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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANADIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD-

IZTAPALAPA

INFORME FINAL DE SERVICIO SOCIAL

PRESENTADO POR:

José Rodolfo Mora Linares

Teléfono: 57-51-66-71

Matrícula: 88227661

Licenciatura en Biología Experimental

Título del Proyecto:Detección y Evaluación de las Propiedades Hematopoyéticas de

Plantago major L in vitro.

Clave de registro del Servicio Social: BE.009.97

Directores:M. en B. E. Rodolfo Velasco Lezama. Profesor Titular "C" de T. C.

Q.B.P. Rafaela Tapia Aguilar. Profesor Titular "B" de T. C.

Lugar de Realización: Laboratorio de Hematología Experimental

del Departamento de Ciencias de la Salud.

Fecha de terminación: 19 de Diciembre de 1997.Alumno

José Rodolfo Mora Linares

Director Directora

M. en B. E. Rodolfo Velasco Lezama Q.B.P. Rafaela Tapia Aguilar

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CONTENIDO PAG.

RESUMEN 3

INTRODUCCIÓN 5

JUSTIFICACIÓN 12

NATURALEZA DEL PROYECTO 14

HIPÓTESIS 15

OBJETIVO GENERAL 16

OBJETIVOS ESPECÍFICOS 16

MATERIAL Y MÉTODOS 17

RESULTADOS 21

DISCUSIÓN 32

CONCLUSIONES 34

BIBLIOGRAFÍA. 35

Nombre: José Rodolfo Mora Linares.

Matrícula: 88227661.

3

Licenciatura: Biología Experimental.

Título del Trabajo: Detección y Evaluación de las propiedades

Hematopoyéticas de Plantago major L in vitro.

Clave de registro del Servicio Social: BE.009.97

Fecha de entrega: 13 febrero de 2003.

M. en B. E. Rodolfo Velasco Lezama. Profesor Titular "C" de T.C.

Q.B.P. Rafaela Tapia Aguilar. Profesor Titular "B" de T.C.

RESUMEN

En la medicina tradicional mexicana se recomienda el empleo de las

partes aéreas de Plantago major L (Plantaginaceae), para el tratamiento de

cáncer (leucemia), heridas, llagas, anemia. En Asia se utiliza la raíz para el

tratamiento del cáncer. Considerando el uso de la planta contra la anemia,

en el presente trabajo se evaluó el efecto de las estructuras de Plantago

major L. sobre la proliferación de células hematopoyéticas de la médula ósea

y de bazo de ratón in vitro.

Se obtuvieron los extractos acuoso y metanólico de las espigas, hojas.

raíz y partes aéreas de la planta: Se prepararon disoluciones con 0.4, 0.2,

0.1 y 0.05 g/mL de los extractos en medio de Leibovitz (L-15) , se

adicionaron a cultivos de células de médula ósea o de bazo de ratón, de 8 a

12 semanas de edad. Los cultivos se incubaron 72 y 48 horas

respectivamente a 37°C y con humedad relativa de 90% y 5 % de CO2.

4

Simultáneamente, se prepara-ron cultivos testigos libres de extracto. Las

células se cosecharon, lavaron y contaron en cámara cuentaglóbulos.

El extracto acuoso de la espiga, hoja, raíz o de las estructuras aéreas

por separado, aparentemente estimularon la proliferación de las células en

cultivo. Sin embargo, debido a la amplia dispersión de la desviación

estándar, los incrementos no fueron estadísticamente significativos, Gráficas

1 a 5. El extracto metanólico de las estructuras aéreas a las concentraciones

de 0.4 y 0.2 g/mL incrementó la cuenta de células de médula ósea, Gráficas

6,7 y 8. Con la hoja los incrementos en la cuenta celular fueron de 31 y 5

veces, respectivamente, Gráficas 9 a 10. Se observó una relación directa

entre concentración del extracto y capacidad estimulante de la proliferación

celular, se observaron diferencias estadísticamente significativas las

diferentes concentraciones de los extractos. Ninguno de los extractos

ensayados estimuló la proliferación de células de bazo en cultivo. Gráficas

11 a 15.

La concentración de 0.4 g/mL del extracto metanólico de la hoja presentó la

mayor actividad hematopoyética. Queda por conocerse: El tipo y estado de

maduración de las células mieloides estimuladas. El extracto metanólico

podría servir como fuente para la obtención y caracterización de principios

activos de utilidad en el tratamiento de diferentes tipos de anemias.

