UNIVERSIDAD AUTÓNOMAMETROPOLITANA- IZTAPALAPA

DIVISIÓN: CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD

GRADO: LICENCIATURA

BIOLOGÍA EXPERIMENTAL

DETERMINACION DE LA EXPRESION DE LOSRECEPTORES DE ESTROGENOS Y

EN HIPOFISIS DE RATAS

NOMBRE: RAUL MORALES ZOZAYAS

MATRÍCULA: 95334788

ASESOR:Dr. PABLO DAMIÁN MATZUMURA

2003

Nombre: Raúl Morales Zozayas.Matricula: 95334788.Licenciatura: Biología Experimental.Título: Determinación de la expresión de los receptores de estrógenos α y β enhipófisis de ratas.Registro: BE.029.03Fecha: 20 de abril del 2004Asesor: Dr. Pablo Damián Matzumura. Laboratorio de Endocrinología molecular, delÁrea de Reproducción Animal Asistida. Universidad Autónoma Metropolitana,Unidad Iztapalapa.

Los estrógenos son hormonas esteroides que regulan procesos biológicostales como el crecimiento, la diferenciación y la homeostasis de los órganosreproductivos. En la hipófisis controlan la síntesis y secreción de hormonas como lahormona luteinizante (LH), la hormona estimulante de los folículos (FSH) y laprolactina (PRL). Debido a que los estrógenos, llevan acabo sus efectos por medio dela interacción con sus receptores (RE), los cuales a su vez son factores detranscripción que activan a sus genes blanco a través de la formación de dímeros(α/α, β/β) o heterodímeros (α/β), se procedió a determinar si se mantenía la expresiónde los REα y REβ en hipófisis de ratas hembra OVX por 28 días (OVX-28d), así comotambién se determinó si la proporción REα/REβ cambiaba como resultado de lacastración y de la administración de benzoato de estradiol (BE), un potente agonistaestrogénico, podía regular la expresión de las isoformas del RE. Los resultados fueronlos siguientes: en las hipófisis de ratas hembra castradas por 28 días se expresó másel ARNm del REα que el REβ, aunado a los datos publicados por otros autores,concluimos que la proporción en la expresión del ARNm de las isoformas del RE essemejante en animales intactos, ooforectomizados a tiempos cortos (7días) y atiempos largos (28 días). Además se concluye que el BE no afectó la expresión delgen que codifica para el ARNm-REα, pero sí reduce la expresión del ARNm-REβ enratas OVX por 28 días. Estos datos nos permiten sugerir posibles mecanismos deacción de los estrógenos (y sus receptores) en el hecho de que cuando a las ratashembra OVX-28d se les inyecta BE, la respuesta estrogénica no se encuentramodificada por cambios en la expresión de los REα y REβ. De esta manera,correlacionando los datos al proyecto del cual se originó, el incremento en laexpresión del ARNm que codifica para una de las sialiltransferasas (ST6N) quemodifican la actividad de la hormona estimulante de los folículos (FSH) en ratas OVX-28d inyectadas con BE, no es debido a la pérdida en la capacidad de respuesta de lahipófisis al estimulo estrogénico exógeno (BE), sino al hecho de que el gen quecodifica a esta enzima está regulado por otros factores inhibitorios, posiblementehipofisiarios, los cuales aumentan con la castración, en comparación con ladisminución en la expresión de la ST6N en ratas OVX-7d, el cual fue demostrado quees independiente de la acción estrogénica (manuscrito en preparación).Contrariamente, cuando la expresión del ARNm-ST3N disminuye a los 28 días OVXcon respecto a su vehículo, es debido a que el gen que controla a esta enzimapresenta elementos de respuesta a estrógenos (ausentes en el promotor del genST6N), lo cual genera que el estradiol exógeno reprima la síntesis de lasialiltransferasa e induce la formación de isoformas de la hormona estimulante de losfolículos (FSH) con menos ácido siálico, las cuales tienen mayor potencia biológicapara inducir la ovulación.

DETERMINACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LOS RECEPTORES DEESTROGENOS α Y β EN HIPÓFISIS DE RATA.

INTRODUCCIÓN.

EFECTOS DE LOS ESTRÓGENOS

Los estrógenos cumplen una función vital en la fisiología reproductiva tantofemenina como masculina estimulando el crecimiento y la diferenciación celular entejidos como el útero, vagina, ovario, glándula mamaria, testículos, epidídimo ypróstata (Korach, 1994), además regulan los ciclos reproductivos (Ganong, 2000,Childs y cols., 2001). Estudios prospectivos han demostrado que los estrógenospueden ser útiles para reducir los problemas de osteoporosis en mujeresmenopausicas, ya que si se toma antes de la menopausia puede disminuir lapérdida de hueso y aumentar la masa ósea, así también tienen un efecto protectorcontra las enfermedades cardiovasculares (Greenspan y Strewler, 2000, Doren ySamsioe, 2000, Grodstein y cols., 1996). Además pueden prevenir o retardar laaparición de enfermedades degenerativas del sistema nervioso como en laenfermedad de Alzheimer (Paganini-Hill y cols., 1994). Dichos efectos sonllevados a cabo por medio de mecanismos genómicos que ejercen los estrógenosa través de su interacción con sus receptores intracelulares o por mecanismos nogenómicos, como se revisará a continuación.

