectos en la eficiencia encapsulación

............................................................................................................................ 33

Tabla 19 Significancia estadística ...................................................................... 34

Tabla 20 Solubilidad del complejo oleorresina-β-ciclodextrina ......................... 37

Tabla 21 Tamaño de partícula e índice de polidispersión .................................. 41

Tabla 22 Estabilidad a condiciones de estrés y sin protección de la luz. ........... 42

Tabla 23 Estabilidad a condiciones ambientales y sin protección de la luz ....... 43

Tabla 24 Estabilidad a condiciones de estrés y con protección de la luz ........... 44

Tabla 25 Estabilidad a condiciones ambientales y con protección de la luz ...... 46

Tabla 26 Cinética de la estabilidad de la oleorresina y del complejo oleorresina-

β-ciclodextrina .................................................................................................... 47

Tabla 27 Tiempo de vida media de la oleorresina y complejo de oleorresina-β-

ciclodextrina ....................................................................................................... 47

Tabla 28 Formulación preliminar de crema de uso cosmético ........................... 50

xi

Índice de gráficos

Gráfica 1 Curva de calibración con estándar secundario de β-caroteno Sigma-

Aldrich, CAS 7235-40-7 en hexano grado analítico. ......................................... 31

Gráfica 2 Curva de solubilidad del complejo oleorresina-β-ciclodextrina ......... 37

Gráfica 3 Estabilidad a condiciones de estrés y sin protección de la luz. .......... 43

Gráfica 4 Estabilidad a condiciones ambientales sin protección de la luz ......... 44

Gráfica 5 Estabilidad en condiciones de estrés y con protección de la luz ........ 45

Gráfica 6 Estabilidad a condiciones ambientales con protección de la luz ........ 46

xii

Índice de figuras

Figura 1 Oleorresina de pimiento ......................................................................... 7

Figura 2 Estructura carotenoide ............................................................................ 9

Figura 3 Estructura química de los pigmentos carotenoides habitualmente

presentes en nuestra dieta y de mayor relevancia nutri-funcional. ..................... 10

Figura 4 Ejemplo de carotenoide ácido bixina ................................................... 12

Figura 5 Espectro de absorción de β-caroteno .................................................... 13

Figura 6 Vitamina A y su derivación del β-caroteno. ........................................ 14

Figura 7 Estructura de la β-ciclodextrina ........................................................... 17

Figura 8 Equipo Söxhlet ..................................................................................... 19

Figura 9 Pimiento (Capsicum annuum) en estado de madurez. ......................... 31

Figura 10 Diagrama de Pareto de efectos estimados para la eficiencia de

encapsulación. ..................................................................................................... 34

Figura 11 Diagrama del efecto de tiempo de agitación en la eficiencia de

encapsulación. ..................................................................................................... 35

Figura 12 Ruptura del equilibrio al superar el tiempo de agitación. .................. 35

Figura 13 Diagrama del efecto de interacción entre el tiempo de agitación y

volumen de oleorresina. ...................................................................................... 36

Figura 14 Influencia de la velocidad de agitación en el flujo ............................. 36

Figura 15 Solubilidad a 40°C. ............................................................................ 38

Figura 16 Termograma de oleorresina de pimiento (Capsicum annuum) .......... 38

Figura 17 Termograma de β-ciclodextrina Sigma-Aldrich, CAS 7585-39-9 ..... 39

Figura 18 Termograma del complejo oleorresina-β-ciclodextrina .................... 39

Figura 19 Espectro IR de β-ciclodextrina Sigma-Aldrich, CAS 7585-39-9 ....... 40

Figura 20 Espectro IR del complejo oleorresina- β-ciclodextrina ...................... 40

xiii

Índice de ecuaciones

Ecuación 1 Stokes-Einstein ................................................................................ 21

Ecuación 2 Eficiencia de encapsulación expresada en porcentaje ..................... 26

Ecuación 3 Solubilidad (g/L) .............................................................................. 26

Ecuación 4 Significancia estadística ................................................................... 30

Ecuación 5 Error estándar del efecto .................................................................. 30

Ecuación 6 Modelo matemático para determinar la eficiencia de encapsulación.

............................................................................................................................ 37

xiv

Índice de anexos

Anexo A Árbol de problemas ............................................................................. 57

Anexo B Categorización de variables................................................................. 58

Anexo C Instrumentos de recolección de datos .................................................. 59

Anexo D Fotografías del trabajo de investigación ............................................. 62

xv

Glosario

ORP Oleorresina de pimiento

DSC Calorimetría de barrido diferencial

DLS Dispersión de luz dinámica

FT-IR Espectroscopia infrarrojo con transformadas de Fourier

UV-Vis Espectrofotometría ultravioleta-visible

TGA Análisis termogravimétrico

t Tiempo de agitación en minutos

V Volumen de oleorresina de pimiento en mililitros

A Velocidad de agitación en revoluciones por minuto

EF Eficiencia de encapsulación

xvi

“Evaluación de estabilidad de la oleorresina de pimiento (Capsicum annuum),

encapsulada en β-ciclodextrina; para uso como colorante”

Autora: Chamba Adriana

Tutora: Suárez Heredia Martha

Resumen

La oleorresina de pimiento (Capsicum annuum) contiene fundamentalmente

carotenoides, capsaicinoides y algunas vitaminas; al contener carotenoides limita su

aplicación como colorante natural debido a su falta de estabilidad. En este estudio se

evaluó la estabilidad de la oleorresina de pimiento (Capsicum annuum) encapsulada en

β-ciclodextrina, para uso como colorante natural. La oleorresina del pimiento (Capsicum

annuum) fue sometida a un proceso de encapsulación en 𝛽-ciclodextrina aplicando el

método de coprecipitación, dónde se determinó mediante un diseño factorial 23, que al

trabajar con: 800rmp, 40 minutos de agitación y 3mL de oleorresina se maximiza la

eficiencia de encapsulación al 99,07%. Se estableció mediante gravimetría que a 40°C la

solubilidad del complejo de oleorresina-β-ciclodextrina es de 0,788g/L±0,313g/L. El

complejo oleorresina-β-ciclodextrina presentó estabilidad térmica al no presentar picos

alrededor de 134,49°C en el termograma realizado por calorimetría de barrido

diferencial; estabilidad electrostática con un potencial Z de -36,4±1,4 mV y estabilidad

de almacenamiento donde se evidenció un tiempo de vida media para la oleorresina de

alrededor del día 18 o 19, en cambio el complejo de oleorresina-β-ciclodextrina aumenta

su tiempo de vida media, incluso se observó que en condiciones de estrés a 39,66°C y

con protección a la luz va alcanzar un tiempo de vida media de 50 días.

Palabras claves: PIMIENTO, OLEORRESINA, 𝛽-CICLODEXTRINA,

ENCAPSULACIÓN, COMPLEJO, ESTABILIDAD.

xvii

Evaluation of stability of pepper oleoresin (Capsicum annuum), encapsulated in β-

cyclodextrin; for use as a colorant

Author: Chamba Adriana

Tutor: Suárez Heredia Martha

Abstract

Pepper oleoresin (Capsicum annuum) contains mainly carotenoids, capsaicinoids and

some vitamins; as it contains carotenoids, it limits its application as a natural dye due to

its lack of stability. This study evaluated the stability of the pepper oleoresin (Capsicum

annuum) encapsulated in β-cyclodextrin, for use as a natural dye. The pepper oleoresin

(Capsicum annuum) was subjected to an encapsulation process in β-cyclodextrin

applying the coprecipitation method, where it was determined by means of a factorial

design 23, which when working with: 800rmp, 40 minutes of agitation and 3mL of

oleoresin maximizes the encapsulation efficiency at 99.07%. It was established by

gravimetry that at 40°C the solubility of the oleoresin-β-cyclodextrin complex is

0.788g/L±0.313g/L. The oleoresin-β-cyclodextrin complex presented thermal stability as

it did not present peaks around 134.49°C in the thermometer performed by differential

scanning calorimetry; electrostatic stability with a Z potential of -36.4±1.4 mV and

storage stability where a half-life time for oleoresin of around day 18 or 19 was

evidenced, whereas the oleoresin complex-β-cyclodextrin increases its half-life time, it

was even observed that under stress conditions at 39.66°C and with light protection it

will reach a half-life time of 50 days.

Keywords: PEPPER, OLEORESIN, Β-CYCLODEXTRIN, ENCAPSULATION,

COMPLEX, STABILITY.

1

Introducción

La oleorresina de pimiento (Capsicum annuum) contiene fundamentalmente

carotenoides, capsaicinoides y algunas vitaminas; al contener carotenoides limita su

aplicación como colorante natural debido a su falta de estabilidad. Una posible alternativa

es la encapsulación por lo tanto se evaluó la estabilidad de la oleorresina de pimiento

(Capsicum annuum), encapsulada en β-ciclodextrina; para uso como colorante, para lo

cual se identificaron las condiciones óptimas para maximizar la eficiencia de

encapsulación.

El contenido del trabajo de investigación consta de cinco capítulos detallados a

continuación:

El capítulo I; se describe el planteamiento del problema y formulación del

problema en donde se buscó conceptualizar y limitar el tema de investigación, además se

planteó las preguntas directrices necesarias para diferenciar los objetivos de la

investigación, y justificar el problema.

El capítulo II, se describe los antecedentes a este estudio que han sido

desarrollados y que se utilizaron como base para la ejecución del mismo. Además,

incluye el fundamento teórico, que sustentan el trabajo de investigación. También se

conceptualizaron las variables y se planteó las posibles respuestas al problema.

El Capítulo III corresponde al marco metodológico que muestra el diseño

experimental, variables y consideraciones estadísticas para el análisis de dato de la

ejecución de la parte experimental

El Capítulo IV, corresponde al análisis de resultados que se obtuvo de la parte

experimental y sus respectivas discusiones.

El Capítulo V se desarrolló las conclusiones respectivas del trabajo de

investigación y recomendaciones que se podrían utilizar en estudios posteriores en la

misma línea de investigación.

2

Capítulo I

El problema

Planteamiento del problema.

El color es una impresión sensorial por la cual el ser humano se encuentra

influenciado ya sea por su valor estético o como medio de identificación es por ello que

en productos alimenticios, cosméticos y medicamentos se incluye un colorante para

mejorar su apariencia física. En el caso de los medicamentos incorporar un colorante en

su formulación genera una gran aceptación en pacientes pediátricos (Suárez, Barbosa,

Pinzón, & Barreto, 2007), lo mismo sucede con los alimentos que recurren a la adición

de colorantes para resaltar, recuperar o uniformar su color original o simplemente para

hacerlo más atractivo. En el mercado existen dos tipos de colorantes, los naturales y

sintéticos, las industrias se ven inclinadas al uso de colorantes sintéticos que poseen

mejores propiedades en disolución en medios acuosos, una amplia gama de colores,

resistencia a tratamientos propios del proceso de fabricación, además son más

económicos que los naturales (Parra & Martínez, 2004).

En la actualidad la industria busca ofrecer a sus consumidores un producto de

mayor calidad, estabilidad y sobre todo saludable es por eso que representa un gran reto

la implementación de colorantes naturales como alternativa al uso de colorantes

sintéticos. Incorporar en las formulaciones alimenticias o farmacéuticas colorantes

naturales produce beneficios debido a que no producen daños en la salud y pueden ser

una opción para reducir los efectos cancerígenos a nivel mundial, debido a la capacidad

antioxidante que presentan (Mínguez, Pérez, & Hornero, 2005).

Ecuador cuenta con una variedad de especies vegetales que pueden ser fuente de

colorantes naturales, uno de ellos es el pimiento (Capsicum annuum) que ha

incrementado consumo en los últimos años, debido a sus tres presentaciones en el

mercado: fruto fresco, en polvo y oleorresina (Jiménez & Iza, 2018). La utilización de la

oleorresina del pimento como colorante es limitada tanto por su solubilidad en medios

apolares como por su poca estabilidad debido a la presencia de carotenoides en su

composición. Los carotenoides son pigmentos liposolubles responsables de la mayoría

de los colores amarillos, anaranjados y rojos de frutos y verduras que en estado natural

son estables sin embargo cuando son sometidos a procesos de extracción en disolución

con aceites o en disolventes orgánicos se vuelven muchos más lábiles debido a factores

que influyen en su degradación como por ejemplo estructura del carotenoide, exposición

a la luz, actividad del agua, temperatura, presencia de oxidantes (Meléndez, Vicario, &

Heredia, 2004a).

La falta de estabilidad de la oleorresina de pimiento implica que las industrias,

para otorgar la coloración de la gama del amarillo al anaranjado, utilicen tartrazina que

es uno de los colorantes sintéticos que más reacciones alérgicas produce y podría dejar

residuos de sustancias cancerígenas. A partir del 2010, en caso de los alimentos se normó

3

que todos los productos que contengan este colorante deben llevar la advertencia: “puede

alterar la actividad y la atención en niños”. Algunos de los alimentos que contienen este

tipo de colorante son refrescos en polvo, dulces, helados, gelatinas, snacks, aperitivos,

salsas, condimentos, entre otros (Rocío, 2013). Lo mismo sucede en la industria

farmacéutica que utiliza este colorante en comprimidos, jarabes a base de hierro y

complejo B (González, 2015).