5

INTRODUCCIÓN

La hematopoyesis es el proceso dinámico de producción y desarrollo

de las células sanguíneas a partir de un grupo de células precursoras toti-

potenciales (stem), que se encuentran en la médula ósea y que bajo la

influencia de sustancias humorales como las citocinas y el microambiente, se

diferencian y dan origen a las líneas de eritrocitos, leucocitos y plaquetas.

Las células madre hematopoyéticas (stem) hacen su primera aparición

en el saco vitelino del embrión humano, migran después al hígado del feto,

donde aumenta el número de líneas celulares que se producen.

Posteriormente, la hematopoyesis se desplaza al bazo y finalmente a la

médula ósea, lugar que se mantiene como sitio único de producción de

sangre a lo largo de la vida del individuo (Golde, 1992).

Existen varios tipos de células madre (tallo) con diferentes capacida-

des de replicación y diferenciación, de esta manera unas células pueden

replicarse ampliamente y en contrapartida poseer capacidad limitada para la

diferenciación. El principal miembro de este conjunto es la célula madre

totipotencial; la cual es la base para la renovación de los sistemas hemato-

poyético e inmune (Golde, 1985, Iscove, 1990).

Como es conocido, la sangre humana consta de elementos plasmá-

ticos y celulares que en conjunto cumplen las funciones siguientes:

1. Transporte de oxígeno de los pulmones a los tejidos y CO2 de los tejidos a

los pulmones.

6

2. Nutrición: Transporte de los materiales alimenticios.

3. Excreción: Transporte del gasto metabólico a riñones, pulmones, piel o

intestino para renovación o eliminación.

4. Mantenimiento del equilibrio ácido-base corporal.

5. Regulación del balance de agua.

6. Regulación de la temperatura corporal.

7. Defensa celular y humoral ante agentes infecciosos o antigénicos.

8. Regulación del metabolismo a través del transporte de

metabolitos (McKensey, 2000).

Entre los principales elementos formes de la sangre se encuentran

los

eritrocitos, leucocitos y plaquetas.

ERITROCITOS:

La función primaria de los eritrocitos es llevar el oxígeno desde los

pulmones a los tejidos y devolver el CO2 de los tejidos a los pulmones para

su eliminación mediante la hemoglobina, por medio de la actividad de la

enzima anhidrasa carbónica, la cual al acelerar la reacción entre bióxido de

carbono y el agua permite la absorción de grandes cantidades de bióxido de

carbono en la sangre, de esta manera los eritrocitos contribuyen a mantener

el equilibrio ácido-base del organismo (Hoffbrand y Pettit, 1993).

H2O + CO2 H2CO3

7

LEUCOCITOS:

Los leucocitos están distribuidos en neutrófilos, eosinófilos, basófilos,

monocitos y linfocitos. Los nombres de los tres primeros reflejan su afinidad

ante los colorantes de Romanowsky. Los monocitos y linfocitos son células

mononucleares. los monocitos son fagocíticos, se transforman en macrófa-

gos y se localizan en los tejidos.

LINFOCITOS:

Son células de gran importancia para la inmunidad humoral y celular,

se desarrollan en los ganglios linfáticos, bazo, timo, amígdalas y tejido

linfoide del intestino, los linfocitos junto con los neutrófilos comprenden la

mayor parte de los leucocitos en la sangre. En la inmunidad celular los

linfocitos derivados del timo, esto es los T sensibilizados se unen a

antígenos heterólogos específicos y los destruyen. La inmunidad humoral

implica la producción de anticuerpos circulantes por parte de los linfocitos B

(Lee, 1995).

PLAQUETAS:

Los trombocitos o plaquetas se derivan de los megacariocitos de la

médula ósea, protegen las superficies vasculares al presentarse una lesión

el vaso sanguíneo se contrae, por lo que disminuye el paso sangre a través

de él, en seguida las plaquetas se adhieren a la colágena del endotelio del

vaso dañado, liberan adenosina difosfato (ADP), trombina y serotonina, cuyo

papel es reforzar la agregación de las plaquetas hasta llegar a la formación

8

de un trombo plaquetario, el cual detiene momentáneamente la pérdida de

sangre, mismo que es reforzado simultáneamente y substituido por la

formación de fibrina, posteriormente se inicia la reparación del sitio dañado

(Velasco, 1991).