MECANISMOS DE ACCIÓN

Los efectos fisiológicos que provocan los estrógenos pueden llevarse acabo a través de dos mecanismos de acción principalmente uno a corto tiempo(mecanismo de acción “no-genómico”), entre estos efectos rápidos se encuentranflujos de iones, desencadenamiento de potenciales de acción, descarga devesículas secretoras o activación de proteínas kinasas asociadas a la membrana,todos estos procesos ocurren en unos pocos segundos o minutos (Falkenstein ycols., 2000, Nemere y cols., 1998, Pietras y cols., 2001, Levin, 1999, Kelly yLevin, 2001, Watson y Gametchu 1999). Por otro lado para que se lleven acabolos efectos efectos genómicos, los estrógenos deben ingresar a la célula y unirse asus receptores inactivos que se encuentran en el compartimiento citoplasmático onuclear. El RE al formar complejos con la hormona, presentan cambiosconformacionales alostéricos que lo convierten en una forma activa capaz deregular la transcripción nuclear de sus genes blancos. Para funcionar de maneraeficiente y directa, el receptor debe dimerizarse y fosforilarse, interactuar consecuencias especificas del ADN o elemento de respuesta a estrógeno (ERE) yluego acoplarse con otros factores de transcripción para formar un complejomultimérico estable que estimule a la ARN polimerasa para que inicie latranscripción del gen blanco (Yen y cols., 2001, Weintraub, 1995).

ESTRUCTURA DEL RECEPTOR DE ESTRÓGENOS (RE)

El receptor de estrógenoS fue identificado en 1962 por Jensen y Jacobsen,cuando identificaron la presencia de sitios de unión a estradiol en diferentes tejidosde ratas (Jensen y Jacobsen, 1962). Cuatro años más tarde, Toft y Gorski aislaronpor primera vez receptores de estrógenoS del útero de ratas (Toft y Gorski, 1966).Hasta 1995 se asumía, que existía un solo receptor de estrógenos (RE)responsable de mediar todos los efectos fisiológicos y farmacológicos de losestrógenos naturales y sintéticos, sin embargo en 1996, fue clonado un segundoRE, el RE beta (REβ), el cual se identifico en ovario y próstata de rata (Kuiper ycol., 1996), así como también en ese mismo año se identificó en humanos(Mosselman y cols., 1996). Posteriormente, se hanaislado diferentes isoformas deestos receptores (Pakde y cols., 2000). Estudios utilizando compuesto incapacesde penetrar a la membrana como el E2-BSA-FITC (estradiol 17-β acoplado aalbúmina y a fluoresceína) demostraron la presencia de receptores de membranaen células endoteliales (Russel y col., 2000), y en células MCF-7 (Marquez yPietras, 2001). Así como también en células de ovario de Hamster (Razandi y col.,1999). Los receptores de estrógenos pertenecen a la superfamilia de receptoresnucleares que incluyen receptores de otras hormonas esteroides, hormonastiroideas, vitaminas y varios receptores huérfanos (Carson-Jurica y col., 1990). LosRE son factores de transcripción que regula la transcripción de varios genesblancos, estos receptores están compuestos de 6 regiones denominadas con lasletras de la “A” a la “F”. La región A/B está localizada en el lado amino terminal dela proteína y es la región menos conservada entre los distintos receptoresnucleares. Este dominio contiene una función de activación de la transcripcióngenética (Activation Function 1 o AF-1) y varios sitios de fosforilación, que sonimportantes en el proceso de activación de la proteína especialmente en losprocesos donde el receptor es activado en ausencia de hormona (Ignar-Trowbridge y col., 1992, Kato y col., 1995, Piedras y col., 1995), adyacente seencuentra la región de unión al ADN o dominio C, la más conservada entre losdiferentes receptores nucleares compuesta, por nueve residuos de cisteínas queson invariablemente conservados entre los diferentes receptores esteroideos, delos cuales, ocho están coordinados alrededor de dos iones de Zn2+ para formardos dedos de zinc que le confieren al receptor la capacidad de unirseespecíficamente al ADN. La unión a una secuencia específica en el ADN estádeterminada por la composición de aminoácidos localizada entre estos dos dedosde zinc, conocida como la caja P (P-box) (Freedman y col., 1992). Entre la regiónde unión al ADN y el dominio E/F, se encuentra la región D o región de bisagra, lacual no ha sido bien caracterizada y que participa en la unión a la proteínachaperona de choque térmico hsp90 (heat shock protein 90), la cual permaneceunida al receptor mientras éste se encuentre en un estado inactivo. Finalmente, enel extremo carboxilo terminal se encuentra la región E/F o dominio de unión alligando (LBD), donde se une la hormona (E2). Esta región a pesar que es

conservada entre los diferentes receptores esteroideos es altamente específicapara su hormona, es decir que el receptor de estrógeno une estrógeno con altaafinidad, pero no otras hormonas esteroideas. Otras funciones de este dominioincluyen otra función de activación de la transcripción o AF-2 (Activation Function2), dimerización, interacción con otras proteínas co-activadoras o co-represoras dela transcripción, fosforilación y localización nuclear. Ambos receptores el beta y el alfa tienen estructuras similares exhibiendoun alto grado de conservación de los aminoácidos en el dominio de unión al DNA(DBD) aproximadamente de un 96% y una moderada conservación en el dominiode unión al ligando (LBD; carboxilo terminal) de aproximadamente un 59%; perodivergencia considerable en el amino terminal, así como también en su tamaño(Kuiper y cols., 1997).