Debido a estos antecedentes, es deseable que el uso de colorantes sintéticos sea

observado y se ponga énfasis en la necesidad de investigar alternativas de origen natural.

Es por eso que se planteó resolver el problema de estabilidad de la oleorresina del

pimiento (Capsicum annuum) a través de un proceso de encapsulación en una matriz de

𝛽-ciclodextrina. Este tipo de matriz presenta una cavidad interna de carácter hidrófobo

y una superficie externa de carácter hidrofílico lo que facilitaría la formación de un

complejo de inclusión oleorresina-𝛽-ciclodextrina (G. Martínez & Gómez, 2007). Este

complejo podría ser potencialmente utilizado en aplicaciones en productos alimenticios

y farmacéuticos con menos riesgos para la salud que los colorantes sintéticos.

Formulación del problema.

Los parámetros del proceso de encapsulación de la oleorresina pimiento

(Capsicum annuum) en β-ciclodextrina, influyen en la eficiencia de encapsulación y

estabilidad de la oleorresina.

Preguntas directrices.

¿Qué método permite extraer la oleorresina de pimiento (Capsicum

annuum)?

¿Cómo se puede encapsular la oleorresina de pimiento (Capsicum

annuum) en una matriz de β-ciclodextrina?

¿De qué manera se puede determinar la eficiencia de encapsulación de la

oleorresina de pimiento (Capsicum annuum) en una matriz de β-

ciclodextrina?

¿De qué forma se puede evaluar la estabilidad del complejo oleorresina-

β-ciclodextrina?

¿Cómo se puede determinar la solubilidad del complejo la oleorresina-β-

ciclodextrina?

Objetivos.

Objetivo general.

Evaluar la estabilidad de la oleorresina de pimiento (Capsicum annuum)

encapsulada en β-ciclodextrina, para uso como colorante.

Objetivos específicos.

Extraer la oleorresina de pimiento (Capsicum annuum) por el método

Söxhlet.

4

Encapsular la oleorresina de pimiento (Capsicum annuum) en β-ciclodextrina

por el método de coprecipitación.

Determinar la eficiencia de encapsulación de oleorresina de pimiento

(Capsicum annuum) mediante la cuantificación de carotenoides totales

expresados como β-caroteno por espectrofotometría ultravioleta-visible.

Evaluar la estabilidad del complejo oleorresina-β-ciclodextrina por

espectrofotometría ultravioleta-visible.

Determinar la solubilidad del complejo oleorresina-β-ciclodextrina en agua

a través del método gravimétrico a diferentes temperaturas.

Importancia y Justificación.

En la actualidad existe una tasa de crecimiento del 8% en la demanda de

colorantes naturales prevista hasta el año 2022, la misma que en el mercado representa

más de $3500 millones (Gaete, 2017). Este crecimiento se centra en el interés del

consumidor debido a que el uso de los colorantes sintéticos es considerado tóxico. Un

ejemplo son los colorantes que provienen de azoderivados, que son causantes de

enfermedades cardiovasculares, respiratorias, diabetes y cáncer y que su consumo ha ido

en aumento en los últimos años a nivel mundial. De acuerdo a la Organización Mundial

de la Salud (OMS) se estima que para el 2020 el 75% de las muertes en el mundo serán

por causa de este tipo de enfermedades (Gómez, 2011).

El consumo de productos ricos en antioxidantes y vitaminas es una alternativa

para reducir la problemática en la salud humana; de ahí nace la importancia del uso de la

oleorresina del pimento (Capsicum annuum) debido a que de ella se obtienen las más

altas concentraciones de carotenoides derivados de fuentes vegetales, especialmente de

β-caroteno (2,220 μg/100g de porción comestible) que son compuestos con carácter

antioxidante y además poseen mayor contenido de vitamina C (81mg/100g de porción

comestible) que aporta con el 135% de las ingestas recomendadas en comparación con

la naranja que aporta con el 130% (Jiménez & Iza, 2018).

En Ecuador se estima que se siembran alrededor de 1420 ha de pimiento, con una

producción que bordea las 6955 toneladas y un rendimiento promedio de 4,58 t/ha

(Jiménez & Iza, 2018). La provincia de Manabí ocupa el primer lugar en producción con

el 26%, le sigue la provincia de Santa Elena con 25% y Loja con 22%; siendo un aporte

importante en el sector agrícola. Esta producción permitiría que el pimiento no solo sea

aprovechado como fruto fresco, sino también como colorante en la industria alimenticia

o farmacéutica (Villacís & Mastrocola, 2018).

La utilización de la oleorresina de pimiento (Capsicum annuum) sería una

alternativa muy factible para que las industrias disminuyan el uso de colorantes sintéticos

en sus productos, debido a que este tipo de oleorresina presenta propiedades

nutricionales, farmacológicas y colorantes (Cardona et al., 2006). Sin embargo para

incorporar a la oleorresina de pimiento como colorante, es fundamental que se trate de

mejorar su estabilidad y solubilidad en medios acuosos; debido a que la presencia de

carotenoides en su composición química, afectan su estabilidad a la luz, temperatura y

5

oxidación.

Al encapsular la oleorresina en β-ciclodextrina se otorgará al colorante natural un

valor agregado. Los componentes apolares de la oleorresina de pimiento al ser incluidos

en una matriz de superficie polar, favorecerá su solubilidad en agua; por lo tanto el

colorante podría ser aplicado en productos de carácter hidrofílico y no solo en productos

hidrófobos. Actualmente el uso de la oleorresina de pimiento es limitado, únicamente se

utiliza 10 mg/kg de oleorresina dispersos en aceites comestibles, alcohol benzílico,

dextrosa, lecitina y sales, como parte de formulaciones alimenticias (Fernández, 2007).

El presente estudio se enfoca en el proceso de encapsulación de oleorresina de

pimiento (Capsicum annuum) en β-ciclodextrina, para determinar la estabilidad y

solubilidad de la oleorresina de pimento (Capsicum annuum) como parte del complejo

de inclusión, resultados que permitirán conocer si es posible aplicar en una formulación

alimenticia o farmacéutica.

6

Capítulo II

Marco referencial

Antecedentes.

La oleorresina de pimiento (Capsicum annuum) contiene fundamentalmente

carotenoides, capsaicinoides y algunas vitaminas. Al ser una fase apolar se limita su

aplicación como colorante natural; en la industria se encuentra dispersa en aceites

comestibles, alcohol bencílico, dextrosa, lecitina y sales (Fernández, 2007). La

estabilidad de la mezcla de componentes, se ve afectada por la exposición a la luz,

actividad del agua, temperatura y presencia de oxidantes (Meléndez et al., 2004a).

Una alternativa para mejorar las propiedades de la oleorresina de pimiento sería

un proceso de encapsulación. Se han realizado estudios para encapsular compuestos

hidrofóbicos en diversas matrices aplicando métodos de encapsulación que se detallan a

continuación:

Garzón, Londoño, Hurtado, Cardona y Rincón en el año 2013 evaluaron la

efectividad, en términos de la capacidad colorante sobre un chorizo, de la oleorresina de

pimiento (ORP) obtenida por fluidos supercríticos, comparada con la ORP

microecapsulada por spray-drying. En el proceso de microencapsulación se utilizó 40g

de ORP con una mezcla de encapsulantes compuesta por 25% de maltodextrina (10

equivalentes dextrosa) y 75% de almidón modificado, en una relación 1:10 ORP:

encapsulantes, respectivamente. (Garzón, Londoño, Hurtado, Cardona, & Rincón, 2013).

Otro estudio que se tomó como referencia es el de Alzate, Ceballos, López,

Caicedo y Cano Salazar en el año 2013, acerca de la obtención del complejo

ciclodextrina-curcumina y su uso como reemplazante de tartrazina. Se desarrollaron tres

experimentos; el primero estudió el efecto de la concentración y tipo de solvente sobre

la absorción de la curcumina, en el siguiente experimento se determinó la asociación y

relación estequiométrica entre la curcumina y dos ciclodextrinas:β-ciclodextrina (β-CD)

y γ-ciclodextrina (γ-CD) y en el último se estudió los métodos de mezcla física y

coprecipitación para obtener el complejo curcumina-ciclodextrina, la eficiencia se

analizó por calorimetría de barrido diferencial (DSC). Se determinó en esta investigación

que la curcumina forma complejos de inclusión en presencia de β-CD y γ-CD en

solución. La solubilidad de curcumina es más efectiva en γ-CD, además la asociación de

ambas ciclodextrinas es de 1:1, indicando que es más fuerte con γ-CD. El análisis de

DSC muestra que los complejos de inclusión por mezcla física y coprecipitación se

formaron. Sin embargo, para efectos de solubilidad, es más recomendable utilizar el

método de coprecipitación, dado que hay una prehidratación. (Alzate Ceballos, López, Caicedo, &

Cano, 2013)

Así mismo en la revista de Bioengineering en el 2017, Kotronia y colaborares

estudiaron la encapsulación de aceite esencial del Orégano (Origanum onites L.) en β-

ciclodextrina utilizando el método de coprecipitación. Se aplicó una relación 20:80 p/p

7

de aceite esencial-ciclodextrina a temperatura ambiente. La caracterización del complejo

se realizó por dispersión de luz dinámica (DLS), espectroscopia FT-IR, calorimetría de

barrido diferencial (DSC), análisis termogravimétrico (TGA), espectroscopía de

resonancia magnética nuclear (NMR) y escaneo Microscopía Electrónica (SEM). La

espectrofotometría UV-Vis se utilizó para la determinación de la eficacia de inclusión la

misma que fue del 26%. (Kotronia et al., 2017)

La encapsulación de los aceites esenciales de citral (cymbopogon citratus) en β-

ciclodextrinas usando CO2 supercrítico, fue estudiada por Restrepo, Vinasco, Jaramillo,

& Colmenares en 2009. Se estudió la variación de temperatura (313,15; 323,15; 333,15

K) y presión (172,32; 206,78 y 241,25 bar) para obtener un porcentaje de eficiencia de

encapsulación alto. Se determinó que las condiciones óptimas de encapsulamiento son

de presión: 241,25 bar y temperatura: 313,15K, para estas condiciones se obtuvo un

porcentaje de eficiencia de 48,9%. El complejo formado se evaluó mediante

cromatografía de gases, espectroscopia FT-IR y espectrofotometría UV-Vis. (J. Restrepo,

Vinasco, Jaramillo, & Colmenares, 2009)

En la Universidad Pontificia Católica del Perú en el 2016 Centurión y Kong

realizaron la caracterización fisicoquímica del complejo de fenbendazol y β-ciclodextrina

en solución acuosa. Se utilizó el método de coprecipitación obteniéndose un aumento de

la solubilidad del fenbendazol desde 0,28 hasta 2,5 μg/mL, valor que se obtuvo mediante

un estudio de solubilidad de fases. Para caracterizar el complejo se utilizó técnicas de

espectrofotometría UV/Vis, IR, DSC-TGA y con cálculos computacionales. (Centurión &

Kong, 2016)

Fundamento teórico.

Oleorresina de pimiento (Capsicum annuum).

La oleorresina de pimiento (Capsicum annuum) es un material oleoso de color

rojo anaranjado (Figura 1) que se obtiene mediante la extracción del polvo seco, con un

solvente de carácter apolar. Contiene una mezcla compleja de aceites esenciales,

materiales coloreados, ceras, aminoácidos y proteínas. La oleorresina es insoluble en

agua, mientras que es fácilmente soluble en aceite vegetal, grasas y se dispersa en agua

mediante la adición de polisorbato (M. Restrepo, 2006). Además se caracteriza por

presentar aroma agradable, una viscosidad media (82 a 90 cP aproximadamente), sabor

dulce y contenido de agua menor al 0,5% (Plaza & Lock, 1997).

Figura 1 Oleorresina de pimiento

Fuente: (Proyar.com.ar, 2019)

8

Además es utilizada como un ingrediente para aportar principios aromatizantes y

pigmentantes, que mediante una variación de la solubilidad se puede utilizar en la

industria cosmética, farmacéutica, alimentación animal y en aplicaciones agrícolas (M.

Restrepo, 2006).

Cualitativamente se determina la presencia de ácidos grasos, una pequeña

cantidad de aceites esenciales, pigmentos, compuestos pungentes, resinas, proteínas,

celulosa, pentosas y minerales. En la tabla 1 se describen los principales compuestos

presentes en la oleorresina de pimiento:

Tabla 1 Composición química de la oleorresina de pimiento

Grupo Compuestos

Ácidos grasos

65 a 70% linoleico

9-8% palmítico

7% linolénico

2,5% esteárico

9% oleico.

1-3% laurico

2-4% miristico y palmitoleico

Carotenoides

52%-60% capsantina

10-18% capsorrubina (pigmentos rojos)

3-5% β-criptoxantina

8-10% zeaxantina

<4% violaxantina (pigmentos amarillos)

8-23% β-caroteno (pigmento amarillo-

anaranjado).

Vitaminas

Vitamina E (α-tocoferol)

Esteroles y esteroides

En muy baja concentración

Fracción aromática

11 mg/kg m-xileno

11 mg/kg β-elemeno

7,9 mg/kg geranilacetona o βionona

5,6 mg/kg (E)-6-metil-3,5-heptadien-2-ona

4,2 mg/kg 2- isobutil-3-metoxipirazina

2,9 mg/kg 2,3,5,6-tetrametilpirazina

1,3-1,8 mg/kg benzaldehído, safranal y β-

ciclocitral

1-2 mg/kg dihidroactinidiolido, eugenol,

campfeno y δ-terpineno

<1 mg/kg (Z)-3-hexen-1-ol, (E)-2-hexenal;

hexanol, (E)-2-hexen1-ol y hexanal.