La hematopoyesis puede ser modificada por agentes físicos, químicos

o infecciosos dando origen a distintas enfermedades hematológicas. Las

enfermedades de la sangre y de órganos hematopoyéticos pueden dividirse

en: Trastornos que afectan primariamente a los glóbulos rojos, leucocitos,

plaquetas, la coagulación sanguínea o bien alterar la producción de todas

las líneas celulares como en la anemia aplástica y los diferentes tipos de

leucemias.

Los agentes que causan aplasia medular o anemia aplástica pueden

ser agrupados en:

1) Los que regularmente producen lesión de la médula ósea si se dan en

dosis suficientes como:

Radiación (isótopos radiactivos), exposición a radiaciones de explosiones

nucleares, benceno, agentes quimioterapéuticos de procesos malignos.

2) Los que ocasionalmente se asocian con insuficiencia medular ósea:

Cloranfenicol, sulfamidas, quinacrina (Atebrina), fenilbutazona

(Butazolidina), trinitrotolueno, arsenobenzoles y preparados de oro.

De ellos, el Cloranfenicol es el agente que mas frecuentemente se ha

asociado con el desarrollo de aplasia de la médula ósea en los Estados

Unidos de América en los últimos años. Es posible que en nuestro país

donde no existe un control para el consumo de este antibiótico, la incidencia

de aplasia medular debido al cloranfenicol sea mayor que en los Estados

Unidos de América. En algunos pacientes la aplasia medular puede evolucio-

9

nar a leucemia, caracterizada por proliferación anormal en la médula ósea de

los precursores hematopoyéticos (Huff, 1989).

La aplasia medular puede presentarse a cualquier edad, pero con

mayor incidencia alrededor de los 30 años, con ligero predominio en el

varón, puede presentarse en forma insidiosa como anemia, neutropenia o

trombo-citopenia. El paciente puede presentar hematomas, epistaxis,

gingivorragias, púrpura cutánea, sangrados a nivel digestivo, urinario,

muscular y del sistema nervioso central, siendo éste último el de mayor

gravedad y el que más frecuentemente acaba con la vida del paciente. Como

consecuencia de la leucopenia (neutropenia), los pacientes presentan

infecciones en la faringe, pulmones, recto, vías urinarias y piel, causadas

principalmente por bacterias gram negativas y hongos oportunistas. Con el

propósito de restablecer la hematopoyesis, en la medicina moderna se

centra en tres objetivos principales:

1. Identificación, evaluación y eliminación de los agentes etiológicos.

2. Terapia de apoyo mediante transfusión de paquetes de sangre total o de

concentrados celulares específicos, este tratamiento no es curativo, pero

permite al paciente atacar las infecciones y evitar los sangrados que

podrían incluso causarle la muerte. Esta terapia tiene efectos

secundarios, ya que el sistema inmune del paciente se sensibiliza y

después de varias transfusiones puede presentar rechazo inmunológico a

las células transfundidas o de éstas a las del paciente.

3. Restauración de la hematopoyesis normal mediante el tratamiento con

Globulina anti-linfocito (GAL), ciclosporina, glucocorticoides, andrógenos,

factores de crecimiento hematopoyético (Factor estimulante de colonias

de granulocitos-macrófagos -CSF-GM), interleucina 3. Ninguno de estos

tratamientos ofrece por sí solo una alternativa para la regeneración

definitiva de la hematopoyésis, por lo que en la mayoría de los casos se

emplea la combinación de medicamentos, con resultados alentadores,

10

pero con algunos efectos colaterales. En los casos de anemia aplástica

con mayor resistencia a los tratamientos se recurre a la esplenectomía,

quimioterapia, radioterapia y más reciente y exitosamente al transplante

de médula ósea (Morales et al., 1992).

Por su tecnología y costo el transplante de médula ósea no es accesible

para la mayoría de los enfermos., por lo que la anemia aplástica aún hoy en

nuestro país es causa de muerte en los adultos que la padecen. Es por ello

que la población mexicana utiliza plantas medicinales para el tratamiento de

ésta y de otras enfermedades hematológicas graves para las que la medicina

moderna no tiene tratamientos efectivos o accesibles.

En la literatura mexicana, existe información de plantas utilizadas para

curar enfermedades de la sangre entre las cuales destaca Plantago major,

(Llantén) planta originaria del norte de Europa y del centro de Asia. En

México tiene amplia distribución, se emplea también como desinflamatorio,

antipirético, antihelmíntico, astringente, vulnerario, cicatrizante y purificador

de la sangre. En otros países se usa contra el cáncer y principios de cáncer

(Argueta et al., 1994).