EXPRESIÓN DE LAS ISOFORMAS DEL RECEPTOR DE ESTRÓGENOS ENTEJIDOS

Los receptores de estrógenos se encuentran en varios tejidos humanostales como el ovario, las trompas de Falopio, el útero, el pulmón, el riñón, elcerebro, el corazón, la próstata y el testículo (Taylor y Al-Azzawi, 2000), losREα se expresan en útero, hígado, mama y riñón, mientras que los RE , entejidos no reproductivos como hueso, cerebro, hipófisis, tracto urinario, aparatocardiovascular y próstata, además en tejidos reproductivos como ovario ytestículo. Ambos receptores se presentan en ovarios, cerebro, hueso, sistemacardiovascular y mamas. (Pelletier y El-Alfy, 2000, Kuiper y cols., 1998, Farhat ycols., 1996). Por otra parte se han identificado receptores de estrógenos en varioscanceres de mama (Shaw y col., 2002). Muchos estudios en la identificación delos receptores de estrógenos en los humanos se han realizado por medio detécnicas de ARN como son: RT-PCR, ensayo de protección de RNAsa ehibridación in situ (Byers y col., 1997, Kuiper y col., 1997). En el presente estudiotiene como objetivo determinar la expresión de los receptores alfa y beta endiferentes tipos celulares a través de la técnica de RT-PCR.

ANTECEDENTES.

Los receptores de estrógenos son expresados en dos formas REα y REβ,ambas formas se expresan tanto in vivo como in vitro, y es muy claro que el REα yREβ puedan formar complejos heterodimericos con habilidad de unirse al ADN(Pettersson y cols., 1997, Shaw y cols., 2002). Las propiedades de transactivaciónde estos receptores (REαy el REβ) han mostrado vías opuestas, ya que cuandoestos receptores forma complejos con el 17 β−estradiol desde el sitio de activaciónde la proteína 1 (AP-1), se observó que con el REα la transactivación fue activadapor el estradiol y con el REβ la transactivación fue inhibida por el estradiol (Paechy cols., 1997).

Se ha demostrado que cuando se expresan los dos tipos de receptores(REαy el REβ) pueden heterodimerizarse en ausencia de los estrógenos, esto

implica que los efectos de los estrógenos se pueden modular por lo menos enparte por la formación de heterodimeros (Cowley y cols., 1997, Pettersson y cols.,1997). Así como también se ha demostrado que el REβ puede modular laactividad de transactivación del REα (Hall y cols., 1999). Estudios demostraron que el estradiol puede regular la expresión del Genque codifica para la enzima sialiltransferasa (ST3N) (Damián-Matzumura y cols.,1999), esta enzima adiciona ácido sialico a la hormona estimulante de los folículos(FSH), dicha adicción puede dar origen a formas ácidas y básicas de la FSH, ymodifica la bioactividad de esta (Ulloa-Aguire y cols., 1995). De tal forma quecuando el estradiol interacciona con sus receptores de estrógenos puede regularde una forma negativa ó positiva a la enzima ST3N, dependiendo de que receptorse este expresando en la hipófisis.

OBJETIVO

Estandarizar la técnica que permitan determinar la expresión de los ARNmque codifican para los receptores de estrógenos α y β en hipófisis de rata OVX por28 días, a través de la técnica de RT-PCR.

METODOLOGÍA

MODELO EXPERIMENTAL

Se utilizaron ratas hembra adultas de más de 60 días de edad, con un pesoentre 250 y 300g, de la cepa Wistar (Rattus norvergicus, bioterio del InstitutoNacional de Ciencias Medicas y de la Nutrición, Salvador Zubirán, México D.F.),las cuales fueron mantenidas bajo condiciones de luz controlada (encendida de07:00 a 19:00h), alimentadas con comida para animales de laboratorio (Purina LabChow, purina, México) y con agua potable. Solamente se utilizaron animales quepresentaron al menos 3 ciclos estrales regulares continuos de 4 días cada uno, loscuales se determinaran por frotis vaginales diarios.

RATAS OVARIECTOMIZADAS (OVX).

Con la finalidad de determinar el efecto de la castración sobre la expresióndel ARNm del REα y REβ, 16 ratas por grupo fueron castradas bilateralmente porincisión abdominal bajo anestesia de eter y se mantuvieron en el bioterio hasta los28 días post-castración. Posteriormente se obtuvieron las hipófisis y fueronlavadas con solución salina estéril y almacenadas a -70°C en tubos depolipropileno estériles individuales hasta la determinación de la expresión delARNm de los REα y REβ por el método de RT-PCR cuantitativo.