Modificado: Alarco & Patiño (2008) (Alarco & Patiño, 2008)

9

Carotenoides.

Los carotenoides entre todos los pigmentos presentes en los organismos vivos son

los más ampliamente distribuidos en la naturaleza, después de las clorofilas. Se los

encuentra en tejidos fotosintéticos como no fotosintéticos y son los responsables del color

amarillo, naranja y rojo de la mayoría de frutos, bacterias, algas, hongos y animales. En

el caso de los animales no son capaces de sintetizarlos y los incorporan a través de la

dieta. Se estima que la producción anual en la naturaleza es de 108 toneladas, y se

conocen cerca de 700 carotenoides (Mínguez et al., 2005).

Estructura química y clasificación.

Desde el punto de vista químico son tretraterpenos constituidos por ocho unidades

de isopreno con un anillo de ciclohexeno en cada uno de los extremos de la cadena

(Carranco, Calvo, & Gil, 2011). Todos los carotenoides pueden ser considerados como

derivados de licopeno (C40H56) cuyo orden se invierte en el centro de la molécula (Figura

2), y por modificaciones mediante reacciones de hidrogenación, deshidrogenación,

ciclación, inserción de oxígeno, migración de doble enlace, migración de metilo,

alargamiento de la cadena, acortamiento de la cadena pueden transformarse en otros

carotenoides (Taylor & Jiménez, 2011).

Figura 2 Estructura carotenoide

Fuente: (Taylor & Jiménez, 2011).

Existen dos tipos de carotenoides: los carotenos, que no contienen oxígeno en sus

anillos terminales por ejemplo β-caroteno, licopeno, α-caroteno, etc. y las xantofilas que

si los tienen como la β-criptoxantina, luteína, zeaxantina, etc. (Carranco et al., 2011); otra

forma de clasificarlos es como primarios y secundarios. El grupo de carotenoides

primarios es aquel requerido por las plantas para el desarrollo de la fotosíntesis por

ejemplo β-caroteno, violaxantina y neoxantina, en cambio los carotenoides secundarios

se localizan en frutas y flores, como: α-caroteno, β-criptoxantina, zeaxantina,

anteraxantina, capsantina, capsorrubin. En la Figura 3 se presentan algunas estructuras

de pigmentos carotenoides más importantes:

10

Figura 3 Estructura química de los pigmentos carotenoides habitualmente presentes en nuestra

dieta y de mayor relevancia nutri-funcional.

Fuente: (Mínguez et al., 2005).

11

Distribución de los carotenoides en los alimentos.

Los carotenoides se encuentran mayormente distribuidos en los vegetales tanto

en concentración como en variedad, sin embargo también se los puede encontrar en algas,

bacterias, hongos y en animales, aunque estos últimos no pueden sintetizarlos. Su

distribución en las plantas no siguen un patrón único por ejemplo, en las verduras se basa

en el modelo general de los cloroplastos de todas las plantas superiores, existiendo de

mayor a menor cantidad la luteína, β-caroteno, violaxantina, neoxantina, zeaxantina, β-

criptoxantina y anteraxantina; en cambio en el caso de las frutas las que se encuentran en

mayor proporción son las xantofilas (Carranco et al., 2011).

En los animales, los carotenoides son incorporados a través de la dieta y se

almacenan en el tejido adiposo sin transformarse, por ejemplo el color de la yema de

huevo se debe a dos xantofilas, luteína y zeaxantina, y a trazas de β-caroteno, mientras

que la astaxantina se encuentra en el salmón lo que otorga el color rosado a la carne.

También en algunos crustáceos se encuentran casos en que los carotenoides como la

astaxantina, se unen a proteínas originando compuestos llamados caroteno-proteínas,

que son los responsables de colores verdosos o azulados, los mismos que cuando se

someten a un proceso de desnaturalización durante su cocción se evidencia el color rojo

del carotenoide (Meléndez, Vicario, & Heredia, 2004b).

En la tabla 2 se presenta la distribución de algunos carotenoides en los alimentos

más representativos.

Tabla 2 Distribución del contenido de carotenoides en alimentos representativos expresados en

µg/100g

Carotenoides µg/100g

Alimento α-caroteno β-caroteno β-criptoxantina Luteína o

zeaxantina Licopeno

Zanahoria 4649 8836 - - -

Pimiento 59 2379 2205 - -

Calabaza 4795 6940 - - -

Tomate 112 393 - 130 3025

Naranja 16 51 122 187 -

Melón 27 1595 - 40 -

Maíz 33 30 - 884 -

Modificado: (Mínguez et al., 2005)

12

Propiedades físico-químicas.

Los carotenoides son compuestos lipídicos por lo tanto son insolubles en agua

pero solubles en compuestos orgánicos como: acetona, metanol, éter dietílico, hexano,

cloroformo y piridina, entre muchos otros; aunque con algunas excepciones. Debido a

que poseen un carácter hidrofóbico se encuentran normalmente en membranas celulares,

sin embargo cuando se asocian con proteínas o se someten a reacciones de glicosilación

se les puede encontrar en medios acuosos (Meléndez, Vicario, & Heredia, 2007).

En cuanto a su acidez y basicidad los carotenoides ácidos pueden formar sales

sódicas o potásicas solubles en agua por tratamiento con álcali, como es el caso de bixina

(Figura 4), astaceno o mitiloxantina (Meléndez et al., 2007).

Figura 4 Ejemplo de carotenoide ácido bixina

Fuente: (Narváez & Mena, 2015).

Otra propiedad de los carotenoides es que presentan actividad antioxidante, que

se manifiesta por la capacidad de inactivar algunas especies de moléculas en estado de

excitación electrónica, principalmente las fotosensibles. Se ha demostrado que los

carotenoides son muy efectivos para la inactivación de oxígeno singulete, (1O2); por lo

tanto evitan el daño fotoxidativo iniciado por esta molécula reactiva (Carranco et al.,

2011).

La propiedad de absorber a la luz se deriva de la presencia de siete o más enlaces

dobles conjugados con la posibilidad de emitir en la gama de colores del amarillo al rojo.

La absorción de la radiación electromagnética de los carotenoides obedecen la ley de

Lambert-Beer, propiedad que permite cuantificarlos espectrofotométricamente

(Meléndez et al., 2004b). En la figura 5 se muestra un espectro de absorción de β-caroteno

en dónde se definieron dos valores de absorción máxima en 465 nm y 490 nm (Gallego,

Acosta, Ocampo, & Cristian, 2006).

13

Figura 5 Espectro de absorción de β-caroteno

Fuente: (Gallego et al., 2006)

Estabilidad de los carotenoides.

Los carotenoides se caracterizan por ser estables cuando se encuentran en su

ambiente natural, sin embargo cuando se realiza un proceso de extracción con solventes

orgánicos o cuando se somete al alimento a cocción se vuelven más lábiles y se ven

afectados por: la estructura, luz, temperatura, pH, reacciones de oxidación y

almacenamiento (Meléndez et al., 2004a).

De acuerdo a la estructura los carotenoides pueden sufrir reacciones de captación

de radicales que disminuyen el número de dobles enlaces coplanares, debido a la

presencia de grupos hidroxilo o carbonilo lo que origina que la reactividad disminuya.

En cambio con la luz pueden sufrir reacciones fotoquímicas que afecten a su estructura

originando compuestos de bajo peso molecular con pérdida de coloración; por ejemplo

licopeno, cuando se aplica luz fluorescente provoca la formación de cinco isómeros

diferentes: di-cis, 5-cis, 9-cis, 13-cis y 15-cis-licopeno (Meléndez et al., 2004a).

La temperatura y pH ( fuertemente alcalinos y ácidos) generan reacciones de

degradación, especialmente los carotenos con mayor actividad biológica que tienen

todos sus dobles enlaces en forma del isómero trans, que se transforman parcialmente en

la forma cis, un ejemplo de esta reacción de isomerización se puede efectuar durante el

proceso de esterilización de productos enlatados, con lo que se pierde parte del poder

vitamínico de los carotenos (Meléndez et al., 2004a).

Otro factor que influye en la estabilidad es el oxígeno que favorece la oxigenación

de los enlaces dobles a funciones epóxidos, hidroxilos y peróxidos entre otros. Esta

destrucción produce decoloración de los pigmentos y pérdida de vitamina A. Los

carotenoides además son oxidados por los peróxidos de las grasas y por tanto se destruyen

bajo condiciones que favorecen la oxidación, incluida la presencia de trazas de cobre y

el menor grado de hierro (Contreras, 2004).

El efecto del almacenamiento sobre los carotenoides va a depender de las

condiciones, en el estudio de Quintero en el año 2004, se han evaluado los cambios que

14

tienen lugar en α-caroteno, β-caroteno y luteína, cuando se mantienen en la oscuridad a

diferentes temperaturas y cuando se almacenan a 25°C expuestos a la luz, los resultados

revelaran que los niveles de las formas todo-trans de estos tres carotenoides disminuyen

al aumentar la temperatura de almacenamiento o el tiempo de iluminación (Quintero,

2004)

Función y actividad biológica.

La importancia de los carotenoides en los alimentos además de su función como

colorantes es también sus propiedades de precursor de la vitamina A (o provitamina A)

y a la acción biológica como antioxidantes.

El β-caroteno es la provitamina A más importante, tanto en términos de

biopotencia como por su presencia en la naturaleza. De 10 a 50 % del β-caroteno ingerido

es absorbido en el tracto intestinal y luego parcialmente convertido en vitamina A; esta

conversión de β-caroteno a vitamina A es de 1:2 (Figura 6), pero en la práctica se ha

encontrado que la eficiencia de la bioconversión del β-caroteno a vitamina A en el cuerpo

humano es de 6:1 (Contreras, 2004).

Figura 6 Vitamina A y su derivación del β-caroteno.

Fuente: (Contreras, 2004).

Los carotenoides son utilizados por el organismo debido a la capacidad

antioxidante que presentan frente a radicales libres de muy diversa naturaleza y origen,

integrando a los carotenoides en el complejo sistema de antioxidantes primarios junto a

los tocoferoles y la vitamina C (Mínguez et al., 2005).

Encapsulación.

El recubrimiento de un compuesto sólido, líquido o gaseoso con una envoltura

que en la mayoría de los casos es de naturaleza polimérica se conoce como encapsulación

(Neira et al., 2013). Es utilizada con la finalidad de otorgar un valor agregado al producto

debido a que mejora la protección, transporte y liberación controlada, en algunos casos

del principio activo (Guevara & Jiménez, 2008).

15

Métodos de encapsulación.

Existen diversas metodologías para encapsular por ejemplo: el secado por

atomización, gelificación iónica, coprecipitación, polimerización interfacial,

coacervación, entre otras (Neira et al., 2013). En el proceso de selección del método de

encapsulación es muy importante tener en cuenta los siguientes factores: el tamaño

partícula requerido, las propiedades fisicoquímicas del material encapsulante y el

compuesto activo, la finalidad del producto encapsulado, el mecanismo de liberación

deseado y el costo (López, 2012).

En la tabla 3 se muestra diferentes métodos de encapsulación con sus

características.

Tabla 3 Métodos de encapsulación

Tipo de Técnica Método de encapsulación Tamaño de partícula (µm)

Química

Coacervación simple 20-200

Coacervación compleja 5-200

Inclusión molecular

(coprecipitación) 5-50

Mecánica

Secado por atomización 1-50

Enfriamiento por

atomización

20-200

Extrusión 200-2000

Fluidización por lecho >100

Modificado: (Guevara & Jiménez, 2008)

Método de inclusión molecular.

Las interacciones entre componentes en los cuales una pequeña molécula se ajusta

dentro de otra se conoce como inclusión molecular, este proceso puede proteger sabores

y otros ingredientes sensibles a factores que afecten su estabilidad como calor, pH, luz,

humedad entre otros. La formación de un complejo de inclusión establece un sistema

donde un compuesto huésped se sitúa en la cavidad del hospedador sin alterar su

estructura de forma significativa (Ortega, 2016).

Materiales encapsulantes.

Existen varios materiales que pueden ser utilizados para atrapar, recubrir o

encapsular un compuesto sólido, líquido o gaseoso. Para su selección se debe considerar

las características que se desean en el producto final. Si el núcleo debe estar protegido de

la acción del agua o humedad, el material de recubrimiento deberá ser hidrófobo o caso

contrario hidrofílico (Wandrey, Bartkowiak, & Harding, 2010).

16

En la tabla 4 se identifican algunos ejemplos de materiales encapsulantes.

Tabla 4 Materiales encapsulantes

Tipo de

material

Ejemplos Método de

encapsulación

Grasas

Cera carnauba, alcohol estearílico, ácido esteárico

Fluidización por

lecho

Proteínas

Gelatina, albúmina, zeína

Fluidización por

lecho, extrusión,

coacervación

Polímeros

Derivados celulósicos, derivados acrílicos,

poliésteres (poliláctico y copolímeros de ácidos

láctico y glicólico).