P. major crece en climas cálido, semicálido y templado, desde el nivel del

mar hasta los 3500 m. sobre el nivel del mar. Es una planta asociada a

terrenos de cultivo, bosques tropicales caducifolio, bosque espinoso, pastizal

y bosques mesófilo de montaña, de encino, de pino y mixto de pino-encino

(Samuelsen, 2000).

Esta planta es anual o perenne, alcanza los 10 a 30 cm de altura, con

pequeños camotes. Tiene las hojas en roseta que surgen desde el nivel del

suelo, envolviendo parte del tallo, el envés de la hoja es mas ancho que el

11

haz. Las flores son diminutas y de color blanco-verdosas, acomodadas en

una espiga larga, dando la apariencia de una mazorca delgada, las semillas

son de color café.

A nivel nacional, la mayoría de los usos reportados para el llantén

corresponden a padecimientos digestivos, sin embargo se pueden distinguir

de manera general, dos grupos de acuerdo a las propiedades que se le

atribuyan de manera explícita: en el primero desempeñando una acción

desinflamante y en el segundo, como analgésico. En el resto de los

padecimientos desempeñará una o más funciones (INI, 1999).

12

JUSTIFICACIÓN

Debido a que el sistema hematopoyético tiene recambio constante, es

susceptible de ser alterado en su funcionamiento por agentes físicos, quími-

cos o infecciosos, que producen síndromes hematológicos de pronóstico

favorable como las anemias regenerativas o enfermedades de pronóstico

fatal como la anemia aplástica y las leucemias.

Considerando que el hombre a lo largo de su vida se expone a

agentes tóxicos para la médula ósea, bien sea por contaminación del medio

ambiente con hidrocarburos (benceno y derivados), el consumo de frutas y

verduras contaminados en campos tratados con plaguicida (Mirsalis et.al.,

1990), el uso indiscriminado de antibióticos (cloranfenicol) y alimentos que

contienen colorantes y saborizantes artificiales, es posible que estos sean

causantes de las enfermedades de la sangre como anemia aplástica y

leucemia, cada vez más frecuentes en individuos jóvenes en edad

productiva.

Para el control de la anemia aplástica y de los diferentes tipos de

leucemia, la medicina moderna emplea la quimioterapia, radioterapia y más

recientemente al transplante de médula ósea de un donador externo o

transplante de células totipotenciales del paciente aisladas de su sangre,

clonadas in vitro y trasfundidas posteriormente a él (Morales et al., 1992).

Sin embargo, debido al alto costo, a los recursos técnicos y materiales

necesarios para un transplante este procedimiento en nuestro país es

prácticamente inaccesible para la mayoría de los pacientes, por lo que aún

hoy, la anemia aplástica es causa de muerte en los adultos que la padecen.

13

Por tal motivo, la población acude al empleo de plantas para contrarrestar o

controlar estas enfermedades.

En la literatura mexicana e internacional se recomienda la decocción

de Plantago major (llantén) para el tratamiento de estas enfermedades. En

México se utiliza esta planta contra diversas enfermedades. En Puebla,

Veracruz y Chiapas se recomienda la infusión de las partes aéreas contra la

anemia. Las hojas se aplican en forma de emplastos como cicatrizante y

vulnerario (Márquez et al., 1999). Por otra parte, en Filipinas se ingiere la

infusión de la raíz contra el cáncer y leucemia. Por tal motivo, con el

presente trabajo se intenta conocer experimentalmente las propiedades

hematopoyé-ticas de la planta y determinar su posible utilidad posterior en el

manejo de la anemia aplástica.

14

NATURALEZA DEL PROYECTO

El presente proyecto forma parte de la línea de investigación que

estudia los agentes fisicos, químicos y biológicos que modifican la hemato-

poyesis, particularmente la producción de megacariocitos y de plaquetas.

Este trabajo se ubica en el campo de la investigación en hematología

e intenta validar o contraponer experimentalmente el conocimiento popular

acerca de las propiedades curativas de Plantago major en el tratamiento de

enfermedades hematológicas. Inicialmente, determinando el efecto de los

extractos acuoso y metanólico de la planta sobre la proliferación in vitro de

células hematopoyéticas del bazo y de la médula ósea de ratones sanos y

con base en los resultados, determinar la actividad hematopoyética en

ratones sanos y en ratones con anemia aplástica inducida.