RATAS POR 28 DÍAS OVX + BENZOATO DE ESTRADIOL

Con la finalidad de determinar el efecto de la administración de benzoato deestradiol (BE) sobre la expresión del ARNm de los REα y REβ, grupos de ratasOVX por 28 días fueron inyectadas (IP) con una dosis de 10µg de BE/100µl devehículo y fueron sacrificadas 24 horas después de la última. De la misma forma,los grupos control recibieron solamente el vehículo (100µl de aceite de maiz) yfueron sacrificados. Se removieron las hipófisis y se almacenaron como se indicaanteriormente.

EXTRACCIÓN DEL ARN TOTAL

La extracción del ARN total de las muestras de hipófisis de rata se realizópor el método de isotiocianato de guanidina, usando el reactivo de TRIZoLTM

(Invitrogene) según el método de aislamiento de ARN en un solo paso(Chomczynski y Sachi 1987), se utilizaron 1ml del reactivo por cada muestra.

Primeramente las muestras de tejidos fueron homogenizadas, usando unhomogenizador de tejidos (STIR-PAK, Fisher, Chicago IL) a máxima velocidad por20 segundos sobre hielo, posteriormente se incubaron durante 5 minutos parapermitir la disociación completa del complejo de nucleoproteínas. Después a loshomogenizados se les agregaron 200µl de cloroformo y se agitaron vigorosamentepor 15 segundos. Posteriormente se paso el contenido en un tubo demicrocentrífuga tipo Eppendorf de 1.5 ml nuevo y estéril. Se incubaron por 3

minutos y se centrifugaron a no más de 12,000 x g (11,400 rpm, CentrífugaEppendorf) por 15 minutos, esto provoco que se formaran tres fases [Fase inferiorroja (orgánica = lípidos y proteínas), interfase blanca (=proteínas y ADN), fasesuperior incolora (acuosa) con el ARN]. La fase acuosa se transfirió a un tubo demicrocentrífuga de 1.5 ml nuevo y estéril y se agregaron 500µl de isopropanol paraprecipitar el RNA, se incubo por 24 horas. Después se centrifugo a no más de12,000 g durante 10 minutos. El RNA se observo como un "pellet" blanco. Sedecanto el sobrenadante sobre un pedazo de papel higiénico y se agrego 1ml deetanol al 75% en agua con DEPC. Posteriormente se mezclaron las muestras conel "vortex" hasta que "se desprendio el pellet", y se centrifugaron a no más de7,500 x g (9,000 rpm) por 5 minutos. Se secaron cuidadosamente el ARN con unapipeta Pasteur estéril, con la punta adelgazada, conectada al vacío. Por último seresuspendió el ARN en 20-30µl de formamida (0.1% v/v) pipeteandorepetidamente. Se cuantifico la concentración del ARN de cada muestra porespectrofotometría a 260 nm y se determinaron la presencia de contaminantesproteicos por la relación 260/280, lo cual fue de 1.8 y 2.0. Las se muestras deARN total se guardaron a -20oC hasta el momento de la electroforesis.

ELECTROFORESIS DE ARN EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES

Con la finalidad de determinar que el ARN no este degradado, los ARN’s sesepararon según su peso molecular mediante electroforesis en geles de agarosaal 1.0% (Invitrogene, grado Biología Molecular) conteniendo la soluciónamortiguadora de acido (3-[N-Morpholino] propanosulfonico(MOPS) 10X yformaldehído al 37% (sigma) como desnaturalizante.

Para la preparación de las muestras y conforme a lo obtenido en lacuantificación del ARN total, se ajustaron los volúmenes con ddH2O-DEPC(Dietilpirocarbonato) a un volumen final de 10µl en tubos para centrífuga tipoEppendorff de 0.5ml. A cada muestra se le adicionarán 10µl de la solucióndesnaturalizante FMF (50% formamida, MOPS:; PM=209.3; pKa=7.2 a 25oC, pHrango 6.5-7.9 1X MOPS, 6.5% formaldehído (FMF), y se calentaron a 75oC en unbaño de aceite (Boekel Industries Inc., USA) por 5 minutos, se mantendrán enhielo por 5 minutos y se centrifugarán a 11,000 rpm.

Después de la desnaturalización, a cada muestra se les adicionaron 2µl dela solución de carga para ARN (30% glicerol, 0.1% azul de bromofenol y 0.1%xilen cianol) y 0.2µl de la solución de bromuro de etidio 10µg/ml. Una vezdepositadas las muestras en los pozos del gel, estos se cubrieron totalmente con1X MOPS y se llevaron a cabo el corrimiento electroforético a 75 V por 1.5 horas. El marcador de peso molecular de 100 pb, se trato de igual forma que lasmuestras por analizar.

TRANSCRIPCIÓN REVERSA (RT)

La síntesis de los cDNAs del receptor de estrógenos alfa y beta serealizaron mediante las técnicas de retrotranscripción, para la cual, se emplearonel estuche de amplificación Invitrogene, el procedimiento fue el siguiente: En un tubo 0.2 ml estéril se colocaron los siguientes componentes:1µl de ARN total de las muestras de tejidos1µl de oligo (dT) 12-18, (0.5 µg/µl)1µl dNTPs mix (10mM)se aforaron a 10 µl con H2O-DEPC

Se incubaron a 70oC por 10 min, seguido por 1 minuto en hielo. Secentrifugaron para bajar todo la muestra. Por separado se prepararon la siguientemezcla y se le adicionaron cada componente en el siguiente orden.2µl de 10X PCR buffer4µl de 25mM MgCl22µl de 10 mM mezcla de dNTP's [dATP, dCTP, dGTP, dTTP]2µl de 0.1 M DTT1µl de RNase OUT