Coacervación,

fluidización por

lecho, extrusión,

coprecipitación

Carbohidratos

Almidón, dextranos, jarabe de glucosa,

ciclodextrinas, maltodextrinas, sacarosa.

Coacervación,

fluidización por

lecho, extrusión,

coprecipitación

Gomas

Agar, alginato de sodio, goma arábiga, goma guar,

goma de mezquite.

Secado por

atomización

Materiales

inorgánicos Carbonato de calcio, silicatos y sulfato de calcio.

Fluidos

supercríticos

Modificado: (Garnica & Alcántar, 2019; Wandrey et al., 2010)

β-Ciclodextrina.

El oligosacárido cíclico formado por siete unidades de D-(+) glucopiranosa

unidas por enlaces α (1-4) se conoce como β-Ciclodextrina (Figura 7). Se obtiene

mediante una reacción de degradación enzimática del almidón (Serra, 2016) que da lugar

a una estructura molecular toroidal, rígida y con una cavidad interior de volumen

específico (262 Å3). La cavidad interior es hidrófoba, por lo que este compuesto tiene la

propiedad de formar complejos de inclusión albergando moléculas hidrófobas en su

interior; viabilizando la solubilidad en agua de este tipo de moléculas (G. Martínez &

Gómez, 2007).

La β-Ciclodextrina (Figura 7), presenta un peso molecular de 1135g/mol con una

solubilidad a 25°C de 1,85%P/V, además con respecto a su toxicidad se ha demostrado

que por vía oral no es tóxica debido a la falta de absorción en el tracto gastrointestinal

(LD50 > 5000 mg/kg) (Serra, 2016).

17

Figura 7 Estructura de la β-ciclodextrina

Fuente: (G. Martínez & Gómez, 2007)

Estabilidad por almacenamiento.

La capacidad que presenta una sustancia de mantener o conservar por un tiempo

definido, sus propiedades químicas, físicas, microbiológicas, toxicológicas o terapéuticas

mediante la interrelación de tiempo, temperatura y humedad, se conoce como estabilidad

por almacenamiento. Las condiciones por almacenamiento pueden ser: normal o de

control y acelerada o estrés (Tenelema, 2014).

Condiciones normales o de control.

Se aplica para determinar la estabilidad básica de un producto, por efecto de tipo

de empaque o recipiente, se lo realiza a condiciones ambientales de temperatura y

humedad (Domínguez, 2009).

Condiciones aceleradas o estrés.

El producto es sometido a condiciones severas de temperaturas mayores o

menores que las condiciones ambientales. El objetivo es acelerar la tasa normal de

degradación (Domínguez, 2009).

Cinética de degradación para estudio de estabilidad.

La estabilidad es generalmente expresada en términos de una constante cinética

de velocidad (k), que presenta unidades de acuerdo al orden cinético de reacción. Para

determinar el orden cinético de reacción de un solo reactivo, el método más empleado es

por tanteo, que consiste en determinar en varios tiempos la concentración y realizar las

diversas regresiones lineales según sea el orden de reacción: 0, 1, 2, 3, 1/2, 3/2 o 5/2 hasta

obtener el mejor coeficiente de correlación cercano a 1. En la tabla 5 se presenta algunas

ecuaciones cinéticas de acuerdo al orden cinético (Villacis, 2018).

18

Tabla 5 Ecuaciones cinéticas de reacción.

Orden cinético Ecuación cinética

0 [A]=[A0]-a*k*t

1 ln[A]=ln[A0]-a*k*t

2 1/[A]=1/[A0]+a*k*t

3 1/[A]2=1/[A0]2+2*a*k*t

1/2 [A]1/2=[A0]1/2-1/2*a*k*t

Nota. [A]: concentración instantánea; [A0]: concentración inicial o en tiempo cero; t: tiempo; a:

factor estequiométrico; k: constante cinética.

Modificado: (Villacis, 2018)

Tiempo de vida media.

En una reacción que involucra un solo reactivo se puede hablar en cinética

química de la vida media del proceso, definida como el tiempo que debe transcurrir para

que la concentración instantánea del reactivo disminuya a la mitad su valor original. En

la tabla 6 se representa algunas ecuaciones para determinar el tiempo de vida de acuerdo

al orden cinético (Aguilar, 2009).

Tabla 6 Ecuaciones de tiempo de vida media.

Orden cinético Ecuación cinética

0 t1/2=[A0]/2*a*k

1 t1/2=ln(2)/a*k

1/2 t1/2={√2*(√2-1)*[A0]1/2}/ a*k

Nota. t1/2: tiempo de vida media; [A0]: concentración inicial o en tiempo cero; a: factor

estequiométrico; k: constante cinética.

Modificado: (Aguilar, 2009)

Fundamento metodológico.

Tratamiento a la muestra.

Selección de la materia prima.

El procedimiento de separar de forma manual las partes deterioradas, manchadas

y con ataques de insectos u hongos en hojas, flores, frutos y raíces que puedan generar

alteración en los análisis se conoce como selección de materia prima (Sharapin, 2000).

Secado.

Es una operación que consiste en retirar agua u otro solvente de un material

vegetal o extracto. Al realizar el secado se impide procesos de degradación enzimática

otorgando estabilidad química, mayor facilidad de almacenamiento y transporte.

En material vegetal el secado se puede hacer a temperatura ambiente o en estufas

19

con aire circulante en un rango de 30°C-40°C hasta llegar a un porcentaje de humedad

relativa del 11% (Sharapin, 2000).

Molienda.

El objetivo es la disminución de tamaño del material vegetal para adecuarlo a un

proceso de extracción, debido a que si se encuentra en fragmentos gruesos el proceso de

extracción sería incompleto, por la pobre penetración del solvente en el tejido vegetal.

Con la reducción de tamaño se destruye parcialmente las membranas celulares lo que

facilita la disolución de los constituyentes celulares en el líquido externo llamado

solvente (Sharapin, 2000).

El resultado de la molienda genera varios tamaños de partícula del material

vegetal que deber ser separado a través de un juego de tamices; mediante fuerzas

giratorias o vibratorias. Las partículas que excedan el tamaño deseado retornan al proceso

de molienda hasta alcanzar el tamaño óptimo para ser almacenado (Morillo & Suárez,

2017).

Extracción Söxhlet.

Se realiza en un equipo llamado Söxhlet, donde el proceso inicia con una muestra

seca dentro de un cartucho de celulosa en forma de dedal, ubicado en la cámara de

sifonamiento como se ilustra en la figura 8. El principio de extracción se basa en que el

disolvente líquido adecuado alcance su punto de ebullición y se vaporiza por un tubo

lateral hasta el refrigerante donde es condesado y cae sobre el cartucho de celulosa. El

disolvente se recircula por el equipo repetidamente, extrayendo en cada recorrido una

fracción de compuestos de interés (Campos, 2017).

Figura 8 Equipo Söxhlet

Fuente: (Nuñez, 2008)

20

Espectrofotometría Ultravioleta-visible.

Detecta las transiciones electrónicas de los enlaces conjugados y ofrece

información de la longitud y estructura de la parte conjugada de una molécula. Para medir

el espectro ultravioleta-visible se disuelve la muestra en un disolvente que no absorba

sobre los 200nm y se coloca en una celda de cuarzo (Wade, 2011).

El espectrofotómetro tiene una fuente que emite todas las frecuencias de la luz

ultravioleta-visible, la misma que pasa por un monocromador donde selecciona la

longitud de onda adecuada. Esta luz de una sola longitud de onda pasa a través de la celda

cuarzo y llega al detector donde se mide la intensidad de la luz (Wade, 2011).

Solubilidad.

Se define como la máxima cantidad de un soluto que se puede disolver en

determinada cantidad de disolvente a una temperatura especifica. El aumento

temperatura en la mayor parte de los casos aumenta la solubilidad de la mayoría de

sustancias sólidas, la misma que puede ser expresada en gramos por litro, miligramos por

litro, porcentaje de soluto, entre otras (Chang, 2011).

Este aumento de solubilidad por el cambio de temperatura puede explicarse con

dos hechos: primero el calor suministrado al sistema aumenta la velocidad de difusión de

las partículas del soluto en el seno del disolvente y segundo el calor suministrado es

absorbido por las moléculas del soluto, debilitando las fuerzas intermoleculares y

facilitando el proceso de solvatación (Guillen, 2017).

Calorimetría de barrido diferencial (DSC).

Registra el flujo de calor diferencial requerido para mantener a la misma

temperatura una muestra del material y una referencia inerte. Este análisis se realiza en

un intervalo de temperatura a una velocidad determinada de calentamiento lo que origina

cambios en el material de referencia debido a transiciones térmicas que se producen por

transformaciones de fases, conversiones estructurales, reacciones de descomposición y

deshidratación (Zambrano, 2015).

Este tipo de análisis es utilizado para determinar compatibilidad de principio

activo-excipientes, estudio de formación de complejos, polimorfos, determinación del

punto de fusión, entre otras (Zambrano, 2015).

Espectroscopia infrarroja con transformadas de Fourier.

Se debe a las vibraciones de los enlaces y proporciona evidencia de los grupos

funcionales presentes, lo que origina un espectro de infrarrojo que es una gráfica de la

energía absorbida por una molécula como una función de la frecuencia o longitud de

onda del haz de luz. Estos espectros pueden medirse usando muestras sólidas, liquidas o

gaseosas que se colocan en el haz de luz infrarrojo (Wade, 2011).

El espectrofotómetro infrarrojo con transformadas de Fourier se caracteriza por

usar un interferómetro y por tanto presenta varias ventajas: la sensibilidad es mejor

21

debido a que mide todas las frecuencias de manera simultánea, utiliza menos energía de

la fuente, requiere menos tiempo para el escaneo, mejor resolución y exactitud (Wade,

2011) .

Dispersión dinámica de la luz (DLS).

Esta técnica también es conocida como espectroscopía de correlación fotónica o

dispersión cuasi-elástica de la luz que sirve para medir el tamaño de partícula en el rango

submicrónico. Se caracteriza por medir la velocidad del movimiento browniano y lo

relaciona con el tamaño de partícula debido a que partículas grandes movimientos lentos

y partículas pequeñas movimientos rápidos. Esta velocidad se define por una propiedad

conocida como coeficiente de difusión traslacional que está relacionado con la ecuación

de Stokes-Einstein (ecuación 1) (Morilla, 2018):

𝐷 =𝑘𝑇

3 𝜋 𝜂 𝑑(ℎ)

Ecuación 1 Stokes-Einstein

Donde:

d(h): diámetro hidrodinámico

k: constante de Boltzman

T: temperatura absoluta

𝜂: viscosidad del medio dispersante

𝐷: coeficiente de difusión traslacional

Índice de polidispersión.

La medida de la distribución de los tamaños de las partículas presentes en una

suspensión se conoce como índice de polidispersión. Las partículas presentan un tamaño

homogéneo cuando la suspensión presenta una polidispersión menor o igual a 0.5

(Bosquéz, Guerrero, & Vernon, 2003).

Potencial Z.

Es la forma abreviaba de denominar al potencial electrocinético de los sistemas

coloidales. En otras palabras se conoce como la diferencia de potencial entre el medio de

dispersión y la capa estacionaria de fluido anexa a la partícula dispersada.

Estas partículas dispersadas en un medio acuoso en la mayoría de los casos

adquieren una carga de superficie por dos motivos: ionización de los grupos de superficie

o por adsorción de especies cargadas (Moulden, 2018).

La medida de potencial Z otorga información de estabilidad frente a

aglomeraciones de las partículas debido a que cuando el potencial Z tiende a cero, las

partículas carecen de cargas y se agrupan, logrando que la suspensión se desestabilice

(Yoval, Montellano, Soberanis, & Guzmán, 2013).

22

Marco legal.

Al ser una investigación que implica la especie Capsicum annuum; el Laboratorio

de Investigación de Productos Naturales cuenta con el Contrato Marco de Acceso a

Recursos Genéticos: MAE-DNB-CM-2017-0078 que permite:

“La recolección de especímenes de especies y la utilización del recurso

genético y/o sus productos derivados para fines exclusivamente de

investigación científica con el fin de promover, proteger y garantizar la

conservación de la biodiversidad, a través de la utilización sostenible de los

recursos biológicos y genéticos” (MAE, 2018, http://www.ambiente.gob.ec).

Hipótesis.

Hipótesis alternativa (Hi).

Es posible encapsular oleorresina de pimiento (Capsicum annuum) en β-

ciclodextrina, para obtener un colorante soluble en agua.

Hipótesis Nula (Ho).

No es posible encapsular oleorresina de pimiento (Capsicum annuum) en β-

ciclodextrina, para obtener un colorante soluble en agua.

Sistema de variables.

Variable dependiente o respuesta.

La eficiencia de encapsulación expresada en porcentaje, se define como la

fracción de ingrediente activo encapsulado respecto al ingrediente activo total (Battista,

Trapé, Constenla, Ramírez, & Piña, 2013), por lo tanto se estableció como la cantidad de

oleorresina encapsulada expresada como β-caroteno con respecto a la cantidad total de

oleorresina expresada como β-caroteno antes de encapsular.

Variables independientes.

En la investigación se manipuló los siguientes factores en el proceso de

encapsulación:

Velocidad de agitación (rpm) se aplicó para dispersar las gotas de la

solución de oleorresina 0,5% en la solución del 5% de β-ciclodextrina.