15

HIPÓTESIS

Dentro del campo de la medicina tradicional mexicana se utiliza la

infusión de Plantago major para el tratamiento de enfermedades hematoló-

gicas como leucemia y anemia aplástica, es posible que esta planta presente

componentes que estimulen y restauren la hematopoyésis normal, motivo por

el cual se justifique su utilización en el tratamiento de anemia aplástica.

Por otra parte, es posible que la planta contenga componentes

inhibidores de la proliferación de células transformadas, lo que explicaría

que sea utilizada en el tratamiento de leucemia y cáncer.

La adición de extractos de la planta completa o de sus diferentes

partes a cultivos de células de bazo y de médula ósea de ratón podrían

estimular la proliferación de ellas e incrementar la concentración celular,

respecto a cultivos testigos libres de extractos de la planta.

16

OBJETIVO GENERAL

Determinar el efecto de los extractos acuoso y metanólico de Plantago

major sobre la proliferación in vitro de células del sistema hematopoyético de

ratones sanos.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Obtener los extractos acuoso y metanólico de Plantago major.

2. Realizar una curva dosis-respuesta con extractos de la planta aplicados a

cultivos de células de bazo y de médula ósea de ratón.

3. Evaluar el efecto de los extractos acuoso y metanólico sobre la

proliferación in vitro de células de bazo y de médula ósea de ratones

sanos.

17

MATERIAL Y MÉTODOS

MATERIAL BIOLÓGICO:

Ratones machos CD1 de 8 a 12 semanas de edad

Estructuras aéreas y raíz de Plantago major L.

SOLUCIONES, REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO:

Medio alfa-MEM

Medio de Leibovitz.

Azul de tripan al 0.4%.

Solución salina fisiológica.

MATERIAL:

Material desechable de uso frecuente en laboratorios de cultivo de tejidos.

Pipeta de Thomas para: glóbulos rojos y glóbulos blancos.

Equipo de disección.

EQUIPO:

Incubadora con entrada para CO2 (National)

Campana de flujo laminar (Vecco).

Potenciómetro (Beckman).

Centrifuga para microhematocrito (Hermle).

Centrifuga (Solbat).

Cámaras de Neubauer (Boeco).

Microscopio óptico con contraste de fases (Carl Zeiss).

Espectrofotómetro (Perkin Elmer).

Balanza analítica (Ohaus).

Microscopio Invertido (Carl Zeiss).

Rotavapor (Büchii).

Balanza Analítica (Ohaus).

18

OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS:

- La planta se dejó secar a temperatura ambiente protegida del polvo y

de la luz solar.

- Las partes aéreas (hojas y espigas) y la raíz se molieron con un

molino de mano para preparar extractos únicos o de mezclas de

estas estructuras.

- Se colocaron 500 gramos del material molido en un matraz balón, se

adicionaron 700 ml agua destilada y la mezcla se calentó a reflujo

durante 4 horas, el extracto se filtró, el solvente se evaporó hasta

sequedad total en baño maría.

- En el caso del extracto metanólico, primero se sometió a reflujo con

- hexano durante 4 horas, el molido se dejó secar a temperatura

- ambiente y después se repitió el procedimiento con metanol.

- Se prepararon disoluciones con 0.4, 0.2, 0.1 y 0.05 g/mL del extracto

- y se evaluó su efecto sobre la proliferación in vitro de células de

- médula ósea y de bazo de ratón.

19

CULTIVO DE MÉDULA ÓSEA DE RATÓN

- Se sacrificó por dislocación cervical un ratón macho CD1 de 8 a 12

semanas de edad.

- Se aisló el fémur en condiciones de esterilidad, y se inyectó a través de

canal medular 1 ml de medio de Leibovitz (L-15) suplementado con 10%

de suero de caballo (Metcalf, 1975).

- La suspensión celular se diluyó 1:20 con disolución de Turk y se contaron

las células nucleadas totales en cámara cuenta-globulos al microscopio

de luz (Simmons, 1980).

- Se determinó la viabilidad celular con azul de tripan al 0.4% y se ajustó la

concentración a 2.0 X 105 células/mL (Hudson y Hay, 1980).

- Se colocó 0.1 ml de la suspensión celular en un sistema de cultivo con

0.8 g/mL de medio de Leibovitz con 10% de suero de caballo y 0.1 ml

del extracto de prueba.