Después se incubaron a 42oC por 5 min. Posteriormente se agregaron 1µl(200 unidades) de la enzima SUPER SCRIPT II, se agitaron y se incubaron a42oC por 50 min. Para terminar la reacción se incubaron a 70oC por 15 minutos einmediatamente después se colocaron en hielo, y se centrifugaron a 11000 rpmpor 1 min. Finalmente se le adicionaron a cada RT 1µl de RNasa H y se incubron a37oC por 20 minutos y se colocaron en hielo. Las incubaciones se realizaron enun termociclador modelo 9600, Perkin Elmer. Los RTs se almacenaron a -70°Chasta su posterior utilización.

AMPLIFICACIÓN DEL cDNA POR REACCIÓN EN CADENA DE LAPOLIMERASA (PCR).

Con la finalidad de conocer la expresión diferencial del ARNm de losreceptores de estrógenos alfa y beta, se utilizaron la reacción en cadena de laPolimeras (PCR). La técnica se realizo como a continuación se indica. Se adicionaron en un tubo para PCR de 0.2 ml estéril la siguiente mezcla: 5µl 10X PCR buffer, 3 µl 25 mM MgCl2, 1 µl 10 mM dNTP mix, 2µl aligo sentidopara receptor alfa, 1 µl oligo antisentido para alfa, 2 µl cDNA (Producto del RT),36.5 µl H20 dd estéril, después se centrifugará la mezcla (11000 rpm por 30segundos) y se adicionaron 0.5µl de AmpliTaq® DNApol (Invitrogene). En otro tubo para PCR de 0.2 ml estéril se le agrego la siguiente mezcla: 5µl 10X PCR buffer, 3 µl 25 mM MgCl2, 1 µl 10 mM dNTP mix, 2µl oligo sentidopara receptor beta, 1 µl oligo antisentido para beta, 2 µl cDNA (Producto del RT),36.5 µl H20 dd estéril, después se centrifugo la mezcla (11000 rpm por 30segundos) y se adicionaron 0.5µl de AmpliTaq® DNApol (Invitrogene).

Se usaron las siguientes temperaturas en los ciclos del termocicladorMinicycler (MJ Research), cabe mencionar que la temperaturas de alineación se

iniciaron con las temperaturas determinadas por la temperatura de disociaciónteórica (Tm; del inglés temperature of melting) que viene calculada en el informetécnico de síntesis de cada oligonucleótido (Invitrogene), la cual fue de 53°C parael RE alfa y de 50°C para el RE beta.

CONDICIONES DE REACCIÓN

#ciclos Temperatura/Tiempo 1 94oC / 5 min 94oC / 30 s

25 53oC / 30 s para REα y REβ con 50°C/30 s 72oC / 30 s 1 72oC / 7 min 4oC el resto del tiempo

Con la finalidad de normalizar la síntesis de los PCR obtenidos, sesintetizaron al mismo tiempo PCRs con los nucleotidos de ciclofilina (Cyc),utilizando los mismos RTs que se usaron para la síntesis de los PCRs de losreceptores de estrógenos en reacción paralela, en este caso se utilizaron 0.2µl decada uno de los oligos de Cyc esperando un producto de peso molecular de453pb.

Las secuencias de los oligonucleótidos utilizados son:

Para el receptor de estrógenos alfa:1. Oligonucléotido superior o sentido para el receptor alfa5’- GGTCCAATTCTGACAATCGACG- -3’Posiciones (sentido) 677-698.2. oligonucléotido inferior o antisentido del receptor alfa5’- TTTCGTATCCCGCCTTTCATC-3’Posiciones (antisentido) 975-995.

Para el receptor de estrógenos beta:1.Oligonucléotido superior o sentido para el receptor Beta5’-AACCTCAAAAGAGTCCTTGGTGTG -3’Posiciones (sentido) 584- 6072. oligonucléotido inferior o antisentido del receptor5´-AACCTCAAAAGAGTCCTTGGTGTG-3’Posiciones (antisentido) 892- 910

Una vez sintetizados los PCR se corrieron en un gel de agarosa al 1.2 %con Bromuro de Etilio en 0.5X de TBE (ácido bórico, Tris-base,Etilendiaminotetracetico = EDTA); a 75V por 1.5 horas. Después los productos de

PCR se digitalizaron para que posteriormente sean analizarándensitométricamente en un analizador de imágenes GelDoc (BioRad). Losresultados se expresaron en forma del cociente del área de la densidad ópticarelativa.

ACTIVIDADES REALIZADAS

Este servicio se realizo en 6 meses a partir del 25 de septiembre del 2003hasta el 24 de marzo del 2004.

ETAPA 1: Extracción de los RNAs totales de hipófisis. (Noviembre a Diciembre,2003).

ETAPA 2: Síntesis de los cDNA a partir del ARNm de hipófisis por medio de latécnica de retrotranscripción. (Diciembre, 2003).

ETAPA 3: Amplificación de los cDNAs de las isoformas de los receptores de ERαy ERβ por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para laexpresión del ARNm que codifica para los receptores de estrógenos alfa y beta.(Enero-Febrero, 2004).