Tiempo de agitación (minutos) es el tiempo necesario que se aplicó para

el proceso de encapsulación.

Volumen de la oleorresina (mL) se aplicará a una concentración del 0,5%

en la que se varió la cantidad de oleorresina encapsulada expresada como

β-caroteno.

23

Capítulo III

Marco metodológico

Diseño de la investigación.

En la investigación se utilizaron métodos experimentales que aplicaron técnicas

previamente desarrolladas y probadas, las mismas que usaron equipos e instrumentos que

emitieron resultados numéricos que fueron analizados, debido a esto el paradigma fue

cuantitativo porque “adopta el modelo hipotético deductivo, utiliza métodos cuantitativos

y estadísticos, se basa en fenómenos observables susceptibles de medición, análisis

matemáticos y control experimental” (Perez, Ruiz, & Hernández, 1999, p14).

El nivel de investigación fue explicativo ya que “se encarga de buscar el porqué

de los hechos mediante el establecimiento de relaciones causa-efecto” (Morales,

2012). Por lo tanto se determinó como afectan las variables independientes: velocidad de

agitación, tiempo de agitación y volumen de oleorresina, sobre la dependiente: eficiencia

de encapsulación además los datos que se obtuvieron fueron analizados mediante

estadística inferencial y descriptiva.

El enfoque siguió una línea de investigación en el área de productos naturales que

corresponde a los colorantes naturales, para su compresión se empleó la investigación

experimental y documental. Fue experimental debido a que “el investigador decide los

niveles que corresponderán a cada grupo de sujetos; la variable se manipula con

diferentes niveles que asigna el investigador y además existe la medición de la variable

dependiente” (Jimenez & Arraya, 2009). Fue del tipo documental ya que se empleó la

recolección, selección y análisis de información coherente que aportó al desarrollo del

trabajo de investigación (S. Martínez, 2002).

Población y muestra.

Muestra.

La muestra que se estudió corresponde a los frutos de pimiento (Capsicum

annuum), en los mismos se aplicó un tratamiento de maduración, desinfectado,

escaldado, secado y tamizado para su utilización.

Métodos y materiales.

En la tabla 7 y tabla 8 se presentan los materiales-equipos y reactivos

respectivamente, que se utilizó para la ejecución de la parte experimental:

24

Tabla 7. Materiales y equipos

Equipos y materiales Marca Modelo

Equipo

Balanza analítica Denver Instrument PI 214

Balanza microanalítica Meter Toledo GWP®

B451386191

Espectrofotómetro UV-Visible Varian Cary 50

Estufa con convección natural Binder BD240

Rotavapor J.P. Selecta -

Tamizadora vibratoria Gilson SS-15

Centrifuga MRC .

Espectrofotómetro Infrarrojo Jasco FT/IR 4600

Calorímetro diferencial de barrido TA Instruments Q2000-1705

Dispersión dinámica de luz Horiba Scientific SZ-100

Material

Equipo Söxhlet - -

Embudo de decantación - -

Plancha de agitación THERMO SCIENTIFIC

Molino Victoria -

Agitador magnético Talboys PC-420 D

Cajas Petri - -

Papel filtro - -

Vasos de precipitación - -

Bureta - -

Elaborado por: Chamba Adriana

Tabla 8. Reactivos

Reactivos Marca Grado

Cloroformo Fisher Scientific Analítico

Hexano Merck Analítico CAS 110-54-3

Estándar de β-caroteno Sigma-Aldrich Estándar secundario CAS 7235-40-7

β-ciclodextrina Sigma-Aldrich CAS 7585-39-9

Sulfato de sodio anhidro - -

Elaborado por: Chamba Adriana

Método.

Tratamiento de la muestra.

Se adquirieron pimientos comerciales (Capsicum annuum) disponibles en un

mercado de la ciudad de Quito. La muestra fresca se almacenó a temperatura ambiente

hasta que alcanzó un color rojo homogéneo en toda la fruta. En la muestra de pimiento

se realizó el tratamiento preliminar detallado en la metodología descrita por Morillo y

Suárez, (2017).

25

Extracción de oleorresina de pimiento (Capsicum annuum).

La oleorresina fue extraída en un equipo Söxhlet, se utilizó cloroformo como

solvente. Se pesaron 2g de muestra seca en balanza analítica Denver Instrument. Se

extrajo a reflujo en una plancha de agitación THERMO SCIENTIFIC, hasta reacción

negativa de Carr-Price.

El extracto total se evaporó a sequedad en un rotavapor J.P. Selecta; se colocó el

extracto concentrado en cajas Petri taradas y se secó a 40°C en la estufa BINDER de

convección forzada. Se registró el peso y el extracto se almacenó protegido de la luz en

una cámara higroscópica.

Encapsulación de la oleorresina.

Se utilizó el método de coprecipitación. Se prepararon dos soluciones, una

solución acuosa al 5% P/V de β-ciclodextrina Sigma-Aldrich, CAS 7585-39-9 (solución

A) y otra de oleorresina al 0,5% en hexano analítico (solución B). Se realizó un goteo de

30 gotas/min de la solución B sobre la solución A, manteniendo el sistema a una

temperatura constante de 45°C. La solución resultante se centrifugó durante 26 min a

7600 rpm en una centrífuga MRC y el sólido obtenido se sometió a un proceso de secado

a 40°C en la estufa BINDER de convección de aire por un día.

Los experimentos utilizaron un diseño experimental 23 al 95% de confianza, con

los factores que se indica en la tabla 9 para definir el método de trabajo.

Tabla 9 Factores experimentales del proceso de encapsulación.

Factores Niveles

Agitación

Tiempo 40 min. 60min.

Velocidad 800rpm 1200rpm

Oleorresina Volumen 3mL 6mL

Elaborado por: Chamba Adriana

Eficiencia de encapsulación.

Curva de calibración.

Se prepararon disoluciones patrón en un rango de concentraciones de 0,2 mg/L

hasta 1 mg/L, se utilizó un estándar secundario de β-caroteno Sigma-Aldrich, CAS 7235-

40-7 en hexano grado analítico. Se midieron las absorbancias de cada solución patrón

enun espectrofotómetro ultravioleta visible VARIAN BioCary50 a una longitud de onda

de 450nm.

26

Cuantificación de carotenoides totales expresados como β-caroteno en

mg/L.

Se determinó espectrofotométricamente la cantidad de carotenoides totales en la

oleorresina obtenida, mediante lectura de la absorbancia de la solución a una longitud de

onda de 450nm.

Los carotenoides totales no encapsulados en β-ciclodextrina fueron extraídos con

5mL de hexano grado analítico y 2mL de un solución al 1% de sulfato de sodio anhidro,

se centrifugó por diez minutos a 7600 rpm y se realizó un proceso de separación de fases

con un embudo de decantación. La fase apolar se llevó a un volumen de aforo de 10mL

con hexano grado analítico. Se medió la absorbancia en un espectrofotómetro UV- VIS

a longitud de onda de 450nm.

Se evaluó la eficiencia de encapsulación mediante la ecuación 2:

%𝐸𝐹 = 𝐶. 𝑇. 𝐴 − 𝐶. 𝑇. 𝑁𝐸

𝐶. 𝑇. 𝐴 × 100

Ecuación 2 Eficiencia de encapsulación expresada en porcentaje

Donde:

C.T.NE: Cantidad de carotenoides totales no encapsulados.

C.T.A: Cantidad de carotenoides totales antes de encapsular.

Solubilidad del complejo oleorresina-β-ciclodextrina.

La solubilidad fue evaluada en cuatro temperaturas 20, 25, 40 y 70 ºC. Se pesó

en cinco frascos tarados las cantidades de 10, 20, 30, 40 y 50 mg en balanza analítica

Denver Instrument. Se añadió 10mL de agua destilada en cada frasco, se agitó por tres

horas en una plancha THERMO SCIENTIFIC y se colocó en un baño térmico durante

siete días. Se evaporó hasta sequedad y se pesaron los frascos en balanza analítica Denver

Instrument y se determinó se determinó la solubilidad mediante la ecuación 3 (Peña,

2007).

𝑆(𝑔/𝐿) =𝑊1 − (𝑊2 − 𝑊3)

𝑉

Ecuación 3 Solubilidad (g/L)

Donde:

W1: Peso inicial del complejo oleorresina-β-ciclodextrina en gramos

W2: Peso del complejo oleorresina-β-ciclodextrina mas el frasco en gramos

(7días).

W3: Peso del frasco vacío en gramos.

V: Volumen en litros

27

Análisis térmico.

Se utilizó el calorímetro diferencial de barrido TA Instruments y se corrieron

termogramas de: β-ciclodextrina, oleorresina y complejo de oleorresina-β-ciclodextrina.

Se utilizaron cápsulas de aluminio Standar Pan T1G1122. Se pesó en balanza

microanalítica Meter Toledo la cápsula vacía y aproximadamente 0.8mg de la muestra

analizar. El intervalo de temperatura fue de 0-400°C a una velocidad de calentamiento

de 10°C/min.

Análisis por espectroscopia infrarroja con transformadas de Fourier.

Se realizaron dos espectros IR en un espectrofotómetro Jasco, el de β-

ciclodextrina y del complejo de oleorresina-β-ciclodextrina. Se colocó la muestra en el

cristal de seleniuro de zinc. Se ingresó al software Spectra Manager y se realizó el

espectro FT-IR.

Tamaño de partícula, polidispersión.

Se prepararon dos soluciones al 0,1% de β-ciclodextrina y del complejo de

oleorresina-β-ciclodextrina; se determinó el índice de refracción de las soluciones y se

procedió a hacer las lecturas de tamaño de partícula y polidispersión en el equipo de

Dispersión Dinámica de Luz (DLS) Horiba Scientific a un ángulo de medición de 173°.

Potencial Z.

Se preparó una solución del complejo de oleorresina-β-ciclodextrina al 0,1%; se

tomó 5mL de la solución y se colocó en una celda de electroforesis. Se determinó el

potencial Z en el equipo de Dispersión Dinámica de Luz (DLS) Horiba Scientific.

Estabilidad de almacenamiento.

Se evaluó la estabilidad del extracto de oleorresina y del complejo formado

oleorresina-β-ciclodextrina. Se pesaron 0,5g en la balanza analítica Denver Instrument,

del complejo y del extracto, y se almacenaron con las condiciones de la tabla 10.

Tabla 10 Condiciones de almacenamiento

Parámetros Condiciones de desarrollo

Envase

Caja Petri (protegida de la luz)

Caja Petri

Temperatura

Ambiente

40°C

Elaborado por: Chamba Adriana

28

Para el análisis de la oleorresina se preparó una solución al 0,005%, se utilizó

como solvente hexano analítico MERCK, se midió la absorbancia en un

espectrofotómetro UV- VIS a longitud de onda de 450nm cada cuatro días en un período

de 40 días.

En el análisis del complejo oleorresina-β-ciclodextrina, se pesó 20mg del

complejo en la balanza analítica Denver Instrument. Se armó un sistema de reflujo, en el

balón se colocó el complejo con 10mL de agua destilada y 5mL de hexano. Se realizó

una agitación por dos minutos a 1000rpm en una plancha de agitación THERMO

SCIENTIFIC. Se calentó el sistema a 55°C y se mantuvo la agitación por una hora. Se

enfrió el sistema, el líquido se centrifugó durante diez minutos a 3500 rpm en una

centrífuga MRC y se realizó el proceso de separación de fases en un embudo de

decantación (Eguinoa, 2014). La fase apolar se secó con sulfato de sodio anhidro y se

llevó a un volumen de aforo de 5mL con hexano. Se midió la absorbancia en el

ultravioleta visible VARIAN a 450nm cada cuatro días en un período de 40 días.

Diseño experimental.

Se realizó un diseño factorial 23 con un intervalo de confianza del 95%, para

definir el método de trabajo que maximice la eficiencia de encapsulación. Los siguientes

factores son los que influyen a la variable respuesta eficiencia de encapsulación:

% Eficiencia de encapsulación = f (tag, Tsolv.c, Vag, Co, T°, TCDs, CCD, Vsolu.o)

Donde:

tag: tiempo de agitación T°: temperatura

Tsolv.o: tipo de solvente para la oleorresina TCDs: tipo de ciclodextrina

Vag: velocidad de agitación CCD concentración de ciclodextrina

Cc: concentración de la oleorresina Vsolu.c: volumen de oleorresina

Se mantuvieron constantes los siguientes factores: tipo de solvente y

concentración de oleorresina, temperatura, tipo y concentración de ciclodextrina. Se

estableció que los factores de estudio sean: tiempo de agitación, velocidad de agitación

y volumen de oleorresina, cada uno con dos niveles. En la tabla 11 se representan los

niveles seleccionados para cada factor de acuerdo a ensayos preliminares con su

respectiva codificación:

Tabla 11 Codificación de niveles por factor

Factor Codificación

- +

Velocidad de agitación (rpm) 800 1200

Tiempo de agitación (min) 40 60

Volumen de oleorresina (mL) 3 6

Elaborado por: Chamba Adriana

29

Conforme al diseño planteado se realizaron ocho ensayos de acuerdo a la matriz

de experimentos aleatorizada presentada en la tabla 12, los mismos que generaron 7

efectos posibles sobre la variable respuesta que se dividen en primarios, secundarios y

terciarios.