- Se colocaron 0.5 ml de la mezcla anterior en placas Nunc de 1 cm2.

- Los cultivos se incubaron 72 horas a 37°C en humedad relativa de 90% y

5% de CO2 .

- Las células se recuperaron de las placas de cultivo, las cuales se lavaron

con 1 ml de medio de Leibovitz (L-15), todo el material se centrifugó a

2500 rpm durante 3 minutos a temperatura ambiente, se desechó el sobre

nadante, el botón celular se resuspendió en 0.5 ml de medio L-15 y se

contaron las células en un hemocitómetro, mediante microscopía de luz.

Simultáneamente se prepararon cultivos testigos libres de extracto. El

número de células en los cultivos testigos fue considerado como el 100%

de la proliferación celular y contra el se compararon las cuentas

obtenidas con los extracto de prueba.

20

CULTIVO DE BAZO DE RATÓN

- Se sacrificó un ratón macho CD1 de 8 a 12 semanas de edad por

dislocación cervical.

- Se aisló el bazo en condiciones de esterilidad, se dispersaron mecánica-

mente las células, se lavaron con 30 ml de medio Alfa-MEM frío con pH

7.2, se determinó la viabilidad celular con azul de tripan al 0.4% y se

ajustó la concentración a 2.0 X 106 células/mL en cámara cuenta-glóbulos

(Nakeff, 1981).

- Se cultivó un volumen de la suspensión celular con 8 volúmenes de

medio Alfa-MEM con suero de caballo al 10% y se adicionó 0.1 ml del

extracto de la prueba.

- Se colocaron 0.5 ml de la mezcla anterior en pozos de placas Nunc de 1

cm2 e incubaron durante 48 horas a 37°C en cámara con húmedad

relativa de 90% y 5% de CO2.

- Las células se recuperaron lavando las placas de cultivo con 1 ml de

medio Alfa MEM pH 7.2, la suspensión celular se centrifugó a 2500 rpm

durante 10 minutos a temperatura ambiente, se desechó el sobrenadante,

el botón celular se resuspendió en 0.5 ml de medio Alfa-MEM y se conta-

ron las células en un hemocitómetro mediante microscopía de luz.

Además, se prepararon cultivos testigos libres de extracto.

Análisis Estadístico

Los resultados se expresan como la media aritmética de los cultivos,

desviación estándar, error estándar y la prueba de t para pares de datos no

agrupados.

21

RESULTADOS

El extracto acuoso de las estructuras aéreas indujo de 2.76 a 4.30

incrementos en la concentración celular en cultivo de médula ósea de ratón, sin

embargo debido a la amplia dispersión en los valores de la desviación estándar,

dichos incrementos no fueron estadísticamente significativos. Gráfica 1.

Los extractos acuosos de la espiga, hoja o raíz no estimularon la prolifera-

ción de células en cultivo de médula ósea, debido a la amplia dispersión de la

desviación estándar los incrementos observados no presentaron significancia

estadística. Gráficas 2, 3, 4, y 5.

Por otra parte, los extractos metanólicos de las estructuras aéreas, espigas

y hojas, al ser empleados en las concentraciones de 0.4 y 0.2 g/mL al ser

ensayados en cultivos de médula ósea de ratón estimularon la proliferación

celular, causando incrementos significativos (p<0.02) en la concentración celular.

Gráficas 6, 7 y 8.

Con el extracto metanólico de la hoja se obtuvo la mayor actividad

estimulante de la proliferación celular, alcanzando los 31.34 incrementos en la

concentración celular respecto al cultivo testigo. Sin embargo la capacidad

disminuyó drásticamente al emplear la concentración 0.2 g/mL, alcanzando en

este caso incrementos de 5.24. Gráfica 9. En ambos casos los incrementos

fueron significativos estadísticamente con p<0.01. Gráfica 10.

22

Ninguna de las concentraciones empleadas, de los extractos acuoso o

metanólico estimuló la proliferación de células de bazo en cultivo, ya que no

obstante que provocaron incrementos en la concentración de las mismas, los

resultados presentaron amplia dispersión, por lo que no fueron estadísticamente

significativos. Gráficas 11 a 15.