ETAPA 4: Análisis de resultados. (Marzo y Abril, 2004).

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS

Se extrajo el ARN total de ratas OVX-28 días por el método de isotiocianatode guanidina.

Se determino la expresión del ARNm de las dos isoformas de los receptoresde estrógenos por medio de la técnica de RT-PCR.

RESULTADOS

INTEGRIDAD DEL ARN TOTAL.

La integridad y homogeneidad en las concentraciones del ARN totalobtenido de hipófisis individuales de ratas hembra castradas se determinó a travésde la técnica de electroforesis en geles de agarosa al 1% (p/v) bajo condicionesdesnaturalizantes [formaldehído al 7% (v/v)] usando aproximadamente 5 µg decada muestra, como se indica en “Material y Métodos”. En la figura 1 se muestrauna fotografía representativa del un gel en donde se observa la presencia de dosbandas bien definidas que corresponden a los ARN ribosomales de 28 S (4.7 kb) y18 S (1.9 kb), así como una banda en la parte inferior del gel que corresponde alos ARN de transferencia. La nitidez de las bandas 28 S y 18 S nos indica que lasmuestras no están degradadas y por lo tanto son adecuadas para poderamplificarlas por la técnica de transcripción reversa (RT) seguida de la reacción encadena de la polimerasa (PCR).

Figura 1. Gel de agarosa representativo donde se observa la separación por electroforesis delARN total. La integridad de las bandas del ARN ribosomal, 28S banda superior y 18S bandainferior, refleja la integridad de las muestras. Los carriles del 1 a 4 corresponden al ARN total deextractos de hipófisis individuales obtenidas de ratas ooforectomizadas (OVX) e inyectadas con elvehículo (100 µl de aceite de maíz) y los carriles 6 a 8 ARN de extractos de hipófisis de ratas OVXinyectadas con 10 µg de Benzoato de estradiol /100 µl de vehículo.

28S

18S

1 2 3 4 5 6 7 8 9CARRILES

EXPRESIÓN DE LOS ARNm QUE CODIFICAN PARA LAS ISOFORMAS α Y βDEL RECEPTOR DE ESTRÓGENOS POR RT-PCR.

Con la finalidad de determinar la expresión de los ARNm de los receptoresde estrógenos (RE) alfa (α) y beta (β) en hipófisis de ratas OVX se utilizó el ARNtotal de muestras individuales de hipófisis, previamente analizada su integridad porelectroforesis, para realizar la síntesis de los cDNAs por medio de la técnica deRT-PCR en un termociclador Minicycler (MJ Research). Se emplearon losoligonucleótidos específicos (sentido y antisentido) para cada isoforma del REreportados en la sección de “Material y Métodos”.

Debido a que el objetivo del presente trabajo es el de estandarizar latécnica de amplificación de los ARNm que codifican para cada isoforma del RE, seprobaron diversas condiciones de reacción, variando la temperatura de alineacióny el número de ciclos de amplificación. Se inició con las temperaturasdeterminadas por la temperatura de disociación teórica (Tm; del ingléstemperature of melting) que viene calculada en el informe técnico de síntesis decada oligonucleótido (Invitrogene), la cual fue de 53°C para el RE alfa y de 50°Cpara el RE beta. Cabe hacer notar que cuando en el gel no se observa ningunabanda o se presentan más bandas de las esperadas y/o de pesos molecularesdiferentes a los calculados en pares de bases (pb) (REα=304 pb y REβ=327 pb)no se imprimen las fotografías correspondientes.

Isoforma delRE

Temperaturas dealineación

Número de ciclos Resultados

REα 53 y 55°C 30 Múltiples BandasREα 60°C 30 y 40 No bandasREα 57°C 40 Una sola bandaREβ 50 °C 30 Múltiples BandasREβ 55 °C 30 y 40 No bandasREβ 53 40 Una sola banda

Las condiciones del RT-PCR que finalmente se utilizaron a lo largo de esteproyecto fueron las siguientes:

a) RTTemperatura/Tiempo70°C 10min42°C 5min42°C 50min70°C 15min37°C 20min

b) PCR

Receptor de estrógenos alfa:#ciclos Temperatura/Tiempo1 94oC / 5 min

94oC / 30 s 40 57oC / 30 s 72oC / 30 s 1 72oC / 7 min 4oC el resto del tiempo

Receptor de estrógenos beta #ciclos Temperatura/Tiempo

1 94oC / 5 min 94oC / 30 s 40 53C / 30 s 72oC / 30 s 1 72oC / 7 min 4oC el resto del tiempo

La determinación de los pesos moleculares de los productos de estasreacciones se realizó mediante electroforesis en geles de agarosa al 1.2% (p/v)comparándolas con el estándar de peso molecular conocido como escalera de 100pares de bases (100 bp DNA ladder; Invitrogene). Los resultados obtenidos fueronanalizados por densitometría en el analizador de imágenes GelDOC (BioRad) y losresultados se expresan en pares de bases de peso molecular aparente.