Tabla 12 Matriz de experimentos aleatorizada

N° de

experimento

Velocidad de

agitación

Tiempo de

agitación

Volumen de solución de

oleorresina

1 - - -

2 + - -

3 - + -

4 + + -

5 - - +

6 + - +

7 - + +

8 + + +

Elaborado por: Chamba Adriana

Operacionalización de las variables.

Tabla 13 Matriz Operacionalización de variables

Factor Nivel Respuesta

Velocidad de agitación 800 rpm

1200rpm Eficiencia de encapsulación (%)

Tiempo de agitación 40 min.

60 min. Eficiencia de encapsulación (%)

Volumen de oleorresina 3mL

6mL Eficiencia de encapsulación (%)

Elaborado por: Chamba Adriana

Técnicas e instrumentos de recolección de datos.

En la recolección de datos se utilizó la técnica de observación, el instrumento de

recolección de datos se refleja en el Anexo C; en el cual se registraron los pesos de las

muestras y las lecturas de las absorbancias antes y después de encapsular, necesarios para

análisis.

Técnicas de procesamiento y análisis de datos.

La matriz fue aleatorizada en el programa estadístico JMP©, para el desarrollo de

30

la parte experimental. Los datos experimentales que se obtuvieron en el diseño factorial

23 se analizaron mediante los efectos por Algoritmo de Yates como se indica en la tabla

14 a un nivel de confianza del 95% y el software que se aplicó para las gráficas de los

efectos fue Statgraphics.

Tabla 14 Algoritmo de Yates

Número de

corridas

Matriz de

diseño Algoritmo Identificación

A t V Respuesta 1 2 3 D Efectos

1 - - - R1 X1 Y1 Z1 8 Promedio Promedio

2 + - - R2 X2 Y2 Z2 4 Efecto 1 A

3 - + - R3 X3 Y3 Z3 4 Efecto 2 T

4 + + - R4 X4 Y4 Z4 4 Efecto 3 A, t

5 - - + R5 X5 Y5 Z5 4 Efecto 4 V

6 + - + R6 X6 Y6 Z6 4 Efecto 5 A, V

7 - + + R7 X7 Y7 Z7 4 Efecto 6 t, V

8 + + + R8 X8 Y8 Z8 4 Efecto 7 A, t, V

Nota. A: velocidad de agitación; t: tiempo de agitación; V: volumen de oleorresina; D: divisor.

Modificado: (Pagura, Hernández, & Dianda, 2015)

Se determinó la significancia de los efectos mediante la ecuación 4 donde se

estableció que el efecto es significativo cuando el valor absoluto del efecto es mayor al

producto entre el estadístico t de student al 95% de confianza (k) y el error estándar del

efecto (SE) (Montgomery, 2013).

|𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜| > 𝑘 𝑆𝐸

Ecuación 4 Significancia estadística

El error estándar del efecto se calculó mediante la ecuación 5, donde SA

corresponde a la desviación estándar de la respuesta (Montgomery, 2013).

𝑆𝐸 =2 𝑆𝐴

√𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎𝑠

Ecuación 5 Error estándar del efecto

31

Capítulo IV

Análisis y discusión de resultados

Resultados.

Muestra.

La muestra de pimiento (Capsicum annuum) fue almacenada por diez días hasta

que alcanzó un color rojo homogéneo en toda la fruta como lo indica la Figura 9.

Figura 9 Pimiento (Capsicum annuum) en estado de madurez.

Se realizó el proceso de extracción de la oleorresina con cloroformo y se obtuvo

un rendimiento de extracción del 8,09% ± 0,68% valor que es comparable con el estudio

realizado por Cardona & otros, (2006) en el cual se realizó la extracción de la oleorresina

de pimiento (Capsicum annuum) con tres solventes: acetona, acetato de etilo y hexano,

con rendimientos de extracción del 6,1%; 4,2% y 2,9% respectivamente. (Cardona et al.,

2006)

Encapsulación de la oleorresina.

Se realizó un diseño experimental 23 donde la variable respuesta fue la eficiencia

de encapsulación y para su cuantificación se utilizó la curva calibración con un

coeficiente correlación del 0,9998 como muestra la gráfica 1.

Gráfica 1 Curva de calibración con estándar secundario de β-caroteno Sigma-Aldrich, CAS

7235-40-7 en hexano grado analítico.

y = 0,2022x - 0,0043

R² = 0,9998

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

Ab

sorb

anci

a

Concentración (mg/L)

32

Los factores que se estudiaron fueron: el tiempo de agitación, velocidad de

agitación y volumen de oleorresina y en la tabla 15 se visualiza los resultados de la media

y desviación estándar de la eficiencia de encapsulación.

Tabla 15 Resultados de la eficiencia de encapsulación del diseño factorial 23

N° de corridas A t V R1 (%) R2 (%) 𝐄𝐅̅̅̅̅ SA

1 - - - 99,07 99,48 99,28 0,29

2 + - - 99,60 99,72 99,66 0,08

3 - + - 95,35 95,60 95,48 0,18

4 + + - 89,36 89,89 89,63 0,37

5 - - + 95,89 95,11 95,50 0,55

6 + - + 93,09 93,07 93,08 0,01

7 - + + 95,14 95,27 95,21 0,09

8 + + + 96,73 96,45 96,59 0,20

Nota. A: velocidad de agitación; t: tiempo de agitación; V: volumen de oleorresina; R: respuesta;

EF̅̅̅̅ : Media de la eficiencia de encapsulación y SA: desviación estándar.

Elaborado por: Chamba Adriana.

Se evaluó como afecta el tiempo de agitación, velocidad de agitación y volumen

de oleorresina, con los datos de la media y desviación estándar de la tabla 15, aplicando

Algoritmo de Yates detallado en la tabla 16.

Tabla 16 Estimación de los efectos por algoritmo de Yates

N° de corridas 𝐄𝐅̅̅̅̅ 1 2 3 Di ME Identificación

1 99,28 198,94 384,04 764,41 8 95,55 Promedio

2 99,66 185,10 380,38 -6,50 4 -1,63 A

3 95,48 188,58 -5,47 -10,62 4 -2,65 t

4 89,63 191,80 -1,04 -2,43 4 -0,61 A, t

5 95,50 0,38 -13,84 -3,66 4 -0,91 V

6 93,08 -5,85 3,22 4,43 4 1,11 A, V

7 95,21 -2,42 -6,23 17,05 4 4,26 t, V

8 96,59 1,39 3,81 10,04 4 2,51 A, t, V

Nota. A: velocidad de agitación; t: tiempo de agitación; V: volumen de oleorresina; EF̅̅̅̅ : Media

de la eficiencia de encapsulación; Di: divisor y ME: magnitud del efecto.

Elaborado por: Chamba Adriana.

Los efectos se agrupan en tres categorías: primarios, secundarios y terciarios

como se muestra en la tabla 17 de acuerdo a los resultados de la magnitud del efecto.

33

Tabla 17 Efectos que se produce en la eficiencia de encapsulación

Tipo de efecto Variables ME

Primarios

A -1,63

t -2,65

V -0,91

Secundarios

A, t -0,61

A, V 1,11

t, V 4,26

Ternario A, t, V 2,51

Nota. A: velocidad de agitación; t: tiempo de agitación; V: volumen de oleorresina y ME:

magnitud del efecto.

Elaborado por: Chamba Adriana.

Los signos en los datos de la magnitud del efecto de la tabla 17 se encuentran

relacionados directamente con la variable repuesta, se observa que los efectos primarios

generan un decremento, en el caso de la velocidad de agitación se produce un decremento

de 1,63 unidades en la eficiencia de encapsulación, cuando se produce el cambio de

800rpm a 1200rpm, lo mismo sucede con el tiempo de agitación que decrece en 2,65

unidades al pasar de 40min a 60 min y el volumen de oleorresina al pasar de 3mL a 6mL

decrece en 0,91 unidades. Los que tienen signo positivo indican un incremento, lo que se

observa en los efectos secundarios y efecto ternario donde la interacción entre la

velocidad de agitación y el volumen de oleorresina incrementa en 1,11 unidades la

eficiencia de encapsulación, en cambio la interacción tiempo de agitación y volumen de

oleorresina incrementan en 4,26 unidades y la interacción entre velocidad de agitación,

tiempo de agitación y volumen de oleorresina incrementan en 2,51 unidades. Por lo tanto

se determinó la significancia estadística de los efectos en la eficiencia de encapsulación

al 95% de confianza como indica la tabla 18, para lo cual se aplicó la ecuación 4 con los

datos de desviación estándar de la tabla 15.

Tabla 18 Significancia estadística de los efectos en la eficiencia encapsulación

N° de corridas ME SE Identificación

1 95,55 0,205 Promedio

2 -1,63 0,06 A

3 -2,65 0,125 t

4 -0,61 0,265 A, t

5 -0,91 0,39 V

6 1,11 0,01 A, V

7 4,26 0,065 t, V

8 2,51 0,14 A, t, V

Nota. A: velocidad de agitación; t: tiempo de agitación; V: volumen de oleorresina y ME:

magnitud del efecto y SE: error estándar del efecto.

Elaborado por: Chamba Adriana.

34

En la significancia de los efectos se estableció que el efecto es estadísticamente

significativo aplicando el criterio de la ecuación 4, cabe mencionar que el efecto terciario

en un diseño factorial 23 se considera como un “efecto ignorable” debido al ruido propio

de la experimentación (Gutiérrez & Salazar, 2008) es decir la interacción entre velocidad

de agitación, tiempo de agitación y volumen de oleorresina es estadísticamente no

significativo. En la tabla 19 se identifica la significancia estadística de cada uno de los

efectos.

Tabla 19 Significancia estadística

Tipo de efecto Variables Significancia estadística

Primarios

A Estadísticamente significativo

t Estadísticamente significativo

V Estadísticamente significativo

Secundarios

A, t Estadísticamente significativo

A, V Estadísticamente significativo

t, V Estadísticamente significativo

Ternarios A, t, V Estadísticamente no significativo

Nota. A: velocidad de agitación; t: tiempo de agitación; V: volumen de oleorresina.

Elaborado por: Chamba Adriana.

En la tabla 19 se observa que los efectos primarios y secundarios son

estadísticamente significativos sin embargo estos efectos se graficaron en un diagrama

de Pareto ilustrado en la figura 10, con el cual se pudo visualizar cuáles tienen un mayor

impacto sobre la eficiencia de encapsulación.

Figura 10 Diagrama de Pareto de efectos estimados para la eficiencia de encapsulación.

En la figura 10 se observa una línea de color azul que corresponde al valor crítico

de 2,306 de acuerdo a la tabla de t de student (α/2) al 95% y con 8 grados de libertad que

35

establece que todo efecto que supere la línea son de importancia significativa (Gutiérrez

& Salazar, 2008) en tal caso los efectos de interés son el tiempo de agitación y la

interacción tiempo de agitación y volumen de oleorresina.

En el caso del tiempo de agitación se observa de acuerdo a la tabla 17 que origina

un decremento de 2,65 unidades en la eficiencia de encapsulación es decir que al utilizar

un tiempo de 40 minutos y al incrementarlo a 60 minutos disminuye notablemente la

eficiencia de encapsulación como se indica en la figura 11.

Figura 11 Diagrama del efecto de tiempo de agitación en la eficiencia de encapsulación.

Este decremento de la eficiencia de encapsulación al utilizar un tiempo de 60

minutos se debe posiblemente a que se superó el tiempo de agitación óptimo, por lo tanto

se rompe el equilibrio entre las fuerzas segregativas y las de mezclado originando un

proceso de segregación del encapsulado de la oleorresina de pimiento (Capsicum

annuum) en β-ciclodextrina como se representa en la figura 12 (McCabe, Smith, &

Harriott, 1998).

Figura 12 Ruptura del equilibrio al superar el tiempo de agitación.

36

El otro efecto de interés es la interacción entre el tiempo de agitación y el volumen

de oleorresina que de acuerdo a la tabla 17 aumenta en 4,26 unidades la eficiencia de

encapsulación. Sin embargo no se conoce que combinación de niveles de los dos factores

origina el aumento por lo tanto se realizó una gráfica de efecto de interacción entre estos

factores ilustrada en la figura 13.

Figura 13 Diagrama del efecto de interacción entre el tiempo de agitación y volumen de

oleorresina.

Con respecto a la figura 13, se aprecia una interacción significativa entre el tiempo

de agitación y volumen de oleorresina, en particular se observa que si se trabaja con

tiempo de agitación bajo (40min.) y un volumen de oleorresina bajo (3mL) se obtiene el

valor más alto en la eficiencia de encapsulación del 99,07% en comparación con las otras

combinaciones. Además, en la tabla 17 se muestra el efecto primario de la velocidad de

agitación que decrece en 1,63 unidades la eficiencia de encapsulación debido al cambio

de nivel de 800rpm a 1200rpm. Este decremento en la variable respuesta se debe

posiblemente al flujo inestable que se produce al aplicar una agitación a 1200rpm debido

a que no existe un mezclado homogéneo con un flujo ondulante como ocurre a 800rpm

como se muestra en la figura 14 (García, 2019) .