EFECTO DEL EXTRACTO METANÓLICO DE Plantago major L.SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE MÉDULA ÓSEA DE RATÓN

In vitro

0

5

10

15

20

25

0

2

4

6

8

10

12

14

0.4 0.2 0.1 0.05 TESTIGO

g/mL de Extracto

PARTES AERÉAS

Células X 105/mL

0.4 0.2 0.1 0.05 TESTIGO

g/mL de Extracto

RAÍZ

Células X 105/mL

GRAFICA 6 GRAFICA 7

EFECTO DEL EXTRACTO METANÓLICO DE Plantago major L.SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE MÉDULA ÓSEA DE RATÓN

In vitroESPIGA

g/mL de Extracto g/mL de Extracto

Células X 105/mL Células X 105/mL

GRAFICA 8 GRAFICA 9

TESTIGO TESTIGO0.4 0.2 0.1 0.05 0.4 0.2 0.1 0.05

+* *

+ p < 0.02 Altamente significativa

**

* p < 0.05

No significativa

+ p < 0.02

Altamente significativa

0

10

20

30

40

50

60

0

5

10

15

20

25

+

*

*

* p < 0.05

No significativa

HOJA

+

27

EFECTO DEL EXTRACTO METANÓLICO DE Plantago major L.SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE MÉDULA ÓSEA DE RATÓN

In vitro

0

5

10

15

20

25

PARTES AERÉAS RAÍZ

g/mL de Extracto g/mL de Extracto

Células X 105/mL Células X 105/mL

GRAFICA 6 GRAFICA 7

TESTIGO TESTIGOO.4 0.2 0.1 0.05 0.4 0.2 0.1 0.05

+

+

+ p < 0.02

**

Altamente significativa

+

+ *

*

* p > 0.05* No significativa

0

2

4

6

8

10

12

14 + p < 0.02Altamente significativa

*p>0.05

No significativa

26

0

5

10

15

20

25

ESPIGA

Células X 105/mL

GRAFICA 8

0

2

4

6

8

10

12

14

EFECTO DEL EXTRACTO METANÓLICO DE Plantago majorL. SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE MÉDULA ÓSEA DE

RATÓN In vitro

0

10

20

30

40

50

60

0

5

10

15

20

25

ESPIGA HOJA

Células X 105/mL Células X 105/mL

0.4 0.2 0.1 0.05 TESTIGO 0.4 0.2 0.1 0.05 TESTIGO

g/mL de Extracto g/mL de Extracto

GRAFICA 8 GRAFICA 9

EFECTO DEL EXTRACTO ACUOSO DE Plantago major L.SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE BAZO DE RATÓN In vitro

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

PARTES AÉREAS ESPIGA

Células X 105/mL Células X 105/mL

0.4 0.2 0.1 0.05 TESTIGO 0.4 0.2 0.1 0.05 TESTIGO

g/mL de Extracto g/mL de Extracto

GRAFICA 11 GRAFICA 12

**

*

*

*p>0.05

No significativa

*

*

*

*

*p>0.05

No significativa

29

EFECTO DEL EXTRACTO ACUOSO DE Plantago major L.SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE BAZO DE RATÓN In vitro

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0

0.5

1

1.5

2

2.5

HOJA RAÍZ

Células X 105/mL Células X 105/mL

0.4 0.2 0.1 0.05 TESTIGO 0.4 0.2 0.1 0.05 TESTIGO

g/mL de Extracto g/mL de Extracto

GRAFICA 13 GRAFICA 14

*

*

*

*

*No significativa * *

* *

*No significativa

30

EFECTO DEL EXTRACTO ACUOSO DEPlantago major L. SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE

MÉDULA ÓSEA DE RATÓN In vitro

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

HOJA RAÍZ

Células X 105/mL Células X 105/mL

0.4 0.2 0.1 0.05 TESTIGO 0.4 0.2 0.1 0.05 TESTIGO

g/mL de Extracto g/mL de Extracto

GRAFICA 3 GRAFICA 4

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.21.4

1.6

1.8* *

*

*

*No significativa *

* *

*

*No significativa

p>0.05, No significativa

24

EFECTO DEL EXTRACTO ACUOSO DEPlantago major L. SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE

MÉDULA ÓSEA DE RATÓN In vitro

0

0.5

1

1.5

2

2.5

PARTES AÉREAS ESPIGA

0.4 0.2 0.1 0.05 TESTIGO 0.4 0.2 0.1 0.05 TESTIGO

Células X 105/mL

g/mL de Extracto

Células X 105/mL

g/mL de Extracto

GRAFICA 1 GRAFICA 2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6*

*

*

*

*No signuficativa *

*

*

*

*No significativa

* P>0.05 No significativa

23

32

DISCUSIÓN

Plantago major es una de las plantas más estudiadas, se conocen gran

parte de sus componentes y la acción farmacológica de algunos de ellos. Sin

embargo, las partes aéreas en conjunto aún son empleadas en México para el

tratamiento de enfermedades o síndromes relacionados con procesos que

modifican la proliferación de las células de la médula ósea, no obstante en

nuestros días se desconoce su efecto sobre la proliferación de células del sistema

hematopoyético.