Usando la misma técnica se determinó el área de la densidad óptica relativa(unidades=pixeles) para cada banda de los productos de PCR obtenidos. Losresultados se expresan como el cociente de la densidad óptica relativa para cadamuestra problema (ARNm-RE α o β) entre la densidad óptica relativa obtenidapara la sonda de normalización de la ciclofilina (ARNm-Cyc), cuya expresión esconstitutiva.

EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE LOS RECEPTORES DE ESTRÓGENOS ALFAY BETA

Este estudio se realizó para comparar la expresión de las isoformas (α y β)de los ARNm del receptor de estrógenos en hipófisis de ratas OVX por 28 días sintratamiento, utilizando como sonda de normalización la ciclofilina (Cyc), por mediode la técnica de RT-PCR. En la figura 2 se muestra que la expresión del ARNm dela isoforma α es aproximadamente el doble de la expresión del ARNm del ERβ,determinado bajo las mismas condiciones experimentales.

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0.1

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1 2

DENS

IDAD

OPT

ICA

RELA

TIVA

(RE α

o R

E β/C

yc)

12

Figura 2. Expresión diferencial de los receptores de estrógenos alfa (REα) y beta (REβ) enhipófisis de ratas ooforectomizadas por 28 días. A) Gráfica de los cocientes de las densidadesópticas relativas de los productos de RT-PCR de cada RE entre los productos de ciclofilina (Cyc),donde * p<0.005. B) Fotografía de los geles donde se muestran los productos de PCR de cuatrodiferentes hipófisis (experimentos independientes) para los REα, REβ y el producto del gen denormalización Cyc.

REα

REβ

REα REβ

A)

B)

*n=16

Resultados similares a los nuestros fueron reportados por Wilson ycolaboradores (1998) cuando compararon la expresión del ARNm de las dosisoformas del receptor de estrógenos en ratas hembra adultas intactas de la cepaSprage-Dawley por las técnicas de RT-PCR radiactivo, usando 32P; sin embargo,estos autores encontraron una diferencia de más de 5 X, en contraste con loreportado por Mitchner y colaboradores (1998) en la misma cepa, utilizando latécnica de hibridación in situ e inmunohistoquímica y por el grupo de Tena-Sempere (2004) usando la técnica de PCR en tiempo real, cuyos resultados sonsemejantes a los que nosotros reportamos. Una posible explicación de losresultados descritos por el grupo de Wilson es que al hacer un RT-PCRradioactivo, la intensidad de la marca depende del tiempo de exposición, el cual nose comporta en forma lineal con respecto a la concentración, ya que cuando hayun exceso de ADN marcado con 32P, la intensidad es mucho mayor que cuando laconcentración es menor, por lo que esta técnica es muy útil para los casos en loscuales la expresión es baja, más no es recomendable para aquellos experimentosen los cuales se comparan genes que se expresan en gran cantidad. La razón porla cual estos autores utilizaron el PCR radiactivo es porque también analizaron laexpresión de las isoformas del receptor de estrógenos en hipófisis de ratasprepúberes, donde su expresión es tan baja que solamente mediante esta técnicaes posible detectar los transcritos.

A pesar de estas diferencias y de acuerdo a lo esperado, la expresión delREα se mantiene notablemente mayor al REβ en hipófisis de ratas hembracastradas por 28 días, lo cual implica que la respuesta que se observa en hipófisisde animales ooforectomizados por largo tiempo (>20 días) es proporcional a loobservado en tiempos cortos (1-7días) de OVX con respecto a los REα y REβ. Laimportancia que tiene este resultado para nuestro proyecto es que se puede inferirque cuando se hacen experimentos con ratas ooforectomizadas por tiempoprolongado, el efecto observado es por la ausencia de estrógenos, más no por elde sus receptores, y en el caso de estimular con agentes con actividadestrogénica, la hipófisis tiene la capacidad de responder al estímulo porque sesiguen sintetizando los receptores de estrógenos en las mismas proporciones.

EFECTO DEL BENZOATO DE ESTRADIOL SOBRE LA EXPRESIÓN DELARNm DE LAS ISOFORMAS α Y β DEL RECEPTOR DE ESTRÓGENOS.

Para determinar el efecto que tiene el benzoato de estradiol (BE) sobre laexpresión de los ARNm de los REα y REβ en hipófisis de ratas ovariectomizadaspor 28 días (OVX), se les inyectó una dosis única de 10 µg BE en 100 µl devehículo (V=aceite de maíz) y se compararon con las ratas control inyectadas con100 µl del vehículo (figura 3).

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SID

Ad

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ICA

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ATI

VA(R

E α y

Reb

/ C

yc)

1234

Figura 3. Efecto de la inyección de BE sobre los ARNm de los receptores de estrógenos alfa(REα )y beta (REβ) en hipófisis de ratas ooforectomizadas por 28 días (OVX) A) Gráfica quemuestra la comparación del efecto del estradiol sobre los REα y REβ), los resultados se expresancomo el cociente de las densidades ópticas relativas de los productos de PCR de cada RE entrelos productos de ciclofilina (Cyc), donde letras diferentes indican diferencias significativas p<0.005.B) Fotografía representativa de los geles donde se muestran los productos de PCR, obtenidos apartir de las hipófisis de ratas OVX inyectadas con 100 µl de aceite de maíz como vehículo (V) ocon 10 µg de benzoato de estradiol (BE) en 100 µl de vehículo, para los REα, REβ y el productodel gen de normalización Cyc.