Figura 14 Influencia de la velocidad de agitación en el flujo

37

De acuerdo al análisis estadístico realizado se determinó que las condiciones

óptimas para maximizar la eficiencia de encapsulación son: 800rmp, 40 minutos de

agitación y 3mL de oleorresina, con lo que se obtiene una eficiencia de encapsulación

del 99,07%. Para la predicción en cada punto del diseño se obtuvo un modelo matemático

como indica la ecuación 6.

%𝐸𝐹 = 95,55 −1,63

2𝐴 −

2,65

2𝑡 −

0,61

2𝐴𝑡 −

0,91

2𝑉 +

1,11

2𝐴𝑉 +

4,26

2𝑡𝑉

Ecuación 6 Modelo matemático para determinar la eficiencia de encapsulación.

Donde:

EF: eficiencia de encapsulación

A: velocidad de agitación

t: tiempo de agitación

V: volumen de oleorresina

Solubilidad del complejo oleorresina-β-ciclodextrina.

En la tabla 20 se detalla el resultado de solubilidad para cada temperatura de

análisis.

Tabla 20 Solubilidad del complejo oleorresina-β-ciclodextrina

Temperatura (°C) Solubilidad (g/L)

20 0,696 ± 0,334

25 0,774 ± 0,357

40 0,788 ± 0,313

70 1,016 ± 0,463

Elaborado por: Chamba Adriana.

De acuerdo a la tabla 20 y el gráfico 2 se observa como la solubilidad aumenta

conforme la temperatura asciende.

Gráfica 2 Curva de solubilidad del complejo oleorresina-β-ciclodextrina

0,600

0,700

0,800

0,900

1,000

1,100

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

SOLU

BIL

IDA

D (

g/L)

TEMPERATURA (°C)

38

La oleorresina de pimiento (Capsicum annuum) al ser de carácter apolar dificulta

la solubilidad en agua pero al acomplejarse con β-ciclodextrina esto cambia,

posiblemente debido a que los grupos hidrofóbicos de todos los compuesto presentes en

la oleorresina como el β-caroteno, ya no se encuentran en contacto con el solvente sino

con los átomos de la cavidad interna de la β-ciclodextrina y la parte externa de la misma

es la que interactúa con el solvente formando puentes de hidrógeno, por lo tanto se reduce

la tensión interfacial entre la oleorresina con baja solubilidad y la propia disolución

originando así una dispersión del color como se ilustra en la figura 15 (Jullian, 2007).

Figura 15 Solubilidad a 40°C.

Análisis térmico.

La figura 16 corresponde al termograma del extracto de oleorresina de pimiento

(Capsicum annuum) donde se observa que la temperatura inicial de degradación es de

134,49°C.

Figura 16 Termograma de oleorresina de pimiento (Capsicum annuum)

En el termograma de la figura 17 corresponde a la β-ciclodextrina se observa una

temperatura de degradación de 307,93°C. Si bien en el rango de 0-100°C se observa la

39

presencia de picos, estos se deben posiblemente a la pérdida de agua que contiene la β-

ciclodextrina utilizada con un 15% de humedad.

Figura 17 Termograma de β-ciclodextrina Sigma-Aldrich, CAS 7585-39-9

En la figura 18 se muestra el termograma del complejo de oleorresina-β-

ciclodextrina en donde no se observa picos en el rango de 130-170°C. Estos datos indican

que indica la formación del complejo de inclusión, le otorga estabilidad térmica a la

oleorresina de pimiento (Capsicum annuum). La temperatura de degradación en

289,02°C se debe posiblemente a la β-ciclodextrina con un desplazamiento del pico de

307,93 debido a la interacción entre la oleorresina y β-ciclodextrina.

Figura 18 Termograma del complejo oleorresina-β-ciclodextrina

40

Análisis por espectroscopia infrarroja con transformadas de Fourier.

Los espectros IR de las figuras 19 y 20 corresponden a la β-ciclodextrina Sigma-

Aldrich, CAS 7585-39-9 y al complejo de oleorresina- β-ciclodextrina respectivamente.

Figura 19 Espectro IR de β-ciclodextrina Sigma-Aldrich, CAS 7585-39-9

Figura 20 Espectro IR del complejo oleorresina- β-ciclodextrina

La variación de los picos en la forma, el cambio de intensidad pueden dar

información respecto de la formación de un complejo de inclusión; en la figura 19 se

muestran bandas características de absorción de la β-ciclodextrina: 3306,36cm-1 que

corresponde al estiramiento del grupo OH, en 2913,91 cm-1 estiramiento C-H, la

vibración de estiramiento H-O-H en 1642,09cm-1 y en 1020,16cm-1 el estiramiento C-O-

C.

41

De acuerdo a la figura 20 se observa un espectro similar a la β-ciclodextrina sin

embargo se evidencian cambios en la intensidad de los picos y existen desplazamientos

de la banda de estiramiento del grupo OH de 3306,36cm-1 a 3286,11cm-1 y de

2913,91cm-1 a 2900,41cm-1 del estiramiento C-H. Además el pico observado en

1642,09cm-1 en la figura 19 cambia de intensidad en la figura 20 lo que indica de acuerdo

a Meñaca, Restrepo y Colmenares (2018) la formación del complejo de oleorresina-β-

ciclodextrina debido a la interacción de los grupos OH dentro de la cavidad de la β-

ciclodextrina con la oleorresina de pimiento (Capsicum annuum) encapsulada. (Meñaca,

Restrepo, & Colmenares, 2018)

Tamaño de partícula, polidispersión.

Se determinó el tamaño de partícula y el índice de polidispersión de la β-

ciclodextrina y del complejo de oleorresina-β-ciclodextrina y se obtuvieron los siguientes

resultados detallados en la tabla 21.

Tabla 21 Tamaño de partícula e índice de polidispersión

Muestra Tamaño (nm) Tamaño (µm) Índice de

polidispersión

β-ciclodextrina 10772,0 10,8 42,148

Oleorresina-β-

ciclodextrina 10648,2 10,6 4,884

Elaborado por: Chamba Adriana

De acuerdo a la tabla 19 el tamaño de partícula del complejo oleorresina-β-

ciclodextrina es menor en 1,2% con respecto a la β-ciclodextrina, esto se debe

posiblemente a la encapsulación por el método de coprecipitación que según Guevara y

Jiménez (2008) permite que se obtenga un tamaño de partícula en un rango de 5-50µm.

Si se compara el tamaño de partícula de la β-ciclodextrina y el complejo oleorresina-β-

ciclodextrina, no se observa una variación considerable; sin embargo, en el índice de

polidispersión se ve una diferencia de 37,26 unidades, lo que indica que el complejo

oleorresina-β-ciclodextrina presenta mejor uniformidad en el tamaño de partícula en

suspensión.

Potencial Z.

El valor del potencial Z que se obtuvo de la solución acuosa al 0,1% de complejo

oleorresina-β-ciclodextrina es de -36,4±1,4 mV que según Díaz, Jiménez y Lugo (2016)

los valores de potencial zeta mayores que 30 mV y menores que -30 mV promueven una

alta estabilidad y evitan que las partículas lleguen al fenómeno de agregación. (Díaz,

Jiménez, & Lugo, 2016) y de acuerdo a esto la solución acuosa del complejo oleorresina-

β-ciclodextrina presenta una alta estabilidad electrostática.

42

Estabilidad de almacenamiento.

Se realizó un estudio de la estabilidad tanto del extracto de oleorresina y del

complejo formado oleorresina-β-ciclodextrina, en condiciones de control (temperatura

ambiente) y estrés (40°C); además se varió el envase utilizando cajas Petri protegidas de

la luz y otras sin protección.

Se cuantificaron los carotenoides totales en función de β-caroteno durante 40 días.

En la tabla 22 se presenta la concentración de β-caroteno de las muestras de oleorresina

y complejo oleorresina-β-ciclodextrina a 39,66°C; 26,18% de humedad y un envase sin

protección de luz.

Tabla 22 Estabilidad a condiciones de estrés y sin protección de la luz.

Oleorresina Complejo oleorresina-β-ciclodextrina

Tiempo

(días) Concentración (mg/L)

Tiempo

(días) Concentración (mg/L)

0 1,6909 0 0,5419

1 1,4794 1 0,3911

4 0,7983 4 0,3733

8 0,9890 8 0,3876

12 0,7943 12 0,3599

14 0,7275 14 0,3114

19 0,7151 16 0,3055

23 0,5547 19 0,3055

27 0,4729 23 0,2971

33 0,4415 27 0,2397

36 0,4165 33 0,2229

40 0,2575 36 0,2140

40 0,2100

Elaborado por: Chamba Adriana

Con los datos de tabla 22 se realizó la gráfica 3 que muestra la concentración de

oleorresina en función del tiempo. En la cual se observa como la concentración de

oleorresina desciende drásticamente conforme el tiempo avanza esto se debe

posiblemente a la degradación química debida a reacciones de hidrolisis, oxidación y

fotolisis (García, 2019). Además se visualiza que la concentración del complejo no

disminuye drásticamente conforme el tiempo avanza.

43

Gráfica 3 Estabilidad a condiciones de estrés y sin protección de la luz.

En la tabla 23 se muestra la estabilidad a temperatura ambiente (21,05°C) con una

humedad del 48% y en envases sin protección de la luz.

Tabla 23 Estabilidad a condiciones ambientales y sin protección de la luz

Oleorresina Complejo oleorresina-β-ciclodextrina

Tiempo

(días) Concentración (mg/L)

Tiempo

(días) Concentración (mg/L)

0 1,8134 0 0,6107

1 1,6783 1 0,5469

4 1,4310 4 0,3940

8 1,0515 8 0,3525

12 0,8858 12 0,3342

14 0,8076 14 0,3342

19 0,7924 16 0,3342

23 0,7674 19 0,3258

27 0,6304 23 0,3045

33 0,6246 27 0,3010

36 0,5785 33 0,2837

40 0,2535 36 0,2728

40 0,2145

Elaborado por: Chamba Adriana

Con los datos de la tabla 23 se realizó la gráfica 4 que se observa como la

oleorresina de pimiento se ve afectada por la luz y humedad del medio, provocando que

su concentración inicial descienda en un 86%. En el caso del complejo oleorresina-β-

0,0000

0,2000

0,4000

0,6000

0,8000

1,0000

1,2000

1,4000

1,6000

1,8000

0 5 10 15 20 25 30 35 40

CO

NC

EN

TR

AC

IÓN

(m

g/L

)

TIEMPO (Días)

OLEORRESINA COMPLEJO

44

ciclodextrina se produce un decremento del 64% en su concentración inicial por lo tanto

la encapsulación le otorga mayor estabilidad frente a la luz y humedad del medio.

Gráfica 4 Estabilidad a condiciones ambientales sin protección de la luz

En el caso de las muestras a 39,66°C; 26,18% de humedad y un envase con

protección de luz, se observó que la oleorresina se degrada bruscamente en el doceavo

día, sin embargo con la protección de la luz permite que en el día cuarenta llegue a una

concentración de 0,2620mg/L en comparación a la realizada en condiciones ambientales

que llego a 0,2575mg/L (tabla 22).

Con respecto al complejo oleorresina-β-ciclodextrina también presenta mayor

concentración en día 40 debido a que llega a 0,2308mg/L en comparación a 0,2100mg/L

en condiciones ambientales (tabla 22). En la tabla 24 se muestra como varía la

concentración en condiciones de estrés con protección de la luz.

Tabla 24 Estabilidad a condiciones de estrés y con protección de la luz

Oleorresina Complejo oleorresina-β-ciclodextrina

Tiempo

(días) Concentración (mg/L)

Tiempo

(días) Concentración (mg/L)

0 1,7475 0 0,5459

1 1,5503 1 0,3535

4 1,1384 4 0,3302

8 1,0135 8 0,3292

12 0,8710 12 0,3183

14 0,7408 14 0,3094

19 0,7235 16 0,3010

23 0,6798 19 0,2971

27 0,6087 23 0,2852

33 0,5597 27 0,2719

36 0,3856 33 0,2575

40 0,2620 36 0,2432

40 0,2308

Elaborado por: Chamba Adriana

0,0000

0,2000

0,4000

0,6000

0,8000

1,0000

1,2000

1,4000

1,6000

1,8000

2,0000

0 5 10 15 20 25 30 35 40

CO

NC

EN

TR

AC

IÓN

(m

g/L

)

TIEMPO (Días)

OLEORRESINA COMPLEJO

45

De acuerdo a la tabla 24 se obtuvo la gráfica 5 en donde se visualiza que la

variación de la concentración se mantiene aproximadamente constante en el complejo

oleorresina-β-ciclodextrina en comparación con la oleorresina que se observa una

inflexión en el doceavo día.

Gráfica 5 Estabilidad en condiciones de estrés y con protección de la luz

Finalmente en condiciones ambientales (21,05°C; 48% humedad) con protección

de la luz, se evidencia que la oleorresina alcanza en el día 40 una concentración de

0,4170mg/L, la misma que es mayor respecto a la obtenida en condiciones ambientales

sin protección de la luz con una concentración de 0,2535mg/L (tabla 23). Estos valores

indican que la luz es un factor que afecta a la estabilidad de la oleorresina.

Con respecto al complejo oleorresina-β-ciclodextrina se observa que al igual que

la oleorresina mantiene la más alta concentración en el día 40 de 0,2738mg/L en

comparación a la de 0,2145mg/L (tabla 23) en condiciones ambientales sin protección de

la luz.