En los estudios fitoquímicos de la planta, se han detectado flavonoides,

plantaglucósidos y siringinina. Las semillas contienes taninos, dos alcaloides

monoterpénicos; la plantagonina y la indicaína (Samuelsen, 2000). Sin embargo,

en la literatura científica no existen reportes respecto a la actividad

hematopoyética de estos compuestos (NAPRALERT, 1998).

La capacidad del extracto metanólico de P. major para estimular la

proliferación de las células de médula ósea, pudiera estar relacionada con la

presencia de moléculas que actúan como mitógenos, actividad que se ha ligado

habitualmente a moléculas polipeptídicas como la fitohemaglutinina y el mitógeno

pokeweed, aislados de los extractos acuosos de Phaseolus vulgaris y Phytolacca

americana, respectivamente: Estas lectinas (mitógenos) son utilizadas en el cultivo

de células hematopoyéticas (Nakeff y Velasco, 1981). Sin embargo y aún

considerando la posible presencia de estas u otras glucoproteínas mitogénicas en

el extracto acuoso, el calentamiento prolongado podría haberlas desnaturalizado o

precipitado, provocando la pérdida de actividad mitogénica en los cultivos. La

actividad hematopoyetica obtenida con el extracto metanólico, es posiblemente

33

debida a moléculas que son producto del calentamiento de la planta y uque no se

encuentran en su forma natural.

Por otra parte, La actividad hematopoyética obtenida con el extracto

metanólico pudiera atribuirse a la presencia de moléculas termoestables como los

ácidos carboxílicos, palmítico, esterárico, linoléico y linolénico reportados en las

semillas de la planta (el material ensayado incluía las espigas con semillas). Se ha

demostrado que estos ácidos ayudan a restablecer la hematopoyesis en ratones

que han sido irradiados letalmente con rayos X (Miyanomae y Friendel, 1988).

En estudios químicos de la planta se ha demostrado la existencia de

adenina (Duke), además de alantoinas, ácido clorogénico (Duke), ácido ferúlico

(EMP), y sinigina (CNC), que aislados de otras plantas, se demostró tienen efecto

inmunoestimulante, por lo que se esperaba que los extractos obtenidos

estimularan la proliferación de células de médula ósea (precursoras de las células

linfoides) y particularmente las del bazo (linfocitos T y B). Sin embargo no fue así,

lo cual podría atribuirse a que en la mayoría de los casos, estos compuestos han

sido obtenidos de infusiones (tés) o macerados de la planta (reposo en agua y

temperatura ambiente por al menos 12 horas), mientras que en nuestro caso los

extractos se prepararon mediante calentamiento a ebullición (decocción), por lo

que de estar presentes los compuestos arriba mencionados, podrían haberse

descompuesto o transformado en productos secundarios, no estimulantes de la

hematopoyesis.

34

CONCLUSIONES

Bajo las condiciones experimentales seguidas en este trabajo, el extracto

metanólico de P. major estimuló la proliferación de células de la médula ósea, por

lo que podría ser utilizado como fuente de obtención y caracterización de princi.-

pios activos de utilidad en el tratamiento de diferentes tipos de anemia

La concentración 0.4 g/ml del extracto metanólico de la hoja presentó la

mayor actividad de todos los extractos ensayados, provocando que las células de

médula ósea incrementaran 32 veces su concentración en el cultivo.

El extracto metanólico de las partes aéreas de la planta (hojas y espigas) y

de las espigas presentaron menor actividad estimulante que el extracto de las

hojas, es posible que en forma natural, las espigas desempeñen un papel regula-

dor o antagonista de la actividad mitogénica de la hoja.

La actividad ampliamente mitogénica de la hoja, podría respaldar su uso

popular en forma de emplasto o fomento para cicatrizar heridas.

Queda por conocerse, el linaje y el grado de maduración de las células que

proliferan en presencia del extracto metanólico.

35

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