REα

REβ

V BE V BE

A)

B)

c

aa

b n=16

La figura 3 muestra que el BE no tiene efecto sobre la expresión del REα,en comparación con su respectivo vehículo; contrariamente, la expresión delARNm del REβ presentó una disminución estadísticamente diferente del 50% conrespecto al vehículo (p<0.005). Este resultado es similar a lo reportado por Tena-Sempere y colaboradores (2004) quienes, utilizando la técnica RT-PCR en tiemporeal, lo demostraron en hipófisis de ratas OVX por 14 días. Cabe hacer notar queesta publicación apareció el mes anterior a la escritura del presente reporte (abrilde 2004).

Contrariamente a lo que esperábamos, el benzoato de estradiol no modificóla expresión del REα en hipófisis de ratas OVX, como sucede con otros tejidoscomo el hígado (Xu y cols., 2004) y en endometrio y miometrio humanos y deoveja (Wu y cols., 1996; Vienonen y cols., 2004), donde el mismo estradiol regulala expresión de sus propios receptores.

La importancia de estos resultados radica en el hecho de que la hipófisispuede responder a estímulos estrogénicos a pesar de haber pasado por un tiempolargo en ausencia de los mismos, sin que se modifique la expresión del REα.Además, el hecho de que el BE reduzca la síntesis del ARNm-REβ en un 50%,puede ocasionar aumento temporal en la respuesta estrogénica, ya que se hademostrado que el REβ puede actuar como inhibidor de la actividad mediada porel REα unida a su ligando (Paech K y cols., 1997; Matthews y Gustafsson, 2003).

CONCLUSIONES

• En primer lugar se determinó que en las hipófisis de ratas hembrascastradas por 28 días, se expresa más el ARNm del REα que el REβ,aunado a los datos publicados por otros autores, podemos que laproporción en la expresión del ARNm de las isoformas del RE es semejanteen animales intactos, ooforectomizados a tiempos cortos (7días) y atiempos largos (28 días).

• Además se concluye que el BE no afecta la expresión del gen que codificapara el ARNm-REα, pero sí reduce la expresión del ARNm-REβ en ratasOVX por 28 días.

Una contribución importante de este trabajo es el hecho de que no se habíanreportado resultados en animales que fueron sacrificados después de un períodolargo de castración (28 días), lo cual implica que la hipófisis de rata tiene lacapacidad de expresar las isoformas de los RE de la misma manera que losanimales intactos en los diferentes días del ciclo estral (Schreihofer y cols., 2000),como en los animales castrados por 3, 7 y 14 días (Mitchner y cols., 1998; Tena-Sempere y cols., 2004).

Estos resultados son importantes en el contexto de nuestro trabajo deinvestigación, ya que nos permiten responder algunas preguntas que estabanpendientes.

Debido a que los estrógenos, como el BE, llevan acabo sus efectos pormedio de la interacción con sus receptores, los cuales a su vez son factores detranscripción que activan a sus genes blanco a través de la formación dehomodímeros (α/α, β/β) o heterodímeros (α/β), se procedió a determinar si semantenía la expresión de los REα y REβ en hipófisis de ratas hembra OVX por 28días (OVX-28d), si la proporción REα/REβ cambiaba como resultado de lacastración y si la administración de un potente agonista estrogénico, como el BE,puede regular la expresión de las isoformas del RE. Las respuestas a estaspreguntas nos permiten sugerir posibles mecanismos de acción de los estrógenos(y sus receptores) en el hecho de que cuando a las ratas hembra OVX-28d se lesinyecta BE, la respuesta estrogénica no se encuentra modificada por cambios enla expresión de los REα y REβ.

De esta manera, el incremento en la expresión del ARNm que codifica parauna de las sialiltransferasas (ST6N) que modifican la actividad de la hormonaestimulante de los folículos (FSH) en ratas OVX-28d inyectadas con BE, no esdebido a la pérdida en la capacidad de respuesta de la hipófisis al estimuloestrogénico exógeno (BE), sino al hecho de que el gen que codifica a esta enzimaestá regulado por otros factores inhibitorios, posiblemente hipofisiarios, los cualesaumentan con la castración, en comparación con la disminución en la expresión

de la ST6N en ratas OVX-7d, el cual fue demostrado que es independiente de laacción estrogénica (manuscrito en preparación).

Contrariamente, cuando la expresión del ARNm-ST3N disminuye a los 28días OVX con respecto a su vehículo, esto es debido a que el gen que controla aesta enzima presenta elementos de respuesta a estrógenos (ausentes en elpromotor del gen ST6N), lo cual genera que el estradiol exógeno reprima lasíntesis de la sialiltransferasa e induce la formación de isoformas de la hormonaestimulante de los folículos (FSH) con menos ácido siálico, las cuales tienenmayor potencia biológica para inducir la ovulación (Damián-Matsumura y cols.,1999).

CRITERIOS DE EVALUACIÓN.

Debido a que se trata de la estandarización de una técnica, se considerocompletado el servicio social cuando se puedo cuantificar en forma reproducible laexpresión de los ARNm de los ERα y ER β en los tejidos de hipófisis de ratasOVX por 28 días.

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