En la tabla 25 se muestra la variación de la concentración durante los 40 días de

estudio a las condiciones antes mencionadas.

0,0000

0,2000

0,4000

0,6000

0,8000

1,0000

1,2000

1,4000

1,6000

1,8000

2,0000

0 5 10 15 20 25 30 35 40

CO

NC

EN

TR

AC

IÓN

(m

g/L

)

TIEMPO (Días)

OLEORRESINA COMPLEJO

46

Tabla 25 Estabilidad a condiciones ambientales y con protección de la luz

Oleorresina Complejo oleorresina-β-ciclodextrina

Tiempo

(días) Concentración (mg/L)

Tiempo

(días) Concentración (mg/L)

0 1,9627 0 0,5464

1 1,8989 1 0,4816

4 1,8415 4 0,4766

8 1,6361 8 0,3965

12 1,5330 12 0,3935

14 0,9937 14 0,3109

19 0,9476 16 0,3005

23 0,9356 19 0,2832

27 0,8867 23 0,2526

33 0,6591 27 0,2263

36 0,5488 33 0,3104

40 0,4178 36 0,3218

40 0,2738

Elaborado por: Chamba Adriana

En la gráfica 6 se evidencia que la oleorresina se degrada drásticamente a partir

de doceavo día por lo que se visualiza un punto de inflexión en la curva, además con

respecto al complejo oleorresina-β-ciclodextrina se mantiene en una degradación

constante conforme el tiempo avanza.

Gráfica 6 Estabilidad a condiciones ambientales con protección de la luz

0,0000

0,2000

0,4000

0,6000

0,8000

1,0000

1,2000

1,4000

1,6000

1,8000

2,0000

2,2000

0 5 10 15 20 25 30 35 40

CO

NC

EN

TR

AC

IÓN

(m

g/L

)

TIEMPO (Días)

OLEORRESINA COMPLEJO

47

Se determinó las constantes cinéticas, el tiempo de vida media con los datos de

las tablas de la 22 a la 25, además se determinó que la estabilidad tanto en condiciones

ambientales como de estrés siguen una cinética de primer orden de acuerdo al método

gráfico que según Fonseca y Berrocal (2004) establece que al graficar el logaritmo

natural de la concentración en función del tiempo se obtiene un coeficiente de correlación

mejor en comparación a los otros ordenes cinéticos. (Fonseca & Berrocal, 2004)

En la tabla 26 se presentan las ecuaciones obtenidas, su coeficiente de correlación

y las constantes cinéticas para cada condición de estudio.

Tabla 26 Cinética de la estabilidad de la oleorresina y del complejo oleorresina-β-ciclodextrina

Muestra Luz T (°C) Ecuación R2 Orden

Cinético

Constante

cinética (días-1)

Oleorresina

Si 39,66 y=-0,0370x+0,2863 0,9055 1 0,0370

21,05 y=-0,0362x+0,4747 0,8705 1 0,0362

No 39,66 y=-0,0377x+0,4002 0,9273 1 0,0377

21,05 y=-0,0366x+0,7204 0,9560 1 0,0366

Complejo

oleorresina-β-

ciclodextrina

Si 39,66 y=-0,0202x-0,8147 0,9124 1 0,0202

21,05 y=-0,0187x-0,7396 0,8035 1 0,0187

No 39,66 y=-0,0139x-0,7086 0,9215 1 0,0139

21,05 y=-0,0158x-0,7272 0,8150 1 0,0158

Nota. y: ln [Concentración]; x: tiempo (días); R2: coeficiente de correlación; T: temperatura

Elaborado por: Chamba Adriana

Con las contantes cinéticas de la tabla 26 se determinó el tiempo de vida media

para la oleorresina y del complejo de oleorresina-β-ciclodextrina a cada una de las

condiciones de estudio de la estabilidad como se visualiza en la tabla 27.

Tabla 27 Tiempo de vida media de la oleorresina y complejo de oleorresina-β-ciclodextrina

Muestra Luz T (°C) Tiempo de vida media

(días)

Oleorresina

Si 39,66 19

21,05 19

No 39,66 18

21,05 19

Complejo oleorresina-β-ciclodextrina

Si 39,66 34

21,05 37

No 39,66 50

21,05 43

Nota. T: temperatura

Elaborado por: Chamba Adriana

48

En la tabla 27 se observa que la oleorresina disminuye en el 50% la concentración

de carotenoides totales expresados como β-caroteno alrededor del día 18 o 19, en cambio

el complejo de oleorresina-β-ciclodextrina aumenta su tiempo de vida media, incluso se

observa que en condiciones de estrés a 39,66°C y con protección a de la luz va alcanzar

un tiempo de vida media de 50 días. Por lo tanto el proceso de encapsulación de la

oleorresina de pimiento (Capsicum annuum) en β-ciclodextrina permite conservar por

más tiempo las propiedades de la oleorresina.

Validez de la hipótesis de trabajo.

Con los resultados analizados, se puede aceptar la hipótesis alternativa: “Es

posible encapsular oleorresina de pimiento (Capsicum annuum) en β-ciclodextrina, para

obtener un colorante soluble en agua y con mayor estabilidad”.

De acuerdo al análisis estadístico se obtuvo que en condiciones de 800rmp, 40

minutos de agitación y 3mL de oleorresina se obtiene una eficiencia de encapsulación

del 99,07%.

Los resultados de los análisis permitieron verificar la solubilidad en agua del

complejo formado y la estabilidad incrementada del mismo respecto de la oleorresina

utilizada.

49

Capítulo V

Conclusiones y recomendaciones

Conclusiones.

Se realizó la extracción de la oleorresina de pimiento (Capsicum annuum) con

cloroformo como solvente en un equipo Söxhlet y se obtuvo un rendimiento de

extracción del 8,09% ± 0,68%.

Se desarrolló un proceso de encapsulación de la oleorresina de (Capsicum

annuum) en β-ciclodextrina y se determinó el método de trabajo que maximice la variable

respuesta eficiencia de encapsulación, mediante un diseño factorial 23. Se obtuvo una

eficiencia de encapsulación del 99,07% al trabajar con: 800rmp, 40 minutos de agitación

y 3mL de oleorresina.

Se determinó la solubilidad a cuatro temperaturas (20, 25, 40 y 70°C) por el

método gravimétrico, la solubilidad a 70°C es de 1,016g/L±0.463g/. Sin embargo a esta

temperatura se evidenció la perdida de color por tanto la solubilidad del complejo de

oleorresina-β-ciclodextrina es adecuada a 40°C y se obtuvo 0,788g/L±0.313g/L, sin

pérdida de color.

Se corrieron termogramas de: β-ciclodextrina, oleorresina y complejo de

oleorresina-β-ciclodextrina, donde se observó que la temperatura inicial de degradación

de la oleorresina es de 134,49°C, en la β-ciclodextrina fue de 307,93°C y en el complejo

de oleorresina-β-ciclodextrina en 289,02°C. Por lo tanto el proceso de encapsulación de

la oleorresina en β-ciclodextrina otorgó estabilidad térmica a la oleorresina al no

presentar picos alrededor de 134,49°C.

Se analizó la formación del complejo oleorresina-β-ciclodextrina mediante

espectroscopía infrarroja, se realizaron los espectros IR de β-ciclodextrina y del complejo

de oleorresina- β-ciclodextrina donde se observaron desplazamientos en el espectro del

complejo de oleorresina-β-ciclodextrina en la banda de estiramiento del grupo OH de

3306,36cm-1 a 3286,11cm-1 y de 2913,91cm-1 a 2900,41cm-1 del estiramiento C-H con

respecto al espectro de β-ciclodextrina por lo tanto indica la formación del complejo de

oleorresina-β-ciclodextrina debido a la interacción de los grupos OH dentro de la cavidad

de la β-ciclodextrina con la oleorresina de pimiento (Capsicum annuum) encapsulada.

Se obtuvo un tamaño de partícula de 10,8µm para la β-ciclodextrina y 10,6µm

para el complejo de oleorresina-β-ciclodextrina con una variación entre ambas del 1,2%,

además el índice de polidispersión fue de 42,148 en la β-ciclodextrina y 4,884 en el

complejo de oleorresina-β-ciclodextrina con una variación considerable de 37,26

unidades, lo que indica que el complejo oleorresina-β-ciclodextrina presenta mejor

uniformidad en el tamaño de partícula en suspensión.

50

Se determinó el valor del potencial Z de una solución acuosa al 0,1% de complejo

oleorresina-β-ciclodextrina que fue de -36,4±1,4 mV y al estar fuera del rango de menos

30mV a 30mV presentó una alta estabilidad electrostática por lo tanto el complejo

oleorresina-β-ciclodextrina en solución no presenta fenómenos de agregación.

Se estudió la estabilidad de almacenamiento durante 40 días donde se evidenció

como la oleorresina baja su concentración drásticamente conforme el tiempo avanza, en

cambio el complejo oleorresina-β-ciclodextrina mantiene una degradación constante en

cada uno de las condiciones de almacenamiento de acuerdo a la tabla 10, por lo tanto se

determinó que las condiciones de almacenamiento para el complejo oleorresina-β-

ciclodextrina deben ser a temperatura ambiente en envase con protección a luz. Sin

embargo la diferencia recae en el tiempo de vida media debido a que la oleorresina

disminuye en el 50% su concentración de carotenoides totales expresados como β-

caroteno alrededor del día 18 o 19, en cambio el complejo de oleorresina-β-ciclodextrina

aumenta su tiempo de vida media, incluso se observa que en condiciones de estrés a

39.66°C y con protección de la luz va alcanzar un tiempo de vida media de 50 días.

Recomendaciones.

Se recomienda realizar un estudio para determinar una formulación de crema de

uso cosmético con la aplicación del complejo oleorresina-β-ciclodextrina. De acuerdo a

una prueba preliminar de una formulación detallada en la tabla 28 se obtuvo buenos

resultados debido a que no se evidenció separación de fases durante un mes y obtuvo un

pH de 5-6.

Tabla 28 Formulación preliminar de crema de uso cosmético

Componente Porcentaje (%)

Úrea 1

Agua 80

Glicerina 5

Complejo oleorresina-β-ciclodextrina 9

Aceite de aguacate 3

Carboximetilcelulosa 1

Span 80 1

Total 100

Nota. Elaborado por: Chamba Adriana

Se plantea determinar en el complejo de oleorresina- β-ciclodextrina el índice de

Carr, Hauner y ángulo de reposo para determinar la compresibilidad y pueda ser aplicado

posiblemente en comprimidos de vitamina C

51

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Anexos

Anexo A Árbol de problemas

Falta de estabilidad de la oleorresina de pimiento (Capsicum annuum)

Pardeamiento no

enzimático

Humedad

Presencia de

carotenoides

Degradación oxidativa

Termosensible Fotosensible

Utilización de colorantes

sintéticos tóxicos

Aparición de

enfermedades

Aparición de

compuestos vía ruta

sintética

Escaso uso de colorantes

naturales en la industria

Precauciones en el

almacenamiento

58

Anexo B Categorización de variables

Ole

orr

esin

a d

e pim

ien

to (C

apsi

cum

an

nu

um

)

Composicón Química

Carotenoides

Estructura química y clasificación

Distribución en los alimentos

Propiedades físico-químicas

Encapsulación

Métodos

Materiales encapsulantes

Estabilidad por alamacenamiento Tiempo de vida media

59

Anexo C Instrumentos de recolección de datos

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

Instrumento de recolección de datos

Datos para la eficiencia de encapsulación

Fecha del análisis:

N° Patrón Velocidad de

agitación (rpm)

Tiempo de

agitación

(min.)

Volumen de

oleorresina

(mL)

Absorbancia

antes de

encapsular

Absorbancia

después de

encapsular

Eficiencia de

encapsulación

(%)

1

2

3

4

5

6

7

8

60

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

Instrumento de recolección de datos

Datos para la solubilidad

Fecha del análisis:

Temperatura (°C):

Frasco

Volumen

de agua

(mL)

Peso

frasco

vacío

(g)

Peso del

complejo

(mg)

Peso del

frasco

más

complejo

(después

7días)

Masa de

complejo

solubilizado

(g)

Solubilidad

(g/L)

1

2

3

4

5

61

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

Instrumento de recolección de datos

Datos para estabilidad por almacenamiento

Fecha del análisis:

Temperatura (°C):

Humedad (%):

Día:

Muestra Peso del

complejo (mg)

Factor de

disolución

Absorbancia Concentración

(mg/L)

1

2

3

4

5

6

7

8

62

Anexo D Fotografías del trabajo de investigación

Imagen 1 Muestra de pimiento fresca cortada diagonalmente

Imagen 2 Muestra de pimiento seco

Imagen 3 Extracción de oleorresina de pimiento

63

Imagen 4 Reacción de Carr-Price

Imagen 5 Oleorresina de pimiento

Imagen 6 Encapsulación de la oleorresina de pimiento en β-ciclodextrina

64

Imagen 7 Muestras encapsuladas del diseño experimental

Imagen 8 Muestra

Imagen 9 Estabilidad de almacenamiento día cero

Imagen 10 Estabilidad de almacenamiento día 40

65

Imagen 11 Cremas de uso cosmético